BRPI0017624B1 - método de processamento de amostra para citômetro de fluxo - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE AMOSTRA PARA CITÔMETRO DE FLUXO (51) Int.CI.: G01N 15/00 (30) Prioridade Unionista: 03/12/1999 US 09/454,488 (73) Titular(es): XY, LLC (72) Inventor(es): LISA A. HERICKHOFF; KRISTOPHER S. BUCHANAN (85) Data do Início da Fase Nacional: 08/08/2011 / 30

RELATÓRIO DESCRITIVO

Patente de Invenção para: “MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE AMOSTRA PARA CITÔMETRO DE FLUXO”

Dividido do pedido de patente de invenção PI 0016121-7, depositado em 29/11/2000.

I - Campo Técnico [001] Esta invenção se refere a um aparelho de bocal aperfeiçoado para um sistema de citômetro de fluxo e processos para aperfeiçoamento de citometria de fluxo. Especificamente, esta invenção se refere a um novo projeto de uma geometria de superfície interna nova de bocal que manuseia e orienta uma amostra de modo suave em uma direção radial apropriada para análise e classificação eficaz. A invenção também focaliza os sistemas para classificação de células delicadas, especialmente células de esperma vivo.

II - Histórico da Invenção [002] Os citômetros de fluxo têm estado em uso clínico e de pesquisas por muitos anos e suas aplicações na indústria animal, tais como indústria de reprodução de animais vem aumentando rapidamente. Um citômetro de fluxo comercialmente disponível utiliza uma geometria de fluido cilíndrica em seu bocal. Este tipo de sistema de citômetro de fluxo possui uma passagem de fluxo focada com simetria de revolução, conforme descrito em algumas Patentes US (Patentes números 5.602.039, 5.483.369, 4.660.971, 4.988.619 e 5.466.572). Este tipo de projeto, de acordo com a lei de similaridade, não produz amostras orientadas radialmente. Na clínica de reprodução animal e campos de pesquisa biológica, quando células, tais como células de esperma são classificadas, elas podem ser pré-manchadas com um corante que produz fluorescência quando exposto a uma fonte de luz de excitação. Conforme foi explicado na Patente US número 5.135.759 de Lawrence Johnson, um citômetro de fluxo que detecta a fluorescência emitida perpendicular ao eixo de fluxo pode ser usada com alta precisão na medição e discriminação de teor de DNA das células. Contudo, conforme observado por outros, mesmo esta precisão na medição do teor de DNA pode ser obtida apenas mais eficazmente, quando as células de interesse são esféricas ou cilíndricas (Dean e outros, 1978, Biophys. J. 23: 1-5). Como

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 8/47 / 30 para as células de esperma, que possuem cabeças achatadas, a intensidade de fluorescência observada depende muito da orientação apropriada das cabeças com relação ao detector. As células de esperma emitem um sinal fluorescente mais forte a partir da borda do que da superfície plana. Portanto, a intensidade do sinal fluorescente depende da orientação da cabeça do esperma conforme ele passa pelo detector. Uma vez que o teor de DNA é determinado pela fluorescência e uma vez que a intensidade da fluorescência é afetada pela orientação, a determinação do teor de DNA pode ser composta pela falta de orientação em um bocal. Por esta razão, sem orientação radial, a distribuição de intensidade de fluorescência resultante obtida para cabeças de esperma normais, orientadas aleatoriamente, reflete o teor de DNA e a orientação da cabeça. Uma vez que as células emitem um sinal fluorescente mais brilhante da borda da cabeça (Gledhill e outros, 1976, J. Cell Physiol. 87: 367-376; Pinkel e outros, 1982, Citometry 7: 268-273) a exatidão da determinação do teor de DNA (que pode diferir de tão pouco quanto 3,5%) é altamente afetada pela orientação das células. Por esta razão, o citômetro de fluxo convencional possui limitações experimentadas, especialmente quando da classificação de células de esperma aplainadas ou outras células não esféricas ou não cilíndricas e semelhantes.

[003] Adicionalmente, determinadas células podem exibir funcionalidade diminuída como resultado do processo de classificação. Isto pode ser especificamente verdadeiro para células, tais como, células de esperma de mamíferos que não são apenas mecanicamente delicadas, porém também que podem tornar-se funcionalmente impedidas (como talvez visto através de fertilidade reduzida) ou mesmo feridas mortalmente como resultado de alguma ocorrência no processo de classificação. Para os esforços de citometria de fluxo com células delicadas têm havido limitações significativas nas capacidades. Isto é mais grave no campo altamente especializado de classificação de células de esperma, não apenas porque as células propriamente são incomumente delicadas, porém também porque existe a necessidade de razões de classificação muito altas por razões fisiológicas e práticas. Estas duas necessidades competitivas provaram apresentar desafios importantes no campo único de classificação de espermas para fins de reprodução comercial. Assim, embora estes dois aspectos Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 9/47 / 30 manuseio e orientação suaves - sejam talvez independentemente aplicáveis a uma variedade de exemplos, em muitos casos, eles podem atuar sinergisticamente. Ambos seus caracteres independentes e suas interpelações sinergísticas são contudo mais agudas no campo de classificação de esperma comercial. De modo interessante, esta relação de sinergia e em potencial parece não ter sido completamente apreciada antes da presente invenção.

[004] Visto em isolamento, o aspecto da orientação apropriada de uma amostra contendo partículas ou células pode assim ser vista como desempenhando um papel importante na intensidade de sinal de citômetro de fluxo e qualidade e na eficácia da classificação. Esforços para orientar hidrodinamicamente a amostra foram feitos e o uso de orientação hidrodinâmica da amostra no fluxo através de sistemas e citômetros de fluxo foram explorados nas últimas décadas (Fulwyler, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25:781-783; Kachel e outros, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 774-780; Dean e outros, supra). A orientação hidrodinâmica da amostra dentro do citômetro de fluxo pode melhorar a medição precisa de teor de relativo de DNA-mancha e pode também prover uma medição potencialmente útil dos parâmetros morfológicos, tais como, espessura de célula e grau de curvatura da face plana. Para algumas aplicações, esta orientação é em linha reta. Contudo, quando células delicadas (tais como células de esperma) ou ouras partículas estão envolvidas, contudo, uma técnica mais suave é necessária. Por exemplo, um tubo de injeção de amostra com uma ponta conformada em cunha tem sido usado em alguns esforços de aumentar a porcentagem das células orientadas (Dean e outros, 1978, Biophys. J. 23: 1-5; Fulwyler, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 781-783: Johnson e outros, 1986, Cytometry 7: 268273; Pinkel e outros, 1982, Cytometry 3: 1-9, Welch e outros, 1994, Cytometry 17 (suppl. 7): 74). Em razão da ponta conformada em cunha do tubo de injeção de amostra, a corrente da amostra tendeu a ser drenada em uma borracha fina pelo fluido de revestimento oposto à corrente cilíndrica. As células com cabeças planas, tais como as do esperma de mamífero, freqüentemente encontraram o fluido de revestimento em velocidade mais alta (100 mm/seg.) e foram então giradas, de modo que seus lados planos estavam no plano da borracha. Infelizmente, a separação do evento de orientação e do evento de análise final

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 10/47 / 30 pode causar menos resultados ótimos. Portanto, esta técnica não vem sendo mostrada na prática como sendo tão vantajosa quanto desejado.

[005] Em uma aplicação diferente, Kachel e seus colegas (Kachel e outros, supra) demonstrou a lei de similaridade e os três tipos discutidos de passagens de fluxo que influenciaram as partículas em movimento. Eles concluíram que, para obter orientação radial uniforme com forças hidrodinâmicas para partículas planas, tais como, hemácias aplainadas, a passagem de fluxo preferida seria uma pela qual a constrição unilateral pode ser obtida. A passagem de fluxo mais simples que exibiu uma constrição unilateral aumentada no uso com um sistema de fluxo seria feita de um tubo com uma seção transversal em elipse e também terminaria em uma saída em elipse. Em uma disposição, o eixo longo desta saída elipse estaria localizado em um ângulo reto para o eixo longo na seção transversal do tubo elíptico de constrição. Contudo, uma vez que a saída em elipse não produz o tipo de gotículas desejadas para um classificador de célula de citômetro de fluxo de alta velocidade, esta disposição não foi destinada a uso e aparentemente não foi aplicada ao citômetro de fluxo.

