MXPA02005488A - Boquilla mejorada para citometro de flujo y metodos para el manejo de muestra de citometro de flujo. - Google Patents
Boquilla mejorada para citometro de flujo y metodos para el manejo de muestra de citometro de flujo.Info
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Abstract
Una disposicion de boquilla mejorada para un citometro de flujo y metodos que acompanan que han sido inventados para una orientacion altamente eficiente y proceso de clasificacion en una muestra plana e item dedicados tales como celulas de esperma de equinos o de bovinos. La disposicion de boquilla mejorada comprende una boquilla con una geometria de superficie interior novedosa que puede acelerar gentilmente las celulas e incluso incluir un elemento de superficie interior de torsion individual tipo eliptica dentro de la boquilla, por ejemplo una boquilla de orientacion de torsion individual. El elemento de superficie interior de torsion individual tipo eliptica puede tener una superficie de flujo laminar y puede producir el paso de flujo mas simple para aplicar fuerzas minimas las cuales actuan en naturaleza de aceleracion o fuerzas hidrodinamicas de orientacion, es decir, las fuerzas de orientacion de torsion individual, para orientar una muestra plana tal como celulas de esperma animales dentro de una direccion apropiada para un analisis y proceso de clasificacion eficiente en uso clinico para investigacion y para la industria de inseminacion animal.
Description
Boquilla Mejorada para Citómetro de Flujo y Métodos para el Manejo de Muestra de Citómetro de Flujo.
Esta invención se refiere a un aparato de boquilla mejorado para una disposición de citómetro de flujo y métodos para mejorar la citometria de flujo. Específicamente, esta invención se refiere a un diseño novedoso de una geometría de superficie interior de boquilla que gentilmente maneja y orienta una muestra dentro de una dirección radial propia para analizar y clasificar eficientemente. La invención además se enfoca en disposiciones para clasificar células delicadas, especialmente células de esperma vivo.
Antecedentes de la Invención.
Los citómetros de flujo han sido, por varios años, utilizados en ambientes clínico y de investigaciones y sus aplicaciones en la industria animal tales como la industria de la reproducción de animales que ha incrementado rápidamente. Un citómetro de flujo disponible comercialmente utiliza en su boquilla una geometría de fluido cilindrica. Este tipo de disposición de citómetro de flujo tiene un paso de flujo centrante con simetría de revolución, tal como se escribe en algunas de las patentes norteamericanas (patentes US N° 5,602,039; 5,483,469; 4,660,971; 4,988,619 y 5,466,572) . Este tipo de diseño, de acuerdo con la ley de similaridad, no produce muestras orientadas radialmente. En los campos clínicos, de reproducción animal e investigación biológica, cuando las células tales como las células de esperma son clasificadas, estas pueden ser pre impregnadas con una tinta que produce fluorescencia cuando se expone a una fuente de luz de excitación. Tal como se explica en la patente norteamericana US N° 5,135,759 a nombre de Lawrence Johnson, un citórnetro de flujo que detecta la fluorescencia emitida perpendicular al eje de flujo que puede ser utilizado con alta precisión en la medición y discriminación de contenidos de ADN de las células. Sin embargo, tal como otros han notado, incluso esta precisión en medición del contenido de ADN puede ser realizado de manera efectiva únicamente cuando las células de interés son esféricas o cilindricas
(Dean y otros, 1978, Biophys. J. 23:1—5) . En tanto para las células de esperma, las cuales presentan cabezas aplanadas, la intensidad de fluorescencia observada depende en mayor parte sobre la orientación propia de las cabezas con respecto al detector. Las células de esperma emiten una señal fluorescente mas fuerte desde el borde que de la superficie plana. Por lo tanto, la intensidad de la señal fluorescente depende de la orientación de la cabeza de esperma mientras que pasa el detector. Debido al contenido de ADN que está determinado por la fluorescencia y debido a la intensidad fluorescente que es afectada por la orientación, la determinación de contenido de ADN puede ser compuesta por falta de orientación en una boquilla. Para esta razón, sin una orientación radial, el resultado de la distribución de intensidad fluorescente obtenida por una orientación aleatoria normal de las cabezas de esperma refleja tanto el contenido ADN y la orientación de la cabeza. Debido a que las células emiten una señal fluorescente mas brillante desde el borde de la cabeza (Gledhill y otros, 1976, J. Cell Physiol. 87:367-376; Pin el y otros, 1982, Citometría 7:268-273) la precisión de la determinación del contenido de ADN (el cual puede diferir por tan poco como 3.5%) es altamente afectado por la orientación de las células. Por esta razón, el citórnetro de flujo convencional tiene limitaciones experimentadas, especialmente cuando se clasifican células de esperma aplanadas u otras células no esféricas o no cilindricas y lo similar.
Adicionalmente, ciertas células pueden exhibir una funcionalidad reducida como resultado del proceso de clasificación. Esto puede ser particularmente verdadero para células tales como células de esperma de mamífero las cuales no son únicamente delicadas mecánicamente sino pueden además deteriorarse funcionalmente, (quizás visto a través de la fertilidad reducida) o incluso herirlas mortalmente como resultado de algún suceso en el proceso de distribución. Para la citometría de flujo los esfuerzos con células delicadas han sido delimitaciones significantes en las capacidades. Esto es casi preciso en el campo altamente especializado de clasificación de célula de esperma no solo debido a que las células por si mismas son delicadas, pero sino además que existe una necesidad de uso de velocidades extremadamente altas de clasificación por razones fisiológicas y prácticas. Estas dos necesidades competentes han demostrado exponer retos críticos en el campo de la clasificación de esperma para propósitos de cría comerciales. De esta manera, mientras que estos dos aspectos, manejo gentil y orientación, son quizás aplicables independientemente a una variedad de instancias, en varias instancias estas pueden actuar cinergéticainente . Tanto sus caracteres independientes y sus interrelaciones cinergéticas y quizás mas preciso en el campo de la clasificación de esperma comercial. Interesantemente, esta sinergia e interrelación potencial aparece como no haber sido completamente apreciada previo a la presente invención.
Visto en aislamiento, el aspecto de la orientación propia de una muestra que contiene partículas o células que de esta manera pueden ser vistas que juegan un rol importante en la intensidad de la señal del citómetro de flujo y cualidad en la eficiencia de clasificación. Los esfuerzos para orientar hidrodinámicamente la muestra han sido realizados y el uso de la orientación hidrodinámica de la muestra en flujo a través de disposiciones de citómetros de flujo que han sido explorados en las últimas décadas
(Fulwyler, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25:781—783; Kachel y otros, 1977, J . Histochem. Cytochem. 25:774—780; Dean y otros, mencionados anteriormente) .
La orientación hidrodinámica de la muestra dentro del citómetro de flujo puede mejorar la medición precisa del contenido relativo de ADN teñido y además puede proveer una medición potencialmente útil de parámetros morfológicos tales como el espesor de la célula y el grado de curvatura de la cara plana. Para algunas aplicaciones, esta orientación es derecha. Sin embargo, cuando las células delicadas (tales como las células de esperma) u otras partículas son incorporadas, sin embargo, una técnica más gentil ha sido necesaria. Por ejemplo, un tubo de inyección de muestra con una punta de forma acuñada o biselada ha sido utilizado en algunos trabajos para incrementar el porcentaje de células orientadas (Dean y otros, 1978, Biophys. J. 23:1-5; Fulwyler, 1977, J. ffistochem. Cytochem. 25:781—783; Jonson y otros, 1986, citometría 7:268—273; Pinkel y otros, 1982 citometria 3:1-9; Welch y otros, 1994, citometría 17 (suplemento 7):74). Debido a la punta de forma acuñada del tubo de inyección de muestra, la corriente de muestra tiende a ser dirigida dentro de una banda delgada por medio del fluido de envainado opuesto a la corriente cilindrica. Las células con la cabeza plana tales como el esperma de mamíferos, generalmente encuentran el fluido de envainado a una velocidad mayor (100 mm/s) , y fueron rotados para que su lado plano estuviese en el plano de la banda. Desafortunadamente, la separación del evento de orientación y el evento de análisis ultimo puede causar menos resultados óptimos. Por lo tanto, esta técnica no se ha mostrado prácticamente tan ventajosa como se desea.
En una aplicación diferente, Kachel y sus colegas (Kachel y otros, mencionados anteriormente) demostraron la ley de similaridad y discutieron tres tipos de pasos de flujo que influenciaron las partículas en movimiento. Esto dio como resultado que, para realizar una orientación radial uniforme con las fuerzas hidrodinámicas para partículas planas tales como las células rojas de sangre aplanadas, el paso de flujo preferido puede ser aquel en el que _ se pueda obtener una construcción unilateral. El paso de flujo mas simple que exhibe una construcción unilateral incrementada en el uso con un flujo a través de un sistema el cual puede ser fabricado a partir de un tubo con una sección transversal elipsoidal, y puede además terminar en una salida elipsoidal. En una disposición, el eje longitudinal de esta salida elipsoidal puede estar ubicado en un ángulo recto al eje longitudinal en la sección transversal del tubo de construcción—elíptica. Sin embargo, dado que la salida elíptica no produce el tipo de gotas deseado para un clasificador de célula de citómetro de flujo de alta velocidad, esta disposición no fue la intención de ser utilizada en, y aparentemente no ha sido aplicada a, un citómetro de flujo.
En un trabajo similar, Rens y sus colegas diseñaron una punta de boquilla que presenta un interior elíptico y un orificio de salida elíptico (Rens y otros, 1988, publicación PCT N° PCT/US98/15403; Rens y otros, 1998, citometría 33:476-481; Rens y otros, 1999 Reproducción Molecular DEV. 52:50— 56) . Este interior contenía una primer zona elipsoidal y una segunda zona elipsoidal que fueron separadas por una zona transitoria. Todas las zonas presentaban un eje largo y un eje corto. El eje largo de la segunda zona elipsoidal fue orientado a 90° con respecto a la primer zona elipsoidal. Un orificio cilindrico, perforado con una piedra preciosa, fue ubicado en el extremo del orificio de salida elipsoidal y sirvió como la salida final. Este dispositivo solucionó parcialmente el problema de la orientación aleatoria tal como existía en un cítómetro de flujo convencional y pudo orientar alrededor del 60% del total de las células de esperma aplanadas de un jabalí a través del citómetro de flujo. Sin embargo cuando la fuerza hidrodinámica en un paso de flujo fue tomada en consideración, el paso de las partículas planas a través de la boquilla diseñada por Rens y sus colegas recibieron tensiones innecesarias. Para las células delicadas, y especialmente para quizás las células de esperma mas delicadas tales como las células de esperma de bovinos o de equinos, esté esfuerzo simplemente no aparenta, mejorar la eficiencia deseada ya sea en la orientación o en la viabilidad de las células.
De esta manera existe una necesidad insatisfecha para la invención mientras que las artes de implementación necesaria y elementos han estado disponiblemente hace mucho tiempo. Esta necesidad concierne a la disponibilidad del manejo gentil y quizás a la orientación de partículas o células a ser analizado, la habilidad para analizar propiamente y orientar eficientemente, y la habilidad para minimizar la situación de tensión potencial que es causada por el citómetro de flujo para las partículas o células. Posteriormente, mientras que existen los problemas en los citómetros de flujos convencionales, una completa apreciación de que un problema existió y que el problema fue por lo tacto no apreciado por aquellos entendidos en el arte. Los intentos sustanciales por aquellos entendidos en el arte para completar la necesidad o arreglárselas con las dificultades que han sido realizadas pero no han sido completamente exitosas principalmente debido a una falla en el entendimiento a como fueron los problemas y quizás como estos se ínterrelacionaron. Algunos trabajos realizados por aquellos entendidos en el arte incluso derivaron en patentes las cuales aparentemente tocaron el problema pero en efecto, estos tendían en algunos aspectos una divulgación alejada de la dirección técnica en la cual la presente invención se dirige.
