KR20070058710A - 개선된 플로우 사이토미터 노즐 및 플로우 사이토미터 샘플처리 방법 - Google Patents

개선된 플로우 사이토미터 노즐 및 플로우 사이토미터 샘플처리 방법 Download PDF

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Abstract

소 또는 말 정자 세포 등의 아이템에 관련되는 평면적인 샘플의 고효율적인 배향 및 소팅 프로세스를 위한 플로우 사이토미터의 개선된 노즐 시스템 및 그에 수반되는 방법들을 개발하였다. 상기 개선된 노즐 시스템은 세포들을 부드럽게 가속시킬 수 있고 예컨대 단일 토션 배향 노즐(6)의 노즐의 (c)내에 타원형의 단일 토션 내부 표면을 가질 수 있는 새로운 내부 표면 기하학적 구조로 된 노즐(16)을 포함한다. 상기 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소(예컨대)(8,9,10)는 층류 표면을 가지며 동물 정자 세포 등의 평면적인 샘플(16)을 임상 의료용, 연구용 및 동물 수정 산업 용도의 분석 및 효율적 소팅 프로세스를 위해 적절한 방향으로 배향시키도록 유체역학적인 힘, 즉 단일 토션 배향력으로 배향시키거나 또는 가속 특성으로 작용하는 최소한의 힘을 가하기 위한 가장 간단한 유동 경로를 생성할 수 있다.
플로우 사이토메트리, 소팅, 단일 토션 배향 노즐, 포유동물 정자세포

Description

개선된 플로우 사이토미터 노즐 및 플로우 사이토미터 샘플 처리 방법{IMPROVED FLOW CYTOMETER NOZZLE AND FLOW CYTOMETER SAMPLE HANDLING METHODS}
도 1은 본 발명의 시스액(sheath fluid) 컨테이너, 샘플 주입 튜브 및 노즐을 나타낸 플로우 사이토미터의 일부를 나타낸 단면도이다. 상기 도면은 또한 노즐 내의 샘플 튜브의 상대적인 위치를 나타낸다.
도 2는 하나의 노즐 첨단과, 샘플 주입 튜브와 노즐 첨단이 있는 시스액 컨테이너(이하 노즐 본체)와의 상대적인 위치의 3차원 도면이다. 도2a는 경사진 첨단과 원형 입구를 갖는 샘플 주입 튜브의 개략적인 도면이다.
도 3a, 3b 및 3c는 노즐에 대한 본 실시예들 중 하나의 개략적인 도면이다. 도3a는 제1 타원형 증가 구역, 원하는 타원 경계 위치, 타원형 감소 구역, 원추형 구역, 원통형 구역, 및 원형 배출 오리피스를 나타낸 노즐 첨단의 3차원 도면이다. 도3b는 하나의 설계에서의 노즐의 테이퍼된 내부 표면을 도시한 개략적인 단면도이다. 도3c는 원통형 구역 및 원형 배출 오리피스의 단면도이다.
도4a는 특히 원형 배출 오리피스를 도시한 노즐 첨단 영역의 저면도이다. 도4b는 가장 큰 원형 입구, 원하는 타원 경계 위치, 보다 큰 원추형 구역의 원형 입구 및 원통형 구역의 가장 작은 원형 입구를 도시한 노즐의 내부 설계의 상면도이다. 또한, 입구의 최소 직경은 원형 배출 오리피스의 직경이다.
도 5는 단일 토션 배향 노즐이 납작한 파티클을 배향시킬 때 어떻게 작용하는 지를 나타내는 도면이다.
도 6은 종래기술에 존재하는 축방향 이동면들을 갖는 노즐의 일례에 대한 개략적인 도면이다.
도 7a, 7b 및 7c는 도6에 개략적으로 도시된 노즐 등에 존재할 수 있는 위치에 대한 이론적인 축의 속도, 가속도, 및 가속운동의 변화율의 플롯이다.
도8은 본 발명의 일 실시예에 의한 축방향 이동면들을 갖는 노즐의 일례에 대한 개략적인 도면이다.
도9a, 9b 및 9c는 도8에 개략적으로 도시된 노즐 등에 존재할 수 있는 위치에 대한 이론적인 축의 속도, 가속도, 및 가속운동의 변화율의 플롯이다.
본 발명은 플로우 사이토미터 시스템에 대한 개선된 노즐 장치 및 사이토메트리(cytometry)를 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분석 및 효율적인 소팅(sorting)을 위해 샘플을 조심스럽게 다루어 적당한 반경방향으로 배향시키는 노즐 내부 표면 기하학의 혁신적인 설계에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 민감한 세포, 특히 살아있는 정액 세포를 소팅하기 위한 시스템에 초점을 맞추고 있다.
플로우 사이토미터는 수년동안 임상의료용, 연구용이었으며, 동물 번식 산업 등의 동물 산업에서의 응용이 급속하게 증가하고 있다. 상업적으로 이용가능한 플로우 사이토미터는 일반적으로 그 노즐의 원통형 유체 기하학을 이용한다. 상기 타입의 플로우 사이토미터 시스템은, 미국 특허(제5,602,039호, 제5,483,469호, 제4,660,971호, 제4,988,619호, 및 제5,466,572호)에 기재된 바와 같이, 회전대칭된 포커싱 유동 경로(focusing flow path)를 갖는다. 유사성의 법칙에 의하면, 상기 타입의 설계는, 반경방향으로 배향된 샘플들을 생성할 수 없다. 임상의료, 동물 번식, 및 생물학적 연구 분야에서는, 정자 세포 등의 세포가 소트될 때, 여기(excitation) 광원에 노출되는 경우에 형광을 생성하는 염료로 미리 착색될 수 있다. 로렌스 존슨(Lawrence Johnson)에게 허여된 미국 특허 제5,135,759호에 설명된 바와 같이, 플로우의 축에 수직하는 방출된 형광을 검출하는 플로우 사이토미터는 세포들의 DNA 내용의 측정 및 감별시 고정밀도로 사용될 수 있다. 그러나, 언급된 바와 같이, DNA 내용 측정시의 상기 정밀도도, 관심 있는 세포들이 구형 또는 원통형일 때 가장 효율적으로 실현될 수 있다(딘 등., 1978, 지오피직스. 제이. 23:1-5). 헤드부가 납작한 정자 세포에 관해서는, 관측된 형광 강도가 탐지기에 대한 헤드부의 적절한 배향에 크게 의존한다. 정자 세포는 납작한 면보다 에지부로부터 더 강한 형광 신호를 방출한다. 따라서, 형광 신호의 강도는 탐지기를 통과할 때 정자 헤드의 배향에 의존한다. DNA 내용이 형광에 의해 결정되고, 형광 광도가 배향에 의해 영향을 받기 때문에, DNA 내용 감별은 노즐에 있어서 배향의 부족에 의해 번거롭게 된다. 이 때문에, 반경방향의 배향이 없으면, 그 결과 정상적으로 랜덤하게 배향된 정자 헤드부에 대해 얻어진 형광 강도 분포는, DNA 내용과 헤드부 배향 모두를 반영한다. 상기 세포들은 헤드 에지로부터 더 밝은 형광 신호를 방출하기 때문에(1976년 글레드힐 등.,에 의한 셀 피지올.87: 367-376; 1982년 핀켈 등.,에 의한 사이토메트리 7:268-273), DNA 내용 감별의 정확도(3.5%만큼 적게 차이가 날 수 있음)는 세포 배향에 의해 크게 영향을 받는다. 이 때문에, 종래의 플로우 사이토미터는, 특히 납작한 정자 세포 또는 다른 비구형 또는 비원통형 세포들 등을 소팅할 때는, 경험상의 제약을 갖는다.
또한, 소트 프로세스의 결과로서 특정 세포들은 기능이 감소할 수 있다. 이는 특히 기계적으로 민감할 뿐만 아니라 소트 프로세스시 발생하는 결과로서 기능적으로 손상(감소된 수정율을 통해 알 수 있는 바와 같이)되거나 심지어 치명적으로 손상될 수 있는 포유류의 정자 세포들 등의 세포들에 적용될 수 있다. 민감한 세포에 대한 플로우 사이토메트리 노력에 있어서는, 능력에 상당한 한계가 있다. 이 한계는, 세포들 자체가 대단히 민감할 뿐만 아니라, 생리적 및 실용적인 이유로 매우 높은 소팅속도에 대한 요구가 있기 때문에 고도로 전문화된 정자 세포 소팅 분야에서 가장 중요하다. 이 2가지의 경쟁적인 요구는 상업적인 번식 목적을 위한 정자 소팅의 유일한 분야에서 매우 중요한 도전을 제기하는 것으로 증명되고 있다. 따라서, 상기 2가지 양태, 즉 유연한 처리와 배향은 다양한 경우에 독립적으로 적용가능하며, 많은 경우에 있어서는 서로 상승작용할 수 있다. 그 독립적인 양태와 그 상승적인 상호관계는 상업적 정자 소팅 분야에서 가장 중요할 것이다. 흥미롭게도, 상기 상승작용 및 잠재적인 상호관계는 본 발명 이전에는 충분히 인정받지 못한 것으로 보인다
따라서, 분리의 관점에서는, 파티클 또는 세포를 포함하는 샘플의 적절한 배향의 양태는 플로우 사이토미터 신호의 강도 및 질과 소팅 효율에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 유체역학적으로 샘플을 배향하기 위한 노력이 이루어지고, 시스템 및 플로우 사이토미터를 통해 유동하는 샘플에 유체역학적 배향을 사용하는 것에 대해, 몇 십년 동안 연구되고 있다(1997년 후루일러에 의한 제이.히스토켐. 사이토켐.25:781-783; 1977년 카켈 등에 의한 제이.히스토켐.사이토켐.25:774-780; 딘 등., supra). 플로우 사이토미터 내의 샘플의 유체역학적 배향은 상대적인 DNA-착색 내용의 정밀한 측정을 향상시킬 수 있고 또한 납작한 면의 굴곡의 정도 및 세포두께 등의 잠재적으로 유용한 형태학상의 파라미터들의 측정을 제공할 수 있다. 일부 응용에 있어서, 상기 배향은 수월하다. 그러나, 민감한 세포(정자 세포 등) 또는 다른 파티클이 포함되면, 보다 유연한 기술이 필요하게 된다. 예컨대, 배향된 세포의 퍼센티지를 증가시키기 위한 노력으로 쐐기 모양 첨단을 갖는 샘플 주입 튜브가 사용되어 오고 있다(1978년 딘 등에 의한 바이오피직스, 제이. 23:1-5; 1977년 후루일러에 의한 제이.히스토켐.사이토켐. 25:781-783; 1986년 존슨 등에 의한 사이토메트리 7:268-273; 1982년 핀켈 등에 의한 사이토메트리 3:1-9; 1994년 웰치 등에 의한 사이토메트리 17(부록.7):74). 샘플 주입 튜브의 쇄기 모양 첨단 때문에, 샘플 스트림은 원통형 스트림과 반대로 시스액(sheath fluid)에 의해 얇은 리본으로 끌리는 경향이 있었다. 포유류 정자 등의 납작한 헤드를 갖는 세포들은, 종종 고속(100mm/sec)에서 시스액와 충돌한 후 회전하여 납작한 측면이 리본면에 있게 된다. 불행히도, 배향 결과와 최종 분석 결과의 분리는 최적의 결과를 발생시킬 수는 없다. 따라서, 상기 기술은 실용적으로는 원하는 만큼 이득이 되는 것으로 보이지 않는다.
