CN109641971B - 抗体融合蛋白的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使抗体与溶酶体酶融合而成的融合蛋白的制造方法。一种制造方法，其为使抗体与人溶酶体酶融合而成的融合蛋白的制造方法，其包括：(a)将产生该融合蛋白的哺乳动物细胞在无血清培养基中进行培养，使该融合蛋白分泌到培养液中的步骤；(b)通过从该培养液中除去该哺乳动物细胞而回收培养上清的步骤；以及(c)利用使用结合有对该融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、以及尺寸排阻柱色谱，从该培养上清中纯化出该融合蛋白的步骤。

Description

抗体融合蛋白的制造方法
技术领域
本发明涉及使抗体与溶酶体酶融合而成的融合蛋白的制造方法，例如，涉及将通过对导入了整合有编码该融合蛋白的基因的表达载体的宿主细胞进行培养而得到的重组融合蛋白纯化至能够作为药物利用的纯度的方法。
背景技术
目前，有很多含有重组蛋白作为有效成分的药物正在销售。这样的重组蛋白是通过对导入了整合有编码目标蛋白质的基因的表达载体的宿主细胞进行培养而在培养上清中得到的。在培养上清中得到的重组蛋白含有夹杂物，因此不能直接作为药物使用。为了作为药物使用，需要对培养上清中含有的重组蛋白进行纯化。
已经报道了如下方法：使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，对该宿主细胞进行培养，将在培养上清中得到的重组蛋白纯化至能够作为药物使用的水平。例如报道了下述方法：对于作用于红细胞祖细胞而使其分化成红细胞的、作为促进红细胞产生的糖蛋白的人促红细胞生成素(hEPO)，使用CHO细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括染料亲和柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献1)。另外，例如报道了下述方法：对于具有促进卵巢中的雌激素生产和分泌的活性的促性腺激素之一的人促卵泡激素(hFSH)，使用CHO细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括阳离子交换柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献2)。另外，例如报道了下述方法：对于作为具有将存在于硫酸肝素、硫酸皮肤素等糖胺聚糖(GAG)分子内的硫酸酯键水解的活性的溶酶体酶之一的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)，使用CHO细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括阳离子交换柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献3)。另外，例如报道了下述方法：对于作为具有将糖脂质和糖蛋白的末端α-半乳糖苷键水解的活性的溶酶体酶之一的人α-半乳糖苷酶A(hα-Gal A)，使用CHO细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包含阴离子交换柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献4、专利文献5)。此外，例如报道了下述方法：对于具有以碱基序列非特异性的方式分解DNA的活性的人DNaseI，使用CHO细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括阴离子交换柱色谱和染料配体亲和柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献6)。
这样，为了取得能够作为药物使用的重组蛋白，对于各重组蛋白，开发出了单独的纯化方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-511378号公报
专利文献2：日本特开2009-273427号公报
专利文献3：日本特表2014-508506号公报
专利文献4：国际公开第2014/017088号
专利文献5：国际公开第2016/117341号
专利文献6：国际公开第2016/067944号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供以重组蛋白的形式表达抗体与其他蛋白质融合而成的融合蛋白、并将其纯化至能够作为药物在市场中流通的纯度的方法。
用于解决问题的方法
在面向上述目的研究中，本发明人反复进行了深入研究，结果发现，将导入了整合有编码使抗转铁蛋白受体抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)融合而成的融合蛋白的基因的表达载体的哺乳动物细胞在无血清培养基中进行培养，通过将在培养液中得到的融合蛋白利用使用对融合蛋白具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱以及尺寸排阻柱色谱的组合进行纯化，能够以高纯度高效地进行纯化。本发明是基于这些发现进一步加以研究而完成的。即，本发明提供以下发明。
1.一种制造方法，其为使抗体与人溶酶体酶融合而成的融合蛋白的制造方法，其包括：
(a)将产生该融合蛋白的哺乳动物细胞在无血清培养基中进行培养，使该融合蛋白分泌到培养液中的步骤；
(b)通过从该培养液中除去该哺乳动物细胞而回收培养上清的步骤；以及
(c)利用使用结合有对该融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、以及尺寸排阻柱色谱，从该培养上清中纯化出该融合蛋白的步骤。
2.如上述1所述的制造方法，其中，在该步骤(c)中，依次利用使用结合有对该融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、以及尺寸排阻柱色谱。
3.如上述1或2所述的制造方法，其中，对该融合蛋白具有亲和性的物质选自由蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、该抗体的抗原、将该抗体作为抗原进行识别的抗体、以及该溶酶体酶的抗体组成的组中。
4.如上述1至3中任一项所述的制造方法，其中，对磷酸基具有亲和性的该材料为氟磷灰石或羟基磷灰石中的任意一种。
5.如上述1至3中任一项所述的制造方法，其中，对磷酸基具有亲和性的该材料为羟基磷灰石。
6.如上述1至5中任一项所述的制造方法，其中，与该人溶酶体酶融合的该抗体为人源化抗体或人抗体。
7.如上述1至5中任一项所述的制造方法，其中，与该人溶酶体酶融合的该抗体为人源化抗体。
8.如上述1至7中任一项所述的制造方法，其中，与该人溶酶体酶融合的该抗体以存在于血管内皮细胞的表面的分子作为抗原。
9.如上述8所述的制造方法，其中，存在于血管内皮细胞的表面的该分子选自由转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F、有机阴离子转运体、MCT-8、单羧酸转运体、以及Fc受体组成的组中。
10.如上述8所述的制造方法，其中，该血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。
11.如上述10所述的制造方法，其中，存在于该脑血管内皮细胞的表面的分子选自由转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F、有机阴离子转运体、MCT-8、以及单羧酸转运体组成的组中。
12.如上述8至11中任一项所述的制造方法，其中，该血管内皮细胞为人的血管内皮细胞。
13.如上述1至12中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为抗人转铁蛋白受体抗体。
14.如上述1至13中任一项所述的制造方法，其中，该融合蛋白是经由选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类、透明质酸、生物素-链霉抗生物素蛋白、以及它们的衍生物组成的组中的接头将该抗体与该人溶酶体酶结合而成的。
15.如上述1至13中任一项所述的制造方法，其中，该融合蛋白是在该抗体的重链的C末端侧或N末端侧、通过肽键直接结合该人溶酶体酶或者经由接头序列结合该人溶酶体酶而成的。
16.如上述1至13中任一项所述的制造方法，其中，该融合蛋白是在该抗体的轻链的C末端侧或N末端侧、通过肽键直接结合该人溶酶体酶或者经由接头序列结合该人溶酶体酶而成的。
17.如上述15或16所述的制造方法，其中，该接头序列由1～50个氨基酸残基构成。
18.如上述17所述的制造方法，其中，该接头序列包含选自由1个甘氨酸、1个丝氨酸、氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、序列号1的氨基酸序列、序列号2的氨基酸序列、序列号3的氨基酸序列、以及1～10个这些氨基酸序列连续而成的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。
19.如上述17或18所述的制造方法，其中，该接头序列具有氨基酸序列(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列。
20.如上述1至19中任一项所述的制造方法，其中，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人I2S)。
21.如上述20所述的制造方法，其中，该人I2S具有序列号5所表示的氨基酸序列。
22.如上述20所述的制造方法，其中，该人I2S与序列号5所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有作为人I2S的活性。
23.如上述20所述的制造方法，其中，该人I2S与序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性，并且具有作为人I2S的活性。
24.如上述20所述的制造方法，其中，该人I2S具有在序列号5所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有作为人I2S的活性。
25.如上述20所述的制造方法，其中，该人I2S具有在序列号5所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有作为人I2S的活性。
26.如上述20所述的制造方法，其中，该人I2S具有在序列号5所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有作为人I2S的活性。
27.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人源化抗hTfR抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：
(a)轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、重链具有序列号7所表示的氨基酸序列的抗体；
(b)轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列、重链具有序列号9所表示的氨基酸序列的抗体；以及
(c)轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、重链具有序列号11所表示的氨基酸序列的抗体。
28.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人源化抗hTfR抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：
(a)轻链与序列号6所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性、重链与序列号7所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体；
(b)轻链与序列号8所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性、重链与序列号9所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体；以及
(c)轻链与序列号10所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性、重链与序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体。
29.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人源化抗hTfR抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：
(a)轻链与序列号6所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性、重链与序列号7所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体；
(b)轻链与序列号8所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性、重链与序列号9所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体；以及
(c)轻链与序列号10所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性、重链与序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体。
30.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人源化抗hTfR抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：
(a)轻链具有在序列号6所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号7所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；
(b)轻链具有在序列号8所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号9所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；以及
(c)轻链具有在序列号10所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号11所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体。
31.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人源化抗hTfR抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：
(a)轻链具有在序列号6所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号7所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；
(b)轻链具有在序列号8所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号9所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；以及
(c)轻链具有在序列号10所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号11所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体。
32.如上述20所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人I2S)，该融合蛋白为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的蛋白质：
(a)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
(b)由具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；以及
(c)由具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
33.如上述20所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的蛋白质：
(a)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号12所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
(b)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；以及
(c)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号14所表示的氨基酸序列的融合蛋白。
发明效果
根据本发明，可以提供纯化至能够在临床上用作伴有中枢神经障碍的溶酶体病的治疗剂的纯度的、抗转铁蛋白受体抗体与溶酶体酶的融合蛋白。特别是，可以提供纯化至能够在临床上用作伴有中枢神经障碍的亨特综合征的治疗剂的纯度的、抗转铁蛋白受体抗体与人I2S的融合蛋白。
附图说明
图1是示出实施例6中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品的SE-HPLC的谱图的图。纵轴表示215nm下的吸光度，横轴表示保留时间(分钟)。(A)表示来自于I2S-抗hTfR抗体3的单体的峰，(B)表示来自于I2S-抗hTfR抗体3的聚合物的峰。
图2是示出实施例12中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品的SE-HPLC的谱图的图。纵轴表示215nm下的吸光度，横轴表示保留时间(分钟)。(A)表示来自于I2S-抗hTfR抗体3的单体的峰，(B)表示来自于I2S-抗hTfR抗体3的聚合物的峰。
具体实施方式
本发明涉及使抗转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)与人溶酶体酶结合而成的蛋白质的制造方法。在此，与溶酶体酶结合的抗体只要具有与抗原特异性结合的性质即可，对于抗体的动物种类等没有特别限制，特别地为人抗体或人源化抗体。例如，抗体可以为人以外的哺乳动物的抗体，另外也可以为人抗体与人以外的其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。
人抗体是指其整体由来源于人的基因编码的抗体。其中，出于提高基因的表达效率等目的对原来的人的基因施加突变而得到的基因所编码的抗体也是人抗体。另外，将编码人抗体的两个以上的基因组合并将某一人抗体的一部分置换成其他人抗体的一部分而得到的抗体也是人抗体。人抗体具有免疫球蛋白轻链的三个部位的互补决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的三个部位的互补决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链的三个部位的CDR按照从N末端侧起的顺序依次称为CDR1、CDR2和CDR3。免疫球蛋白重链的三个部位的CDR按照从N末端侧起的顺序依次称为CDR1、CDR2和CDR3。通过将某一人抗体的CDR置换成其他人抗体的CDR而改变了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也是人抗体。
本发明中，通过改变原来的人抗体的基因而对原来的抗体的氨基酸序列施加了置换、缺失、添加等突变的抗体也称为人抗体。在将原来的抗体的氨基酸序列中的氨基酸置换成其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、进一步更优选为1～3个。在使原来的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、进一步更优选为1～3个。另外，施加了组合有这些氨基酸的置换和缺失的突变的抗体也是人抗体。在添加氨基酸的情况下，在原来的抗体的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、进一步更优选为1～3个的氨基酸。施加了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的突变的抗体也是人抗体。施加了突变的抗体的氨基酸序列与原来的抗体的氨基酸序列优选显示出80％以上的同源性，更优选显示出90％以上的同源性，进一步优选显示出95％以上的同源性，进一步更优选显示出98％以上的同源性。即，本发明中提到“来源于人的基因”时，除了来源于人的原来的基因以外，也包含通过对来源于人的原来的基因施加改变而得到的基因。
本发明中，“人源化抗体”的术语是指可变区的一部分(例如特别是CDR的全部或一部分)的氨基酸序列来源于人以外的哺乳动物、除此以外的区域来源于人的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的三个部位的互补决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的三个部位的互补决定区(CDR)用其他哺乳动物的CDR置换而制作的抗体。作为移植到人抗体的适当位置的CDR的来源的其他哺乳动物的生物种类只要是人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，例如小鼠。
本发明中，以下对抗体为人抗体或人源化抗体的情况进行详述。人抗体和人源化抗体的轻链有λ链和κ链。构成抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一种。另外，人抗体和人源化抗体的重链有γ链、μ链、α链、σ链和ε链，分别对应于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。构成抗体的重链可以为γ链、μ链、α链、σ链和ε链中的任意一种，优选为γ链。此外，抗体的重链的γ链有γ1链、γ2链、γ3链和γ4链，分别对应于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在构成抗体的重链为γ链的情况下，其γ链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一种，优选为γ1链或γ4链。在抗体为人源化抗体或人抗体、且为IgG的情况下，该抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一种，该抗体的重链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一种，优选为γ1链或γ4链。例如，作为优选的抗体的一个方式，可以列举轻链为λ链、重链为γ1链的方式。
本发明中，“嵌合抗体”的术语是指来源于两个以上的不同种类的、两个以上的不同抗体的片段连接而成的抗体。
人抗体与其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指人抗体的一部分被人以外的哺乳动物的抗体的一部分置换而得到的抗体。抗体由以下说明的Fc区域、Fab区域和铰链部构成。作为这样的嵌合抗体的具体例，可以列举Fc区域来源于人抗体、而Fab区域来源于其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰链部来源于人抗体或其他哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举Fc区域来源于其他哺乳动物、而Fab区域来源于人抗体的嵌合抗体。铰链部可以来源于人抗体或其他哺乳动物的抗体中的任意一者。
另外，抗体也可以说由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例，还可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于人抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体；相反地重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于其他哺乳动物的抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于人抗体的嵌合抗体。在此，其他哺乳动物的生物种类只要是人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠。
人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特别是指“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体可以列举Fc区域来源于人抗体、而Fab区域来源于小鼠抗体的嵌合抗体；或者相反地Fc区域来源于小鼠抗体、而Fab区域来源于人抗体的嵌合抗体。铰链部来源于人抗体或小鼠抗体中的任意一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例，还可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于人抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于小鼠抗体的嵌合抗体；相反地重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于小鼠抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于人抗体的嵌合抗体。