Compendio de la invención
Es por lo tanto un objeto de la invención presentar una geometría de superficie interior de boquilla mejorada que produce un paso de flujo simple para aplicar fuerzas hidrodinámicas necesarias para acelerar y quizás orientar una muestra dentro de una dirección propia para propósitos de análisis y clasificación eficiente. Esta geometría de superficie interior de boquilla mejorada puede comprender ya sea uno o dos de: una característica de fuerza aceleradora configurada apropiadamente y/o un elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptica dentro de una boquilla de orientación de torsión individual que produce la fuerza hidrodinámica especial, es decir, las fuerzas de orientación de torsión individual.
Tal como lo muestra ahora la presente invención, los problemas con la tensión no deseada en las células pueden ser vistos en al menos una parte debido a ya sea la fuerzas de manejo inapropiada, específicamente: las fuerzas de aceleración inapropiadas o la existencia de una segunda fuerza de torsión creada por la segunda zona elipsoidal. En tanto a las fuerzas de aceleración aplicadas, los dispositivos utilizan generalmente transiciones internas abruptas a las boquillas y demás, causando una aceleración extrema en cortas distancias. Con respecto al aspecto de orientación, por ejemplo, las soluciones tales como aquella provista por Ren (mencionada anteriormente) mostró, que luego de que las células hayan sido orientadas por una primera fuerza de torsión creada por una primer zona elipsoidal, una fuerza adicional (quizás un pliegue) fue aplicada. Específicamente, las partículas planas se encontraron en una posición orientada luego de que éstas fueran orientadas a partir de una posición aleatoria por medio de la primer zona elipsoidal. Estas estaban listas para salir en las posiciones orientadas. En este memento, sin embargo, los dispositivos de Rens y otros plegaban innecesariamente estas partículas orientadas en la parte plena en una segunda vez por medio de las fuerzas hidrodinámicas creadas por la segunda zona elipsoidal. Tal como muestra la presente invención estos diseños no son completamente eficientes en un citómetro de flujo de alta velocidad. Cuando las células de esperma plana con cola son orientadas a través de este tipo de boquilla, además de su ineficiencia, la geometría de este tipo de boquilla aparentemente impactan dos veces las fuerzas de torsión. Esto aparece como una fuerza o alto daño innecesario a las células de espermatozoide de cola larga previo a que salgan de la boquilla. Además, en algunos diseños en donde el orificio es realizado por una piedra preciosa que es separada del interior principal, un flujo laminar suave puede además ser afectado en algún grado. Esto puede causar casi la aceleración instantánea y por lo tanto puede tensionar innecesariamente las células y puede afectar la orientación de las células de esperma previamente orientadas. Por lo tanto, los métodos de Rens y los trabajos más recientes de otros, divulgan actualmente algo distinto de lo más eficiente, menos acelerado y menos torsional y una superficie interior laminar suave de una realización de la presente invención.
Es otro objeto diseñar la geometría de superficie interior de boquilla más simple que provee una superficie de flujo laminar y que al mismo momento reduzca la distorsión de la muestra, especialmente en células de esperma .
Aún otro objeto es el presentar una disposición la cual pueda medir más rápidamente y más precisamente y ordenar la muestra, especialmente células de esperma delicadas en el uso de investigación y uso clínico y en la industria de inseminación animal .
Un objeto posterior es proveer métodos para mejorar la orientación y eficiencia de clasificación de la muestra, especialmente las células de esperma en la citometría de flujo para la investigación y uso clínico y la industria de inseminación animal .
Naturalmente, los objetos posteriores de la invención son divulgados a través de otras áreas de la memoria y las reivindicaciones .
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una vista en corte de una porción de un citómetro de flujo que muestra un contenedor de fluido de envainado, un tubo de inyección de muestra y una boquilla de la presente invención. Esta figura muestra además la ubicación con respecto al tubo de muestra dentro de la boquilla.
La figura 2 es un aviste tridimensional de una punta de boquilla y su posición relativa con el contenedor de fluido de envainado (aquí llamado el cuerpo de la boquilla) con un tubo de inyección de muestra y una punta de boquilla. La figura 2A es un dibujo esquemático de un tubo de inyección de muestra que tiene una punta biselada y una boca circular.
Las figuras 3A, 3B y 3C son dibujos esquemáticos de una de las presentes realizaciones de la boquilla. La figura 3A es una vista tridimensional de la punta de boquilla que muestra la primer zona de incrementación elíptica, la ubicación de demarcación de elipse deseada, la zona de reducción elíptica, la zona cónica, la zona cilindrica, y el orificio de salida circular. La figura 3B es una vista en corte esquemática que muestra la superficie interior achaflanada o inclinada de la boquilla en un diseño uniforme.
La figura 3C es una vista en corte de la zona cilindrica y del orificio de salida circular.
La figura 4A es una vista inferior de la región de la punta de boquilla que muestra específicamente el orificio de salida circular. La figura 4B es una vista superior del diseño interior de la boquilla que muestra la boca circular más grande, la ubicación de demarcación de elipse deseada, la boca circular mayor de la zona cónica y la boca circular menor de la zona cilindrica. El diámetro de la boca menor es además el diámetro del orificio de salida circular.
La figura 5 ilustra como la boquilla de orientación de torsión individual trabaja en la orientación de partículas planas.
La figura 6 es un diagrame esquemático de un ejemplo de una boquilla que presenta superficies de movimiento axial tal como existen en el arte previo.
La figura 7a, b y c son esquemas de la velocidad axial teórica, la aceleración y la velocidad de cambio de movimiento de aceleración con respecto a la ubicación tal como existen para una boquilla ilustrada esquemáticamente en la figura 6.
La figura 8 es un diagrama esquemático de un ejemplo de un boquilla que presenta superficies de movimiento axial de acuerdo con una realización de la presente invención.
Las figuras 9a, 9b y 9c son esquemas de la velocidad axial teórica, aceleración y velocidad de cambio de movimiento de aceleración con respecto a la ubicación tal como puede existir para una boquilla tal como la que se ilustre esquemáticamente en la figura 8.
Descripción Detallada de las Realizaciones Preferidas
Tal como puede verse de las ilustraciones y manteniéndose con los objetos de la presente invención, los conceptos básicos de la presente invención pueden ser implementados de diferentes maneras. Haciendo referencia a la figura 1, se muestra una porción de la disposición de citómetro de flujo en donde una muestra es procesada dentro de gotas individuales previo a ser analizada y clasificada. Tal como será bien entendido por aquellos con un conocimiento mediano en le arte a partir de las vistas en corte esquemáticas, un contenedor de fluido de envainado (1) puede contener algo de fluido de envainado (2) importado a través del puerto o acceso de fluido de envainado (no ilustrado) . Una muestra de disposición de inyección comprende un tubo de inyección de muestra (3) conectado a una reserva de muestra (no ilustrado) . La disposición de inyección de muestra generalmente actúa para proveer el flujo apropiado de algún material de muestra a una disposición de boquilla. El contenedor de fluido de envainado al mismo momento introduce un fluido de envainado dentro de la disposición de boquilla. La muestra puede ser rodeada por fluido de envainado para formar un fluido que contiene muestra y puede de esta manera salir de la disposición de boquilla a través del mecanismo de formación de gotas a través del cual el fluido que contiene la muestra forma pequeñas gotas . Éstas pequeñas gotas pueden pasar a través del área de caída libre a una alta velocidad por sobre alrededor de 20 metros por segundo por medio de la combinación de oscilación de un oscilador y alta presión a partir de la disposición de citómetro de flujo. Subsecuentemente, estas pequeñas gotas, por ejemplo, las gotas que contiene muestra, pueden ser analizadas por un sistema analítico (no ilustrado) en el área de caída libre.
Si las células vivas tales como las células de esperma plena son introducidas como el material de muestra, éstas pueden ser teñidas con una o más tinturas fluorescentes. Las células de espermas pueden ser transportadas en una sola fila en la corriente de fluido de envainado que pasa al sistema analítico (no ilustrado) . El sistema analítico puede incluir un láser enfocado cuya longitud de -.onda es ajustada para excitar una tinture fluorescente que puede estar o no presente . La señal de fluorescencia recolectada desde cada célula puede esta manera ser censada a través de un sistema de detección (no ilustrado) . Entonces, este proceso puede incluir un proceso de clasificación por medio de un dispositivo clasificador o similar dependiendo de la propiedad física individual tal como el contenido de ADN de cada célula introducida a través de la aplicación diferencial de carga de varías gotas tal como aquellos entendidos en el arte fácilmente pueden comprender. Subsecuentemente, cada célula es clasificada dependiendo de su carga. Tal como se menciona anteriormente, estos aspectos generales de citometría de flujo son bien conocidos y son discutidos en las referencias mencionadas anteriormente (incorporadas a la presente a modo de referencia) Con respecto al manejo de la muestra para las funciones del citómetro de flujo y la viabilidad de las muestras, dos aspectos pueden ser importantes: la alineación de torsión y el movimiento axial de la muestra. Cada una de éstas son discutidas separadamente, sin embargo debe entenderse que éstas no son mutuamente exclusivas y pueden tener efectos cinergéticamente. Esto es especialmente cierto en cuanto se refiere a la viabilidad de las muestras, es decir, la habilidad de la muestra para realizar sus funciones con eficacia esperada y no estar afectados sustancialmente por medio del proceso de citometría de flujo. El primero de esto dos aspectos, es decir la alineación por torsión, será discutido primeramente.
Los aspectos ilustrados en la figura 1 pueden además ser vistos a través de la ilustración tridimensional en la figura 2. Esta vista tridimensional muestra una porción del contenedor de fluido de envainado 2, el tubo de inyección de muestra (3) y la disposición de boquilla que presenta una boquilla (6) . El tubo de inyección de muestra 3 tal como se ilustre en la figura 2 en detalle, tiene un apunta biselada (4) y una boca circular (5) . La boquilla especialmente diseñada (6) es el término de una boquilla de orientación de torsión individual en la presente invención y será presentada en detalle a continuación.
Tal como se conoce, el tubo de inyección de muestra sirve para introducir el material de muestra en el flujo delgado dentro de la disposición de boquilla en donde la muestra es rodeada por el fluido de envainado. Tal como es bien sabido por aquellos que presentan un mediano conocimiento en el arte, el tubo de inyección de muestra convencional generalmente tiene una forma cilindrica. Sin embargo, dado que este tipo de tubo de inyección de muestra puede no ayudar a controlar la orientación de la muestra, la muestra que sale de este tipo de tubo de inyección de muestra generalmente tiene un estado no orientado. En las últimas décadas fue producido un tubo de inyección de muestra modificada (Dean y otros mencionada anteriormente; Fulwyler 1977, mencionado anteriormente; Johnson y otros, 1986 Cyntometría 7: 268—273; Pinkel y otros, 1982, mencionado más arriba) . Este tubo de inyección de muestra modificado puede tener una punta biselada y puede ayudar en algún grado, a orientar el material de muestra que viene de esta punta. Debido a la forma biselada de la punta del tubo de inyección de muestra, la corriente de muestra puede ser dirigida dentro de una banda delgada por medio del fluido de envainado. El resultado en el cambio de la condición de flujo puede realizar una orientación correspondiente al material de muestra.
En el presente diseño, basado sobre el concepto del mecanismo de la punta biselada, el tubo de inyección de muestra con el tipo de punta biselada ilustrada es mantenido pero el tamaño interior específico es único. Más importante aún, la ubicación de la punta biselada dentro de la boquilla es especialmente establecida. Tal como se ilustra en las figuras 2A, el tubo de inyección de muestra (3) , referido aquí como un tubo de inyección de muestra de orientación mejorada comprende una punta biselada 4 y una boca circular 5 en su sección transversal. La punta biselada es más o menos de forma rectangular en su sección transversal. Esta tiene un eje largo y un eje corto. Mientras que naturalmente esto puede ser variado para adecuar la aplicación o las partículas a ser configuradas, en una realización preferida el ángulo de la boca biselada es de alrededor de 4°, el diámetro exterior del tubo es de alrededor de 1.5mm y el diámetro de la boca circular es de alrededor de 0.25mm.
Hasta ahora se ha discutido únicamente el rol que juega el tubo de inyección de muestra en la orientación de la muestra. Se puede entender que sin embargo tal como aquellos entendidos en el arte pueden entender, la fuerzas de orientación provistas de esta manera son muy limitadas.