다른 응용에서는, 카켈 등(Kachel et al., supra)이 유사성의 법칙을 증명했으며, 이동하는 파티클에 영향을 주는 유동 경로의 3가지 유형을 논의했다. 그들은 납작한 적혈세포 등의 납작한 파티클에 대해 유체역학적 힘으로 균일한 반경 배향을 실현하기 위해서는, 바람직한 유동 경로는 일면이 수축되는 경로일 것이라고 결론지었다. 플로우 스루 시스템(flow through system)을 사용하여 일면의 수축이 증가하는 가장 간단한 유동 경로는, 타원면 교차부를 갖는 튜브로 이루어지고, 또한 타원면 배출구(outlet)에서 끝난다. 일 구성에 있어서, 상기 타원면 배출구의 장축은 수축하는 타원 튜브의 교차부에 있는 장축의 우측 모서리에 배치된다. 그러나, 상기 타원면 배출구는 고속 플로우 사이토미터 세포 소터에 필요한 작은 드롭릿의 형태를 생성하지 않기 때문에, 상기 구성은 플로우 사이토미터에 사용되도록 의도되지 않았으며, 플로우 사이토미터에 적용되지 않는다.
유사한 노력으로, 렌 등이 타원 내부 및 타원 배출 오리피스를 갖는 노즐 첨단을 설계했다(1998년 렌 등에 의한 PCT 공보 넘버. PCT/US98/15403; 1998년 렌 등에 의한 사이토메트리 33:476-481; 1999년 렌 등에 의한 몰. 레프로드. 디이브이. 52:50-56). 이 내부는 천이 구역에 의해 분리된 제1 타원면 구역 및 제2 타원면 구역을 포함한다. 상기 모든 구역 각각은 장축과 단축을 갖는다. 제2 타원면 구역의 장축은 제1 타원면 구역의 장축에 대해 90°배향되었다. 보석을 통해 연마된 원통형 오리피스는 타원면 배출 오리피스의 단부에 배치되어 있고, 최종 배출구로서 작 용한다. 상기 장치는 부분적으로 종래 플로우 사이토미터에 존재했던 랜덤 배향의 문제점을 해결하였고, 플로우 사이토미터를 통과할 때마다 납작해진 수퇘지의 총 정자 세포들중 약 60%를 배향시킬 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 유동 경로에서의 유체역학적 힘을 고려한다면, 렌 등에 의해 고안된 노즐을 통과하는 납작한 파티클들은 불필요한 스트레스를 받았다. 민감한 세포들 및 특히 말 또는 소의 정자 세포 등의 보다 민감한 정자 세포들에 있어서, 상기 접근은 단순히 배향 또는 세포 생존력에 있어서의 바람직한 효율을 얻기 위해 등장한 것은 아니다.
따라서, 오랫동안 본 발명에 대해 갈망되었지만 만족되지 않은 요구가 있었던 반면 필요한 구현 기술 및 요소들은 이용되고 있었다. 상기 요구는, 분석될 파티클 또는 세포들을 유연하게 처리하고 배향시키는 능력, 적절히 분석하고 효율적으로 소트하는 능력, 및 플로우 사이토미터가 파티클 또는 세포에 야기시키는, 잠재적으로 스트레스를 주는 상황을 최소화시키기 위한 능력에 관한 것이다. 또한, 종래 플로우 사이토미터에 문제점이 발생했지만, 문제가 존재하고, 그 문제가 무었인 지에 대해 당업자들이 충분히 알지 못했다. 상기 요구를 충족시키거나 어려움을 극복하기 위해 당업자들에 의한 실질적인 시도들은 이루어졌지만, 정확하게 문제가 무엇이고 어떻게 연관되어 있는 지에 대해 이해하지 못했기 때문에 충분히 성공적이지 않았다. 당업자들에 의한 일부 노력들이 상기 문제들에 대해 다룬 것처럼 보이는 특허로 되었지만, 실제로는 이들은 본 발명에 개시된 기술적 방향과는 동떨어진 경향이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 필요한 유체역학적 힘을 가하여, 분석 및 효과적인 소팅 목적을 위한 적절한 방향으로 샘플을 가속시키고 배향시키기 위한 가장 간단한 유동 경로를 생성하는, 개선된 노즐 내부 표면 기하학을 제시하는 것이다. 상기 개선된 노즐 내부 표면 기하학은, 적절히 구성된 가속력 특징 및/또는 특별한 유체역학적 힘, 즉, 단일 토션 배향력을 생성하는 단일 토션 배향 노즐내의 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소중 하나 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 발명이 나타내고 있는 바와 같이, 바람직하지 않은 세포 스트레스가 갖는 문제들은 부적절한 조작힘, 특히 부적절한 가속력 또는 제2 타원면 구역에 의해 생성되는 제2 토크의 존재에 의해 적어도 부분적으로 나타날 수 있다. 가해진 가속력에 대해서는, 장치들이 종종 노즐 내부에 돌발적인 천이를 이용하여, 짧은 거리에 대해 심한 가속도를 유발시켰다. 배향의 양태에 관해서는, 예컨대 렌(상기함) 등의 접근에 의해, 세포들이 제1 타원면 구역에 의해 생성된 제1 토크에 의해 배향된 후, 부가적인, 아마도 2배의, 스트레스가 가해진다는 것을 알 수 있다. 특히, 납작한 파티클은 제1 타원면 구역에 의해 랜덤 위치로부터 배향된 후 배향된 위치에 이미 있었다. 이들은 배향된 위치에서 배출될 준비를 한다. 이때, 그러나, 렌 등의 장치들은 상기 배향된 납작한 파티클들을 제2 타원면 구역에 의해 생성된 유체역학적 힘에 의해 불필요하게 2회 비틀었다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 상기 설계는 고속 플로우 사이토미터에서는 충분히 효과적이지 못하다. 꼬리를 가진 납작한 정자 세포들은 상기 타입의 노즐을 통해 배향되는 경우, 그 비효율성 외에도, 상기 타입의 노즐에서의 기하학에 의해 분명히 토크보다 2배의 충격이 가해진다. 이는 꼬리가 긴 정자 세포들이 노즐을 빠져나가기 전에 불필요하게 높은 스트레스 또는 손상을 받는 것으로 나타난다. 또한, 오리피스가 메인 내부로부터 분리된 보석으로 이루어지는 일부 설계에서는, 완만한 층류가 어느 정도 영향을 받을 수 있다. 상기 층류는 거의 순간 가속도를 유발시킬 수 있어, 세포에 불필요한 스트레스를 줄 수 있고, 이미 배향된 정자 세포들의 배향에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 렌에 의한 접근 및 다른 최근의 노력들은 실제로 본 발명에 의한 실시예의 보다 효율적이고, 덜 가속적이고 토션이 적고 완만하게 층진 내부 표면과는 동떨어져 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 층류 표면을 제공하고 동시에 샘플, 특히 정자 세포의 왜곡을 감소시키는 가장 간단한 노즐 내부 표면 기하학을 설계하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 보다 신속하고, 보다 정확하게 샘플, 특히 연구용, 임상 치료용 및 동물 수정 산업용의 민감한 정자 세포들을 측정하고 소트할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 연구용 및 치료용 및 동물 수정 산업용의 플로우 사이토메트리에 있어서 샘플, 특히 정자 세포들의 배향 및 소팅 효율을 개선하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 특징들은 명세서 및 청구항에 걸쳐 개시되어 있다.
본 발명의 목적을 참조하여, 설명으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기본 개념은 여러 가지 방식으로 구현될 수 있다. 도1을 참조하면, 도1은 샘플이 분석되어 소트되기 전에 각각의 작은 드롭릿(droplet)들 안으로 프로세스되는 플로 우 사이토미터 시스템의 일부를 도시하고 있다. 개략적인 사시도로부터 당업자들이라면 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 시스액 컨테이너(1)는 시스액 포트(도시 안함)를 통해 유입되는 시스액(2)을 포함할 수 있다. 샘플 주입 시스템은 샘플 저장기(도시 안함)에 연결된 샘플 주입 튜브(3)를 포함한다. 샘플 주입 시스템은 일반적으로 노즐 시스템에 일부의 샘플 재료의 적절한 플로우를 제공하도록 작용한다. 상기 시스액 컨테이너는 동시에 시스액을 노즐 시스템에 도입한다. 상기 샘플은 시스액에 의해 둘러싸여 샘플저장 유체를 형성할 수 있고, 그 후 상기 샘플저장 유체가 작은 드롭릿들을 형성하게 하는 드롭형성 메카니즘을 통해 노즐 시스템을 빠져나간다. 상기 작은 드롭릿들은 사이토미터 시스템으로부터의 오실레이터에 의한 진동과 플로우 고압의 조합에 의해 약 20m/s 이상의 고속으로 자유낙하영역을 통과할 수 있다. 그 결과, 상기 작은 드롭릿들, 즉 샘플저장 드롭들은 자유낙하영역에서 분석 시스템(도시 안함)에 의해 분석될 수 있다. 납작한 정자 등의 살아있는 세포들이 샘플 재료들로서 도입되면, 하나 이상의 형광 염료들로 착색될 수 있다. 상기 정자 세포들은 분석 시스템(도시 안함)을 지나 시스액 스트림으로 일렬로 운반될 수 있다. 분석 시스템은 현존하는 형광 염료를 여기시키도록 파장이 조정되는, 초점이 맞추어진 레이저를 포함할 수 있다. 각 세포로부터 수집된 형광 신호는 그 후 탐지 시스템(도시 안함)을 통해 감지될 수 있다. 그리고, 상기 프로세스는 당업자들이라면 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 각종 드롭들에 상이한 전하를 인가함으로써, 도입된 각 세포의 DNA 내용 등의 각각의 물리적 특성에 따라, 소팅 장치 등에 의한 소팅 프로세스를 포함할 수 있다. 결과적으로, 각 세포는 그 전하에 따 라 소트된다. 상기한 바와 같이, 플로우 사이토미터의 상기 일반적인 양태는 공지되어 있으며 상기한 참고문헌에 논의되어 있다(이하 참고문헌에 포함됨).
