ES2339366T3 - Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes. - Google Patents
Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes. Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína oligomérica que comprende 2, 3, ó 4 proteínas de fusión, en la que cada proteína de fusión comprende: c) un polipéptido (A'') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, siendo dicho polipéptido un anticuerpo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un fragmento recombinante del mismo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y d) un polipéptido (B'') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) un péptido o proteína inhibi- dor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicho péptido o proteína inhibidor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis.
Description
Inhibidores de angiogénesis multifuncionales y
multivalentes.
La invención se relaciona con proteínas de
fusión útiles como inhibidores de angiogénesis multifuncionales y
multivalentes que comprenden un polipéptido que reconoce y bloquea
una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el
proceso de angiogénesis y un polipéptido que comprende un dominio de
oligomerización y una región funcionalmente activa, inhibidora o
moduladora del proceso de angiogénesis, separados por una región
sensible a proteinasas. La invención también se refiere a las
construcciones génicas y vectores útiles para la producción de
dichas proteínas de fusión.
La angiogénesis es el proceso biológico que
conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los
preexistentes en un órgano o tejido. La angiogénesis comienza con la
descomposición de la membrana basal debido a la acción de las
proteinasas secretadas por las células endoteliales, continúa con la
migración y proliferación de dichas células endoteliales, para
finalizar con la formación del lumen, la membrana basal y el
envolvimiento con células periféricas.
En condiciones fisiológicas normales en un
adulto sano, no hay angiogénesis con la excepción de los fenómenos
asociados con el ciclo menstrual femenino y la cicatrización de
heridas. Sin embargo, un desequilibrio en el proceso de la
angiogénesis contribuye al desarrollo de desórdenes patológicos,
tales como la artritis reumática, retinopatía diabética, psoriasis,
bartonelosis, rechazo de órganos trasplantados, hemorragias y
neovascularización ocular (uno de los casos más frecuentes de
ceguera), la retinopatía diabética, la retinopatía del prematuro,
la degeneración macular, el glaucoma neovascular, la oclusión de las
venas de la retina, la oclusión arterial de la retina, el
pterigium, la rubeosis, la neovasculatura corneal, los tumores
sólidos, la hemangioma y la proliferación y metástasis de los
tumores, entre otros.
La angiogénesis juega, además, un papel
importante en el crecimiento progresivo y dispersión metastásica de
los tumores. Un tumor tiene que estimular continuamente el
desarrollo de nuevos capilares para poder crecer. Los nuevos vasos
generados en el tumor proporcionan a las células malignas una vía
por donde pueden entrar en la circulación y establecer metástasis
en lugares distantes. Si esta actividad angiogénica pudiera
reprimirse o eliminarse, entonces el tumor, aunque presente, no
podría desarrollarse.
Por este motivo, diversos grupos de
investigadores están trabajando en la búsqueda de compuestos que
ejerzan una acción inhibitoria de la angiogénesis (inhibidores de
la angiogénesis o agentes antiangiogénicos) útiles como agentes
terapéuticos para el tratamiento o prevención de patologías que
cursan con el desarrollo de angiogénesis.
En relación con los tumores, se acepta que los
tumores no pueden crecer o metastatizar a otro órgano sin la
génesis de nuevos vasos sanguíneos, constituyendo el cambio
("switch") angiogénico un acontecimiento temprano en la
progresión tumoral. Se han descrito diversas estrategias
anti-angiogénicas que interfieren en diferentes
niveles de la vía angiogénica: bloqueando la actividad del factor de
crecimiento; inhibiendo las proteinasas de la matriz extracelular
(MEC); dirigiéndose directamente a las células endoteliales (CE);
regulando por exceso los inhibidores endógenos, etc. Los
inhibidores endógenos de la angiogénesis han recibido una especial
atención en la terapia del cáncer, dado que parece que son agentes
no tóxicos y no inmunogénicos. Se han identificado, al menos, 10
inhibidores angiogénicos endógenos [O'Reilly, M.S. et al.,
Cell, 88: 277-285, 1997], de los cuales, los que
mejor se conocen son la angiostatina y la endostatina.
Las endostatinas (ES) son inhibidores de la
migración de células endoteliales y de la angiogénesis y se ha
demostrado que reducen el crecimiento tumoral en modelos animales.
Los mecanismos implicados en dichos efectos no están claro, aunque
se ha propuesto que está implicada la unión a los receptores de la
superficie celular (integrinas y heparán sulfatos,
VEGFR-2), las metaloproteinasas y los componentes de
la MEC. Las ES derivan del dominio NC1 de los colágenos XV y XVIII,
de donde se liberan proteolíticamente en forma trimérica y además
se convierten en endostatinas monoméricas de aproximadamente 20 kDa.
