ES2342922T3 - Procedimiento de manipulacion de muestras de un citometro de flujo. - Google Patents

Abstract

Una disposición de boquilla mejorada para un citómetro de flujo para la orientación altamente eficiente y proceso de clasificación en una muestra plana e ítem dedicados tales como células de esperma de equinos o de bovinos. La disposición de boquilla mejorada comprende una boquilla con una geometría de superficie interior novedosa que puede acelerar gentimente las células e incluso incluir un elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptica puede tener una superficie de flujo laminar y puede producir el paso de flujo más simple para aplicar fuerzas mímimas las cuales actúan en naturaleza de acelaración o fuerzas hidrodinámicas de orientación, es decir, de torsión.

Description

Procedimiento de manipulación de muestras de un citómetro de flujo.

I. Campo técnico

La presente invención versa acerca de un procedimiento que utiliza una boquilla mejorada para un procesamiento de muestras de un citómetro de flujo. Específicamente, la presente invención versa acerca de un diseño novedoso de una geometría de una superficie interior de una boquilla que manipula con cuidado y orienta una muestra en una dirección radial apropiada para un análisis y una clasificación eficaz. La presente invención también se centra en un procedimiento para clasificar células delicadas, especialmente espermatozoides vivos.

II. Antecedentes

Los citómetros de flujo han tenido un uso clínico y de investigación durante muchos años y sus aplicaciones en la industria animal, tal como en la industria de cría de animales han aumentado rápidamente. Un citómetro de flujo disponible comercialmente utiliza normalmente una geometría cilíndrica de fluido en su boquilla. Este tipo de sistema de citómetro de flujo tiene un recorrido de flujo que se centra con una simetría de revolución, como se describe en algunas patentes US (n^{os} de patente 5.602.039, 5.483.469, 4.660.971, 4.988.619 y 5.466.572). Este tipo de diseño, según la ley de similitud, no produce muestras orientadas de forma radial. En los campos clínico, de cría de animales, y de investigación biológica, cuando se clasifican células tales como espermatozoides, pueden ser tincionadas previamente con un tinte que produce fluorescencia cuando se expone a una fuente de luz de excitación. Como se explicó en la patente US nº 5.135.759 de Lawrence Johnson, se puede utilizar un citómetro de flujo que detecta la fluorescencia emitida perpendicular al eje de flujo con gran precisión en la medición y en la discriminación del contenido de ADN de las células. Sin embargo, como otros han señalado, incluso esta precisión en la medición del contenido de ADN solo puede conseguirse de forma más eficaz cuando las células de interés son esféricas o cilíndricas (Dean et al., 1978, Biophys. J. 23: 1-5). En cuanto a los espermatozoides -que tienen cabezas planas- la intensidad observada de fluorescencia depende en gran parte de la orientación apropiada de las cabezas con respecto al detector. Los espermatozoides emiten una señal fluorescente más fuerte desde el borde que la superficie plana. Por lo tanto, la intensidad de la señal fluorescente depende de la orientación de la cabeza del espermatozoide según pasa por el detector. Debido a que el contenido de ADN se determina por medio de fluorescencia y debido a que la intensidad fluorescente se ve afectada por la orientación, la determinación del contenido de ADN puede complicarse por la falta de orientación en una boquilla. Por esta razón, sin una orientación radial, la distribución de intensidad de fluorescencia resultante obtenida para cabezas normales de espermatozoide orientadas de forma aleatoria refleja tanto el contenido de ADN como la orientación de las cabezas. Debido a que las células emiten una señal de fluorescencia más brillante desde el borde de la cabeza (Gledhill et al., 1976, J. Cell Physiol. 87: 367-376; Pinkel et al, 1982, Cytometry 7: 268-273) la precisión de la determinación del contenido de ADN (que puede diferir en tan solo el 3,5%) se ve muy afectada por la orientación de las células. Por esta razón, el citómetro convencional de flujo ha sufrido limitaciones, especialmente cuando se clasifican espermatozoides aplanados u otras células no esféricas o no cilíndricas y similares.

Además, ciertas células pueden exhibir una funcionalidad reducida como resultado del procedimiento de clasificación. Esto puede ser particularmente cierto para células tales como espermatozoides de mamíferos que no son solo delicados mecánicamente, sino que también se vuelven funcionalmente incapacitados (como quizás se puede ver por de una fertilidad reducida) o incluso heridos mortalmente como resultado de alguna incidencia en el proceso de clasificación. Ha habido limitaciones significativas en las tentativas de citometría de flujo con células delicadas acerca de las capacidades. Esto es más grave en el campo altamente especializado de clasificación de espermatozoides no solo porque las propias células son excepcionalmente delicadas, sino también porque existe la necesidad de tasas extremadamente elevadas de clasificación por razones fisiológicas y prácticas. Ha sucedido que estas dos necesidades contrapuestas suponen retos sumamente críticos en el campo excepcional de clasificación de esperma con fines comerciales de cría. Por lo tanto, aunque estos dos aspectos -una manipulación y una orientación con cuidado- son quizás aplicables de forma independiente en una variedad de casos, en muchos casos pueden actuar de forma sinérgica. Tanto sus caracteres como sus interrelaciones sinérgicos son quizás más críticas en el campo comercial de clasificación de esperma. De modo interesante, parece que esta sinergia e interrelación potencial no han sido apreciadas completamente antes de la presente invención.

Vistos por separado, el aspecto de una orientación apropiada de una muestra que contiene partículas o células puede ser vista por lo tanto que desempeña un papel importante en la intensidad y en la calidad de la señal del citómetro de flujo y en la eficacia de clasificación. Se han realizado esfuerzos para orientar la muestra de forma hidrodinámica y se ha explorado en las últimas décadas el uso de la orientación hidrodinámica de la muestra en flujo a través de sistemas y citómetros de flujo (Fulwyler, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 781-783; Karbel et al., 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 774-780; Dean et al., supra). La orientación hidrodinámica de la muestra dentro del citómetro de flujo puede mejorar la medición precisa del contenido relativo de tinción del ADN y también puede proporcionar una medición potencialmente útil de parámetros morfológicos tal como grosor de las células y grado de curvatura de la cara plana. Para algunas aplicaciones, esta orientación es sencilla. No obstante, cuando hay implicadas células delicadas (tal como espermatozoides) u otras partículas, ha sido necesaria, sin embargo, una técnica más cuidadosa. Por ejemplo, incluso se ha utilizado un tubo de inyección de muestras con una punta con forma de cuña en algunos intentos por aumentar el porcentaje de las células orientadas (Dean et al., 1978, Biophys. J. 23: 1-5; Fulwyler, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 781-783; Johnson et al., 1986, Cytometry 7: 268-273; Pinkel et al., 1982, Cytometry 3: 1-9; Welch et al., 1994, Cytometry 17 (supl. 7): 74). Debido a esta punta con forma de cuña del tubo de inyección de muestras, la corriente de muestras tendía a ser aspirada en una banda delgada por el fluido envolvente a diferencia de lo que ocurre en una corriente cilíndrica. Las células con cabezas planas tal como espermatozoides de mamíferos, encontraron a menudo el fluido envolvente a una mayor velocidad (100 mm/seg), y fueron giradas de forma que sus lados planos se encontraban en el plano de la banda. Por desgracia, la separación del evento de orientación y el evento de análisis final pueden provocar resultados que no llegan a ser óptimos. Por lo tanto, esta técnica no ha mostrado ser prácticamente tan ventajosa como se desea.