抗体原本具有由两条免疫球蛋白轻链和两条免疫球蛋白重链共计四条多肽链构成的基本结构。但是，本发明中，提到“抗体”时，除了具有该基本结构的抗体以外，还包含：
(1)由一条免疫球蛋白轻链和一条免疫球蛋白重链共计两条多肽链构成的抗体；或者如以下详述的那样，
(2)在免疫球蛋白轻链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白重链而成的单链抗体；以及
(3)在免疫球蛋白重链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体。
另外，(4)由从原本的含义下的抗体的基本结构中缺失Fc区域而得到的Fab区域构成的片段、以及由Fab区域和铰链部的全部或一部分构成的片段(包括Fab、F(ab’)和F(ab’)2)也包含在本发明中的“抗体”中。此外，经由接头序列使轻链的可变区与重链的可变区结合而形成单链抗体的scFv也包含在本发明中的抗体中。
本发明中，提到“单链抗体”时，是指在包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质。另外，在包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质也是本发明中的“单链抗体”。例如，上述(2)和(3)所示者包含在单链抗体中。在免疫球蛋白重链的C末端侧经由接头序列结合有免疫球蛋白轻链的单链抗体中，通常免疫球蛋白重链缺失了Fc区域。免疫球蛋白轻链的可变区具有三个与抗体的抗原特异性相关的互补决定区(CDR)。同样地，免疫球蛋白重链的可变区也具有三个CDR。这些CDR是决定抗体的抗原特异性的主要区域。因此，单链抗体中优选包含免疫球蛋白重链的全部三个CDR和免疫球蛋白轻链的全部三个CDR。但是，只要可维持抗体的抗原特异性的亲和性，也可以为使CDR的一个或多个缺失的单链抗体。
单链抗体中，配置在免疫球蛋白的轻链与重链之间的接头序列是由优选为2～50个、更优选为8～50个、进一步优选为10～30个、进一步更优选为12～18个或15～25个、例如为15个或25个的氨基酸残基构成的肽链。关于这样的接头序列，只要由其将两链连接而成的抗hTfR抗体保持对hTfR的亲和性，则对其氨基酸序列没有限定，但优选仅由甘氨酸构成或者由甘氨酸和丝氨酸构成，例如具有氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号1)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号2)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号3)、或者这些氨基酸序列重复2～10次或2～5次而成的序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的C末端侧经由接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区而形成ScFV的情况下，优选使用由相当于3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号1)连续而成的共计15个氨基酸构成的接头序列。
本发明中，作为抗体特异性识别的抗原，例如为存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)。作为该表面抗原，可以列举转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F等有机阴离子转运体、MCT-8等单羧酸转运体、Fc受体，但不限定于这些。抗原优选为存在于人血管内皮细胞的表面的这些分子(表面抗原)。
上述表面抗原之中，转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F等有机阴离子转运体、MCT-8等单羧酸转运体存在于形成血脑屏障(BloodBrain Barrier)的脑毛细血管内皮细胞(脑血管内皮细胞)的表面。能够识别这些抗原的抗体可经由抗原与脑毛细血管内皮细胞结合。并且，与脑毛细血管内皮细胞结合的抗体能够通过血脑屏障而到达中枢神经系统。因此，通过使目标蛋白质与这样的抗体结合，能够使其到达中枢神经系统。作为目标蛋白质，可以列举具有应在中枢神经系统中发挥药效的功能的蛋白质。可以列举例如在伴有中枢神经障碍的溶酶体病患者中缺损或功能不全的溶酶体酶作为目标蛋白质。该溶酶体酶无法直接到达中枢神经系统，无法对患者的中枢神经障碍显示出药效，但通过与这些抗体结合，变得能够通过血脑屏障，因此能够改善在溶酶体病患者中观察到的中枢神经障碍。
本发明中，“人转铁蛋白受体”或“hTfR”的术语是指具有序列号4所示的氨基酸序列的膜蛋白质。本发明的抗hTfR抗体在其一个实施方式中与序列号4所表示的氨基酸序列中从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基至C末端的苯丙氨酸为止的部分(hTfR的细胞外区域)特异性地结合，但并不限定于此。
以下以抗hTfR的抗体为例对抗体的制作方法进行说明。作为抗hTfR的抗体的制作方法，一般的方法是使用导入了整合有hTfR基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhTfR)，使用该rhTfR利用小鼠等动物进行免疫而得到的方法。从免疫后的动物取出抗hTfR的抗体产生细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，由此能够制作具有抗hTfR的抗体产生能力的杂交瘤细胞。
另外，通过利用体外免疫法用rhTfR对由小鼠等动物得到的免疫系统细胞进行免疫，也能够取得产生抗hTfR的抗体的细胞。在利用体外免疫法进行免疫的情况下，对该免疫系统细胞所来源的动物种类没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，可以使用例如由小鼠的脾脏制备的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可以使用由人的外周血、骨髓、脾脏等制备的细胞。在利用体外免疫法对人的免疫系统细胞进行免疫的情况下，能够得到抗hTfR的人抗体。
本发明中，对于应当与抗体结合的人溶酶体酶没有特别限定，可以列举α-L-艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖脑苷酯酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-N-乙酰基半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β--葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰基葡糖胺酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰葡糖胺酶、棕榈酰蛋白质硫酯酶-1(PPT-1)、三肽基肽酶-1(TPP-1)、透明质酸酶-1、CLN1和CLN2等溶酶体酶。
在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)的情况下，关于与抗体结合的人溶酶体酶，α-L-艾杜糖苷酶能够用作赫勒氏综合征或赫勒-施艾氏(Hurler-Scheie)综合征中的中枢神经障碍治疗剂，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶能够用作亨特综合征中的中枢神经障碍治疗剂，葡糖脑苷脂酶能够用作戈谢病中的中枢神经障碍治疗剂，β半乳糖苷酶能够用作GM1-神经节苷脂贮积症1～3型中的中枢神经障碍治疗剂，GM2活化蛋白质能够用作GM2-神经节苷脂贮积症AB异型中的中枢神经障碍治疗剂，β-己糖胺酶A能够用作山德霍夫氏病和泰-萨二氏病中的中枢神经障碍治疗剂，β-己糖胺酶B能够用作山德霍夫氏病中的中枢神经障碍治疗剂，N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶能够用作I-细胞病中的中枢神经障碍治疗剂，α-甘露糖苷酶能够用作α-甘露糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，β-甘露糖苷酶能够用作β-甘露糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，半乳糖脑苷酯酶能够用作克拉伯病中的中枢神经障碍治疗剂，鞘脂激活蛋白C能够用作戈谢病样贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，芳基硫酸酯酶A能够用作异染性脑白质退化症(异染性脑白质营养不良)中的中枢神经障碍治疗剂，α-L-岩藻糖苷酶能够用作岩藻糖苷酶贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰葡糖胺酶能够用作天冬氨酰葡糖胺尿症中的中枢神经障碍治疗剂，α-N-乙酰基半乳糖胺酶能够用作辛德勒病和川崎病中的中枢神经障碍治疗剂，酸性鞘磷脂酶能够用作尼曼匹克病中的中枢神经障碍治疗剂，α-半乳糖苷酶A能够用作法布里病中的中枢神经障碍治疗剂，β-葡萄糖醛酸苷酶能够用作斯赖综合征中的中枢神经障碍治疗剂，乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰基葡糖胺酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶和N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶能够用作沙费利波综合征中的中枢神经障碍治疗剂，酸性神经酰胺酶能够用作法伯病中的中枢神经障碍治疗剂，淀粉-1，6-葡萄糖苷酶能够用作柯里氏病(福布斯-柯里氏病)中的中枢神经障碍治疗剂，唾液酸酶能够用作唾液酸酶缺乏症中的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰葡糖胺酶能够用作天冬氨酰葡糖胺尿症中的中枢神经障碍治疗剂，棕榈酰蛋白质硫酯酶-1(PPT-1)能够用作神经元蜡样脂褐质沉积症或桑-哈二氏(Santavuori-Haltia)病中的中枢神经障碍治疗剂，三肽基肽酶-1(TPP-1)能够用作神经元蜡样脂褐质沉积症或詹-比二氏(Jansky-Bielschowsky)病中的中枢神经障碍治疗剂，透明质酸酶-1能够用作透明质酸酶缺乏症中的中枢神经障碍治疗剂，CLN1和CLN2能够用作巴藤病中的中枢神经障碍治疗剂。
在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)的情况下，作为应当与抗体结合的溶酶体酶的优选例，可以列举人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)。I2S是具有将存在于硫酸肝素、硫酸皮肤素等糖胺聚糖(GAG)分子内的硫酸酯键水解的活性的溶酶体酶之一。亨特综合征是先天性缺失该酶的基因疾病。亨特综合征的患者在组织内蓄积硫酸肝素、硫酸皮肤素，结果表现出角膜混浊、精神发育迟缓等各种症状。但是，在轻症的情况下，也有时观察不到精神发育迟缓。该抗体与hI2S的融合蛋白能够通过透过BBB而将蓄积在脑组织内的GAG分解，因此，通过给药于表现出精神发育迟缓的亨特综合征的患者，能够作为中枢神经障碍治疗剂使用。
本发明中，“人I2S”或“hI2S”的术语特别是指具有与野生型的hI2S相同的氨基酸序列的hI2S。野生型的hI2S具有由序列号5所表示的525个氨基酸构成的氨基酸序列。但是，不限于此，只要具有I2S活性，对野生型的hI2S的氨基酸序列施加置换、缺失、添加等突变而得到的氨基酸序列也包含在hI2S中。在将hI2S的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、进一步更优选为1～2个。在使hI2S的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、进一步更优选为1～2个。另外，也可以施加组合有这些氨基酸的置换和缺失的突变。在对hI2S添加氨基酸的情况下，在hI2S的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、进一步更优选为1～2个的氨基酸。也可以施加组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的突变。施加了突变的hI2S的氨基酸序列与原来的hI2S的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示出90％以上的同源性，进一步优选显示出95％以上的同源性。
需要说明的是，本发明中，提到hI2S具有I2S活性时，是指在使hI2S与抗体融合而形成融合蛋白时，相对于天然型的hI2S本来具有的活性，具有3％以上的活性。其中，相对于天然型的hI2S本来具有的活性，该活性优选为10％以上、更优选为20％以上、进一步优选为50％以上、进一步更优选为80％以上。在与抗体融合的hI2S施加了突变的情况下也同样。抗体例如为抗hTfR抗体。
本发明中提到“融合蛋白”时，是指使抗体与人溶酶体酶经由非肽接头或肽接头结合、或者直接结合而得到的物质。以下对使抗体与人溶酶体酶结合的方法进行详述。
作为使抗体与人溶酶体酶结合的方法，有经由非肽接头或肽接头使其结合的方法。作为非肽接头，可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类、以及透明质酸、或它们的衍生物、或者它们的组合。肽接头是由以肽键键合的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端分别与抗体或人溶酶体酶中的任意一者形成共价键，由此使抗体与人溶酶体酶结合。
在使用生物素-链霉抗生物素蛋白作为非肽接头的情况下，可以使抗体结合生物素，使人溶酶体酶结合链霉抗生物素蛋白，经由该生物素与链霉抗生物素蛋白的结合使抗体与人溶酶体酶结合；相反地，也可以使抗体结合链霉抗生物素蛋白，使人溶酶体酶结合生物素，经由该生物素与链霉抗生物素蛋白的结合使抗体与人溶酶体酶结合。
使用PEG作为非肽接头使本发明的抗体与人溶酶体酶结合而得到的物质特别地称为抗体-PEG-人溶酶体酶。抗体-PEG-人溶酶体酶可以通过使抗体与PEG结合而制作抗体-PEG，接着使抗体-PEG与人溶酶体酶结合来制造。或者，抗体-PEG-人溶酶体酶也可以通过使人溶酶体酶与PEG结合而制作人溶酶体酶-PEG，接着使人溶酶体酶-PEG与抗体结合来制造。使PEG与抗体和人溶酶体酶结合时，使用经碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状酰亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团修饰的PEG。这些导入至PEG中的官能团主要通过与抗体和人溶酶体酶分子内的氨基反应而将PEG与抗体和人溶酶体酶共价键合。对此时使用的PEG的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝300～60000、更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可以优选作为非肽接头使用。
例如，抗体-PEG通过将抗体和具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)按照ALD-PEG-ALD相对于该抗体的摩尔比为11、12.5、15、110、120等的方式进行混合，在其中添加NaCNBH3等还原剂使其反应而得到。接着，在NaCNBH3等还原剂的存在下使抗体-PEG与人溶酶体酶反应，由此得到抗体-PEG-人溶酶体酶。相反地，也可以通过先使人溶酶体酶与ALD-PEG-ALD结合而制作人溶酶体酶-PEG，接着使人溶酶体酶-PEG与抗体结合而得到抗体-PEG-人溶酶体酶。
关于抗体和人溶酶体酶，也可以在抗体的重链或轻链的C末端侧或N末端侧经由接头序列或者直接通过肽键分别结合人溶酶体酶的N末端或C末端。这样使抗体与人溶酶体酶结合而成的融合蛋白可以通过将在编码抗体的重链或轻链的cDNA的3’末端侧或5’末端侧直接或夹着编码接头序列的DNA片段以框内方式配置有编码人溶酶体酶的cDNA的DNA片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，并对导入有该表达载体的哺乳动物细胞进行培养而得到。在该哺乳动物细胞中，在使编码人溶酶体酶的DNA片段与重链结合的情况下，将整合有编码抗体的轻链的cDNA片段的哺乳动物细胞用的表达载体也导入至相同的宿主细胞中，另外，在使编码人溶酶体酶的DNA片段与轻链结合的情况下，将整合有编码抗体的重链的cDNA片段的哺乳动物细胞用的表达载体也导入至相同的宿主细胞中。在抗体为单链抗体的情况下，使抗体与人溶酶体酶结合而成的融合蛋白可以通过在编码人溶酶体酶的cDNA的5’末端侧或3’末端侧直接或者夹着编码接头序列的DNA片段连接有编码单链抗体的cDNA的DNA片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，并在导入有该表达载体的这些细胞中进行表达而得到。
在抗体的轻链的C末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的C末端侧。在此，抗体的轻链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
在抗体的重链的C末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的重链的C末端侧。在此，抗体的重链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
在抗体的轻链的N末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的N末端侧。在此，抗体的轻链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
在抗体的重链的N末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的重链的N末端侧。在此，抗体的重链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
此时，在抗体与人溶酶体酶之间配置接头序列的情况下，该序列由优选为1～50个、更优选为1～17个、进一步优选为1～10个、进一步更优选为1～5个的氨基酸构成，构成接头序列的氨基酸的个数可以根据应当与抗体结合的人溶酶体酶而适当调节为1个、2个、3个、1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个等。关于这样的接头序列，只要由其连接的抗体保持对hTfR的亲和性，并且由该接头序列连接的人溶酶体酶在生理条件下能够发挥该蛋白质的生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如具有由甘氨酸或丝氨酸中的任意一个氨基酸构成的氨基酸序列、由氨基酸序列G1y-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号1)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号2)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号3)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连续而成的由1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用具有氨基酸序列Gly-Ser的序列作为接头序列。抗体为单链抗体时也同样。
需要说明的是，本发明中，在一个肽链包含两个以上的接头序列的情况下，为方便起见，将各接头序列从N末端侧起依次命名为第一接头序列、第二接头序列。
在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，作为抗体的优选方式，可以列举以下的(x)～(z)。即为下述中的任意一者：
(x)轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、重链具有序列号7所表示的氨基酸序列的抗体；
(y)轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列、重链具有序列号9所表示的氨基酸序列的抗体；
(z)轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、重链具有序列号11所表示的氨基酸序列的抗体。
需要说明的是，在此，(x)、(y)和(z)分别相当于实施例中所示的人源化抗hTfR抗体编号1、人源化抗hTfR抗体编号2和人源化抗hTfR抗体编号3。
但是，在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，抗体的优选方式并不限于上述的(x)～(z)。例如，只要对hTfR具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有80％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体也可以在本发明中使用。另外，只要对hTfR具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有90％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体也可以在本发明中使用。另外，只要对hTfR具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有95％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有95％以上的同源性的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。
另外，只要对hTfR具有亲和性，轻链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。另外，只要对hTfR具有亲和性，轻链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。此外，只要对hTfR具有亲和性，轻链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。
在上述抗体的优选方式(x)中，在序列号6所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号15所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号7所表示的重链的氨基酸序列中，序列号16所表示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式(y)中，在序列号8所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号17所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号9所表示的重链的氨基酸序列中，序列号18所表示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式(z)中，在序列号10所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号19所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号11所表示的重链的氨基酸序列中，序列号20所表示的氨基酸序列为可变区。在这些抗体的优选方式(x)～(z)中，特别是在这些可变区中导入对构成重链或/和轻链的氨基酸序列的氨基酸序列的置换、缺失或添加。
需要说明的是，本发明中，原来的蛋白质(包括抗体)的氨基酸序列与施加了突变的蛋白质的氨基酸序列的同源性可以使用公知的同源性计算算法容易地算出。例如，作为这样的算法，有BLAST(Altschul SF.J Mol.Biol.215.403-10、(1990))、Pearson和Lipman的类似性检索法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85.2444(1988))、Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2.482-9(1981))等。
在抗体为人源化抗人转铁蛋白受体抗体、人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人I2S)的情况下，作为融合蛋白的优选方式，可以列举以下的(a)～(c)。即，
(a)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
(b)由具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
(c)由具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
另外，在抗体为人源化抗人转铁蛋白受体抗体、人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人I2S)的情况下，作为融合蛋白的优选方式，可以列举以下的(a)～(c)。即，
(a)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列，该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号12所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
