ES2355015T3 - Compuestos de azufre como inhibidores de la serina proteasa ns3 del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un compuesto, o un enantiómero, estereoisómero, rotámero, tautómero, o racemato de dicho compuesto, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho enantiómero, estereoisómero, rotámero, tautómero, o racemato, dicho compuesto que tiene la estructura:

Description

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con nuevos inhibidores de la proteasa del virus de la hepatitis C (HCV); composiciones farmacéuticas que contienen uno o más de dichos inhibidores; procedimientos para la preparación de dichos inhibidores; y con procedimientos para el uso de dichos inhibidores en el tratamiento de la hepatitis C y 5 trastornos relacionados. Esta invención además desvela nuevos compuestos como inhibidores de la serina proteasa de HCV NS3/NS4a.

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus de ARN de cadena simple sentido (+) que ha sido involucrado como el principal agente causante de la hepatitis ni A ni B (NANBH), en particular, de la NANBH asociada a sangre (BB-10 NANBH) (véase la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 89/04669 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea Núm EP 381 216). La NANBH se distingue de otros tipos de enfermedades hepáticas inducidas por virus, tales como el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV ), el virus de la hepatitis delta (HDV ), citomegalovirus (CMV) y el virus de Epstein-Barr (EBV ), así como otras formas de enfermedades hepáticas, tales como alcoholismo y cirrosis biliar primaria. 15

Recientemente, se ha identificado, clonado y expresado una proteasa de HCV necesaria para el procesamiento de polipéptidos y la replicación viral, (véase, por ejemplo, la Patente U.S Núm 5.712.145). Esta poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos contiene, desde el extremo terminal amino hasta el extremo terminal carboxi, una proteína de nucleocápside (C), proteínas de envoltura (E1 y E2) y varias proteínas no estructurales (NS1; 2; 3; 4a; 5a y 5b). NS3 es una proteína de aproximadamente 68 kda, codificada por alrededor de 1893 nucleótidos del genoma de 20 HCV, y tiene dos dominios distintos: (a) un dominio de serina proteasa que consiste en aproximadamente 200 de los aminoácidos N-terminales; y (b) un dominio de ATPasa dependiente de ARN en el extremo C-terminal de la proteína. La proteasa NS3 se considera un miembro de la familia de quimiotripsinas, debido a similitudes en la secuencia de proteína, en la estructura tridimensional general y el mecanismo de catálisis. Otras enzimas del tipo quimiotripsina son elastasa, factor Xa, trombina, tripsina, plasmina, uroquinasa, tPA y PSA. La serina proteasa de HCV NS3 es 25 responsable de la proteólisis del polipéptido (poliproteína) en las uniones NS3/NS4a, NS4a/NS4b, NS4b/NS5a y NS5a/NS5b, y en consecuencia, es responsable de la generación de cuatro proteínas virales durante la replicación viral. Esto ha convertido a la serina proteasa de HCV NS3 en una diana atractiva para la quimioterapia antiviral. Los compuestos de la invención pueden inhibir dicha proteasa. Además, pueden modular el procesamiento de polipéptido de virus de la hepatitis C (HCV) 30

Se ha determinado que la proteína NS4a, un polipéptido de aproximadamente 6 kda, es un cofactor para la actividad de serina proteasa de NS3. La autoescisión de la unión NS3/NS4a por la serina proteasa NS3/NS4a se produce en forma intramolecular (es decir, cis), mientras que los otros sitios de escisión son procesados en forma intermolecular (es decir, trans).

El análisis de los sitios de escisión naturales para la proteasa de HCV reveló la presencia de cisteína en P1 y 35 serina en P1’, y que estos residuos están estrictamente conservados en las uniones NS4a/NS4b, NS4b/NS5a y NS5a/NS5b. La unión NS3/NS4a contiene una treonina en P1 y una serina en P1’. Se postula que la sustitución CysThr en NS3/NS4a explica la necesidad de procesamiento cis en lugar de trans en esta unión. Véase, por ejemplo, Pizzi et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 91:888-892, Failla et al. (1996) Folding & Design 1:35-42. El sitio de escisión de NS3/NS4a, además, es más tolerante a la mutagénesis, que los otros sitios. Véase, por ejemplo, Kollykhalov 40 et al (1994): J. Virol., 68: 7525-7533. Asimismo, se ha hallado que los residuos ácidos en la región corriente arriba del sitio de escisión son necesarios para la escisión eficaz. Véase, por ejemplo, Komoda et al. (1994): J. Virol., 68: 7351-7357.

Se ha informado que los inhibidores de la proteasa de HCV incluyen antioxidantes (véase la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 98/14181), ciertos péptidos y análogos peptídicos (véase la Publicación de 45 Solicitud de Patente Internacional Nro. WO 98/17679; Landro et al (1997): Biochem., 36: 9340-9348; Ingallinella et al (1998): Biochem., 37: 8906-8914, Llinàs-Brunet et al (1998): Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 1713-1718), inhibidores basados en el polipéptido de 70 aminoácidos eglina c (Martin et al (1998): Biochem., 37: 11459-11468), inhibidores de afinidad seleccionados del inhibidor de tripsina secretora pancreática humana (hPSTI-C3) y repertorios de minicuerpos (MBip) (Dimasi et al (1997): J. Virol., 71: 7461-7469), cVHE2 (un fragmento de anticuerpo de dominio variable 50 “camelizado”) (Martin et al (1997): Protein Eng., 10: 607-614) y 1-antiquimiotripsina (ACT) (Elzouki et al) (1997): J. Hepat., 27: 42-28). Recientemente, se ha desvalado una ribozima diseñada para destruir selectivamente el ARN del virus de la hepatitis C (véase, BioWorld Today 9 (217): 4 (10 de noviembre de 1998)).

Además, se hace referencia a las Publicaciones PCT Nros. WO 98/17679, publicada el 30 de abril de 1998 (Vertex Pharmaceuticals Incorporated); WO 98/22496, publicada el 28 de mayo de 1998 (F. Hoffmann-La Roche AG); y 55 WO 99/07734, publicada el 18 de febrero de 1999 (Boehringer Ingelheim Canada Ltd.).

El HCV se ha involucrado en la cirrosis hepática y en la inducción del carcinoma hepatocelular. El pronóstico

de pacientes que sufren de la infección de HCV actualmente es malo. La infección de HCV es más difícil de tratar que otras formas de hepatitis, debido a la falta de inmunidad o remisión asociada con la infección de HCV. La información actual indica una tasa de supervivencia inferior al 50%, a los cuatro años posteriores al diagnóstico de cirrosis. Los pacientes diagnosticados con carcinoma hepatocelular extirpable localizado tienen una tasa de supervivencia de cinco años del 10-30%, mientras que aquellos con carcinoma hepatocelular no extirpable localizado tienen una tasa de 5 supervivencia de cinco años inferior al 1%.