En una aplicación distinta, Kachel y sus colegas (Kachel et al., supra) demostraron la ley de similitud y expusieron tres tipos de recorridos de flujo que influyen en las partículas en movimiento. Concluyeron que, para conseguir una orientación radial uniforme con fuerzas hidrodinámicas para partículas planas tales como hematíes aplanados, el recorrido preferente de flujo sería aquel en mediante el cual se obtuviese una constricción unilateral. El recorrido de flujo más sencillo que exhibe una mayor constricción unilateral en uso con un sistema de flujo a través del mismo se haría de un tubo con un corte transversal elipsoidal, y también terminaría en una salida elipsoidal. En una disposición, el eje largo de esta salida elipsoidal estaría ubicado con un ángulo recto al eje largo en el corte transversal del tubo elíptico de constricción. Sin embargo, dado que la salida elíptica no produce el tipo de gotitas deseado para un citómetro de flujo de alta velocidad clasificador de células, no se prevé que esta disposición sea utilizada en un citómetro de flujo, y por lo visto no ha sido aplicada a uno.

En un intento similar, Rens y sus colegas diseñaron una punta de boquilla que tenía un interior elíptico y un orificio elíptico de salida (Rens et al., 1998, Publicación PCT nº PCT/US98/15403; Rens et al., 1998, Cytometry 33: 476-481; Rens et al., 1999, Mol. Reprod. Dev. 52: 50-56). Este interior contenía una primera zona elipsoidal y una segunda zona elipsoidal que estaban separadas por una zona de transición. Todas las zonas tenían cada una un eje largo y un eje corto. El eje largo de la segunda zona elipsoidal estaba orientado 90º al de la primera zona elipsoidal. Había un orificio cilíndrico, taladrado a través de una piedra preciosa, ubicado en el extremo del orificio elipsoidal de salida y sirve como la salida final. Este dispositivo solucionó parcialmente el problema de la orientación aleatoria como la que existía en un citómetro convencional de flujo y podía orientar aproximadamente el 60% del total de los espermatozoides aplanados de un cerdo cada vez a través del citómetro de flujo. No obstante, cuando se toman en consideración las fuerzas hidrodinámicas en un recorrido de flujo, las partículas planas que pasan a través de la boquilla diseñada por Rens y sus colegas han recibido tensiones innecesarias. Para células delicadas, y especialmente para los espermatozoides quizás más delicados tales como los espermatozoides equinos o bovinos, este enfoque, simplemente, no parece que produzca la eficacia deseada ni en la orientación ni en la viabilidad celular.

El documento EP 0 288 029 versa acerca de un dispositivo de flujo de células de tipo flujo envolvente adecuado para su uso en un análisis celular de cuerpos vivos.

Johnson et al., 1999, Theriogenology 52, 1323-1341, hace referencia a un procedimiento citométrico de flujo de alta velocidad de clasificación de espermatozoides X e Y y acerca de cómo se puede maximizar la eficacia de dicho procedimiento.

Por lo tanto, existía una necesidad percibida desde hace tiempo, pero no satisfecha, de la invención, aunque las técnicas y los elementos de aplicación necesarios habían estado disponibles desde hace mucho. Esta necesidad tenía que ver con la capacidad para manipular con cuidado y quizás orientar las partículas o las células que van a ser analizadas, la capacidad para analizar de forma apropiada y clasificar de forma eficaz, y la capacidad para minimizar la situación potencialmente estresante que el citómetro de flujo provoca para las partículas o células. Además, aunque existían problemas en los citómetros de flujo, una comprensión completa de que existía un problema y qué problema resultaba invisible hasta entonces para los expertos en la técnica. Se habían llevado a cabo intentos sustanciales por los expertos en la técnica para cubrir la necesidad o para afrontar las dificultades pero no habían tenido un éxito completo, probablemente debido a un fracaso para comprender cuáles eran exactamente los problemas y quizás cómo se interrelacionaban. Algunos esfuerzos realizados por los expertos en la técnica incluso se desarrollaron en patentes que parecía que habían mencionado los problemas pero, de hecho, tendían en algunos aspectos a enseñar algo que se aleja de la dirección técnica en la que se dirigieron los presentes inventores.

III. Revelación de la invención

Por lo tanto, es un objetivo presentar un procedimiento utilizando una geometría mejorada de la superficie interior de una boquilla que produce el recorrido más sencillo de flujo para aplicar fuerzas hidrodinámicas necesarias para acelerar y quizás orientar una muestra en una dirección apropiada con fines de análisis y de clasificación eficaz. Esta geometría mejorada de la superficie interior de una boquilla puede comprender una o ambas de: una característica de fuerza de aceleración configurada de forma apropiada y/o un elemento de torsión única de la superficie inferior con forma elíptica dentro de una boquilla de orientación de torsión única que produce las fuerzas hidrodinámicas especiales, es decir, las fuerzas de orientación de torsión única.

Como muestra ahora la presente invención, los problemas de una tensión no deseable de las células podían ser vistos, al menos en parte, debidos bien a fuerzas no apropiadas de manipulación, específicamente: fuerzas no apropiadas de aceleración, o bien a la existencia de una segunda fuerza de torsión creada por la segunda zona elipsoidal. En cuanto a las fuerzas aplicadas de aceleración, los dispositivos utilizaron a menudo transiciones bruscas internas en la boquilla y provocaron de esta manera una aceleración extrema durante distancias cortas. En cuanto al aspecto de la orientación, por ejemplo, enfoques tales como el de Ren (mencionado anteriormente) mostraron, que después de que se orientaron las células por medio de una primera fuerza de torsión creada por una primera zona elipsoidal, se aplicó una tensión adicional -quizás duplicándola-. Específicamente, las partículas planas ya se encontraban en una posición orientada después de que fueron orientadas desde una posición aleatoria por la primera zona elipsoidal. Estaban listas para salir en posiciones orientadas. Sin embargo, en este momento, los dispositivos de Rens y otros retorcían sin necesidad estas partículas planas orientadas una segunda vez por medio de las fuerzas hidrodinámicas creadas por una segunda zona elipsoidal. Como muestra la presente invención, estos diseños no son del todo eficaces en un citómetro de flujo de alta velocidad. Cuando se orientan los espermatozoides planos con colas a través de este tipo de boquilla, aparte de su ineficacia, la geometría en este tipo de boquilla aparentemente impacta dos veces en las fuerzas de torsión. Esto parece que fatiga muchísimo, sin necesidad, o daña los espermatozoides de cola larga antes de que salen de la boquilla. Además, en algunos diseños en los que el orificio está fabricado en una piedra preciosa que está separada del interior principal, también puede verse afectado en algún grado un flujo laminar homogéneo. Esto podría provocar una aceleración casi instantánea y, por lo tanto, podría fatigar sin necesidad a las células y podría afectar a la orientación de los espermatozoides ya orientados. Por lo tanto, los enfoques de Rens y otras tentativas más recientes realmente enseñan algo que se aleja de la superficie interior laminar homogénea más eficaz, menos aceleratriz y menos torsional de la presente invención.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para mejorar la orientación y la eficacia de clasificación de la muestra, especialmente los espermatozoides en la citometría de flujo para un uso en la investigación y clínico y en la industria de la inseminación animal.

IV. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista en corte transversal de una porción de un citómetro de flujo que muestra un recipiente de fluido envolvente, un tubo de inyección de muestras y una boquilla de la presente invención. Esta figura también muestra una ubicación relativa del tubo de muestras dentro de la boquilla.

La Figura 2 es una vista tridimensional de una punta de la boquilla y su posición relativa con el recipiente de fluido envolvente (el cuerpo de la boquilla aquí) con un tubo de inyección de muestras y una punta de boquilla. La Figura 2A es un dibujo esquemático del tubo de inyección de muestras que tiene una punta biselada y una boca circular.