(b)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列，该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
(c)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列，该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号14所表示的氨基酸序列的融合蛋白。
本发明中，抗体与人溶酶体酶的融合蛋白可以通过对下述哺乳动物细胞进行培养而产生，该哺乳动物细胞按照通过表达或强表达编码该融合蛋白的基因而产生该融合蛋白的方式施加了人为的操作。此时在产生融合蛋白的哺乳动物细胞内强表达的该基因通常通过利用整合有该基因的表达载体进行转化而导入至该哺乳动物细胞中。另外，对于此时使用的哺乳动物细胞没有特别限定，优选来源于人、小鼠、中国仓鼠的细胞，特别优选来源于中国仓鼠卵巢细胞的CHO细胞。本发明中，提到融合蛋白时，特别是指对这样的产生融合蛋白的哺乳动物细胞进行培养时分泌到培养基中的重组融合蛋白。
抗体与人溶酶体酶的融合蛋白也可以通过分别产生抗体和人溶酶体酶后，利用非肽接头或肽接头使它们结合而制造。此时，抗体和人溶酶体酶可以通过对下述哺乳动物细胞进行培养而以重组蛋白的形式产生，该哺乳动物细胞按照通过表达或强表达编码抗体和人溶酶体酶的基因而产生它们的方式施加了人为的操作。
用于整合编码融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的基因而使其表达的表达载体只要在导入至哺乳动物细胞内时表达该基因，则可以没有特别限定地使用。整合到表达载体中的该基因配置在能够在哺乳动物细胞内调节基因的转录频率的DNA序列(基因表达调控部位)的下游。作为本发明中能够使用的基因表达调控部位，可以列举例如来源于巨细胞病毒的启动子、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子等。
导入了这样的表达载体的哺乳动物细胞可表达整合到表达载体中的所期望的蛋白质，但其表达量根据各个细胞而异，并不一致。因此，为了高效地生产重组蛋白，需要从导入了表达载体的哺乳动物细胞中选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该选择步骤，在表达载体中整合了作为选择标志物发挥作用的基因。
作为选择标志物，最常见的为分解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(药剂耐性标志物)。哺乳动物细胞在一定浓度以上的上述药剂的存在下死亡。但是，导入了表达载体的哺乳动物细胞能够利用整合到表达载体中的药剂耐性标志物将上述药剂分解，使药剂无毒化或弱毒化，因此在上述药剂存在下也能够存活。将整合有药剂耐性标志物作为选择标志物的表达载体导入至哺乳动物细胞中，在含有与该药剂耐性标志物对应的药剂的选择培养基中一边缓慢地升高该药剂的浓度一边继续培养时，可得到即使在更高浓度的药剂存在下也能够增殖的细胞。在这样选择出的细胞中，通常，整合到表达载体中的编码所期望的蛋白质的基因的表达量也与药剂耐性标志物一起增加，因此，作为结果，选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞。
另外，作为选择标志物，也可以使用谷氨酰胺合成酶(GS)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。将哺乳动物细胞在含有谷氨酰胺合成酶的抑制剂、例如蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)且不含有谷氨酰胺的选择培养基中进行培养时，细胞死亡。但是，将整合有谷氨酰胺合成酶作为选择标志物的表达载体导入至哺乳动物细胞中时，在该细胞中，谷氨酰胺合成酶的表达水平升高，因此，即使在更高浓度的MSX存在下也能够增殖。此时，若一边缓慢地升高MSX的浓度一边继续培养，则可得到即使在更高浓度的MSX存在下也能够增殖的细胞。在这样选择出的细胞中，通常，整合到表达载体中的编码所期望的蛋白质的基因的表达量也与谷氨酰胺合成酶一起增加，因此，作为结果，选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞。
另外，作为选择标志物，也可以使用二氢叶酸还原酶(DHFR)。在使用DHFR作为选择标志物的情况下，将导入了表达载体的哺乳动物细胞在含有氨甲蝶呤、氨基蝶呤等DHFR抑制剂的选择培养基中进行培养。一边缓慢地升高DHFR抑制剂的浓度一边继续培养时，可得到即使在更高浓度的DHFR抑制剂存在下也能够增殖的细胞。在这样选择出的细胞中，通常，整合到表达载体中的编码所期望的蛋白质的基因的表达量也与DHFR一起增加，因此，作为结果，选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞。
已知有在编码所期望的蛋白质的基因的下游侧经由内部核糖体进入位点(IRES：internal ribosome entry site)配置有谷氨酰胺合成酶(GS)作为选择标志物的表达载体(国际专利公报WO2012/063799、WO2013/161958)。这些文献中记载的表达载体可以特别优选在本发明的制造方法中使用。
例如，作为用于表达蛋白质的表达载体的下述表达载体可以优选在本发明的制造方法中使用，该表达载体包含基因表达调控部位，在其下游包含编码该蛋白质的基因，进一步在下游包含内部核糖体进入位点，进一步在下游包含编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且在该基因表达调控部位的下游或者与该基因表达调控部位不同的基因表达调控部位的下游进一步含有二氢叶酸还原酶基因或药剂耐性基因。在该表达载体中，作为基因表达调控部位或不同的基因表达调控部位，优选使用来源于巨细胞病毒的启动子、SV40早期启动子、人延伸因子-1α启动子(hEF-1α启动子)、人泛素C启动子，特别优选为hEF-1α启动子。
另外，作为内部核糖体进入位点，优选使用来源于选自由小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇B组病毒、人免疫球蛋白重链结合蛋白质基因、果蝇触角足基因、果蝇超级双胸基因组成的组中的病毒或基因的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点，特别优选为来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点。在使用来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点的情况下，除了野生型的内部核糖体进入位点以外，也可以优选使用野生型的内部核糖体进入位点中所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体进入位点。另外，在该表达载体中，优选使用的药剂耐性基因优选为嘌呤霉素或新霉素耐性基因，更优选为嘌呤霉素耐性基因。
另外，例如作为用于表达蛋白质的表达载体的下述表达载体可以优选在本发明的制造方法中使用，该表达载体包含hEF-1α启动子，在其下游包含编码该蛋白质的基因，进一步在下游包含来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点，进一步在下游包含编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且进一步包含不同的基因表达调控部位及其下游的二氢叶酸还原酶基因，该内部核糖体进入位点是野生型的内部核糖体进入位点中所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体进入位点。作为这样的表达载体，可以列举WO2013/161958中记载的表达载体。
另外，例如，作为用于表达蛋白质的表达载体的下述表达载体可以优选在本发明的制造方法中使用，该表达载体包含hEF-1α启动子，在其下游包含编码该蛋白质的基因，进一步在下游包含来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点，进一步在下游包含编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且进一步包含不同的基因表达调控部位及其下游的药剂耐性基因，该内部核糖体进入位点是野生型的内部核糖体进入位点中所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体进入位点。作为这样的表达载体，可以列举WO2012/063799中记载的pE-mIRES-GS-puro和WO2013/161958中记载的pE-mIRES-GS-mNeo。
本发明中，为了选择融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的表达水平高的细胞，将导入了整合有编码融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的基因的表达载体的哺乳动物细胞在选择培养基中进行选择培养。
在选择培养中，在使用DHFR作为选择标志物的情况下，使选择培养基中含有的DHFR抑制剂的浓度阶段性地升高。在DHFR抑制剂为氨甲蝶呤的情况下，其最大浓度优选为0.25～5μM、更优选为0.5～1.5μM、进一步优选为约1.0μM。
在使用GS作为选择标志物的情况下，使选择培养基中含有的GS抑制剂的浓度阶段性地升高。在GS抑制剂为MSX的情况下，其最大浓度优选为100～1000μM、更优选为200～500μM、进一步优选为约300μM。另外，此时，通常使用不含有谷氨酰胺的培养基作为选择培养基。
在使用分解嘌呤霉素的酶作为选择标志物的情况下，选择培养基中含有的嘌呤霉素的最大浓度优选为3～30μg/mL、更优选为5～20μg/mL、进一步优选为约10μg/mL。
在使用分解新霉素的酶作为选择标志物的情况下，选择培养基中含有的G418的最大浓度优选为0.1mg～2mg/mL、更优选为0.5～1.5mg/mL、进一步优选为约1mg/mL。
另外，作为用于哺乳动物细胞的培养的培养基，只要能够对哺乳动物细胞进行培养而使其增殖，则选择培养中使用的培养基、后述的用于产生融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的培养基(重组蛋白产生用培养基)均可以没有特别限定地使用，优选使用无血清培养基。
通过选择培养选择出的融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的表达水平高的细胞作为这些物质的产生细胞用于这些物质的生产。融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的生产通过将这些物质的产生细胞在重组蛋白产生用培养基中进行培养而进行。将该培养称为生产培养。
本发明中，作为用作重组蛋白产生用培养基的无血清培养基，优选使用例如含有氨基酸3～700mg/L、维生素类0.001～50mg/L、单糖类0.3～10g/L、无机盐0.1～10000mg/L、微量元素0.001～0.1mg/L、核苷0.1～50mg/L、脂肪酸0.001～10mg/L、生物素0.01～1mg/L、氢化可的松0.1～20μg/L、胰岛素0.1～20mg/L、维生素B120.1～10mg/L、腐胺0.01～1mg/L、丙酮酸钠10～500mg/L和水溶性铁化合物的培养基。可以根据期望在培养基中添加胸苷、次黄嘌呤、惯用的pH指示剂和抗生素。
另外，作为用作重组蛋白产生用培养基的无血清培养基，可以使用DMEM/F12培养基(DMEM与F12的混合培养基)作为基本培养基，这些各培养基是本领域技术人员公知的。此外，作为无血清培养基，也可以使用包含碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、胰岛素、亚硒酸钠、二氨基丁烷、氢化可的松、硫酸铁(II)、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和聚乙烯醇的DMEM(HG)HAM改良型(R5)培养基。此外，也可以使用市售的无血清培养基、例如CD OptiCHOTM培养基、CHO-S-SFM II培养基或CD CHO培养基(Thermo Fisher Scientific公司)、EX-CELLTM302培养基或EX-CELLTM325-PF培养基(SAFC Biosciences公司)等作为基本培养基。例如，作为含有16μmol/L胸苷、100μmol/L次黄嘌呤和4mmol/L L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺的无血清培养基的EX-CELLTM Advanced CHO Fed-batch培养基(SAFC Biosciences公司)可以优选用于融合蛋白产生细胞的培养。
融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的产生细胞的生产培养在将这些产生细胞在重组蛋白产生用培养基中的密度调节至优选0.2×105～5×105个/mL、更优选1×105～4×105个/mL、进一步优选约2×105个/mL后开始。
生产培养在经时地观察细胞的存活率(％)的同时进行，按照生产培养期间中的细胞的存活率优选维持于85％以上、更优选维持于90％以上的方式进行。
另外，生产培养期间中，培养温度优选维持于33.5～37.5℃，生产培养基中的溶解氧饱和度优选维持于38～42％、更优选维持于约40％。在此，溶解氧饱和度是指将氧的饱和溶解量设为100％时在相同条件下的氧的溶解量。
另外，生产培养期间中，生产培养基利用叶轮(impeller)进行搅拌。此时的叶轮的旋转速度优选调节为50～100转/分钟、更优选调节为60～95转/分钟、例如70转/分钟、90转/分钟等，其转速根据叶轮的形状等适当变更。
作为生产培养中的优选培养条件的初期条件，可以列举例如下述条件：生产培养开始时的产生细胞在重组蛋白产生用培养基中的密度为2×105个/mL，生产培养期间中的培养温度为34～37℃，生产培养基中的溶解氧饱和度为40％，并且培养基利用以约89转/分钟的速度旋转的叶轮进行搅拌。
在生产培养结束后回收培养基，将回收的培养基离心分离或者进行膜过滤，由此能够除去细胞等而得到培养上清。该培养上清中含有的目标融合蛋白通过使用各种色谱的工序进行纯化。纯化工艺可以在室温或低温环境下进行，优选在低温环境下进行，特别优选在1～10℃的温度下进行。
以下，对培养上清中含有的抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的纯化方法进行详述。
纯化工序的一个步骤为使用结合有对融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对融合蛋白具有亲和性的物质没有特别限定，优选为蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、将构成融合蛋白的抗体作为抗原进行识别的抗体、构成融合蛋白的抗体作为抗原所识别的物质、或者抗人溶酶体酶抗体，更优选为蛋白A。也可以将它们组合使用。通过加载培养上清，使培养上清中含有的融合蛋白与柱结合，将柱清洗后，使融合蛋白从柱上洗脱。这样能够除去大多数的夹杂物。在构成融合蛋白的抗体为人IgG的情况下，将构成融合蛋白的抗体作为抗原进行识别的抗体为抗人IgG抗体。
在上述对融合蛋白具有亲和性的物质之中，蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、将构成融合蛋白的抗体作为抗原进行识别的抗体也可以称为对融合蛋白具有亲和性的物质，或者也可以称为对抗体具有亲和性的物质。
蛋白A为存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁的分子量约42kD的蛋白质。蛋白A能够特异性地与IgG1、IgG2和IgG4类的人抗体(或人源化抗体)的Fc区域结合。另外，蛋白A也能够与属于VH3亚家族的IgG的Fab区域结合。因此，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体具有Fc区域且为IgG1、IgG2和IgG4类的人抗体(或人源化抗体)的情况下，使用蛋白A。另外，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体为属于VH3亚家族的人抗体(或人源化抗体)的Fab、F(ab’)或F(ab’)2的情况下，也可以使用蛋白A。
关于在此使用的蛋白A，只要对抗体具有所期望的亲和性，则并不限定于野生型的蛋白A，也可以为使野生型的蛋白A的氨基酸序列的1～10个氨基酸发生置换、缺失、添加而得到的突变型蛋白A。此外，只要对抗体具有所期望的亲和性，也可以为包含野生型或突变型蛋白A的氨基酸序列的部分序列的肽。该部分序列包含与抗体结合的区域。
蛋白G是作为链球菌的菌体成分之一的蛋白质，特别是已知分子量为约65kD(G148蛋白G)的蛋白G和分子量为约58kD(C40蛋白G)的蛋白G。蛋白G能够特异性地与IgG1、IgG2、IgG3和IgG4类的人抗体(或人源化抗体)结合。因此，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体为不与蛋白A结合的IgG3类的抗体的情况下，可以通过使用蛋白G对融合蛋白进行纯化。
关于在此使用的蛋白G，只要对抗体具有所期望的亲和性，则并不限定于野生型的蛋白G，也可以为使野生型的蛋白G的氨基酸序列的1～10个氨基酸发生置换、缺失、添加而得到的突变型蛋白G。此外，只要对抗体具有所期望的亲和性，也可以为包含野生型或突变型蛋白A的氨基酸序列的部分序列的肽。该部分序列包含与抗体结合的区域。野生型的蛋白G具有白蛋白结合区域，但在本发明中可以特别优选使用使该区域缺失的突变型蛋白G。
蛋白L是作为大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的菌体成分之一的蛋白质。蛋白L能够特异性地与人抗体(或人源化抗体)的轻链的κ链之中属于κI、κIII和κIV亚类的κ链结合。因此，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体为具有属于这些亚类的轻链的抗体的情况下，即使抗体为Fab或ScFv，也可以使用蛋白L。
关于在此使用的蛋白L，只要对抗体具有所期望的亲和性，则并不限定于野生型的蛋白L，也可以为使野生型的蛋白L的氨基酸序列的1～10个氨基酸发生置换、缺失、添加而得到的突变型蛋白L。此外，只要对抗体具有所期望的亲和性，也可以为包含野生型或突变型蛋白L的氨基酸序列的部分序列的肽。该部分序列包含与抗体结合的区域。
蛋白A/G是使四个蛋白A的Fc结合区域和两个蛋白G的Fc结合区域结合而成的人造蛋白质。蛋白A/G兼具蛋白G和蛋白A这两者的性质，能够纯化可利用蛋白A进行纯化的抗体和可利用蛋白G进行纯化的抗体中的任意一种。
在构成融合蛋白的一部分的抗体为人IgG的情况下，将构成融合蛋白的一部分的抗体作为抗原进行识别的抗体为特异性地结合该人IgG的抗人IgG抗体。该抗人IgG抗体可以通过使用融合蛋白或构成其一部分的抗体作为抗原对动物进行免疫，以单克隆抗体的形式或以多克隆抗体的形式来制作。
在抗体为抗转铁蛋白受体(TfR)抗体、抗胰岛素受体抗体、抗瘦素受体抗体、抗脂蛋白受体抗体、抗IGF受体抗体、抗OATP-F抗体、抗有机阴离子转运体抗体、抗MCT-8抗体、抗单羧酸转运体抗体和Fc受体抗体的情况下，构成融合蛋白的一部分的抗体作为抗原进行识别的物质分别为TfR、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F、有机阴离子转运体、MCT-8和Fc受体的细胞外区域。
纯化工序的另一个步骤为使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对磷酸基具有亲和性的固定相没有特别限定，优选羟基磷灰石和氟磷灰石、特别优选羟基磷灰石。加载于该柱色谱中的包含融合蛋白的溶液优选在加载前将其pH调节至6.8～7.8。
在上述纯化工序的另一个步骤中，融合蛋白结合至预先利用含有盐和磷酸的pH为中性附近的缓冲液进行了平衡化的固定相上。此时使用的缓冲液优选为MES缓冲液，其pH优选为6.8～7.8。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为70～230mM、更优选为160～220mM。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为0.2～4.0mM、更优选为1～2.5mM。
将结合有融合蛋白的柱清洗后，利用含有盐的pH为中性附近的缓冲液使融合蛋白从柱上洗脱，回收含有融合蛋白的级分。此时使用的缓冲液优选为磷酸缓冲液，其pH优选为6.8～7.8。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为10～50mM、更优选为20～40mM。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为70～230mM、更优选为160～220mM。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为0.2～4.0mM。
作为纯化工序的又一步骤的、利用尺寸排阻柱色谱的纯化工序是用于除去内毒素等低分子的杂质、融合蛋白的多聚体、分解物等的工序，由此，能够得到实质上较纯的融合蛋白。
在融合蛋白的纯化工序中，也可以追加使有可能从培养上清中带入的病毒失活的工序。该病毒失活工序可以在纯化工序的第一步骤之前实施，可以在纯化工序的各步骤之间实施，也可以在纯化工序结束后实施。例如，在纯化工序依次进行使用结合有对融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱(纯化工序的第一步骤)、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱(纯化工序的第二步骤)、以及尺寸排阻柱色谱(纯化工序的第三步骤)的情况下，病毒失活工序优选在纯化工序的第一步骤之前或者纯化工序的第一步骤与第二步骤之间实施。
病毒失活工序通过在含有融合蛋白的溶液中添加非离子性表面活性剂，并在20～60℃下搅拌2～6小时来进行。作为此时使用的非离子性表面活性剂的优选例，可以列举聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和磷酸三正丁基酯、或它们的混合物。
病毒失活工序也可以使用病毒除去膜来进行。通过使含有融合蛋白的溶液在孔径为35nm、20nm的病毒除去膜中通过，能够除去溶液中含有的病毒。
使用本发明的制造方法得到的融合蛋白的纯化品是能够直接作为药物使用的纯度的纯化品。融合蛋白的纯化品中含有的来源于宿主细胞的蛋白质(HCP)的浓度优选小于300ppm、更优选小于100ppm，例如小于60ppm。另外，融合蛋白的纯化品中含有的聚合物在融合蛋白整体中所占的比率优选小于1％。
在使用本发明的制造方法得到的融合蛋白的纯化品作为药物进行供给的情况下，可以以含有适当的赋形剂的水性液剂或冷冻干燥制剂的形式供给。在制成水性液剂的情况下，可以制成填充于管形瓶中的形态，也可以以预先填充于注射器中的预填充型制剂的形式供给。在冷冻干燥制剂的情况下，在使用前溶解于水性介质中后使用。
融合蛋白的纯化品在作为药物给药于人时，作为注射剂，可以给药至例如静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内，优选静脉内给药。
另外，融合蛋白的纯化品在给药于人时能够通过BBB，因此，能够用作伴有中枢神经障碍的各种疾病的治疗剂。通过给药融合蛋白，能够预防、缓解中枢神经障碍，或者能够延缓其进展。
以下，对该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号14所表示的氨基酸序列的融合蛋白(人源化抗hTfR抗体-I2S)的纯化方法进行详述。需要说明的是，构成该融合蛋白的一部分的抗体为IgG1类的抗体。
纯化工序的第一步骤为使用结合有对融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对抗体具有亲和性的物质没有特别限定，优选为蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、抗人IgG1抗体、作为抗体的抗原的hTfR或抗人I2S抗体，更优选为蛋白A。在该物质为hTfR的情况下，为其细胞外区域。
在第一步骤中，在使用蛋白A作为对融合蛋白具有亲和性的物质的情况下，使含有融合蛋白的培养上清结合至预先利用含有盐的中性附近的缓冲液进行了平衡化的柱上。此时使用的缓冲液优选为氨基丁三醇缓冲液，其pH优选为6.5～7.5、更优选为约7.0。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为60～180mM、更优选为100～150mM、进一步优选为约140mM。
将结合有融合蛋白的柱清洗后，利用含有盐的酸性的缓冲液使融合蛋白洗脱，回收含有融合蛋白的级分。此时使用的缓冲液优选为甘氨酸缓冲液，其pH优选为3.2～3.8、更优选为3.5。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为60～180mM、更优选为100～150mM、进一步优选为约140mM。将回收的含有融合蛋白的溶液的pH迅速调节至中性附近。
纯化工序的第二步骤为使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对磷酸基具有亲和性的固定相没有特别限定，优选羟基磷灰石和氟磷灰石、特别优选羟基磷灰石。
在纯化工序的第二步骤中，在作为固定相使用羟基磷灰石作为对磷酸基具有亲和性的材料的情况下，融合蛋白结合至预先利用含有盐和磷酸的pH为中性附近的缓冲液进行了平衡化的固定相上。此时使用的缓冲液优选为MES缓冲液，其pH优选为6.8～7.8、更优选为pH7.3。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为150～230mM、更优选为215mM。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为1.0～4.0mM、更优选为2.0mM。
