KR101780575B1 - 신규한 인터루킨-33 수용체와 결합 단백질 조성물 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 인터루킨-33 수용체 및 결합 단백질 조성물 및 그 용도에 관한 것으로 본 발명은 병원균 및 염증 질환에 대한 숙주 방어에서 광범위한 스펙트럼의 IL-33 활성을 조사하는데 도움을 줄 것이다.

Description

신규한 인터루킨-33 수용체와 결합 단백질 조성물 및 그 용도{COMPOSITION OF NOVEL INTERLEUKIN-33 RECEPTOR AND BINDING PROTEIN, AND USE THEREOF}

본 발명은 신규한 인터루킨-33 수용체와 결합단백질 조성물 및 그 용도에 관한 것으로 본 발명은 병원균 및 염증 질환에 대한 숙주 방어에서 광범위한 스펙트럼의 IL-33 활성을 조사하는데 도움을 줄 것이다.

인터루킨(이하, 'IL'라 함)-33은 IL-1 사이토카인 계열 중 하나로 고내피소정맥(high endothelial venules)으로부터 유래한 핵 인자(nuclear factor)로 발견되었다(Baekkevold, E.S., et al. Am J Pathol 163, 69-79 (2003)).IL-33은 전구체 IL-33 분자로 세포내에서 합성되고 주로 위치한다.전구체 IL-33은 분비되는 신호 펩타이드를 가지지 않고;그것은 mature 단백질로 세포외로 분비된다.

혈관계를 따라 IL-33의 항시 높은 발현은 정상 조직에서 검출되고 괴사성 세포로부터 분비된다. 이 결과는 외상 또는 감염 동안 내피 또는 상피 세포 손상 후 면역 시스템을 경계하는 내생적인 '위험' 신호로 HMGB1와 유사한 IL-33의 가능한 역할을 시사한다(Moussion, C., Ortega, N. & Girard, J.P. PLoS One 3, e3331 (2008)). 또한, 기능적 연구는 IL-33이 마우스에서 prototypic RNA/DNA 바이러스 복제에 반응하는 괴사성 세포로부터 분비되는 손상 관련된 분자적 패턴(DAMP) 또는 alarmins이라는 것을 나타낸다. mature IL-33의 특징적인 생물학적 활성은 해결되어야 할 필요성이 있다.

최초 희귀(organ) 수용체로 보고된 ST2 (IL-1RL1, DER4, Fit-1 또는 T1으로도 알려짐)(Bergers, G., Reikerstorfer, A., Braselmann, S., Graninger, P. & Busslinger, M. EMBO J 13, 1176-1188 (1994);Klemenz, R., Hoffmann, S. & Werenskiold, A.K. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 5708-5712 (1989);Tominaga, S. FEBS letters 258, 301-304 (1989))는 IL-33 수용체의 리간드 결합 체인이다(Schmitz, J., et al. Immunity 23, 479-490 (2005)). 신호전달을 위한 IL-33 수용체 복합체는 리간드 결합 체인 ST2(IL-1R4) 및 신호전달 체인 IL-1 수용체 부속 단백질(IL-1RAcP;IL-1R3)로 구성되어 있다. IL-33 결합 후, 그 수용체 복합체는 IRAK(IL-1 receptor-associated kinase), TRAF6(TNF receptor associated factor 6) 및/또는 MAPKs를 통하여 NF-kB 및 AP-1과 같은 다운스트림 신호 전달 분자들을 활성화한다. ST2는 마우스 및 인간에서 Th2 세포의 선택마커이고(Trajkovic, V., Sweet, M.J. & Xu, D. Cytokine Growth Factor Rev 15, 87-95 (2004); Lohning, M., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6930-6935 (1998);Moritz, D.R., Rodewald, H.R., Gheyselinck, J. & Klemenz, R. J Immunol 161, 4866-4874 (1998)) 비만세포,호산구 및 심지어 호염구에서 발현된다.이들 세포는 IL-33의 자극에 의한 IL-4,IL-5,IL-6,IL-13 및 IL-8을 포함하는 Th2 염증성 사이토카인 및 케모카인을 생산한다. 순환 CD34+ 조혈 전구세포는 ST2를 발현하고 고 수준의 Th2-관련 사이토카인을 분비하여 IL-33에 반응한다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 인터루킨(IL)-33 수용체를 동정하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 IL-1 수용체 부속 단백질 2 (IL-1R9) 및 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)을 유효성분으로 포함하는 인터루킨(IL)-33에 대한 수용체 및 결합 단백질 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 IL-1 수용체 부속 단백질 2 (IL-1R9)는 서열번호 1 내지 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)은 서열번호 3 내지 6에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 인터루킨(IL)-33은 서열번호 7(전구체 IL-33) 또는 8(Mature IL-33)의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 IL-1 수용체 부속 단백질 2 (IL-1R9) 및 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 인터루킨(IL)-33 관련 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아만성관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선 관절염, 반응 관절염 및 패혈성 관절염, 척추관절염, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양성 결장염, 염증장병, 인슐린 의존 당뇨병, 갑상샘염, 천식, 알레르기병, 건선, 피부염 피부경화증, 이식대숙주병, 기관 이식거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역병, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신장증후군, 만성피로증후군, 베게너 육아종증, 헨녹-쇈라인 자반증(Henoch-Schonlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅톤씨 무도병, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병, 발작, 1차담관성간경화증, 용혈빈혈, 악성암, 심장부전, 심근경색, 애디슨씨병, 산발성, 다선성 결핍 I형 및 다선성 결핍 II형, 슈미트씨 증후군, 성인(급성) 호흡곤란증후군, 탈모증, 원형탈모증, 흠성혈청 관절증, 관절증, 라이터씨병, 건선관절증, 궤양성결장염관절증, 창자병 윤활막염, 클라미디아, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽상병/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역수포병, 보통천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 1차 IgA 병, 자가면역용혈빈혈, 쿰스 양성 용혈빈혈, 후천성 악성빈혈, 소아악성빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리병(Royal Free Disease), 만성점막피부칸디다증, 거대세포 동맥염, 1차 경화증 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍증후군, 후천성 면역결핍관련병, B형 간염, C형 간염, 공통가변성면역결핍(공통가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소부전,조기 난소부전, 섬유소성 폐병, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증후 간질성 폐병, 간질성 폐렴, 결합조직병 관련 간질성 폐병, 복합 결합조직병 관련 폐병, 전신 경화증 관련 간질성 폐병, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐병, 전신홍반루푸스 관련 폐병, 피부근육염/다발근육염 관련 폐병, 쇼그렌병 관련 폐병, 강직척추염 관련 폐병, 혈관염성 광범위 폐병, 혈철소증 관련 폐병, 약물 유도 간질성 폐병, 방사선 섬유증, 폐쇄세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤 폐병, 감염후 간질성 폐병, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(고전적 자가면역 또는 루푸스 간염), 2형 자가면역 간염(항LKM 항체간염), 자가면역 매개 저혈당증, 흑색가시세포증 관련 B형 인슐린 내성, 부갑상샘저하증, 기관 이식 관련 급성 면역 질환,기관 이식 관련 만성 면역 질환, 골관절염, 1차경화담관염, 건선 1형, 건선 2형, 특발 백혈구감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장병 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원반형 홍반루푸스, 특발성 또는 NOS 남성 불임, 정자 자가면역성, 다발성 경화증(모든 서브타입), 교감 눈염증, 결합조직 질환에 부차적인 폐 고혈압, 굿파스쳐 증후군, 결절다발 동맥염의 폐동맥 징후, 급성 류마티스열, 류마티스성 척추염, 스틸스병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스씨병/동맥염, 자가면역 저혈소판증, 특발 저혈소판증, 자가면역 갑상샘 질환, 갑상샘저하증, 갑상샘종 자가면역 갑상샘저하증(하시모토씨병), 위축 자가면역 갑상샘저하증, 1차 점액부종, 수정체성 포도막염, 1차 혈관염, 백반증, 급성 간질환, 만성 간질환, 알콜간경화증, 알콜 유도 간 손상, 담즙정체, 특이 간질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 질환, Th2 형 및 Th1 형 매개 병, 급성 및 만성 통증 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 IL-1 수용체 부속 단백질 2 (IL-1R9) 및 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 임의의 기술로 제조할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는 특히 바람직한 방법에는 XENOMOUSE 유전자 전이 마우스를 사용하는 방법, 항체 제조에 있어서 당업계에 공지된 하이브리도마 및 SLAM 세포 이식 기술(Abgenix, Inc., 캘리포니아 프리몬트 소재)을 사용하는 방법 등이 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 단백질 및 그 단백질에 대한 항체 또는 항원 결합부와 약제학적 허용성 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 약학 조성물은 추가로 IL-33 활성이 해로운 질환을 치료하기 위한 다른 추가 치료제를 하나 이상 포함한다.