Se hace referencia al documento WO 00/59929 (US 6.608.027, Cesionario: Boehringer Ingelheim (Canadá) Ltd.; publicada el 12 de octubre de 2000), que desvela derivados peptídicos de la fórmula:

Se hace referencia a A. Marchetti et al: Synlett, S1, 1000-1002 (1999), que describe la síntesis de análogos 10 bicíclicos de un inhibidor de proteasa de HCV NS3. Un compuesto desvelado en dicha publicación tiene la fórmula:

Se hace referencia también a W. Han et al: Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., (2000), 10, 711-713, que describe la preparación de ciertas -cetoamidas, -cetoésteres y -dicetonas que contienen funcionalidades alilo y etilo.

Además, se hace referencia al documento WO 00/09558 (Cesionario: Boehringer Ingelheim Limited; publicado 15 el 24 de febrero de 2000), que desvela derivados peptídicos de la fórmula:

en la que los diversos elementos se definen en este documento. Un compuesto ilustrativo de dicha serie es:

Asimismo, se hace referencia al documento WO 00/09543 (Cesionario: Boehringer Ingelheim Limited; publicado el 24 de febrero de 2000), que desvela derivados peptídicos de la fórmula:

en la que los diversos elementos se definen en este documento. Un compuesto ilustrativo de dicha serie es: 5

Se hace referencia además al documento U.S. 6.608.027 (Boehringer Ingelheim, Canadá), que desvela inhibidores de proteasa NS3 del tipo:

en la que los diversos restos se definen en este documento.

Los tratamientos actuales para la hepatitis C contemplan interferón- (INF) y terapia de combinación con 5 ribavirina e interferón. Ver, por ejemplo, Beremguer et al (1998): Proc. Assoc. Am. Physicians, 110 (2): 98-112. Estos tratamientos poseen una baja tasa de respuesta sostenida y frecuentes efectos secundarios. Véase, por ejemplo, Hoofnagle et al (1997): N. Engl. J. Med., 336: 347. Actualmente, no hay vacuna para la infección de HCV.

Aun más, se hace referencia al documento WO 01/74768 (Cesionario: Vertex Pharmaceuticals Inc), publicado el 11 de octubre de 2001, que desvela ciertos compuestos de la siguiente fórmula general (en la que R se define en este 10 documento), como inhibidores de serina proteasa NS3 del virus de la hepatitis C:

Un compuesto específico desvelado en el documento mencionado anteriormente WO 01/74768 tiene la siguiente fórmula:

15

Las Publicaciones PCT WO 01/77113; WO 01/081325; WO 02/08198; WO 02/08256; WO 02/08187; WO 02/08244; WO 02/48172; WO 02/08251; y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos pendiente Serie Núm.

10/052.386, presentada el 18 de enero de 2002, desvelan diversos tipos de péptidos y/u otros compuestos, como inhibidores de la serina proteasa NS-3 del virus de la hepatitis C.

El documento WO 2005/087731 desvela una serie de compuestos que tienen actividad inhibidora de proteasa de HCV, así como composiciones farmacéuticas que los comprenden, y procedimientos de uso de ellas para tratar trastornos asociados con la proteasa de HCV. 5

El documento WO 2006/130628 desvela una serie de compuestos que tienen actividad inhibidora de proteasa del HCV, que se pueden usar en la formulación combinada con los agentes antivirales y/o inmunomoduladores.

Hay una necesidad de nuevos tratamientos y terapias para la infección de HCV. Existe la necesidad de compuestos útiles en el tratamiento, la prevención o la mejoría de uno o más síntomas de la hepatitis C. Existe la necesidad de procedimientos para el tratamiento, la prevención o la mejoría de uno o más síntomas de la hepatitis C. 10

Hay una necesidad de procedimientos para la modulación de la actividad de serina proteasas, en particular, la serina proteasa de HCV NS3/NS4a, mediante el uso de compuestos que se proporcionan en la presente memoria.

Existe la necesidad de procedimientos para la modulación del procesamiento del polipéptido de HCV empleando los compuestos que se proporcionan en la presente memoria.

Sumario de la invención 15

La Solicitud de Patente U.S de Serie Núm 11/064.673, se presentó el 24 de febrero de 2005 (que se publicó como US 2007/0042968 el 22 de febrero de 2007).

En sus muchas realizaciones, la presente invención provee nuevos compuestos como inhibidores de la proteasa de HCV; composiciones farmacéuticas que contienen uno o más de los compuestos; procedimientos para la preparación de formulaciones farmacéuticas que comprenden uno o más de dichos compuestos; procedimientos para el 20 tratamiento o la prevención de HCV, o la mejoría de uno o más de los síntomas de la hepatitis C, usando uno o más de dichos compuestos o una o más de dichas formulaciones; y procedimientos para la modulación de la interacción de un polipéptido de HCV con proteasa de HCV, usando uno o más de dichos compuestos o una o más de dichas formulaciones. La presente invención desvela compuestos, así como sales, solvatos o ésteres farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos, dicho compuesto que tiene la estructura: 25

Descripción detallada

Una realización de la invención desvela compuestos citados anteriormente y expuestos más adelante en la Tabla 1, o una sal, solvato o éster farmacéuticamente aceptables de estos.

Como se usó anteriormente y a lo largo de esta divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos 30 que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

“Paciente” incluye seres humanos y animales.

“Mamífero” significa seres humanos y otros animales mamíferos.

El término “aislado” o “en forma aislada”, para un compuesto, se refiere al estado físico de dicho compuesto posteriormente de ser aislado de un procedimiento de síntesis o de una fuente natural, o sus combinaciones. El término 35 “purificado” o “en forma purificada” para un compuesto, se refiere al estado físico de dicho compuesto después de ser obtenido de un procedimiento o procedimientos de purificación descritos en la presente o bien conocidos por el experto en la técnica, en suficiente pureza como para ser caracterizado por medio de técnicas analíticas convencionales descritas en la presente o bien conocidas por los expertos en la técnica.

Además, también cabe mencionar que cualquier heteroátomo con valencias no satisfechas en el texto, 40 esquemas, ejemplos y Tablas de la presente se asume que tiene el átomo o átomos de hidrógeno para satisfacer las valencias.

El término “uno o más” o “al menos uno”, cuando se indica la cantidad de sustituyentes, compuestos, agentes

de combinación y similares, se refiere a por lo menos uno y hasta el número máximo de sustituyentes, compuestos, agentes de combinación y similares química y físicamente permisibles, presentes o añadidos, de acuerdo con el contexto. Dichas técnicas y dicho conocimiento son conocidos por los expertos en la técnica.

Como se utiliza en la presente, el término “composición” tiene la intención de abarcar un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades establecidas, y además, cualquier producto que se origine, 5 directa o indirectamente, a partir de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades establecidas.

En la presente también se contemplan los profármacos y solvatos de los compuestos de la invención. El término “profármaco”, según se emplea en la presente, indica un compuesto que es un precursor del fármaco que, después de la administración a un sujeto, se somete a una conversión química a través de procedimientos metabólicos o químicos para producir un compuesto de la Fórmula I o una sal o un solvato de este. Se provee una descripción de 10 profármacos en T. Higuchi y V. Stella: Pro-drugs as Novel Delivery Sistems (1987), 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design (1987), Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, ambas incorporadas a la presente solicitud por referencia.