将结合有融合蛋白的柱清洗后，利用含有盐的pH为中性附近的缓冲液使融合蛋白从柱上洗脱，回收含有融合蛋白的级分。此时使用的缓冲液优选为磷酸缓冲液，其pH优选为6.8～7.8、更优选为pH7.3。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为30～50mM、更优选为约35mM。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为150～230mM、更优选为215mM。
纯化工序的第三步骤为尺寸排阻柱色谱。该步骤是用于除去内毒素等低分子的杂质、融合蛋白的多聚体、分解物等的步骤，由此，能够得到实质上较纯的融合蛋白。
在人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化工序中，也可以追加使有可能从培养上清中带入的病毒失活的工序。该病毒失活工序可以在纯化工序的第一步骤之前实施，可以在纯化工序的各步骤之间实施，也可以在纯化工序结束后实施，例如，在纯化工序的第一步骤之前或者纯化工序的第一步骤与第二步骤之间实施。
病毒失活工序通过在含有人源化抗hTfR抗体-I2S的溶液中添加非离子性表面活性剂，并在20～60℃下搅拌2～6小时来进行。作为此时使用的非离子性表面活性剂的优选例，可以列举聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和磷酸三正丁基酯、或它们的混合物。
病毒失活工序也可以使用病毒除去膜来进行。通过使含有人源化抗hTfR抗体-I2S的溶液在孔径为35nm、20nm的病毒除去膜中通过，能够除去溶液中含有的病毒。
使用本发明的制造方法得到的人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化品是能够直接作为药物使用的纯度的纯化品。人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化品中含有的来源于宿主细胞的蛋白质(HCP)的浓度小于100ppm、例如小于60ppm、小于40ppm等。另外，人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化品中含有的聚合物在人源化抗hTfR抗体-I2S整体中所占的比率小于1％、例如小于0.8％、小于0.6％、小于0.5％等。
在使用本发明的制造方法得到的人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化品作为药物进行供给的情况下，可以以含有适当的赋形剂的水性液剂或冷冻干燥制剂的形式供给。在制成水性液剂的情况下，可以制成填充于管形瓶中的形态，也可以以预先填充于注射器中的预填充型制剂的形式供给。在冷冻干燥制剂的情况下，在使用前溶解于水性介质中后使用。
人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化品在作为药物给药于人时，作为注射剂，可以给药至例如静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内。例如，该纯化品可以通过点滴进行静脉内给药。
另外，人源化抗hTfR抗体-I2S的纯化品能够用作亨特综合征、特别是伴有中枢神经障碍的亨特综合征的治疗剂。给药于亨特综合征的患者的人源化抗hTfR抗体-I2S能够分解蓄积在患者的脏器中的糖胺聚糖(GAG)，进而还能够通过BBB而分解蓄积在脑组织内的GAG，因此能够预防、缓解亨特综合征的中枢神经障碍，或者能够延缓其进展。
实施例
以下，参考实施例进一步详细地对本发明进行说明，但并没有将本发明限定于实施例的意图。
[实施例1]hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白表达用载体的构建
使用编码由具有序列号6所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号7所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗hTfR抗体编号1、由具有序列号8所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号9所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗hTfR抗体编号2、由具有序列号10所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号11所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗hTfR抗体编号3这三种人源化抗hTfR抗体(编号1～3)的基因，构建人源化抗hTfR抗体-hI2S融合蛋白表达用载体。
用KpnI和NcoI消化pEF/myc/nuc载体(Invitrogen公司)，将包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域切出，利用T4 DNA聚合酶对其进行平滑末端化处理。用BglII和EcoRI消化pCI-neo载体(Invitrogen公司)，切除包含CMV的增强子/启动子和内含子的区域后，用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理。在其中插入上述包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pE-neo载体。用SfiI和BstXI消化pE-neo载体，切除包含新霉素耐性基因的约1kbp的区域。以pcDNA3.1/Hygro(+)载体(Invitrogen公司)作为模板，使用引物Hyg-Sfi5’(序列号27)和引物Hyg-BstX3’(序列号28)，通过PCR反应对潮霉素基因进行扩增。用SfiI和BstXI消化扩增出的潮霉素基因，插入到上述切除了新霉素耐性基因的pE-neo载体中，构建pE-hygr载体。pE-hygr载体的构建法也公开在专利文献(日本特开2009-273427)中。
人工合成包含编码具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号1的轻链全长的基因的DNA片段(序列号21)。在该DNA片段的5’侧导入MluI序列，在3’侧导入NotI序列。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI-NotI间。将所得到的载体作为人源化抗hTfR抗体编号1的轻链表达用载体pE-hygr(LC1)。
人工合成包含编码具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号2的轻链全长的基因的DNA片段(序列号22)。在该DNA片段的5’侧导入MluI序列，在3’侧导入NotI序列。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI-NotI间。将所得到的载体作为人源化抗hTfR抗体编号2的轻链表达用载体pE-hygr(LC2)。
人工合成包含编码具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号3的轻链全长的基因的DNA片段(序列号23)。在该DNA片段的5’侧导入MluI序列，在3’侧导入NotI序列。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI-NotI间。将所得到的载体作为人源化抗hTfR抗体编号3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)。
人工合成具有序列号24所表示的碱基序列的DNA片段，该DNA片段包含编码在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号1的重链的C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头结合具有序列号5所表示的氨基酸序列的hI2S而得到的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号12所表示的氨基酸序列、使人源化抗hTfR抗体编号1的重链与hI2S结合而得到的蛋白质。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI与NotI之间，构建pE-neo(HC-I2S-1)。
人工合成具有序列号25所表示的碱基序列的DNA片段，该DNA片段包含编码在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号2的重链的C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头结合具有序列号5所表示的氨基酸序列的hI2S而得到的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号13所表示的氨基酸序列、使人源化抗hTfR抗体编号2的重链与hI2S结合而得到的蛋白质。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI与NotI之间，构建pE-neo(HC-I2S-2)。
人工合成具有序列号26所表示的碱基序列的DNA片段，该DNA片段包含编码在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号3的重链的C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头结合具有序列号5所表示的氨基酸序列的hI2S而得到的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号14所表示的氨基酸序列、使人源化抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S结合而得到的蛋白质。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI与NotI之间，构建pE-neo(HC-I2S-3)。
[实施例2-1]hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株的制作
使用GenePulser(Bio-Rad公司)，利用实施例1中构建的pE-hygr(LC1)与pE-neo(HC-I2S-1)的组合、实施例1中构建的pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-2)的组合、以及实施例1中构建的pE-hygr(LC3)与pE-neo(HC-I2S-3)的组合，通过下述方法分别对CHO细胞(CHO-K1，由美国典型培养物保藏中心获得)进行转化。
细胞的转化大致利用以下的方法进行。将5×105个CHO-K1细胞接种到添加有CDOptiCHOTM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)的3.5cm培养皿中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。培养后，以达到5×106个细胞/mL的密度的方式将细胞悬浮在Opti-MEMTMI培养基(Thermo Fisher Scientific公司)中。采集100μL的细胞悬浮液，在其中添加用CDOptiCHOTM培养基稀释至100μg/mL的pE-hygr(LC1)和pE-neo(HC-I2S-1)质粒DNA溶液各5μL。使用GenePulser(Bio-Rad公司)实施电穿孔，在细胞中导入质粒。在37℃、5％CO2的条件下培养一晚后，将细胞在添加有0.5mg/mL的潮霉素和0.8mg/mL的G418的CD OptiCHOTM培养基中进行选择培养。对于pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-2)的组合、以及pE-hygr(LC3)与pE-neo(HC-I2S-3)的组合，也利用同样的方法转化细胞。
接着，利用有限稀释法，按照每一孔接种一个以下的细胞的方式将通过选择培养选择出的细胞接种到96孔板上，培养约10天，以使各细胞形成单克隆菌落。采集形成有单克隆菌落的孔的培养上清，利用ELISA法调查人源化抗体含量，选择出hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株。
此时的ELISA法大致利用以下的方法实施。在96孔微量滴定板(Nunc公司)的各孔中各添加100μL用0.05M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将山羊抗人IgG多克隆抗体溶液稀释至4μg/mL而得到的溶液，在室温下静置至少1小时，使抗体吸附到板上。接着，用在磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中添加有0.05％Tween20的溶液(PBS-T)将各孔清洗3次后，在各孔中各添加200μL Starting Block(PBS)封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)，将板在室温下静置30分钟。接着，将各孔用PBS-T清洗3次后，在各孔中各添加100μL用在磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中添加有0.5％BSA和0.05％Tween20的溶液(PBS-BT)稀释至适当浓度的培养上清或人IgG标准品，将板在室温下静置至少1小时。接着，将板用PBS-T清洗3次后，在各孔中各添加100μL用PBS-BT稀释的HRP标记抗人IgG多克隆抗体溶液，将板在室温下静置至少1小时。用PBS-T将各孔清洗3次后，在各孔中各添加100μL含有0.4mg/mL邻苯二胺的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)，在室温下静置8～20分钟。接着，在各孔中各添加100μL的1mol/L硫酸，使反应停止，使用96孔板酶标仪，对各孔测定490nm下的吸光度。选择出显示高测定值的孔所对应的细胞作为hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株。
将利用pE-hygr(LC1)与pE-neo(HC-I2S-1)的组合进行转化而得到的hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hI2S-抗hTfR抗体表达株1。将该细胞株表达的hI2S与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为I2S-抗hTfR抗体1。
将利用pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-2)的组合进行转化而得到的hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hI2S-抗hTfR抗体表达株2。将该细胞株表达的hI2S与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为I2S-抗hTfR抗体2。
将利用pE-hygr(LC3)与pE-neo(HC-I2S-3)的组合进行转化而得到的hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hI2S-抗hTfR抗体表达株3。将该细胞株表达的hI2S与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为I2S-抗hTfR抗体3。
[实施例3]hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株的制作
使实施例2中得到的hI2S-抗hTfR抗体表达株1～3悬浮在含有10mg/L胰岛素、40mg/mL胸苷和10％(v/v)DMSO的CD OptiCHOTM培养基中后，分注到冻存管中，作为种子细胞在液氮中保存。
[实施例4]hI2S-抗hTfR抗体表达株的培养
利用以下的方法制造I2S-抗hTfR抗体。将实施例2-1中得到的hI2S-抗hTfR抗体表达株3按照细胞密度为约2×105个/mL的方式悬浮在含有4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、100μmol/L次黄嘌呤和16μmol/L胸苷的约200L无血清培养基(EX-CELL高级CHO流加培养基、Sigma Aldrich公司)中。将140L该细胞悬浮液移至培养槽中。利用叶轮以89rpm的速度对培养基进行搅拌，将培养基的溶解氧饱和度保持于约40％，在34～37℃的温度范围内将细胞培养约11天。培养期间中，对细胞数、细胞的存活率、培养基的葡萄糖浓度和乳酸浓度进行监测。在培养基的葡萄糖浓度小于15mmol/L的情况下，立即向培养基中添加葡萄糖溶液，以使葡萄糖浓度为37.89mmol/L。培养结束后回收培养基。利用Millistak+HC Pod过滤器D0HC级(Merck公司)对回收的培养基进行过滤，进一步利用Millistak+HC X0HC级(Merck公司)进行过滤，得到含有I2S-抗hTfR抗体3的培养上清。使用PelliconTM 3Cassette w/UltracelPLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：1.14m2、Merck公司)对该培养上清进行超滤，浓缩至液量为约十七分之一为止。接着，使用Opticap XL600(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。将所得到的液体作为浓缩培养上清。
[实施例5]病毒的失活
在实施例4中得到的浓缩培养上清中添加磷酸三正丁基酯(TNBP)和聚山梨醇酯80，使终浓度分别为0.3％(v/v)和1％(w/v)，在室温下轻柔地搅拌4小时。该操作用于使混入到培养上清中的病毒失活。但是，只要使用不含有生物来源成分的无血清培养基来培养细胞，则几乎没有在培养上清中混入对人体有害的病毒的可能性。
[实施例6]hI2S-抗hTfR抗体的纯化
将病毒失活后的浓缩培养上清添加到0.5倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中后，利用Millipak-200过滤单元(孔径：0.22μm、Merck公司)进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)平衡化的、作为蛋白A亲和柱的MabSelect SuRe LX柱(柱体积：约3.2L、柱床高：约20cm、GE Healthcare公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到蛋白A上。
接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的含有500mM NaCl和450mM精氨酸的10mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)，对柱进行清洗。接着，以相同流速供给柱体积的2.5倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，进一步对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有140mM NaCl的100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)使吸附在蛋白A上的I2S-抗hTfR抗体3洗脱。洗脱液接收到预先装有1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)的容器中，立即进行中和。
在由上述蛋白A亲和柱得到的洗脱液中依次添加200mM磷酸缓冲液(pH7.0)、含有4M NaCl和2mM磷酸缓冲液的10mM MES缓冲液(pH7.3)、以及1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，将洗脱液中含有的磷酸钠和NaCl的浓度分别调节至2mM和215mM，并且将洗脱液的pH调节至7.3。接着，利用Opticap XL600(孔径：0.22μm、Merck公司)对该洗脱液进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有215mM NaCl和2mM磷酸钠的10mM MES缓冲液(pH7.3)平衡化的、作为羟基磷灰石柱的CHT II型40μm柱(柱体积：约3.2L、柱床高：约20cm、Bio-Rad公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到羟基磷灰石上。
接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的该缓冲液，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有215mM NaCl的35mM磷酸缓冲液(pH7.3)使吸附在羟基磷灰石上的I2S-抗hTfR抗体3洗脱。需要说明的是，利用羟基磷灰石柱进行的纯化每次使用由蛋白A亲和柱得到的洗脱液的一半，分两次实施。
在上述由羟基磷灰石柱得到的洗脱液中添加稀盐酸，将pH调节至6.5。接着，使用PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：1.14m2、Merck公司)进行超滤，浓缩至溶液中的I2S-抗hTfR抗体3的浓度为约2mg/mL为止。接着，使用OpticapXL600(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。
将上述浓缩液以19cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的5倍体积的含有0.8mg/mLNaCl和75mg/mL蔗糖的20mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡化的、作为尺寸排阻柱的Superdex 200柱(柱体积：约12.6L、柱床高：40cm、GE Healthcare公司)上，进一步以相同的流速供给该缓冲液。此时，在由尺寸排阻柱得到的洗脱液的流道中配置用于连续测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm下显示出吸收峰的级分作为包含I2S-抗hTfR抗体3的级分，将其作为I2S-抗hTfR抗体纯化品。需要说明的是，利用尺寸排阻柱进行的纯化每次使用由羟基磷灰石柱得到的洗脱液的一半，分两次实施。
[实施例7]纯化各步骤中的I2S-抗hTfR抗体的回收率的测定
使用实施例2中记载的ELISA法对纯化各步骤中的I2S-抗hTfR抗体3的加载量和洗脱液中回收的量进行测定。将其结果示于表1。回收了30.6g的I2S-抗hTfR抗体3作为纯化品，其相当于当初培养上清中含有的36.7g的I2S-抗hTfR抗体3的约76.5％。这些结果表明，上述实施例中记载的纯化法作为I2S-抗hTfR抗体3的纯化方法是效率非常高的。需要说明的是，表1中，工序回收率(％)是指各纯化步骤中的回收的rhI2S量相对于加载的rhI2S量的比率，总回收率(％)是指各纯化步骤中回收的rhI2S量相对于供于纯化工序的rhI2S量的初始量的比率。
[表1]
(表1)纯化各步骤中的I2S-抗hTfR抗体3的回收率
Figure BDA0001974655560000471
[实施例8]I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析(HCP的定量)
利用ELISA法对I2S-抗hTfR抗体纯化品中含有的来源于宿主细胞的蛋白质(HCP)的量进行定量。首先，在96孔板(Nunc公司)的各孔中添加来源于抗CHO细胞的蛋白质抗体100μL，静置一晚，使抗体吸附。将各孔清洗3次后，在各孔中添加含有酪蛋白的封闭溶液200μL，在25℃下振荡60分钟。将各孔清洗3次后，在各孔中分别添加含有I2S-抗hTfR抗体纯化品的溶液(样品溶液)或HCP标准溶液100μL，在25℃下振荡2小时。将各孔清洗3次后，在各孔中添加生物素化的来源于抗CHO细胞的蛋白质抗体100μL，在25℃下振荡60分钟。将各孔清洗3次后，添加HRP偶联链霉抗生物素蛋白(Jackson Immuno Research Laboratories公司)100μL，在25℃下振荡60分钟。将各孔清洗3次后，在各孔中添加TMB底物溶液100μL，在25℃下振荡使其显色。TMB底物溶液使用TMB微孔过氧化物酶底物系统(KPL公司)的TMB过氧化物酶底物与过氧化物酶底物溶液B的等量混合物。显色后，在各孔中添加1mol/L硫酸100μL，使酶反应停止，利用96孔板酶标仪测定各孔在450nm下的吸光度。由HCP标准溶液的测定值制作标准曲线，将样品溶液的值内插于标准曲线，对I2S-抗hTfR抗体纯化品中含有的HCP进行定量。由这样求出的HCP的定量值和使用实施例2中记载的ELISA法测定的I2S-抗hTfR抗体纯化品的定量值对I2S-抗hTfR抗体纯化品中含有的HCP进行定量。其结果可知，I2S-抗hTfR抗体纯化品中含有的HCP的量为约35ppm(即，1mg的I2S-抗hTfR抗体纯化品中有约35ng的HCP)。
[实施例9]I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析(SE-HPLC分析)