Las Figuras 3A, 3B y 3C son dibujos esquemáticos de una de las presentes realizaciones de la boquilla. La Figura 3A es una vista tridimensional de la punta de la boquilla que muestra la primera zona de elipticidad creciente, la ubicación de demarcación de elipse deseada, la zona de elipticidad decreciente, la zona cónica, la zona cilíndrica, y el orificio circular de salida. La Figura 3B es una vista esquemática en corte transversal que muestra la superficie interior ahusada de la boquilla en un diseño unitario. La Figura 3C es una vista en corte transversal de la zona cilíndrica y del orificio circular de salida.

La Figura 4A es una vista desde abajo de la región de la punta de la boquilla que muestra específicamente el orificio circular de salida. La Figura 4B es una vista desde arriba del diseño interior de la boquilla que muestra la boca circular más grande, la ubicación de demarcación de elipse deseada, la boca circular más grande de la zona cónica y la boca circular más pequeña de la zona cilíndrica. El diámetro de la boca más pequeña es también el del orificio circular de salida.

La Figura 5 muestra cómo funciona la boquilla de orientación de torsión única para orientar partículas planas.

La Figura 6 es un diagrama esquemático de un ejemplo de una boquilla que tiene superficies de movimiento axial como pueden haber existido en la técnica anterior.

Las Figuras 7a, 7b y 7c son gráficos de la velocidad, la aceleración y la tasa de cambio de movimientos de aceleración axiales teóricas con respecto a la ubicación como las que pueden existir para una boquilla, tal como la mostrada de forma esquemática en la Figura 6.

La Figura 8 es un diagrama esquemático de un ejemplo de una boquilla que tiene superficies de movimiento axial según una realización de la presente invención.

Las Figuras 9a, 9b y 9c son gráficos de la velocidad, aceleración y tasa de cambio de movimientos de aceleración axiales teóricas con respecto a la ubicación como las que pueden existir para una boquilla, tal como la mostrada de forma esquemática en la Figura 8.

V. Modos para llevar a cabo la invención

Se podría conseguir el objetivo de la presente invención por medio del procedimiento según la reivindicación 1.

Como puede verse en las ilustraciones y en consonancia con el objetivo de la presente invención, se pueden implementar los conceptos básicos de la presente invención de distintas formas. Con referencia a la Figura 1, muestra una porción de un sistema de citómetro de flujo en el que se procesa una muestra en gotitas individuales antes de ser analizadas y clasificadas. Como comprenderán bien las personas con un nivel normal de dominio de la técnica, desde la vista esquemática en corte transversal, un recipiente (1) de fluido envolvente puede contener algo de fluido envolvente (2) importado a través de la vía (no mostrada) de acceso de fluido envolvente. Un sistema de inyección de muestras comprende un tubo (3) de inyección de muestras conectado a un depósito de muestras. En general, el sistema de inyección de muestras actúa para proporcionar un flujo apropiado de parte del material de la muestra a un sistema de boquilla. Al mismo tiempo, el recipiente de fluido envolvente introduce un fluido envolvente dentro del sistema de boquilla. La muestra puede estar rodeada por el fluido envolvente para formar un fluido que contiene una muestra y puede luego salir del sistema de boquilla a través de un mecanismo de formación de gotas a través del cual el fluido que contiene una muestra forma gotitas pequeñas. Estas gotitas pequeñas pueden pasar a través de un área de caída libre a una velocidad elevada de más de 20 metros por segundo por medio de la combinación de la oscilación por medio de un oscilador y una presión elevada del sistema de citómetro de flujo. Subsiguientemente, se pueden analizar estas gotitas pequeñas, es decir, las gotas que contienen la muestra, por medio de un sistema analítico (no mostrado) en el área de caída libre. Si se introducen células vivas tales como espermatozoides planos como el material de la muestra, pueden ser tincionadas con uno o más tintes fluorescentes. Estos espermatozoides pueden ser transportados en una única hilera en la corriente de fluido envolvente por el sistema analítico (no mostrado). El sistema analítico puede incluir un láser enfocado cuya longitud de onda se ajusta para excitar un tinte fluorescente que puede haber presente. Entonces, se puede detectar la señal de fluorescencia recogida de cada célula por medio de un sistema (no mostrado) de detección. Entonces, este procedimiento puede incluir un procedimiento de clasificación por medio de un dispositivo de clasificación o similar, dependiendo de la propiedad física individual tal como el contenido de ADN de cada célula introducida, mediante la aplicación diferencial de carga a las diversas gotitas como comprenderán los expertos en la técnica. Subsiguientemente, se clasifica cada célula dependiendo de su carga. Como se ha mencionado anteriormente, estos aspectos generales de la citometría de flujo son bien conocidos y están expuestos en las referencias mencionadas anteriormente (incorporadas en el presente documento por referencia).

En relación con la manipulación de la muestra para las funciones del citómetro de flujo y la viabilidad de la muestra, dos aspectos pueden ser importantes: la alineación torsional y el movimiento axial de la muestra. Se expone cada uno de estos por separado, sin embargo, se debería comprender que no son mutuamente exclusivos y pueden tener efectos de forma sinérgica. Esto es especialmente cierto en relación con la viabilidad de la muestra, es decir, la capacidad de la muestra para llevar a cabo sus funciones con eficacias esperadas y que no se vea sustancialmente afectada por el procesamiento de la citometría de flujo. Se expone en primer lugar el primero de estos dos aspectos, la alineación torsional.

Los aspectos ilustrados en la Figura 1 también pueden verse en la vista tridimensional mostrada en la Figura 2. Esta vista tridimensional muestra una porción del recipiente (1) de flujo envolvente, el tubo (3) de inyección de muestras y el sistema de boquilla que tiene una boquilla (6). El tubo (3) de inyección de muestras, como se muestra en la Figura 2A en detalle, tiene una punta biselada (4) y una boca circular (5). La boquilla (6) especialmente diseñada se denomina una boquilla de orientación de torsión única en la presente invención y será presentada en detalle a continuación.

Como se conoce, el tubo de inyección de muestras sirve para introducir el material de muestra en un flujo delgado dentro del sistema de boquilla en el que la muestra está rodeada por el fluido envolvente. Como es bien conocido por las personas con un nivel normal de dominio de la técnica, el tubo convencional de inyección de muestras tiene a menudo una forma cilíndrica. Sin embargo, dado que este tipo de tubo de inyección de muestras puede no ayudar a controlar la orientación de la muestra, la muestra que sale de este tipo de tubo de inyección de muestras tiene normalmente un estado no orientado. En las últimas dos décadas, se produjo un tubo modificado de inyección de muestras (Dean et al., 1978, supra; Fulwyler, 1977, supra; Johnson et al., 1986, Cytometry 7: 268-273; Pinkel et al., 1982, supra). Este tubo modificado de inyección de muestras puede tener una punta biselada y puede ayudar, hasta cierto punto, en la orientación del material de muestra que sale de su punta. Debido a la forma biselada en la punta del tubo de inyección de muestras, se puede aspirar la corriente de muestra en una banda delgada por medio del fluido envolvente. El cambio resultante en la condición del flujo puede provocar una orientación correspondiente del material
de muestra.

En el presente diseño, basado en el concepto del mecanismo de la punta biselada, se mantiene el tubo de inyección de muestras con el tipo de punta biselada pero el tamaño interior específico es único. Lo más importante es que está especialmente fijada la ubicación de la punta biselada dentro de la boquilla. Como se muestra en la Figura 2A, el tubo (3) de inyección de muestras, denominado en el presente documento un tubo de inyección de muestras de mejora de la orientación, comprende una punta biselada (4) y una boca circular (5) en su corte transversal. La punta biselada es más o menos una forma rectangular en su corte transversal. Esta tiene un eje largo y un eje corto. Aunque naturalmente esto puede variar para adecuarse a la aplicación o a las partículas que estén siendo clasificadas, en una realización preferente el ángulo de la punta biselada es de aproximadamente 4º, el diámetro externo del tubo es de aproximadamente 1,5 mm y el diámetro de la boca circular es de aproximadamente 0,25 mm.