[006] Em um esforço semelhante, Rens e seus colegas projetaram uma ponta de bocal que tinha um interior elíptico e um orifício de saída elíptico (Rens e outros, 1998, Publicação PCT número PCT/US98/15403; Rens e outros, 1998, Cytometry 33:476-481; Rens e outros, 1999, Mol. Reprod. Dev. 52:50-56). Este interior continha uma primeira zona elíptica e uma segunda zona elíptica que foram separadas por uma zona de transição. Todas as zonas tinham um eixo geométrico longo e um eixo geométrico curto. O eixo geométrico longo da segunda zona em elipse foi orientado a 90° em relação aquele da primeira zona elíptica. Um orifício elíptico, perfurado através de uma jóia, estava localizado ao final do orifício de saída elíptico e serviu como a saída final. Este dispositivo resolveu parcialmente o problema de orientação aleatória que existia em um citômetro de fluxo convencional e orientaria cerca de 60% das células de espermatozóide aplainadas totais de um varão, cada vez, através do citômetro de fluxo. Não obstante, quando as forças hidrodinâmicas em uma passagem de fluxo fossem levadas em consideração, as partículas planas passando através do bocal projetado por Rens e seus colegas receberam tensões desnecessárias. Para células

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 11/47 / 30 delicadas e, especialmente para talvez as células de esperma mais delicadas, tais como, células de esperma bovino ou eqüino, esta abordagem simplesmente não parece render a eficiência desejada tanto em orientação quanto em viabilidade de célula.

[007] Assim, existiu uma longa necessidade insatisfeita para a invenção, enquanto técnicas de implementação e elementos necessários há muito fossem disponíveis. Esta necessidade referia-se à capacidade de manusear suavemente e talvez orientar as partículas ou células a serem analisadas, a capacidade de analisar apropriadamente e classificar eficazmente e a capacidade de minimizar a situação potencialmente estressante que o citômetro de fluxo causaria às partículas ou células. Adicionalmente, embora existam problemas nos citômetros de fluxo convencionais, uma apreciação plena de que o problema existia e o que no problema não foi visto anteriormente pelos versados na técnica. Tentativas substanciais feitas pelos versados na técnica para satisfazer a necessidade ou abreviar as dificuldades foram realizadas, porém não tiveram sucesso, mais provavelmente em razão da falha do entendimento de quais eram exatamente os problemas e como eles estariam relacionados entre si. Alguns esforços feitos pelos versados na técnica, mesmo maturados nas patentes pareciam ter tocado no problema, porém de fato eles tenderam a algumas considerações ensinadas não na direção da dos presentes inventores.

III - Revelação da Invenção [008] É portanto um objetivo apresentar uma geometria de superfície interna de bocal aperfeiçoada, que produza a passagem de fluxo mais simples aplicando-se forças hidrodinâmicas necessárias para acelerar e talvez orientar a amostra na direção apropriada para análise e classificação eficaz. Esta geometria de superfície interna do bocal aperfeiçoada pode compreender um ou ambos: uma característica de força acelerada configurada apropriadamente e/ou um elemento de superfície interna torsional, simples, semelhante a elipse, dentro de um bocal de orientação torsional que produz as forças hidrodinâmicas especiais, a saber, as forças de orientação torsionais simples.

[009] Conforme a presente invenção agora mostra, os problemas com tensões de célula indesejáveis seriam vistos como pelo menos, em parte, devido às forças de

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 12/47 / 30 manuseio não apropriadas, especificamente: forças de aceleração inadequadas ou a existência de uma segunda força torsional criada pela segunda zona em elipse. Como para as forças acelerativas aplicadas, os dispositivos freqüentemente utilizaram transições abruptas internas para o bocal e assim causavam aceleração extrema em curtas distâncias. Como para o aspecto de orientação, por exemplo, abordagens tais como aquelas de Ren (mencionado anteriormente) mostraram que, após as células terem sido orientadas pela primeira força torsional criada pela primeira zona em elipse, uma tensão adicional, talvez em dobro, era aplicada. Especificamente, as partículas planas já estavam em uma posição orientada após o que elas terem sido orientadas de uma posição aleatória pela primeira zona em elipse. Elas estavam prontas para sair nas posições orientadas. Nesta hora, contudo, os dispositivos de Rens e outros desnecessariamente torciam estas partículas planas orientadas uma segunda vez, pelas forças hidrodinâmicas criadas pela segunda zona em elipse. Conforme a presente invenção mostra, estes projetos não são plenamente eficazes em um citômetro de fluxo de alta velocidade. Quando as células de esperma planas com caudas são orientadas através deste tipo de bocal, além de sua ineficácia, a geometria neste tipo de bocal aparentemente impacta duas vezes as forças torsionais. Isto parece estressar desnecessária e altamente ou danificar as células de esperma com caudas longas, antes delas saírem do bocal. Além disto, em alguns projetos onde o orifício é feito em uma jóia que é separada da parte interna principal, um luxo laminar brando pode também ser afetado em algum grau. Isto causaria aceleração quase instantânea e poderia estressar desnecessariamente as células e afetaria a orientação das células de esperma já orientadas. Portanto, as abordagens de Rens e outros esforços mais recentes realmente não ensinam uma superfície interna laminar mais eficaz, menos acelerada e menos torsional de uma concretização da invenção.

[010] É outro objetivo projetar uma geometria de superfície interna de bocal mais simples que forneça superfície de fluxo laminar e ao mesmo tempo que reduza a distorção da amostra, especialmente das células de esperma.

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 13/47 / 30 [011] Outro objetivo é apresentar um sistema que possa medir mais rápida e acuradamente além de classificar a amostra, especialmente células de esperma delicadas, em pesquisa e uso clínico e na indústria de inseminação de animais. [012] Um objetivo adicional é prover processos para aperfeiçoar a orientação e eficiência de classificação da amostra, especialmente das células de esperma na citometria de fluxo para pesquisa e uso clínico e indústria de inseminação de animais.

[013] Naturalmente, objetivos adicionais da invenção são revelados através de outras áreas da descrição e dos desenhos.

IV - Breve Descrição dos Desenhos [014] A figura 1 é uma vista em seção transversal de uma porção de um citômetro de fluxo mostrando um recipiente de fluido de revestimento, um tubo de injeção de amostra e um bocal da presente invenção. Esta figura também mostra uma localização relativa do tubo de amostra dentro do bocal.

[015] A figura 2 é uma vista tridimensional de uma ponta de bocal e sua posição relativa com o recipiente de fluido de revestimento (aqui o corpo do bocal) com um tubo de injeção de amostra e uma ponta de bocal. A figura 2A é um desenho esquemático do tubo de injeção de amostra que possui uma ponta chanfrada e uma boca circular.

[016] As figuras 3A, 3B e 3C são desenhos esquemáticos de uma das presentes concretizações do bocal. A figura 3A é uma vista tridimensional da ponta de bocal mostrando a primeira zona de aumento de capacidade de elipse, a localização de demarcação de elipse desejada, a zona de diminuição de capacidade de elipse, a zona cônica, a zona cilíndrica e o orifício de saída circular. A figura 3B é uma vista em seção transversal esquemática mostrando uma superfície interna afunilada do bocal em um projeto unitário. A figura 3C é uma vista em seção transversal da zona cilíndrica e o orifício de saída circular. [017] A figura 4A é uma vista inferior da região de ponta de bocal mostrando especificamente o orifício de saída circular. A figura 4B é uma vista superior do projeto interior do bocal mostrando a boca circular maior, a localização de demarcação de elipse desejada, a boca circular maior da zona cônica e a boca

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 14/47 / 30 circular menor da zona cilíndrica. O diâmetro da boca menor é também aquele do orifício de saída.

[018] A figura 5 mostra como o bocal de orientação torsional simples trabalha na orientação das partículas planas.

[019] A figura 6 é um diagrama esquemático de um exemplo de um bocal possuindo superfícies de movimento axial como as que podem ter existido na técnica anterior.

[020] As figuras 7a, 7b e 7c são gráficos da velocidade axial teórica, aceleração e razão de alteração dos movimentos de aceleração com relação à localização, conforme possam existir para um bocal, tal como o mostrado esquematicamente na figura 6.

[021] A figura 8 é um diagrama esquemático de um exemplo de um bocal possuindo superfícies de movimento axial de acordo com uma concretização da presente invenção.