将TSKgel UltraSW Aggregate柱(内径7.8mm×高度30cm、东曹公司)设置到LC-20A系统、SPD-20AV的UV/VIS检测器(岛津制作所公司)中。将柱用含有5％丙醇和20mM NaCl的200mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡化。在该柱上以0.5mL/分钟的恒定流速加载以1mg/mL的浓度含有实施例6中得到I2S-抗hTfR抗体纯化品的10μL溶液，进一步以相同的流速供给该缓冲液。将测定215nm下的吸光度而制作的洗脱曲线示于图1。所得到的曲线基本仅显示出来自于I2S-抗hTfR抗体3的单个的峰。但是，确认到在主峰(图中峰A)前检测到的来自于I2S-抗hTfR抗体3的聚合物的峰(图中峰B)。由峰整体的面积与峰B的面积的比率计算出聚合物在I2S-抗hTfR抗体3整体中所占的比率为约0.49％。
[实施例10]I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析(总结)
以上的I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析结果表明，实施例6中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品几乎不含有包括HCP的夹杂物；聚合物的存在比率极低。即，可以说I2S-抗hTfR抗体纯化品是能够作为药物、例如作为静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内给药剂直接使用的品质的纯化品。
[实施例11]hI2S-抗hTfR抗体表达株的培养(其他方法)
将实施例3中得到的hI2S-抗hTfR抗体表达株3的种子细胞在37℃水浴中融解。将细胞以4×105个/mL的密度悬浮在含有4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、100μmol/L次黄嘌呤、16μmol/L胸苷、500μg/mL潮霉素B和10μg/mL嘌呤霉素的无血清培养基(EX-CELL高级CHO流加培养基、Sigma Aldrich公司)中，在37℃、5％CO2的条件下振荡培养3天。反复进行该培养直至细胞数增殖到至少5×1011个为止。
接着，将细胞以细胞密度达到约2×105个/mL的方式悬浮在含有4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、100μmol/L次黄嘌呤和16μmol/L胸苷的无血清培养基(EX-CELL高级CHO流加培养基、Sigma Aldrich公司)中。将约1400L该细胞悬浮液移至培养槽中，利用叶轮以80rpm的速度进行搅拌，将培养基的pH保持于6.9、将溶解氧饱和度保持于约40％，将培养温度调节至34～37℃的范围，同时将细胞培养约11天。另外，从第3天到第10天每天各添加70L含有35g/L葡萄糖的EX-CELL高级CHO Feed1。培养中每天实施采样，测定细胞数、存活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度。从第5天至第11天测定抗hTfRAb-I2S表达量。在葡萄糖浓度小于15mmol/L的情况下，立即添加葡萄糖以达到37.89mmol/L的浓度。
培养结束后回收培养基。利用Millistak+HC Pod过滤器D0HC级(Merck公司)对回收的培养基进行过滤，进一步利用Millistak+HC X0HC级(Merck公司)进行过滤，得到含有I2S-抗hTfR抗体3的培养上清。该培养上清使用PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：9.12m2、Merck公司)对该培养上清进行超滤，浓缩至液量为约十三分之一为止。接着，使用Opticap XL600(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。将所得到的液体作为浓缩培养上清。
[实施例12]hI2S-抗hTfR抗体的纯化(其他方法)
将实施例11中得到的浓缩培养上清的1/3液量以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)平衡化的、作为蛋白A亲和柱的MabSelect SuRe LX柱(柱体积：约9.8L、柱床高：约20cm、GE Healthcare公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到蛋白A上。
接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的含有500mM NaCl和450mM精氨酸的10mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)，对柱进行清洗。接着，以相同流速供给柱体积的2.5倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有140mM NaCl的100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)使吸附在蛋白A上的I2S-抗hTfR抗体3洗脱。洗脱液接收到装有100mM MES缓冲液(pH7.0)的容器中，立即进行中和。
在由上述蛋白A亲和柱得到的洗脱液中添加聚山梨醇酯80，以使终浓度为1％(w/v)，在室温下轻柔地搅拌3小时以上。该工序用于使有可能混入到洗脱液中的病毒失活。
在上述病毒失活后的溶液中依次添加200mM磷酸缓冲液(pH7.0)、含有4M NaCl和2mM磷酸缓冲液的10mM MES缓冲液(pH7.3)、以及1M Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，将洗脱液中含有的磷酸钠和NaCl的浓度分别调节至2mM和215mM，并且将洗脱液的pH调节至7.3。接着，利用OPTICAP SHC XL3(0.22μm、Merck公司)对该洗脱液进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有215mM NaCl和2mM磷酸缓冲液的10mM MES缓冲液(pH7.3)平衡化的、作为羟基磷灰石柱的CHT II型40μm柱(柱体积：约19.2L、柱床高：约20cm、Bio-Rad公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到羟基磷灰石上。
接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的该缓冲液，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有215mM NaCl的35mM磷酸缓冲液(pH7.3)使吸附在羟基磷灰石上的I2S-抗hTfR抗体3洗脱。
在上述由羟基磷灰石柱得到的洗脱液中添加稀盐酸，将pH调节至6.5。接着，使用PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：2.85m2、Merck公司)进行超滤，浓缩至溶液中的I2S-抗hTfR抗体3的浓度为约20mg/mL为止。接着，使用OPTICAPSHC XL3(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。
将上述浓缩液以24cm/hr以下的流速加载到预先用柱体积的5倍体积的含有0.8mg/mL NaCl和75mg/mL蔗糖的20mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡化的、作为尺寸排阻柱的Superdex 200柱(柱体积：约38.5L、柱床高：40cm、GE Healthcare公司)上，进一步以相同的流速供给该缓冲液。此时，在由尺寸排阻柱得到的洗脱液的流道中配置用于连续测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm下显示出吸收峰的级分作为包含I2S-抗hTfR抗体3的级分。将回收的溶液用Planova 20N(尺寸：0.3m2、旭化成医疗公司)和Millipak-100过滤单元(孔径：0.22μm、Merck公司)进行过滤。将过滤后的溶液作为I2S-抗hTfR抗体纯化品。
[实施例13]纯化各步骤(其他方法)中的I2S-抗hTfR抗体的回收率的测定
利用实施例2中记载的ELISA法或吸光度测定对纯化各步骤(其他方法)中的I2S-抗hTfR抗体3的加载量和洗脱液中回收的量进行测定。将其结果示于表2。回收了68.8g的I2S-抗hTfR抗体3作为纯化品，其相当于当初培养上清中含有的96.8g的I2S-抗hTfR抗体3的约82％。这些结果表明，上述实施例12中记载的纯化法(其他方法)作为I2S-抗hTfR抗体的纯化方法是效率非常高的。需要说明的是，表3中的工序回收率(％)和总回收率(％)的含义与表1中所用的含义相同。
[表2]
(表2)纯化各步骤中的I2S-抗hTfR抗体3的回收率
Figure BDA0001974655560000511
[实施例14]利用其他方法得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析(HCP的定量)
对于实施例12中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品，利用实施例8中记载的方法进行HCP的定量。其结果可知，I2S-抗hTfR抗体纯化品中含有的HCP的量为约20ppm(即，1mg的I2S-抗hTfR抗体纯化品中有约20ng的HCP)。
[实施例13]利用其他方法得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析(SE-HPLC分析)
对于实施例12中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品，利用实施例9中记载的方法进行SE-HPLC分析。将其分析结果示于图2。所得到的曲线基本仅显示出来自于I2S-抗hTfR抗体3的单个的峰。但是，确认到在主峰(图中峰A)前检测到的来自于I2S-抗hTfR抗体3的聚合物的峰(图中峰B)。由峰整体的面积与峰B的面积的比率计算出聚合物在I2S-抗hTfR抗体3整体中所占的比率为约0.37％。
[实施例10]利用其他方法得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析(总结)
以上的I2S-抗hTfR抗体纯化品的分析结果表明，实施例12中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品几乎不含有包括HCP的夹杂物；聚合物的存在比率极低。即，可以说利用其他方法得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品是能够作为药物、例如作为静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内给药剂直接使用的品质的纯化品。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供例如纯化至能够直接作为药物使用的纯度的、抗体与其他蛋白质融合而成的融合蛋白。
序列表白由文本
序列号1：接头的氨基酸序列的例1
序列号2：接头的氨基酸序列的例2
序列号3：接头的氨基酸序列的例3
序列号6：人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的氨基酸序列
序列号7：人源化抗hTfR抗体编号1的重链的氨基酸序列
序列号8：人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的氨基酸序列
序列号9：人源化抗hTfR抗体编号2的重链的氨基酸序列
序列号10：人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的氨基酸序列
序列号11：人源化抗hTfR抗体编号3的重链的氨基酸序列
序列号12：人源化抗hTfR抗体编号1的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
序列号13：人源化抗hTfR抗体编号2的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
序列号14：人源化抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
序列号15：人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的可变区的氨基酸序列
序列号16：人源化抗hTfR抗体编号1的重链的可变区的氨基酸序列
序列号17：人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的可变区的氨基酸序列
序列号18：人源化抗hTfR抗体编号2的重链的可变区的氨基酸序列
序列号19：人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的可变区的氨基酸序列
序列号20：人源化抗hTfR抗体编号3的重链的可变区的氨基酸序列
序列号21：包含编码人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列
序列号22：包含编码人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列
序列号23：包含编码人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列
序列号24：编码人源化抗hTfR抗体编号1的重链与hI2S的融合蛋白的碱基序列、合成序列
序列号25：编码人源化抗hTfR抗体编号2的重链与hI2S的融合蛋白的碱基序列、合成序列
序列号26：编码人源化抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S的融合蛋白的碱基序列、合成序列
序列号27：引物Hyg-Sfi5’、合成序列
序列号28：引物Hyg-BstX3’、合成序列
序列表
<110> JCR制药股份有限公司（JCR Pharmaceuticals Co., Ltd.）
<120> 抗体融合蛋白的制造方法（Method for Production of Antigen FusionProteins）
<130> 1211JP
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例接头1的氨基酸序列
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例接头2的氨基酸序列
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例接头3的氨基酸序列
<400> 3
Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210> 4
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1               5                   10                  15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
            20                  25                  30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
        35                  40                  45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65                  70                  75                  80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
                85                  90                  95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
            100                 105                 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
    130                 135                 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145                 150                 155                 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
                165                 170                 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
        195                 200                 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
    210                 215                 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
                245                 250                 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
            260                 265                 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
        275                 280                 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
    290                 295                 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305                 310                 315                 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
            340                 345                 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
        355                 360                 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
    370                 375                 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385                 390                 395                 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
                405                 410                 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
            420                 425                 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
        435                 440                 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
    450                 455                 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465                 470                 475                 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
                485                 490                 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
            500                 505                 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
        515                 520                 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
    530                 535                 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545                 550                 555                 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
                565                 570                 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
            580                 585                 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
        595                 600                 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
    610                 615                 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625                 630                 635                 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
                645                 650                 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
            660                 665                 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
        675                 680                 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
    690                 695                 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705                 710                 715                 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
                725                 730                 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
            740                 745                 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
        755                 760
<210> 5
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
            20                  25                  30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
        35                  40                  45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
    50                  55                  60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65                  70                  75                  80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