본 발명의 항체 및 항체 일부는 대상체에 투여하기에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 약제학적 허용성 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적 허용성 담체"란 용어에는 생리학적으로 화합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적 허용성 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상 또는 이의 조합물이 포함된다. 대부분의 경우에는 조성물에 당과 같은 등장제, 만니톨, 소르비톨과 같은 다알콜 또는 염화나트륨이 포함되는 것이 바람직하다. 약제학적 허용성 담체는 추가로 항체 또는 항체 일부의 유효 수명이나 효과를 증강시키는 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량 포함할 수도 있다.

본 발명의 항체 및 항체 일부는 비경구 투여에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 여기서, 항체 또는 항체 일부는 항체 0.1 내지 250mg/ml를 포함하는 주사 용액으로 제조하는 것이 바람직하다. 주사 용액은 플린트 또는 호박색 바이엘, 앰플 또는 사전충진 주사기 중의 액체 또는 동결건조 투약 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)의 L-히스티딘(1-50mM), 최적으로는 5-10mM일 수 있다. 다른 적당한 완충액으로는 석신산나트륨, 구연산나트륨,인산나트륨 또는 인산칼륨이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 염화나트륨은 0 내지 300mM(액체 투약량 형태인 경우 최적으로는 150mM)의 농도로 용액의 독성을 개질하는데 사용될 수 있다. 동결건조 투약 형태에는 동결방지제, 주로 0 내지 10% 슈크로스(최적으로는 0.5 내지 1.0%)가 첨가될 수 있다. 다른 적당한 동결방지제에는 트레할로스 및 락토스가 있다.

동결건조 투약 형태에는 장확장성 약물, 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2 내지 4%)이 첨가될 수 있다. 액체 및 동결건조 투약 형태에는 안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10mM)이 첨가될 수 있다. 다른 적당한

장확장성 약물에는 글리신, 아르기닌이 있으며, 이는 0 내지 0.05%폴리소르베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%)으로서 포함될 수 있다. 또 다른 계면활성제에는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 있으나, 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이러한 형태에는 예컨대 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예컨대 액체 용액(예, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌약 등이 포함된다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도마다 다르다. 일반적으로 바람직한 조성물은 주사 용액 또는 주입 용액 형태, 예컨대 다른 항체로 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 조성물과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 또 다른 바람직한 양태에서,항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.

치료요법적 조성물은 일반적으로 멸균될 수 있고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적당한 다른 주문 구조로 조제될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요에 따라 앞에서 열거한 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적당한 용매에서 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 필요에 따라 전술한 다른 성분을 포함하는 멸균 매개제에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조에 유용한 멸균 동결건조 분말의 경우에,바람직한 제조방법은 전술한 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유체성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 주사 조성물의 지속적 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 첨가하여 제공할 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체 일부는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 다양한 치료요법적 용도에서 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 이 화합물이 신속 방출되지 않게 하는 담체와 함께 조제될 수 있으며, 그 예에는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 조절 방출 제형이 있다. 여기에는 에틸렌비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체화합성중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다

[예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NewYork, 1978].

특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 예컨대 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 이러한 화합물( 및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 충진되거나, 정제로 압착되거나 또는 대상체 식이에 직접 첨가될 수도 있다. 경구 치료 투여용인 경우, 상기 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취성 정제,협측 정제, 트로키, 캡슐; 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여외 다른 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화 방지용 물질로 코팅하거나 또는 상기 방지용 물질과 함께 공동 투여할 필요가 있을 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부의 "치료요법적 유효량" 또는 "예방요법적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료요법적 유효량"이란 용어는 원하는 치료 결과를 수득하기 위한 투약량과 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다.

상기 항체 또는 항체 일부의 치료요법적 유효량은 당업자라면 결정할 수 있는 것으로서, 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중과 개체 내에서 원하는 반응을 유도해내는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료요법적 유효량은 치료요법적 유익 효과가 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방요법적 유효량"은 원하는 예방요법적 결과를 수득하기 위한 투약량 및 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 일반적으로, 예방요법적 용량은 질병의 초기 단계전이나 초기 단계에 대상체에 사용되기 때문에 예방요법적 유효량은 치료요법적 유효량보다 적은 양일 것이다.

투약 섭생은 원하는 최적 반응(예컨대, 치료요법적 또는 예방요법적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 볼러스 1정을 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특히, 투여 용이성과 투약량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투약 단위 형태는 치료하는 포유동물 대상체에 대하여 단일 투약량으로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 따라서, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정 치료 또는 예방요법적 효과, 및 (b) 개체의 민감도 치료에 있어서 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 제한에 따라 결정되고 직접 좌우된다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부의 치료요법적 또는 예방요법적 유효량에 대한 비제한의 예시적 범위는 0.1 내지 20mg/kg,더 바람직하게는 1 내지 10mg/kg 이다. 또한, 투약량 값은 개체의 필요 및 조성물 투약을 관리하거나 감독하는 자의 전문

가적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 투약량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아니다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 2의 IL-1R9 및 IL-1R9-Fc 및 서열번호 3 내지 6의 IL-18BP의 isoform a(IL-18BPa), IL-18BPa의 Fc(IL-18BPa-Fc),isoform c(IL-18BPc), IL-18BPc의 Fc(IL-18BPc-Fc)를 이용하여 실험하였다.

IL-33과 IL-18BP 및 IL-1R9이 상호작용을 하는 것을 본 발명을 통하여 알 수 있으므로 IL-33은 Th1 및 Th2 cytokine을 모두 regulation 함으로 Th1 및 Th2 관련 자가면역질환에 사용할 수 있다.

좀 더 구체적으로 설명하면, IL-18BP은 Th1 (rheumatoid arthritis, colitis, psoriasis) 및 Th2 (Asthma and atopic dermatitis) 양쪽 모두에 사용한다. 그 이유로, IL-33은 단독으로 작용하면 Th1 만일 IL-12, IL-2, IFN알파와 공동으로 작용하면 Th2 면역반응을 유도한다.

지금까지 IL-18BP의 보고는 IL-18이 유도하는 IFN 감마 억제만 중점적으로 다루고 있고 Th1 면역 억제 치료제로 등록되어 되어있고, 본 발명의 발명자가 관련되어 있다.

또한 IL-1R9의 경우 본 발명의 결과에서 보면 지금까지 orphan receptor로 ligand를 없는 것으로 알려져 있었으나, IL-33이 IL-1R9의 ligand이며, Fc-IL-1R9이 직접 IL-33에 binding을 하지는 못하나 co-receptor로 작용해서 IL-33에 의해서 유도되는 Th1 면역반응, 즉 IFN 감마 induction에 중요한 역할을 하는 것을 최초로 보고한 것이다.

따라서 IL-1R9의 기능을 억제하는 중화항체를 제조하여 IL-33의 Th1 면역반응을 특이적이고 선택적으로 억제하는데 활용될 수 있다.

또한 상기 Th1 관련 자가면역 질환은 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 건선, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증(예를 들면, 적혈구무형성증, 재생 불량성 빈혈 등), 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군, 전신홍반루푸스 등로부터 선택되는 것이 바람직하고,

상기 Th2 관련 자가면역 질환은 알러지 천식, 다년성 알러지 비염, 계절성 알러지 비염, 아토피 피부염, 접촉성 과민반응(접촉성 피부염 포함), 결막염, 특히 알러지 결막염, 호산구성 기관지염, 음식 알러지, 호산구성 위장염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 크론병, 비만세포증 그리고 과IgE 증후군(hyper IgE syndrom) 및 전신성 홍반성 루푸스와 같은 자가 면역질환, 건선, 여드름, 다발성 경화증,이식 거부반응, 재관류 손상, 만성 폐쇄성 폐질환, 류마티스 관절염, 건선 관절염 및 골관절염 등을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명자들은 추정적인 인터루킨(IL)-33 수용체 동정을 시도하였다. IL-33 친화 크로마토그래피는 신규한 IL-33 상호작용 단백질인 IL-1R9(IL-1 receptor accessory protein 2 (IL-1RAcPL2; IL-1R9) 및 IL-18BP(IL-18 binding protein)를 분리하였다. IL-33은 IL-1R9가 아니라 IL-18BP와 상호작용을 한다. 흥미롭게도, IL-18BP는 IFNγ 및 IL-8을 저해하는 반면에 항-IL-1R9는 선택적으로 IFNγ를 억제한다. 또한, mature IL-33는 IFNγ를 유도하지만 전구체 IL-33은 IFNγ을 유도하는데 실패한다. 이러한 결과는 병원균 및 염증 질환에 대한 숙주 방어에서 광범위한 스펙트럼의 IL-33 활성을 조사하는데 도움을 줄 것이다. 중요하게 그 동정된 신규 IL-33 수용체 관련 분자들인 IL-1R9(IL-1RAcPL2) 및 IL-18BP는 여러 세포 타입에서 IL-33의 생물학적 활성에 선택적으로 관여한다.