“Solvato” significa una asociación física de un compuesto de esta invención con una o más moléculas de disolvente. Esta asociación física involucra diferentes grados de enlace iónico y covalente, que incluyen enlaces de 15 hidrógeno. En ciertas ocasiones, el solvato será aislable, por ejemplo, cuando una o más moléculas de disolvente se incorporan en la retícula cristalina del sólido cristalino. “Solvato” abarca tanto los solvatos en fase de solución como los solvatos aislables. Ejemplos no limitativos de solvatos apropiados incluyen etanolatos, metanolatos y similares. Un “hidrato” es un solvato en el que la molécula de disolvente es H2O.

Las expresiones “cantidad efectiva” o “cantidad terapéuticamente efectiva” se usan para describir una cantidad 20 de compuesto o de una composición de la presente invención, efectiva en la inhibición de la serina proteasa de HCV NS3/NS4a, y en consecuencia, que produce el efecto terapéutico, paliativo, inhibitorio o preventivo deseado.

Los compuestos de la presente invención pueden formar sales, que también se encuentran dentro del alcance de esta invención. La referencia a un compuesto de la presente invención en la presente se entiende que incluye la referencia a sus sales, a menos que se indique lo contrario. El término “sal/es”, según se emplea en la presente 25 solicitud, indica sales ácidas formadas con ácidos inorgánicos y/u orgánicos, así como sales básicas formadas con bases inorgánicas y/u orgánicas. Además, cuando un compuesto de la presente invención contiene tanto un resto básico, tales como, pero sin limitación, una piridina o un imidazol, y un resto ácido, tal como, sin limitación, un ácido carboxílico, pueden formarse zwiteriones (“sales internas”), y estos se incluyen dentro del término “sal” o “sales” como se usa en la presente. Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente 30 aceptables), si bien otras sales también son útiles. Las sales de los compuestos de la presente invención pueden formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un compuesto de la presente invención con una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como aquel en el cual la sal se precipita, o en un medio acuoso, seguido por liofilización.

Los ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen acetatos, ascorbatos, benzoatos, bencenosulfonatos, 35 bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforatos, alcanforsulfonatos, fumaratos, hidrocloruros, hidrobromuros, hidroyoduros, lactatos, maleatos, metanosulfonatos, naftalenosulfonatos, nitratos, oxalatos, fosfatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos, tartratos, tiocianatos, toluensulfonatos (también conocidos como tosilatos) y similares. Además, los ácidos que generalmente se consideran apropiados para la formación de sales farmacéuticamente útiles a partir de compuestos farmacéuticos básicos se describen, por ejemplo, en P. Stahl et al, Camille G. (eds.). Handbook of 40 Pharmaceutical Salts. Properties, Selection y Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH; S. Berge et al, Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1-19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; y en The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. en su sitio de Internet). Estas divulgaciones se incorporan aquí por referencia.

Los ejemplos de sales básicas incluyen sales de amonio; sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, 45 litio y potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio; sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas), tales como diciclohexilaminas, t-butilaminas; y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. Los grupos básicos que contienen nitrógeno se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo inferior (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo y butilo), sulfatos de dialquilo (por ejemplo, sulfatos de dimetilo, dietilo y dibutilo), haluros de cadena larga (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de decilo, 50 laurilo y estearilo), haluros de aralquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo) y otros.

Se entiende que todas dichas sales de ácidos y sales de bases son sales farmacéuticamente aceptables dentro del alcance de la invención, y todas las sales de ácidos y bases se consideran equivalentes a las formas libres de los compuestos correspondientes, para los fines de la invención.

Los ésteres farmacéuticamente aceptables de los presentes compuestos abarcan los siguientes grupos: (1) 55 ésteres de ácidos carboxílicos obtenidos por medio de la esterificación de los grupos hidroxi, en el que el resto no carbonilo de la porción ácido carboxílico de la agrupación éster se selecciona de alquilo de cadena recta o ramificada (por ejemplo, acetilo, n-propilo, t-butilo o n-butilo), alcoxialquilo (por ejemplo, metoximetilo), aralquilo (por ejemplo,

bencilo), ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo), arilo (por ejemplo, fenilo opcionalmente sustituido con, por ejemplo, halógeno, alquilo C1-4 o alcoxi C1-4 o amino); (2) ésteres de sulfonatos, tales como alquil- o aralquilsulfonilo (por ejemplo, metanosulfonilo); (3) ésteres de aminoácidos (por ejemplo, L-valilo o L-isoleucilo); (4) ésteres de fosfonatos; y (5) ésteres de mono-, di- o trifosfatos. Los ésteres de fosfatos pueden ser adicionalmente esterificados, por ejemplo, por un alcohol C1-20 o derivado reactivo de éste, o por un 2,3-di-acilo(C6-24) glicerol. 5

Los compuestos de la presente invención, y sales, solvatos, ésteres y profármacos de estos, pueden existir en su forma tautomérica (por ejemplo, como una amida o un imino éter). Todas dichas formas tautoméricas se contemplan en la presente como parte de la presente invención.

Todos los estereoisómeros (por ejemplo, isómeros geométricos, isómeros ópticos y similares) de los presentes compuestos (incluso, aquellos de las sales, los solvatos, ésteres y profármacos de los compuestos, al igual que de las 10 sales y los solvatos de los profármacos), tales como aquellos que pueden existir debido a los carbonos asimétricos en diversos sustituyentes, que incluyen formas enantioméricas (que pueden existir aun en ausencia de carbonos asimétricos), formas rotaméricas, atropoisómeros y formas diastereoméricas, se consideran dentro del alcance de la presente invención, al igual que los isómeros de posición (por ejemplo, 4-piridilo y 3-piridilo). Los estereoisómeros individuales de los compuestos de la invención pueden, por ejemplo, estar sustancialmente libres de otros isómeros, o 15 pueden estar mezclados, por ejemplo, como racematos, o con todos los otros estereoisómeros, o con otros seleccionados. Los centros quirales de la presente invención pueden tener la configuración S o R según las recomendaciones IUPAC 1974. Se entiende que el uso de los términos “sal”, “solvato”, “profármaco” y similares se aplica igualmente a la sal, el solvato y el profármaco de enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, isómeros de posición, racematos o profármacos de los compuestos de la invención. 20

Las formas polimórficas de los compuestos de la presente invención, y de sus sales, solvatos, ésteres y profármacos, se incluyen en la presente invención.

Debe entenderse que la utilidad de los compuestos de la presente invención para las aplicaciones terapéuticas analizadas en la presente es aplicable a cada compuesto en sí mismo, o a la combinación o las combinaciones de uno o más compuestos, como se ilustra, por ejemplo, en el párrafo inmediatamente a continuación. También se aplica el 25 mismo presupuesto a las composiciones farmacéuticas que comprenden dicho compuesto o dichos compuestos, y a los procedimientos de tratamiento que involucran dicho compuesto o compuestos.

Los compuestos de acuerdo con la invención pueden tener propiedades farmacológicas; en particular, los compuestos de la invención pueden ser inhibidores de la proteasa de HCV, cada compuesto, en sí mismo o combinado con uno o más compuestos seleccionados de los compuestos de la invención citados con anterioridad. Los compuestos 30 pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades tales como HCV, HIV (SIDA: síndrome de inmunodeficiencia adquirida) y trastornos relacionados, así como para la modulación de la actividad de la proteasa del virus de la hepatitis C (HCV), la prevención del HCV, o la mejoría de uno o más de los síntomas de la hepatitis C.