플로우 사이토미터의 기능과 샘플의 생존력을 위한 샘플들의 처리에 관해서는, 2가지 양태: 토션 얼라인먼트 및 샘플의 축방향 이동이 중요할 수 있다. 이들 각각은 독립적으로 논의되지만, 상호 배타적이지 않으며 상승효과를 가질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이는, 샘플의 생존력, 즉, 샘플이 플로우 사이토메트리 프로세싱에 의해 예상되지만 실제로는 작용하지 않는 효과를 갖는 기능을 수행하는 능력에 관한 것이기 때문에, 특히 사실이다. 상기 2가지 양태중 토션 얼라인먼트에 대해 우선 설명한다.
도1에 설명된 양태들은 또한 도2에 도시된 3차원 도면을 통해 이해될 수 있다. 상기 3차원 도면은 플로우 시스 컨테이너(1), 샘플 주입 튜브(3) 및 노즐(6)을 갖는 노즐 시스템의 일부를 도시한다. 도2a에 상세하게 도시한 바와 같이, 샘플 주입 튜브(3)는 경사진 첨단(4) 및 원형 입구(5)를 갖는다. 상기 특별히 설계된 노즐(6)을 본 발명에서는 단일 토션 배향 노즐이라 하고, 이하에 상세하게 설명한다.
공지된 바와 같이, 상기 샘플 주입 튜브는 얇은 플로우의 샘플 재료를, 상기 샘플이 시스액에 의해 포위되는 노즐 시스템에 도입시키도록 작용한다. 당업자들이라면 충분히 이해할 수 있는 바와 같이, 종래의 샘플 주입 튜브는 대개 원통형이다. 그러나, 이 타입의 샘플 주입 튜브는 샘플의 배향을 제어하는 데 있어서 도움을 줄 수 없기 때문에, 상기 타입의 샘플 주입 튜브로부터 배출되는 샘플은 보통 비배향 상태이다. 지난 20년 동안, 개량된 샘플 주입 튜브가 생산되었다(1978년 딘 등., supra; 후루일러,1997, supra; 존슨 등., 1986, 사이토메트리 7:268-273; 핀켈 등., 1982, supra). 상기 개량된 샘플 주입 튜브는 경사진 첨단을 갖고, 상기 첨단으로부터 배출되는 샘플 재료를 배향시키는 데 어느 정도 도울 수 있다. 샘플 주입 튜브의 경사진 형상에 의해, 샘플 스트림이 시스액에 의해 얇은 리본속으로 끌려갈 수 있다. 그에 따른 유동 상태의 변화가 샘플 재료의 대응하는 배향을 발생시킨다.
상기 설계에서는, 경사진 첨단의 메커니즘의 개념에 기초하여, 도시된 경사진 첨단의 타입을 갖는 샘플 주입 튜브가 유지되지만, 특정 내부 사이즈는 독특하다. 가장 중요한, 노즐내의 경사진 첨단의 위치는 특별히 지정된다. 도2a에 도시된 바와 같이, 여기서는 배향 개선 샘플 주입 튜브라 하는 샘플 주입 튜브(3)가 경사진 첨단(4) 및 그 교차부에 있는 원형 입구(5)를 포함한다. 경사진 첨단은 그 교차부가 거의 사각 형상이다. 첨단은 장축과 단축을 갖는다. 보통 이 첨단은 응용이나 소트되는 파티클에 적합하게 되도록 변경될 수 있고, 바람직한 실시예에서는 경사진 첨단의 각도는 약 4°이고, 튜브의 외주 직경은 약 1.5mm이며 원형 입구의 직경은 약 0.25mm이다.
지금까지는, 샘플의 배향시 샘플 주입 튜브가 하는 역할에 대해서만 논의되었다. 그러나, 당업자들이 알 수 있는 바와 같이, 상기 방법으로 제공되는 배향력은 매우 제한되어 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 예컨대, 상기 특징 단독으로 배향 문제를 해결할 수 있다면, 높은 퍼센티지 배향에 대한 노력은 필요없게 될 것이다. 대신, 당업자들이 실현한 바와 같이, 높게 배향된 샘플을 얻기 위해서는 특히 샘플이 수정의 목적 등을 위해 정자 세포 등의 납작하고, 비구형이거나, 또는 민감한 세포들을 포함하는 경우, 부가적인 시도가 필요하였다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 대부분의 배향력은 노즐의 내부 표면으로부터 생성되어야 한다. 따라서, 노즐은 기능적, 및 강력하지만 유연한 배향력의 생성을 위한 기본적 요소로서 작용하였다.
이를 이해한다면, 현재 설계가 종래 기술과 얼마나 상이한 지 알 수 있을 것이다. 도1 및 도2로부터 알 수 있는 바와 같이, 또한 도3a, 3b, 3c로부터 특히 도출할 수 있는 바와 같이, 플로우 사이토미터 시스템은 특별히 설계된 단일 토션 배향 노즐(6)을 포함한다. 상기 단일 토션 배향 노즐(6)은 세라믹 재료 등의 일부 선택된 재료들로 형성될 수 있다. 노즐의 사이즈, 즉 높이 및 직경 등은 변경될 수 있지만, 종래 플로우 사이토미터에 적합하고, 동시에 본 발명에 기재된 바와 같이 원하는 배향력을 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직한 실시예에서는, 노즐이 하나로 이루어지지만, 설명의 편의상 두 부분 즉, 상부 원통형 부분(a) 및 하부 원추형 부분(b)으로 나누어진다. 바람직한 실시예들중 하나에 있어서, 상부 원통형 부분(a)의 높이는 약 8mm이고 외주 직경은 약 6mm일 수 있다. 원추형 부분(b)의 높이는 약 4.5mm일 수 있고 오리피스에서의 외주 직경은 약 1mm 이하일 수 있다. 따라서, 노즐의 총 높이는 약 12.5mm일 수 있다. 또한, 하나의 노즐을 사용하면 최적 구성에서의 모든 배향 및 축방향 이동 요소들을 고정시키는 데 도움을 준다. 이에 의해, 사용의 용이함, 반복가능성, 및 다른 실용적 문제들 또한 증가시킬 수 있다.
도3a는 3차원 도면이고 도3b 및 도3c는 본 발명의 단일 토션 배향 노즐의 개 략적인 단면도이다. 도3a 및 도3b에서 설명한 바와 같이, 단일 토션 배향 노즐(6)은 내부 표면 요소에 의해 둘러싸인 노즐 체적을 포함한다. 단일 토션 배향 노즐의 내부 표면 요소는 내부 기하학을 구성한다. 상기 내부 표면 요소는 단일 토션 내부 표면을 갖는 단일 토션 내부 표면 요소를 포함할 수 있다. 상기 단일 토션 내부 표면 요소는 샘플을 포함한 플로우가 이를 통과할 때 유체역학적 축을 갖는 단일 토션 유체역학적 힘을 발생시키는 능력을 갖는다. 또한 단일 토션 내부 표면 요소는 샘플에 가속도를 생성시킬 수 있는 가속 특성을 갖는다. 샘플이 상기 단일 토션 내부 표면 요소를 통과하면, 단일 토션 유체역학적 힘에 의해 배향되어 유체역학적 축에 대해 방사상으로 정렬될 수 있다. 또한 이후의 분석 및 소팅 프로세스를 위해 퇴진하도록 가속화될 수 있다. 상기 특별한 단일 토션 유체역학적 힘은 단일 토션 배향력이라 칭해질 수 있다.
단일 토션 내부 표면의 전체 형상은 점차 아래쪽으로 테이퍼되기 때문에 점진적으로 테이퍼된, 단일 토션 내부 표면 요소라 칭해진다. 도3b에 도시된 바와 같이 길이 방향의 단면도로부터, 상기 점진적으로 테이퍼된, 단일 토션 내부 표면 요소는 저부에서 상부까지 개방되어 있는 "부채형(fan-like)"이기 때문에 2차원으로 보일 수 있다. 점진적으로 테이퍼된, 단일 토션 내부 표면 요소의 테이퍼된 정도는 변경될 수 있지만, 원하는 가속력이 발생되어 샘플에 작용하도록 "부채형"의 저부로부터 상부까지 약 23°인 것이 바람직하다. 또한, 점진적으로 테이퍼된, 단일 토션 내부 표면 소자는 그 내부 기하학에 기초하여 몇 개의 구역들로 분할될 수 있고, 각 구역은 층류 표면을 가질 수 있다, 기본적으로, 점진적으로 테이퍼된 단일 토션 내부 표면 요소는 3차원 도면에서 타원형 단일 토션 내부 표면 및 원통형 내부 구역(d)을 갖는, 테이퍼된 타원형 내부 구역(c)으로 이루어질 수 있다. 상기 타원형 단일 토션 내부 표면은 그 교차부에서 상이한 형상을 포함할 수 있다. 예컨대, 타원형보다는 달걀형 또는 사각 형상에 가깝게 될 수 있다. 상기 형상들은, 타원형상, 달걀형상, 또는 심지어 사각형상이 최대 또는 원하는 정도에 달하는 경계위치의 상부와 하부의 타원형 단일 토션 내부 표면을 따라 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, 주어진 교차부에서는 정확히 수학적인 타원이 존재하지 않지만 상기 각 형상들은 "타원형"이라는 용어에 의해 포함되도록 의도된다. 이와 유사하게, 용어 "원형"도 완전한 원형 심지어 전혀 원형이 아니어도 좋다. 즉, 원형인 것이 바람직하지만, 적절한 함수가 존재하는 한 다른 형상들도 동일할 수 있다.