Hasta ahora, solo se ha expuesto el papel que desempeña un tubo de inyección de muestras en la orientación de la muestra. Sin embargo, se puede comprender que como comprenderán los expertos en la técnica, las fuerzas de orientación proporcionadas de esta forma están muy limitadas. Por ejemplo, si esta característica por sí sola hubiese solucionado los problemas de orientación, las tentativas a partir de entonces para una orientación de un porcentaje elevado no hubiesen sido necesarias. En cambio, como comprenderán los expertos en la técnica, para obtener una muestra muy orientada, especialmente cuando la muestra contiene células planas, no esféricas o delicadas tales como espermatozoides para un fin de inseminación o similar, es necesario un enfoque adicional. Como muestra la presente invención, la mayoría de las fuerzas de orientación deberían provenir de la superficie interior de la boquilla. Por lo tanto, la boquilla sirve como un elemento fundamental para la producción de fuerzas de orientación funcionales y debidamente potentes y, pese a ello, delicadas.

Con esta comprensión, se puede ver ahora cómo difiere el presente diseño con respecto a la técnica anterior. Como puede verse de forma óptima en las Figuras 1 y 2, y como se destaca en particular en las Figuras 3A, 3B y 3C, el sistema de citómetro de flujo comprende la boquilla (6) de orientación de torsión única diseñada de forma única. La boquilla (6) de orientación de torsión única puede estar fabricada de algunos materiales selectos tal como un material cerámico y similares. Aunque puede variar el tamaño de la boquilla, por ejemplo, la altura y el diámetro, etc., preferentemente debe caber dentro de un citómetro convencional de flujo y al mismo tiempo proporcionar las fuerzas deseadas de orientación como se ha descrito en la presente invención. Además, aunque en una realización preferente la boquilla está fabricada de una única pieza, en aras de una mejor ilustración, puede estar dividida en dos porciones, es decir, una porción cilíndrica superior (a) y una porción cónica inferior (b). En una de las realizaciones preferentes, la altura de la porción cilíndrica superior (a) puede ser de aproximadamente 8 mm y el diámetro externo puede ser de aproximadamente 6 mm. La altura de la porción cónica (b) puede ser de aproximadamente 4,5 mm y el diámetro externo en el orificio puede ser inferior a aproximadamente 1 mm. Por lo tanto, la altura total de la boquilla puede ser de aproximadamente 12,5. El uso de una boquilla unitaria también ayuda a fijar todos los factores de orientación y de movimiento axial en una disposición óptima. Por lo tanto, también puede aumentar la facilidad de uso, la repetibilidad, y otras cuestiones prácticas.

La Figura 3A es una vista tridimensional y las Figuras 3B y 3C son vistas esquemáticas en corte transversal de una boquilla de orientación de torsión única de la presente invención. Como mejor se ilustra en las Figuras 3A y 3B, la boquilla (6) de orientación de torsión única comprende un volumen de boquilla rodeado por un elemento de superficie interior. El elemento de superficie interior de la boquilla de orientación de torsión única constituye su geometría interior. El elemento de superficie interior comprende un elemento de torsión única de superficie interior que tiene una superficie interior de torsión única. Este elemento de superficie interior de torsión única tiene la capacidad para generar fuerzas hidrodinámicas de torsión única que tienen un eje hidrodinámico cuando un flujo que contiene la muestra pasa a través del mismo. El elemento de superficie interior de torsión única también tiene una característica de aceleración de la velocidad que puede producir una velocidad acelerante sobre la muestra. Cuando la muestra pasa a través de este elemento de torsión única de superficie interior, se orienta la muestra por medio de las fuerzas hidrodinámicas de torsión única y se alinea de forma radial con respecto al eje hidrodinámico. También se puede acelerar para que salga para el análisis y el procedimiento de clasificación subsiguientes. Estas fuerzas hidrodinámicas de torsión única pueden ser denominadas como fuerzas de orientación de torsión única.

La forma global de la superficie interior de torsión única está ahusada gradualmente corriente abajo, de forma que puede denominarse un elemento de superficie interior de torsión única ahusada gradualmente. Desde la vista de sección longitudinal como se muestra en la Fig. 3B, este elemento de superficie interior de torsión única ahusada gradualmente puede ser visto en dos dimensiones con una forma "similar a un abanico" que se abre de abajo arriba. El grado de ahusamiento del elemento de superficie interior de torsión única ahusada gradualmente puede variar pero preferentemente puede ser de aproximadamente 23º desde la parte inferior de la forma "similar a un abanico" hasta la parte superior, de forma que se puede generar la fuerza deseada de aceleración para actuar sobre la muestra. Además, el elemento de superficie interior de torsión única ahusada gradualmente puede estar dividido en algunas zonas en base a su geometría interior y cada zona puede tener una superficie de flujo laminar. Básicamente, el elemento de superficie interior de torsión única ahusada gradualmente está fabricado de una zona interior ahusada (c) similar a una elipse, una superficie interior de torsión única y una zona interior cilíndrica (d) en la vista tridimensional. Esta superficie interior de torsión única similar a una elipse puede incluir distintas formas en sus cortes transversales. Por ejemplo, además de tener forma de elipse, puede tener forma oval, o incluso casi una forma rectangular. Cualquiera de las formas puede darse en cualquier ubicación a lo largo de la superficie interior de torsión única similar a una elipse justo encima y debajo de una ubicación de demarcación en la que su elipticidad, ovalidad o incluso rectangularidad alcanza un grado máximo o deseado. Como se debería comprender, se pretende que cada una de estas formas esté abarcada por la expresión "similar a una elipse" aunque no hay presente una elipse matemática verdadera en un corte transversal dado.

Por supuesto, la zona interior ahusada similar a una elipse puede tener un eje mayor y un eje menor en sus cortes transversales y la elipticidad puede estar controlada de forma homogénea. Por lo tanto, dependiendo de su variación de elipticidad, esta zona interior ahusada similar a una elipse puede estar dividida en las siguientes zonas corriente abajo desde la parte superior hasta la parte inferior:

1)

una zona (8) de elipticidad creciente con una boca circular (7) en la parte superior en la que aumenta la relación del eje mayor con respecto al eje menor en los cortes transversales;

2)

una ubicación deseada (9) de demarcación de elipse corriente abajo de la zona (8) de elipticidad creciente en la que la relación del eje mayor con respecto al eje menor alcanza una relación óptima que puede ser una relación máxima para una muestra, como mejor se ilustra en la Figura 3A; y

3)

una zona (10) de elipticidad decreciente en la que la relación del eje mayor con respecto al eje menor en las secciones transversales decrece.

\vskip1.000000\baselineskip

En base a la geometría descrita anteriormente, las formas bidimensionales de la vista de corte transversal de arriba abajo de la zona interior ahusada similar a una elipse pueden experimentar cambios de transición desde un círculo en la región de la boca, a formas similares a una elipse (que pueden incluso ser elipses reales) con una elipticidad creciente gradualmente (que es la relación entre los ejes mayor y menor -con independencia de la forma implicada), a la elipse deseada o similar, a formas similares a una elipse con una elipticidad decreciente gradualmente, y finalmente a un círculo de nuevo en la región en la que la zona interior ahusada similar a una elipse se une a la zona cilíndrica. Dado que toda la zona interior similar a una elipse está ahusada, las áreas de corte transversal de toda la zona interior similar a una elipse se volverán gradualmente más pequeñas desde la parte superior a la parte inferior. Por lo tanto, se puede ajustar la elipticidad al cambiar la relación entre los ejes mayor y menor. La relación entre los ejes mayor y menor puede cambiar gradualmente desde la parte superior de 1 a más de 1, o quizás incluso una relación óptima para la muestra. La relación óptima puede ser una relación máxima. Subsiguientemente, la relación puede cambiar de nuevo gradualmente desde la relación máxima a una relación menor que la máxima y luego a 1. Como seguramente sabrán los expertos en la técnica, cuando la relación se vuelve 1 la forma en corte transversal puede ser un círculo. La relación máxima como se ha hecho referencia anteriormente puede variar hasta cierto grado. En una realización preferente, la longitud del eje mayor puede ser de 2,2 mm y la del eje menor puede ser de 1,0 mm. Por lo tanto, la relación máxima está diseñada para que sea de aproximadamente 2,2 para esta realización preferente. Naturalmente, puede variar en base a la aplicación o similar.