Los compuestos de la presente invención pueden usarse para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de trastornos asociados con la proteasa de HCV; por ejemplo, el procedimiento comprende el contacto 35 íntimo de un compuesto de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, esta invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto o compuestos de la invención como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas, en general, comprenden además por lo menos un portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico (denominados colectivamente en la presente, materiales portadores). Debido a su actividad inhibitoria de HCV, dichas composiciones farmacéuticas 40 poseen utilidad en el tratamiento de la hepatitis C y trastornos relacionados.

En otra realización más, la presente invención desvela procedimientos para la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención, como ingrediente activo. En las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la presente invención, los ingredientes activos generalmente serán administrados en mezcla con materiales portadores adecuados, seleccionados apropiadamente con respecto a la forma de 45 administración propuesta, es decir, comprimidos orales, cápsulas (rellenas con sólido, rellenas con semisólido o rellenas con líquido), polvos para reconstitución, geles orales, elíxires, gránulos dispersables, jarabes, suspensiones y similares, y compatibles con las prácticas farmacéuticas convencionales. Por ejemplo, para administración oral en forma de comprimidos o cápsulas, el componente de fármaco activo puede combinarse con cualquier portador oral inerte farmacéuticamente aceptable, no tóxico, tal como lactosa, almidón, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato 50 dicálcico, sulfato de calcio, talco, manitol, alcohol etílico (formas líquidas) y similares. Además, cuando se desea o es necesario, pueden incorporarse también en la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes o agentes colorantes adecuados. Los polvos y los comprimidos pueden estar compuestos por desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 95 por ciento de composición de la invención.

Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales, edulcorantes de maíz, gomas 55 naturales y sintéticas tales como goma de acacia, alginato sódico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y ceras. Entre los lubricantes pueden mencionarse, para el uso en estas formas de dosificación, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Los desintegrantes incluyen almidón, metilcelulosa, goma de guar y similares,

Cuando sea apropiado, pueden incluirse también agentes edulcorantes y saborizantes y conservantes. Algunos de los términos observados con anterioridad, a saber, desintegrantes, diluyentes, lubricantes, aglutinantes y similares, se describen a continuación en más detalle.

Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden formularse en forma de liberación sostenida a fin de proporcionar la liberación de tasa controlada de cualquiera de uno o más de los componentes o 5 ingredientes activos, de manera de optimizar los efectos terapéuticos, es decir, la actividad inhibitoria de HCV y similares. Las formas de dosificación adecuadas para la liberación sostenida incluyen comprimidos en capas, que contienen capas de diversas velocidades de desintegración o matrices poliméricas de liberación controlada, impregnadas con los componentes activos y moldeadas en forma de comprimidos o cápsulas que contienen dichas matrices poliméricas porosas encapsuladas o impregnadas. 10

Las preparaciones en forma líquida comprenden soluciones, suspensiones y emulsiones. Se pueden mencionar, a modo de ejemplo, las soluciones acuosas o de agua-propilenglicol para inyección parenteral, o la adición de edulcorantes y opacificantes, para soluciones, suspensiones y emulsiones orales. Las preparaciones en forma líquida además pueden comprender soluciones para administración intranasal.

Las preparaciones en aerosol adecuadas para inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de 15 polvo, que pueden presentarse en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un gas comprimido inerte, por ejemplo, nitrógeno.

Para la preparación de supositorios, una cera de baja fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos, tal como, manteca de cacao se funde primero, y el ingrediente activo se dispersa allí de manera homogénea, mediante la agitación o mezcla similar. La mezcla homogénea fundida posteriormente se vierte en moldes de tamaño 20 conveniente, se deja enfriar, y de ese modo, solidificar.

También se incluyen las preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse, poco antes del uso, en preparaciones en forma líquida para administración oral o parenteral. Dichas formas líquidas comprenden soluciones, suspensiones y emulsiones.

Los compuestos de la invención también pueden suministrarse por vía transdérmica. Las composiciones 25 transdérmicas pueden adoptar la forma de cremas, lociones, aerosoles o emulsiones, y pueden incluirse en un parche transdérmico del tipo matriz o depósito, como son convencionales en el arte para este propósito.

Los compuestos de la invención también pueden administrarse por vía oral, intravenosa, intranasal o subcutánea.

Los compuestos de la invención también pueden comprender preparaciones que se presentan en una forma de 30 dosificación unitaria. En dicha forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias de tamaño adecuado, que contienen cantidades apropiadas de los componentes activos, por ejemplo, una cantidad efectiva para lograr el propósito deseado.

La cantidad de la composición activa de la invención en una dosis unitaria de preparación generalmente puede variar o ajustarse desde aproximadamente 1,0 mg hasta aproximadamente 1000 mg; preferentemente, desde aproximadamente de 1,0 mg hasta aproximadamente de 950 mg; más preferentemente, desde aproximadamente de 1,0 35 mg hasta aproximadamente de 500 mg, y habitualmente, desde aproximadamente de 1 hasta aproximadamente de 250 mg, de acuerdo con la aplicación particular. La dosificación real empleada puede variarse de acuerdo con la edad, el sexo, el peso del paciente y la gravedad de la afección tratada. Dichas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica.

En general, la forma de dosificación oral humana que contiene los ingredientes activos puede administrarse 1 ó 40 2 veces por día. La cantidad y frecuencia de la administración serán reguladas conforme al juicio del médico a cargo. Un régimen de dosificación diaria recomendado generalmente para administración oral puede variar desde aproximadamente 1,0 mg hasta aproximadamente 1000 mg por día, en dosis únicas o divididas.

A continuación se describen algunos términos útiles:

Cápsula. Se refiere a un recipiente especial o contenedor hecho de metilcelulosa, alcoholes polivinílicos o 45 gelatinas desnaturalizadas o almidón, para sostener o contener composiciones que comprenden los ingredientes activos. Las cápsulas de cubierta dura típicamente están hechas de combinaciones de gelatinas de hueso y piel de cerdo de relativamente alta concentración de gel. La cápsula en sí misma puede contener pequeñas cantidades de colorantes, agentes opacantes, plastificantes y conservantes.

Comprimido. Se refiere a una forma de dosificación sólida, comprimida o moldeada, que contiene los 50 ingredientes activos con diluyentes adecuados. El comprimido puede prepararse mediante la compresión de mezclas o granulaciones obtenidas por medio de la granulación en húmedo, la granulación en seco o por compactación.

Gel oral. Se refieren a los ingredientes activos dispersos o solubilizados en una matriz semisólida hidrófila.

Polvos para constitución. Se refieren a combinaciones de polvo que contienen los ingredientes activos y diluyentes adecuados, que pueden suspenderse en agua o jugos.

Diluyente. Se refiere a sustancias que habitualmente forman la mayor porción de la composición o forma farmacéutica. Los diluyentes adecuados incluyen azúcares tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; almidones derivados de trigo, maíz, arroz y papa; y celulosas tales como celulosa microcristalina. La cantidad de diluyente en la 5 composición puede variar de aproximadamente 10 a aproximadamente 90% en peso de la composición total; preferentemente, de aproximadamente de 25 a aproximadamente 75%; más preferentemente, de aproximadamente de 30 a aproximadamente 60% en peso, aun más preferentemente, de aproximadamente de 12 a aproximadamente 60%.

