ES2358176T3 - Célula magnética y método de uso de la misma. - Google Patents

Célula magnética y método de uso de la misma. Download PDF

Info

Publication number
ES2358176T3
ES2358176T3 ES04746441T ES04746441T ES2358176T3 ES 2358176 T3 ES2358176 T3 ES 2358176T3 ES 04746441 T ES04746441 T ES 04746441T ES 04746441 T ES04746441 T ES 04746441T ES 2358176 T3 ES2358176 T3 ES 2358176T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
magnetic
cell
cells
acid
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES04746441T
Other languages
English (en)
Inventor
Mitsuo Graduate School Biomedical Sciences OCHI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai R&D Management Co Ltd
Original Assignee
Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Management Co Ltd filed Critical Eisai R&D Management Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2358176T3 publication Critical patent/ES2358176T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Magnetic Record Carriers (AREA)

Abstract

Una célula magnética que comprende: una célula que tiene integrina en una superficie de la misma; y una partícula magnética que comprende un péptido que tiene una actividad adhesiva a integrina y un material magnético, en la que la cantidad de péptido que recubre a las partículas magnéticas es de 3 ng a 6,6 μg por 1 mg de la partícula magnética, en la que la partícula magnética está en la superficie de la célula y el péptido está en la superficie de la partícula magnética.

Description

CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a una célula magnética que es útil en medicina, en particular en medicina regenerativa.
TÉCNICA ANTECEDENTE
En general, un fármaco se dispersa por todo el cuerpo después de la administración, y sería deseable que unanticanceroso y otros fármacos con fuertes efectos secundarios permanecieran a altas concentraciones en el sitio deacción sin dispersarse a otros lugares. Se han realizado diversos esfuerzos para concentrar el fármaco localmente.Un método que se ha probado es usar una partícula magnética para concentrar el fármaco localmente por medio deuna fuerza magnética ejercida desde el exterior del cuerpo. Por ejemplo, es posible incluir un material magnéticojunto con el fármaco en un liposoma que, a continuación, es administrado y guiado hasta una ubicación por la fuerzamagnética, aumentando de este modo la concentración local del fármaco (véase por ejemplo el documento Journalof the Japanese Oral Surgery Society, febrero de 1997, págs. 55-61).
Por otro lado, también se conoce una técnica para modificar con un anticuerpo la superficie de una perla magnéticacompuesta por un polímero y un material ferrimagnético tal como magnetita y similares, y usar una reacción de antígeno-anticuerpo para aislar y producir una célula, y esta técnica se ha aplicado al tipado de HLA, selección decélulas madre hematopoyéticas y similares (véase por ejemplo el documento Biomaterial, febrero de 2003, págs.113-119).
El documento WO 00/71169 A2 describe un método de marcado de células vivas para hacerlas detectables enobtención de imágenes por resonancia magnética (MRI).
El documento Elmi M. M et al., a simple method for preparation of inmuno-magnetic liposomes, International Journalof pharmaceutics 215 (2001) 45-50, describe un método para preparar liposomas inmuno-magnéticos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Problemas a resolver por la invención
Sin embargo, no existen ejemplos de unión de la partícula magnética a una célula mensenquimatosa, condrocito uotras células que podrían usarse en medicina regenerativa. Por lo tanto, muchas preguntas siguen sin resolver, talescomo si la célula que tiene la partícula magnética unida a ella es retenida o no localmente por la fuerza magnéticaexterna después de la administración y si la célula muestra o no actividad intrínseca.
Medios para resolver los problemas
Los inventores perfeccionaron la presente invención como resultado de una exhaustiva investigación centrada en lasfunciones de la superficie celular. Es decir, en la presente invención, se proporciona una célula magnética deacuerdo con la reivindicación 1. La composición de esta célula le permite moverse a una ubicación deseada usando el magnetismo de la partícula magnética.
En la célula magnética de acuerdo con la presente invención, la superficie está unida mediante una secuencia deaminoácidos específica de la partícula magnética. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos específica incluye un péptido (RGDS) que comprende los cuatro aminoácidos, arginina-glicina-ácido aspártico-serina.
En la célula magnética de acuerdo con la presente invención, la partícula magnética incluye al menos un materialmagnético.
En un aspecto preferido de la célula magnética de acuerdo con la presente invención, la partícula magnética también incluye un fármaco.
Efecto ventajoso de la invención
Dado que, con la célula magnética de acuerdo con la presente invención, la célula magnética puede introducirse enel cuerpo y mantenerse durante un largo periodo en un sitio afectado por una enfermedad mediante una acción deun campo magnético desde el exterior del cuerpo, las funciones intrínsecas de la célula pueden expresarse eficazmente. Además, el uso de la célula magnética de acuerdo con la presente invención permite la aplicación amedicina regenerativa incluyendo formación de cartílago y a fármacos contra el cáncer y otros sistemas deadministración de fármacos de acuerdo con las necesidades de terapia.
MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVENCIÓN
(Primera realización) (no forma parte de la invención)
La célula magnética se basa en el uso de un componente adhesivo sobre una superficie de una célula. La figura 1muestra una vista esquemática de una célula magnética 10 de la primera realización. Esta célula magnética 10comprende una partícula magnética 60, que está unida mediante un enlazador 50 a glucoproteína 40 expresada enla superficie de la célula 20 que tiene el núcleo 30. Los ejemplos de la glucoproteína 40 usados incluyen, aunque sinlimitación, CD44 o HLA.
Un ejemplo de la partícula magnética 60 usada incluye un liposoma que comprende un material magnético 70. Esteliposoma también puede contener un fármaco 80, que puede controlar la actividad celular, y el material magnético y el fármaco también pueden encapsularse usando otro tipo de cápsula
En este caso, el liposoma es una bicapa lipídica esférica que tiene un interior acuoso. Cuando se forma el liposoma,una molécula presente en una solución acuosa se incorpora al interior acuoso. El contenido incorporado al liposomaestá protegido de un micro-entorno externo y es transportado eficazmente al interior del citoplasma, dado que elliposoma se fusiona con la membrana celular.
Aquellos conocidos habitualmente como liposoma pueden usarse como el liposoma usado, particularmente aquellosliposomas que pueden usarse sin problemas para ingestión oral e inyección. Dicho liposoma puede usarseapropiadamente, o puede diseñarse de nuevo y formarse un liposoma usando los materiales conocidos. Más específicamente, es deseable usar un liposoma que comprende fosfolípidos, éter glicerofosfolípidos, esfingofosfólipidos, gliceroglucolípidos y esfingoglucolípidos como principales componentes estructurales de la membrana del liposoma, y que también comprende esterol, tocoferol y similares como componente lipídico queestabiliza la membrana del liposoma.
Pueden usarse fosfolípidos conocidos habitualmente como los fosfolípidos mencionados anteriormente, incluyendofosfolípidos naturales, fosfolípidos sintéticos y similares. Los fosfolípidos que pueden usarse favorablemente incluyen (1) fosfatidilcolina, (2) fosfatidiletanolamina, (3) fosfatidilglicerol, (4) fosfatidilserina, (5) ácido fosfatídico, (6)fosfatidilinositol y similares.