En el extremo N-terminal de NC1, hay un dominio de
trimerización de aproximadamente 60 residuos conectado con el módulo
de ES de 180 residuos aproximadamente mediante una región bisagra
flexible que contiene diversos sitios sensibles a proteinasa que
liberan endostatina después de la escisión proteolítica.
Boehm et al. [Nature, 390:404 (1997)]
describen el empleo, como modelo experimental, de ratones a los que
se les habían implantado diversos tumores (carcinoma pulmonar de
Lewis, fibrosarcoma y melanoma). En los ratones no tratados con ES,
dichos tumores crecieron rápidamente, provocando la muerte del
animal. En cambio, los ratones tratados con ES después del
desarrollo de tumores, se observó una reducción del volumen tumoral
hasta alcanzar un tamaño casi microscópico. El tratamiento cíclico
con ES de ratones portadores de tumor produjo una regresión
completa de los tumores en modelos animales. Sin embargo, ensayos
clínicos que se están llevando a cabo con ES no han reportado una
inhibición significativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha
observado regresión tumoral. Desgraciadamente, este no es un
ejemplo aislado y otros ensayos clínicos que incluyen diferentes
moléculas anti-angiogénicas también son
decepcionantes, a pesar de lo notables que fueron los efectos
antitumorales en los modelos animales. En este contexto, parece
lógico combinar varios inhibidores de la angiogénesis para el
tratamiento de cánceres humanos. Alternativamente, la actividad
biológica potenciada (ES + angiostatina) y la acción dirigida hacia
el tumor [ES + RGD (arginina-glicina-ácido
aspártico)] pueden mejorar potencialmente la inhibición del
crecimiento tumoral.
Por otra parte, se ha demostrado el potencial
terapéutico de un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un
anticuerpo anti-laminina (L36) con actividad
anti-angiogénica tanto in vivo como in
vitro. Los resultados pusieron de manifiesto que la alteración
del potencial morfogenético de las matrices asociadas a las células
es una forma eficaz de impedir in vivo la formación de vasos
sanguíneos asociada al tumor.
A pesar de los esfuerzos realizados hasta la
fecha, sigue existiendo la necesidad de desarrollar compuestos
inhibidores de la angiogénesis útiles como agentes terapéuticos para
el tratamiento o prevención de patologías que cursan con el
desarrollo de angiogénesis.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar compuestos con actividad antiangiogénica potencialmente
útiles como agentes terapéuticos para la prevención y/o el
tratamiento de patologías que cursan con angiogénesis, por ejemplo,
psoriasis, artritis reumática, retinopatías, cáncer, etc.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en unas proteínas de fusión, potencialmente útiles como
inhibidores de angiogénesis multifuncionales y multivalentes, que
comprenden un (a) polipéptido que comprende una región que reconoce
y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada
en el proceso de angiogénesis y (b) un polipéptido que comprende un
dominio de oligomerización y una región funcionalmente activa,
inhibidora o moduladora del proceso de angiogénesis, separados por
una región sensible a proteinasas.
La invención se ilustra mediante la construcción
de varias quimeras proteicas. Una de las proteínas de fusión (véase
el Ejemplo) comprende el fragmento Fv de cadena única del anticuerpo
(scFv) monoclonal L36 anti-laminina y el dominio
NC1 de colágeno XVIII que comprende un dominio de trimerización y un
dominio de endostatina (ES) unidos por un péptido bisagra que
contiene sitios sensibles a proteinasas que liberan ES monomérica
tras la escisión proteolítica. Los niveles de proteinasas están
aumentados en el microentorno tumoral, por lo que dicha proteína de
fusión libera in situ tanto monómeros de ES como trímeros de
scFv. Dicha proteína de fusión fue secretada por las células
humanas genéticamente modificadas en una forma funcionalmente
activa. La forma intacta tiene una masa molecular de 210 kDa
aproximadamente, lo que indica que, en condiciones fisiológicas,
subunidades individuales se asocian de manera no covalente para
producir una estructura trimérica. Dicha proteína de fusión
trimérica inhibió de manera considerable la capacidad de las células
endoteliales para migrar en respuesta a factores de crecimiento y
para desarrollarse en túbulos tipo capilares cuando crecían sobre
sustratos de Matrigel. Asimismo, dicha proteína de fusión se trató
con varias proteinasas distintas. Los datos muestran que la
catepsina L, la elastasa pancreática y diversas metaloproteinasas de
la matriz (MMP) generan tanto monómeros tipo ES como fragmento de
anticuerpo (scFv) trimérico. Además, las proteínas de fusión se
procesaron correctamente cuando fueron producidas por células
tumorales productoras MMP genéticamente modificadas, pero no cuando
fueron producidas por células genéticamente modificadas, que no
producían MMPs. Estos resultados abren la vía para una nueva
estrategia de terapia génica contra el cáncer utilizando ese tipo de
proteínas de fusión, las cuales forman parte de una nueva
generación de inhibidores de la angiogénesis útiles como agentes
terapéuticos para tratar enfermedades asociadas a desequilibrios en
dicha angiogénesis.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con una construcción génica que comprende, operativamente
unidas, al menos una secuencia de ácido nucleico (A), que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que
reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula
implicada en el proceso de angiogénesis; y una secuencia de ácido
nucleico (B), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización,
(ii) una región funcionalmente activa en el proceso de
angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho
dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en
el proceso de angiogénesis, en donde el extremo 3' de dicha primera
secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico (B).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un cassette de expresión que comprende dicha construcción génica,
operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector recombinante que comprende dicha construcción génica o
dicho cassette de expresión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora que comprende dicha construcción génica, o
dicho cassette de expresión, o dicho vector recombinante.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una proteína de fusión obtenible por expresión de la secuencia de
ácido nucleico contenida en dicha construcción génica. Dicha
proteína de fusión, típicamente, comprende un polipéptido (A') que
comprende una región que reconoce y bloquea una región
funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de
angiogénesis; y un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de
oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el
proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas
entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente
activa en el proceso de angiogénesis.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende bien dicha proteína de
fusión junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente
aceptable, o bien un vector que comprende una construcción génica
de la invención, o un cassette de expresión de la invención, y,
opcionalmente, al menos, un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dicha proteína de fusión, o de dicha construcción
génica o de dicho cassette de expresión o de dicho vector
recombinante, en la elaboración de una composición farmacéutica
para prevenir, tratar, impedir o minimizar el desarrollo de
angiogénesis.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dicha proteína de fusión, o de dicha construcción
génica o de dicho cassette de expresión o de dicho vector
recombinante, en la elaboración de una composición farmacéutica
para el tratamiento y/o prevención de patologías que cursan con
angiogénesis.
La Figura 1 es una representación cartográfica
en donde se muestra el efecto sobre la morfogénesis capilar del
tratamiento individual y combinado con diferentes concentraciones de
un anticuerpo monoclonal recombinante con formato scFv (L36)
[fragmento Fv de cadena única del anticuerpo monoclonal
anti-laminina L36] y de una proteína de fusión
dimérica Fc-ES (proteína de fusión entre el dominio
ES y el fragmento Fc de una inmunoglobulina).
La Figura 2 ilustra la producción de una
proteína de fusión proporcionada por esta invención y su
procesamiento proteolítico. La Figura 2A muestra esquemáticamente
el gen \alpha1 (colágeno XVIII) y la secuencia codificante del
dominio NC1. La Figura 2B muestra esquemáticamente dicho dominio NC1
que comprende un péptido conector, el dominio de trimerización, el
péptido bisagra y el dominio de ES. La Figura 2C muestra
esquemáticamente una quimera o proteína de fusión formado por un
anticuerpo monoclonal recombinante con formato scFv y el dominio
NC1 de colágeno XVIII (L36). La Figura 2D muestra el resultado del
procesamiento proteolítico de dicha proteína de fusión observándose
la formación de un anticuerpo trimérico y ES monomérica.
La Figura 3A muestra esquemáticamente la
estructura génica de un anticuerpo en formato scFv y diversas
construcciones génicas que contienen (o no) la secuencia
codificante del dominio de la ES. La Figura 3B muestra los
resultados de un análisis por western blot de las proteínas de
fusión purificadas; la inmunotransferencia se reveló con un
anticuerpo monoclonal (AcM) anti-myc y/o con un AcM
anti-ES [carril 1: L36 scFv, carril 2: L36
scFv-NC1^{ES-}, carril 3: L36
scFv-NC1^{ES+}, carril 4: NC1 y carril 5: ES].
La Figura 4A muestra un gradiente de equilibrio
de sedimentación del dominio scFv-NC1^{ES-} (1
mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) a 11.000 rpm
y 20ºC. Los círculos abiertos representan datos, las tres líneas
sólidas representan los gradientes teóricos de un monómero (37.148
Da), un dímero (74.296 Da) y un trímero (111.444 Da) de scFv. En el
recuadro superior de dicha Figura 4A, se muestra la distribución de
la velocidad de sedimentación de la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES-} (1 mg/ml en tampón PBS) a 42.000
rpm y 20ºC. La Figura 4B es una gráfica que muestra la afinidad de
unión a laminina inmovilizada en un soporte plástico [mayor en el
caso de la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-}
(trimérica) que en el caso de L36 scFv (monomérico)]. La Figura 4C
es una gráfica que muestra la modulación dependiente de dosis de la
diferenciación de células endoteliales (en respuesta a diferentes
concentraciones de scFv o de L36 scFv-NC1^{ES-})
en un ensayo habitual en Matrigel. Cada punto representa la media
de dos pocillos más menos la desviación estándar. La Figura 4D
muestra los resultados de someter a la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES-} a la acción de diversas
proteinasas (MMPs, elastasa pancreática porcina y catepsina L).