                85                  90                  95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
            100                 105                 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
        115                 120                 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
    130                 135                 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145                 150                 155                 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
                165                 170                 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
            180                 185                 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
        195                 200                 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
    210                 215                 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225                 230                 235                 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
                245                 250                 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
            260                 265                 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
        275                 280                 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
    290                 295                 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305                 310                 315                 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
                325                 330                 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
            340                 345                 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
        355                 360                 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
    370                 375                 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385                 390                 395                 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
                405                 410                 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
            420                 425                 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
        435                 440                 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
    450                 455                 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465                 470                 475                 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
                485                 490                 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
            500                 505                 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro
        515                 520                 525
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的氨基酸序列
<400> 6
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 7
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号1的重链的氨基酸序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
        115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
    130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
            180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
        195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的氨基酸序列
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
            20                  25                  30
Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 9
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号2的重链的氨基酸序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
    210                 215                 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
            260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
        275                 280                 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
    290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305                 310                 315                 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
                325                 330                 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
            340                 345                 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
        355                 360                 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
    370                 375                 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385                 390                 395                 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
                405                 410                 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
            420                 425                 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Leu Ser Pro Gly Lys
    450
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210> 11
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号3的重链的氨基酸序列
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 12
<211> 973
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号1的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
        115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
    130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
            180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
        195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser
        435                 440                 445
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
    450                 455                 460
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
465                 470                 475                 480
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
                485                 490                 495
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
            500                 505                 510
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
        515                 520                 525
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
    530                 535                 540
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
545                 550                 555                 560
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
                565                 570                 575
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
            580                 585                 590
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
        595                 600                 605
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
    610                 615                 620
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
625                 630                 635                 640
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
                645                 650                 655
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
            660                 665                 670
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
        675                 680                 685
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
    690                 695                 700
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
705                 710                 715                 720
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
                725                 730                 735
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
            740                 745                 750
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
        755                 760                 765
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
    770                 775                 780
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
785                 790                 795                 800
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
                805                 810                 815
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
            820                 825                 830
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
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Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
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Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
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Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
                885                 890                 895
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
            900                 905                 910
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
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Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro
                965                 970
<210> 13
<211> 980
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号2的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
    210                 215                 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
            260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
        275                 280                 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
    290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
        355                 360                 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
    370                 375                 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385                 390                 395                 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
                405                 410                 415
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            420                 425                 430
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                485                 490                 495
Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala
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Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly
    530                 535                 540
Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr
545                 550                 555                 560
Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr
                565                 570                 575
Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser
            580                 585                 590
Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu
        595                 600                 605
His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly
    610                 615                 620
Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu
625                 630                 635                 640
Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His
                645                 650                 655
Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr
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Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr
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            740                 745                 750
Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala
        755                 760                 765
Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala
    770                 775                 780
Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu
785                 790                 795                 800
Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser
                805                 810                 815
Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu
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    850                 855                 860
Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp
865                 870                 875                 880
Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr
                885                 890                 895
Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu
            900                 905                 910
Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg
        915                 920                 925
Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe
    930                 935                 940
Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu
945                 950                 955                 960
Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln
                965                 970                 975
Leu Leu Met Pro
            980
<210> 14
<211> 975
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
Gly Ser Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val
    450                 455                 460
Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly
465                 470                 475                 480
Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser
                485                 490                 495
Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser
            500                 505                 510
Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr
        515                 520                 525
Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile
    530                 535                 540
Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys
545                 550                 555                 560
Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr
                565                 570                 575
Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn
            580                 585                 590
Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu
        595                 600                 605
Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys
    610                 615                 620
Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser
625                 630                 635                 640
Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro
                645                 650                 655
Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile
            660                 665                 670
Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala
        675                 680                 685
Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu
    690                 695                 700
Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys
705                 710                 715                 720
Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val
                725                 730                 735
Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr
            740                 745                 750
Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly
        755                 760                 765
Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu
    770                 775                 780
Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu
785                 790                 795                 800
Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met
                805                 810                 815
Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe
            820                 825                 830
Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro
        835                 840                 845
Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu
    850                 855                 860
Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly
865                 870                 875                 880
Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp
                885                 890                 895
Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile
            900                 905                 910
Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val
        915                 920                 925
Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala
    930                 935                 940
Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met
945                 950                 955                 960
Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro
                965                 970                 975
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的可变区的氨基酸序列
<400> 15
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 16
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号1的重链的可变区的氨基酸序列
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的可变区的氨基酸序列
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
            20                  25                  30
Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号2的重链的可变区的氨基酸序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
        115                 120
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的可变区的氨基酸序列
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗hTfR抗体编号3的重链的可变区的氨基酸序列
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 21
<211> 725
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的氨基酸序列的碱基序列, 合成序列
<400> 21
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgacatcca ggtcacacag tcaccaagtt ttctgagcgc aagcgtgggc 120
gacagggtca ctatcacatg caaggcaagc caggacgtga actccgcagt ggcctggttc 180
cagcagaagc cagggaaagc acccaagctg ctgatctatt ggacctctac aaggcacacc 240
ggtgtcccag atcggttctc aggttccggc agcggaacag tgtatactct gaccatttcc 300
agcctgcagc ctgaagactt cgctacttac tattgccagc agcattactc caccccaaga 360
acatttggcg gagggactaa agtggagatc aagaggaccg tggccgctcc ctccgtcttc 420
atttttcccc ctagcgacga acagctgaag agtggcacag cctcagtggt ctgtctgctg 480
aacaatttct accctaggga ggctaaagtg cagtggaagg tcgataacgc actgcagtct 540
ggaaatagtc aggagtcagt gacagaacag gactccaaag atagcactta ttctctgtct 600
agtacactga ctctgagcaa ggccgattac gaaaagcaca aagtgtatgc ttgcgaagtc 660
acccatcagg ggctgtcatc accagtcacc aagtcattca atagaggcga gtgctaagcg 720
gccgc 725
<210> 22
<211> 725
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的氨基酸序列的碱基序列, 合成序列
<400> 22
Ala Cys Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala
1               5                   10                  15
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly
        35                  40                  45
Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly
    50                  55                  60
Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr
65                  70                  75                  80
Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys
                85                  90                  95
Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala
            100                 105                 110
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr
        115                 120                 125
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala
    130                 135                 140
Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Ala
145                 150                 155                 160
Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala
            180                 185                 190
Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys
        195                 200                 205
Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Cys
    210                 215                 220
Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala
225                 230                 235                 240
Gly Gly Cys Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala Gly Gly Thr
                245                 250                 255
Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys
            260                 265                 270
Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr
        275                 280                 285
Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys
    290                 295                 300
Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys
305                 310                 315                 320
Cys Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys
                325                 330                 335
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Thr Cys Ala Thr
            340                 345                 350
Gly Gly Cys Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly
        355                 360                 365
Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly
    370                 375                 380
Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly
385                 390                 395                 400
Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Thr Gly Thr
                405                 410                 415
Cys Thr Thr Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr
            420                 425                 430
Thr Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala
        435                 440                 445
Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys
    450                 455                 460
Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly
465                 470                 475                 480
Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Ala Cys
                485                 490                 495
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala
            500                 505                 510
Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys
        515                 520                 525
Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala
    530                 535                 540
Ala Thr Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr
545                 550                 555                 560
Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Thr
                565                 570                 575
Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr
            580                 585                 590
Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr
        595                 600                 605
Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys
    610                 615                 620
Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala
625                 630                 635                 640
Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Thr Gly Cys Gly Ala
                645                 650                 655
Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly
            660                 665                 670
Cys Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala
        675                 680                 685
Cys Thr Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Gly