Los ejemplos de la fosfatidilcolina (1) mencionada anteriormente incluyen lecitina de yema de huevo, lecitina de soja,lecitina de yema de huevo hidrogenada, lecitina de soja hidrogenada, fosfatidilcolina derivada de soja, fosfatidilcolinahidrogenada derivada de soja y otras fosfatidilcolinas naturales; y sistemas sintéticos tales como fosfatidilcolina que comprende un ácido carboxílico saturado o insaturado con de 7 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos específicosincluyen dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina y dioleoil fosfatidilcolina. Los restos de ácidos grasos delas mencionadas anteriormente pueden ser octanoilo, nonanoilo, decanoilo, undecanoilo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, oleilo, estearilo, palmitoleilo, oleilo, linoleilo, linolenilo, araquidonilo u otros grupos. Además, las partes delresto de ácido graso que se unen a los sitios 1- y 2- de glicerina pueden ser iguales o diferentes.
Los ejemplos de la fosfatidiletanolamina (2) mencionada anteriormente incluyen fosfatidiletanolamina derivada desoja, fosfatidiletanolamina hidrogenada derivada de soja y otras fosfatidiletanolaminas naturales; y sistemassintéticos tales como fosfatidiletanolamina que comprende un ácido carboxílico saturado o insaturado con de 7 a 22átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyen dimiristoil fosfatidiletanolamina, dipalmitoil fosfatidiletanolamina y dioleoil fosfatidiletanolamina. Los restos de ácidos grasos pueden ser grupos tales como losmostrados en (1) anteriormente.
Los ejemplos del fosfatidilglicerol (3) mencionado anteriormente incluyen sistemas sintéticos tales como fosfatidilglicerol que comprende un ácido carboxílico saturado o insaturado con de 7 a 22 átomos de carbono. Losejemplos específicos incluyen dimiristoil fosfatidilglicerol, dipalmitoil fosfatidilglicerol y dioleoil fosfatidilglicerol. Losrestos de ácidos grasos constituyentes pueden ser grupos tales como los mostrados en (1) anteriormente.
Los ejemplos de la fosfatidilserina (4) mencionada anteriormente incluyen fosfatidilserina derivada de soja, fosfatidilserina hidrogenada derivada de soja y otros sistemas naturales; y sistemas sintéticos tales como fosfatidilserina que comprende un ácido carboxílico saturado o insaturado con de 7 a 22 átomos de carbono. Losejemplos específicos incluyen dimiristoil fosfatidilserina, dipalmitoil fosfatidilserina y dioleoil fosfatidilserina. Losrestos de ácidos grasos constituyentes pueden ser grupos tales como los mostrados en (1) anteriormente.
Los ejemplos de los ácidos fosfatídicos (5) incluyen ácidos sintéticos tales como ácidos fosfatídicos que comprendenun ácido carboxílico saturado o insaturado con de 7 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyenácido dimiristoil fosfatídico, ácido dipalmitoil fosfatídico, ácido dioleoil fosfatídico y similares. Los restos de ácidosgrasos constituyentes pueden ser grupos tales como los mostrados en (1) anteriormente. Además, los ejemplos delfosfatidilinositol (6) mencionado anteriormente incluyen fosfatidilinositol derivado de soja, fosfatidilinositol hidrogenado derivado de soja y otros sistemas naturales, y también puede usarse fosfatidilinositol sintético. Losrestos de ácidos grasos constituyentes pueden ser grupos tales como los mostrados en (1) anteriormente. Tambiénpueden usarse Glicerofosfolípidos, esfingofosfolípidos, gliceroglucolípidos, esfingoglucolípidos y similares como unconstituyente de membrana del liposoma usado en la presente invención. En la presente invención, pueden usarseesteroles y tocoferoles como componente lipídico para estabilizar la membrana del liposoma. Los esteroles mencionados anteriormente pueden ser los conocidos habitualmente como esteroles, y los ejemplos incluyencolesterol, sitosterol, campesterol, estigmasterol y brassicasterol. El colesterol es particularmente deseable desde elpunto de vista de disponibilidad. Los tocoferoles mencionados anteriormente pueden ser aquellos conocidoshabitualmente como tocoferoles y, por ejemplo, el tocoferol comercial es deseable desde el punto de vista dedisponibilidad y similares.
El material de la cápsula usado puede ser una resina de intercambio iónico, cerámica cristalina, un vidrio o látex biocompatible. También puede usarse como microesfera junto con diversos tensioactivos. Además, puede usarse una nanoesfera y otro lípido, polímero o un material proteico como el material de la cápsula mencionado anteriormente. El diámetro de la cápsula no está particularmente limitado pero es preferentemente de decenas acientos de nanómetros. La cápsula de fármaco encapsula al menos un material magnético y puede encapsular o noencapsular a un fármaco, pero es deseable desde el punto de vista del control celular que el fármaco esté encapsulado.
La cápsula de fármaco también puede estar provista de un medio de control de la liberación del fármaco paracontrolar la liberación del fármaco, y los ejemplos de medio de control de la liberación del fármaco incluyen unpolímero, una molécula sensible a la temperatura y una sustancia sensible a ultrasonidos y/o al magnetismo. Los
15
25
35
45
55
65
ejemplos específicos incluyen el compuesto polimérico (polímero de ácido poliacrílico) con un punto deenturbiamiento descrito en la Publicación de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública Nº H5-228358 y lassustancias sensibles a ultrasonido (derivado de porfirina y derivado de xanteno, etc.) descritas en la Publicación dePatente Japonesa Abierta a Inspección Pública Nº 11-92360.
Siempre que el material magnético sea magnético, no existen límites particulares respecto al material magnético usado, que puede ser paramagnético, super-paramagnético o ferromagnético y el término “ferromagnético” puede incluir ferromagnético o ferrimagnético. Los ejemplos específicos del material magnético incluyen magnetita (Fe2O3)y maghemita así como partículas de compuestos de hierro, cobalto, níquel y otros elementos ferromagnéticos. Deestos materiales ferromagnéticos, la magnetita y la maghemita son deseables debido a que no muestran toxicidadpara los organismos vivos y son estables. La magnetita es particularmente deseable.
El material magnético mencionado anteriormente no solamente incluye la partícula de compuesto ferromagnéticomencionado anteriormente por sí misma sino también la partícula magnética que está incluida en celulosa, almidón,dextrano, agarosa, metacrilato, estireno o similares, y la partícula magnética biosintetizada por una bacteria magnética en la que la magnetita está cubierta por fosfolípidos.
Se explican algunos métodos mediante los cuales la superficie de la célula mencionada anteriormente contiene a la partícula magnética. Dichos métodos incluyen un método en el que un grupo funcional reactivo de la superficiecelular se une a un grupo funcional reactivo de la partícula magnética mediante enlace covalente, y un método en elque la unión se realiza por medio de un enlazador y similares. Los ejemplos del enlazador usado en la presenteinvención incluyen un anticuerpo o compuesto (en lo sucesivo en este documento, “separadores bifuncionales”) quetiene un grupo carboxilo, un grupo amino u otros grupos funcionales reactivos en ambos extremos. Los ejemplospreferidos del método de unión del enlazador a bacterias con célula magnética incluyen un método de unir el grupofuncional reactivo en la superficie celular mediante el separador bifuncional a la partícula magnética cubierta con unapelícula fosfolipídica que se obtiene machacando las bacterias magnéticas, y un método de unir HLA, CD44 u otrasmoléculas adhesivas a la superficie celular mediante una reacción de antígeno-anticuerpo a un anticuerpo usadocomo un enlazador que está unido mediante un enlace amida a la partícula magnética cuya superficie ha sido modificada con el grupo carboxilo.