Por ejemplo, esta sola característica ha solucionado el problema de orientación, por los trabajos posteriores de aquí en más sobre el alto porcentaje de orientación no han sido necesarios. En cambio, tal como se han dado cuenta aquellos entendidos en el arte, para obtener una alta orientación de muestra especialmente cuando la muestra contiene células planas no esféricas, o delicadas, tales como células de esperma para un propósito de inseminación o lo similar, fue necesario realizar un trabajo adicional. Tal como muestra la presente invención, la mayoría de las fuerzas de orientación deben provenir de la superficie interior de la boquilla. De esta manera, la boquilla sirve como un elemento fundamental para la producción de fuerzas de orientación funcionales y apropiadamente fuertes aunque gentiles.
Con esta idea puede observarse como el presente diseño difiere de aquel del arte previo. Tal como puede verse de las figuras 1 y 2, y como se ha referido particularmente en las figuras 3A, 3B y 3C, la disposición de citómetro de flujo comprende el diseño único de boquilla de orientación de torsión individual (6) . La boquilla de torsión individual (6) puede ser realizada de algún material selectivo tal como un material cerámico y lo similar. Aunque el tamaño de la boquilla, por ejemplo la altura, el diámetro, etc., puede variar, debe preferentemente encajar dentro de un citómetro de flujo convencional y al mismo momento proveer las fuerzas de orientación deseada tal como se describe en la presenta invención. Posteriormente, aunque en una realización preferida la boquilla está realizada en una única pieza, para el propósito de una mejor ilustración, puede ser dividido en dos porciones por ejemplo una porción cilindrica superior (a) y una porción cónica inferior (b) . En una de las realizaciones preferidas, la altura de la porción cilindrica superior (a) puede ser de alrededor de 8mm y el diámetro exterior puede ser de alrededor de 6mm. La altura de la porción cónica (b) puede ser de alrededor de 4 , 5mm y el diámetro exterior del orificio puede ser menor que alrededor de lmm. De esta manera, la altura total de la boquilla puede ser alrededor de 12,5mm. El uso de una boquilla unitaria además ayuda en la fijación total de la orientación y los factores de movimiento axial en una disposición óptima. Puede de esta manera incrementarse el uso, la repetición y otros usos prácticos.
La figura 3A es una vista tridimensional y la figuras
3B y C son vistas en corte transversal esquemático de una boquilla de orientación de torsión individual de la presente invención. Tal como puede ser mejor visto en las figuras 3A y 3B, la boquilla de orientación de torsión individual (6) , comprende un volumen de boquilla encerrado por medio de un elemento de superficie interior. El elemento de superficie interior de la boquilla de orientación de torsión individual constituye su geometría interior. El elemento de- la superficie interior puede comprender un elemento de superficie interior de torsión individual que presenta una superficie interior de torsión individual . Este elemento de superficie interior de torsión individual tiene la habilidad para generar fuerzas hidrodinámicas de torsión individual que presentan un eje hidrodinámico cuando un flujo que contiene la muestra pasa a través del mismo. El elemento de superficie interior de torsión individual además tiene una característica de aceleración de velocidad que puede producir una velocidad de aceleración sobre la muestra. Cuando la muestra pasa a través de este elemento de superficie interior de torsión individual, la muestra puede estar orientada por medio de las fuerzas hidrodinámicas de torsión individual y alineadas radialmente con respecto al eje hidrodinámico. También puede ser acelerado para salir para el análisis subsecuente y el proceso de clasificación. Estas fuerzas hidrodinámicas de torsión individual especial pueden ser referidas como fuerzas de orientación de torsión simple.
La forma total de la superficie interior de torsión individual es generalmente inclinada corriente abajo para que pueda ser referida como un elemento de superficie interior de torsión individual gradualmente inclinado. A partir de la vista de sección longitudinal tal como se ilustra en la figura 3B, este elemento de superficie interior de torsión individual, inclinado gradualmente que puede ser visto en dos dimensiones tal como una forma de ventilador que se abre desde la parte inferior hasta la parte superior. El grado de la inclinación del elemento de superficie interior de torsión individual inclinado gradualmente puede variar pero preferentemente es alrededor de 23° desde la parte inferior de la forma de tipo ventilador hacia la parte superior para que la fuerza de aceleración deseada pueda ser generada para actuar sobre la muestra. Además, el elemento de superficie interior de torsión individual inclinado gradualmente puede ser dividido en unas pocas zonas basadas sobre su geometría interior y cada zona puede tener una superficie de flujo laminar. Básicamente, el elemento de superficie interior de torsión individual inclinado gradualmente puede estar realizado de una zona interior tipo elíptica inclinada (c) que presenta una superficie interior de torsión individual tipo elíptica y una zona interior cilindrica (d) en la vista tridimensional. Esta superficie interior de torsión individual de tipo elíptica puede incluir diferentes formas en sus secciones transversales. Por ejemplo, a pesar de ser de forma elíptica, puede ser de forma ovalada o incluso similar a una forma rectangular. Cualquiera de estas formas pueden suceder en cualquier ubicación a lo largo de la superficie interior de torsión individual tipo elíptica justo por debajo y por encima de la ubicación de demarcación en la cual su elipticidad, ovalidad o incluso rectangularidad alcanzan un grado máximo o deseado. Tal como pueden entenderse cada una de estas formas son referidas para ser abarcadas por medio del término tipo elíptico incluso aunque un elipse matemático verdadero no este presente en una sección transversal dada. Similarmente, en donde se divulga el término circular no necesariamente debe ser un circulo perfecto o incluso un circulo en si . Nuevamente puede ser preferido que sea circular, sin embargo, otras formas pueden ser equivalentes mientras que la función apropiada este presente.
Por supuesto la zona interior tipo elíptica inclinada puede presentar un eje mayor y un eje menor en su sección transversal y la elipticidad puede ser controlada suavemente. De esta manera dependiendo sobre su variación de elipticidad, esta zona interior tipo elíptica inclinada puede estar dividida dentro de las siguientes zonas desde abajo, corriente abajo hacia arriba:
1) una zona de incrementación elíptica (8) con una boca circular (7) en la parte superior en donde el cociente del eje mayor sobre el eje menor en la sección transversal es incrementado;
2) una zona de demarcación de elipse deseado (9) corriente abajo de la zona de incremento de elipticidad (8) en la cual el eje mayor sobre el eje menor alcanza un cociente óptimo que puede ser un cociente máximo para una muestra tal como puede ser mejor ilustrado en la figura 3A; y
3) una zona de reducción de elipticidad (10) en donde el cociente del eje mayor sobre el eje menor en la sección transversal es reducido .
Basado sobre la geometría descrita anteriormente las dos formas dimensionales de la vista de corte transversal desde la parte superior hacia la parte inferior de la zona interior tipo elíptica inclinada puede sufrir cambios de transición desde un circulo en la región de boca hasta formas tipo elípticas (las cuales pueden incluso ser elipses actuales) con una elipticidad que incrementa gradualmente (esto es el cociente del eje mayor al eje menor sin importar la forma incluida) , al elipse deseado o lo similar, a las formas tipo elíptica con una elipticidad que se reduce gradualmente, y finalmente a un circulo nuevamente en la región en donde la zona interior tipo elíptica inclinada se une a la zona cilindrica. Dado que toda la zona interior tipo elíptica es inclinada, las áreas de sección transversal de la total zona interior tipo elíptica pueden ser gradualmente menores desde la parte superior hacia la parte inferior. La elipticidad puede de esta manera ser ajustada por medio del cambio del cociente del eje mayor sobre el eje menor. El cociente entre el eje mayor sobre el eje menor puede cambiar gradualmente desde la parte superior- desde 1 a más de 1 o quizás incluso un cociente óptimo para la muestra. El cociente óptimo puede ser un cociente máximo. Subsecuentemente, el cociente puede cambiarse gradualmente nuevamente desde el cociente máximo a uno menor que el cociente máximo y luego a uno. Tal como aquellos entendidos en el arte bien conocen, cuando el cociente se vuelve 1 la forma en le sección transversal puede ser un circulo. El cociente máximo tal como se menciona anteriormente puede variar en algún grado. En una realización preferida, la longitud del eje mayor puede ser de 2.2mm y la longitud del eje menor puede ser alrededor de lmm. De esta manera, el cociente máximo está diseñado para se alrededor de 2.2 para esta realización preferida. Naturalmente puede variar basado en la aplicación o lo similar.
En una realización, la ubicación de demarcación de elipse deseado (9) corriente abajo de la zona de aumento de elipticidad (8) dentro de la boquilla que puede ser ubicada en donde la punta biselada del tubo de inyección de muestra es ubicada. Esta además puede ser ubicada en donde la muestra de la banda de flujo recibe las fuerzas de orientación deseadas que son completamente funcionales en donde la muestra es extorsionada mínimamente por medio de las fuerzas de orientación deseadas o fuerzas de torque, en donde el tiempo requerido para la célula para que esta salga es mínimo o en donde la muestra luego de salir del orificio de la boquilla puede todavía mantener bien su estado orientado para un análisis subsecuente y clasificación que puedan ser conducidos eficientemente. Esta ubicación puede ser referida como punto de inyección. Para el citórnetro de flujo de clasificación de alta velocidad del estado del arte ahora operado, esta ubicación o punto de inyección basado en el descubrimiento de la presente invención, puede ser alrededor de 6 mm desde el orificio de salida. De esta manera, sí una distancia de orientación mantenida es definida como la distancia que indica hasta donde una partícula de muestra puede mantener su estado orientado desde el punto en el cual es orientado a un punto en el cual pierde estáticamente su grado de estado orientado, en la distancia desde la punta biselada del tubo de inyección de muestra del orificio de salida de la boquilla y la distancia desde el orificio de salida a la inserción en donde el rayo láser o censor a lo largo del paso de flujo en la zona de caída libre cae dentro de esta distancia de orientación mantenida. Por ejemplo, puede ser dentro de los 10 mm para la punta biselada a la intersección con el rayo láser, tal como se describe por Dean y sus colegas (Dean y otros, mencionado anteriormente) . Por lo tanto, en cualquier partícula demuestra que está orientada, sin importar en cual punto dentro de la instancia desde la punta biselada a la intersección con el rayo láser o censor, puede mantener su estado de orientación previo a ser analizado. Teóricamente, esta distancia de orientación mantenida puede incluso ser mayor que 10 mm cuando un citómetro de flujo está equipado con la boquilla diseñada especialmente de la presente invención y el tubo de inyección de muestra con la punta biselada. Posteriormente para los beneficios de la completa orientación, el eje largo de la punta biselada puede ser alineado con el eje mayor de la ubicación de demarcación de elipse deseado y el eje corto se encuentra con el eje menor tal como se ilustra.
En corriente abajo desde la zona interior tipo elíptica inclinada (c) puede encontrarse una zona interior cilindrica (d) . Esta zona interior cilindrica (d) tal como se puede apreciar en las figuras 3A, IB y 3C puede ser posteriormente dividido en una zona cónica (12) que es inclinada y una zona cilindrica (14) . La zona cónica (12) tiene una boca circular mayor (11) y la parte superior que se une con la zona interior tipo elíptica inclinada (C) y un orificio circular menor (13) en conexión con la zona cilindrica (14) . La boca circular mayor (11) en la parte superior de la zona cónica puede ser alrededor de 0.19 mm en diámetro y la abertura circular puede ser de alrededor de 0.07 mm en una realización preferida. La altura de la zona cónica puede ser alrededor de 0.3 mm. La zona cilindrica (14) puede además presentar una boca con __el mismo diámetro tal como la abertura pequeña de la zona cónica a través de su orificio de salida circular (15) y puede ser alrededor de 0.15 mm en altura.
La figura 4A ilustra una vista inferior de la boquilla de orientación de torsión individual que muestra el orificio circular. El orificio circular puede ser lo suficientemente pequeño para que pequeñas gotas que contienen las partículas de muestra puedan ser formadas. El diámetro en una de las realizaciones preferidas puede ser alrededor de 0.07 mm. La figura 4B muestra una vista superior de la boquilla de orientación de torsión individual. Tal como puede observarse claramente, la boca puede estar en una forma circular con un diámetro de alrededor de 5.25 mm.