한편, IL-1R4 및 IL-1R3는 HMC-1 세포에서는 발현된 반면 인간 PBMCs는 IL-1R4 및 IL-1R9를 발현하고, 이것은 IFNγ 생성에 기여한다. 이 결과는 인간 PBMC에서 IL-33-유도된 IFNγ을 특이적으로 중화하는 anti-IL-1R9 항체로 증명되었다. 수용성 IL-18BP 및 IL-1R4는 특이적으로 IL-33에 결합하고(도 2) IL-33-유도된 사이토카인들을 억제하였다.

부연하면, anti-IL-1R9는 HMC-1 세포에서 IL-8 유도를 불럭할 수 없었으나(도 5a), PBMC에서는 특이적으로 IL-33-유도된 IFNγ를 억제하였다(도 5b). 이 결과는 다른 세포 타입에서 IL-33 수용체의 독특한 구성을 시사한다. 즉, HMC-1 세포에서 IL-33 수용체는 IL-1R4 및 IL-1R3으로 구성되고, PBMC에서 IL-33 수용체는 IL-1R4 및 IL-1R9으로 구성된다(도 5c).두 번째 체인의 IL-33 수용체인 IL-1R3 또는 IL-1R9은 IL-33/IL-1R4 precomplex 형성 후 리간드에 결합 친화도를 가진다(도5c). 다운 스트림 사이토카인을 유도하는 세포 막 상의 IL-33/수용체 복합체의 이벤트는 수용성 IL-33 수용체 및 결합 단백질에 의하여 방해된다(도5c, 오른쪽 패널)

여러 costimulatory 인자들의 존재에서 IL-33에 의한 IFNγ의 유도는 FcIL-1R4 및 FcIL-18BPa와 같은 조합된 두 IL-33 저해제에 의하여 충분하게 억제되었다(도 8).

본 발명자들은 IL-33-유도된 IFNγ가 IL-10에 의하여 억제되는지를 조사하였다. IFNγ 생성 세포군은 인간 PBMC 및 마우스 비장세포/림프절 세포 모두에서 현저하게 증가하였다(도 7). IL-12-유도된 IFNγ 생성 세포 군의 상승효과는 LPS의 것에 비하여 더 효과적이었다.

본 발명의 결과는 면역 반응에서 IL-33의 정확한 역할을 분석하는 중요한 실험적 도구가 될 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

IL-33 리간드-친화 크로마토그래피는 IL-1R9 및 IL-18BP을 분리함

Novick, D., et al. Immunity 10, 127-136 (1999)에 기재된 것과 같이 IL-33 리간드-친화 크로마토그래피를 제조하기 위하여 Mature 재조합 IL-33 단백질 (5mg)을 생산하였다. 수용성 IL-33 결합 단백질을 분리하기 위하여 농축된 인간 뇨를 IL-33 리간드-친화 컬럼에 적용하였다. 세척 후, 산성 용액-용출된 IL-33 결합 단백질을 웨스턴 블럿으로 조사하였다. 웨스턴 블럿 수행 전, 본 발명자들은 IL-1R9 (IL-1RAcPL2)가 IL-1R3(IL-1RAcP)와 높은 호모로지(35.3% identity)를 가지는 것을 야기하는 후보 수용체를 선택하기 위하여 IL-1R 계열과 비교하여 IL-33 수용체의 호모로지를 분석하였다. 따라서 본 발명자들은 항-IL-1R9 항체로 웨스턴 블럿을 수행하였다. 약 53kDa의 분자량을 가지는 밴드가 항-인간 IL-1R9 항체에 의하여 인지되었지만 대조군 레인에서는 그러하지 않았다(도 1a).IL-33의 생물학적 활성은 IL-18-유도된 Th1/Th2 사이토카인 모두와 매우 유사하므로 리간드-친화 크로마토그래피로부터 유래한 동일한 분획을 IL-18BP를 테스트하는데 사용하였다. IL-18BP의 예측된 분자량인 약 40kDa은 anti-IL-18BP 항체로 특이적으로 검출되었다(도 1b).유사한 실험을 친화 크로마토그래피로부터 용출된 분획에서 공지된 IL-33 수용체들이 존재하는지를 확인하기 위하여 수행하였다. 예측된 분자량의 뇨 수용성 IL-1R3(IL-1RAcP) 및 IL-1R4(ST2)이 검출되었고(도 1c/d) 그 결과는 기존 보고와 일치하였다(Smith, D.E., et al. Immunity 18, 87-96 (2003);Yanagisawa, K., et al. J Biochem 121, 95-103 (1997)).

IL-1 리간드 및 수용체/결합 단백질 사이의 특이적 상호작용 분석

본 발명자들은 IL-1 리간드와 수용체 사이의 특이적인 상호작용을 분석하기 위하여 Hong, K., et al. Hybridoma (Larchmt) 31, 99-104 (2012)에 기재된 것과 같이 Fc 융합 단백질로 인간 IL-1R9, IL-18BPa, IL-18BPc, 및 IL-1R4를 발현하였다. 재조합 FcIL-1R9은 FcIL-1R9 CHO stable 클론으로부터 유래한 혈청 없는 배지를 사용하여 Protein A 친화 크로마토그래피로 정제하였다.그러나 FcIL-1R9는 IL-33와 상호작용하는데 실패하였다.이 결과는 사이토카인 수용체의 두 번째 체인 단독으로는 리간드에 대한 결합 친화를 소유하지 않았기 때문에 IL-1R9이 신호 전달 체인으로서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 도 1b의 결과를 명확하게 하기 위하여 FcIL-18BPa 및 c로 면역침전 분석을 수행하였다. FcIL-18BPa 및 c 모두는 mature IL-33와 특이적으로 상호작용을 하였지만(도 2a) 단지 FcIL-18BPa는 전구체 IL-33에 결합친화를 가졌다(도 2b). IL-18BP가 IL-33에 결합하기 때문에 FcIL-1R4가 IL-18와 상호작용을 하는지를 조사하는 것은 흥미롭다.그러나 FcIL-1R4는 mature(도2c) 및 전구체 IL-18와 상호작용하는데 실패하였다(도 2d). IL-33와 FcIL-1R4 의 상호작용을 증명하기 위하여, 면역침전 분석을 반복하였다. FcIL-1R4는 특이적으로 mature IL-33와 상호작용을 하였지만 (도 2e) 전구체 IL-33와는 그러하지 않았다(도 2f).

IL-18BP isoform은 IL-33 활성을 선택적으로 억제

전구체 IL-33에 대한 IL-18BPa의 독특한 상호작용을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HMC-1 세포에서 IL-18BPa이 전구체 IL-33-유도된 IL-8 생산을 저해하는지를 테스트하였다. 인간 HMC-1 세포에서 IL-33-유도된 IL-8은 FcIL-18BPa에 의하여 저해되었지만(도 3a) IL-8 억제는 FcIL-18BPc에 의하여 얻어지지 않았다(도 3b). FcIL-18BPa 및 c 모두가 충분하게 용량 의존적으로 mature IL-33-유도된 IL-8을 억제한다(도 3c/d).FcIL-18BPa에 의한 IL-33-유도된 IL-8 생성의 저해는 FcIL-18BPc의 것에 비하여 더 효과적이다.FcIL-1R4 및 FcIL-18BP 모두는 mature IL-33와 상호작용하므로, 본 발명자들은 HMC-1 세포에서 mature IL-33-유도된 IL-8 생산에서 조합된 FcIL-1R4+FcIL-18BPa 또는 FcIL-1R4+FcIL-18BPc을 테스트하였다.IL-8은 조합된 저해제들에 의하여 효과적으로 억제되었고 조합된 저해제들의 용량 반응은 IL-18BP 단독보다 더 리니어하였다(도 3e/f).