Desintegrantes. Se refieren a materiales añadidos a la composición a fin de ayudar a su separación (desintegración) y a la liberación de los medicamentos. Los desintegrantes adecuados incluyen almidones; almidones 10 modificados “solubles en agua fría” tales como almidón de carboximetil sódico; gomas naturales y sintéticas, tales como goma de algarroba, karaya, guar, tragacanto y agar; derivados de celulosa, tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; celulosas microcristalinas y celulosas microcristalinas reticuladas, tales como croscarmelosa sódica; alginatos, tales como ácido algínico y alginato sódico; arcillas, tales como bentonitas; y mezclas efervescentes. La cantidad de desintegrante en la composición puede variar de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 15% en peso de la composición, más preferentemente, de aproximadamente 4 a aproximadamente 10% en peso.

Aglutinantes. Se refieren a sustancias que unen o “pegan” polvos y los tornan cohesivos mediante la formación de gránulos, para servir de “adhesivo” en la formulación. Los aglutinantes añaden intensidad cohesiva, ya presente en el diluyente o agente de volumen. Los aglutinantes adecuados incluyen azúcares tales como sacarosa; almidones derivados de trigo, maíz, arroz y papa; gomas naturales tales como goma de acacia, gelatina y tragacanto; derivados de 20 algas marinas, tales como ácido algínico, alginato sódico y alginato cálcico de amonio; materiales celulósicos tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa de sodio; polivinilpirrolidona; y sustancias inorgánicas tales como silicato de aluminio magnésico. La cantidad de aglutinante en la composición puede variar desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20% en peso de la composición; más preferentemente, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10% en peso; aun más preferentemente, de aproximadamente 3 a 25 aproximadamente 6% en peso.

Lubricante. Se refiere a una sustancia añadida a la forma farmacéutica, a fin de permitir que el comprimido, los gránulos, etc., posteriormente de su compresión, sean liberados desde el molde o la matriz, mediante la reducción de la fricción o el desgaste. Los lubricantes adecuados incluyen estearatos metálicos tales como estearato de magnesio, estearato de calcio o estearato de potasio; ácido esteárico; ceras de alto punto de fusión; y lubricantes solubles en agua 30 tales como cloruro de sodio, benzoato de sodio, acetato de sodio, oleato de sodio, polietilenglicoles y d’-l-leucina. Los lubricantes habitualmente se añaden en la última etapa antes de la compresión, ya que deben presentarse sobre las superficies de los gránulos y entre ellos y las partes de la prensa. La cantidad de lubricante en la composición puede variar desde aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 5% en peso de la composición; preferentemente, desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2%; más preferentemente, desde aproximadamente 0,3 hasta 35 aproximadamente 1,5% en peso.

Deslizantes. Son materiales que evitan la aglomeración y mejoran las características de flujo de las granulaciones, de manera que el flujo es suave y uniforme. Los deslizantes adecuados incluyen dióxido de silicio y talco. La cantidad de deslizante en la composición puede variar de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5% en peso de la composición total; preferentemente, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2% en peso. 40

Agentes colorantes. Son excipientes que proveen coloración a la composición o a la forma de dosificación. Dichos excipientes pueden incluir tinturas de grado alimenticio y tinturas de grado alimenticio adsorbidas por un adsorbente adecuado tal como arcilla u óxido de aluminio. La cantidad de agente colorante puede variar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5% en peso de la composición; preferentemente, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1%. 45

Biodisponibilidad. Se refiere a la velocidad y la medida en las que el ingrediente de fármaco activo o el resto terapéutico son absorbidos por la circulación sistémica desde una forma farmacéutica administrada, en comparación con un estándar o control.

Los procedimientos convencionales para la preparación de comprimidos son conocidos. Dichos procedimientos incluyen procedimientos en seco, tales como la compresión directa y la compresión de granulación producida por la 50 compactación; o procedimientos húmedos u otros procedimientos especiales. Los procedimientos convencionales para la elaboración de otras formas de administración, tales como, por ejemplo, cápsulas, supositorios y similares, son también conocidos.

Otra realización de la invención desvela el uso de los compuestos o de las composiciones farmacéuticas de la invención desveladas con anterioridad, para el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo, hepatitis C y 55 similares. El procedimiento comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto o de la composición farmacéutica de la invención a un paciente que sufre de dicha enfermedad o enfermedades, y que necesita dicho tratamiento.

En otra realización más, los compuestos de la invención pueden usarse para el tratamiento de HCV en seres humanos, en modo de monoterapia o en modo de terapia de combinación (por ejemplo, combinación doble, combinación triple, etc.), tal como, por ejemplo en combinación con agentes antivirales o inmunomoduladores. Ejemplos de dichos agentes antivirales o inmunomoduladores incluyen ribavirina (de Schering-Plough Corporation, Madison, New Jersey) y LevovirinTM (de ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, California), VP 50406TM (de Viropharma, Incorporated, 5 Exton, Pennsylvania), ISIS 14803TM (de ISIS Pharmaceuticals, Carlsbad, California), HeptazymeTM (de Ribozyme Pharmaceuticals, Boulder, Colorado), VX 497TM (de Vertex Pharmaceuticals, Cambridge, Massachusetts), ThymosinTM (de SciClone Pharmaceuticals, San Mateo, California), MaxamineTM (Maxim Pharmaceuticals, San Diego, California), micofenolato mofetil (de Hoffman-LaRoche, Nutley, New Jersey), interferón (tal como, por ejemplo, interferón-alfa, conjugados de PEG-interferón alfa) y similares. Los “conjugados de PEG-interferón alfa” son moléculas de interferón 10 alfa covalentemente unidas a una molécula de PEG. Los conjugados de PEG-interferón alfa ilustrativos incluyen interferón alfa-2a (RoferonTM, de Hoffman La-Roche, Nutley, New Jersey) en forma de interferón alfa-2a pegilado (por ejemplo, como se comercializa con la denominación comercial PegasysTM); interferón alfa-2b (IntronTM, de Schering-Plough Corporation), en forma de interferón alfa-2b pegilado (por ejemplo, como se comercializa con la denominación comercial PEG-IntronTM), interferón alfa-2c (Berofor AlphaTM, de Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) o interferón 15 de consenso, definido por la determinación de una secuencia de consenso de interferones alfa naturales (InfergenTM, de Amgen, Thousand Oaks, California).

Como se establece con anterioridad, la invención contempla tautómeros, rotámeros, enantiómeros, y además, otros estereoisómeros de los compuestos de la invención. En consecuencia, como será apreciado por el experto en la técnica, algunos de los compuestos de la invención pueden presentarse en formas isómeras adecuadas. Dichas 20 variaciones se contemplan dentro del alcance de la invención.

Otra realización de la invención desvela un procedimiento para la elaboración de los compuestos desvelados en esta solicitud. Los compuestos pueden prepararse mediante varias técnicas conocidas en la materia. Los procedimientos ilustrativos se reseñan en los siguientes esquemas de reacción. Las ilustraciones no deben ser interpretadas como un límite al alcance de la invención, que es definido en las reivindicaciones adjuntas. Serán 25 evidentes para los expertos en la técnica las vías mecánicas alternativas y las estructuras análogas.