Haciendo referencia a la figura 5, puede observarse como sucede la orientación. Tal como puede notarse, esta figura es un dibujo modificado de Kachel y sus colegas (figura 3, de Kachel y otros 1977 J. Histochem. Cytochexn. 25:774—780). Este dibujo, una sección transversal alrededor de la ubicación de demarcación de elipse deseada 9, ilustra principalmente la distribución de las fuerzas de orientación generadas desde la superficie interior de torsión individual tipo elíptica. Tal como se ilustra, la transformación desigual de la superficie interior de torsión individual tipo elíptica puede causar fuerzas laterales preferenciales que generan componentes de flujo adicionales a lo largo del eje mayor y puede reducir las fuerzas generadas a lo largo del eje menor. De esta manera, las fuerzas generadas a lo largo del eje mayor pueden ser vistas como mas fuertes que las fuerzas generadas a lo largo del eje menor para, de esta manera, orientar una partícula placa 16 tal como se ilustra. El diseño único de la presente invención muestra su superioridad en que la zona interior tipo elíptica inclinada (c) esta conectada directamente a la zona interior cilindrica (d) y el orificio de salida circular 15. Esta geometría diseñada especialmente evita satisfactoriamente la ley de similaridad y por lo tanto las partículas de muestra que han sido orientadas pueden ser capaces de salir individualmente al orificio de salida circular y todavía mantener su estado alineado de orientación. En adición a lo anterior, el elemento de superficie interior de torsión individual inclinado en su totalidad puede ser visto comprendiendo una superficie de flujo laminar. A través de un flujo laminar y las fuerzas de orientación de torsión individual generadas por la superficie de flujo laminar, la muestra puede ser radialmente orientada y alineada a lo largo del eje hidrodinámico. Esta muestra alineada orientativamente es de esta manera mantenida en el estado alineado de orientación cuando sale del orificio de salida circular en donde la muestra es dividida en partículas individuales y lo similar, y es rodeada por una gota de fluido de envainado, y es analizada. Por lo tanto, la muestra finalmente orientada puede ser debido a los esfuerzos combinados desde la punta biselada del tubo de inyección de muestra y la superficie interior de orientación de torsión individual que, debido a su única geometría, genera fuerzas de orientación de torsión individuales y produce flujo laminar.
Se ha mencionado que la superficie interior total de la boquilla de orientación de torsión individual puede ser unitaria. La manera de dividir la superficie interior total dentro de la zona interior tipo elíptica inclinada (c) es la zona interior cilindrica (d) y sus propias zonas subsecuentes tal como fue descrito anteriormente es solamente para propósito de una explicación mas clara.
La industria de cría de animales ha sido incrementada tomando en ventaja los principios de la citometría de flujo y utilizando los beneficios que un citómetro en flujo de alta velocidad puede proveer. Los especímenes de esperma sexuados pueden ahora ser discriminados satisfactoriamente por medio del mecanismo de clasificación que utiliza el citómetro de flujo. Con esta boquilla de orientación de torsión individual diseñada exclusivamente, los espermas que contienen cromosomas Y y X pueden ser clasificados mas eficientemente y a un mayor porcentaje tal como fue descrito anteriormente. Las células de esperma sexuadas pueden ser divididas en nuestro bifurcador compatible de espermas preparados especialmente tal como se describe en la publicación PCT N° WO 99/05504 (LoDo PCT) . Las células de esperma divididas pueden ser inyectadas en la ubicación de demarcación dentro del elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptica de la boquilla de orientación de torsión individual en donde estas pueden ser rodeadas por el fluido de envainado para formar un esperma rodeado de vaina. Subsecuentemente las gotas que contienen esperma pueden ser producidas por un mecanismo de formación de gotas y analizados en el área de caída libre. Las gotas que contienen esperma son luego cargadas y clasificadas por medio del dispositivo de clasificación recolectadas por un sistema de recolección compatible de espermas que contiene un fluido de recolección de esperma especialmente fabricado. Este proceso puede minimizar la atención sobre el esperma creado a través del proceso de clasificación. Los espermas que contienen cromosoma Y y X pueden de esta manera ser utilizados para la inseminación y producción de mamíferos de sexo deseado.
De esta manera, es al menos el único diseño de una geometría de superficie interior de la boquilla de orientación de torsión individual que realiza la invención superior a otras boquillas convencionales. Tal como puede ser esperado por aquellos que tienen un mediano conocimiento en el arte, esta boquilla de orientación de torsión individual cuando esta especialmente combinada con el tubo de inyección de muestra biselado ubicado en una ubicación apropiada con respecto a una región específica de la superficie interior de la boquilla de orientación de torsión individual, puede proveer resultados los cuales pueden ser incluso mas satisfactorios .
Tal como se menciono anteriormente, lo anterior sea mención al aspecto de alineación torsional de la invención. Un segundo aspecto importante es el movimiento axial de la muestra. Este aspecto abarca no solo el movimiento de la muestra en su trayectoria de la boquilla hacia el eje central, sino además las tensiones que recibe la muestra durante su paso. Estos movimientos pueden quizás ser los mas fácilmente caracterizados por tres valores, los tres derivados de distancia con respecto a la ubicación a lo largo de la muestra. Estas derivadas pueden ser resumidas como lo siguiente :
Derivada Concepto más común análogo primer derivada de distancia velocidad con respecto a la ubicación, segunda derivada de distancia aceleración con respecto a la ubicación, tercer derivada de distancia velocidad de cambio de con respecto a la ubicación. aceleración
Tal como puede entenderse a partir de las figuras 6 a 9C, la boquilla puede estar presente en cualquier número de superficies de movimiento axiales, esto es superficies cuya influencia o quizás solo confinan la muestra mientras pasa a través de la boquilla. Tal como se ilustra en la figura 6, la superficie de movimiento axial puede ser de pares simétricos y también pueden ser simples como una primer superficie de movimiento axial (21) y una segunda superficie de movimiento axial (22) . Mientras que la muestra pasa por la boquilla
(6) , esta superficie de movimiento axial pueden actuar en maneras las cuales influencian la muestra o su viabilidad. La muestra es de esta manera (generalmente hidrodinámicamente) sometida a una primer superficie de movimiento axial (21) . Pueden luego transitar a una ubicación de transición (23) para volverse influenciadas por una segunda superficie de movimiento axial (22) . Luego de la ubicación de transición
(23) la muestra es luego sometida a una segunda superficie de movimiento axial (22) . Luego de esto puede salir de la boquilla tal como por el orificio de salida circular (15) .
Debe entenderse que la superficie de movimiento axial puede tener cualquier forma. En una disposición, tal como aquella que puede tener una velocidad constante puede tener una forma tubular. Tal como se ilustraren las figuras 6 y 8, en una disposición tal como aquella que logra la aceleración de las muestras mientras pasa a través de la boquilla (6) , puede ser configurado como superficie de aceleración tales como las superficies cónicas ilustradas. Por supuesto la superficie de aceleración puede además desacelerar la muestra. Causando la aceleración o desaceleración, la superficie puede cambiar la velocidad de la muestra mientras pasa a través de la boquilla (6) . De esta manera, puede entenderse que la boquilla (6) , tal como se ilustra en la figura 8 puede incluir una primer superficie de aceleración axial (24) y una segunda superficie de aceleración axial (25) . La primer superficie de aceleración axial (24) hace que la muestra experimente un primer valor de aceleración (el cual puede o no ser constante) y la segunda superficie de aceleración axial (25) que puede hacer que la muestra experimente un segundo valor de aceleración. Este segundo valor de aceleración puede o no ser diferente del primero. Tal como se ilustra en la figura 8, dado que la segunda superficie de aceleración (25) converge a una diferente velocidad, es común que indique un diferente valor de aceleración.
Naturalmente, en cualquier momento en donde ocurra una aceleración, la muestra puede experimentar una tensión. Esta tensión puede tener impactos en la funcionalidad y viabilidad de las muestras. Un aspecto particular para algunas muestras, tal como células largas, puede ser el hecho de que cuando estén en un cambio en velocidad, puedan tener diferencias en la tendencia de velocidad desde un extremo de la muestra hacia el siguiente. Esto puede ser fácilmente entendido en la referencia a una muestra tal como una célula de esperma. Las células de esperma viables tienen cabezas y colas . Cuando la cabeza es acelerada diferencialmente de la aceleración de la cola, o cuando la cabeza es movida a una velocidad diferente de aquella de la cola, un diferencial puede ser creado desde la cabeza hacia la cola. Este diferencial puede causar tensión en la célula. En casos extremos, puede incluso jalar la cola de la cabeza. Obviamente esto puede destruir la eficacia de la muestra. La presente invención provee una disposición a través de la cual esto puede ser minimizado y los efectos no deseados pueden ser evitados o reducidos. Esto es realizado por medio del sometimiento de la muestra a un bajo grado de cambios en aceleración o velocidad a través de la longitud de la muestra. Tal como aquellos entendidos en el arte pueden entender, bajo puede ser un termino relativo el cual depende de la célula y el medio ambiente. Puede ser determinado empíricamente o teóricamente como un valor el cual es ilustrado para realizar porcentajes prácticos de eficacia en la muestra para su aplicación especifica. Estas probabilidades pueden ser tales como al menos 70%, 80%, 90%, o lo similar. La baja aceleración o velocidad de cambio en la aceleración puede además ser aplicada afirmativamente.
Los cambios en la aceleración o velocidad pueden suceder cuando la superficie de movimiento axial cambia. Estos cambios pueden ser abruptos o gentiles . Naturalmente algunas realizaciones de la presente invención prefieren lo último. Haciendo referencia a la figura 6, puede verse como un cambio abrupto en la superficie de movimiento axial a lo largo del eje puede tensionar la muestra. La primer superficie de movimiento axial (21) cambia en un modo discreto en la ubicación de transición (23) . Por ejemplo, cuando la segunda superficie de movimiento axial (22) es creada por un elemento separado, tal por medio de la inserción de una joya, puede existir una discontinuidad en la boquilla (6) . A tal punto, la muestra puede de esta manera ser sometida a un cambio extremo en velocidad casi instantáneamente. Nótese que tal cambio discreto puede existir intencionalmente, debido a los desalineamientos casi imperceptibles. Sin importar los aspectos tales como estos pueden tender a desgarrar la muestra. Por medio de la prohibición de transiciones las cuales pueden no ser discretas, la presente invención puede evitar o minimizar las tensiones de esta manera creadas. La transición puede ser una transición continua en un área curva, teniendo una cantidad delimitada de discreciones o desalineamientos, o puede solo evitar la posibilidad de un cambio discreto teniendo una superficie interior de boquillas (6) la cual es única. En esta manera, la boquilla puede efectivamente tener una superficie única. En tal disposición, la boquilla (6) puede estar diseñada afirmativamente para presentar una transición con una diferenciación de aceleración máxima. Tal como se ilustra en la figura 8, esto puede ser realizado a través del diseño de un área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada tal como se muestra entre la primer superficie de movimiento axial y la segunda. También puede realizarse por medio del uso de un orificio de salida único. El área de transición de diferenciación de aceleración máxima puede de esta manera ser o al menos dar como resultado el orificio de salida uniforme.
En términos de las tres derivadas de distancia con respecto a la ubicación mencionada anteriormente, los conceptos anteriores pueden ser entendidos haciendo referencia a la figura 7A-C y 9A-C. Tal como se ilustra, estas figuras son representaciones gráficas de los tres valores derivados de ubicaciones respectivas en sus boquillas adyacentes ilustradas en las figuras 6 y 8. Las figuras 7A y 9A representan la primer derivada de' distancia con respecto a la ubicación, un concepto similar a la velocidad. Dado que la boquilla en la figura 6 tiene un cambio discreto en la ubicación de transición (23) , puede verse que dl/dl cambia discretamente en la ubicación de transición (23) . Para la boquilla (6) en la figura 8, el valor dl/dl no cambia discretamente. Esta muestra puede ser tratada con menor tensión por esta única razón. En la figura 7B y 9B puede verse que los valores d2l/dl2 para sus boquillas respectivas son también diferentes. En la figura 7B, la segunda derivada de distancia con respecto al valor de ubicación (o quizás mas fácilmente visto como aceleración) tiene un momento de cambio extremo. Nuevamente, esto no está presente en la figura 9. Finalmente, la tercer derivada de distancia con respecto a los valores de ubicación d3l/dl3, (o quizás mas fácilmente visto como velocidad de cambio de aceleración) también difiere. En la figura 7C, el primer valor se vuelve positivo y luego negativo. En los valores ilustrados en la figura 9C, los valores nunca cambian de signo, estos son ya sean cero o positivo pero nunca negativo. Cada uno de estos conceptos pueden ser construidos convencionalmente a través de los cuales se entienden y caracterizan la boquilla como esta diseñada para evitar o minimizar la atención en la muestra.