IFNγ 유도에서 mature IL-33의 특징적인 생물학적 활성

도 3에 나타낸 것과 같이, HMC-1 세포에서 전구체 IL-33(100ng/ml) 자극된 IL-8 생성은 전구체 IL-33의 생물학적 활성이 mature IL-33(10ng/ml)의 것에 비하여 10/20배 덜 활성을 나타낸다.본 발명자들은 IL-12의 존재하에서 전구체 및 mature IL-33-유도된 IFNγ을 조사하였다. 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 마우스 비장세포를 IL-12의 존재하에서 전구체 및 mature IL-33으로 자극하였다. 도 3a/b의 결과와 다르게, 단지 mature IL-33 + IL-12만이 상승적으로 IFNγ를 유도한 반면 아주 높은 농도(1mg/ml)의 전구체 IL-33도 IFNγ를 유도하는데 실패하였다 (도 4a/b).

IL-1R9는 PBMC에서는 IL-33 수용체의 구성요소이지만 HMC-1 세포에서는 그러하지 아니함

IL-33 리간드 친화 크로마토그래피는 희귀 수용체 IL-1R9 (IL-1RAcPL2)를 분리하였지만(도 1a), 재조합 FcIL-1R9는 전구체 및 mature IL-33 모두와 상호작용할 수 없었다.이 결과는 아마 IL-1R9이 리간드와 직접적인 결합 친화도를 가지지 않는 신호 전달 체인으로 작용한다는 것을 시사한다. 따라서 본 발명자들은 IL-1R9이 IL-33 생물학적 활성에 어떻게 관여하는지를 이해하기 위하여 anti-IL-1R9 및 FcIL-1R4로 IL-33 분석을 수행하였다. Mature IL-33는 인간 HMC-1에서 IL-8 생산을 현저하게 증가시켰다(도 5a). IL-8의 유도는 FcIL-1R4에 의하여 특이적으로 억제되었지만 anti-IL-1R9 및 대조군 anti-IL-1R8은 IL-33 활성을 억제하지 못하였다(도 5a). 다음, 본 발명자들은 IL-12의 존재에서 IFNγ를 생산하는 인간 PBMC로 IL-33 분석을 수행하였다. 흥미롭게도, anti-IL-1R9는 특이적으로 IFNγ 생성을 억제하였지만, 대조군 anti-IL-1R8 항체로는 억제를 얻지 못하였다(도 5b). 이 데이터를 설명하기 위하여, HMC-1 및 PBMC에서 IL-33 수용체 구성성분의 차별적인 발현을 묘사하였다(도5c).IL-33 저해 에세이는 HMC-1은 IL-1R4(ST2) 및 IL-1R3(IL-1RAcP)를 발현하는 반면에 PBMC는 IL-1R4(ST2) 및 IL-1R9(IL-1RAcPL2)를 발현하는 것을 시사한다. IL-33/IL-1R4 precomplex는 HMC-1에서 IL-1R3를 리쿠르트하거나 PBMC에서 IL-1R9를 리쿠르트한다(도 5c, 좌에서 우측 패널로).IL-33/IL-18BP 및 IL-33/sIL-1R4와 같은 IL-33 저해 복합체는 순환계에 존재하고 세포 막 상에 그들의 수용체에 IL-33 접근을 저해한다(도 5c,우측 패널).

여러 IL-33 저해제에 의한 IFNγ의 억제

수용성 IL-33 수용체 및 결합 단백질의 저해 효과를 조사하기 전에, 본 발명자들은 IL-33 및 IL-18 사이의 상승적인 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 IL-1 계열 리간드 사이의 가능한 상승효과를 평가하기 위하여 IL-12+IL-18, IL-12+IL-33, 또는 IL-12+IL-18+IL-33의 다른 조합으로 IFNγ를 유도하였다. IL-12 존재 하에서 IL-18 또는 IL-33은 IFNγ 생성을 상승시키고 이것은 IL-12+IL-18+IL-33 자극에 의하여 더욱 증가하였다 (도 6a). IL-18 plus IL-33는 추가적인 효과를 나타내었다. IFNγ의 억제는 단일 또는 둘 또는 세 저해제의 조합으로 테스트하였다. FcIL-1R4 뿐만 아니라 FcIL-18BPa 및 c는 IL-18- 및 IL-33- 유도된 IFNγ를 특이적으로 억제하였지만 FcIL-1R4는 IL-18-유도된 IFNγ ( "＃" 심벌로 표시된)에 대한 효과는 없었고 이 결과는 면역 침전 에세이와 일치하였다(도 2c/d). 유사한 억제가 둘 또는 셋으로 조합된 저해제로 얻어졌고 그 저해는 FcIL18BPa 또는 FcIL18BPc와 조합된 FcIL-1R4에서 현저하였다(도 6c).

IL-33 자극 + costimulatory factor에 의한 IFNγ 생성 세포의 FACS 분석

LPS는 IL-18-유도된 IFNγ에서 costimulatory 인자로 사용되기 때문에 IL-12, IL-33, 및 LPS의 자극 후 인간 PBMC 및 마우스 비장세포에서 IFNγ 생성 세포를 측정하였다. IL-4 및 IFNγ 생성 세포를 도 7에 나타낸 것과 같이 자극 24시간 후 FACS 분석으로 조사하였다. 인간 PBMC에서, IL-12+IL-33는 현저하게 IFNγ 생성 세포의 수를 증가시켰지만 IL-4 생성 세포는 검출되지 않았다(도 7a).IL-33+LPS에 의한 IFNγ 생성 세포의 증가는 IL-33+IL-12의 것에 비하여 더 약하였다. 동일한 실험을 마우스 비장 세포(도 7b) 및 림프절 세포(도 7c)로 반복하였다. 그 결과는 인간 PBMC와 매우 유사하였다 . 본 발명자들은 배양된 상등액에서 IFNγ 생성을 측정하여 FACS 분석을 증명하였고, LPS-유도된 IFNγ는 IL-12의 것보다 두배 덜 하였다.

여러 costimulatory 인자의 존재에서 IL-33-유도된 IFNγ는 IL-33 저해제들에 의하여 파괴됨

IL-33-유도된 IFNγ에 대한 costimulatory 인자의 효과를 테스트하기 위하여, 인간 PBMC 및 마우스 비장세포를 여러 costimuli의 존재하에서 mature IL-33로 처리하였다(도 8a/b). IFNγ 생성에 대한 상승 효과는 IL-2, IL-12 및 IFNa로는 얻어졌지만, TNFα로는 얻지 못하였다. IL-12는 인간 PBMC 및 마우스 비장세포 분석에서 가장 강력한 costimulatory 인자이었다 (도 8a/b). 본 발명자들은 IL-33-유도된 IFNγ에 대한 IL-33 저해 분자들(FcIL-18BPa + FcIL-1R4)의 효과를 조사하였고 이 조합은 IFNγ의 가장 큰 억제를 제공하기 때문에 선택하였다(도 3e/f 및 6c). 두 IL-33 저해제의 조합은 인간 PBMC 및 마우스 비장세포에서 IL-33-유도된 IFNγ를 선택적으로 억제하였다(도 8a/b).