En la célula magnética usada, la partícula magnética puede estar incluida dentro de la célula, o puede estar unida ala superficie celular, o puede estar unida a la superficie celular mediante un enlazador. Una partícula magnética puede estar incluida dentro de la célula, por ejemplo, mediante un método que usa una “pistola de partículas” comose describe en la Publicación de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública Nº H6-133784.
En la primera realización, el fármaco 80 que está contenido en la partícula magnética mencionada anteriormente 60puede ser una sustancia bioactiva tal como una citoquina u otra sustancia que controla el sistema de transmisión deseñales celulares, aunque no está limitada a éstas. Los ejemplos específicos de citoquinas incluyen interferones(IFN-, IFN-, IFN- y similares), interleuquinas (IL-1 a IL18 y similares), linfotoxinas, factores de necrosis tumoral (TNF y similares) factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factores estimuladores de colonias de macrófagos (M-CSF, CSF-1), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), eritropoyetina,trombopoyetina, factor de células madre hematopoyéticas (SCF), factor de actividad quimiotáctica de monocitos(MCAF), factores de crecimiento transformantes (TGF-, TGF-), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento nervioso(NGF) y similares. En particular, se prefieren interferones, interleuquinas, factores de necrosis tumoral, eritropoyetina, trombopoyetina, factores de crecimiento transformantes, factor de crecimiento de fibroblastos, factorde crecimiento epitelial, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento nervioso.
El fármaco mencionado anteriormente 80 puede ser un fármaco para una enfermedad a prevenir y/o tratar en el sitioafectado por la enfermedad. Aunque sin limitarse a esto, los ejemplos específicos de fármacos incluyen un anticanceroso tal como clorhidrato trihidrato de irinotecano, mitomicina C, 5-fluorouracilo, cisplatino, clorhidrato de gemcitabina, doxorrubicina y taxol. Otros ejemplos incluyen donepazil y otros fármacos contra el Alzheimer. La célulamagnética puede usarse como un sistema de suministro de fármacos al incorporar este fármaco 80 en la parte del liposoma de la célula magnética.
El fármaco mencionado anteriormente 80 puede formar una sal. Los ejemplos favorables de esta sal incluyen salesde ácidos inorgánicos, sales de ácidos orgánicos, sales de bases inorgánicas, sales de bases orgánicas, y sales conaminoácidos ácidos o básicos. De éstas, se prefieren las sales farmacológicamente aceptables. Los ejemplosfavorables de sales con ácidos inorgánicos incluyen sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, mientras que los ejemplos favorables de sales con ácidos orgánicosincluyen sales con ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácidoláctico, ácido esteárico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y similares. Los ejemplos favorables de sales con bases inorgánicas incluyen sales de sodio, sales de potasio y otrassales de metales alcalinos, sales de calcio, sales de magnesio y otras sales de metales alcalinotérreos, y sales dealuminio, sales de amonio y similares. Los ejemplos favorables de sales con bases orgánicas incluyen sales condietilamina, dietanolamina, meglumina, N,N'-dibenciletilendiamina y similares.
Cuando el fármaco mencionado anteriormente 80 se administra al paciente como fármaco preventivo o terapéuticopara una enfermedad asociada, no existen límites respecto a la vía de administración, dosificación o número deadministraciones, que varían dependiendo de los síntomas del paciente, del tipo y la gravedad de la enfermedad, dela edad, de las funciones cardiaca, hepática y renal y similares. Por ejemplo, En el caso de terapia contra el cánceren un ser humano, pueden administrarse de 0,01 mg a 1000 mg o preferentemente de 0,1 mg a 1000 mg o máspreferentemente de 0,1 mg a 100 mg diariamente a un adulto en el caso de administración oral, y de 0,01 mg a 500 mg o preferentemente de 0,1 mg a 500 mg o más preferentemente de 0,1 mg a 100 mg diariamente a un adulto enel caso de administración intravenosa, divididos en de 1 a 5 administraciones al día, dependiendo de los síntomas.
5 10 15 20
25
30
35
40 45
50
55
60
65
Una composición de fármaco que comprende el fármaco mencionado anteriormente 80 también puede introducirseen la célula magnética, y la composición mencionada anteriormente puede fabricarse mediante un método conocidousando excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, estabilizantes, aromatizantes, diluyentes y otros aditivos.Los ejemplos específicos de excipientes incluyen excipientes orgánicos tales como lactosa, sacarosa, glucosa,almidón de maíz, almidón de patata, alfa dextrina de almidón y otros derivados de almidón, celulosa cristalina y otros derivados de celulosa, goma arábiga, dextrina, y pululano; y excipientes inorgánicos tales como anhídrido silícicoligero, silicato de aluminio sintético, silicato de calcio, metasilicato aluminato de magnesio y otros derivados desilicato, hidrogenofosfato de calcio y otros derivados de fosfato, carbonato de calcio y otros carbonatos, sulfato decalcio y otros sulfatos y similares. Los ejemplos específicos de lubricantes incluyen ácido esteárico, sales metálicasde ácido esteárico tales como estearato de calcio y estearato de magnesio, talco, sílice coloidal, ceras tales como cera de colmena y cera espermaceti, ácido bórico, ácido adípico, sulfatos tales como sulfato de sodio, glicol, ácidofumárico, benzoato de sodio, DL-leucina, sales de sodio de ácidos grasos, lauril sulfatos tales como lauril sulfatosódico y lauril sulfato de magnesio, ácido silícicos tales como anhídrido silícico e hidrato silícico, y los derivados dealmidón mencionados anteriormente. Los ejemplos específicos de aglutinantes incluyen hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, macrogol, y compuestos tales como los excipientes mencionados anteriormente. Los ejemplos específicos de disgregantes incluyen derivados de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa sustituida por inferiores, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa cálcica, ycarboximetilcelulosa sódica reticulada internamente así como almidón de carboximetilo, almidón de carboximetilo sódico, polivinilpirrolidona reticulada y otros almidones modificados químicamente y celulosa. Los ejemplosespecíficos de estabilizantes incluyen ésteres de ácido paraoxibenzoico tales como metilparabeno y propilparabeno, alcoholes tales como clorobutanol, alcohol bencílico y alcohol polietílico, cloruro de benzalconio, fenoles tales comofenol y cresol, timerosal, ácido dihidroacético, y ácido sórbico. Los ejemplos específicos de aromatizantes incluyenedulcorantes, aromas ácidos, aromáticos y similares que se usan habitualmente en preparaciones.
Aunque sin limitarse a esto, la célula usada en la presente invención es preferentemente un linfocito, una célulamadre mesenquimatosa, un condrocito cultivado o similares.
(Segunda realización) (de acuerdo con la invención)
La figura 2 muestra una vista esquemática de una célula magnética de acuerdo con la presente invención. Lapresente invención usa integrina 110 presente en la superficie celular y el péptido 120, que tiene actividad adhesivacon respecto a integrina. Aunque sin limitarse a esto, el péptido mencionado anteriormente puede ser RGDS (unpéptido constituido por los cuatro aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico-serina, peso molecular 433,42).
En la presente invención, la célula magnética 200 que tiene una partícula magnética en la superficie se proporcionamediante el uso de la perla magnética activada 130, que está modificada con la secuencia de aminoácidos de RGDSen la superficie de la perla magnética.
Esta célula magnética puede prepararse de la siguiente manera. En primer lugar, una perla magnética cuyasuperficie ha sido modificada de antemano con un grupo carboxilo se activa por medio de un reactivo. El reactivo para la activación no está particularmente limitado siempre que pueda activar el grupo carboxilo, pero se prefiereuna carbodiimida. En segundo lugar, El grupo carboxilo activado en la superficie de la perla magnética y el grupoamino del péptido se hacen reaccionar para formar un enlace amida, que introduce al péptido en la superficie de laperla magnética.