[022] As figuras 9a, 9b e 9c são gráficos da velocidade axial teórica, aceleração e razão de alteração de movimentos de aceleração com relação à localização conforme possam existir para um bocal tal como aquele mostrado esquematicamente na figura 8.

V - Modos de Realizar a Invenção [023] Conforme pode ser visto das ilustrações e de acordo com os objetivos da presente invenção, os conceitos básicos da presente invenção podem ser implementados de modos diferentes. Com referência à figura 1, ela mostra uma porção do sistema de citômetro de fluxo, onde uma amostra é processada em gotículas individuais antes de serem analisadas e classificadas. Conforme é bem entendido pelos versados na técnica comum, a partir da vista em seção transversal esquemática, um recipiente de fluido de revestimento (1) pode conter algum fluido de revestimento (2) importado através de um orifício de fluido de revestimento (não mostrado). Um sistema de injeção de amostra compreende um tubo de injeção de amostra (3) conectado ao reservatório de amostra (não mostrado). O sistema de injeção de amostra geralmente atua para prover o fluxo apropriado de algum material de amostra para o sistema de bocal. O recipiente de fluido de revestimento ao mesmo tempo, introduz um fluido de revestimento

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 15/47 / 30 dentro do sistema de bocal. A amostra pode ser circundada por um fluido de revestimento para formar um fluido contendo amostra e pode então sair do sistema de bocal através de um mecanismo de formação de gota através do qual o fluido contendo amostra forma pequenas gotículas. Estas pequenas gotículas podem passar através de uma área de queda livre em alta velocidade por cerca de 20 metros por segundo por combinação de oscilação por um oscilador e pressão alta do sistema de citômetro de fluxo. Subseqüentemente, estas pequenas gotículas, isto é, as gotas contendo amostra, podem ser analisadas por um sistema analítico (não mostrado) na área de queda livre. Se as células vivas, tais como, as células de esperma planas são introduzidas como o material de amostra, elas podem ser manchadas com um ou mais corantes fluorescentes. Estas células de esperma podem ser transportadas em fila simples na corrente de fluido de revestimento após passarem o sistema analítico (não mostrado). O sistema analítico pode incluir um laser focado cujo comprimento de onda é ajustado para excitar um corante fluorescente que pode estar presente. O sinal de fluorescência coletado de cada célula pode então ser detectado através de um sistema de detecção (não mostrado). Então, este processo pode incluir um processo de classificação, por um dispositivo de classificação ou semelhante, dependendo da propriedade física individual, tal como o teor de DNA de cada célula introduzida, através da aplicação diferencial de carga às várias gotículas como os versados na técnica prontamente entenderão. Subseqüentemente, cada célula é classificada dependendo de sua carga. Conforme mencionado anteriormente, estes aspectos gerais de citometria de fluxo são bem conhecidos e são discutidos nas referências mencionadas anteriormente (incorporadas aqui como referência).

[024] Em relação ao manuseio da amostra para as funções de citômetro de fluxo e viabilidade da amostra, dois aspectos podem ser importantes: alinhamento torsional e o movimento axial da amostra. Cada um destes é discutido separadamente, contudo, deve ser entendido que eles não são mutuamente exclusivos e podem possuir efeitos sinergísticos. Isto é especialmente verdade como ele se refere à viabilidade da amostra, isto é, a capacidade da amostra de realizar suas funções com as eficácias esperadas e não substancialmente afetado

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10/30 pelo processo de citometria de fluxo. O primeiro destes dois aspectos, o alinhamento torsional é discutido primeiro.

[025] Estes aspectos ilustrados na figura 1 podem também ser vistos através da vista tridimensional mostrada na figura 2. Esta vista tridimensional mostra uma porção do recipiente de revestimento de fluxo (1), o tubo de injeção de amostra (3) e o sistema de bocal possuindo um bocal (6). O tubo de injeção de amostra (3) , conforme mostrado na figura 2A em detalhes, possui uma ponta chanfrada (4) e uma boca circular (5). O bocal especialmente projetado (6) é denominado um bocal de orientação torsional simples na presente invenção e será apresentado em detalhes a seguir.

[026] Como é sabido, o tubo de injeção de amostra serve para introduzir o material de amostra em fluxo fino dentro dos sistema de bocal, onde a amostra é circundada pelo fluido de revestimento. Como é bem sabido pelos versados na técnica, o tubo de injeção de amostra convencional freqüentemente possui uma forma cilíndrica. Entretanto, uma vez que este tipo de tubo de injeção de amostra pode não ajudar no controle de orientação da amostra, a amostra de vem para fora deste tipo de tubo de injeção de amostra geralmente possui um estado não orientado. Nas últimas décadas, um tubo de injeção de amostra modificado foi produzido (Dean e outros, 1989, supra; Fulwyler, 1977 supra, Johnson e outros, 1986, Cytometry 7: 268-273; Pinkel e outros, 1982, supra). Este tubo de injeção de amostra modificado pode ter uma ponta chanfrada e pode ajudar, em algum grau, na orientação do material de amostra que sai de sua ponta. Em razão da forma chanfrada da ponta do tubo de injeção de amostra, a corrente de amostra pode ser drenada em uma borracha fina pelo fluido de revestimento. A alteração resultante na condição de fluxo pode causar uma orientação do material de amostra.

[027] No presente projeto, com base no conceito do mecanismo de ponta chanfrada, o tubo de injeção de amostra com o tipo de ponta chanfrada mostrada é mantido porém o tamanho interno específico é único. Mais importante, a localização da ponta chanfrada dentro do bocal é especialmente estabelecida. Conforme mostrado na figura 2A, o tubo de injeção de amostra (3), denominado aqui um tubo de injeção de amostra que aperfeiçoa a orientação, compreende

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 17/47 / 30 uma ponta chanfrada (4) e uma boca circular (5) em sua seção transversal. A ponta chanfrada é mais ou menos de forma retangular em sua seção transversal. Esta possui um eixo geométrico longo e um eixo geométrico curto. Embora naturalmente isto possa variar para adequar-se à aplicação ou partículas sendo classificadas, em uma concretização preferida, o ângulo da ponta chanfrada é de cerca de 4°, o diâmetro de saída do tubo é de cerca de 1,5 mm e o diâmetro da boca circular é de cerca de 0,25 mm.

[028] Por isto, nós apenas discutimos o papel que um tubo de injeção de amostra desempenha na orientação da amostra. Pode ser entendido contudo, como os versados na técnica entenderão, que foças de orientação providas desta maneira são muito limitadas. Por exemplo, se este aspecto sozinho tivesse resolvido os problemas de orientação, os esforços doravante na orientação de alta percentagem não teriam sido necessários. Ao invés disto, conforme verão os versados na técnica, para obter-se uma amostra altamente orientada, especialmente quando a amostra continha as células planas, não esféricas ou delicadas, tais como as células de esperma para uma finalidade de inseminação ou semelhante, uma abordagem adicional era necessária. Conforme a presente invenção mostra, a maior parte das forças de orientação pode vir da superfície interna do bocal. Assim, o bocal servia como um elemento fundamental para produção de forças de orientação funcionais e apropriadamente suaves sendo ainda potentes.

[029] Com este entendimento, pode ser visto agora como o presente projeto difere em relação ao da técnica anterior. Conforme pode ser visto das figuras 1 e 2 e conforme especificamente denominado nas figuras 3A, 3B e 3C, o sistema de citômetro de fluxo compreende um bocal de orientação torsional (6) simples unicamente projetado. O bocal de orientação torsional simples (6) pode ser feito de algumas materiais selecionados, tais como, material de cerâmica e semelhante. Embora o tamanho do bocal, por exemplo, altura e diâmetro, etc. possa variar, ele preferivelmente ajusta-se a um citômetro de fluxo convencional e ao mesmo tempo fornece as forças de orientação desejadas, conforme descrito nesta presente invenção. Adicionalmente, embora em uma concretização preferida, o bocal seja feito de uma peça simples, para a finalidade de uma ilustração melhor,

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 18/47 / 30 ele pode ser dividido em duas partes, isto é, uma porção cilíndrica superior (a) e uma porção cônica inferior (b). Em uma das concretizações preferidas, a altura da porção cilíndrica superior (a) pode ser de cerca de 8 mm e o diâmetro externo pode se de cerca de 6 mm. A altura da porção cônica (b) pode ser de cerca de 4,5 mm e o diâmetro externo no orifício pode ser inferior a cerca de 1 mm. Assim, a altura total do bocal pode ser de cerca de 12,5 mm. O uso de um bocal unitário também ajuda na fixação de todos fatores de orientação e movimento axial em uma disposição ótima. Assim, isto pode aumentar a facilidade de uso, repetidamente e outras matérias práticas.