물론, 테이퍼된 타원형 내부 구역은 그 교차부에서 주축 및 마이너 축을 가질 수 있고 타원율은 원만하게 제어될 수 있다. 따라서, 그 타원율의 변화에 따라, 상기 테이퍼된 타원형 내부 구역은 상부에서 저부쪽으로 다음 구역들로 분할될 수 있다.
1) 교차부들의 마이너 축에 대한 주축의 비가 증가하는 상부에서 원형 입구(7)를 갖는 타원율 증가 구역(8);
2) 마이너 축에 대한 주축의 비가 도3a에 설명한 바와 같이 샘플에 대한 최대비인 최적비에 달하는, 타원율 증가 구역(8) 아래쪽의 원하는 타원경계위치(9); 및
3) 교차부들의 마이너 축에 대한 주축의 비가 감소하는 타원율 감소 구역(10).
상기한 기하학에 기초하여, 테이퍼된 타원형 내부 구역의 상부로부터 저부까지의 단면도의 2차원 형상은 입구 영역의 원으로부터, 타원율(형상에 관계없이 마이너 축에 대한 주축의 비)이 점차 증가하는 타원형(실제 타원일 수 있음); 원하는 타원 등, 타원율이 점차 감소하는 타원형, 및 마지막으로 테이퍼된 타원형 내부 구역이 원통형 구역과 합치되는 영역에서의 원으로의 과도적 변화가 행해진다. 전체 타원형 내부 구역은 테이퍼되어 있기 때문에, 전체 타원형 내부 구역의 단면적은 상부로부터 저부까지 점차 작아질 것이다. 따라서 타원율은 마이너 축에 대한 주축의 비율을 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 마이너 축에 대한 주축의 비율은 상부로부터 1로부터 1이상 즉, 샘플에 대한 최적비로 점차 변할 수 있다. 최적비는 최대비일 수도 있다. 그 후, 상기 비는 최대비로부터 점차 최소비보다 작게 변한 후 다시 1로 된다. 당업자들이라면 잘 아는 바와 같이, 상기 비율이 1로 되면 교차부의 형상은 원이 될 것이다. 상기 최대비율은 어느 정도 변경될 수 있다. 바람직한 실시예에서는, 주축의 길이가 2.2mm이고 마이너 축의 길이가 1.0 mm일 수 있다. 따라서, 최대비율은 상기 바람직한 일 실시예에 대해서는 약 2.2로 설계될 수 있다. 이는 당연히 응용에 따라 변경될 수 있다.
일 실시예에서는, 노즐 내에서 타원율 증가 구역(8) 아래쪽의 원하는 타원 경계 위치(9)는 샘플 주입 튜브의 경사진 첨단이 배치된 곳일 수 있다. 이는 또한 리본 플로우에 있는 샘플이 충분히 기능적인 원하는 배향력을 받고, 샘플이 바람직 한 배향력 또는 토크에 의해 최소한으로 토킹되고, 세포들을 배출시키는 데 필요한 시간을 최소로 하며, 또한 노즐의 오리피스로부터 배출된 후의 샘플이 배향된 상태를 잘 유지하여 이후의 분석 및 소팅이 효율적으로 수행될 수 있는 곳일 수 있다. 상기 위치를 주입점이라 한다. 지금 고속 소팅 플로우 사이토미터가 작동되는 현재 기술의 상태에 있어서는, 본 발명에 기초하여 상기 위치 또는 주입점은 배출 오리피스로부터 약 6 mm일 수 있다. 이에 의해, 샘플 파티클이 배향되는 점으로부터 배향된 상태의 정도가 통계적으로 감소하는 점까지 배향된 상태를 얼마나 유지할 수 있는 지를 나타내는 거리로서 배향 유지 거리를 정의한다면, 샘플 주입 튜브의 경사진 첨단으로부터 노즐의 배출 오리피스까지의 거리 및 배출 오리피스로부터 낙하 구역의 유동 경로를 따라 레이저빔 또는 센서와의 교차부까지의 거리가 상기 배향 유지 거리내에 있게 된다. 예컨대, 이는 딘 등(Dean et al., supra)이 설명한 바와 같이, 경사진 첨단으로부터 레이저빔과의 교차부까지 10mm 내에 있을 수 있다, 따라서, 경사진 첨단으로부터 레이저빔 또는 센서와의 교차부까지의 거리내에 있는 점에서는, 임의의 배향되어 있는 샘플 파티클은, 분석되기 전의 배향상태를 유지할 것이다. 이론적으로, 상기 배향 유지 거리는 플로우 사이토미터가 특별히 설계된 본 발명의 노즐과 경사진 첨단을 갖는 샘플 주입 튜브가 구비되어 있는 경우, 10 mm보다 길 수 있다. 또한, 충분한 배향의 이점을 위해, 경사진 첨단의 장축은 원하는 타원 경계 위치의 주축과 정렬될 수 있고, 단축은 도시된 바와 같이 마이너 축과 정렬될 수 있다.
상기 테이퍼된 타원형 내부 구역(c)으로부터 아래쪽은 원통형 내부 구역(d) 일 수 있다. 상기 원통형 내부 구역(d)은, 도3a, 도3b, 및 도3c에 도시된 바와 같이, 테이퍼된 원추형 구역(12) 및 원통형 구역(14)으로 더 분할될 수 있다. 상기 원추형 구역(12)은 테이퍼된 타원형 내부 구역(c)과 결합하는 상부의 큰 원형 입구(11) 및 원통형 구역(14)과 연결된 작은 원형 오리피스(13)를 갖는다. 바람직한 실시예에서는, 원추형 구역의 상부에 있는 큰 원형 입구(11)는 직경이 약 0.19mm일 수 있고 원형 입구는 약 0.07mm일 수 있다. 원추형 구역의 높이는 약 0.3mm일 수 있다. 원통형 구역(14)은 원형 배출 오리피스(15)를 통해 원추형 구역의 더 작은 입구와 동일한 직경을 갖는 입구를 가질 수 있고, 높이가 약 0.15mm일 수 있다.
도4a는 원형 오리피스를 도시하는 단일 토션 배향 노즐의 저면도이다. 원형 오리피스는 샘플 파티클을 포함하고 있는 작은 드롭렛들이 형성될 수 있을 만큼 충분히 작아야 한다. 바람직한 실시예들중 하나의 직경은 약 0.07mm일 수 있다. 도4b는 단일 토션 배향 노즐의 상면도이다. 명백하게 알 수 있는 바와 같이, 입구는 약 5.25mm의 직경을 갖는 원형일 수 있다.
도5를 참조하면, 배향이 어떻게 발생하는 지를 알 수 있다. 공지된 바와 같이, 상기 도면은 카켈 등(도3, 카켈 등., 1977, 제이. 히스토케. 사이토켐. 25:774-780)으로부터의 변경도이다. 원하는 타원경계위치(9) 주위의 교차부인 상기 도면은, 우선 타원형의 단일 토션 내부 표면으로부터 발생되는 배향력의 분포를 나타낸다. 도시한 바와 같이, 타원형의 단일 토션 내부 표면의 유사하지 않은 변형은, 선취된 측력이 주축을 따라 부가적인 플로우 성분을 발생시킬 수 있게 하고, 마이너 축을 따라 발생된 힘을 감소시킬 수 있다. 이에 의해, 주축을 따라 발생된 힘이 마이너 축을 따라 발생된 힘보다 강해지는 것을 볼 수 있고, 이에 의해 납작한 파티클(16)을 도시된 바와 같이 배향시킬 수 있다. 본 발명의 고유한 설계는 테이퍼된 타원형 내부 구역(c)이 원통형 내부 구역(d) 및 원형 배출 오리피스(15)에 바로 연결되어 있는 점에서 우수성이 있다. 상기 특별히 설계된 기하학은 유사성의 법칙을 성공적으로 피하기 때문에, 배향된 샘플 파티클들은 원형 배출 오리피스를 각각 빠져나갈 수 있고 계속해서 그 배향된 얼라인먼트 상태를 유지할 수 있다.
또한, 전체가 테이퍼된 단일 토션 내부 표면 요소가 층류 표면을 포함하는 것을 볼 수 있다. 층류 및 층류 표면에 의해 발생된 단일 토션 배향력을 통해, 샘플들은 반경방향으로 배향되고 유체역학적 축을 따라 정렬될 수 있다. 따라서, 배향정렬된 샘플은, 상기 샘플이 각각의 파티클 등으로 분리되고, 시스액 드롭에 의해 포위되어 분석되는 원형 출구를 빠져나갈 때의 배향정렬 상태로 유지된다. 따라서, 최종적으로 배향된 샘플은, 고유 기하학에 의해 단일 토션 배향력을 생성하고 층류를 생성하는 단일 토션 배향 내부 표면 및 샘플 주입 튜브의 경사진 첨단으로부터의 결합된 노력에 의한 것일 수 있다.
단일 토션 배향 노즐의 전체 내부 표면은 일원적이라는 것을 명심해야 한다. 상기한 바와 같이 전체 내부 표면을 테이퍼된 타원형 내부 구역(c), 원통형 내부 구역(d) 및 그 후의 구역들로 분할하는 방법은 명백한 설명을 위한 것이다.