En la presente invención, la cantidad del péptido que recubre a la perla puede ser de 10 ng a 20 g de anticuerpo o péptido que forma un ligando por el equivalente a 3 mg de perla magnética, y es preferentemente de 15 ng a 15 g omás preferentemente de 20 ng a 10 g. Es decir, en términos de peso unitario de perla magnética, de 3 ng a 6,6 gpueden recubrir por 1 mg de perla magnética. Si se recubre con demasiado péptido la perla magnética, las células magnéticas finales terminan adhiriéndose entre sí, impidiendo el movimiento hasta el sitio afectado por laenfermedad que es la diana. Si se recubre con demasiado poco, no pueden conseguirse las propiedades de la propia célula magnética.
A continuación, la perla magnética con el péptido introducido y la molécula de adhesión a la superficie de la céluladiana se hacen reaccionar para preparar la perla magnética de acuerdo con la presente invención. Para los fines dela reacción, la cantidad de perla magnética con péptido introducido depende del porcentaje de introducción depéptido, pero es preferentemente de 0,1 l a 20 l o más preferentemente de 0,2 l a 18 l o aún más preferentemente de 0,5 l a 15 l por 2 x 105 de las células diana mencionadas anteriormente. Si la cantidad de perla magnética con péptido introducido es de 0,1 l o menos, la propia célula magnética no realizará su función,mientras que si la cantidad de perla magnética con péptido introducido es de 20 l o más, las células magnéticas seadherirán entre sí, impidiendo el movimiento al sitio afectado por la enfermedad que es la diana.
Aunque sin limitarse a esto, la solución de reacción para hacer reaccionar a la perla magnética con el péptido introducido con la molécula de adhesión en la superficie celular puede ser BSA (albúmina de suero bovino) soluciónsalina tamponada con fosfato (en lo sucesivo en este documento, "BSA/PBS"), y se prefiere una solución deBSA/PBS con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) añadido, BSA al 0,5%, EDTA 4,4 M en PBS (-)(concentración de EDTA de 4,4 M a 2 mM).
En la segunda realización, un experto en la materia podría entender fácilmente que el material magnético y el fármaco en la primera realización pueden usarse de la misma manera.
A continuación, se explicará el método de uso de la célula magnética de acuerdo con la presente invención. Lacélula magnética preparada como se ha descrito anteriormente puede usarse en terapia como se describe acontinuación si se cultiva en diversas células. El fluido de cultivo y la temperatura en el cultivo pueden seleccionarsesegún sea apropiado. El fluido de cultivo depende de las células usadas, pero por ejemplo un fluido de cultivo a base de DMEM (Medio Eagle modificado de Dulbecco) es adecuado en el caso de condrocitos cultivados.
La célula magnética de acuerdo con la presente invención puede usarse en terapia estando retenida durante unlargo periodo en un sitio diana afectado por la enfermedad de acuerdo con el tipo de células. Por ejemplo, usandouna célula madre mesenquimatosa mieloide, puede formarse tejido condroide en un sitio afectado por laenfermedad. Por consiguiente, es importante que la célula magnética de acuerdo con la presente invención searetenida durante un largo periodo en el sitio diana afectado por la enfermedad.
La expresión “retenido durante un largo periodo en un sitio afectado por la enfermedad” usada en la presenteinvención significa que la célula magnética es retenida durante el tiempo suficiente para que se realicen susfunciones, y es deseable un periodo de 1 a 90 días o preferentemente de 1 a 80 días o más preferentemente de 1 a50 días. El sitio de administración de la célula magnética de acuerdo con la presente invención puede ser un sitiocon una lesión en el cuerpo o un sitio sometido a tratamiento, y los ejemplos incluyen cerebro, hueso, hígado,corazón y articulaciones. Los ejemplos específicos de enfermedades incluyen hemorragia cerebral, tumoresmalignos, daño de la médula espinal, defectos de cartílago, defectos musculares y daños al ligamento.
La administración de la célula magnética de acuerdo con la presente invención para la retención dentro del cuerpopuede ser mediante métodos quirúrgicos o mediante inyección. La administración quirúrgica significa administraciónabriendo un agujero en un hueso por ejemplo, mientras que inyección significa administración directa medianteinyección a un sitio afectado por la enfermedad o administración general mediante inyección intravenosa.
La expresión “campo magnético” usada en la presente invención significa preferentemente un campo 60 gauss (enlo sucesivo en este documento "G") o más con el fin de imantar a la partícula magnética, y se prefieren 70 G o más con el fin de retener a la partícula en una ubicación específica e impedir la dispersión en el cuerpo. El campomagnético puede aplicarse desde el exterior del cuerpo o puede aplicarse incrustando un imán en el cuerpo. En estecaso, se prefiere un imán de neodimio desde el punto de vista de fuerza magnética del imán, estabilidad y potencia.
La figura 3 muestra una vista esquemática de terapia usando la célula magnética de acuerdo con la presenteinvención. Como se muestra en la figura 3, la célula magnética de acuerdo con la presente invención se introduce in vivo mediante inyección intra-articular. Dado que el imán permanente se dispone en una ubicación a la que debemoverse y colocarse la célula magnética, la célula magnética de acuerdo con la presente invención puede moversea la ubicación deseada mediante la acción de la fuerza magnética de los imanes permanentes mencionadosanteriormente. En la figura 3, la célula magnética puede moverse a un sitio defectuoso en cartílago articular ycolocarse allí. Si una célula usada como la célula magnética de acuerdo con la presente invención es una célula madre mesenquimatosa mieloide, es posible formar tejido condroide en el sitio y reparar el sitio defectuosomencionado anteriormente.
La reparación de cartílago, que es un foco de atención de la investigación de la medicina regenerativa, se explicó enla figura 3, pero si la ubicación del tratamiento es una célula cancerosa, es posible concentrar localmente un fármacoincluyendo un anticanceroso en la partícula magnética que compone la célula magnética.
La liberación de fármaco a partir de la célula magnética de acuerdo con la presente invención que se ha administrado in vivo está controlada por medio de enzimas u otra acción, o temperatura.
La expresión “controlar la actividad de la célula magnética” usada en la presente invención significa el control de laactividad celular tal como diferenciación o proliferación por medio de citoquinas u otros fármacos.
La célula magnética y la cápsula con el fármaco pueden administrarse simultáneamente o por separado y, porejemplo, un modo sería un kit de fármaco en el que la célula magnética y la cápsula con el fármaco se incluyencomo inyecciones en un único paquete.
La presente invención se explica con más detalle usando los siguientes ejemplos.
Ejemplos
(Preparación de la célula magnética 1) (Ejemplo de referencia)
1.
Activación de perlas magnéticas
El equivalente a 3 mg (60 l) se tomaron de una solución madre de ferrisphere 100C (fabricada por Japan Paint; 50mg/ml) como perlas magnéticas, y se lavaron añadiendo NaOH 0,01 N y agitando a temperatura ambiente durante10 minutos en un mezclador. Esta operación de lavado se repitió una vez, y el lavado se realizó de nuevo añadiendoagua desionizada y agitando a temperatura ambiente durante 5 minutos en el mezclador. Esta operación de lavadose repitió 3 veces. Para activar las perlas magnéticas, el exceso de agua se retiró y las perlas magnéticas semezclaron minuciosamente en un tubo con 50 l cada uno de clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (en lo sucesivo en este documento “EDC”, fabricada por Sigma) y Nhidroxisuccinimida (en lo sucesivo en este documento “NHS”, fabricada por Sigma) preparada previamente a 50mg/ml a pH 5,0 con ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico 25 mM (en lo sucesivo en este documento “MES”, fabricadopor Sigma), y se agitó inclinando lentamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre un imán de neodimio, y el sobrenadante se retiró. Finalmente se lavó dosveces con MES 25 mM a pH 5,0, para un volumen de solución final (40 l).