[030] A figura 3 é uma vista tridimensional e as figuras 3B e 3C são vistas em seção transversal de um bocal de orientação torsional da presente invenção. Conforme pode ser melhor ilustrado nas figuras 3A e 3B, o bocal de orientação torsional simples (6) compreende um volume de bocal encoberto por um elemento de superfície interna. O elemento de superfície interna do bocal de orientação torsional simples constitui sua geometria interna. O elemento de superfície interna pode compreender um elemento de superfície interna torsional simples possuindo uma superfície interna torsional simples. O elemento de superfície interna torsional simples possui a capacidade de gerar forças hidrodinâmicas torsionais simples possuindo um eixo geométrico hidrodinâmico quando uma amostra contendo fluxo passa através do mesmo. O elemento de superfície interna torsional simples também possui uma característica de aceleração de velocidade que pode produzir uma velocidade de aceleração da amostra. Quando a amostra passa através de seu elemento de superfície interior torsional simples, a amostra pode ser orientada pelas forças hidrodinâmicas torsionais simples e radialmente alinhada com relação ao eixo geométrico hidrodinâmico. Ela também pode ser acelerada para sair para análise subsequente e processo de classificação. Estas forças hidrodinâmicas torsionais simples especiais podem ser referidas como forças de orientação torsional simples.

[031] A forma total da superfície interna torsional simples é gradualmente afunilada a jusante, de modo que ela pode ser referida como um elemento de superfície interna torsional simples, gradualmente afunilada. Da vista de seção longitudinal conforme mostrado na figura 3B, este elemento de superfície interna

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 19/47 / 30 torsional simples, gradualmente afunilado pode ser visto em duas dimensões como sendo uma forma semelhante a ventoinha que se abre da parte inferior para a superior. O grau afunilado do elemento de superfície interna torsional simples, gradualmente afunilado pode variar, porém pode preferivelmente ser de cerca de 23° a partir da parte inferior de uma forma semelhante a ventoinha para a parte superior, de modo que a força de aceleração desejada pode ser gerada para agir sobre a amostra. Além disto, o elemento de superfície interna torsisonal simples, gradualmente afunilado pode ser dividido em algumas zonas, com base em sua geometria interna e cada zona pode ter uma superfície de fluxo laminar. Basicamente, o elemento de superfície interna torsional simples, gradualmente afunilado pode ser feito de uma zona interior semelhante a elipse, afunilada (c) possuindo uma superfície interna torsional simples, semelhante a elipse e uma zona interna cilíndrica (d) em uma vista tridimensional. Esta superfície interna torsional simples, semelhante a elipse pode incluir formas diferentes em suas seções transversais. Por exemplo, além de ser conformada em elipse, ela pode ser de forma oval ou mesmo fechada em uma forma de retângulo. Quaisquer destas formas podem ocorrer em qualquer localização ao longo da superfície interna torsional simples, semelhante a elipse, imediatamente acima e abaixo de uma localização de demarcação na qual sua elipcidade, ovalidade ou mesmo retangularidade alcança um máximo ou o grau desejado. Conforme seria entendido, cada uma destas formas destina-se a ser englobada pelo termo semelhante a elipse, mesmo que uma elipse matemática verdadeira não esteja presente em uma dada seção transversal. De modo semelhante, onde discutido, o termo circular não precisa ser perfeitamente circular ou mesmo de todo circular. Novamente, pode ser preferido que seja circular, contudo, outras formas podem ser equivalentes, à medida que a função apropriada esteja presente.

[032] Naturalmente, a zona interna semelhante a elipse, afunilada, pode ter um eixo geométrico maior e um eixo geométrico menor em suas seções transversais e a elipcidade pode ser suavemente controlada. Assim, dependendo da variação da elipcidade, esta zona interna semelhante a elipse, afunilada, pode ser dividida nas zonas que se seguem a partir da parte superior a jusante para a parte inferior:

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 20/47 / 30 [033] uma zona de elipcidade crescente (8) com uma boca circular (7) na parte superior, onde a razão do eixo geométrico maior para o eixo geométrico menor nas seções transversais aumenta;

[034] uma localização de demarcação de elipse desejada (9) a jusante da zona de aumento de elipcidade (8) onde o eixo geométrico principal para o eixo geométrico menor alcança uma razão ótima que pode ser uma razão máxima para uma amostra conforme pode ser melhor ilustrado na figura 3A; e [035] uma zona de diminuição de elipcidade (10) onde a razão do eixo geométrico maior para o eixo geométrico menor nas seções transversais diminui. [036] Com base na geometria descrita acima, as duas formas dimensionais da vista em seção transversal da parte superior para a inferior da zona interna semelhante a elipse afunilada podem sofrer alterações transacionais de um círculo na região de boca para as formas semelhantes a elipse (que podem mesmo ser elipses reais) com elipcidade gradualmente crescente (que é a razão do eixo geométrico maior para o menor - independente da forma envolvida) para a elipse desejada ou semelhante, para formas semelhantes elípticas com elipcidade diminuindo gradualmente e finalmente para um círculo, novamente na região onde a zona interna semelhante a elipse afunilada une-se à zona cilíndrica. Uma vez que a zona interna semelhante a elipse total é afunilada, as áreas em seção transversal da zona interna semelhante a elipse tornam-se gradualmente menores a partir da parte superior para a inferior. A elipcidade pode assim ser ajustada por alterar a razão do eixo geométrico maior para o menor. A razão do eixo geométrico maior para menor pode alterar gradualmente da parte superior 1 para mais do que 1 ou talvez menos de uma razão ótima para a amostra. A razão ótima pode ser uma razão máxima. Subseqüentemente, a razão pode gradualmente alterar de volta da razão máxima para a menor do que a razão máxima e então para 1. Conforme os versados na técnica sabem, quando a razão torna-se 1, a forma na seção transversal pode ser um círculo. A razão máxima conforme referido acima pode variar em algum grau. Em uma concretização preferida, o comprimento do eixo geométrico maior pode ser de 2,2 mm e aquele do eixo geométrico menor pode ser de 1,0 mm. Assim, a razão máxima é projetada a

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 21/47 / 30 cerca de 2,2 para esta concretização preferida. Naturalmente, ela pode variar com base na aplicação ou semelhante.

[037] Em uma concretização, a localização de demarcação da elipse desejada (9) a jusante da zona de aumento de elipcidade (8) dentro do bocal pode ser o lugar onde a ponta chanfrada do tubo de injeção de amostra é localizada. Este também pode ser o lugar onde a amostra no fluxo de borracha recebe as forças de orientação desejadas que são plenamente funcionais, onde a amostra sofre torque mínimo pelas forças de orientação desejadas ou forças de torque, onde o tempo necessário para que a célula saia é mínimo, ou onde a amostra após sair do orifício do bocal pode ainda manter bem seu estado orientado, assim a análise subsequente e classificação podem ser conduzidas eficazmente. Esta localização pode ser referida como um ponto de injeção. Para o citômetro de fluxo de classificação de alta velocidade da técnica anterior corrente agora operado, esta localização ou o ponto de injeção com base nas descobertas da presente invenção, pode ser de cerca de 6 mm da saída. Assim, se uma distância de manutenção de orientação é definida como a distância que indica a que ponto uma partícula de amostra pode manter seu estado orientado do ponto onde ela é orientada para um ponto no qual ela perde estatisticamente seu grau de estado orientado, a distância da ponta chanfrada do tubo de injeção de amostra para o orifício de saída do bocal e a distância do orifício de saída para a inserção com o feixe a laser ou sensor ao longo da passagem de fluxo na zona de queda, cai dentro desta distância mantendo orientação. Por exemplo, ela pode estar dentro de 10 mm da ponta chanfrada para a interseção com um feixe a laser, conforme descrito por Dean e seus colegas (Dean e outros, supra). Portanto, quaisquer partículas de amostra que são orientadas, independentemente do ponto, dentro da distância da ponta chanfrada, para a interseção com o feixe a laser ou sensor, manterão seu estado orientado antes de serem analisadas. Teoricamente, esta distância mantendo orientação poderia mesmo ser maior do que 10 mm quando um citômetro de fluxo for equipado com o bocal especialmente projetado da presente invenção e o tubo de injeção de amostra com a ponta chanfrada. Adicionalmente, para os benefícios de orientação plena, o eixo geométrico longo da ponta chanfrada pode ser alinhado com o eixo geométrico maior da

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 22/47 / 30 localização de demarcação de elipse desejada e eixo geométrico de classificação com o eixo geométrico menor, conforme mostrado.