동물 번식 산업은 점점 더 플로우 사이토미터의 원리를 이용하며 고속 플로우 사이토미터를 제공할 수 있는 이점을 이용하고 있다. 유성의 정자 표본은 플로우 사이토미터를 채용한 소팅 메카니즘에 의해 성공적으로 감별될 수 있다. 상기한 바와 같이, 상기 유일하게 설계된 단일 토션 배향 노즐로, X 및 Y 염색체를 갖는 정자를 상기한 바와 같이 보다 효율적이고 높은 퍼센티지로 소트할 수 있다. 유성의 정자 세포들은 PCT 공보 WO99/05504호(LoDo PCT)에 기재된 바와 같이 특별히 준비된 정자 화합성 버퍼에서 완충될 수 있다. 상기 완충된 정자 세포는 시스액에 의해 포위되어 시스로 포위된 정자를 형성할 수 있는 단일 토션 배향 노즐의 타원형 단일 토션 내부 표면 요소 내의 경계 위치에 주입될 수 있다. 그 후 정자를 포함한 드롭들을 드롭형성 기구로 형성하여 자유낙하영역에서 분석할 수 있다. 그 후 상기 정자를 포함한 드롭들은 챠지되고 소팅 장치에 의해 소트된 후 특별히 만들어진 정자 집합 유체를 포함하는 정자 화합성 수집 시스템에 의해 수집된다. 상기 전체 프로세스는 소팅 프로세스를 통해 생성된 정자에 대한 스트레스를 최소화할 수 있다. X 또는 Y 염색체를 가진 정자는 그 후 원하는 성의 포유동물을 수정 및 생산하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 적어도 단일 토션 배향 노즐의 내부 표면 기하학의 특이한 설계에 의해 본 발명이 다른 종래의 노즐보다 우수하게 된다. 당업자들이라면 예상할 수 있는 바와 같이, 상기 단일 토션 배향 노즐은, 단일 토션 배향 노즐의 내부 표면의 특정 영역에 대해 적절한 위치에 배치된 경사진 샘플 주입 튜브와 특별히 결합되면, 보다 만족스러운 결과를 제공할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 토션 얼라인먼트 양태에 대해 논의하였다. 두 번째로 중요한 양태는 샘플의 축방향 이동에 관한 것이다. 상기 양태는 중심축 아래쪽으로 노즐을 가로지를 때의 샘플의 이동뿐만 아니라, 그 경로동안 샘플이 받는 스트레스를 포함한다. 상기 이동은 3가지 값, 샘플에 따른 위치에 대한 거리의 3가지의 도함수로 가장 쉽게 설명될 것이다.
도함수 유사하고 보다 공통적인 개념
위치에 대한 거리의 1차 도함수 속도
위치에 대한 거리의 2차 도함수 가속도
위치에 대한 거리의 3차 도함수 가속도의 변화율
도6 내지 도9c로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 노즐은 임의 개수의 축방향 이동면, 즉 샘플이 노즐을 통과할 때 영향을 미치거나 단지 샘플을 가두는 면을 가지고 있다. 도6에 도시된 바와 같이, 축방향 이동면들은 대칭쌍일 수 있고 또한 제1 축방향 이동면(21) 및 제2 축방향 이동면(22)만큼 간단할 수도 있다. 노즐(6) 아래로 샘플이 통과하면, 상기 축방향 이동면들은 샘플 또는 샘플의 생존력에 영향을 미치도록 작용할 수 있다. 이에 의해 샘플은 제1 축방향 이동면(21)에 (보통 유체역학적으로) 종속된다. 그 후 천이 위치(23)에서 천이되어 제2 축방향 이동면(22)에 의해 영향을 받게 된다. 천이 위치(23) 이후 샘플은 제2 축방향 이동면(22)에 종속된다. 그 후 원형 배출 오리피스(15)에서 노즐을 빠져나갈 수 있다.
축방향 이동면은 임의의 형상을 가질 수 있다. 일정한 속도를 갖는 종류의 시스템에서는, 축방향 이동면은 튜브형을 가질 수 있다. 도6 및 도8에 도시된 바와 같이, 노즐(6)을 통과할 때 샘플을 가속시키는 종류의 시스템에서는, 축방향 이동 면은 도시된 원추형 표면 등의 가속면들로 구성될 수 있다. 가속면은 또한 샘플을 감속시킬 수도 있다. 가속 또는 감속을 발생시킴으로써, 샘플이 노즐(6)을 통과할 때 샘플의 속도를 변경시킬 것이다. 이에 의해, 도8에 도시된 바와 같은 노즐(6)은 제1 축가속면(24) 및 제2 축가속면(25)을 포함하는 것을 이해할 수 있다. 제1축 가속면(24)은 샘플이 제1 가속치(일정할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있음)를 경험하게 하고, 제2 축가속면(25)은 샘플이 제2 가속치를 경험하게 한다. 상기 제2 가속치는 제1 가속치와 상이할 수도 있고 상이하지 않을 수도 있다. 도8에 도시된 바와 같이, 제2 가속면(25)은 상이한 속도로 수렴하기 때문에, 상이한 가속치를 나타내기 쉽다.
즉, 가속이 있을 때마다 샘플은 스트레스를 경험할 것이다. 상기 스트레스는 샘플의 생존력과 기능에 영향을 미칠 수 있다. 긴 세포 등의 일부 샘플들에 대해서의 특이한 양태는, 속도의 변화가 있으면, 샘플의 일단으로부터 다음 단까지의 속도 경향에서 차이점이 있을 수 있다는 사실이다. 이는 정자 세포 등의 샘플을 참조하면 가장 쉽게 이해될 것이다. 생육할 수 있는 정자 세포는 헤드와 꼬리를 갖는다. 헤드가 꼬리의 가속도와 다르게 가속되거나, 헤드가 꼬리의 속도와 상이한 속도로 움직이면, 헤드로부터 꼬리까지 특이형태가 생긴다. 이 특이 형태는 세포에 스트레스를 야기시킬 수 있다. 심한 경우에는, 헤드와 꼬리가 분리될 수도 있다. 이는 샘플의 효능을 파괴시킬 수 있다. 본 발명은 이를 최소화하고 바람직하지 않은 영향을 제거하거나 감소시킬 있는 시스템을 제공한다. 이는 샘플의 길이에 걸리는 가속도 또는 속도의 변화 정도를 "낮게" 함으로써 달성될 수 있다. 당업자들이 라면 이해할 수 있는 바와 같이 "낮음"은 세포와 환경에 의존하는 상대적인 단어이다. 이는, 특정 응용에 대한 샘플의 효능의 실질적인 퍼센티지를 실현하기 위해 도시된 값으로서 이론적으로 또는 경험적으로 결정될 수 있다. 상기 가능성은 적어도 70%, 80%, 90%, 등일 수 있다. 또한, "낮은" 가속도 또는 가속도의 변화율은 긍정적으로 적용될 수 있다.
가속도 또는 속도의 변화는 축방향 이동면이 변할 때 발생할 수 있다. 상기 변화는 돌발적이거나 느릴 수 있다. 당연히 본 발명의 일부 실시예들은 후자를 선호한다. 도6을 참조하면, 축에 따른 축방향 이동면의 돌발적인 변화가 샘플에게 스트레스를 어떻게 주는 지를 알 수 있다. 제1 축방향 이동면(21)은 천이 위치(23)에서 불연속적으로 변한다. 예컨대, 제2 축방향 이동면(22)이 보석의 삽입 등의 별도의 요소에 의해 생성되면, 노즐(6)에 불연속이 존재할 수 있다. 이러한 점에서, 샘플에 거의 순간적으로 심한 속도의 변화가 발생할 수 있다. 이와 같은 불연속적인 변화는 거의 인식되지 않는 부정합에 의해 비의도적으로 존재할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 상기와 같은 양태들에 의해 샘플이 끊어지는 경향이 있다. 불연속적이지 않은 천이들을 제공함으로써, 본 발명은 그에 따라 발생되는 스트레스를 방지하거나 최소화할 수 있다. 천이는 제한된 양의 '불연속' 또는 부정합을 가짐으로써 곡선 영역에서와 같이 연속적인 천이일 수 있고, 또는 하나의 노즐(6)의 내부면을 가짐으로써 불연속 변화의 가능성을 방지할 수 있다. 상기 방법에서는, 노즐은 하나의 표면을 갖는 것이 효과적이다. 이와 같은 구성에 있어서, 노즐(6)은 최대 가속 미분을 갖는 천이를 나타내도록 설계되는 것이 바람직하다. 도8에 도시된 바와 같이, 이는 제1 축방향 이동면과 제2 축방향 이동면 사이에 도시된 바와 같은 제한된 최대 가속 미분 천이 영역(26)에서의 설계를 통해 실현될 수 있다. 또한 하나의 배출 오리피스를 사용함으로써 실현될 수도 있다. 제한된 최대 가속 미분 천이 영역은 하나의 배출 오리피스의 결과로서 존재할 수 있다.
상기한 바와 같이 위치에 대한 거리의 3가지 도함수의 관점에서, 도7a-c 및 도9a-c를 참조하면 상기 개념들이 이해될 것이다. 도시된 바와 같이, 상기 도면들은 도6 및 도8에 도시된 인접 노즐의 각 위치에서의 3가지 도함수 값들을 그래프로 나타낸 것이다. 도7a 및 도9a는 위치에 대한 거리의 1차 도함수를 나타내며, 의미는 속도와 유사하다. 도6에서의 노즐은 천이 위치(23)에서 불연속 변화를 갖기 때문에, dl/dl은 천이위치(23)에서 불연속적으로 변한다. 도8의 노즐(6)에서의 dl/dl은 불연속적으로 변하지 않는다. 상기 이유들만으로도 샘플들은 스트레스를 덜 받도록 처리될 수 있다. 도7b 및 도9b에서는, 각 노즐에 대한 d2l/dl2 값도 다르다는 것을 알 수 있다. 도7b에서는, 위치에 대한 거리의 2차 도함수 값(또는 보다 용이하게 가속도라고 표현될 수 있음)이 심한 변화의 순간을 갖는다. 또한, 도9b에는 심한 변화의 순간이 없다. 마지막으로, 위치에 대한 거리의 3차 도함수 값, 즉 d3l/dl3(또는 보다 용이하게 가속도의 변화율이라고 표현될 수 있음)도 다르다. 도7c에서는, 우선 상기 값이 포지티브로 된 후 네거티브로 된다. 도9c에 도시된 값에 있어서는, 그 값들의 부호가 절대 변하지 않으며, 제로 또는 포지티브이고 절대로 네거티브는 아니다. 노즐은 샘플에 대한 스트레스를 방지하거나 최소화하도록 설계 되어 있기 때문에 상기 각 개념들은 노즐을 이해하고 특징짓기에 편리하게 구성될 수 있다.