En una realización, la ubicación deseada (9) de demarcación de elipse corriente abajo de la zona (8) de elipticidad creciente dentro de la boquilla puede ser el lugar en el que está ubicada la punta biselada del tubo de inyección de muestras. Este también puede ser el lugar en el que la muestra en la banda de flujo recibe las fuerzas deseadas de orientación que son completamente funcionales, en el que la muestra está sometida mínimamente a un par por medio de las fuerzas deseadas de orientación o las fuerzas de par, cuando el tiempo requerido para que la célula salga es mínimo, o cuando, después de que sale la muestra del orificio de la boquilla, puede seguir manteniendo bien su estado orientado, de forma que el análisis y la clasificación subsiguientes pueden llevarse a cabo de forma eficaz. Esta ubicación puede denominarse como un punto de inyección. Para el citómetro de flujo de alta velocidad de clasificación del estado actual de la técnica operado ahora, esta ubicación o el punto de inyección, en base a los descubrimientos de la presente invención, puede ser de aproximadamente 6 mm desde el orificio de salida. Por lo tanto, si una distancia de mantenimiento de la orientación está definida como la distancia que indica lo lejos que una partícula de muestra puede mantener su estado orientado desde el punto en el que está orientada hasta un punto en el que pierde estadísticamente su grado de estado orientado, la distancia desde la punta biselada del tubo de inyección de muestras hasta el orificio de salida de la boquilla y la distancia desde el orificio de salida hasta la intersección con el haz láser o el sensor a lo largo del recorrido de flujo en la zona de caída cae perfectamente dentro de esta distancia de mantenimiento de la orientación. Por ejemplo, puede haber menos de 10 mm desde la punta biselada hasta la intersección con el haz láser, como describieron Dean y sus colegas (Dean et al., supra). Por lo tanto, cualquier partícula de muestra que esté orientada, sin importar en qué punto dentro de la distancia desde la punta biselada hasta la intersección con el haz láser o el sensor, mantendrá su estado orientado antes de que sea analizada. En teoría, esta distancia de mantenimiento de la orientación podría incluso ser mayor de 10 mm cuando hay un citómetro de flujo equipado con la boquilla diseñada especialmente de la presente invención y el tubo de inyección de muestras con la punta biselada. Además, para todos los beneficios de la orientación, el eje largo de la punta biselada puede estar alineado con el eje mayor de la ubicación deseada de demarcación de la elipse y el eje corto es el eje menor, como se muestra.

Corriente abajo desde la zona interior ahusada similar a una elipse (c) es una zona interior cilíndrica (d). Esta zona interior cilíndrica (d), como puede verse en las Figuras 3A, 3B y 3C puede estar dividida además en una zona cónica (12) que está ahusada y en una zona cilíndrica (14). La zona cónica (12) tiene una boca circular más grande (11) en la parte superior que se une con la zona interior ahusada similar a una elipse (c) y tiene un orificio circular más pequeño (13) en conexión con la zona cilíndrica (14). La boca circular más grande (11) en la parte superior de la zona cónica puede tener un diámetro de aproximadamente 0,19 mm y la abertura circular puede ser de aproximadamente 0,07 mm en una realización preferente. La altura de la zona cónica puede ser de aproximadamente 0,3 mm. La zona cilíndrica (14) también puede tener una boca con el mismo diámetro que la abertura menor de la zona cónica en todo su orificio circular (15) de salida y puede tener una altura de aproximadamente 0,15 mm.

La Figura 4A ilustra una vista desde abajo de la boquilla de orientación de torsión única que muestra el orificio circular. El orificio circular debería ser lo suficientemente pequeño como para que se formen las gotitas minúsculas que contienen partículas de la muestra. El diámetro en una de las realizaciones preferentes puede ser de aproximadamente 0,07 mm. La Figura 4B muestra una vista desde arriba de la boquilla de orientación de torsión única. Como puede verse claramente, la boca puede tener una forma circular con un diámetro de aproximadamente 5,25 mm.

Con referencia a la Figura 5, puede verse cómo se produce la orientación. Como puede observarse, esta figura es un dibujo modificado de Kachel y sus colegas (Figura 3, Kachel et al., 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 774-780). Este dibujo, un corte transversal en torno a la ubicación deseada (9) de demarcación de la elipse, muestra, en primer lugar, las distribuciones de las fuerzas de orientación generadas desde la superficie interior de torsión única similar a una elipse. Como se muestra, la transformación distinta de la superficie interior de torsión única similar a una elipse puede hacer que fuerzas laterales preferentes generen componentes adicionales de flujo a lo largo del eje mayor y puede reducir las fuerzas generadas a lo largo del eje menor. Por lo tanto, las fuerzas generadas a lo largo del eje mayor pueden ser vistas como más fuertes que las fuerzas generadas a lo largo del eje menor para orientar de esta manera una partícula plana (16) como se muestra. El diseño único de la presente invención muestra su superioridad en el sentido de que la zona interior ahusada similar a una elipse (c) está conectada directamente a la zona interior cilíndrica (d) y al orificio circular (15) de salida. Esta geometría diseñada especialmente evita con éxito la ley de similitud y, por lo tanto, las partículas de la muestra que han sido orientadas podrán salir de forma individual del orificio circular de salida y mantendrán aún su estado alineado de forma orientada.

Además de lo anterior, se puede ver que todo el elemento de superficie interior ahusada de torsión única comprende una superficie de flujo laminar. Por medio de un flujo laminar y de las fuerzas de orientación de torsión única generadas por la superficie de flujo laminar, se puede orientar de forma radial y alinear la muestra a lo largo del eje hidrodinámico. La muestra alineada de forma orientada se mantiene de esta manera en el estado alineado de forma orientada cuando sale del orificio circular de salida en el que se separa la muestra en partículas individuales y similares, está rodeada por una gota de fluido envolvente, y es analizada. Por lo tanto, la muestra finalmente orientada puede ser debida a los esfuerzos combinados de la punta biselada del tubo de inyección de muestras y de la superficie interior de orientación de torsión única que, debido a la geometría única, genera las fuerzas de orientación de torsión única y produce un flujo laminar.

Se debe señalar que toda la superficie interior de la boquilla de orientación de torsión única puede ser unitaria. La forma de dividir toda la superficie interior en la zona interior ahusada similar a una elipse (c), la zona interior cilíndrica (d) y sus propias zonas subsiguientes como se han descrito anteriormente es simplemente en aras de una explicación clara.