[038] A jusante da zona interna semelhante a elipse, funilada (c) pode estar uma zona interna cilíndrica (d). Esta zona interna cilíndrica (d) pode ser vista em ambas as figuras 3A, 3B e 3C pode ser adicionalmente dividida em uma zona cônica (12) que é afunilada e uma zona cilíndrica (14). A zona cônica (12) possui uma boca circular maior (11) na parte superior que se une com a zona interna semelhante a elipse afunilada (c) e um orifício circular menor (13) em conexão com a zona cilíndrica (14). A boca circular maior (11) na parte superior da zona cônica pode ser de 0,19 mm de diâmetro e a abertura circular pode ser de 0,07 mm em uma concretização preferida. A altura da zona cônica pode ser de cerca de 0,3 mm. A zona cilíndrica (14) pode ter também uma boca com o mesmo diâmetro que a abertura menor da zona cônica, através de todo seu orifício de saída circular (15) e pode ser de cerca de 0,15 mm de altura.

[039] A figura 4A ilustra uma vista inferior do bocal de orientação torsional simples mostrando o orifício circular. O orifício circular seria pequeno o bastante, de modo que gotículas finas contendo partículas possam ser formadas. O diâmetro em uma das concretizações preferidas pode ser de cerca de 0,07 mm. A figura 4 mostra uma vista superior do bocal de orientação torsional simples. Conforme pode ser visto claramente, a boca pode estar em uma forma circular com um diâmetro de cerca de 5,25 mm.

[040] Com referência à figura 5, pode ser visto como a orientação ocorre. Conforme pode ser observado, esta figura é um desenho modificado de Kachel e seus colegas (figura 3, Kachel e outros, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 774780). Este desenho, uma seção transversal ao redor da localização de elipse de demarcação desejada (9) mostra, primeiro, as distribuições das forças de orientação geradas da superfície interna torsional simples, semelhante a elipse. Conforme mostrado, a transformação não semelhante da superfície interna torsional simples semelhante a elipse pode fazer com que as forças preferenciais laterais gerem componentes de fluxo adicional ao longo do eixo principal e pode diminuir as forças geradas ao longo do eixo geométrico menor. Assim, as forças geradas ao longo do eixo geométrico maior podem ser vistas como mais fortes do

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 23/47 / 30 que as forças geradas ao longo do eixo geométrico menor para desta forma orientarem uma partícula plana (16) conforme mostrado. O projeto único da presente invenção mostra sua superioridade pelo que a zona interna semelhante a elipse, afunilada (c) é conectada diretamente à zona interna cilíndrica (d) e o orifício de saída circular (15). Esta geometria especialmente projetada evita com sucesso a lei de similaridade e, portanto, as partículas de amostra que foram orientadas serão capazes de deixar individualmente o orifício de saída circular e ainda manter seu estado alinhado e orientado.

[041] Além do acima, o elemento de superfície interna torsional simples, afunilado integral pode ser visualizado para compreender uma superfície de fluxo laminar. Através de um fluxo laminar e as forças de orientação torsionais simples geradas pela superfície de fluxo laminar, a amostra pode ser radialmente orientada e alinhada ao longo do eixo geométrico hidrodinâmico. A amostra alinhada e orientada é assim mantida no estado alinhado e orientado quando sai do orifício de saída circular, onde a amostra é dividida em partículas individuais e semelhante, é circundada por um fluido de queda de revestimento, e é analisado. Portanto, a amostra finalmente orientada pode ser devida aos esforços combinados da ponta chanfrada do tubo de injeção de amostra e a superfície interna de orientação torsional simples, devido a geometria única, gera forças de orientação torsional simples e produz fluxo laminar.

[042] Deve ser ressaltado que a superfície interna integral do bocal de orientação torsional simples pode se unitária. O modo de dividir a superfície interna integral na zona interna semelhante a elipse afunilada (c), a zona interna cilíndrica (d) e suas zonas subsequentes próprias conforme descrito acima, é puramente para uma finalidade de explicação clara.

[043] A indústria de reprodução animal vem tirando vantagem freqüente dos princípios da citometria de fluxo e utilizando os benefícios que um citômetro de fluxo de alta velocidade pode fornecer. Espécies de esperma sexuados podem agora ser discriminados com sucesso por mecanismos de classificação que o citômetro de fluxo emprega. Com este bocal de orientação torsional simples projetado unicamente, os espermas portando cromossomo X e Y podem ser classificados mais eficazmente e em uma porcentagem maior conforme descrito

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 24/47 / 30 acima. Células de esperma sexuadas podem ser tamponadas em nosso tampão compatível com esperma preparado especialmente conforme descrito na Publicação PCT número WO99/05505 (LoDo PCT). As células de esperma tamponadas podem ser injetadas no local de demarcação dentro do elemento de superfície interna torsional simples, semelhante a elipse do bocal de orientação torsional simples, onde eles podem ser circundados pelo fluido de revestimento para formar um esperma circundado por revestimento. Subseqüentemente, as gotas contendo esperma podem ser produzidas por um mecanismo de formação de gota e analisadas na área de queda livre. As gotas contendo esperma são então carregadas e classificadas pelo dispositivo de classificação e coletadas por um sistema de coleta compatível de esperma contendo um fluido de coleta de esperma especialmente fabricado. Este processo integral pode minimizar as tensões mediante o esperma criado através do processo de classificação. O esperma portando cromossomo X ou Y pode então ser usado para inseminação e produção de um mamífero de sexo desejado.

[044] Assim, é pelo menos o único projeto de uma geometria de superfície interna do bocal de orientação torsional simples que torna a invenção superior a outro bocal convencional. Conforme será esperado pelos versados na técnica comum, este bocal de orientação torsional, simples, quando especialmente combinados com um bocal de injeção de amostra chanfrado, localizado em um local apropriado em relação a uma região específica da superfície interna do bocal de orientação torsional simples, pode prover resultados que podem mesmo ser mais satisfatórios.

[045] Conforme mencionado anteriormente, o precedente discutiu o aspecto de alinhamento torsional da invenção. Um segundo aspecto importante é aquele de movimento axial da amostra. Este aspecto engloba não apenas o movimento da amostra conforme ela atravessa o bocal para baixo do eixo geométrico central, porém as tensões que a amostra recebe durante esta passagem. Estes movimentos podem talvez ser mais facilmente caracterizados por três valores, as três derivadas da distância com relação à localização ao longo da amostra. Estas derivadas podem ser resumidas como se segue:

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Derivada

Análogo de Conceito Mais Comum velocidade aceleração razão de alteração de aceleração

Primeira derivada da distância com relação à localização

Segunda derivada da distância com relação à localização

Terceira derivada da distância com relação à localização [046] Conforme pode ser entendido das figura 6-9c, o bocal pode apresentar qualquer número de superfícies de movimento axial, isto é, superfícies que influenciam ou talvez apenas confinem a amostra conforma a mesma passa através do bocal. Conforme mostrado na figura 6, as superfícies de movimento axial podem ser pares simétricos e podem também ser tão simples quanto uma superfície de movimento axial (21) e uma segunda superfície de movimento axial (22). Conforme a amostra passa abaixo do bocal (6), estas superfícies de movimento axial podem atuar de modo a influenciar a amostra ou sua viabilidade. A amostra é assim (geralmente hidrodinamicamente) submetida a uma primeira superfície de movimento axial (21). Ela pode então transitar em um local de transição (23) para tornar-se influenciada por uma segunda superfície de movimento axial (22). Após a localização de transição (23) a amostra é então submetida à segunda superfície de movimento axial (22). Ela pode então sair do bocal, tal como um orifício de saída circular (15).