En otro aspecto del cual puede ser algún factor para algunas muestras en el aspecto de la duración de velocidad, aceleración, o velocidad de cambio de aceleración tal como es experimentado por la muestra. Esto puede además ser referido como un tiempo de dilatación para la muestra. En a citometría de flujo, existe generalmente una necesidad para muestras individuales que sean ubicadas en gotas individuales. Los aspectos de tales que pueden causar una transición deseada del fluido en el ultimo tiempb posible. En las disposiciones las cuales se intenta hacer esto, pueden ser importante el prestar particular atención a las áreas cercanas de alrededor de 100 µm del punto de salida (27) , las áreas mayores de 300µm alejados del punto de salida (27) , áreas cercanas al punto de salida (27) o incluso en áreas alejadas del punto de salida (27) Además, en algunas disposiciones puede ser aceptable someter momentáneamente únicamente la muestra a los valores no deseados. De esta manera los limites pueden ser establecidos a través de la boquilla (6) o en ubicaciones especificas dentro de la boquilla (6) . Algunos de los limites los cuales pueden ser aplicados son mencionados en las tablas 1 y 2.
TABLA 1 : valores d2A/dl:
0.16 m/s por micrón en la 100 K 10~3 m/s por micrón a boquilla, una distancia de mas de 300µm alejado del punto
0.05m/s por micrón en la de salida, 50 X 10"3 m/s por boquilla micrón a una distancia de mas de 300 µm alejado los valores anteriores del punto de salida. alejados de las cercanías del 25 X 10~3 m/s por micrón a punto de salida, una distancia de mas de 300 µm alejado del punto 0.10 m/s por micrón alejados de salida, del punto de salida, valores los cuales no cambian discontinuamente a
0.13m/s por micrón alejados lo largo del eje central, del punto de salida, valores los cuales son generalmente cualquiera de
0.16 m/s por micrón en las los anteriores, cercanías del punto de cualquiera de estos salida. valores en varias ubicaciones,
0.20 m/s por micrón en las cualquier combinación de cercanías del punto de estos valores, salida, cualquier combinación de estos valores con 0.23 m/s por micrón en las cualquiera de los valores cercanías del punto de en la tabla 2. salida, TABLA 2: valores d3l/dl
100,000 X 106 m/s por mícrón2 300 X 10"6 m/s por micrón2 en la boquilla, alejado del punto de salida. 10, 000 X 10~s m/s por micrón2 200 X 10"6 m/s por micrón2 en la boquilla, a una distancia del punto de salida, 2,000 X 10"6 m/s por micrón2 100 X 10-6 m/s por micrón2 en la boquilla, a una distancia del punto de salida, 1,100 X 10"6 m/s por micrdn2 una velocidad de cambio de en la boquilla, aceleración de valores con los valores anteriores respecto a la ubicación alejados de las cercanías del axial que no cambia punto de salida, discontinuamente en la boquilla, 100,100 X 10"e m/s por micrón2 una velocidad de cambio de alejado del punto de salida aceleración de valores o d3l/dl3 que no cambian de
50,000 X 10"6 m/s por micrón2 signo de la boquilla, alejado del punto de salida, valores los cuales son casi cualquiera de los
10 , 000 X 10"e m/s por micron2 anteriores, alej ado del punto de salida, cualquier combinación de los valores anteriores en 5 , 000 X 10"s m/s por micrón2 varias ubicaciones, alej ado del punto de salida, cualquier combinación de lo anterior 1 , 000 X 10"6 m/s por micrón2 cualquiera de estos alej ado del punto de salida , valores en varias ubicaciones , cualquier combinación de estos valores de cualquiera de estos valores con cualquiera de los valores en la tabla 1.
En coordinación afirmativa tales aspectos con las muestras especificas, los valores pueden además ser establecidos sobre la longitud de muestra/célula efectiva. Estas longitudes pueden ser determinadas teóricamente, medida como la longitud de muestra actual, incluso ser determinadas empíricamente como la longitud de muestra efectiva. Nuevamente, estas acciones afirmativas o coordinadas dan como resultado evitar dejar cosas a la deriva y pueden permitir certeza para los usuarios. En las determinaciones empíricas, entre otras, debe entenderse que los valores alcanzados pueden ser elegidos para no exceder las capacidades practicas de la muestra sobre su longitud, es decir que la muestra retiene una probabilidad aceptable suficientemente de funcionalidad luego de que son procesadas. En esta manera, por medio de la coordinación de la diferenciación de aceleración máxima, por medio de la limitación afirmativa de la diferenciación de aceleración máxima y por medio de los valores elegidos afirmativamente (determinados o no) para no exceder las capacidades prácticas de la muestra, la presente invención puede realizar de en su lado.
Tal como se mencionaba anteriormente, la sinergia puede existir entre estos aspectos y el aspecto de alineación hidrodinámica o de la invención. El giro y jalado combinado puede y aparentemente causa tensión en algunas muestras, especialmente en células de espermas. De esta manera la posibilidad de combinar las fuerzas hidrodinámicas de torsión y la diferenciación de aceleración máxima o los valores similares, estos aspectos pueden combinarse para minimizar también la atención. También se considera el aspecto de combinar los valores anteriores y conceptos con otros parámetros los cuales son similares para causar estrés o tensión en una configuración de citómetro de flujo. Tales parámetros pueden incluir la operación en velocidades de calificación de al menos 500 calificaciones por segundo, al menos 1000 calificaciones por segundo, y al menos 1500 calificaciones por segundo. Similarmente, esto puede además incluir operaciones a 50 psi y lo similar. Finalmente, tal como fue mencionado anteriormente, ciertas muestras pueden ser particularmente susceptibles a la tensión, a los aspectos mencionados anteriormente o a los valores mencionados con anterioridad. Esto puede ser particularmente cierto para las células de esperma, los sistemas de recolección de esperma, las células de esperma de bovinos, células de esperma de equinos, células de esperma las cuales han sido tenidas y clasificadas por medio de su contenido de ADN (tal como las células de esperma sexuadas) , las células de esperma de bovinos hembra o macho clasificadas, e incluso células de esperma de equinos clasificadas hembra o macho.
Tal como puede ser fácilmente entendido de lo precedente, los conceptos básicos de la presente invención pueden ser realizados en una variedad de maneras. Esto incorpora tanto las técnicas de ejercicios así~ como también los dispositivos para realizar el ejercicio apropiado. En esta aplicación, las técnicas de ejercicio son divulgadas como parte del resultado ilustrado para ser realizado por varios dispositivos descritos y como paso a los cuales son inherentes a la utilización. Esto son simplemente resultado natural de la utilización de dispositivo tal como fue intencionado y descrito. Además, mientras que algunos dispositivos son divulgados, debe entenderse que estos no solo realizan ciertos métodos pero además pueden ser variados en un número de manera. Como importante, con respecto a lo mencionado precedentemente todas estas facetas deben ser entendidas a ser comprendidas por esta divulgación.
La discusión incluida en esta solicitud cuya intención sirve como descripción básica. El lector puede notar que la discusión específica puede no describir explícitamente todas las realizaciones posibles; dado que varias alternativas son implícitas. Puede también no explicar completamente la naturaleza genérica de la invención y puede no mostrar explícitamente como cada característica o elemento puede actualmente ser representativo de una función o mayor o de una gran variedad de alternativas o elementos equivalentes. Nuevamente, esto son implícitos incluidos en esta divulgación. En donde la invención es descrita en terminología orientada a dispositivos, cada elemento del dispositivo realiza implícitamente una función. Las reivindicaciones del aparato pueden no solo ser incluidas con respecto al dispositivo descrito, pero además las reivindicaciones de método y proceso pueden ser incluidos para dirigir las funciones de la invención y cada elemento realizado. Ni la descripción ni la terminología intentan limitar el alcance de las reivindicaciones las cuales son incluidas en una solicitud de patente completa.
Debe también entenderse que una variedad de cambios pueden ser realizados sin alejarse de la esencia de la invención. Tales cambios son además incluidos implícitamente en la descripción. Estos todavía caen dentro del alcance de esta invención. Una divulgación mas amplia que abarca tanto las realizaciones explícitas ilustradas, la mayor variedad de alternativas de realizaciones implícitas y los amplios métodos o procesos y lo similar son abarcados por esta divulgación y pudieron haber sido basados cuando se desarrollo la reivindicación para esta solicitud. Esta solicitud buscara reexaminación amplia como se basa en las reivindicaciones como se examina dentro de los derechos del solicitante y será designada para producir una cobertura de patente de numerosos aspectos de la invención tanto independientemente como un sistema total.
Posteriormente, cada uno de varios elementos de la invención y reivindicaciones puede además ser realizados en una variedad de manera. Esta divulgación debe ser entendido para abarcar cada una de tales variaciones, siendo una variación de una realización de cualquier realización de aparato, un método o realización de proceso o incluso meramente una variación de cualquiera de estos elementos . Particularmente debe entenderse que la divulgación se refiere a elementos de la invención. Las palabras para cada elemento puede ser expresado por términos de aparatos equivalentes o términos de métodos incluso si solo la función o resultado es el mismo. Tal equivalente amplio o incluso términos mas genéricos deben ser considerados para ser abarcados en la descripción de cada elemento o acción. Tales términos pueden ser reemplazados cuando se lo desea para realizar explícita la cobertura amplia implícita a la cual esta invención esta dirigida. Como un ejemplo debe entenderse que todas las acciones pueden ser expresadas como un medio para tomar aquella acción o como un elemento en el cual realiza esa acción.
Similarmente, cada elemento físico divulgado debe ser entendido como que abarca una divulgación de la acción la cual facilita el elemento físico. Concerniente a este ultimo aspecto, pero como un ejemplo, la divulgación de una boquilla de orientación debe ser entendida para que abarque la divulgación de un elemento de orientación, el acto de orientar divulgado explícitamente o no, y viceversa, en donde únicamente lo divulgado del acto de orientación, tal como una divulgación debe ser entendido como que abarca la divulgación de un elemento de orientación incluso medios para orientar. Tales cambios y términos alternativos deben ser entendidos como explícitamente incluidos en la descripción.
Todas las referencias en la divulgación o listados en la declaración de divulgación de información presentada con la solicitud son incorporadas a la presente a modo de referencia; sin embargo, para extender declaración puede ser considerado inconsistente con el patentamiento de esta invención, tales declaraciones son expresas no para ser consideradas como realizadas por el solicitante.
Finalmente, a no ser que el contexto lo requería de otra manera, debe ser entendido que el termino "comprende" o variaciones tales como "comprenden" y lo similar, significa la incorporación de un elemento divulgado o paso o grupo de elementos o pasos pero no la exclusión de cualquier otro elemento o paso o grupo de elementos o pasos. Tales términos deben ser interpretados en su forma mas expansiva para soportar la mayor cobertura legalmente permisible para el solicitante en los países tales como Australia y o similar.
Claims (180)
1. Una disposición de citómetro de flujo, que comprende : a. un tubo de inyección de muestra que presenta un punto de inyección a través del cual una muestra puede ser introducida; b. un contenedor de flujo de envainado que presenta un extremo inferior y en donde dicho tubo de inyección de muestra esta ubicado dentro de dicho contenedor de flujo de envainado; c. un puerto de flujo de envainado conectado a dicho contenedor de flujo de envainado; d. una boquilla de orientación de torsión individual ubicada en al menos una parte por debajo de dicho punto de inyección; y e. una disposición analítica la cual censa por debajo de dicha boquilla de orientación de torsión individual.
2. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 1, en donde dicha boquilla de orientación de torsión individual comprende un elemento de superficie interior de torsión individual .
3. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 2 , en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual comprende un elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico achaflanado.
4. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 1 que comprende además : a. una primer superficie de movimiento axial en dicha boquilla; b. una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla; y c. un área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada entre dicha primer superficie de movimiento axial en dicha boquilla y dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada esta coordinada con dicha muestra para ser limitada afirmativamente para que no exceda las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
5. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 4 , en donde dicha primer superficie de movimiento axial comprende una primer superficie de aceleración axial y en donde dicha segunda superficie de movimiento axial comprende una segunda superficie de aceleración axial .
6. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 5, en donde dicha boquilla presenta valores de aceleración causados por su superficie interna y en donde dichos valores de aceleración son seleccionados de un grupo que comprende .- - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón, — no más de alrededor de 0.05 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.10 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.13 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.20 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.23 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 100 X lo"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 50 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 25 X 10-3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - tales valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras que no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, - no más de alrededor de 100,000 X 10"6 m/s por micron2, no más de alrededor de 10,000 X 106 m/s por micrón2, no más de alrededor de 2,000 X 10" m/s por micrón , no más de alrededor de 1,100 X 10 m/s por micron , no más de alrededor de 100,000 X 10 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 50,000 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 10,000 X 10~6 m/s por micron2 alejado de la cercanía del orificio de salida, no más de alrededor de 5,000 X 10"s m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida. - no más de alrededor de 1,000 X 10 m/s por micron2 alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 300 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 200 X 10"6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 100 X 10" m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, y - tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicaci6n axial mientras no cambie el signo a lo largo de un eje central alejado de la cercanía del orificio de salida.
7. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 4, en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada comprende una superficie uniforme.
8. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 4, en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada comprende un orificio de salida uniforme.
9. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 4, en donde dicha disposición analítica la cual censa por debajo de dicha boquilla opera a una velocidad seleccionada de un grupo que comprende al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 1000 clasificaciones por segundos y al menos 1500 clasificaciones por segundo.
10. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 4 , y comprendiendo además un sistema de presurización del cual opera al menos de alrededor de 50 psi.
11. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 9, y comprendiendo además una disposición de recolección de esperma.
12. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 10, y que comprende además una disposición de recolección de esperma.
13. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en las reivindicaciones 4, 7, 8, 9 o 10, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino.
14. Un espécimen de esperma sexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se escriben en las reivindicaciones 11 o 12.
15. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 14, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino .
16. Un mamífero producido a través del uso del espécimen de esperma sexuado producido con una disposición de citsmetro de flujo tal como se escribe en la reivindicación 11 o 12.
17. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 16, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino.
18. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 3, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico inclinada comprende: a. una ubicación de demarcación tipo elipse ubicada alrededor de dicho punto de inyección; y b. una zona de reducción de elipticidad que se extiende por debajo de dicha ubicación de demarcación de tipo elipse .
19. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 3, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico inclinado comprende : a. una zona de aumento de elipticidad; b. una zona de demarcación tipo elipse corriente debajo de dicha zona de incremento de elipticidad; y c. una zona de reducción de elipticidad que se extiende desde dicha ubicación de demarcación tipo elipse.
20. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 18, que comprende además: a. una zona cónica ubicada por debajo de dicha zona de reducción de elipticidad; b. una zona cilindrica ubicada por debajo de dicha zona cónica; en donde tanto la zona cónica y la zona cilindrica comprenden una superficie de flujo laminar; c. un orificio de salida circular ubicada por debajo de dicha zona cilindrica; d. un oscilador al cual dicho orificio de salida circular es sensible; y e. una disposición de clasificación de citometría por flujo por debajo de dicha boquilla de orientación de torsión individual .
21. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 19, que comprende además: a. una zona cónica ubicada por debajo de dicha zona de reducción de elipticidad; b. una zona cilindrica ubicada por debajo de dicha zona cónica; en donde tanto la zona cónica y la zona cilindrica comprende una superficie de flujo laminar; y c. un orificio de salida circular ubicado por debajo de dicha zona cilindrica; d. un oscilador al cual dicho orificio de salida circular es sensible; y e. una disposición de clasificación de citometría de flujo por debajo de dicha boquilla de orientación de torsión individual .
22. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 18, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico inclinado, dicha zona cónica y dicha zona cilindrica son unitarias .
23. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 20, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico inclinado, dicha zona cónica, dicha zona cilindrica y dicho orificio de salida circular son uniformes.
24. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 22, en donde dicha ubicación de demarcación tipo elipse tiene un eje mayor y un eje menor que presenta un cociente, en donde dicho cociente de dicho eje mayor sobre dicho eje menor comprende un cociente óptimo para una muestra.
25. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 24, en donde dicho eje mayor de dicha ubicación de demarcación tipo elipse deseada es de alrededor de 2.2 mm y en donde dicho eje menor de dicha ubicación de demarcación tipo elipse deseada es alrededor de 1.0 mm.
26. Una disposición de cítómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 19, en donde dicha ubicación de demarcación tipo elipse tiene un eje mayor y un eje menor, y en donde dicho eje mayor de dicha ubicación de demarcación tipo elipse deseada es de alrededor de 2.2 mm y en donde dicho eje menor de dicha ubicación de demarcación tipo elipse deseada es de alrededor de 1.0 mm.
27. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 22, en donde dicha boquilla de orientación de torsión individual presenta una dirección corriente abajo, en donde dicha zona de reducción de elipticidad tiene una sección transversal y áreas de sección transversal, en donde dichas secciones transversales de dicha zona de reducción de elipticidad se somete a cambios de transición desde la forma tipo elipse a formas circulares corriente abajo, en donde dichas áreas de sección transversal se vuelven progresivamente pequeñas corriente abajo.
28. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 27, en donde cada una de dichas secciones transversales de dicha zona de reducción de elipticidad presenta un eje mayor y un eje menor y en donde dicho eje mayor y dicho eje menor se vuelven progresivamente iguales corriente abajo.
29. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 21, en donde dicha zona cónica es alrededor de 0.3 mm en altura.
30. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 29, en donde dicha zona cilindrica es de alrededor de 0.15 mm en peso.
31. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 2, en donde dicho elemento de superficie de interior de torsión individual comprende un elemento de superficie interior de torsión individual gradualmente achaflanado.
32. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 31, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual inclinado gradualmente comprende un elemento de superficie interior que se inclina alrededor de 23°.
33. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 19, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual inclinado comprende un elemento de superficie interior que se inclina alrededor de 23°.
34. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 23, en donde dicha boquilla de orientación de torsión individual comprende una boquilla de orientación cerámica de torsión individual .
35. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 22, en donde dicha boquilla de orientación de torsión individual presenta una altura y una parte superior con un diámetro exterior, y en donde dicha altura es alrededor de 13 mm, y en donde dicho diámetro exterior es alrededor de 6 mm.
36. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 20, en donde dicha disposición de citómetro de flujo comprende un orificio de salida circular, en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico inclinado tiene una boca y en donde dicha boca es alrededor de 5.25 mm en diámetro y dicho orificio de salida circular es alrededor de 0.07 mm en diámetro.
37. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 35, en donde dicha disposición de citómetro de flujo comprende un orificio de salida circular y en donde dicho elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptico inclinado tiene una boca y en donde dicha boca es alrededor de 5.25 mm en diámetro y dicho orificio de salida circular es alrededor de 0.07 mm de diámetro .
38. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 36, en donde dicha zona cónica presenta una parte superior con un diámetro interior, y en donde dicho diámetro interior tiene una parte superior de dicha zona cónica que es alrededor de 0.19 mm.
39. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 37, en donde dicha zona cónica presenta una parte superior con un diámetro interior, y en donde dicho diámetro interior tiene una parte superior de dicha zona cónica que es alrededor de 0.19 mm.
40. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 18, en donde el tubo de inyección de muestra comprende un tubo de inyección de muestra de orientación mejorada.
41. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 40, en donde dicho tubo de inyección de muestra de orientación mejorada comprende una punta biselada.
42. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 41, en donde dicha punta biselada presenta una boca circular y en donde dicha boca circular tiene un diámetro de alrededor de 0.01 mm.
43. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 41, en donde dicha zona interior tipo elíptica inclinada presenta un eje mayor y un eje menor en dicho punto de inyección, en donde dicho eje mayor de dicha punta biselada esta alineada con dicho eje mayor de dicha zona interior tipo elíptica inclinada en dicho puno de inyección.
44. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 43, en donde dicha boquilla de orientación de torsión individual presenta una parte inferior, en donde dicha punta biselada presenta una boca circular, en donde dicha disposición de citómetro de flujo comprende además un orificio de salida circular ubicada en dicha parte inferior de dicha boquilla de orientación de torsión individual, en donde dicho punto de inyección esta ubicado a una distancia desde dicho orificio de salida circular de dicha boquilla de orientación de torsión individual en la cual una muestra sale desde dicha boca circular de dicha punta biselada que recibe fuerzas de torque mínima para realizar un estado alineado de orientación.
45. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 44, en donde dicho punto de inyección esta ubicado a una distancia de dicho orificio de salida circular en el cual dicho estado de alineación de orientación de dicha muestra es sustancialmente mantenido cuando dicha muestra sale de dicho orificio circular de dicha boquilla de orientación de torsión simple.
46. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 45, en donde dicho punto de inyección esta ubicado alrededor de 6 mm desde dicho orificio de salida circular de dicha boquilla de orientación de torsión individual .
47. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 9, en donde dicha disposición de citómetro de flujo tiene dimensiones establecidas de acuerdo con las reivindicaciones 26, 29 30, 36, 38 o 46.
48. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 1, en donde dicha muestra comprende células de esperma en un divisor compatible de esperma.
49. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 48, en donde dicha disposición analítica comprende una disposición de clasificación citométrica de flujo.
50. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 49, y comprendiendo además una disposición de recolección compatible de esperma.
51. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 49, en donde dicha muestra comprende células de esperma en un divisor compatible de esperma y en donde dichas células de esperma son seleccionadas de un grupo que consiste de células espermas de equino y células de esperma de bovino.
52. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 51, en donde dicha disposición de citómetro de flujo tiene dimensiones establecidas de acuerdo con las reivindicaciones 26, 29, 30, 36, 38 o 46.
53. Un espécimen de esperma sexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 20, 23, 24, 26, 29, 30, 32, 39, 41, 44, 45, 51 o 52.
54. Un mamífero producido a través del uso de un espécimen de esperma asexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 20, 23, 24, 26, 29, 30, 32, 39, 41, 44, 45, 51 o 52.
55. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en las reivindicaciones 18, 23, 26, 29, 30, 32, 37, 39, 42, 46 y que comprende además: a. una primera superficie de movimiento axial en dicha boquilla; b. una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla; y c. un área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada entre dicha primer superficie de movimiento axial en dicha boquilla y dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada esta coordinada con dicha muestra para estar limitada afirmativamente para no acceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
56. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 55, en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada comprende una superficie unitaria.
57. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 55, en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada comprende un orificio de salida unitaria.
58. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 55, en donde dicha disposición a la ética la cual censa por debajo de dicha boquilla opera a una velocidad seleccionada de un grupo que comprende al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 100 clasificaciones por segundo y al menos 1500 clasificaciones por segundo.
59. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 55, y que comprende posteriormente una disposición de presurización la cual opera al menos alrededor de 50 psi.
60. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 58, y que comprende además una disposición de recolección de esperma.
61. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 59, y que comprende además una disposición de recolección de esperma.
62. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 55, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionada de un grupo que comprende células de esperma de bovinos y células de esperma de equino .
63. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 57, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de espermas de bovino y células de esperma de equinos .
64. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 58, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de espermas de bovino y células de esperma de equinos .
65. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 59, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de espermas de bovino y células de esperma de equinos .
66. Un espécimen de esperma asexual producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 60.
67. Un espécimen de esperma asexual producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 64.
68. Un mamífero producido a través del uso de un espécimen de esperma asexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 60.