IFNγ 생성을 상승적으로 증가시키는 IL-33 plus IL-12의 신호 전달 규명

본 발명자들은 먼저 여러 시간 경과에서 STAT4 인산화를 조사하고 STAT4 인산화를 IL-12 자극 36시간 후에 관찰하였다 (도 9a, 왼쪽 패널에서 lane 5). IL-33의 동시처리는 자극 36시간 후 STAT4 인산화를 더 증가시켰으나(도 9a, 중간 패널의 lane 4) IL-18 동시 처리는 IL-12 단독과 비교하여 STAT4의 것을 증가시키지 않았다(도9a,오른쪽 패널).다음 본 발명자들은 NF-kB 인산화를 조사하였고 STAT4와 다르게, NF-kB는 IL-12 자극 30분 후에 충분하게 활성화하였지만 NF-kB의 인산화는 4시간에 사라졌다(도 9a, 왼쪽 패널에서 line 2). 흥미롭게도, IL-33 또는 IL-18의 동시처리는 4시간에 NF-kB의 최고 활성화를 이동시켰고(도 9a, 중앙 및 우측 패널에서 ine 2) 36시간까지 유지되었다. 유사하게 p38 mitogen-활성화된 protein kinase(p38MAPK) 및 p44/42 mitogen-활성화된 protein kinase(p44/42MAPK) 인산화를 조사하였다(도 9a,line3 및 4). 인간 PBMC에서 p44/42MAPK의 인산화는 덜 현저하게 관찰되었지만 p38MAPK는 이들 자극에 의하여 활성화되지 않았다. 또 FcIL-18BPa, anti-IL-1R9, 또는 FcIL-1R4 및 이들 저해제의 여러 조합의 신호전달 효과를 자극 4 또는 36 시간 후에 테스트하였다. NF-kB의 인산화를 적어도 두 조합된 저해제에 의하여 억제된 반면 STAT4 활성화는 FcIL-1R4가 4시간 자극에서 첨가된 곳에서 증가하였다(도 9b,line 1 및 2). 다른 두 경로는 영향이 없었다(도 9b,line 3 및 4). 궁극적으로, 자극 36시간에 여러 조합된 저해제들은 p38MAPK를 포함하는 STAT4 및 NF-kB 인산화를 현저하게 파괴한 반면(도 9c,line 1 및 2) 조합된 저해제들은 FcIL-1R4 단독을 포함하는 p44/42MAPK 인산화를 증가시켰다(도 9c,line 3 및 4).

T-헬퍼(Th) T-세포 서브타입 면역 반응은 독특한 서브셋 분화 및 증식을 조절하는 특정 사이토카인에 의하여 조절된다. 불균형화된 사이토카인 생성이 여러 면역 질환을 야기하기 때문에 사이토카인의 조절을 이해하는 것은 중요하다. 본 발명은 Th1/Th2 면역 반응의 합류 에지(merging edge)는 IL-1 계열 사이토카인 및 수용체 관련 분자들에 의하여 타이트하게 조절된다는 것을 시사한다. 본 발명의 IFNγ 생성에서 mature IL-33의 생물학적 활성을 포함하는 신규한 IL-33 수용체 및 결합 단백질은 Th1/Th2 면역 반응과 관련된 중요한 면역 조절을 조사하는데 유용할 것이다.

또한 IL-33과 IL-18BP 및 IL-1R9이 상호작용을 하는 것을 본 발명을 통하여 알 수 있으므로 IL-33은 Th1 및 Th2 cytokine을 모두 regulation 함으로 Th1 및 Th2 관련 자가면역질환에 사용할 수 있다. 상기 Th1 관련 자가면역 질환은 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 건선, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증(예를 들면, 적혈구무형성증, 재생 불량성 빈혈 등), 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군, 전신홍반루푸스로부터 선택되는 것이 바람직하고,

상기 Th2 관련 자가면역 질환은 알러지 천식, 다년성 알러지 비염, 계절성 알러지 비염, 아토피 피부염, 접촉성 과민반응(접촉성 피부염 포함), 결막염, 특히 알러지 결막염, 호산구성 기관지염, 음식 알러지, 호산구성 위장염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 크론병, 비만세포증 그리고 과IgE 증후군(hyper IgE syndrom) 및 전신성 홍반성 루푸스와 같은 자가 면역질환, 건선, 여드름, 다발성 경화증,이식 거부반응, 재관류 손상, 만성 폐쇄성 폐질환, 류마티스 관절염, 건선 관절염 및 골관절염등을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

도 1은 IL-33 리간드 친화 크로마토그래피로부터 분리한 수용성 IL-33 결합 단백질의 웨스턴 블럿을 나타냄. 인간 IL-33 리간드-친화 크로마토그래피는 뇨 IL-33 상호작용 단백질을 분리하고 웨스턴 블럿에 의하여 검출하였다. 네 분획을 IL-33 리간드 친화 컬럼으로부터 용출하였다. (a) Anti-IL-1R9 항체는 뇨 수용성 IL-1R9를 인지함. 약 53kDa의 분자량을 가지는 밴드가 용출된 분획에서 검출되었다. mature IL-1R9 세포외 도메인(340 폴리펩타이드)의 이론적인 분자량은 39kDa이다. 예측된 네 N-링크된 glycosylation 부위(트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr, X는 불특정 아미노산일 수 있음)는 뇨 IL-1R9의 부갖거인 분쟈량을 증가시킨다. 특정 항체를 가지는 웨스턴 블럿은 뇨 (b)IL-18BP,(c)IL-1R4 또는 (d)IL-1R3을 인식한다. 데이터는 세 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 2는 전구체 및 mature IL-33와 Fc 수용체 및 결합 단백질의 특이적인 상호작용을 나타내는 그림. (a)Mature 또는 (b) 전구체 IL-33을 각각 재조합 FcIL-18BPa 및 c isoform으로 면역침전하였다. 유사하게 재조합 FcIL-1R4를 (c) Mature IL-18,(d) 전구체 IL-18, (e) Mature IL-33, 또는 (f) 전구체 IL-33의 면역침전에 사용하였다. 각 리간드(100ng)를 얼음에서 30분 동안 PBS 내의 Fc 융합 단백질(500ng)과 혼합하였다. 리간드와 Fc 융합 단백질의 복합체를 protein A 비드(10ml)로 침전시켰다. 그 혼합된 구성요소는 상단에 나타내었다. 데이터는 네 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 3은 HMC-1 세포에서 전구체 또는 mature IL-33-유도된 IL-18의 저해를 나타낸 그림. (a 및 b) 전구체 IL-33에 의한 IL-8 생성의 유도는 용량의존적으로 FcIL-18BPa에 의하여 억제되었지만 FcIL-18BPc는 억제하지 못하였다. (c 및 d) 두 FcIL-18BP 모두는 mature IL-33-유도된 IL-8을 충분하게 억제하였다. (e 및 f) FcIL-18BPa 또는 FcIL-18BPc와 조합된 FcIL-1R4는 mature IL-33-유도된 IL-18 생성을 억제하였고 조합된 저해제의 용량 반응성은 IL-18BP 단독에 비하여 더 리니어하였다. Fc 융합 저해제의 농도는 그래프의 하단에 나타내고 몰 비로 계산됨. 데이터는 세 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 4는 mature IL-33의 특징적인 생물학적 활을 나타냄. (a) 전구체 및 mature 인간 IL-33을 IL-12 존재 하에서 인간 PBMC를 처리하는데 사용하였다. 인간 IFNγ 유도의 상승 효과는 용량 의존적으로 관찰되었지만 높은 농도의 전구체 IL-33는 IFNγ를 유도하지 못하였다. (b) 유사한 실험을 마우스 비장세포로 수행하였고 그 결과는 인간 PBMC와 일치하였다. 각 사이토카인의 농도는 그래프 하단에 기재되었다.데이터는 다섯 번의 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 5는 IL-33 수용체 구성요소의 차별적인 발현이 세포 타입에 의존한다는 것을 나타낸 그림. (a)인간 HMC-1 세포를 mature IL-33(20ng/ml) 단독 또는 FcIL-1R4(0.5mg/ml)와 혼합된 IL-33로 자극하였다. 항체 중화를 위하여, mature IL-33를 anti-IL-1R9 (1mg/ml) 및 대조군 anti-IL-1R8의 전처리 1시간 후에 첨가하였다. (b) 유사하게, 인간 PBMC를 IL-12 존재 하에서 mature IL-33로 자극하였다. HMC-1 세포 에세이와는 대조적으로, mature IL-33-유도된 IFNγ 생성은 anti-IL-1R9에 의하여 완전하게 억제되었다. anti-IL-1R9의 저해 활성은 FcIL-1R4에 비하여 더 효과적인 반면 대조군 anti-IL-1R8는 IFNγ를 억제하지 못하였다. 평균±SEM **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (N = 3/그룹). 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 하나를 나타냄. (c)IL-33 수용체 구성요소의 차별적인 발현을 HMC-1 및 PBMC에서 묘사함 (왼쪽 패널). 그것의 리간드에 IL-33 수용체 결합의 모드를 서술함(왼쪽에서 오른쪽 패널).
도 6은 IL-18 +IL-33에 의한 IFNγ 유도 및 Fc-융합된 IL-33R 저해 단백질들에 의한 IFNγ 억제의 부가적 효과를 나타낸 그림. (a)IL-12+IL-18 또는 IL-12+IL-33는 IFNγ의 유도를 상승하는 반면 IL-33 존재 하에서 IL-12+IL-18는 IFNγ유도에서 부가적인 효과를 나타내었다. (b)IL-18BPa, IL-18BPc, 및 FcIL-1R4는 특이적으로 IFNγ 생성을 감소시켰지만, FcIL-1R4는 IL-18-유도된 IFNγ을 억제하는데 실패하였다(#로 표시됨). (c)둘 또는 셋 Fc-융합된 IL-33R 저해 단백질들은 단일 저해제와 비교하여 IFNγ 생성을 충분하게 억제하였다. 평균±SEM 인간 IFNγ; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (N = 3/그룹). 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 7은 costimulatory 인자들에 의한 IFNγ 생성 세포 군의 증가를 나타낸 그림. (a)인간 PBMCs,(b) 마우스 비장세포 및 (c) 림프 절 세포를 IL-33, LPS, IL-12, IL-12+IL-33, 또는 LPS+IL-33로 자극한 후 유동 세포 분석법로 분석하였다. IL-4 및 IFNγ의 세포내 염색은 IL-12+IL-33가 IFNγ 생성 세포의 군을 증가시키지만 IL-4의 것은 그러하지 못한다는 것을 나타냄. LPS에 의하여 얻어진 증가된 IFNγ 생성 세포 군은 인간 및 마우스 세포 모두에서 IL-12의 것에 비하여 덜 현저하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 8은 여러 costimulatory 인자들에 의하여 유도된 IFNγ를 저해하는 조합된 IL-33R 관련 저해 분자들을 나타낸 그림. (a)IL-2+IL-33,IL-12+IL-33,IFNa+IL-33, 또는 TNFα+IL-33로 인간 PBMCs 및 (b) 마우스 비장세포를 자극하기 전에, 그 자극원을 FcIL-1R4+FcIL-18BPa로 상온에서 30분간 배양한 후 세포에 처리하였다. 가장 현저한 IFNγ의 유도가 IL-12+IL-33에서 관찰되었다. IL-2 및 IFNa는 또한 IFNγ 생성을 덜 현저하게 상승시켰지만 TNFα는 IFNγ를 생성하지 못하였다. 여러 costimulatory 인자의 존재 하에서 FcIL-1R4+FcIL-18BPa는 IL-33-유도된 IFNγ 생성을 효과적으로 억제하였다.평균±SEM 인간 IFNγ; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (N = 4 per group). 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.
도 9는 IL-12+IL-33 활성화된 신호 분자의 웨스턴 블럿을 나타낸 그림. (a)PhosphSTAT4,NF-kB, p38MAPK, 및 p44/42MAPK를 여러 시간 지점에서 IL-2, IL-12+IL-33, 또는 IL-12+IL-18의 자극으로 검출하였다. STAT4의 인산화는 자극 4시간 후에 관찰되고 36시간까지 지속되었다. 증가된 phosphSTAT4는 IL-12 단독에 비교하여 IL-33에 의하여 지속되었다. PhosphNF-kB 활성화는 IL-12 자극 30분 후에 검출되었고 그 활성화는 IL-33 및 IL-18에 의하여 유지되었다. Phosphp38MAPK 및 p44/42MAPK 활성화는 IFNγ 생성과 상관관계가 없었다. 동일한 신호전달 분자들을 여러 L-33R 관련된 저해 분자들로 조사하였다. (b) 자극 4 시간에서, 단지 phosphNF-kB는 두 조합된 저해 분자들에 의하여 감소한 반면 phosphSTAT4는 FcIL-1R4를 첨가한 곳에서 증가하였다. (c) 36 시간 자극에서,둘 또는 세 조합된 IL-33R 관련 저해제들은 phosphSTAT4를 충분하게 저해한 반면 단일 저해제는 그것을 억제하지 못하였다. PhosphNF-kB는 모든 저해제들에 의하여 억제되었지만 Phosphp44/42MAPK는 FcIL-1R4에 의하여 증가하였다. 에세이에 사용된 자극제 및 저해제는 상단에 기재되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 하나를 나타냄.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: IL-33 리간드-친화 크로마토그래피