[047] Deve ser entendido que as superfícies de movimento axial podem ter qualquer forma. Em um sistema, tal como um que possa ter velocidade constante, eles podem ter uma forma tubular. Conforme mostrado nas figuras 6 e 8, em um sistema tal como um que obtenha aceleração da amostra conforme ela passa através do bocal (6), pode ser configurado como superfícies de aceleração, tal como as superfícies cônicas mostradas. A superfície de aceleração poderia também desacelerar a amostra, naturalmente. Acelerando ou desacelerando, a superfície poderia alterar a velocidade da amostra, conforme ela passa através do bocal (6). Assim, pode ser entendido que o bocal (6), tal como mostrado na figura 8, pode incluir uma primeira superfície de aceleração axial (24) e uma

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 26/47 / 30 segunda superfície de aceleração axial (25). A primeira superfície de aceleração axial (24) faz com que a amostra experimente um primeiro valor de aceleração (que pode ou não ser constante) e a segunda superfície de aceleração axial (25) pode fazer com que a amostra experimente um segundo valor de aceleração. Este segundo valor de aceleração pode ou não ser diferente do primeiro. Conforme mostrado na figura 8, uma vez que a segunda superfície de aceleração (25) converge em uma razão diferente, provavelmente indicará um valor de aceleração diferente.

[048] Naturalmente, a qualquer hora que exista uma aceleração, a amostra pode experimentar uma tensão. Esta tensão pode ter impactos na viabilidade e funcionalidade das amostras. Um aspecto específico para algumas amostras, tal como células maiores, pode ser o fato de que quando existe uma alteração na velocidade, existem diferenças na tendência de velocidade de uma extremidade da amostra à próxima. Isto pode ser mais facilmente entendido com referência a uma amostra, tal como célula de esperma. Células de esperma viáveis possuem cabeças e caudas. Quando a cabeça é acelerada diferentemente da aceleração da cauda ou quando a cabeça é movida em uma velocidade diferente daquela da cauda, um diferencial pode ser criado cabeça para a cauda. Este diferencial pode causar tensão na célula. Em casos extremos, pode mesmo ser empurrar a cauda da cabeça. Obviamente isto poderia destruir a eficácia da amostra. A presente invenção provê um sistema através do qual isto pode ser minimizado e os efeitos indesejáveis podem ser evitados ou reduzidos. Isto é realizado por submeter-se a amostra a um grau baixo de alterações na aceleração ou velocidade através do comprimento da amostra. Como os versados na técnica seriam capazes de entender, baixo pode ser um termo relativo que depende da célula e do ambiente. Ele pode ser teórica ou empiricamente determinado como um valor que é mostrado para se obter as porcentagens práticas de eficácia na amostra para sua aplicação específica. Estas probabilidades podem ser tais como pelo menos 70%, 80%, 90% ou semelhante. A aceleração baixa ou razão de troca na aceleração pode também ser afirmativamente aplicada.

[049] Alterações na aceleração ou velocidade podem ocorrer quando as superfícies de movimento axial mudam. Estas alterações podem ser repentinas ou

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 27/47 / 30 brandas. Naturalmente, algumas concretizações da presente invenção preferem a última. Com referência à figura 6, pode ser visto como uma alteração repentina na superfície de movimento axial ao longo do eixo geométrico pode apresentar tensão para a amostra. A primeira superfície de movimento axial (21) altera em um modo separado no local de transição (23). Por exemplo, quando a segunda superfície de movimento axial (22) é criada por um elemento separado, tal como por inserção de uma jóia, pode existir uma descontinuidade no bocal (6). Em tal ponto, a amostra pode então ser submetida a uma alteração extrema na velocidade quase que instantaneamente. Observe que tal alteração em separado pode existir não intencionalmente, devido a desalinhamentos quase imperceptíveis. Independente disto, aspetos tais como estes tendem a empurrar a amostra para separação. Pela provisão de transições que podem não ser separadas a presente invenção pode evitar ou minimizar as tensões assim criadas. A transição pode ser uma transição contínua como na área curvada, por ter-se uma quantidade limitada de separação ou desalinhamento, ou pode apenas evitar a possibilidade de uma alteração separada por ter-se uma superfície interna no bocal (6) que é unitária. Desta maneira, o bocal pode efetivamente possuir uma superfície unitária. Em tal disposição, o bocal (6) pode ser afirmativamente projetado de modo a apresentar uma transição com uma diferenciação de aceleração máxima. Conforme mostrado na figura 8, isto pode ser feito através do projeto de uma área de transição de diferenciação de aceleração máxima limitada (26), tal como mostrado entre a primeira superfície de movimento axial e a segunda. Isto pode ser realizado por uso de um orifício de saída unitário. A área de transição de diferenciação de aceleração máxima limitada pode então ser pelo menos ou resultado do orifício de saída unitário.

[050] Em termos dos três derivados de distância com relação à localização mencionada anteriormente, os conceitos acima podem ser entendidos por referência às figuras 7 a-c e 9 a-c. Conforme mostrado, estas figuras são representações gráficas dos três valores de derivados nos respectivos locais nos seus bocais adjacentes mostrados nas figuras 6 e 8. As figuras 7a e 9a representam o primeiro derivado de distância com relação a localização, um conceito semelhante à velocidade. Uma vez que o bocal na figura 6 possui uma

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22/30 alteração separada no local de transição (23), pode ser visto que dl/di altera separadamente no local de transição (23). Para o bocal (6) na figura 8, o valor dl/di não se altera separadamente. Assim, a amostra pode ser tratada para reduzir a tensão, por esta razão, sozinha. Nas figuras 7a e 9b, pode ser visto que os valores d²1/di² p_{ara seu} respectivo bocal também são diferentes. Na figura 7b, o segundo derivado da distância com relação ao valor de localização (ou talvez mais facilmente visto como aceleração) possui um momento de extrema alteração. Novamente, isto não está tão presente na figura 9b. Finalmente, o terceiro derivado da distância com relação aos valores de localização d³l/di³, (ou talvez mais facilmente visto como razão de alteração de aceleração), também difere. Na figura 7c, o primeiro valor passa como positivo e só depois fica negativo. Nos valores mostrados na figura 9c, os valores nunca alteram os sinais, eles são tanto zero quanto positivo, porém nunca negativos. Cada um destes conceitos pode ser convenientemente construído, para entender-se e caracterizarse o bocal como ele é projetado para evitar ou minimizar as tensões na amostra. [051] Um outro aspecto que pode ser um fator para algumas amostras é o aspecto da duração da velocidade, aceleração ou razão de mudança de aceleração, conforme experimentado pela amostra. Isto pode também ser referido como tempo de parada para a amostra. Na citometria de fluxo, existe freqüentemente a necessidade de amostras simples serem colocadas em gotas simples. Aspectos como este podem causar um desejo de transição de fluido no último tempo possível. Nos sistemas que tendem fazer isto, pode ser importante prestar atenção específica às áreas das vizinhanças de cerca de 100 qm do ponto de saída (27) áreas de mais do que 300 qm para fora do ponto de saída (27), áreas nas vizinhanças do ponto de saída (27) ou mesmo áreas fora do ponto de saída (27). Além disto, em alguns sistemas, pode ser aceitável apenas momentaneamente submeter a amostra aos valores indesejados. Assim, os limites podem ser estabelecidos através de toco o bocal (6) ou nos locais específicos dentro do bocal (9). Alguns dos limites que podem ser aplicados são estabelecidos nas Tabelas 1 e 2.

Tabela 1: Valores d²1/di²

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23/30

0,16 m/seg. por mícron no bocal

0,05 m/seg. por mícron no bocal os valores acima fora das vizinhanças do ponto de saída

0,10 m/seg. por mícron fora do ponto de saída

0,13 m/seg. por mícron fora do ponto de saída,

0,16 m/seg. por mícron nas vizinhanças do orifício de saída,

0,20 m/seg. por mícron nas vizinhanças do ponto de saída,

0,23 m/seg. por mícron nas vizinhanças do ponto de saída,

100 X 10'³ m/seg. por mícron a uma distância superior 300 gm fora do orifício de saída, 50 X 10³ m/seg. por mícron a uma distância superior a 300 gm fora do orifício de saída, 25 X 10'³ m/seg. por mícron a uma distância superior a 300 gm fora o ponto de saída

Os valores que não alteram descontinuamente ao longo do eixo geométrico central

Valores que são no máximo quaisquer dos acima,

Quaisquer destes valores em vários locais,

Qualquer combinação destes valores

Quaisquer combinações destes valores com quaisquer dos valores na Tabela 2.