    690                 695                 700
Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Gly Cys Gly
705                 710                 715                 720
Gly Cys Cys Gly Cys
                725
<210> 23
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的氨基酸序列的碱基序列, 合成序列
<400> 23
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120
cagcctgcca gcatcagctg cagaagctct cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180
tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240
tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300
accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360
acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420
gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480
gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540
aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720
ggcgagtgct aagcggccgc 740
<210> 24
<211> 3002
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗hTfR抗体编号1的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列,合成序列
<400> 24
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaagtgca gctggtcgaa tcaggggggg ggctggtgca gcctggaggc 120
agcctgagac tgtcctgcgc cgcttctggc ttgaccttta gcaactacgg gatgtcctgg 180
gtgcggcagg ctcctggcaa gggactggag ttggtggcca acatcaatac caacggcgga 240
agtacatact atcccgattc agtgaagggc cggttcacca tcagcaggga caacgccaag 300
aacagcctgt atctgcagat gaactctctg agggccgagg atacagccgt gtactattgc 360
actaacaacc ggtacgacga ggactattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtctagc 420
gcctctacca agggcccaag cgtgtttcct ctggctccat cctctaaatc cacctctggc 480
ggcacagccg ctctgggctg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gacagtgtct 540
tggaacagcg gcgccctgac ctccggcgtg cacacatttc ctgctgtgct gcagagctcc 600
ggcctgtaca gcctgtctag cgtggtgacc gtgccatcct ctagcctggg cacccagaca 660
tatatctgca acgtgaatca caagcccagc aatacaaagg tggataagaa ggtggagcca 720
aagtcctgtg acaagaccca cacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 780
ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagccc aaggataccc tgatgatctc tcggacccca 840
gaggtgacat gcgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 900
tatgtggacg gcgtggaggt gcacaatgct aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 960
tccacctata gagtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1020
gagtataagt gcaaggtgtc caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctct 1080
aaggccaagg gccagcccag agagcctcag gtgtacacac tgcctccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtgtc tctgacatgt ctggtcaagg gcttctatcc ctctgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1260
ctggattccg acggctcttt ctttctgtat agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320
cagcagggca acgtgttcag ctgttccgtg atgcacgaag ctctgcataa tcactatact 1380
cagaaatccc tgtcactgtc acctggtaaa ggatcttccg aaacgcaggc caactcgacc 1440
acagatgctc tgaacgttct tctcatcatc gtggatgacc tgcgcccctc cctgggctgt 1500
tatggggata agctggtgag gtccccaaat attgaccaac tggcatccca cagcctcctc 1560
ttccagaatg cctttgcgca gcaagcagtg tgcgccccga gccgcgtttc tttcctcact 1620
ggcaggagac ctgacaccac ccgcctgtac gacttcaact cctactggag ggtgcacgct 1680
ggaaacttct ccaccatccc ccagtacttc aaggagaatg gctatgtgac catgtcggtg 1740
ggaaaagtct ttcaccctgg gatatcttct aaccataccg atgattctcc gtatagctgg 1800
tcttttccac cttatcatcc ttcctctgag aagtatgaaa acactaagac atgtcgaggg 1860
ccagatggag aactccatgc caacctgctt tgccctgtgg atgtgctgga tgttcccgag 1920
ggcaccttgc ctgacaaaca gagcactgag caagccatac agttgttgga aaagatgaaa 1980
acgtcagcca gtcctttctt cctggccgtt gggtatcata agccacacat ccccttcaga 2040
taccccaagg aatttcagaa gttgtatccc ttggagaaca tcaccctggc ccccgatccc 2100
gaggtccctg atggcctacc ccctgtggcc tacaacccct ggatggacat caggcaacgg 2160
gaagacgtcc aagccttaaa catcagtgtg ccgtatggtc caattcctgt ggactttcag 2220
cggaaaatcc gccagagcta ctttgcctct gtgtcatatt tggatacaca ggtcggccgc 2280
ctcttgagtg ctttggacga tcttcagctg gccaacagca ccatcattgc atttacctcg 2340
gatcatgggt gggctctagg tgaacatgga gaatgggcca aatacagcaa ttttgatgtt 2400
gctacccatg ttcccctgat attctatgtt cctggaagga cggcttcact tccggaggca 2460
ggcgagaagc ttttccctta cctcgaccct tttgattccg cctcacagtt gatggagcca 2520
ggcaggcaat ccatggacct tgtggaactt gtgtctcttt ttcccacgct ggctggactt 2580
gcaggactgc aggttccacc tcgctgcccc gttccttcat ttcacgttga gctgtgcaga 2640
gaaggcaaga accttctgaa gcattttcga ttccgtgact tggaagaaga tccgtacctc 2700
cctggtaatc cccgtgaact gattgcctat agccagtatc cccggccttc agacatccct 2760
cagtggaatt ctgacaagcc gagtttaaaa gatataaaga tcatgggcta ttccatacgc 2820
accatagact ataggtatac tgtgtgggtt ggcttcaatc ctgatgaatt tctagctaac 2880
ttttctgaca tccatgcagg ggaactgtat tttgtggatt ctgacccatt gcaggatcac 2940
aatatgtata atgattccca aggtggagac cttttccagt tgttgatgcc ttaagcggcc 3000
gc 3002
<210> 25
<211> 3023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗hTfR抗体编号2的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列,合成序列
<400> 25
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gccaggtgca gctggtccag tcaggagccg aagtgaaaaa gcccggagcc 120
tcagtcaaag tgtcttgtaa agcatcaggt tatacattta cagactacgt catgcactgg 180
gtgaggcagg cacctggaca gggtctggaa tggatcggcg tgatctccac ttactatggc 240
catggaagct acaaccagag attcaagggc agggcgacaa tgactgtaga caaatcaatt 300
tccactgctt atatggagct ggtaaggctg cggtccgacg ataccgctgt gtactattgc 360
gtacgaggag gatacggctc cagctctctg gctggtaatt tcgatgtgtg ggggcagggt 420
accacagtca ccgtgagttc agcaagcaca aagggcccat ctgtgtttcc actggccccc 480
tccagcaaaa gcacctctgg gggtacagcc gctctgggat gtctggtgaa ggattatttc 540
ccagagccag tcaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga catctggagt ccacactttt 600
ccagctgtgc tgcagtctag tgggctgtac tccctgtcat ccgtggtcac tgtccccagc 660
tctagtctgg gtacccagac atatatctgc aacgtgaatc acaagccatc taataccaaa 720
gtcgacaaga aagtggaacc caagtcctgt gataaaactc atacctgccc cccttgtcct 780
gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacacc 840
ctgatgatta gccgaactcc cgaagtcacc tgcgtggtcg tggacgtgtc tcacgaggac 900
cctgaagtca agtttaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc taagacaaaa 960
ccccgagagg aacagtacaa cagtacatat cgtgtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcat 1020
caggactggc tgaacgggaa ggaatataag tgcaaagtgt ccaataaggc actgcccgcc 1080
cctatcgaga aaaccattag caaggccaaa ggacagccta gggaaccaca ggtgtacaca 1140
ctgcctccat cccgggacga gctgactaag aaccaggtca gcctgacctg tctggtgaaa 1200
ggcttctatc cttcagatat cgctgtggag tgggaaagta atggacagcc agagaacaat 1260
tacaagacta ccccccctgt gctggactct gatgggagtt tctttctgta ttctaagctg 1320
accgtggata aaagtcggtg gcagcagggt aatgtcttta gttgttcagt gatgcacgaa 1380
gcactgcaca accactacac ccagaaatca ctgtcactgt caccagggaa aggatcttcc 1440
gaaacgcagg ccaactcgac cacagatgct ctgaacgttc ttctcatcat cgtggatgac 1500
ctgcgcccct ccctgggctg ttatggggat aagctggtga ggtccccaaa tattgaccaa 1560
ctggcatccc acagcctcct cttccagaat gcctttgcgc agcaagcagt gtgcgccccg 1620
agccgcgttt ctttcctcac tggcaggaga cctgacacca cccgcctgta cgacttcaac 1680
tcctactgga gggtgcacgc tggaaacttc tccaccatcc cccagtactt caaggagaat 1740
ggctatgtga ccatgtcggt gggaaaagtc tttcaccctg ggatatcttc taaccatacc 1800
gatgattctc cgtatagctg gtcttttcca ccttatcatc cttcctctga gaagtatgaa 1860
aacactaaga catgtcgagg gccagatgga gaactccatg ccaacctgct ttgccctgtg 1920
gatgtgctgg atgttcccga gggcaccttg cctgacaaac agagcactga gcaagccata 1980
cagttgttgg aaaagatgaa aacgtcagcc agtcctttct tcctggccgt tgggtatcat 2040
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tggatggaca tcaggcaacg ggaagacgtc caagccttaa acatcagtgt gccgtatggt 2220
ccaattcctg tggactttca gcggaaaatc cgccagagct actttgcctc tgtgtcatat 2280
ttggatacac aggtcggccg cctcttgagt gctttggacg atcttcagct ggccaacagc 2340
accatcattg catttacctc ggatcatggg tgggctctag gtgaacatgg agaatgggcc 2400
aaatacagca attttgatgt tgctacccat gttcccctga tattctatgt tcctggaagg 2460
acggcttcac ttccggaggc aggcgagaag cttttccctt acctcgaccc ttttgattcc 2520
gcctcacagt tgatggagcc aggcaggcaa tccatggacc ttgtggaact tgtgtctctt 2580
tttcccacgc tggctggact tgcaggactg caggttccac ctcgctgccc cgttccttca 2640
tttcacgttg agctgtgcag agaaggcaag aaccttctga agcattttcg attccgtgac 2700
ttggaagaag atccgtacct ccctggtaat ccccgtgaac tgattgccta tagccagtat 2760
ccccggcctt cagacatccc tcagtggaat tctgacaagc cgagtttaaa agatataaag 2820
atcatgggct attccatacg caccatagac tataggtata ctgtgtgggt tggcttcaat 2880
cctgatgaat ttctagctaa cttttctgac atccatgcag gggaactgta ttttgtggat 2940
tctgacccat tgcaggatca caatatgtat aatgattccc aaggtggaga ccttttccag 3000
ttgttgatgc cttaagcggc cgc 3023
<210> 26
<211> 3011
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列,合成序列
<400> 26
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat cttccgaaac gcaggccaac 1440
tcgaccacag atgctctgaa cgttcttctc atcatcgtgg atgacctgcg cccctccctg 1500
ggctgttatg gggataagct ggtgaggtcc ccaaatattg accaactggc atcccacagc 1560
ctcctcttcc agaatgcctt tgcgcagcaa gcagtgtgcg ccccgagccg cgtttctttc 1620
ctcactggca ggagacctga caccacccgc ctgtacgact tcaactccta ctggagggtg 1680
cacgctggaa acttctccac catcccccag tacttcaagg agaatggcta tgtgaccatg 1740
tcggtgggaa aagtctttca ccctgggata tcttctaacc ataccgatga ttctccgtat 1800
agctggtctt ttccacctta tcatccttcc tctgagaagt atgaaaacac taagacatgt 1860
cgagggccag atggagaact ccatgccaac ctgctttgcc ctgtggatgt gctggatgtt 1920
cccgagggca ccttgcctga caaacagagc actgagcaag ccatacagtt gttggaaaag 1980
atgaaaacgt cagccagtcc tttcttcctg gccgttgggt atcataagcc acacatcccc 2040
ttcagatacc ccaaggaatt tcagaagttg tatcccttgg agaacatcac cctggccccc 2100
gatcccgagg tccctgatgg cctaccccct gtggcctaca acccctggat ggacatcagg 2160
caacgggaag acgtccaagc cttaaacatc agtgtgccgt atggtccaat tcctgtggac 2220
tttcagcgga aaatccgcca gagctacttt gcctctgtgt catatttgga tacacaggtc 2280
ggccgcctct tgagtgcttt ggacgatctt cagctggcca acagcaccat cattgcattt 2340
acctcggatc atgggtgggc tctaggtgaa catggagaat gggccaaata cagcaatttt 2400
gatgttgcta cccatgttcc cctgatattc tatgttcctg gaaggacggc ttcacttccg 2460
gaggcaggcg agaagctttt cccttacctc gacccttttg attccgcctc acagttgatg 2520
gagccaggca ggcaatccat ggaccttgtg gaacttgtgt ctctttttcc cacgctggct 2580
ggacttgcag gactgcaggt tccacctcgc tgccccgttc cttcatttca cgttgagctg 2640
tgcagagaag gcaagaacct tctgaagcat tttcgattcc gtgacttgga agaagatccg 2700
tacctccctg gtaatccccg tgaactgatt gcctatagcc agtatccccg gccttcagac 2760
atccctcagt ggaattctga caagccgagt ttaaaagata taaagatcat gggctattcc 2820
atacgcacca tagactatag gtatactgtg tgggttggct tcaatcctga tgaatttcta 2880
gctaactttt ctgacatcca tgcaggggaa ctgtattttg tggattctga cccattgcag 2940
gatcacaata tgtataatga ttcccaaggt ggagaccttt tccagttgtt gatgccttaa 3000
taagcggccg c 3011
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Hyg-Sfi5', 合成序列
<400> 27
gaggccgcct cggcctctga 20
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Hyg-BstX3', 合成序列
<400> 28
aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29

Claims (3)

1.一种制造方法，其为使抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人I2S)融合而成的融合蛋白的制造方法，其包括：
(a)将产生该融合蛋白的哺乳动物细胞在无血清培养基中进行培养，使该融合蛋白分泌到培养液中的步骤；
(b)通过从该培养液中除去该哺乳动物细胞而回收培养上清的步骤；以及
(c)使用柱色谱从该培养上清中纯化出该融合蛋白的步骤，
在该步骤(c)中使用的柱色谱仅为3种，并且，在该步骤(c)中，依次利用使用结合有对该融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、以及尺寸排阻柱色谱这3种柱色谱，对该融合蛋白具有亲和性的物质为选自由蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、该抗体的抗原、将该抗体作为抗原进行识别的抗体、以及该人I2S的抗体组成的组中的物质，
该抗体为人源化抗hTfR抗体，该融合蛋白为选自由以下的(i)～(iii)组成的组中的蛋白质：
(i)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
(ii)由具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；以及
(iii)由具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列(Gly-Ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，对磷酸基具有亲和性的该材料为氟磷灰石或羟基磷灰石中的任意一种。
3.如权利要求1的制造方法，其中，对磷酸基具有亲和性的该材料为羟基磷灰石。
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