2.
Fijación de anticuerpos después de la activación
Anticuerpos CD44 de rata (fabricados por Chemicon; 20 g) se disolvieron en MES 25 mM (60 l), se añadieron a las perlas activadas mencionadas anteriormente, y se agitaron inclinando lentamente a temperatura ambientedurante 3 horas para fijar los anticuerpos a las perlas activadas. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre un imán de neodimio, y el sobrenadante se retiró. Los anticuerpos que no habían reaccionado con las perlas se retiraron añadiendo etanolamina 0,05 M en tampón fosfato seguida de agitación inclinando lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Las perlas fijadas se lavaron durante 5 minutos a 4ºC en BSA al 0,5% entampón fosfato (fabricado por Sigma). Esta operación de lavado se repitió cuatro veces. Esto se suspendió en BSAal 0,5% en tampón fosfato (1 ml) y se almacenó a 4ºC.
3. Unión de perlas fijadas a la célula
Células madre mesenquimatosas mieloides de rata cultivadas se transfirieron de una placa a un tubo donde semantuvieron durante 10 minutos a 4ºC. Se realizó una reacción de antígeno-anticuerpo añadiendo las perlaspreparadas mencionadas anteriormente (60 l) a la suspensión celular (1 x 106 células) seguido de agitacióninclinando lentamente durante 1 hora a 4ºC. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre unimán de neodimio, y el sobrenadante se retiró. Esto se resuspendió a continuación en BSA al 0,5% en tampónfosfato. Esta operación de lavado se realizó 4 veces. Los experimentos se realizaron en suspensión en tampón fosfato.
(Preparación de una célula magnética que tiene un liposoma magnético)
1.
Síntesis de N-[3-(2-piridiltio)propionil]fosfatidil etanolamina (en lo sucesivo en este documento “PDP-PE”)
Se disolvieron éster N-succinimidílico del ácido 3-(2-piridiltio)propiónico (25 mg) y trietilamina (50 mol) en etanolanhidro (3 ml), y fosfatidil etanolamina (50 moles) se disolvió adicionalmente y se agitó. Después de 5 horas, elmetanol se retiró a presión reducida, y el residuo se disolvió en cloroformo. Una columna de gel de sílice (10 ml) quese había activado durante una noche a 150ºC se lavó en cloroformo. Después del lavado, el producto de reacción sehizo pasar a través de la columna y se lavó con cloroformo adicional (20 ml). 20 ml de cada una de las solucionesmezcladas a 40:1, 30:1, 25:1, 20:1 y 15:1 de cloroformo/metanol se hicieron pasar a través, seguida de 60 ml de una solución final mezclada a 10:1. Los pases de 15:1 y 10:1 se concentraron juntos a presión reducida.
2.
Preparación del liposoma
Fosfatidilcolina de huevo (10 moles), colesterol (10 moles) y PDP-PE (1 mol) se disolvieron en éter dietílico (3ml), y el éter dietílico se vaporizó a presión reducida. Solución salina (0,9%, 1 ml) que contenía hierro magnético(Fe2O3, 5 mg)) y un fármaco a encapsular (TGF-, bFGF) y un tampón de ácido bórico/ácido cítrico (pH 6,0) seañadieron y se agitaron usando un mezclador de vórtice, y la película fina que se adhería al interior del matraz seretiraba completamente seguida de 50 minutos de tratamiento con ultrasonido con un Sonicador con Baño deultrasonidos (el mismo que anteriormente). Usando un imán permanente de 0,45 T (el mismo que anteriormente), losliposomas magnéticos preparados y los materiales magnéticos no encapsulados se aislaron de la solución. Despuésde 15 minutos de centrifugado a 1000 x g (ppm), los liposomas magnéticos que constituían el sobrenadante sesepararon de los materiales magnéticos no encapsulados que constituían el sedimento.
3.
Unión de liposomas con anticuerpos
Anticuerpos CD44 humanos (20 g) se disolvieron en MES 25 mM (60 l), y el liposoma preparado se añadió y seagitó inclinando lentamente durante 3 horas a temperatura ambiente para fijar los anticuerpos a los liposomas.Después de la reacción, esto se dejó durante 2 minutos sobre un imán de neodimio, y el sobrenadante se retiró.Para retirar los anticuerpos que no reaccionaron, etanolamina (0,05 M) en tampón fosfato se añadió y se agitóinclinando lentamente durante 1 hora a temperatura ambiente.
Esto se lavó durante 5 minutos a 4ºC en BSA al 0,5% en tampón fosfato. Esta operación de lavado se repitió 4veces. Después de la precipitación y la estabilización con BSA al 0,5% en tampón fosfato (1 ml), esto se almacenó a4ºC.
4. Unión de liposomas con anticuerpos fijados a las células
Células madre mesenquimatosas mieloides humanas cultivadas se transfirieron de una placa a un tubo, y sealmacenaron durante 10 minutos a 4ºC. Se realizó una reacción de antígeno-anticuerpo añadiendo los liposomas preparados a la suspensión celular (1 x 106) y agitando inclinando lentamente durante 1 hora a 4ºC. Después de lareacción, el tubo se colocó durante 2 minutos sobre un imán de neodimio, y el sobrenadante se retiró. Esto seresuspendió en BSA al 0,5% en tampón fosfato. Esta operación de lavado se repitió 4 veces. Los experimentos serealizaron en suspensión en tampón fosfato o similares.
Ejemplo 1 (Ejemplo de referencia)
(Ensayo in vitro)
Células madre mesenquimatosas mieloides (4 x 105) unidas a partículas magnéticas que se habían preparadomediante los métodos anteriores se extendieron sobre una placa de Petri. En este ejemplo, un imán de neodimio de4300 G redondo (diámetro 5 mm) se situó bajo el centro de la placa. En el ejemplo comparativo, no se usó ningún imán. Se añadieron TGF- y dexametasona a la placa. Después de 21 días de cultivo, éste se evaluó mediantetinción con azul de toluidina. En el ejemplo, el tejido condroide se había formado localmente centrado en una posición correspondiente a la del imán. En el ejemplo comparativo, el tejido condroide no se había formado localmente.
La figura 4 muestra imágenes microscópicas (50 aumentos) observadas 1 mes después de la inyección intraarticular de células magnéticas de acuerdo con la presente invención sin (A) y con (B) la presencia de un campomagnético externo aplicado durante aproximadamente 72 horas. En la figura 4(A), queda claro que las célulasmagnéticas mostradas mediante puntos negros se observan en todas las células. Por otro lado, en la figura 4(B), las células magnéticas mostradas mediante puntos negros se concentran en el lado izquierdo de la figura 4(B). Latinción de las figuras 4(A) y (B) era realmente mediante tinción con hematoxilina-eosina, y se muestra en gris.
A partir de estos resultados, se muestra que las células magnéticas se movieron localmente por medio de la acciónde imanes. Además, se observó la reparación de cartílago hialino en células que habían sido expuestas a un campomagnético externo.