La industria de cría de animales ha estado aprovechando cada vez más los principios de la citometría de flujo y utilizando los beneficios que puede proporcionar un citómetro de flujo de alta velocidad. Ahora se pueden discriminar con éxito los especímenes sexados de esperma por medio de los mecanismos de clasificación que emplea el citómetro de flujo. Con esta boquilla de orientación de torsión única de diseño único, se pueden clasificar los espermatozoides que tienen cromosomas X e Y de forma más eficaz y con un mayor porcentaje, como se ha descrito anteriormente. Los espermatozoides sexados pueden ser sometidos a tampón en el tampón de los inventores preparado especialmente compatible con esperma como se describe en la publicación PCT nº WO 99/05504 (LoDo PCT). Los espermatozoides sometidos a tampón pueden ser inyectados en la ubicación de demarcación dentro del elemento de superficie interior de torsión única similar a una elipse de la boquilla de orientación de torsión única donde pueden ser rodeados por el fluido envolvente para formar un esperma rodeado por fluido envolvente. Subsiguientemente, se pueden producir las gotas que contienen esperma por medio de un mecanismo de formación de gotas y ser analizadas en el área de caída libre. Entonces, se cargan las gotas que contienen esperma y son clasificadas por medio del dispositivo de clasificación y son recogidas por un sistema de recogida compatible con esperma que contiene un fluido de recogida de esperma fabricado especialmente. Este procedimiento completo puede minimizar las tensiones sobre el esperma creadas por medio del procedimiento de clasificación. Entonces, se puede utilizar el esperma que tiene el cromosoma X o Y para la inseminación y la producción de un mamífero de un género deseado.

Por lo tanto, es al menos el diseño único de una geometría de la superficie interior de la boquilla de orientación de torsión única lo que hace que la invención sea superior a otras boquillas convencionales. Como esperarán las personas con un nivel normal de dominio de la técnica, esta boquilla de orientación de torsión única, cuando se combina especialmente con el tubo biselado de inyección de muestras ubicado en una ubicación apropiada con respecto a una región específica de la superficie interior de la boquilla de orientación de torsión única, puede proporcionar resultados que pueden ser aún más satisfactorios.

Como se ha mencionado anteriormente, lo anterior ha expuesto el aspecto de alineamiento de torsión de la invención. Un segundo aspecto importante es el del movimiento axial de la muestra. Este aspecto abarca no solo el movimiento de la muestra según atraviesa la boquilla hacia abajo por el eje central, sino también las tensiones que recibe la muestra durante su recorrido. Estos movimientos pueden ser caracterizados quizás más fácilmente por tres valores, derivadas los tres de la distancia con respecto a la ubicación a lo largo de la muestra. Estas derivadas pueden ser resumidas como sigue:

1

Como se puede comprender de la figuras 6-9c, la boquilla puede presentar cualquier número de superficies de movimiento axial, es decir, superficies que tienen influencia sobre la muestra, o quizás que solo la limitan, según pasa a través de la boquilla. Como se muestra en la figura 6, las superficies de movimiento axial pueden ser pares simétricos y también pueden ser tan sencillas como una primera superficie (21) de movimiento axial y una segunda superficie (22) de movimiento axial. Según pasa la muestra hacia abajo por la boquilla (6), estas superficies de movimiento axial pueden actuar de maneras que tienen influencia sobre la muestra o su viabilidad. Por lo tanto, la muestra está sometida (normalmente hidrodinámicamente) a una primera superficie (21) de movimiento axial. Entonces, puede pasar a una ubicación (23) de transición para ser influida por una segunda superficie (22) de movimiento axial. Después de la ubicación (23) de transición, la muestra está sometida entonces a la segunda superficie (22) de movimiento axial. Entonces, puede salir de la boquilla, tal como por el orificio circular (15) de salida.

Se debería comprender que las superficies de movimiento axial pueden tener cualquier forma. En un sistema, tal como uno que puede tener una velocidad constante, pueden tener una forma tubular. Como se muestra en las figuras 6 y 8, en un sistema tal como uno que consigue una aceleración de la muestra según pasa a través de la boquilla (6), pueden estar configuradas como superficies de aceleración tal como las superficies cónicas mostradas. Por supuesto, la superficie de aceleración también podría decelerar la muestra. Al provocar una aceleración o una deceleración, la superficie actuaría de forma que cambiaría la velocidad de la muestra según pasa a través de la boquilla (6). Por lo tanto, se puede comprender que la muestra (6), tal como se muestra en la figura 8 puede incluir una primera superficie (24) de aceleración axial y una segunda superficie (25) de aceleración axial. La primera superficie (24) de aceleración axial hace que la muestra experimente un primer valor (que puede ser constante o no) de aceleración y la segunda superficie (25) de aceleración axial puede hacer que la muestra experimente un segundo valor de aceleración. Este segundo valor de aceleración puede ser distinto o no del primero. Como se muestra en la figura 8, dado que la segunda superficie (25) de aceleración converge a una tasa distinta, probablemente indicaría un valor distinto
de aceleración.

Naturalmente, siempre que hay una aceleración, la muestra puede experimentar una tensión. Esta tensión puede tener un impacto sobre la viabilidad y la funcionalidad de las muestras. Un aspecto particular para algunas muestras, tal como células más largas, puede ser el hecho de que cuando hay un cambio en la velocidad, puede haber diferencias en la tendencia de la velocidad desde un extremo de la muestra hasta el siguiente. Esto puede comprenderse más fácilmente con referencia a una muestra tal como un espermatozoide. Los espermatozoides viables tienen cabezas y colas. Cuando se hace que la cabeza acelere de forma diferencial con respecto a la aceleración de la cola, o cuando se hace que se mueva la velocidad a una velocidad distinta que la de la cola, se puede crear un diferencial desde la cabeza a la cola. Este diferencial puede provocar tensión en la célula. En casos extremos, puede incluso separar la cola de la cabeza. Obviamente, esto destruiría la eficacia de la muestra. La presente invención proporciona un sistema mediante el cual se puede minimizar esto y se pueden evitar o reducir los efectos no deseables. Esto se lleva a cabo al someter a la muestra a un grado "bajo" de cambios en la aceleración o la velocidad por la longitud de la muestra. Como los expertos en la técnica podrán comprender, "bajo" puede ser un término relativo que puede depender de la célula y del entorno. Se puede determinar de forma teórica o empírica como un valor que se muestra que consigue porcentajes prácticos de eficacia en la muestra para su aplicación específica. Estas probabilidades puede ser tales como al menos el 70%, 80%, 90% o similar. También se puede aplicar de forma afirmativa la aceleración o la tasa "baja" de cambio en aceleración.

Los cambios en la aceleración o la velocidad pueden producirse cuando cambian las superficies de movimiento axial. Estos cambios pueden ser bruscos o delicados. Naturalmente, algunas realizaciones de la presente invención prefieren éstos. Con referencia a la figura 6, puede verse cómo un cambio brusco en la superficie de movimiento axial a lo largo del eje puede fatigar a la muestra. La primera superficie (21) de movimiento axial cambia de forma discontinua en la ubicación (23) de transición. Por ejemplo, cuando se crea la segunda superficie (22) de movimiento axial por un elemento separado, tal como mediante la inserción de una piedra preciosa, puede existir una discontinuidad en la boquilla (6). En tal punto, se puede someter entonces a la muestra a un cambio extremo en la velocidad casi de forma instantánea. Se hará notar que dicho cambio discontinuo puede existir de forma involuntaria, debido a defectos de alineación casi imperceptibles. Independientemente, aspectos como estos pueden tender a separar la muestra. Al proporcionar transiciones que pueden no ser discontinuas, la presente invención puede evitar o minimizar las tensiones creadas de esta manera. La transición puede ser una transición continua como en un área curvada, al tener una cantidad limitada de "discontinuidad" o de defectos de alineación, o puede evitar simplemente la posibilidad de un cambio discontinuo al tener una superficie interior en la boquilla (6) que es unitaria. De esta forma, la boquilla puede tener de forma efectiva una superficie unitaria. En tal disposición, la boquilla (6) puede estar diseñada de manera afirmativa, de forma que presente una transición con una diferenciación máxima de la aceleración. Como se muestra en la figura 8, esto se puede llevar a cabo mediante el diseño en un área limitada (26) de transición de máxima diferenciación de la aceleración, tal como la mostrada entre la primera superficie de movimiento axial y la segunda. También se puede llevar a cabo utilizando un orificio unitario de salida. Entonces, el área limitada de transición de máxima diferenciación de la aceleración puede encontrarse en el orificio unitario de salida, o ser un resultado
del mismo.