인간 mature IL-33 (5mg)를 제조업자(Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)의 지시에 따라서 Affigel-15 비드(1ml 부피)에 커플링하여서 고정화하였다. 500배 농축된 1 배치의 250ml 조(crude) 뇨 단백질을 밤새 4℃에서 그 리간드-친화 크로마토그래피에 넘기었다. 그 IL-33 리간드-친화 컬럼을 0.5M 염화 나트륨, pH8를 포함한 500ml의 인산 버퍼로 세척하였다. 결합 단백질들을 25mM 구연산, pH 2.2을 포함한 1ml 부피에서 용출한 후, 그 용출된 분획을 즉시 2M glycine으로 중화하였다.

실시예 2: 웨스턴 블럿

IL-33 리간드-친화 정제된 수용성 단백질로부터 IL-33 수용체 관련 분자들의 유래한 검출을 위하여, 20ml의 용출된 분획들을 10% SDS-PAGE에 로딩하였다. Anti-IL-18BP (YbdYbiotech, Seoul Korea), anti-IL-1R3, IL-1R4, 및 anti-IL-1R9 항체(R&D Systems, Minneapolis MN)를 구입하여 웨스턴 블럿에 사용하였다. Peroxidase-부착된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)를 Supex (Neuronex, Seoul Korea) 및 LAS-4000 이미징 디바이스(Fujifilm, Japan)를 사용한 블럿을 디벨로프하는데 사용하였다. 유사하게, 웨스턴 블럿을 anti-IL-33 및 IL-18 항체(YbdYbiotech)로 수행하였다.

신호 분자들(NF-kB, p38MAPK, 및 p44/42MAPK)의 인산화를 검출하기 위하여, 인간 PBMC 세포들을 여러 시간 지점에서 IL-33 저해제들의 존재 또는 부존재 하에서 여러 조합된 사이토카인 자극제로 자극하였다. 세포들을 kinase 파쇄 버퍼(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)로 파쇄한 후 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 그 샘플들을 nitrocellulose 막으로 옮기고. 그 막들을 3% BSA/TBST (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에서 블록킹하였다. 그 막들을 anti-phosph-NF-kB, anti-phosph-p38MAPK, 또는 anti-phosph-p44/42MAPK (Cell Signaling Technology)으로 먼저 프로브한 후 anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology)으로 최종적으로 표준화하였다.

실시예 3: 재조합 단백질들의 발현

재조합 전구체 및 mature IL-33 단백질들을 E.coli, rosetta 세포에서 발현하였고 그 재조합 단백질의 N-말단에 His6-tag를 사용하여 TALON 친화 크로마토그래피(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 정제하였다. 그 TALON 친화-정제된 단백질들을 고 성능 액체 크로마토그래피(GE Healthcare,Waukesha,WI)으로 수행하였다.그 두 단계 정제된 재조합 단백질을 제조업자의 지시에 따라서 LAL 방법(Cape cod, East Falmouth, MA)을 사용하여 레벨(0.3EU/ mg 재조합 단백질 이하)을 테스트한 후 실험에 사용하였다.

실시예 4: 세포 배양 및 바이오에세이

HMC-1 세포를 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구입하여 ATCC의 지시에 따라 유지하였다. HMC-1 세포를 10% FBS로 부유된 Iscove's modified Dulbecco's 배지(IMDM)에서 배양하였다. 바이오에세이를 96-웰 플레이트에서 수행하였다. HMC-1 세포들(1 10⁵/ml)을 에세이 전에 각 웰에 시딩하였다. 다른 여러 IL-33 수용체 관련 저해제들과 여러 자극제들을 그 세포들에 첨가하였다. 그 플레이트를 18시간 동안 세포 배양기에 위치하고 상등액에서 사이토카인들을 측정하였다.