Ejemplo 2 (Ejemplo de referencia)
(Reparación de defecto óseo en articulaciones de rodilla de conejo)
Defectos óseos de 5 mm de ancho se introdujeron en dos lugares en articulaciones de rodilla de conejo de acuerdocon los métodos descritos en el documento Bioindustry 2002 Vol. 19 No. 6, págs. 47-53. Las células magnéticas (3,0g) obtenidas en el ejemplo se administraron a estos defectos mediante inyección. A continuación, un imán con uncampo magnético de 700 G se dejó durante 9 semanas en la superficie correspondiente a los defectos. Mientrastanto, se administraron células magnéticas sin un campo magnético externo en un ejemplo comparativo. Comoresultado, las células de cartílago estaban localmente presentes en los defectos óseos en el ejemplo y se observóreparación de defectos óseos a partir de la formación de puentes de nuevo hueso, mientras que en el ejemplocomparativo sin el campo magnético externo no se observó reparación de defectos óseos.
(Preparación de células magnéticas 2)
1.
Activación de perlas magnéticas usando EDC y NHS
El equivalente a 3 mg (60 l) se tomaron de una solución madre de ferrisphere 100C (fabricada por Japan Paint; 50mg/ml) y se lavaron añadiendo NaOH 0,01 N y agitando durante 10 minutos a temperatura ambiente en un mezclador. Esta operación de lavado se repitió una vez, y el lavado se realizó de nuevo añadiendo agua desionizaday agitando a temperatura ambiente durante 5 minutos en un mezclador. Esta operación de lavado se repitió 3 veces.Para activar las perlas magnéticas, el exceso de agua se retiró y las perlas magnéticas se mezclaron minuciosamente con 50 l de cada uno de EDC y NHS preparados a 50 mg/ml a pH 5,0 con MES 25 mM, y se agitóinclinando lentamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la reacción, el tubo se dejó durante2 minutos sobre un imán de neodimio, y el sobrenadante se retiró. Finalmente se lavó dos veces con MES 25 mM apH 5,0 (volumen de solución final (40 l)).
2.
Fijación de anticuerpos después de la activación
Anticuerpos CD44 de rata (fabricados por Chemicon) o péptidos RGDS (fabricados por Peptide Laboratories) (20 g)se disolvieron en MES 25 mM (60 l), se añadieron a las perlas activadas (suspendidas en 40 l de MES 25 mM a pH 5,0) y se agitaron inclinando lentamente a temperatura ambiente durante 3 horas para fijar los anticuerpos a lasperlas activadas. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre un imán de neodimio, y elsobrenadante se retiró. Para retirar los anticuerpos que no habían reaccionado con las perlas, se añadió etanolamina (0,05 M) en PBS (-) de pH 8,0, y se agitó inclinando lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Las perlas fijadas se lavaron durante 5 minutos a 4ºC en BSA al 0,5% en PBS (-). Esta operación de lavado serepitió cuatro veces. Esto se suspendió en BSA al 0,5% (1 ml) en PBS (-) y se almacenó a 4ºC.
3.
Unión de perlas con anticuerpos fijados a las células
Células madre mesenquimatosas mieloides de rata cultivadas se transfirieron de una placa a un tubo. Se realizó unareacción de antígeno-anticuerpo añadiendo las perlas preparadas (15 l) por 500 l de la suspensión celular (2 x 105 células) seguida de agitación inclinando ocasionalmente durante 1 hora a 4ºC. Se usó BSA al 0,5% en PBS (-) como tampón de reacción en este caso. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre un imán deneodimio, y el sobrenadante se retiró. Esto se resuspendió a continuación en BSA al 0,5% en PBS (-). Esta operación de lavado se realizó 3-4 veces. Los experimentos se realizaron en suspensión en PBS (-) o similares.
(Preparación de perlas magnéticas 3)
1.
Activación de perlas magnéticas usando EDC y NHS
El equivalente a 3 mg (60 l) se tomaron de una solución madre de ferrisphere 100C (fabricada por Japan Paint; 50mg/ml) y se lavaron añadiendo NaOH 0,01 N y agitando durante 10 minutos a temperatura ambiente en un mezclador. Esta operación de lavado se repitió una vez, y el lavado se realizó de nuevo añadiendo agua desionizaday agitando a temperatura ambiente durante 5 minutos en un mezclador. Esta operación de lavado se repitió 3 veces.Para activar las perlas magnéticas, el exceso de agua se retiró y las perlas magnéticas se mezclaron minuciosamente con 50 l de cada uno de EDC y NHS preparados a 50 mg/ml a pH 5,0 con MES 25 mM, y se agitóinclinando lentamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la reacción, el tubo se dejó durante2 minutos sobre un imán de neodimio, y el sobrenadante se retiró. Finalmente se lavó dos veces con MES 25 mM apH 5,0 (volumen final de solución (40 l)).
2.
Fijación de anticuerpos después de la activación
Anticuerpos CD44 de rata (fabricados por Chemicon) o péptidos RGDS (fabricados por Peptide Laboratories) (10 ng) se disolvieron en MES 25 mM (60 l) a pH 5,0, se añadieron a las perlas activadas (suspendidas en 40 l de MES 25 mM a pH 5,0) y se agitaron inclinando lentamente a temperatura ambiente durante 3 horas para fijar losanticuerpos a las perlas activadas. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre un imán deneodimio, y el sobrenadante se retiró. Para retirar los anticuerpos que no habían reaccionado con las perlas, seañadió etanolamina (0,05 M) en PBS (-) de pH 8,0, y se agitó inclinando lentamente a temperatura ambiente durante
5
15
25
35
45
55
1 hora. Las perlas fijadas se lavaron durante 5 minutos a 4ºC en BSA al 0,5% en PBS (-). Esta operación de lavadose repitió cuatro veces. Esto se suspendió en BSA al 0,5% (1 ml) en PBS (-) y se almacenó a 4ºC.
3. Unión de perlas con anticuerpos fijados a las células
Células madre mesenquimatosas mieloides de rata cultivadas se retiraron de una placa y se transfirieron a un tubo.Las perlas preparadas (1 l) se añadieron por 500 l de la suspensión celular (2 x 105 células) seguida de agitación inclinando ocasionalmente durante 1 hora en un refrigerador (4-10ºC) en el caso de los anticuerpos CD44 paraconseguir una reacción de antígeno-anticuerpo. En el caso de los péptidos RGDS, la reacción se realizó mediante agitación por inclinación ocasional durante 1 hora a 37ºC. Se usó BSA al 0,5%, EDTA 4,4 M en PBS (-) como tampón de reacción en este caso. Después de la reacción, el tubo se dejó durante 2 minutos sobre un imán deneodimio, y el sobrenadante se retiró. Esto se resuspendió a continuación en BSA al 0,5% en PBS (-). Esta operación de lavado se realizó 3-4 veces. Los experimentos se realizaron en suspensión en PBS (-) o similares.
Las figuras 5 (A) y (B) muestran imágenes microscópicas (a 480 aumentos) de células magnéticas preparadasmediante los métodos de preparación 2 y 3 anteriores, respectivamente, (células magnéticas mediadas por integrinay péptido RGDS) según lo observado en células madre mesenquimatosas de rata. Queda claro a partir de la figura 5que la actividad de las células magnéticas de acuerdo con la presente invención está afectada por la cantidad de péptido RGDS con cuerpos magnéticos introducido en las perlas magnéticas, en otras palabras, por la cantidad delpéptido mencionado anteriormente que recubre a las perlas magnéticas, y en última instancia las células magnéticasmuestran una mayor tendencia a agregarse en células en el cuerpo cuanto mayor sea la cantidad mencionadaanteriormente de introducción y mayor sea la cantidad de perlas magnéticas.