En términos de las tres derivadas de la distancia con respecto a la ubicación mencionada anteriormente, se pueden comprender los anteriores conceptos mediante referencia a las figuras 7 a-c, y 9 a-c. Como se muestra, estas figuras son representaciones gráficas de los tres valores de derivada en ubicaciones respectivas en sus boquillas adyacentes mostradas en las figuras 6 y 8. Las Figuras 7a y 9a representan la primera derivada de distancia con respecto a la ubicación, un concepto similar a la velocidad. Dado que la boquilla en la figura 6 tiene un cambio discontinuo en la ubicación (23) de transición, puede verse que dl/dl cambia de forma discontinua en la ubicación (23) de transición. Para la boquilla (23) en la figura 8, el valor dl/dl no cambia de forma discontinua. Así, la muestra puede ser tratada con menos tensión solo por esta razón. En las figuras 7b y 9b, se puede ver que los valores dl^{2}/dl^{2} para sus boquillas respectivas también son distintos. En la figura 7b, la segunda derivada de la distancia con respecto al valor de la ubicación (o quizás visto más fácilmente como la aceleración) tiene un momento de cambio extremo. De nuevo, esto no está tan presente en la figura 9b. Finalmente, la tercera derivada de la distancia con respecto a los valores de ubicación, dl^{3}/dl^{3} (o quizás vistos más fácilmente como la tasa de cambio de la aceleración) también difieren. En la figura 7c, el valor primero se vuelve positivo y luego negativo. En los valores mostrados en la figura 9c, los valores nunca cambian de signo, son bien cero o bien positivos, pero nunca negativos. De forma conveniente, se puede construir cada uno de estos conceptos mediante los cuales comprender y caracterizar la boquilla según está diseñada para evitar o minimizar las tensiones sobre la muestra.

Otro aspecto que puede ser un factor para algunas muestras es el aspecto de la duración de la velocidad, la aceleración o la tasa de cambio de la aceleración según es experimentada por la muestra. Esto también puede ser denominado el tiempo de permanencia para la muestra. En la citometría de flujo, a menudo existe una necesidad de que se depositen muestras únicas en gotas únicas. Los aspectos tales como este pueden provocar un deseo de transición del fluido en el último momento posible. En los sistemas que intentan hacer esto, puede ser importante prestar atención en particular a las áreas en el entorno desde aproximadamente 100 um desde el punto (27) de salida, áreas más alejadas que 300 um desde el punto (27) de salida, áreas en el entorno del punto (27) de salida, o incluso áreas alejadas del punto (27) de salida. Además, en algunos sistemas puede ser aceptable someter solo momentáneamente a la muestra a los valores no deseados. Por lo tanto, se pueden establecer límites en la boquilla (6) o en ubicaciones específicas dentro de la boquilla (6). Algunos de los límites que pueden aplicarse se exponen en las tablas 1 y 2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Valores d^{2}l/dl^{2}

2

TABLA 2 Valores d^{3}l/dl^{3}

3

Al coordinar de manera afirmativa dichos aspectos con muestras específicas, los valores también pueden establecerse en la longitud efectiva de la célula/muestra. Estas longitudes pueden ser determinadas tanto de forma teórica, medidas como la longitud real de la muestra, o incluso determinadas de forma empírica como una longitud efectiva de la muestra. De nuevo, estas acciones afirmativas o coordinadas tienen como resultado dejar las cosas al azar y pueden dar certidumbre a los usuarios. En las determinaciones empíricas, entre otras, se debería comprender que se pueden escoger los valores conseguidos, de forma que no superen las capacidades prácticas de la muestra en su longitud, eso es para que la muestra retenga una probabilidad suficientemente aceptable de funcionalidad después de que sea procesada. De esta forma, al coordinar la máxima diferenciación de la aceleración, al limitar de manera afirmativa la máxima diferenciación de la aceleración, y al escoger de manera afirmativa valores (determinados o no), de forma que no superen las capacidades prácticas de la muestra, la presente invención puede conseguir sus propósitos.

Como se ha mencionado anteriormente, puede existir sinergia entre este aspecto y el aspecto de alineamiento hidrodinámico de la invención. El giro y la tracción combinados pueden provocar tensión, y aparentemente lo provocan, en algunas muestras, especialmente en espermatozoides. Por lo tanto, la posibilidad de combinar las fuerzas hidrodinámicas de torsión y la máxima diferenciación de la aceleración o los valores similares, estos aspectos también pueden combinarse para minimizar la tensión. También se puede considerar el aspecto de combinar los anteriores valores y conceptos con otros parámetros que son probablemente la causa de tensión en un contexto de un citómetro de flujo. Dichos parámetros pueden incluir la operación a tasas de clasificación de al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 1000 clasificaciones por segundo, y al menos 1500 clasificaciones por segundo. De forma similar, esto también puede incluir operaciones a 344,7 kPa y similares. Finalmente, como se ha señalado anteriormente, ciertas muestras pueden ser particularmente susceptibles a la tensión, a los aspectos mencionados anteriormente, o a los valores expuestos anteriormente. Esto puede ser particularmente cierto para espermatozoides, sistemas de recogida de esperma, espermatozoides bovinos, espermatozoides equinos, espermatozoides que han sido tincionados y clasificados por su contenido de ADN (tal como en espermatozoides sexados), espermatozoides bovinos clasificados machos o hembras, e incluso espermatozoides equinos clasificados machos o hembras.

Claims (40)

1. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo, que comprende las etapas de:

a.

establecer un fluido envolvente (2);

b.

inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección;

c.

establecer una superficie de torsión única en una boquilla (6) que tiene un eje central en torno al que se aplica un par al utilizar un elemento de superficie interior de torsión única ahusada gradualmente que está dividido en una zona interior ahusada similar a una elipse (c) y una zona interior cilíndrica (d) y en el que la zona interior ahusada similar a una elipse (c) está conectada directamente a la zona interior cilíndrica (d) y un orificio circular (15) de salida de la boquilla (6);

d.

generar fuerzas hidrodinámicas de torsión única desde dicha superficie de torsión única, en el que dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión única tienen un eje hidrodinámico;

e.

orientar dicha muestra con dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión única;

f.

alinear de forma radial dicha muestra con respecto a dicho eje hidrodinámico;

g.

hacer salir dicha muestra de dicha boquilla (6);

h.

analizar dicha muestra.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha superficie interior de torsión única similar a una elipse (c) tiene una elipticidad que varía a lo largo de su longitud y que comprende, además, la etapa de variar de manera homogénea dicha elipticidad de dicha superficie interior de torsión única similar a una elipse (c).

3. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 1, y que comprende, además, las etapas de:

a.

someter dicha muestra a una primera superficie (21) de movimiento axial en una boquilla (6);

b.

pasar hasta una segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6);

c.

someter dicha muestra a dicha segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6) en la que se producen una transición en dichas superficies primera y segunda (21/22) de movimiento axial con una máxima diferenciación de la aceleración;

d.

coordinar dicha máxima diferenciación de la aceleración, de forma que no supere las capacidades prácticas de dicha muestra en su longitud; y

e.

limitar de forma afirmativa dicha máxima diferenciación de la aceleración, de forma que no supere las capacidades prácticas de dicha muestra en su longitud.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 3, en el que dicha etapa de sometimiento de dicha muestra a una primera superficie (21) de movimiento axial en una boquilla (6) comprende la etapa de sometimiento de dicha muestra a una primera superficie (24) de aceleración axial en dicha boquilla (6) y en el que dicha etapa de sometimiento de dicha muestra a dicha segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6) comprende la etapa de sometimiento de dicha muestra a una segunda superficie (25) de aceleración axial, en el que se produce una transición en dichas superficies primera y segunda (21/22) de movimiento axial de máxima diferenciación de la aceleración.

5. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 3, en el que se combinan dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión única y dicha máxima diferenciación de la aceleración y están escogidas de manera afirmativa de forma que no superen las capacidades prácticas de dicha muestra en su longitud.

6. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 5, en el que dicha etapa de transición a una segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6) comprende la etapa de sometimiento de dicha muestra a una superficie unitaria.

\newpage

7. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 6, en el que dicha etapa de transición a una segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6) comprende la etapa de sometimiento de dicha muestra a un orificio unitario (15) de salida.

8. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 3, y que comprende, además, las etapas de:

a.

formar gotas en torno a dicha muestra después de que ha salido de dicha boquilla (6); y

b.

clasificar dichas gotas a una tasa seleccionada del grupo constituido por al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 1000 clasificaciones por segundo, y al menos 1500 clasificaciones por segundo.

\vskip1.000000\baselineskip

9. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 3, y que comprende, además, la etapa de presurizar dicha boquilla (6) hasta una presión de al menos 344,7 kPa.

10. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 8, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides no humanos dentro de dicho fluido envolvente (2).

11. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 9, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides no humanos dentro de dicho fluido envolvente (2).

12. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 3, 6, 7, 8 o 9, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides seleccionados del grupo constituido por espermatozoides bovinos y espermatozoides equinos dentro de dicho fluido envolvente (2).

13. Un procedimiento como se describe en la reivindicación 10 u 11, en el que se procesan espermatozoides no humanos.

14. Un procedimiento como se describe en la reivindicación 13, en el que se procesan espermatozoides bovinos o espermatozoides equinos.

15. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de establecer una superficie interior de torsión única ahusada similar a una elipse (c) en dicha boquilla (6) comprende la etapa de ahusar gradualmente dicha superficie interior de torsión única similar a una elipse (c).

16. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 15, en el que dicha etapa de ahusar gradualmente dicha superficie interior de torsión única similar a una elipse (c) comprende la etapa de establecer un ahusamiento a aproximadamente 23º.

17. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de orientar dicha muestra con dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión única comprende la etapa de someter mínimamente a un par dicha muestra.

18. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 17, en el que dicha muestra recorre una distancia después de llevar a cabo dicha etapa de generar fuerzas hidrodinámicas de torsión única desde dicha superficie de torsión única y antes de llevar a cabo dicha etapa de hacer salir dicha muestra de dicha boquilla (6) y comprende, además, la etapa de minimizar dicha distancia.

19. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 18, en el que dicha etapa de hacer salir dicha muestra de dicha boquilla (6) se produce en un orificio (15) de salida y en el que dicha etapa de minimizar dicha distancia comprende establecer la distancia desde dicho punto de inyección hasta dicho orificio (15) de salida a aproximadamente 6 mm.

20. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 8, en el que dicha muestra está orientada como se describe en la reivindicación 19.

21. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides en un tampón compatible con esperma dentro de dicho fluido envolvente (2).

22. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 21, y que comprende, además, las etapas de:

a.

formar gotas en torno a dichos espermatozoides después de que han salido de dicha boquilla (6); y

b.

clasificar dichas gotas.

\vskip1.000000\baselineskip

23. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 21, y que comprende, además, la etapa de recoger dichos espermatozoides después de llevar a cabo dicha etapa de clasificación de dichas gotas.

24. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 22, en el que dicha etapa de inyectar espermatozoides en un tampón compatible con esperma dentro de dicho fluido envolvente (2) comprende la etapa de inyectar espermatozoides en un tampón compatible con esperma dentro de dicho fluido envolvente seleccionado del grupo constituido por espermatozoides equinos y espermatozoides bovinos.

25. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 24, en el que dicha muestra está orientada como se describe en la reivindicación 19.

26. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 16 o 19, y que comprende, además, las etapas de:

a.

someter dicha muestra a una primera superficie (21) de movimiento axial en una boquilla (6);

b.

pasar a una segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6);

c.

someter dicha muestra a dicha segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6), en el que se produce una transición en dichas superficies primera y segunda (21/22) de movimiento axial con una máxima diferenciación de la aceleración;

d.

coordinar dicha máxima diferenciación de la aceleración de forma que no se superen las capacidades prácticas de dicha muestra en su longitud; y

e.

limitar de manera afirmativa dicha máxima diferenciación de la aceleración, de forma que no se superen las capacidades prácticas de dicha muestra en su longitud.

\vskip1.000000\baselineskip

27. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 26, en el que se combinan dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión única y dicha máxima diferenciación de la aceleración y están escogidas de manera afirmativa, de forma que no se superen las capacidades prácticas de dicha muestra en su longitud.

28. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 27, en el que dicha etapa de transición a una segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6) comprende la etapa de sometimiento de dicha muestra a una superficie unitaria.

29. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 28, en el que dicha etapa de transición a una segunda superficie (22) de movimiento axial en dicha boquilla (6) comprende la etapa de sometimiento de dicha muestra a un orificio unitario (15) de salida.

30. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 26, y que comprende, además, las etapas de:

a.

formar gotas en torno a dicha muestra después de que ha salido de dicha boquilla (6); y

b.

clasificar dichas gotas a una tasa seleccionada del grupo constituido por al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 1000 clasificaciones por segundo, y al menos 1500 clasificaciones por segundo.

\vskip1.000000\baselineskip

31. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 26, y que comprende, además, la etapa de presurizar dicha boquilla (6) a una presión de al menos 344,7 kPa.

32. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 30, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides dentro de dicho fluido envolvente (2).

33. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 31, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides dentro de dicho fluido envolvente (2).

34. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 26, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides seleccionados del grupo constituido por espermatozoides bovinos y espermatozoides equinos dentro de dicho fluido envolvente (2).

35. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 29, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides seleccionados del grupo constituido por espermatozoides bovinos y espermatozoides equinos dentro de dicho fluido envolvente (2).

36. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 30, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides seleccionados del grupo constituido por espermatozoides bovinos y espermatozoides equinos dentro de dicho fluido envolvente (2).

37. Un procedimiento de procesamiento de muestras de citometría de flujo como se describe en la reivindicación 31, en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides seleccionados del grupo constituido por espermatozoides bovinos y espermatozoides equinos dentro de dicho fluido envolvente (2).

38. Un procedimiento de creación de un espécimen sexado de esperma que comprende la etapa de producir un espécimen sexado de esperma como se describe en la reivindicación 32, y en el que dicha etapa de inyectar una muestra dentro de dicho fluido envolvente (2) en un punto de inyección comprende la etapa de inyectar espermatozoides dentro de dicho fluido envolvente (2).

39. Un procedimiento de creación de un espécimen sexado de esperma que comprende la etapa de producir un espécimen sexado de esperma como se describe en la reivindicación 36, y en el que dicha etapa de inyectar espermatozoides dentro de dicho fluido envolvente (2) comprende la etapa de inyectar espermatozoides seleccionados del grupo constituido por espermatozoides bovinos y espermatozoides equinos dentro de dicho fluido envolvente (2).

40. Un procedimiento como se describe en la reivindicación 36, en el que se procesan espermatozoides bovinos o espermatozoides equinos.