일부 샘플들에 대한 특징일 수 있는 다른 양태는, 상기 샘플로 경험한 바와 같이, 속도, 가속도 또는 가속도의 변화율의 지속에 대한 양태이다. 이를 샘플의 지속시간이라 한다. 플로우 사이토메트리에서는, 종종 단일 샘플들이 단일의 드롭에 배치될 필요가 있다. 이와 같은 양태에 의해, 마지막 가능 시간에 유체를 천이시키려는 기대를 유발시킨다. 이와 같은 시도를 행하는 시스템에서는, 배출점(27)의 약 100um 근방 영역, 배출점(27)으로부터 300um 이상 떨어진 영역, 배출점(27)의 근방영역, 또는 심지어 배출점(27)으로부터 떨어진 영역에 특별한 주의를 기울이는 것이 중요하다. 또한, 일부 시스템에서는, 순간적으로 샘플들이 원치 않는 값들로 되는 것이 인정될 수 있다. 따라서 노즐(6)을 통해서 또는 노즐 내의 특정 위치에서의 제한이 있을 수 있다. 적용될 수 있는 제한들중 일부는 표 1 및 표 2에 개시되어 있다.
표 1: d 2 l / dl 2 값
노즐에서 미크론당 0.16 m/sec,
노즐에서 미크론당 0.05 m/sec,
배출점의 근방에서 멀어지면 상기 값,
배출점에서 멀어지면 미크론당 0.10 m/sec,
배출점에서 멀어지면 미크론당 0.13 m/sec,
배출점 근방에서 미크론당 0.16 m/sec,
배출점 근방에서 미크론당 0.20 m/sec,
배출점 근방에서 미크론당 0.23 m/sec,
배출점으로부터 300um 이상 떨어진 거리에서 미크론당 100 ×10-3 m/sec, 배출점으로부터 300um 이상 떨어진 거리에서 미크론당 50 ×10-3 m/sec,
배출점에서 멀어지면 300um 이상의 거리에서 미크론당 25 ×10-3 m/sec,
중심축을 따라 불연속적으로 변하지 않는 값들,
대부분 상기한 값들,
다양한 위치에서의 임의의 상기 값들,
상기 값들의 임의의 조합,
표 2에 있는 임의의 값들과 상기 임의의 값들과의 임의의 조합.
표 2: d 3 l / dl 3 값
노즐에서 미크론2당 100,000 ×10-6 m/sec,
노즐에서 미크론2당 10,000 ×10-6 m/sec,
노즐에서 미크론2당 2,000 ×10-6 m/sec,
노즐에서 미크론2당 1,100 ×10-6 m/sec,
배출점의 근방에서 멀어지면 상기 값들,
배출점에서 멀어지면 미크론2당 100,000 ×10-6 m/sec,
배출점에서 멀어지면 미크론2당 50,000 ×10-6 m/sec,
배출점에서 멀어지면 미크론2당 10,000 ×10-6 m/sec,
배출점에서 멀어지면 미크론2당 5,000 ×10-6 m/sec,
배출점에서 멀어지면 미크론2당 1,000 ×10-6 m/sec,
배출점에서 멀어지면 미크론2당 300 ×10-6 m/sec,
배출점으로부터의 거리에서 미크론2당 200 ×10-6 m/sec,
배출점으로부터의 거리에서 미크론2당 100 ×10-6 m/sec,
노즐에서 불연속하게 변화하지 않는 축위치에 대한 가속치들의 변화율,
노즐에서 사인(sign)이 변화하지 않는 가속치들의 변화율, 즉 d3l/dl3 값들,
대부분 상기한 값들,
다양한 위치에서의 상기 값들의 임의의 조합,
상기의 임의의 조합,
다양한 위치에서의 임의의 상기 값들,
상기 값들의 임의의 조합,
표 1에 있는 임의의 값들과 상기 임의의 값들과의 임의의 조합.
이러한 양태를 특정 샘플들과 긍정적으로 조화시킬 때, 상기 값들은 효과적인 세포/샘플 길이로 정해질 수 있다. 상기 길이들은 이론적으로 결정되고, 실제 샘플 길이로서 측정될 수 있고, 또는 심지어 효과적인 샘플 길이로서 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 상기 긍정적 또는 조화된 작용에 의해 의도한 결과가 초래되고, 사용자들에게 확실함을 허용할 수 있다. 경험적인 결정에 있어서, 무엇보다도, 결정된 값들이 그 길이 이상의 샘플의 실제 능력을 초과하지 않도록, 즉 상기 값들이 처리된 후 샘플이 충분히 수용가능한 기능의 가능성을 유지하도록, 선택될 수 있다는 것을 명심해야 한다. 상기 방법에 있어서, 최대 가속 미분을 조정하고, 상기 최대 가속 미분을 적절히 제한하며, 샘플의 실제 능력을 초과하지 않도록 값(결정되었거나 그렇지 않음)들을 절절히 선택함으로써, 본 발명은 그 목적을 실현할 수 있다.
상기한 바와 같이, 상기 양태와 본 발명의 유체역학적 얼라인먼트 양태 사이에는 상승효과가 존재할 수 있다. 토션과 인력이 결합되면, 일부 샘플이 스트레스를 받을 수 있고, 특히 정자 세포들은 스트레스를 확실히 받을 수 있다. 따라서, 토션 유체역학적 힘들을 결합하는 가능성 및 최대 가속 미분 등의 값들, 상기 양상들은 또한 스트레스를 최소화시키기 위해 결합될 수 있다. 또한 상기 값들과 개념들을 플로우 사이토미터 설정시 스트레스를 유발시키기 쉬운 다른 파라미터들과 결합하는 양태도 고려될 수 있다. 이러한 파라미터들은 적어도 500 소트/초, 적어도 1000 소트/초, 및 적어도 1500 소트/초의 소트 속도에서의 동작을 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 파라미터들은 또한 50 psi 등에서의 동작도 포함할 수 있다. 결국, 상기로부터 알 수 있는 바와 같이, 특정 샘플들은 스트레스, 상기한 양태들, 또는 상기 값들에 특히 민감할 수 있다. 이는 정자 세포, 정자 수집 시스템, 소의 정자 세포, 말의 정자 세포, 그들의 DNA 내용에 의해 착색되고 소트된 정자 세포(유성 정자 세포), 소트된 암수 소의 정자 세포, 및 소트된 암수 말의 정자 세포에 특히 적용될 수 있다.
상기로부터 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기본적인 개념은 각종 방법으로 구체화될 수 있다. 이는, 적절한 실행을 달성하기 위한 장치뿐만 아니라 실행 기술 모두를 포함한다. 상기 응용에 있어서, 실행 기술은 기재된 각종 장치들에 의해 실현되도록 보여진 결과들의 일부로서 및 본래 사용되는 단계들로서 개시되어 있다. 상기 기술들은 단순히 의도적으로 기술된 바와 같은 장치들을 이용한 당연한 결과이다. 또한, 일부 장치들이 개시되어 있지만, 이들은 특정 방법들을 실행할 뿐만 아니라 다수의 방법들로 변경될 수 있다는 것을 이해하기 바란다. 중요하게, 상기 모두에 관해서, 상기 모든 양태는 상기 설명에 의해 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
상기 특허에 포함된 논의는 기본적 설명으로 제공되는 것이다. 독자는 구체적 논의가 가능한 모든 실시예들을 명시적으로 설명할 수는 없으며, 따라서 많은 대안들이 내재함을 이해해야 한다. 또한 본 발명은 일반적인 특징을 충분히 설명할 수도 없으며, 각각의 특징 또는 요소가 실제로 폭넓은 기능 또는 각종 대안 또는 등가 요소들을 대신할 수 있는 방법을 명백하게 보여주지 못할 수 있다. 즉, 이들은 상기 명세서에 내재적으로 포함되어 있다. 본 발명의 장치 지향적 용어로 기술되어 있고, 장치의 각 요소는 내재적으로 기능을 행한다. 장치 청구항들은 기재된 장치에 포함될 뿐만 아니라, 방법 또는 프로세스 청구항들은 본 발명 및 각 요소가 행하는 기능들을 설명하도록 포함될 수 있다. 설명과 용어는 특허 출원 절차를 통해 어느 때에도 포함될 수 있는 청구항들의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 또한, 상기 명세서는 청구범위에 제시되거나 설명에 개시되어 있는 임의의 요소들의 조합 및 치환의 가능성을 포함하도록 해석되어야 한다.
또한, 본 발명의 본질을 벗어나지 않고 각종 변경이 행해질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 변경은 또한 설명에 내재적으로 포함된다. 이들은 본 발명의 범위 내에 있다. 도시된 명백한 실시예(들), 각종 내재적인 대안의 실시예들 모두를 포함하는 광범위한 명세서, 및 광범위한 방법 또는 프로세스 등은 상기 명세서에 의해 포함되고, 상기 출원에 대한 청구항을 작성할 때 의존될 수 있다. 상기 출원은 출원자의 권리 내에서 고려되는 청구항의 기초에 대한 광범위한 심사를 구할 것이고, 독립적으로 또한 총괄 시스템으로서 본 발명의 수많은 양태들을 포괄하는 특허를 작성하도록 고안될 것이다.