La figura 6 muestra los resultados para la expresión de ARNm (genes) de Colágeno de Tipo II y Aggrecan según lomedido mediante RT-PCR después de 21 días de cultivo cuando las células magnéticas (células madre mesenquimatosas de rata) preparadas con CD44 o péptido RGDS de acuerdo con la presente invención se sometieron a cultivo del sedimento usando medio de inducción de cartílago. La expresión de ambos genes seconfirmó en el grupo (grupo D+) en el que la diferenciación se indujo mediante adición de TGF-3 y dexametasona. En el grupo (grupo D-) que se cultivó sin adición de TGF-3 y dexametasona, por otro lado, no se observó expresión de ningún gen. A partir de los resultados mostrados en la figura 6 se supone a partir de Condrogénesis del complejode RT-PCR que se puede inducir a las células magnéticas (células madre mesenquimatosas) que tienen antígenoCD44 o péptido RGDS como enlazador a que se diferencien en células de cartílago.
La figura 7 muestra una fotografía que explica la formación de células magnéticas de acuerdo con la presenteinvención usando células madre neurales de rata. A partir de los resultados mostrados en la figura 7, se muestra que cuando células madre neurales de rata agregadas se dispersaban con una pipeta y a continuación se aplicabanperlas modificadas con el péptido RGDS mencionado anteriormente, se formaban células magnéticas usandocélulas madre neurales de rata mediante la integrina de las células madre neurales.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Con las células magnéticas de acuerdo con la presente invención, dado que las células magnéticas pueden introducirse in vivo y ser retenidas durante un largo periodo en un sitio afectado por una enfermedad mediante laacción de un campo magnético aplicado externamente, las funciones intrínsecas de las células pueden expresarseeficazmente. Además, las células magnéticas de acuerdo con la presente invención pueden aplicarse acondrogénesis y otra medicina regenerativa y como sistemas de administración de fármacos para el anticanceroso y similares dependiendo de la necesidad de terapia.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra una vista esquemática de la célula magnética de acuerdo con la primera realización lapresente invención.
La figura 2 muestra una vista esquemática de la célula magnética de acuerdo con la segunda realización de lapresente invención.
La figura 3 es un dibujo que explica la recuperación de cartílago como medicina regenerativa.
La figura 4 muestra imágenes microscópicas (a 50 aumentos) tomadas sin (A) y con (B) la aplicación de uncampo magnético externo durante aproximadamente 72 horas, un mes después de la inyección intra-articularde células magnéticas de acuerdo con la presente invención.
La figura 5 muestra imágenes microscópicas (a 480 aumentos) de células magnéticas preparadas de acuerdocon los métodos de preparación 2 (5A) y 3 (5B) de la presente invención en células madre mesenquimatosasde rata.
La figura 6 muestra los resultados para la expresión de ARNm (genes) de Colágeno de Tipo II y Aggrecansegún lo medido mediante RT-PCR después de 21 días de cultivo cuando células magnéticas (células madremesenquimatosas de rata) preparadas con CD44 o péptido RGDS de la presente invención se sometieron a cultivo del sedimento usando medio de inducción de cartílago.
La figura 7 muestra fotografías que explican células magnéticas de acuerdo con la presente invención formadasusando células madre neurales de rata. (A) es una imagen a 400 aumentos y (B) es una imagen a 1600 aumentos.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una célula magnética que comprende:
    una célula que tiene integrina en una superficie de la misma; y una partícula magnética que comprende unpéptido que tiene una actividad adhesiva a integrina y un material magnético, en la que la cantidad de péptido5 que recubre a las partículas magnéticas es de 3 ng a 6,6 g por 1 mg de la partícula magnética, en la que la partícula magnética está en la superficie de la célula y el péptido está en la superficie de la partícula magnética.
  2. 2. La célula magnética de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el péptido es un péptido que tiene unasecuencia de aminoácidos de RGDS.
  3. 3. La célula magnética de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además10 un fármaco.
ES04746441T 2003-06-30 2004-06-25 Célula magnética y método de uso de la misma. Expired - Lifetime ES2358176T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003188626 2003-06-30
JP2003-188626 2003-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2358176T3 true ES2358176T3 (es) 2011-05-06

Family

ID=33549759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04746441T Expired - Lifetime ES2358176T3 (es) 2003-06-30 2004-06-25 Célula magnética y método de uso de la misma.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7971592B2 (es)
EP (3) EP2360240A1 (es)
JP (1) JP3889026B2 (es)
KR (2) KR100799060B1 (es)
CN (2) CN101173250B (es)
AT (1) ATE491781T1 (es)
DE (1) DE602004030579D1 (es)
ES (1) ES2358176T3 (es)
WO (1) WO2005001070A1 (es)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101173250B (zh) * 2003-06-30 2011-01-26 卫材R&D管理有限公司 磁性细胞及其使用方法
ITRM20030376A1 (it) 2003-07-31 2005-02-01 Univ Roma Procedimento per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali cardiache da biopsia.
GB0405552D0 (en) * 2004-03-12 2004-04-21 Magnet Attraction Ltd Methods for the targetted delivery of biological molecules
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
JP2007151605A (ja) * 2005-11-30 2007-06-21 Mitsuo Ochi 磁気誘導装置および磁性複合体の誘導システム
US20090220463A1 (en) * 2006-01-19 2009-09-03 Doo-Sik Kim Pharmaceutical Composition For Treating Vascular-Related Diseases Comprising Peptide
CN101379082A (zh) 2006-01-19 2009-03-04 爱吉恩公司 治疗血管相关疾病的包含肽的药物组合物
US9101581B2 (en) 2008-10-27 2015-08-11 Eyegene Inc. Method for treating vascular-related disease
US8544474B2 (en) * 2007-12-20 2013-10-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Systems and methods for magnetic-assisted therapeutic agent delivery
WO2009100137A2 (en) * 2008-02-04 2009-08-13 University Of Miami Magnetic cells for localizing delivery and tissue repair
DE102009043537B4 (de) 2009-09-30 2012-03-22 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren und Anordnung zur Bestimmung von Zell-Vitalitäten
WO2011049236A1 (ja) 2009-10-23 2011-04-28 学校法人芝浦工業大学 磁気誘導システムとその動作方法
KR101028875B1 (ko) * 2010-02-12 2011-04-12 메디스커브 주식회사 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법