Debe entenderse que si bien los esquemas ilustrativos que siguen describen la preparación de algunos compuestos representativos de la invención, la sustitución adecuada de cualquiera de los aminoácidos naturales y no naturales producirá la formación de los compuestos deseados sobre la base de dicha sustitución. Dichas variaciones se contemplan dentro del alcance de la invención. 30

Para los procedimientos que se describen a continuación, se usan las siguientes abreviaturas.

THF: Tetrahidrofurano.

DMF: N,N-Dimetilformamida.

EtOAc: Acetato de etilo.

DCM: Diclorometano. 35

HATU: hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

MeOH: Metanol.

TLC: Cromatografía de capa delgada.

pH: Porcentaje de hidrógeno.

Sat.: Saturado. 40

n-BuLi: n-Butil litio.

TA: Temperatura ambiente.

DPPA: Difenilfosforil azida

Esquemas generales para la preparación de compuestos diana.

Los compuestos de la presente invención se sintetizaron empleando los esquemas generales descritos para la 45 elaboración del Ejemplo de Preparación 1200, como se describe a continuación.

Ejemplo de Preparación 1200:

Etapa 1:

Ciclohexilidenamida del ácido 2-metil-propano-2-sulfínico (1200-B). Se añadió tetraetóxido de titanio (2 5 eq., 3,56 ml, d 1,088) a una solución de ciclohexanona (1,2 eq., 1,0 g, 1,05 ml, d 0,947) en 20 ml de THF seco en una atmósfera de nitrógeno. Después de 5 minutos, se añadió gota a gota (S)-t-butanosulfinamida (1200-A, 1,028 g) en 10 ml de THF. La mezcla se calentó hasta 60ºC durante la noche. Se vertió la mezcla de reacción en un volumen equivalente de solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso con rápida agitación, y de inmediato, se filtró a través de celite. La torta filtrada se lavó con acetato de etilo (50 ml). Las fase del filtrado se separaron, y la fase acuosa se 10 extrajo con acetato de etilo (30 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo se sometió a la cromatografía en gel de sílice (gradiente: éter/hexanos; 1:9 a 1:1) para obtener el producto 1200-B (1,3 g; 76%) en forma de un aceite incoloro. El producto se mantuvo en una atmósfera inerte a -20°C.

Etapa 2: 15

N,N-Dimetil-C-[1-(2-metil-propano-2-sulfinilamino)-ciclohexil]-metanosulfonamida (1200-C). Se añadió n-butil litio (1,3 eq., 8,07 ml de una solución 1,6 M en hexanos), gota a gota, a una solución enfriada (-78°C) de N,N-dimetil metanosulfonamida (1,35 eq., 1,65 g) en 100 ml de THF seco, en una atmósfera anhidra. La mezcla se agitó durante 30 min a esta temperatura, y posteriormente se transfirió por medio de una cánula a una solución de sulfinilimina 1200-B 20 (2,0 g) en 100 ml de THF seco a -78°C. Después de completarse la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. La reacción se inactivó a -78°C mediante la adición de 20 ml de solución de cloruro de amonio saturado acuoso. La mezcla se dejó alcanzar temperatura ambiente, y posteriormente se fraccionó entre diclorometano (300 ml) y solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso (300 ml). La fase acuosa se extrajo nuevamente con diclorometano (2 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo se 25 sometió a la cromatografía en gel de sílice (gradiente: diclorometano/hexanos, 1:1, a 30% de acetona en diclorometano/hexanos, 1:1) para obtener el producto 1200-C (1,36 g; 42%) en forma de un aceite incoloro.

Etapa 3:

C-(1-Amino-ciclohexil)-N,N-dimetil-metanosulfonamida, sal clorhídrica (1200-D). La sulfinamida 1200-C (1,3 g) se disolvió en 40 ml de metanol y se trató con 10 ml de solución de HCl, 4 M, en dioxano. La mezcla se agitó durante aproximadamente 30 minutos hasta el consumo de todo el material inicial, según lo determinado por TLC (20% 5 de acetona en diclorometano/hexanos, 1:1). La mezcla se evaporó hasta sequedad. Se añadió diclorometano (15 ml) a fin de obtener una solución turbia. Con la adición de 100 ml de éter, se formó un precipitado blanco. El producto 1200-D (1,02 g; 98%) se recuperó mediante la filtración, usando papel filtro Whatman #1.

Etapa 4:

10

C-(1-Isocianato-ciclohexil)-N,N-dimetil-metanosulfonamida (1200-E): Una solución de clorhidrato de amina 1200-D (520 mg) en 40 ml de diclorometano se trató con 20 ml de solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso, y se agitó vigorosamente durante 10 minutos a 0ºC. La agitación se detuvo, y se permitió la separación de las fases. Se añadió fosgeno (10 ml de solución al 20% en tolueno) a la fase orgánica (fase inferior), en una porción. La mezcla se agitó vigorosamente de inmediato posteriormente de la adición, durante 10 minutos a 0ºC, y se agitó adicionalmente a 15 temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con 100 ml de diclorometano, y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con 50 ml de solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso frío y se secó sobre sulfato de magnesio. La fase orgánica se filtró y se diluyó con 15 ml de tolueno. La solución resultante se concentró a presión reducida, y el producto 1200-E se mantuvo como una solución 0,2 M.

Etapa 5: 20

Éster metílico de ácido 3-{2-[3-(1-dimetilsulfamoilmetil-ciclohexil)-ureido]-3,3-dimetil-butiril}-6,6-dimetil-3-aza-biciclo[3.1.0]hexano-2-carboxílico (1200-F). Una solución del clorhidrato de amina P2-P3 descrito previamente, 20.07 (Solicitud de Patente U.S. Serie Núm. 11/064.673, Intermediario 20.07) (1,2 eq., 1,0 g) en 30 ml de diclorometano se enfrió hasta 0°C y se trató con N-metilmorfolina (2,5 eq., 0,72 ml, d 0,920). Después de 5 min, se añadió una solución 25 de isocianato 1200-E (13,0 ml de solución 0,2 M en tolueno). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas adicionales (temperatura de 0 a 25°C). La mezcla se trató con HCl acuoso, 1 M (50 ml), y el producto se recogió en acetato de etilo (300 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera (50 ml), y se secó sobre sulfato de magnesio. La mezcla se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a la cromatografía en gel de sílice (gradiente: acetona/hexanos, 1:9 a 4:6) para obtener el producto 1200-F (850 mg; 62%) en forma de un sólido de color blanco. 30

Etapa 6:

Ácido 3-{2-[3-(1-dimetilsulfamoilmetil-ciclohexil)-ureido]-3,3-dimetil-butiril}-6,6-dimetil-3-aza-biciclo [3.1.0] hexano-2-carboxílico (1200-G). Una solución de éster metílico 1200-F (840 mg) en 30 ml de una mezcla 2:1 de THF/agua se enfrió hasta 0°C, y se trató con monohidrato de hidróxido de litio (2,5 eq., 166 mg). La mezcla se agitó 5 durante 10 minutos, y se eliminó el baño de enfriamiento. La reacción se agitó a temperatura ambiente hasta el consumo de todo el material, según lo determinado por TLC (acetona/hexanos; 3:7). Después de 2 horas, la mezcla se trató con HCl acuoso, 1 M (aproximadamente 50 ml) a fin de tornar la mezcla ácida (pH 2). La mezcla se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron a presión reducida para obtener el producto 1200-G (815 mg; 98%) en forma de un sólido de color blanco. 10