또한, 본 발명의 각종 요소들과 청구항들 각각은 다양한 방식으로 실현될 수 있다. 상기 명세서는 이와 같은 변경을 포함하며, 상기 변경은 임의의 장치 실시예, 방법 또는 프로세스 실시예 중의 변경, 또는 심지어 이들 요소들의 변경을 포함하도록 이해되어야 한다. 특히, 상기 명세서가 발명의 구성 요소들에 관한 것이 고, 각 구성요소에 대한 용어는 동일한 장치의 용어 또는 방법의 용어(비록 기능 또는 결과만이 동일하다면)로서 표현될 수 있다. 각 요소 또는 기능의 설명에서는 이러한 동일하고 광범위하고 보다 근본적인 용어가 포함되도록 고려되어야 한다. 이러한 용어들은 본 발명에 부여한 명확하지 않은 넓은 범위를 명확히 하기 위해 바람직하게 대체될 수 있다. 일례로서, 모든 기능은 그 기능을 실행하기 위한 수단으로서 또는 그 기능을 유발시키는 구성요소로서 표현될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 유사하게, 개시되어 있는 각 물리적 요소는 그 물리적 요소가 이용하는 기능을 포함함을 이해하기 바란다. 마지막 관점에 의하면, 일례로서, "배향 노즐"의 설명은, "배향 요소", "배향"의 기능--명백히 논의되었는 지의 여부를 불문하고--을 포함하며, 반대로, "배향"의 실행에 대해서만 설명되어 있다면, 이러한 설명은 "배향 요소" 및 심지어 "배향을 위한 수단"의 설명도 포함함을 이해해야 한다. 이러한 변경 및 대체의 용어들은 명세서에 명백하게 포함됨을 이해하기 바란다.
상기 특허 출원에 언급된 특허, 공보, 또는 다른 참조문헌; 또는 명세서에서 설명된 다른 정보의 내용은 본 발명에 참조되어 포함되어 있지만, 이들 내용은 본기 발명(들)과 일치하지 않는 것으로 여겨지는 한, 이와 같은 내용은 명백하게 본 출원인에 의해 의도된 바로서 고려되지 않는다. 또한, 사용된 각 용어들에 대해서는, 상기 명세서에서의 용어의 이용이 이와 같은 해석과 불일치하지 않으면, 통상의 사전적 정의들은 각 용어에 대해 본 별명에 참조되어 포함된 랜덤 하우스 웹스터스 대사전, 재판에 포함된 바와 같은 모든 정의들, 대체 용어들, 및 동의어들을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
끝으로, 문맥상 달리 해석되지 않는 한, "포함한다(comprise)"("comprises" 또는 "comprising"과 같이 변형될 수 있음)라는 용어는 언급된 구성요소 또는 단계, 또는 구성요소들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 구성요소 또는 단계, 또는 구성요소들 또는 단계들의 그룹을 배제하지는 않음을 암시하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 모든 구성요소 또는 응용들의 다양한 조합 및 순열이 생성되고 제공될 수 있다. 구체적인 응용에 있어서 성능을 최적화하기 위한 모든 것이 행해질 수 있다.
특허 문헌들
Figure 112007035973794-PAT00001
다른 문헌들
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1977년 후루일러,엠.제이에 의한 히스토켐. 사이토켐. 25:781-783의 세포의 유체역학적 배향.
1998년 세이델,지.이.제이알., 헤릭코프,엘.에이., 센크,제이.엘., 도일,에스.피. 및 그린,알.디.에 의한 씨에리오제놀로지 49(1):365의 냉장되고, 냉각되지 않은, 유성의 정액과 암소의 인공수정.
1998년 존슨,엘.에이., 웰치,지.알., 및 도브린스키,제이.알.에 의한 씨에리오제놀로지. 49(1):361 개요의, 포유동물의 X 및 Y 정자의 향상된 플로우 사이토메트릭 소팅: 인공수정을 위한 고속 소팅 및 배향 no77.1e
카켈,브이.,등.,에 의한 히스토케미스트리 및 사이토케미스트리 저널, 1977, Vol.25,No7, pp 774-780의 "플로우 스루 시스템의 납작한 파티클의 유동력에 의해 생성된 균일한 측배향"
렌스, 더블유., 등.,에 의한 테크니컬 노트, 사이토메트리 33, 1998, pp 476-481의 "X 및 Y 염색체를 가진 정자의 소팅 효율을 증진시키기 위해 보다 효율적인 정자 배향을 위한 형식적인 노즐"
1998년 건세이,엠.피., 및 존슨,엘.에이.,에 의한 뉴질랜드 소사이어티 오브 애니멀 프로텍션. 3페이지의 "최근 가축들의 X 및 Y 염색체를 가진 정자의 플로우 사이토메트릭 소팅의 효율성 증진:리뷰"
렌스, 더블유.,등.,에 의한 분자에 의한 재생 및 개발, 1999, pp 50-56의 "X 및 Y 염색체를 가진 정자의 개선된 플로우 사이토메트릭 소팅: 유성의 정액의 수율에 있어서 실질적인 증가"
1994년 존슨,엘.에이., 웰치,지.알., 가너 디엘에 의한 사이토메트리 17(부록. 7):83의 2중 착색 및 죽은 세포 게이팅을 사용하여 X 및 Y 염색체를 가진 살아있는 정자 분리의 개선된 플로우 소팅 분해능.
1994년 웰치 지.알., 호욱크 디.더블유., 존슨 엘.에이.,에 의한 사이토메트리 17(부록. 7):74의 DNA에 기초하여 X 및 Y 염색체를 가진 정자의 플로우 소팅을 위한 FACS IV로의 유체 및 광학적 변경.
1986년 존슨 엘.에이., 핀켈 디.에 의한 사이토메트리 7:266-273의 포유동물 정자의 높은 분해능 DNA 분석을 위한 레이저 기반의 플로우 사이토미터의 수정.
1987년 존슨 엘.에이., 플룩 제이.피., 루크 엠.브이.에 의한 가네테 리서치 17:203-212의 개선된 준비 방법을 사용하고 Hoechst 333-42로 착색한 DNA를 위한 X 및 Y 염색체를 가진 정자의 플로우 사이토메트리.
존슨 엘.에이., 플룩 제이.피., 하욱 에이치.더블류.에 의한 바이오 리프로드 41:199-203, 1989의 토끼들의 성 선별:DNA 및 세포 소팅에 의해 분리된 X 및 Y 정자로부터의 탄생.
1999넌 12월 3일에 출원된 미국 공부 제09/454,488호의 "개선된 플로우 사이토미터 노즐 및 플로우 사이토미터 샘플 처리 방법.

Claims (69)

  1. a. 샘플이 통과하여 도입될 수 있는 주입점을 가진 샘플 주입 튜브;
    b. 하단부를 가지며 상기 샘플 주입 튜브가 내장되는 시스액(sheath fluid) 컨테이너;
    c. 상기 유체 컨테이너에 연결된 시스액 포트;
    d. 적어도 부분적으로 상기 주입점 아래에 배치되는 단일 토션 배향 노즐; 및
    e. 상기 배향 노즐 아래를 탐지하는 분석 시스템을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단일 토션 배향 노즐이 단일 토션 내부 표면 요소를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 단일 토션 내부 표면 요소는 테이퍼된, 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서,
    a. 상기 노즐내의 제1 축방향 이동면;
    b. 상기 노즐내의 제2 축방향 이동면; 및
    c. 상기 노즐내의 제1 축방향 이동면과 제2 축방향 이동면 사이에 있으며, 상기 샘플의 길이에 걸쳐 상기 샘플의 실질적인 능력을 초과하지 않도록 확실하게 제한하기 위해 상기 샘플과 정합되는 제한적인 최대 가속 미분 천이 영역을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 제1 축방향 이동면이 제1 축방향 가속면(24)을 포함하고 상기 제2 축방향 이동면이 제2 축방향 가속면(25)을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 노즐은 그의 내부 표면에 의해 야기되는 가속치를 가지며 상기 가속치는 :
    - 미크론 당 0.16m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 미크론 당 0.05m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 미크론 당 0.10m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 미크론 당 0.13m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 미크론 당 0.16m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 미크론 당 0.20m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 미크론 당 0.23m/sec 이하,
    - 배출 오리피스에서 300um보다 멀리 떨어진 거리에서 미크론 당 100 X 10-3m/sec 이하,
    - 배출 오리피스에서 300um보다 멀리 떨어진 거리에서 미크론 당 50 X 10-3m/sec 이하,
    - 배출 오리피스에서 300um보다 멀리 떨어진 거리에서 미크론 당 25 X 10-3m/sec 이하,
    - 중앙 축을 따라 불연속적으로 변화하지 않는 축방향 위치에 대한 이러한 가속치,
    - micron2 당 100,000 X 10-6m/sec 이하,
    - micron2 당 10,000 X 10-6m/sec 이하,
    - micron2 당 2,000 X 10-6m/sec 이하,
    - micron2 당 1,100 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 micron2 당 100,000 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 micron2 당 50,000 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 micron2 당 10,000 X 10-6m/sec 이 하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 micron2 당 5,000 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 micron2 당 1,000 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스 근방에서 멀어지면 micron2 당 300 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스에서 300um보다 더 떨어진 거리에서 micron2 당 200 X 10-6m/sec 이하,
    - 배출 오리피스에서 300um보다 더 떨어진 거리에서 micron2 당 100 X 10-6m/sec 이하,
    - 중앙 축을 따라 불연속적으로 변화하지 않는 축방향 위치에 대한 이러한 가속치의 변화속도, 및
    - 배출 오리피스 근방에서 떨어진 중앙 축을 따라 신호가 변화하지 않는 축방향 위치에 대한 이러한 가속치의 변화속도를 포함하는 그룹에서 선택되는 플로우 사이토미터 시스템.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 제한적인 최대 가속 미분 천이 영역은 단일 표면을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 제한적인 최대 가속 미분 천이 영역은 단일 배출 오리피스를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 노즐 아래를 탐지하는 분석 시스템은 적어도 초당 500 소트, 적어도 초당 1000 소트, 및 적어도 초당 1500소트를 포함하는 그룹에서 선택된 속도로 작동하는 플로우 사이토미터 시스템.