69. Un maraifero producido a través del uso de un espécimen de esperma asexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 64.
70. Un método de procesamiento de muestras de citometria de flujo, que comprende los pasos de: a. establecer un fluido de envainado; b. inyectar una muestra de dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección; c. establecer una superficie de torsión individual en la boquilla que presenta un eje central alrededor del cual un torque es aplicado; d. generar fuerzas hidrodinámicas de torsión individuales a partir de dicha superficie de torsión individual . e. orientar dicha muestra con dicha fuerzas de hidrodinámicas de torsión individual; f . expulsar dicha muestra desde dicha boquilla; g. analizar dicha muestra.
71. Un método de procesamiento de muestra de citometria de flujo reivindicación 70, en donde dicho paso para establecer una superficie de torsión individual en dicha boquilla.
72. Un método de procesamiento de muestra de citrometria de flujo tal como se describe en la reivindicación 71, donde dicho paso establecer una individual en la boquilla comprende el paso de establecer una superficie interior de torsión individual tipo elíptica inclinada en dicha boquilla.
73. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 72, en donde dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica inclinada tiene una elipticidad la cual varia a lo largo en su longitud y posteriormente comprende el paso de varias suavemente dicha elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica.
74. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 70, que comprende posteriormente los pasos de: a. someter dicha muestra a una primer superficie de movimiento axial en una boquilla; b. transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla; c. someter dicha muestra a dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla en donde dicha primer y segunda superficie de movimiento axial de transición con una diferenciación de aceleración máxima; d. coordinar dicha diferenciación de aceleración máxima para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud; y e. limitar afirmativamente dicha diferenciación de aceleración máxima para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
75. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 74, en donde dicho paso de someter dichía muestra a una primer superficie de movimiento axial en una boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una primera superficie de aceleración axial en dicha boquilla y en donde dicho paso de someter dicha muestra dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una segunda superficie de aceleración axial en donde dicha primer y segunda superficie de movimiento axial transiciona con una diferenciación de aceleración máxima.
76. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 75, en donde dicha boquilla genera valores de aceleración a través de su superficie interna y en donde dichos valores de aceleración son seleccionados de un grupo que comprende: - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón, - no más de alrededor de 0.05 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.10 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.13 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.20 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.23 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 100 X 10~3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 50 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 25 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - tales valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras que no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, - no más de alrededor de 100,000 X 10"s m/s por micron 2, — no más de alrededor de 10,000 X 10"s m/s por micron2, — no más de alrededor de 2,000 X 10"6 m/s por micrón2, — no más de alrededor de 1,100 X 10"e m/s por micron2, — no más de alrededor de 100,000 X 10"6 m/s por micron2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 50,000 X 10"e m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 10,000 X 10"e m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 5,000 X 10"e m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 1,000 X 10"6 m/s por micron2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 300 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, -no más de alrededor de 200 X 10"6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — no más de alrededor de 100 X 10"6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, y - tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie el signo a lo largo de un eje central alejado de la cercanía del orificio de salida.
77. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 74, en donde dicha fuerza hidrodinámica de torsión individual y dicha diferenciación de aceleración máxima combinan y son afirmativamente elegidas para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
78. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 77, en donde dicho paso de transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una superficie unitaria.
79. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 78, en donde dicho paso de transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a un orificio de salida uniforme .
80. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 74, y que comprende además los pasos de: a. formar gotas alrededor de dicha muestra luego de que ha salido de dicha boquilla; y b. clasificar dichas gotas a una velocidad seleccionada de grupo que comprende al menos 500 clasificaciones por segundos, al menos 1000 clasificaciones por segundo, y al menos 1500 clasificaciones por segundo.
81. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 74, y que comprende además el paso de presurizar dicha boquilla a una presión de al menos 50 psi.
82. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 80, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado .
83. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 81, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado .
84. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en las reivindicaciones 74, 78, 79, 80 u 81, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovinos y células de esperma de bovinos dentro del dicho fluido de envainado.
85. Un método de crear un espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se escribe en las reivindicaciones 82 u 83 y en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado.
86. Un método de crear un espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se escribe en la reivindicación 85 en donde dicho paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado comprende el paso de inyectar célula de esperma seleccionado del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado.
87. Un método para crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se escribe en las reivindicaciones 82 u 83 y en donde dicho paso inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado.
88. Un método para crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se escribe en la reivindicación 87, en donde dicho paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionado del grupo que comprende células de esperma de bovinos y células de espermas de equino dentro de dicho fluido de envainado.
89. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 73, en donde dicho paso de variar suavemente dicha elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica comprende los pasos de reducir la elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica corriente debajo de dicho punto de inyección.
90. Un método de procesamiento de muestra de citometría tal como se describe en la reivindicación 73 en donde dicho paso de variar suavemente dicha electricidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica comprende los pasos de : a. incrementar la elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica corriente abajo en dicha boquilla; b. alcanzar una ubicación de demarcación tipo de elipse; y c. reducir la elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica corriente abajo desde dicha ubicación de demarcación tipo elipse.
91. Un método para el procesamiento de muestra de cítometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 89, que comprende además los pasos de: a. fluir por laminado dicho fluido de envainado dentro de dicha boquilla; b. someter dicho fluido de envainado a una zona cónica; someter dichos fluidos de envainado a una zona cilindrica; d. crear una corriente de salida que presenta una sección transversal circular; e. formar gotas desde dicha salida de corriente; y f. clasificar dichas gotas,
92. Un método para el procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 90, que comprende además los pasos de: a. fluir por laminado dicho fluido de envainado dentro de dicha boquilla; b. someter dicho fluido de envainado a una zona cónica; c . someter dichos fluidos de envainado a una zona cilindrica; d. crear una corriente de salida que presenta una sección transversal circular; e. formar gotas desde dicha salida de corriente; y f. clasificar dichas gotas.
93. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se escribe en la reivindicación 91, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cómica y dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cilindrica comprenden ambas el paso de utilizar una superficie unitaria.
94. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 91, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cónica, y dicho paso de someter dicho fluido de envainado una zona cilindrica, y dicho paso de crear una corriente de salida que presenta una sección transversal circular comprenden todas el paso de utilizar una superficie unitaria .
95. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 89, en donde dicha elipticidad tiene un cociente de un eje mayor sobre un eje menor en dicho .punto de inyección, y posteriormente comprende el paso de optimizar dicho cociente para dicha muestra.
96. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 95, en donde dicho paso de optimizar dicho cociente para dicha muestra comprende el paso de configurar dicho cociente a 2.2.
97. Un método de procesamiento de muestra de citornetría de flujo tal como se describe en la reivindicación 90, en donde dicha electricidad tiene un cociente de un eje mayor a solo un eje menor en dicho punto de inyección, y comprende posteriormente el paso de configurar dicho cociente a 2.2.
98. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 93, en donde dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica presenta áreas de sección transversal, y en donde dicho paso de variar suavemente dicha electricidad de dicha superficie interior de torsión individual -tipo elíptica comprende además el paso de reducir las áreas de sección transversal corriente abajo desde dicho punto de inyección.
99. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 98, en donde dicha electricidad presenta un eje mayor y un eje menor y en donde dicho paso de variar suavemente dicha electricidad de dicha superficie - interior de torsión individual y política comprende el paso de hacer que dicho eje mayor y dicho eje menor se vuelvan progresivamente iguales corriente abajo.
100. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 92, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cómica comprende el paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cónica para una longitud óptima para dicha muestra mientras atraviesa corriente abajo.
101. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 100, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cómica para una longitud óptima para dicha muestra mientras que viaja corriente abajo comprende el paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cómica de 0.3 mm de largo.
102. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 100, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cilindrica comprende el paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cilindrica por una longitud óptima para dicha muestra mientras que viaja corriente abajo.
103. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 102, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona crítica para una longitud óptima para dicha muestra mientras esta viaja corriente abajo comprende el paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cilindrica de 0.15 mm de longitud.
104. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 72, en donde dicho paso a establecer una superficie interior de torsión individual tipo elíptica inclinada en dicha boquilla comprende el paso de inclinar gradualmente dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica.
105. Un método de procesamiento de muestra de citometria de flujo tal como se describe en la reivindicación 104, en donde dicho paso de inclinar gradualmente dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica comprende el paso de configurar una inclinación alrededor de 23°
106. Un método para procesar muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 90, en donde dicho paso de incrementar la elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica corriente abajo en dicha boquilla y de reducir la elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica comprende cada una el paso de configurar una inclinación alrededor de 23°.
107. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 107, en donde el paso de utilizar una superficie unitaria comprende el paso de utilizar una superficie cerámica unitaria.
108. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 93, en donde el paso de utilizar una superficie unitaria comprende el paso de establecer una boquilla que presenta una altura de alrededor de 13 mm y un diámetro exterior de alrededor de 6 mm.
109. Un método de procesamiento de muestra de citometria de flujo tal como se describe en la reivindicación 92, en donde dicho paso de crear una corriente de salida presenta una sección transversal circular que comprende el paso de crear una corriente de salida que presenta un diámetro de 0.07 mm, y en donde dicho paso de suavizar la variación de dicha elipticidad dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica comprende el paso de establecer una boca de alrededor de 5.25 mm en diámetro.
110. Un método de procesamiento de muestra de citometria de flujo tal como se describe en la reivindicación 108, en donde dicho paso de crear una corriente de salida que presenta una sección transversal circular comprende el paso de crear una corriente de salida que presenta un diámetro de alrededor de 0.7 mm, y en donde dicho paso de suavizar la variación de dicha elipticidad de dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptico comprende el paso de establecer una boca de alrededor de 5.25 mm de diámetro.
111. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 108, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cómica comprende el paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cónica que presenta un diámetro interior en la parte superior de dicha zona cónica de alrededor de 0.19 mm.
112. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 110, en donde dicho paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cónica comprende el paso de someter dicho fluido de envainado a una zona cónica que presenta un diámetro interior en una parte superior de dicha zona cónica de alrededor de 0.19 mm.
113. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 89, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de asistir en la orientación de dicha muestra en dicho punto de inyección.
114. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 113, en donde dicho paso de asistir en la orientación de dicha muestra en dicho punto de inyección comprende el paso de crear un flujo biselado cerca de dicho punto de inyección.
115. Un método de procesamiento de muestra de cítometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 114, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de establecer una boca circular que presenta una punta biselada con un diámetro de alrededor de 0.01 mm.
116. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 114, que comprende posteriormente el paso de alinear dicho flujo biselado con dicha superficie interior de torsión individual tipo elíptica inclinada en dicha boquilla.
117. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 70, en donde dicho paso de orientar dicha muestra con dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión individual comprende el paso de torsionar mínimamente dicha muestra.
118. El método de procesamiento de muestra- de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 117, en donde dicha muestra viaja a una distancia luego de realizar dicho paso de generar dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión individuales desde dicha superficie de torsión individual y previo a la realización de dicho paso de la salida de la muestra desde dicha boquilla y posteriormente comprende el paso de minimizar dicha distancia.
119. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 118, en donde dicho paso de la salida de dicha muestra de dicha boquilla sucede en un orificio de salida en donde dicho paso de minimizar dicha distancia comprende configurar la distancia desde dicho punto de inyección a dicho orificio de salida en alrededor de 6 mm.
120. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 80, en donde d «icha muestra esta orientada tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 97, 101, 103, 109, 111, o 119.
121. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 70, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma en un divisor compatible de esperma dentro de dicho fluido de envainado.
122. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 121, que comprende los pasos posteriores de: a. formar gotas alrededor de dichas células de esperma luego de que estas han salido de dicha boquilla; y b. clasificar dichas gotas.
123. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 121, y que comprende posteriormente el paso de recolectar dichas células de esperma luego de realizar dicho paso de clasificar dichas gotas.
124. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 122 , en donde dicho paso de inyectar células de esperma en un divisor compatible de esperma dentro de dicho fluido de envainado comprende el paso el paso de inyectar células de esperma en un divisor compatible de esperma dentro de dicho fluido de envainado seleccionado de un grupo que consiste de células de esperma de equinos y células de esperma de bovinos .
125. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 124, en donde dicha muestra esta orientada tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 97, 101, 103, 109, 111, o 119.
126. Un método para crear un espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 70, 91, 95, 97, 101, 103, 105, 112, 114, 117, 118, 124, o 125.
127. Un método para crear un mamífero que compren de el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 70, 91, 94, 95, 97, 101, 103, 105, 112, 114, 117, 118, 124, o 125.
128. Un método de procesamiento de muestra de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 89, 94, 97, 101, 103, 105, 110, 112, 115, o 119 y que comprende además los pasos de : a. someter dicha muestra a una primer superficie de movimiento axial en una boquilla; b. transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla; c, someter dicha muestra a dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla en donde dicha primer y segunda superficie de movimiento axial transicionan con una diferenciación de aceleración máxima; d. coordinar dicha diferenciación de aceleración máxima para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud; y e. limitar afirmativamente dicha diferenciación de aceleración máxima para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
129. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 128, en donde dichas fuerzas hidrodinámicas de torsión individuales y dicha diferenciación de aceleración máxima combinan y son afirmativamente elegidas para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
130. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 129, en donde dicho paso de transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una superficie unitaria.
131. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 130, en donde dicho paso de transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a un orificio de salida uniforme.
132. Un método de procesamiento de muestra de citometría- de flujo tal como se describe en la reivindicación 128, y que comprende además el paso de: a. formar gotas alrededor de dicha muestra luego de que haya salido de dicha boquilla; b. clasificar dichas gotas a una velocidad seleccionada del grupo que comprende al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 1000 clasificaciones por segundo y al menos 1500 clasificaciones por segundo.
133. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 128, y que comprende posteriormente el paso de presurizar dicha boquilla a una presión de al menos 50psi.
134. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 132, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado.
135. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 133, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado .
136. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 128, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado .
137. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 131, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado .
138. Un método de procesamiento de muestra de citometria de flujo tal como se describe en la reivindicación 132, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado.
139. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 133, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado.
140. Un método para crear un espécimen de espermas sexuados que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 134 y en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dichos fluidos de envainado .
141. Un método para crear un espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 138, y en donde dicho paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado.
142. El método para crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 134, y en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro dicho fluido de envainado.
143. El método de crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 138, y en donde dicho paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionado del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado.
144. Una disposición citómetro de flujo que comprende : a. un tubo de inyección de muestra que presenta un punto de inyección a través del cual una muestra puede ser introducida; b. un contenedor de fluido de envainado que presenta un extremo inferior y en donde dicho tubo de inyección de muestra está ubicado dentro de dicho contenedor de fluido de envainado; c. un puerto de fluido de envainado conectado a dicho contenedor de fluido de envainado; d. una primer superficie de movimiento axial en una boquilla; e. una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla; f. un área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada entre dicha primer superficie de movimiento axial en dicha boquilla en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima limitada está coordinada con dicha muestra para ser limitada afirmativamente para que no exceda las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud; g. una disposición analítica la cual censa por debajo de dicha boquilla.
145. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, en donde dicha primer superficie de movimiento axial comprende una primer superficie de aceleración axial en donde dicha segunda superficie de movimiento axial comprende una segunda superficie de aceleración axial .
146. Una disposición de cítómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 14.5, en donde dicha boquilla tiene valores de aceleración causados por su superficie interna y en donde dichos valores de aceleración están seleccionadas de un grupo que comprende: - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón, - no más de alrededor de 0.05 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.10 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.13 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 0.20 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 0.23 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 100 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — no más de alrededor de 50 X 10~3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — no más de alrededor de 25 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — tales valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras que no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, — no más de alrededor de 100,000 lí 10~s m/s por micrón2, — no más de alrededor de 10,000 X 10"6 m/s por micron2 — no más de alrededor de 2,000 X 10"6 m/s por micron2 — no más de alrededor de 1,100 X 10~s m/s por micron2 — no más de alrededor de 100,000 X 10"6 m/s por micron2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 50,000 X 10"s m/s por micrón2 alejado dé la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 10,000 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 5,000 X 10"6 m/s por micron2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 1,000 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 300 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 200 X 10"6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — no más de alrededor de 100 X 10"6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, — tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, y - tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie el signo a lo largo de un eje central alejado de la cercanía del orificio de salida.
147. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, en donde dicha área de transición de diferenciación de la aceleración máxima limitada comprende una superficie unitaria.
148. Una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, en donde dicha área de transición de diferenciación de aceleración máxima comprende un orificio de salida uniforme.
149. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, en donde dicha disposición analítica la cual censa por debajo de dicha boquilla opera a una velocidad seleccionada de un grupo que comprende al menos 500 clasificaciones por segundo, - al menos 1000 clasificaciones por segundo y al menos 1500 clasificaciones por segundo .
150. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, y que comprende además una disposición de presurización la cual opera al menos alrededor 50 psi.
151. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 149, y que comprende posteriormente una disposición de recolección de esperma.
152. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 150, y que comprende además una disposición de recolección de esperma.
153. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, 147, 148, 149, o 150, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprenden células de esperma de bovinos y células de esperma de equino.
154. Un espécimen de esperma sexuado producido con la disposición de citómetro de flujo tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 144, 147, 148, 150, 151, o 152.
155. Un mamífero producido a través del uso del espécimen de esperma sexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 144, 147, 148, 150, 151, o 152.
156. Un disposición de cítómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 144, 148, 149, 150, o 151 que comprende además una boquilla de orientación de torsión individual ubicada en al menos una parte por debajo de dicho punto de inyección.
157. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 156, y que comprende además una disposición de recolección de espermas.
158. Un espécimen de esperma sexuado producido con la disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 157.
159. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 158, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino .
160. Un mamífero producido a través del uso de espécimen de esperma sexuado producido con una disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 157.
161. Un disposición de citómetro de flujo tal como se describe en la reivindicación 160, en donde dicha muestra comprende células de esperma seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino .
162. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo que comprende los pasos de: a. establecer un fluido de envainado; b. inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección; c. someter dicha muestra a una primer superficie de movimiento axial en una boquilla. d. transicionar a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla; e. someter dicha muestra a dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla en donde dicha primera y segunda superficie de movimiento axial transicionan con una diferenciación de aceleración máxima, f. coordinar dicha diferenciación de aceleración máxima para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud; g. limitar afirmativamente dicha diferenciación de aceleración máxima para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud; h. eyectada dicha muestra desde dicha boquilla; i. analizar dicha muestra.
163. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se escribe en la reivindicación 162, en donde dicho paso de someter dicha muestra en la primer superficie de movimiento axial en una boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una primer superficie de aceleración axial y en donde dicho paso de someter dicha muestra a dicha segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una segunda superficie aceleración axial en donde dicha primera y segunda superficie de movimiento axial transicionan con una diferenciación de aceleración máxima.
164. Un método de procesamiento de muestra de citometria de flujo tal como se describe en al reivindicación 162, en donde dicha boquilla crea valores de aceleración a través de su superficie interna y en donde dichos valores de aceleración son seleccionados de un grupo que comprende : - no más de alrededor de 0.16 m/s por micrón, - no más de alrededor de 0.05 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, -no más de alrededor de 0.10 m/s por micrón alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.13 m/s por micrón alejado de la cercanía de-L orificio de salida, - no más de alrededor de 0.1& m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.20 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 0.23 m/s por micrón en la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 100 X 10~3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 50 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 25 X 10"3 m/s por micrón a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - tales valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras que no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, - no más de alrededor de 100,000 X 10"G m/s por mícron2, no más de alrededor de 10,000 X 10"6 m/s por micron2, — no más de alrededor de 2,000 X 10"e m/s por micron2, — no más de alrededor de 1,100 X 10-6 m/s por micrón2, — no más de alrededor de 100,000 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 50,000 X 102 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 10,000 X 10~6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, — no más de alrededor de 5,000 X 10~6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 1,000 X 10"6 m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 300 X 10"s m/s por micrón2 alejado de la cercanía del orificio de salida, - no más de alrededor de 200 x 10~6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - no más de alrededor de 100 X 10"6 m/s por micrón2 a una distancia de más de 300 µm alejado del orificio de salida, - tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie discontinuamente a lo largo de un eje central, y - tal velocidad de cambio de valores de aceleración con respecto a la ubicación axial mientras no cambie el signo a lo largo de un eje central alejado de la cercanía del orificio de salida.
165. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 162, en donde dicho paso de transición a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a una superficie unitaria.
166. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 162, en donde dicho paso de transición a una segunda superficie de movimiento axial en dicha boquilla comprende el paso de someter dicha muestra a un orificio de salida uniforme .
167. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 162, y que comprende además los pasos de: a. formar gotas alrededor de dicha muestra luego de que haya salido de dicha boquilla; y b. clasificar dichas gotas a una velocidad seleccionada de un grupo que comprende al menos 500 clasificaciones por segundo, al menos 1000 clasificaciones por segundo, y al menos 1500 clasificaciones por segundo.
168. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 162, y que comprende además el paso de presurizar dicha boquilla a una presión de al menos 50 psi.
169. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 167, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado.
170. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 168, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado .
171. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 162, 165, 166, 167, o 168 en donde el paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células espermas seleccionadas de un grupo que comprende células de esperma de bovinos y células de esperma de equinos dentro de dicho fluido de envainado .
172. Un método para crear un espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 162, 165, 166, 167, o 168.
173. Un método para crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 162, 165, 166, 167, 168, 169, o 170.
174. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 162, 166, 167, 168, o 169 y que comprende además los pasos de : a. establecer una superficie de torsión individual en dicha boquilla; b. generar fuerzas hidrodinámicas de torsión individuales de dicha superficie de torsión individual; c. orientar dicha muestra con dicha fuerzas hidrodinámicas de torsión individual.
175. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 174, en donde dicha fuerza hidrodinámica de torsión y dicha diferenciación de aceleración máxima combina y son afirmativamente elegidas para no exceder las capacidades prácticas de dicha muestra sobre su longitud.
176. Un método de procesamiento de muestra de citometría de flujo tal como se describe en la reivindicación 175, en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado .
177. Un método para crear un espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 176, y en donde dicho paso de inyectar una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicha fluido de envainado .
178. Un método para "crear ún espécimen de esperma sexuado que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 177, en donde dicho paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionado del grupo que comprende células de esperma de bovino y células de esperma de equino dentro de dicho fluido de envainado.
179. Un método para crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 176, y en donde dicho paso de inyectar en una muestra dentro de dicho fluido de envainado en un punto de inyección comprende el paso de inyectar células de esperma dentro de dicho fluido de envainado .
180. Un método para crear un mamífero que comprende el paso de producir un espécimen de esperma sexuado tal como se describe en la reivindicación 179, en donde el paso de inyectar células de esperma dentro^ de dicho fluido de envainado comprende el paso de inyectar células de esperma seleccionadas de los grupos que comprenden células de esperma de bovinos y células dé espermas de equinos dentro de dicho fluido de envainado . RESUMEN Una disposición de boquilla mejorada para un citómetro de flujo y métodos que acompañan que han sido inventados para una orientación altamente eficiente y proceso de clasificación en una muestra plana e ítem dedicados tales como células de esperma de equinos o de bovinos. La disposición de boquilla mejorada comprende una boquilla con una geometría de superficie interior novedosa que puede acelerar gentilmente las células e incluso incluir un elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptica dentro de la boquilla, por ejemplo una boquilla de orientación de torsión individual. El elemento de superficie interior de torsión individual tipo elíptica puede tener una superficie de flujo laminar y puede producir el paso de flujo más simple para aplicar fuerzas mínimas las cuales actúan en naturaleza de aceleración o fuerzas hidrodinámicas de orientación, es decir, las fuerzas de orientación de torsión individual, para orientar una muestra plana tal como células de esperma animales dentro de una dirección apropiada para un análisis y proceso de clasificación eficiente en uso clínico 0 Z 5^8 Í para investigación y para la industria de inseminación animal . z z /spsg
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