Etapa 7:

[1-(Ciclopropilcarbamoil-hidroxi-metil)-pentil]-amida de ácido 3-{2-[3-(1-dimetilsulfamoilmetil-ciclohexil)-ureido]-3,3-dimetil-butiril}-6,6-dimetil-3-aza-biciclo[3.1.0]hexano-2-carboxílico (1200-H). Una solución de ácido 1200-G (250 mg) en 5 ml de diclorometano seco y 5 ml de DMF seca se agitó a 0ºC y se trató con HATU (1,4 eq., 259 15 mg). Se añadió el clorhidrato de amina 837l (previamente descrito en la Solicitud de Patente U.S. Núm. 11/064.673, Ejemplo 837, Etapa H), (1,3 eq., 149 mg), seguido de N-metilmorfolina (4 eq., 0,21 ml, d 0,920). La mezcla de reacción se agitó durante la noche (temp. 0 a 25°C). Todos los productos volátiles se eliminaron en el evaporador giratorio y el residuo se disolvió en 80 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua (15 ml), con HCl acuoso, 1 M (15 ml), con solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado (15 ml) y salmuera (15 ml). La fase orgánica se secó sobre 20 sulfato de magnesio, se filtró y se concentró en el evaporador giratorio. El producto 1200-H se usó sin otra purificación.

Etapa 8:

(1-Ciclopropilaminooxalil-pentil)-amida de ácido 3-{2-[3-(1-dimetilsulfamoilmetil-ciclohexil)-ureido]-3,3-dimetil-butiril}-6,6-dimetil-3-aza-biciclo[3.1.0]hexano-2-carboxílico (1200). Una solución de hidroxiamida 1200-H 25 (0,485 mmol) en 5 ml de diclorometano se trató con peryodinano de Dess-Martin (1,3 eq., 267 mg). La mezcla se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se inactivó mediante la adición de solución de tiosulfato de sodio saturado acuoso (10 ml). Se agitó la mezcla durante 10 minutos, y posteriormente se añadió solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado (20 ml). La mezcla se agitó durante otros 10 minutos. Se extrajo la mezcla con diclorometano (3 x 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron en el 30 evaporador giratorio. El residuo se purificó en gel de sílice (columna Biotage 25-S; gradiente: 10 a 50% de acetona en hexanos) para obtener el producto 1200 (330 mg; 98%) en forma de un sólido de color blanco.

La Tabla 1 lista los compuestos de la invención y sus intervalos de actividad inhibitoria de la serina proteasa de HCV, según lo determinado por el ensayo que se describe más adelante. La actividad se muestra como intervalos Ki* (nanoMolar), que son:

(intervalo Ki*: A <75 nM, B = 75-250 nM; C >250 nM).

Tabla 1 5

Ejemplo de preparación

Compuesto Intervalo Ki*

1200

A

La presente invención se relaciona con nuevos inhibidores de la proteasa de HCV. Esta utilidad puede manifestarse en su capacidad para inhibir la serina proteasa NS2/NS4a de HCV. Un procedimiento general para dicha demostración se ilustra mediante el siguiente ensayo in vitro.

Ensayo para la determinación de la actividad inhibitoria de la proteasa de HCV. 10

Ensayo espectrofotométrico. El ensayo espectrofotométrico para la determinación de la serina proteasa de HCV puede efectuarse sobre los compuestos de la invención mediante el siguiente procedimiento descrito por R. Zhang et al, en Analytical Biochemistry, 270 (1999), 268-275, cuya divulgación se incorpora en la presente solicitud por referencia. El ensayo, que se sustenta en la proteólisis de sustratos de ésteres cromógenos, es adecuado para el control continuo de la actividad de la proteasa NS3 de HCV. Los sustratos derivan del lateral P de la secuencia de unión 15 NS5A-NS5B (Ac-DTEDVVX(Nva), en el que X = A o P), cuyos grupos carboxilo C-terminales son esterificados con uno de cuatro alcoholes cromóforos diferentes (3- ó 4-nitrofenol, 7-hidroxi-4-metil-cumarina o 4-fenilazofenol). A continuación, se ilustran la síntesis, la caracterización y la aplicación de estos nuevos sustratos de ésteres espectrofotométricos a la detección sistemática de alto rendimiento, y la evaluación cinética detallada de los inhibidores de la proteasa NS3 de HCV. 20

Materiales y procedimientos.

Materiales: Los reactivos químicos para los buffers relacionados con el ensayo se obtienen de Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Los reactivos para la síntesis de péptidos son de Aldrich Chemicals, Novabiochem (San Diego, California), Applied Biosystems (Foster City, California) y Perseptive Biosystems (Framingham, Massachusetts). Los péptidos se sintetizan en forma manual, o en un sintetizador automatizado ABI modelo 431A (de Applied 25 Biosystems). El espectrómetro UV/VIS modelo LAMBDA 12 es de Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut), y se obtienen placas de UV de 96 pocillos de Corning (Corning, New York). El bloque de precalentamiento puede ser de USA Scientific (Ocala, Florida), y el agitador vórtex de placa de 96 pocillos es de Labline Instruments (Melrose Park, Illinois). Se obtiene un lector de placa de microtitulación Sepctramax Plus con un monocrómetro, de Molecular Devices (Sunnyvale, California). 30

Preparación de enzima: La proteasa NS3/NS4A de HCV heterodimérica recombinada (cepa 1a) se prepara usando los procedimientos publicados previamente (D. L. Sali et al: Biochemistry, 37 (1998), 3392-3401). Las concentraciones de proteína se determinan mediante el procedimiento de tinción Biorad, usando estándares de proteasa de HCV recombinados previamente cuantificados por medio del análisis de aminoácidos. Antes de la iniciación del ensayo, el buffer de almacenamiento enzimático (fosfato de sodio, 50 mM, pH 8,0; NaCl, 300 mM, glicerol al 10%; 35 lauril maltósido al 0,05% y DTT, 10 mM) se intercambia con el buffer de ensayo (MOPS, 25 mM, pH 6,5; NaCl, 300 mM; glicerol al 10%; lauril maltósido al 0,05%; EDTA, 5 µM y DTT, 5 µM), empleando una columna previamente empaquetada Biorad Bio-Spin P-6

Síntesis de sustrato y purificación: La síntesis de los sustratos se realiza como se informa en R. Zhang et al (ibid), y se inicia mediante el anclaje de Fmoc-Nva-OH a una resina de cloruro de 2-clorotritilo, usando un protocolo 40 convencional (K. Barlos et al: Int. J. Pept. Protein Res., 37 (1991), 513-520). Los péptidos posteriormente se montan usando la reacción químicas de Fmoc, sea en forma manual, o en un sintetizador de péptidos automático ABI modelo 431. Los fragmentos peptídicos N-acetilados y completamente protegidos se escinden de la resina, ya sea por medio de ácido acético al 10% (HOAc) y trifluoretanol al 10% (TFE) en diclorometano (DCM) durante 30 minutos, o mediante ácido trifluoracético al 2% (TFA) en DCM durante 10 minutos. El filtrado y el lavado de DCM combinados se evaporan 45 en forma azeotrópica (o se extraen repetidamente con una solución acuosa de Na2CO3) a fin de eliminar el ácido

empleado en la escisión. La fase de DCM se seca sobre Na2SO4 y se evapora.