  10. 제 4 항에 있어서, 적어도 50psi에서 작동하는 가압 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  11. 제 9 항에 있어서, 정자 수집 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  12. 제 10 항에 있어서, 정자 수집 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  13. 제 4항, 제 7항, 제 8항, 제 9항, 또는 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  14. 제 11항 또는 제 12항에 기재된 바와 같은 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  16. 제 11항 또는 제 12항에 기재된 바와 같은 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료를 사용하여 생산된 비인간 포유동물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  18. 제 3 항에 있어서, 테이퍼된, 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소는 :
    a. 대략 상기 주입점에 배치된 타원형 경계 위치; 및
    b. 상기 타원형 경계 위치 아래로부터 연장하는 타원 감소 구역을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  19. 제 3 항에 있어서, 테이퍼된, 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소는 :
    a. 타원 증가 구역;
    b. 상기 타원 증가 구역으로부터 하류에 위치하는 타원형 경계 위치; 및
    c. 상기 타원형 경계 위치에서 연장하는 타원 감소 구역을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  20. 제 18 항에 있어서,
    a. 상기 타원 감소 구역 아래에 위치한 원추형 구역;
    b. 상기 원추형 구역 아래에 위치한 원통형 구역;
    c. 상기 원통형 구역 아래에 위치한 원형 배출 오리피스;
    d. 상기 원형 배출 오리피스가 반응하는 오실레이터; 및
    e. 상기 단일 토션 배향 노즐 아래의 플로우 사이토메트리 소팅 시스템을 더 포함하며,
    상기 원추형 구역 및 원통형 구역은 층류 표면을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  21. 제 19 항에 있어서,
    a. 상기 타원 감소 구역 아래에 위치한 원추형 구역;
    b. 상기 원추형 구역 아래에 위치한 원통형 구역;
    c. 상기 원통형 구역 아래에 위치한 원형 배출 오리피스;
    d. 상기 원형 배출 오리피스가 반응하는 오실레이터; 및
    e. 상기 단일 토션 배향 노즐 아래의 플로우 사이토메트리 소팅 시스템을 더 포함하며,
    상기 원추형 구역 및 원통형 구역은 층류 표면을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  22. 제 18 항에 있어서, 테이퍼된, 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소, 상기 원추형 구역, 및 원통형 구역이 단일화된 플로우 사이토미터 시스템.
  23. 제 20 항에 있어서, 테이퍼된, 타원형의 단일 토션 내부 표면 요소, 상기 원추형 구역, 및 원통형 구역 및 원형 배출 오리피스가 단일화된 플로우 사이토미터 시스템.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 타원형 경계 위치는 비율을 갖는 주축 및 마이너 축을 가지며, 상기 마이너 축에 대한 주축의 비율은 샘플에 대한 최적 비율을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 소망하는 타원형 경계 위치의 주축은 2.2mm이고 상기 소망하는 타원형 경계 위치의 마이너 축은 1.0mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  26. 제 19 항에 있어서, 상기 타원형 경계 위치는 주축 및 마이너 축을 가지며, 상기 소망하는 타원형 경계 위치의 주축은 2.2mm이고 상기 소망하는 타원형 경계 위치의 마이너 축은 1.0mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  27. 제 22 항에 있어서, 상기 단일 토션 배향 노즐은 하류측 방향을 가지며, 상기 타원 감소 구역은 횡단면 및 횡단면 영역을 가지며, 상기 타원 감소 구역의 횡단면은 타원 형상으로부터 원형으로 하류측으로 천이하여 변화되며, 상기 횡단면 영역은 하류측으로 점차 감소되는 플로우 사이토미터 시스템.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 타원 감소 구역의 횡단면들 각각은 주축 및 마이너 축을 가지며 상기 주축 및 마이너 축은 하류측으로 점차 동일하게 되는 플로우 사이토미터 시스템.
  29. 제 21 항에 있어서, 상기 원추형 구역은 높이가 0.3mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 원통형 구역은 높이가 0.15mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  31. 제 2 항에 있어서, 상기 단일 토션 내부 표면 요소는 점차 테이퍼된 단일 토션 내부 표면 요소를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  32. 제 31 항에 있어서, 점차 테이퍼된 단일 토션 내부 표면 요소는 23°테이퍼 된 내부 표면 요소를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  33. 제 19 항에 있어서, 점차 테이퍼된 단일 토션 내부 표면 요소는 23°테이퍼된 내부 표면 요소를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  34. 제 23 항에 있어서, 상기 단일 토션 배향 노즐은 단일 토션 세라믹 배향 노즐을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  35. 제 22 항에 있어서, 상기 단일 토션 배향 노즐은 높이 및 외경을 갖는 상부를 가지며, 상기 높이는 13mm이고 상기 외경은 6mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  36. 제 20 항에 있어서, 상기 플로우 사이토미터 시스템은 원형 배출 오리피스를 포함하며, 상기 테이퍼된 타원형 단일 토션 내부 표면 요소는 입구를 가지며, 상기 입구는 직경이 5.25mm이고 상기 원형 배출 오리피스는 직경이 0.07mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 플로우 사이토미터 시스템은 원형 배출 오리피스를 포함하며, 상기 테이퍼된 타원형 단일 토션 내부 표면 요소는 입구를 가지며, 상기 입구는 직경이 5.25mm이고 상기 원형 배출 오리피스는 직경이 0.07mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  38. 제 36 항에 있어서, 상기 원추형 구역은 내경을 갖는 상부를 가지며, 상기 원추형 구역의 상부의 내경은 0.19mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 원추형 구역은 내경을 갖는 상부를 가지며, 상기 원추형 구역의 상부의 내경은 0.19mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  40. 제 18 항에 있어서, 상기 샘플 주입 튜브는 배향 개선 샘플 주입 튜브를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 배향 개선 샘플 주입 튜브는 경사진 팁을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 경사진 팁은 원형 입구를 가지며 상기 원형 입구는 직경이 0.01mm인 플로우 사이토미터 시스템.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 테이퍼된 타원형의 내부 구역은 상기 주입점에 주축 및 마이너 축을 가지며, 상기 경사진 팁의 주축은 상기 테이퍼된 타원형의 내부 구역의 주축과 상기 주입점에서 정렬되는 플로우 사이토미터 시스템.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 단일 토션 배향 노즐은 바닥이 있으며, 상기 경사진 팁은 원형 입구를 가지며, 상기 플로우 사이토미터 시스템은 상기 단일 토션 배향 노즐의 상기 바닥에 있는 원형 배출 오리피스를 더 포함하며, 상기 주입점은 상기 단일 토션 배향 노즐의 원형 배출 오리피스에서 떨어진 위치에 위치하며 그곳에서 상기 경사진 팁의 원형 입구에서 배출된 샘플은 배향 정렬 상태를 얻기 위한 최소한의 토크를 받게되는 플로우 사이토미터 시스템.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 주입점은 원형 배출 오리피스에서 멀리 위치하며 상기 샘플이 단일 토션 배향 노즐의 원형 오리피스에서 배출될 때 그곳에서의 상기 샘플의 배향 정렬 상태가 유지되는 플로우 사이토미터 시스템.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 주입점은 상기 단일 토션 배향 노즐의 원형 배출 오리피스에서 6mm 떨어져 위치하는 플로우 사이토미터 시스템.
  47. 제 9 항에 있어서, 제 26항, 제 29항, 제30항, 제36항, 제38항 또는 제 46항 중 어느 한 항에 따라 성립되는 치수들을 가지는 플로우 사이토미터 시스템.
  48. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 정자 화합성 버퍼내의 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 분석 시스템은 플로우 사이토메트리 소팅 시스템을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  50. 제 49 항에 있어서, 정자 화합성 수집 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  51. 제 49 항에 있어서, 상기 샘플은 정자 화합성 버퍼내의 비인간 정자 세포를 포함하고 상기 비인간 정자 세포는 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택되는 플로우 사이토미터 시스템.
  52. 제 51 항에 있어서, 제 26항, 제 29항, 제 30항, 제 36항, 제 38항 또는 제 46항 중 어느 한 항에 따라 성립되는 치수들을 가지는 플로우 사이토미터 시스템.
  53. 제 1항, 제 20항, 제 23항, 제 24항, 제 26항, 제 29항, 제 30항, 제 32항, 제 39항, 제 41항, 제 44항, 제 45항, 제 51항 또는 제 52항 중 어느 한 항에 기재된 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료.
  54. 제 1항, 제 20항, 제 23항, 제 24항, 제 26항, 제 29항, 제 30항, 제 32항, 제 39항, 제 41항, 제 44항, 제 45항, 제 51항 또는 제 52항 중 어느 한 항에 기재된 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료를 이용하여 생산된 비인간 포유동물.
  55. 제 18항, 제 23항, 제 26항, 제 29항, 제 30항, 제 32항, 제 37항, 제 39항, 제 42항 또는 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 상기 노즐내의 제1 축방향 이동면;
    b. 상기 노즐내의 제2 축방향 이동면; 및
    c. 상기 노즐내의 제1 축방향 이동면과 제2 축방향 이동면 사이에 있으며, 상기 샘플의 길이에 걸쳐 상기 샘플의 실질적인 능력을 초과하지 않도록 확실하게 제한하기 위해 상기 샘플과 정합되는 제한적인 최대 가속 미분 천이 영역을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 제한적인 최대 가속 미분 천이 영역은 단일한 노즐 내부 표면을 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  57. 제 55항에 있어서, 상기 제한적인 최대 가속 미분 천이 영역은 단일 배출 오리피스를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  58. 제 55항에 있어서, 상기 노즐 아래를 탐지하는 분석 시스템은 적어도 초당 500 소트, 적어도 초당 1000 소트, 및 적어도 초당 1500소트를 포함하는 그룹에서 선택된 속도로 작동하는 플로우 사이토미터 시스템.
  59. 제 55항에 있어서, 적어도 50psi에서 작동하는 가압 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  60. 제 58 항에 있어서, 정자 수집 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  61. 제 59 항에 있어서, 정자 수집 시스템을 더 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  62. 제 55 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  63. 제 57 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  64. 제 58 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  65. 제 59 항에 있어서, 상기 샘플은 소 정자 세포 및 말 정자 세포를 포함하는 그룹에서 선택된 비인간 정자 세포를 포함하는 플로우 사이토미터 시스템.
  66. 제 60항에 기재된 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료.
  67. 제 60항에 기재된 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료.
  68. 제 60항에 기재된 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료를 이용하여 생산된 비인간 포유동물.
  69. 제 64항에 기재된 플로우 사이토미터 시스템에서 생성된 비인간 자웅 감별 정자 시료를 이용하여 생산된 비인간 포유동물.
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