실시예 5: 1차 인간 및 마우스 세포에서 바이오에세이

인간 PBMCs들을 Ficoll-Paque™ PLUS (GE healthcare Life Sciences, NJ, USA)에서 혈액의 밀도 원심분리법으로 분리하였다. PBMCs를 식염수(0.9% Sodium chloride)로 2회 세척한 후 배양 배지(RPMI 1640)로 재부유하였다. 마우스 비장세포를 암컷 C57BL/6 마우스로부터 얻어서 RBC 파쇄 버퍼(Sigma, St. Louis, MO)로 파쇄하여 적혈구를 제거하였다. 그 세포들을 배양 배지(RPMI 1640)로 2회 세척하고 동일한 배지에 재부유하였다. PBMC (5 x 10⁵) 및 마우스 비장세포(1 x 10⁶)를 100ml 부피에서 96-웰 플레이트에 시딩한 후 IL-33 수용체 관련 저해제들의 존재 또는 부존재 하에서 100 ml의 배양 배지(대조군) 또는 100ml의 여러 자극제로 배양하였다. costimulatory 인자인, IL-2, IL-12 (Peprotech, Rocky Hill, NJ), IFNa2 (LG biotech, Seoul Korea), TNFα (YbdYbiotech)를 1차 세포를 처리하는데 사용하였다. 18 시간 자극 후, 그 세포 배양 상등액을 사이토카인 측정에 사용하였다.

실시예 6: 유동 세포 분석법

마우스 비장세포 및 인간 PBMC를 상기와 같이 얻어서 유동 세포분석에 사용하였다. 자극을 위해, 비장세포를 1ml 배지에서 24-웰 플레이트의 2 x 10⁶세포/웰에서 배양하고 IL-12(1ng/ml), IL-18(20ng/ml; YbdYbiotech), IL-33(20ng/ml) 및 LPS(1mg/ml; Sigma) 단독 또는 기재된 조합으로 자극하였다. 18 시간 자극 후, GolgiStop (BD Bioscience, San Jose, CA)를 사이토카인 축적을 위하여 그 세포들에 첨가하였다. 6시간 후, 그 세포들을 기재된 것과 같이 특정한 항체(eBioscience, San Diego, CA)로 세포내 IFNγ 및 IL-4를 위하여 얼음에서 염색하였다. 전체적으로, 5 x 10⁴ 이벤트를 FACSCalibur에서 수집하여서 CellQuest 소프트웨어(BDBiosciences)를 사용하여 분석하였다. PBMCs(2x10⁶)를 500ml 부피에서 24-웰 플레이트에 시딩하고, 마우스 비장세포와 동일하게 여러 자극제로 배양하였다. 24시간 배양 후, 그 세포들을 FACS 분석을 위하여 염색하였다.

실시예 7: 사이토카인 레벨의 측정

IL-8 및 IFNγ ELISA 키트를 R&D systems (R&D system)로부터 구입하였다. 사이토카인 레벨을 제조업자의 지시에 따라서 샌드위치 ELISA에 의하여 배양 상등액(100ml)에서 측정하였다.

본 발명의 데이터들은 평균±SEM로 나타내었다. 편차의 통계적 유효성을 unpaired, two-tailed Student's 테스트로 분석하였다. p < 0.05의 값들을 통계적으로 유의성이 있다고 평가하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A novel IL-33 co-receptor and a binding protein Composition and use of the same <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Pro Pro Phe Leu Leu Ala Leu Val Val Cys Ser Val Val Ser 1 5 10 15 Thr Asn Leu Lys Met Val Ser Lys Arg Asn Ser Val Asp Gly Cys Ile 20 25 30 Asp Trp Ser Val Asp Leu Lys Thr Tyr Met Ala Leu Ala Gly Glu Pro 35 40 45 Val Arg Val Lys Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Tyr Ile Arg Thr Asn Tyr 50 55 60 Ser Thr Ala Gln Ser Thr Gly Leu Arg Leu Met Trp Tyr Lys Asn Lys 65 70 75 80 Gly Asp Leu Glu Glu Pro Ile Ile Phe Ser Glu Val Arg Met Ser Lys 85 90 95 Glu Glu Asp Ser Ile Trp Phe His Ser Ala Glu Ala Gln Asp Ser Gly 100 105 110 Phe Tyr Thr Cys Val Leu Arg Asn Ser Thr Tyr Cys Met Lys Val Ser 115 120 125 Met Ser Leu Thr Val Ala Glu Asn Glu Ser Gly Leu Cys Tyr Asn Ser 130 135 140 Arg Ile Arg Tyr Leu Glu Lys Ser Glu Val Thr Lys Arg Lys Glu Ile 145 150 155 160 Ser Cys Pro Asp Met Asp Asp Phe Lys Lys Ser Asp Gln Glu Pro Asp 165 170 175 Val Val Trp Tyr Lys Glu Cys Lys Pro Lys Met Trp Arg Ser Ile Ile 180 185 190 Ile Gln Lys Gly Asn Ala Leu Leu Ile Gln Glu Val Gln Glu Glu Asp 195 200 205 Gly Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Leu Lys Tyr Glu Gly Lys Leu Val Arg 210 215 220 Arg Thr Thr Glu Leu Lys Val Thr Ala Leu Leu Thr Asp Lys Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Leu Phe Pro Met Glu Asn Gln Pro Ser Val Ile Asp Val Gln 245 250 255 Leu Gly Lys Pro Leu Asn Ile Pro Cys Lys Ala Phe Phe Gly Phe Ser 260 265 270 Gly Glu Ser Gly Pro Met Ile Tyr Trp Met Lys Gly Glu Lys Phe Ile 275 280 285 Glu Glu Leu Ala Gly His Ile Arg Glu Gly Glu Ile Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Glu His Leu Gly Glu Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Ile Phe Asp Ser 305 310 315 320 Val Val Glu Ala Asp Leu Ala Asn Tyr Thr Cys His Val Glu Asn Arg 325 330 335 Asn Gly Arg Lys His Ala Ser Val Leu Leu Arg Lys Lys Asp Leu Ile 340 345 350 Tyr Lys Ile Glu Leu Ala Gly Gly Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu 355 360 365 Val Leu Leu Val Val Ile Tyr Lys Cys Tyr Asn Ile Glu Leu Met Leu 370 375 380 Phe Tyr Arg Gln His Phe Gly Ala Asp Glu Thr Asn Asp Asp Asn Lys 385 390 395 400 Glu Tyr Asp Ala Tyr Leu Ser Tyr Thr Lys Val Asp Gln Asp Thr Leu 405 410 415 Asp Cys Asp Asn Pro Glu Glu Glu Gln Phe Ala Leu Glu Val Leu Pro 420 425 430 Asp Val Leu Glu Lys His Tyr Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Pro Glu Arg 435 440 445 Asp Leu Ile Pro Ser Gly Thr Tyr Met Glu Asp Leu Thr Arg Tyr Val 450 455 460 Glu Gln Ser Arg Arg Leu Ile Ile Val Leu Thr Pro Asp Tyr Ile Leu 465 470 475 480 Arg Arg Gly Trp Ser Ile Phe Glu Leu Glu Ser Arg Leu His Asn Met 485 490 495 Leu Val Ser Gly Glu Ile Lys Val Ile Leu Ile Glu Cys Thr Glu Leu 500 505 510 Lys Gly Lys Val Asn Cys Gln Glu Val Glu Ser Leu Lys Arg Ser Ile 515 520 525 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Trp Lys Gly Ser Lys Ser Ser Lys Leu 530 535 540 Asn Ser Lys Phe Trp Lys His Leu Val Tyr Glu Met Pro Ile Lys Lys 545 550 555 560 Lys Glu Met Leu Pro Arg Cys His Val Leu Asp Ser Ala Glu Gln Gly 565 570 575 Leu Phe Gly Glu Leu Gln Pro Ile Pro Ser Ile Ala Met Thr Ser Thr 580 585 590 Ser Ala Thr Leu Val Ser Ser Gln Ala Asp Leu Pro Glu Phe His Pro 595 600 605 Ser Asp Ser Met Gln Ile Arg His Cys Cys Arg Gly Tyr Lys His Glu 610 615 620 Ile Pro Ala Thr Thr Leu Pro Val Pro Ser Leu Gly Asn His His Thr 625 630 635 640 Tyr Cys Asn Leu Pro Leu Thr Leu Leu Asn Gly Gln Leu Pro Leu Asn 645 650 655 Asn Thr Leu Lys Asp Thr Gln Glu Phe His Arg Asn Ser Ser Leu Leu 660 665 670 Pro Leu Ser Ser Lys Glu Leu Ser Phe Thr Ser Asp Ile Trp 675 680 685 <210> 2 <211> 590 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1R9-Fc <400> 2 Met Lys Pro Pro Phe Leu Leu Ala Leu Val Val Cys Ser Val Val Ser 1 5 10 15 Thr Asn Leu Lys Met Val Ser Lys Arg Asn Ser Val Asp Gly Cys Ile 20 25 30 Asp Trp Ser Val Asp Leu Lys Thr Tyr Met Ala Leu Ala Gly Glu Pro 35 40 45 Val Arg Val Lys Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Tyr Ile Arg Thr Asn Tyr 50 55 60 Ser Thr Ala Gln Ser Thr Gly Leu Arg Leu Met Trp Tyr Lys Asn Lys 65 70 75 80 Gly Asp Leu Glu Glu Pro Ile Ile Phe Ser Glu Val Arg Met Ser Lys 85 90 95 Glu Glu Asp Ser Ile Trp Phe His Ser Ala Glu Ala Gln Asp Ser Gly 100 105 110 Phe Tyr Thr Cys Val Leu Arg Asn Ser Thr Tyr Cys Met Lys Val Ser 115 120 125 Met Ser Leu Thr Val Ala Glu Asn Glu Ser Gly Leu Cys Tyr Asn Ser 130 135 140 Arg Ile Arg Tyr Leu Glu Lys Ser Glu Val Thr Lys Arg Lys Glu Ile 145 150 155 160 Ser Cys Pro Asp Met Asp Asp Phe Lys Lys Ser Asp Gln Glu Pro Asp 165 170 175 Val Val Trp Tyr Lys Glu Cys Lys Pro Lys Met Trp Arg Ser Ile Ile 180 185 190 Ile Gln Lys Gly Asn Ala Leu Leu Ile Gln Glu Val Gln Glu Glu Asp 195 200 205 Gly Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Leu Lys Tyr Glu Gly Lys Leu Val Arg 210 215 220 Arg Thr Thr Glu Leu Lys Val Thr Ala Leu Leu Thr Asp Lys Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Leu Phe Pro Met Glu Asn Gln Pro Ser Val Ile Asp Val Gln 245 250 255 Leu Gly Lys Pro Leu Asn Ile Pro Cys Lys Ala Phe Phe Gly Phe Ser 260 265 270 Gly Glu Ser Gly Pro Met Ile Tyr Trp Met Lys Gly Glu Lys Phe Ile 275 280 285 Glu Glu Leu Ala Gly His Ile Arg Glu Gly Glu Ile Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Glu His Leu Gly Glu Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Ile Phe Asp Ser 305 310 315 320 Val Val Glu Ala Asp Leu Ala Asn Tyr Thr Cys His Val Glu Asn Arg 325 330 335 Asn Gly Arg Lys His Ala Ser Val Leu Leu Arg Lys Lys Asp Leu Ile 340 345 350 Tyr Lys Ile Glu Thr Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 355 360 365 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 370 375 380 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 385 390 395 400 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 405 410 415 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 420 425 430 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 435 440 445 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 450 455 460 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 465 470 475 480 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 485 490 495 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 500 505 510 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 515 520 525 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 530 535 540 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 545 550 555 560 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 565 570 575 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 580 585 590 <210> 3 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Met Arg His Asn Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Cys Ala His Val Val Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Pro 20 25 30 Val Ser Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys 35 40 45 Asp Pro Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys Gln Cys 50 55 60 Pro Ala Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Asn Gly 65 70 75 80 Thr Leu Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser 85 90 95 Ile Leu Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly 100 105 110 Arg Leu Trp Glu Gly Ser Thr Ser 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Leu Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly 100 105 110 Arg Leu Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Thr 115 120 125 Gln Leu Cys Lys Ala Leu Val Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu His 130 135 140 Ser Thr Asn Phe Ser Cys Val Leu Val Asp Pro Glu Gln Val Val Gln 145 150 155 160 Arg His Val Val Leu Ala Gln Leu Trp Val Arg Ser Pro Arg Arg Gly 165 170 175 Leu Gln Glu Gln Glu Glu Leu Cys Phe His Met Trp Gly Gly Lys Gly 180 185 190 Gly Leu Cys Gln Ser Ser Leu Thr Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 195 200 205 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 210 215 220 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 225 230 235 240 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 245 250 255 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 260 265 270 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 275 280 285 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 290 295 300 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 325 330 335 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 340 345 350 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 355 360 365 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 370 375 380 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 385 390 395 400 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 405 410 415 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 420 425 430 Lys <210> 7 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys 1 5 10 15 Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg 35 40 45 Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr 50 55 60 Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu 65 70 75 80 Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe 85 90 95 Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser 100 105 110 Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr 115 120 125 Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu 130 135 140 Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly 165 170 175 Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe 180 185 190 Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys 195 200 205 Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His 210 215 220 Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile 225 230 235 240 Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu 245 250 255 Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 260 265 270 <210> 8 <211> 154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val 100 105 110 Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150