Los sustratos de éster se montan usando procedimientos convencionales de acoplamiento de ácido-alcohol (K. Holmber et al: Acta Chem. Scand., B33 (1979), 410-412). Se disuelven los fragmentos peptídicos en piridina anhidra (30-60 mg/ml), a lo cual se añaden equivalentes 10 molar de cromóforo y una cantidad catalítica (0,1 eq.) de ácido paratoluensulfónico (pTSA). Se añade diciclohexilcarbodiimida (DCC, 3 eq.) a fin de iniciar las reacciones de 5 acoplamiento. La formación de producto se controla por medio de HPLC, y puede hallarse finalizada después de una reacción de 12-72 horas a temperatura ambiente. El disolvente de piridina se evapora al vacío y se elimina adicionalmente mediante la evaporación azeotrópica con tolueno. El éster peptídico se desprotege con TFA al 95% en DCM durante dos horas, y se extrae tres veces con éter etílico anhidro a fin de eliminar el exceso de cromóforo. El sustrato desprotegido se purifica por medio de la HPLC de fase inversa en una columna C3 o C8 con un gradiente de 10 acetonitrilo al 30% a 60% (usando seis volúmenes de columna). El rendimiento total posteriormente de la purificación de HPLC puede ser de aproximadamente 20-30%. La masa molecular puede ser confirmada mediante la espectroscopia de masa de ionización por electroaspersión. Los sustratos se almacenan en forma de polvo seco con desecado.

Espectros de sustratos y productos: Los espectros de los sustratos y los correspondientes productos de cromóforos se obtienen en el buffer de ensayo de pH 6,5. Se determinan los coeficientes de extinción en la longitud de 15 onda del valle óptima en cubetas de 1 cm (340 nm para 3-Np y HMC; 370 nm para PAP y 400 nm para 4-Np), usando múltiples diluciones. La longitud de onda del valle óptima se define como aquella longitud de onda que logra la máxima diferencia fraccional en la absorbancia entre sustrato y producto (OD producto OD-OD-sustrato)/OD sustrato).

Ensayo de proteasa: Los ensayos de proteasa de HCV se efectúan a 30ºC usando una mezcla de reacción de 200 µl en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las condiciones del buffer de ensayo (MOPS, 25 mM, pH 6,5; 20 NaCl, 300 mM; glicerol al 10%; lauril maltósido al 0,05%; EDTA, 5 µM; y DTT, 5 µM) se optimizan para el heterodímero NS3/NS4A (D. L. Sali et al, ibid). Típicamente, se colocan mezclas de 150 µl de buffer, sustrato e inhibidor en pocillos (concentración final de DMSO de < 4% v/v), y se dejan preincubar a 30ºC durante aproximadamente 3 minutos. Posteriormente se emplean 50 µl de proteasa precalentada (12 nM, 30ºC) en buffer de ensayo, a fin de iniciar la reacción (volumen final: 200 µl). Las placas se controlan durante el tiempo del ensayo (60 minutos) para detectar 25 cambios de absorbancia en la longitud de onda apropiada (340 nm para 3-Np y HMC; 370 nm, para PAP; y 400 nm, para 4-Np), usando un lector de placa de microtitulación Spectromax Plus, equipado con un monocrómetro (pueden obtenerse resultados aceptables con lectores de placa que utilizan filtros de corte). Se controla la escisión proteolítica de la unión de éster entre el Nva y el cromóforo, a la longitud de onda apropiada, contra un control sin enzima como control para la hidrólisis no enzimática. La evaluación de los parámetros de cinética del sustrato se realiza en un intervalo de 30 concentración de sustrato de 30 veces (6-200 µM). Se determinan las velocidades iniciales usando regresión lineal, y se obtienen constantes de cinética por el ajuste de los datos a la ecuación de Michaelis-Menten, usando el análisis de regresión no lineal (Mac Curve Fit 1.1, K. Raner). Se calculan los números de recambio (kcat), asumiendo que la enzima es completamente activa.

Evaluación de inhibidores e inactivadores: Las constantes de inhibición (Ki) para los inhibidores competitivos 35 Ac-D-(D-Gla)-L-I-(Cha)-C-OH (27), Ac-DTEDVVA(Nva)-OH y Ac-DTEDVVP(Nva)-OH se determinan experimentalmente en concentraciones fijas de enzima y sustrato, por el gráfico de vo/vi versus la concentración de inhibidor ([I] o) de acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten reordenada para la cinética de inhibición competitiva: vo/vi = 1 + [I] o /(Ki (1 + [S] o /Km)), en la que vo es la velocidad inicial no inhibida, vi es la velocidad inicial en presencia de inhibidor en cualquier concentración de inhibidor determinada ([I]o), y [S]o es la concentración de sustrato empleada. Los datos 40 resultantes se ajustan usando la regresión lineal, y la pendiente resultante, 1/(Ki(1+ [S] o/Km) se usa para calcular el valor Ki. Las actividades de varios compuestos de la presente invención se muestran en general en la Tabla 1. La siguiente Tabla 2 enumera los valores Ki* (en microMolar) para algunos compuestos específicos de la invención.

Tabla 2

Ejemplo de Preparación

Ki* (M)

1200

0,012

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto, o un enantiómero, estereoisómero, rotámero, tautómero, o racemato de dicho compuesto, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho enantiómero, estereoisómero, rotámero, tautómero, o racemato, dicho compuesto que tiene la estructura:
2. 2. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo cantidades terapéuticamente 5 efectivas de al menos un compuesto de la reivindicación 1 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
3. 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de trastornos asociados con el virus de la hepatitis C (HCV").
4. 4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, que adicionalmente contiene al menos un agente antiviral. 10
5. 5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, que contiene adicionalmente al menos un interferón.
6. 6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicho al menos un agente antiviral es ribavirina y dicho al menos un interferón es -interferón o interferón pegilado.
7. 7. Uso de una composición farmacéutica que comprende cantidades terapéuticamente efectivas de al menos un compuesto de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar trastornos asociados con el HCV. 15
8. 8. El uso de la reivindicación 7, en el que dicha composición es para uso oral o subcutáneo.
9. 9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como un medicamento.
10. 10. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos asociados con el virus de la hepatitis C.
11. 11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de trastornos asociados con 20 el virus de la hepatitis C.
12. 12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, dicho medicamento comprende adicionalmente al menos un agente antiviral
13. 13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, dicho medicamento contiene adicionalmente al menos un interferón. 25
14. 14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 en el que dicho al menos un agente antiviral es ribavirina y dicho al menos un interferón es -interferón o interferón pegilado.