US9845457B2 (en) 2010-04-30 2017-12-19 Cedars-Sinai Medical Center Maintenance of genomic stability in cultured stem cells
US9249392B2 (en) 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
KR101983229B1 (ko) 2010-07-23 2019-05-29 삼성디스플레이 주식회사 유기 발광 표시 장치 및 그의 제조 방법
WO2013184527A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 Capricor, Inc. Optimized methods for generation of cardiac stem cells from cardiac tissue and their use in cardiac therapy
JP2015529471A (ja) * 2012-06-13 2015-10-08 コーポレイション ドゥレ エコール ポリテクニーク ドゥ モンレアル 磁気感応体の集団化および制御
DE102012212427A1 (de) * 2012-07-16 2014-01-16 Leibniz-Institut Für Festkörper- Und Werkstoffforschung Dresden E.V. Verfahren zur kontrollierten Bewegung von motilen Zellen in flüssigen oder gasförmigen Medien
CA2881394C (en) 2012-08-13 2024-05-14 Cedars-Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
WO2014074475A1 (en) * 2012-11-07 2014-05-15 Emmetrope Ophthalmics Llc Magnetic eye shields and methods of treatment and diagnosis using the same
EP2931367A4 (en) * 2012-12-14 2016-06-15 Medivation Technologies Inc MAGNETIC RETENTION OF REGENERATING CELLS FOR WOUND REPAIR
WO2016013660A1 (ja) * 2014-07-24 2016-01-28 凸版印刷株式会社 脂質膜構造体、脂質膜構造体固定化担体、及び胞体の融合方法
AU2015327812B2 (en) 2014-10-03 2021-04-15 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
US11253551B2 (en) 2016-01-11 2022-02-22 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
US11351200B2 (en) 2016-06-03 2022-06-07 Cedars-Sinai Medical Center CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
WO2018057542A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
KR101927196B1 (ko) * 2016-10-26 2018-12-11 전남대학교 산학협력단 자기구동 관절연골 재생 시스템
JP7336769B2 (ja) 2017-04-19 2023-09-01 シーダーズ―シナイ メディカル センター 骨格筋ジストロフィーを治療する方法及び組成物
EP3665269B1 (en) 2017-08-08 2021-09-15 Greiner Bio-One North America, Inc. Use of magnetic cells to manipulate non-magnetic cells
WO2019126068A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Cedars-Sinai Medical Center Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery
KR102114300B1 (ko) 2018-04-16 2020-05-22 전남대학교 산학협력단 최소 침습 골연골 재생용 자기 구동 마이크로지지체
JP6652608B2 (ja) * 2018-09-13 2020-02-26 ポリヴェイラー，リミテッド パートナーシップ 磁気感応体の集団化および制御
KR102248370B1 (ko) 2018-12-11 2021-05-07 (주)바이오트코리아 세포 탑재용 모듈 장치
KR102227821B1 (ko) * 2020-12-04 2021-03-15 연세대학교 산학협력단 유동관 형상 제어용 자성 세포, 이의 제조방법, 유동관 형상 제어 시스템 및 자성 세포를 이용한 인공지능 유동관 형상 제어계획 수립 시스템
WO2022203384A1 (ko) * 2021-03-23 2022-09-29 연세대학교 산학협력단 자성 세포의 적정 주입량을 결정하기 위한 정보 제공 방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4106488A (en) * 1974-08-20 1978-08-15 Robert Thomas Gordon Cancer treatment method
US4219411A (en) * 1978-09-18 1980-08-26 California Institute Of Technology Cell sorting apparatus
US5067952A (en) * 1990-04-02 1991-11-26 Gudov Vasily F Method and apparatus for treating malignant tumors by local hyperpyrexia
JP2699038B2 (ja) 1992-02-21 1998-01-19 株式会社ノエビア 温度感受性リポソーム
JP2642025B2 (ja) 1992-10-23 1997-08-20 科学技術振興事業団 磁性微粒子による細胞への生体物質導入方法及び磁気による細胞の選択的濃縮・分離法
JP4791616B2 (ja) 1997-09-19 2011-10-12 克郎 立花 薬物坦持体及びその使用方法
US5655546A (en) * 1995-06-07 1997-08-12 Halpern; Alan A. Method for cartilage repair
US5921244A (en) * 1997-06-11 1999-07-13 Light Sciences Limited Partnership Internal magnetic device to enhance drug therapy
US6203487B1 (en) * 1997-12-31 2001-03-20 Thomas Jefferson University Use of magnetic particles in the focal delivery of cells
AU5146300A (en) * 1999-05-21 2000-12-12 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Magnetic resonance tracking of magnetically labeled cells
WO2002030473A1 (en) * 2000-10-11 2002-04-18 Targesome, Inc. Targeted therapeutic agents
US6997863B2 (en) * 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
WO2003037400A2 (en) * 2001-10-31 2003-05-08 Ventrigraft Inc Methods and device compositions for the recruitment of cells to blood contacting surfaces in vivo
EP1551955A4 (en) * 2002-07-16 2006-11-29 Yissum Res Dev Co METHOD FOR IMPLANTING MESENCHYMAL STEM CELLS FOR TISSUE PAIRING AND FORMATION
CN101173250B (zh) * 2003-06-30 2011-01-26 卫材R&D管理有限公司 磁性细胞及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005001070A1 (ja) 2005-01-06
KR100799060B1 (ko) 2008-01-29
EP2182053A1 (en) 2010-05-05
ATE491781T1 (de) 2011-01-15
US20060264690A1 (en) 2006-11-23
EP1650293A4 (en) 2006-07-26
CN1742080A (zh) 2006-03-01
EP1650293B1 (en) 2010-12-15
JPWO2005001070A1 (ja) 2006-07-27
EP2360240A1 (en) 2011-08-24
CN100374550C (zh) 2008-03-12
US7971592B2 (en) 2011-07-05
US8701676B2 (en) 2014-04-22
CN101173250B (zh) 2011-01-26
US20100132722A1 (en) 2010-06-03
DE602004030579D1 (de) 2011-01-27
JP3889026B2 (ja) 2007-03-07
KR100743341B1 (ko) 2007-07-26
EP1650293A1 (en) 2006-04-26
KR20050084315A (ko) 2005-08-26
CN101173250A (zh) 2008-05-07
KR20070047849A (ko) 2007-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2358176T3 (es) Célula magnética y método de uso de la misma.
Prijic et al. Magnetic nanoparticles as targeted delivery systems in oncology
JP5167119B2 (ja) 遺伝子送達
JP5147699B2 (ja) タンパク質ナノ粒子およびその使用
JP5526156B2 (ja) 磁性粒子、及びその製造方法、並びに磁性粒子含有製剤
US6372720B1 (en) Liposome fusion and delivery vehicle
JPWO2006101201A1 (ja) 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム
JP4965570B2 (ja) 膜に囲まれた細胞または細胞小器官の内外へ生体分子をデリバリーするのに適したナノ粒子
WO2014058179A2 (ko) 저밀도 지단백질 유사 나노입자 및 이를 포함하는 간 표적 진단 및 치료용 조성물
CN110198740B (zh) 用于硼中子捕获疗法的新的bsh复合体
JP4195478B2 (ja) 磁性細胞およびその使用方法
Bai et al. Modular design of Bi-specific nanoplatform engaged in malignant lymphoma immunotherapy
JPWO2006077857A1 (ja) 粒子を脂質膜で被覆する方法
Uthaman et al. 9—Fabrication and development of magnetic particles for gene therapy
WO2006072593A2 (en) Device for magnet assisted transfer of chemical compounds into cells and method for magnet assisted transfer of proteins into cells
JP2020534261A (ja) 膜へのタンパク質送達
Denieva et al. Vesicle Delivery Systems of Biologically Active Compounds: From Liposomes to Cerasomes
US20230136448A1 (en) Microbubble-extracellular vesicle complexes
AU2018200468B2 (en) Method and composition for a protein transduction technology and its applications
Scherer et al. Magnetofection: Using magnetic particles and magnetic force to enhance and to target nucleic acid delivery
ES2391764T3 (es) Procedimiento para transfectar células usando un campo magnético
Chompoosor et al. Direct Delivery of Functional Proteins and Enzymes to the Cytosol Using Nanoparticle-Stabilized Nanocapsules
Mkhwanazi The use of cholesterol-galacto compounds in liver directed gene delivery.