Tabela 2: Valores d³l/di³

100.000 X 10'⁶ m/seg. por mícron² no bocal,

10.000 X 10'⁶ m/seg. por mícron² no bocal,

2.000 X 10'⁶ m/seg. por mícron² no bocal,

No ponto de saída

100 X 10'⁶ m/seg. por mícron² a uma distância do ponto de saída

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1.100 X 10^-6 m/seg. por mícron² no bocal,

Nos valores acima, fora das vizinhanças do ponto de saída

100.000 X 10^-6 m/seg. por mícron2 fora das vizinhanças do ponto de saída,

50.000 X 10^-6 m/seg. por mícroii² fora do ponto de saída,

10.000 X 10^-6 m/seg. por mícroii² fora do ponto de saída,

5.000 X 10^-6 m/seg. por mícron2 fora do ponto de saída,

1.000 X 10^-6 m/seg. por mícron2 fora do ponto de saída,

Uma razão de alteração dos valores de aceleração com relação à localização axial como para não alterar descontinuamente no bocal, Uma razão de alteração dos valores de aceleração ou valores d³l/dl³ Valores que são no máximo, quaisquer dos acima

Qualquer combinação dos valores acima nos vários locais,

Qualquer combinação dos acima

Quaisquer combinações de quaisquer destes valores acima com quaisquer dos valores na Tabela 1

300 X 10^-6 m/seg. por mícroii² fora do ponto de saída,

200 X 10^-6 m/seg. por mícroii² a uma distância de.....

[052] Na coordenação afirmativa de tais aspectos com amostras específicas, os valores podem também ser estabelecidos com relação ao comprimento efetivo da célula/amostra. Estes comprimentos podem ser determinados teoricamente, medidos como o comprimento da amostra real ou mesmo ser empiricamente determinados como um comprimento de amostra eficaz. Novamente, estas ações afirmativas ou coordenadas resultam em evitar-se alteração de coisas vivas e podem permitir exatidão aos usuários. Nas determinações empíricas, entre outros, deve ser entendido que os valores obtidos podem ser escolhidos de modo a não exceder as capacidades práticas da amostra com seu comprimento, isto é, de modo que a amostra mantenha uma probabilidade suficientemente aceitável ou funcionalidade após ser processada. Destas maneiras, por coordenação da

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 31/47 / 30 diferenciação de aceleração máxima, por limitação afirmativa da diferenciação de aceleração máxima e por valores de escolha afirmativos (determinados ou não), de modo a não excederem as capacidades práticas da amostra, a presente invenção pode obter seus fins.

[053] Conforme mencionado anteriormente, a sinergia pode existir entre este aspecto e o aspecto de alinhamento hidrodinâmico da invenção. A torcedura e a tração combinadas podem e aparentemente causam tensão em algumas amostras, especialmente as células de esperma. Assim, a possibilidade de se combinarem as forças hidrodinâmicas torsionais e a diferenciação de aceleração máxima ou os valores semelhantes, estes aspectos podem combinar para minimizar a tensão. Pode ser também considerado o aspecto de combinação dos valores acima e conceitos com outros parâmetros que são provavelmente a causa de tensão em um ajuste de citômetro de fluxo. Tais parâmetros podem incluir operação em razões de classificação de pelo menos 500 classificações por segundo, pelo menos 1.000 classificações por segundo e pelo menos 1.500 classificações por segundo. De modo semelhante, isto pode incluir operações a 345 Kpa e semelhantes. Finalmente, conforme aludido acima, determinadas amostras são especificamente suscetíveis à tensão, para os aspectos mencionados acima ou para os valores estabelecidos acima. Isto pode ser especificamente verdadeiro para células de esperma, sistemas de coleta de espermas, células de esperma bovino, células de esperma eqüino, células de esperma que foram manchadas e classificadas por seu teor de DNA (tais como nas células de esperma sexuadas), células de esperma bovino de macho e fêmea classificadas e mesmo células de esperma eqüino de macho e fêmea classificadas.

[054] Conforme pode ser facilmente entendido do precedente, os conceitos básicos da presente invenção podem ser concretizados em uma variedade de modos. Isto envolve técnicas de exercício bem como dispositivos para realizar o exercício apropriado. Neste pedido, as técnicas de exercício são reveladas como parte dos resultados mostrados como sendo obtidos pelos vários dispositivos descritos e as etapas que são inerentes à utilização. Eles são simplesmente o resultado natural da utilização dos dispositivos como previstos e descritos. Além disto, embora alguns dispositivos seja revelados, deve ser entendido que estes

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 32/47 / 30 não apenas realizam determinados processos, porém também podem ser variados de muitos modos. De modo importante, de acordo com todo o precedente, todas estas facetas devem ser entendidas como sendo englobadas por esta revelação. [055] A discussão incluída neste pedido destina-se a servir como uma descrição básica. O leitor deve estar ciente de que a discussão específica pode não descrever explicitamente todas as concretizações possíveis; muitas alternativas estando implícitas. Também pode não estar completamente explicada a natureza genética da invenção e pode não mostrar explicitamente como cada aspecto ou elemento pode realmente ser representativo de uma função mais ampla de uma grande variedade de alternativas ou elementos equivalentes. Novamente, estes são implicitamente incluídos nesta revelação. Onde a invenção é descrita na terminologia orientada pelo dispositivo, cada elemento do dispositivo desempenha implicitamente uma função. As reivindicações do dispositivo podem não apenas estar incluídas para o dispositivo descrito, porém também o método ou reivindicações do processo podem estar incluídas para endereçar as funções da invenção e o desempenho de cada elemento. Nem a descrição nem a terminologia pretendem limitar o escopo das reivindicações que pode estar incluído a qualquer tempo através do processo do pedido de patente; esta revelação também seria interpretada como incluindo a possibilidade de qualquer e toda alteração e combinações de quaisquer elementos revelados na descrição ou apresentados nas reivindicações.

[056] Deve também ser entendido que uma variedade de alterações pode ser feita sem com isto fugir da essência da invenção. Tais alterações estão também implicitamente incluídas na descrição. Eles ainda encontram-se dentro do escopo desta invenção. Uma ampla revelação englobando as concretizações explicitadas mostradas, a grande variedade de concretizações implícitas e os amplos aspectos ou processos e semelhantes estão englobados por esta revelação e podem ter como base o esboço das reivindicações para este pedido. Este pedido busca o exame das reivindicações da forma mais ampla dentro do direito dos depositantes e deverá prover uma patente cobrindo os vários aspectos da invenção como um sistema independente e como um sistema total.

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 33/47 / 30 [057] Adicionalmente, cada um dos vários elementos da invenção e reivindicações podem também ser obtidos de vários modos. Esta revelação deverá ser entendida como englobando cada uma destas variações, sendo uma variação de uma concretização ou de qualquer concretização do dispositivo, processo ou concretização de processo ou mesmo meramente uma variação de qualquer elemento destes. Especificamente, deve ser entendido que, conforme a descrição refere-se aos elementos da invenção, as palavras para cada elemento podem ser expressas por termos de equipamento equivalentes ou termos de processo - mesmo se apenas a função ou o resultado for o mesmo. Tal equivalente, mais amplamente ou em termos mais genéricos seria considerado como estando englobado na descrição de cada elemento ou ação. Tais termos podem ser substituídos onde desejado, para tornar explicita a implicidade de ampla cobertura a qual a invenção se destina. Como exemplo, deve ser entendido que todas as ações podem ser expressas como um meio para tomar-se uma ação ou como um elemento que causa aquela ação. De modo semelhante, cada elemento físico revelado seria entendido como englobando a revelação da ação que o elemento físico facilita. Independente deste último aspecto, porém como um exemplo, a revelação de um 'bocal de orientação seria entendido como englobando a revelação de um elemento de orientação, o ato de orientar - se explicitamente discutido ou não e, de modo contrário, onde apenas a revelação do ato de orientar tal como uma revelação, seria entendida como englobando a revelação de um elemento de orientação e mesmo um dispositivo para orientação. Tais alterações e termos alternativos devem ser entendidos como estando explicitamente incluídos na descrição.

[058] Todas as referências na revelação, na lista de referências que se segue, depositadas com ou listas no pedido de prioridade e o pedido de prioridade propriamente, são cada uma anexadas e desta forma incorporadas como referência; contudo à medida que algumas declarações podem ser consideradas inconsistente com o patenteamento desta invenção, tais declarações não devem ser consideradas expressamente como sendo feitas pelos depositantes. Além disto, de acordo com cada termo usado, deve ser entendido que a medida que sua utilização neste pedido é inconsistente com tal interpretação, definições comuns

Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 34/47 / 30 de dicionário devem ser entendidas como incorporadas para cada termo e todas definições, termos alternativos e sinônimos, tal como contidos no Random House Webster's Unabridged Dicitionary, second edition são desta forma incorporados como referência.