Claims (9)

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5. IL-1 수용체 부속 단백질 2 (IL-1R9) 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 인터루킨(IL)-33 관련 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물로,
   상기 IL-1 수용체 부속 단백질 2 (IL-1R9)는 서열번호 1 내지 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 인터루킨(IL)-33 관련 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아만성관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선 관절염, 반응 관절염 및 패혈성 관절염, 척추관절염, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양성 결장염, 염증장병, 인슐린 의존 당뇨병, 갑상샘염, 천식, 알레르기병, 건선, 피부염 피부경화증, 이식대숙주병, 기관 이식거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역병, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신장증후군, 만성피로증후군, 베게너 육아종증, 헨녹-쇈라인 자반증(Henoch-Schonlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅톤씨 무도병, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병, 발작, 1차담관성간경화증, 용혈빈혈, 악성암, 심장부전, 심근경색, 애디슨씨병, 산발성, 다선성 결핍 I형 및 다선성 결핍 II형, 슈미트씨 증후군, 성인(급성) 호흡곤란증후군, 탈모증, 원형탈모증, 흠성혈청 관절증, 관절증, 라이터씨병, 건선관절증, 궤양성결장염관절증, 창자병 윤활막염, 클라미디아, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽상병/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역수포병, 보통천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 1차 IgA 병, 자가면역용혈빈혈, 쿰스 양성 용혈빈혈, 후천성 악성빈혈, 소아악성빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리병(Royal Free Disease), 만성점막피부칸디다증, 거대세포 동맥염, 1차 경화증 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍증후군, 후천성 면역결핍관련병, B형 간염, C형 간염, 공통가변성면역결핍(공통가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소부전,조기 난소부전, 섬유소성 폐병, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증후 간질성 폐병, 간질성 폐렴, 결합조직병 관련 간질성 폐병, 복합 결합조직병 관련 폐병, 전신 경화증 관련 간질성 폐병, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐병, 전신홍반루푸스 관련 폐병, 피부근육염/다발근육염 관련 폐병, 쇼그렌병 관련 폐병, 강직척추염 관련 폐병, 혈관염성 광범위 폐병, 혈철소증 관련 폐병, 약물 유도 간질성 폐병, 방사선 섬유증, 폐쇄세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤 폐병, 감염후 간질성 폐병, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(고전적 자가면역 또는 루푸스 간염), 2형 자가면역 간염(항LKM 항체간염), 자가면역 매개 저혈당증, 흑색가시세포증 관련 B형 인슐린 내성, 부갑상샘저하증, 기관 이식 관련 급성 면역 질환,기관 이식 관련 만성 면역 질환, 골관절염, 1차경화담관염, 건선 1형, 건선 2형, 특발 백혈구감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장병 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원반형 홍반루푸스, 특발성 또는 NOS 남성 불임, 정자 자가면역성, 다발성 경화증(모든 서브타입), 교감 눈염증, 결합조직 질환에 부차적인 폐 고혈압, 굿파스쳐 증후군, 결절다발 동맥염의 폐동맥 징후, 급성 류마티스열, 류마티스성 척추염, 스틸스병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스씨병/동맥염, 자가면역 저혈소판증, 특발 저혈소판증, 자가면역 갑상샘 질환, 갑상샘저하증, 갑상샘종 자가면역 갑상샘저하증(하시모토씨병), 위축 자가면역 갑상샘저하증, 1차 점액부종, 수정체성 포도막염, 1차 혈관염, 백반증, 급성 간질환, 만성 간질환, 알콜간경화증, 알콜 유도 간 손상, 담즙정체, 특이 간질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 질환, Th2 형 및 Th1 형 매개 병, 급성 및 만성 통증 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 인터루킨(IL)-33 관련 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 자가면역질환은 알레르기병, 아토피성 알레르기, 천식, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 및 전신홍반루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 인터루킨(IL)-33 관련 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물.
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