[059] Finalmente, a menos que o contexto de outra forma requeira, deve ser entendido que o termo compreende ou variações tais como compreendendo destinam-se a implicar na inclusão de um elemento declarado ou etapa ou grupo de elementos ou etapas, porém não na exclusão de qualquer outro elemento ou etapa ou grupo de elementos ou etapas. Tais termos devem ser interpretados em sua forma mais expansiva, de modo a fornecer ao depositante a cobertura mais ampla legalmente permissível nos países, tais como, Austrália e semelhantes.

Documentos de Patente

N° DO DOCU- MENTO	DATA	NOME	CLASSE	SUBCLASSE	DATA DEPÓSI TO
4.362.246	07/12/8 2	Adair	209	3.3	14/06/80
4.660.971	28/04/8 7	Sage e outros	356	39	03/05/84
4.988.619	29/01/9 1	Pinkel	435	30	30/11/87
5.135.759	04/08/9 2	Johnson	424	561	26/04/91
5.371.585	06/12/9 4	Morgan e outros	356	246	10/11/92
5.439.362	08/08/9 5	Spaulding	424	185.1	25/07/94
5.466.572	11/14/9 5	Sasaki e outros	435	2	04/25/94
5.483.469	09/01/9 6	Van den Engh e outros	364	555	02/08/93

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5.60 2.039	11/02/9 7	Van den Engh	436	164	14/10/94
5.602.349	11/02/9 7	Van den Engh	73	864.85	10/14/94
5.660.997	26/08/9 7	Spaulding	435	7.21	07/06/95
5.690.895	25/11/9 7	Matsumoto e outros	422	73	06/12/96
5.700.692	23/12/9 7	Sweet	436	50	27/09/94
5.726.364	10/03/9 8	Van den Engh	73	864.85	10/02/97
5.985.216	16/11/9 9	Rens e outros	422	73	24/07/97
WO 99/05504	24/07/9 8	Pedido PCT	6
WO 96/12171	25/04/9 6	US

Outros Documentos

Dean, P.N., Pinkel, D. and Mendelsob. n, M.L. 1978. Hydrodynamic orientation of spermatozoa heads for flow cytometry. Biophys. J. 23:7-13. Fulwyler, M.J. 1977. Hydrodynamic orientation of cells. J Histochem. Cytochem. 25:781-783.

Seidel, G,E. Jr., Herickhoff, L.A., Schenk, J.L., Doyle, S.P. and Green, R.D. 1998. Artificial insemination of heifers with cooled, unfrozen, sexed semen. 1998. Theriogenology. 49(l):365

Johnson, L.A., Welch, G.R., Rens, W. and Dobrinsky, J.R. 1998. Enhanced flow cytometric sorting of mammalian X and Y sperm: high speed sorting and orienting no 77.le for artificial insemination. Theriogenology. 49(l):361. abstr.

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Kachel, V., et al., Uniform Lateral Orientation, Caused by Flow Forces, of Fiat Particles in Flow Through Systems, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1997, Vol. 25, No. 7, pp 774 -780.

Rens, W., et al., A Novel Nozzle for More Efficient Sperm Orientation to Improve Sorting Efficiency of X and Y Chromosome-Bearing Sperm, Technical Notes, Cytometry 33, 1998, pp 476-48 1.

Gumsey, M.P., and Johnson, L.A., Recent improvements in efficiency of flow cytometric sorting of X and Y chromosome bearing sperm of domestic animals: a review, 1998, New Zealand Society of Animal Protection, three pages.

Rens, W., et al., Improved Flow Cytometric Sorting of X- and YChromosome Bearing Sperm: Substantial Increase in Yield of Sexed Semen, Molecular Reproduction and Development, 1999, pp 50-56.

Johnson, L.A., Welch, G.R., Gamer DL. 1994. Improved flow sorting resolution of X- and Y- chromosome bearing viable sperm separation using dual staining and dead cell gating. Cytometry 17 (supp] 7):83.

Welch G.R., Houck D.W., Johnson L.A., 1994. Fluidic and optical modifications to a FACS IV for flow sorting of X- and Y- chromosome bearing sperm based on DNA. Cytometry 17 (suppl. 7): 74.

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Pedido US 09/454.488, intitulado Improved Flow Cytometer Nozzle and Flow Cytometer Sample Handling Methods, filed December 3, 1999

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Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Método de processamento de amostra de citometria de fluxo, caracterizado por compreender as etapas de:

   a - estabelecimento de um fluido de revestimento; b - injeção da amostra dentro do fluido de revestimento em um ponto de injeção;

   c - sujeição da amostra a uma primeira superfície de movimento axial afunilada em um bocal possuindo um eixo central;

   d - transição para uma segunda superfície de movimento axial afunilada no referido bocal;

   e - sujeição da amostra à segunda superfície de movimento axial no bocal onde as primeira e segunda superfícies de movimento axial transitam com uma diferenciação de aceleração máxima;

   f - coordenação da diferenciação de aceleração máxima e do bocal, de modo a não exceder as capacidades práticas da amostra em seu comprimento; e g - limitar afirmativamente a diferenciação de aceleração máxima, de modo a não exceder as capacidades práticas da amostra em seu comprimento;

   h - saída da amostra do bocal; e

   1 - análise da amostra.
2. 2 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de sujeição da amostra a uma primeira superfície de movimento axial em um bocal compreender a etapa de sujeição da amostra a uma primeira superfície de aceleração axial no bocal e onde a etapa de sujeição da amostra à segunda superfície de movimento axial no bocal compreender a etapa de sujeição da amostra a uma segunda superfície de aceleração axial, onde as primeira e segunda superfícies de movimento axial transitam com uma diferenciação de aceleração máxima.
3. 3 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de trânsito para uma segunda superfície de movimento axial no bocal compreender a etapa de submissão da amostra a uma superfície unitária.

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4. 4 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de trânsito para uma segunda superfície de movimento axial no bocal compreender a etapa de submissão da amostra a um orifício de saída unitário.
5. 5 - Método de acordo com a reivindicação 1, e caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de:

   a - formação de gotas ao redor da amostra após a mesma ter saído do bocal; e b - classificação das gotas em uma razão selecionada do grupo compreendendo, pelo menos, 500 classificações por segundo, pelo menos 1.000 classificações por segundo e, pelo menos, 1.500 classificações por segundo.
6. 6 - Método de processamento de amostra de citometria de fluxo de acordo com a reivindicação 1, e caracterizado por compreender, adicionalmente a etapa de pressurização do bocal a uma pressão de pelo menos 344,73 Kpa.
7. 7 - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a etapa de injeção da amostra dentro do fluido de revestimento em um ponto de injeção compreender a etapa de injeção das células de esperma no fluido de revestimento.
8. 8 - Método de processamento de amostra de citometria de fluxo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a etapa de injeção da amostra dentro do fluido de revestimento em um ponto de injeção compreender a etapa de injeção das células de esperma no fluido de revestimento.
9. 9 - Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a etapa de injeção da amostra no fluido de revestimento em um ponto de injeção compreender a etapa de injeção de células de esperma selecionadas do grupo compreendendo células de esperma bovino e células de esperma eqüino no fluido de revestimento.
10. 10 - Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender as etapas de:

    a - estabelecimento de uma superfície torsional simples no bocal; b - geração de forças hidrodinâmicas torsionais simples da superfície torsional simples; e

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    3 / 3 c - orientação da amostra com as forças hidrodinâmicas torsionais simples.
11. 11 - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as forças hidrodinâmicas torsionais simples e a diferenciação de aceleração máxima combinarem e serem afirmativamente escolhidas, de modo a não excederem as capacidades práticas da amostra em seu comprimento.
12. 12 - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a etapa de injeção da amostra no fluido de revestimento em um ponto de injeção compreender a etapa de injeção de células de esperma no fluido de revestimento.
13. 13 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ângulo de afunilamento da segunda superfície de movimento axial em relação ao eixo central ser maior do que o ângulo de afunilamento da primeira superfície de movimento axial em relação a um eixo central do bocal.

    Petição 870170096005, de 08/12/2017, pág. 40/47

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