La Figura 5 muestra la distribución de la
velocidad de sedimentación de L36 scFv-NC1^{ES+}
(Figura 5A) y de NC1 (Figura 5B). La Figura 5C muestra las curvas
de saturación obtenidas con las concentraciones indicadas de L36
scFv-NC1^{ES+} y NC1. La Figura 5D es una gráfica
que representa la modulación dependiente de dosis de la
diferenciación de células endoteliales (en respuesta a diferentes
concentraciones de L36 scFv, L36 scFv-NC1^{ES+},
NC1 o Fc-ES) en un ensayo habitual en Matrigel. Cada
punto representa la media de dos pocillos más menos la desviación
estándar. La Figura 5E es un diagrama de barras que muestra la
modulación en un ensayo de migración de células endoteliales HUVEC
mediante L36 scFv (L36), NC1, L36 scFv-NC1^{ES+} o
Fc-ES (ES) [como control se utilizó PBS].
La Figura 6A muestra el resultado del
tratamiento de L36 scFv-NC1^{ES+} condiferentes
proteinasas (MMPs, elastasa pancreática porcina y catepsina L),
mientras que la Figura 6B muestra los resultados del mismo
tratamiento para NC1. Las proteínas purificadas se incubaron
durante los tiempos indicados con las distintas proteinasas tal
como se menciona en el Ejemplo (véase el apartado de Material y
Métodos) y las mezclas de reacción fueron analizadas mediante
SDS-PAGE (Figura 6C) o mediante western blot con un
AcM anti-endostatina. Las distancias de migración
de los marcadores de peso molecular y NC1 están indicadas en la
izquierda de dichas figuras. Las puntas de flecha vacías en las
Figuras 6A y 6B indican los productos proteolíticos.
En un aspecto, la invención se relaciona con una
construcción génica, en adelante construcción génica de la
invención, que comprende, operativamente unidas, al menos:
- a)
- una primera secuencia de ácido nucleico (A), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y
- b)
- una segunda secuencia de ácido nucleico (B), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis,
en donde el extremo 3' de dicha primera
secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico (B).
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ácido nucleico (A)
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una
molécula implicada en el proceso de angiogénesis. Ejemplos
ilustrativos de moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis
incluyen proteínas de la matriz extracelular (MEC), factores
angiogénicos, receptores de membrana celular, etc. Entre las
proteínas de la MEC se encuentran el colágeno, los proteoglicanos,
la fibronectina, la laminina, la tenascina, la entactina y la
trombospondina. En una realización particular, dicha molécula
implicada en el proceso de angiogénesis es una laminina, tal como
una laminina de mamífero, por ejemplo, una laminina de rata, ratón o
ser humano. Entre los factores angiogénicos se encuentra la familia
de los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF, vascular
endotelial growth factor), etc. Asimismo, entre los receptores de
membrana celular implicados en la angiogénesis se pueden citar los
receptores de dichos factores angiogénicos, por ejemplo, el receptor
2 de VEFG (VEFGR-2), integrinas, etc.
Prácticamente cualquier polipéptido que
comprenda una región que reconozca y bloquee una región
funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de
angiogénesis puede ser utilizado en esta invención, tal como un
anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo
monoclonal o policlonal, que reconozca una molécula implicada en el
proceso de angiogénesis, o un fragmento recombinante del mismo que
contenga la región que reconoce a dicha molécula implicada en el
proceso de angiogénesis, por ejemplo, en su formato recombinante de
cadena única (fragmento Fv de cadena única o scFv), bifuncional
(diabody), completo (Fab + Fc), etc.; no obstante, en una
realización particular, la secuencia de ácido nucleico (A) codifica
un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) recombinante derivado del
AcM L36 anti-laminina (Ejemplo 1) que contiene la
región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal
L36 fusionada, a través de un linker, tal como un péptido
que comprende la secuencia G_{4}S, a la región variable de la
cadena ligera (VL) del AcM L36 (Figura 2C), y cuya secuencia ha
sido descrita por Sanz L et al. [Cancer Immunology and
Immunotherapy, 2001 Dec;
50(10)557-65], en donde el extremo 3'
de la secuencia codificante de VL está unido al extremo 5' de la
secuencia codificante de dicho linker y el extremo 3' de la
secuencia de nucleótidos codificante de dicho linker está unido al
extremo 5' de la secuencia codificante de
VL.
VL.
El AcM L36 reconoce lamininas de diferentes
especies de animales, por ejemplo, de ratón, rata, humanos, etc.,
ya que interacciona con una región que está muy conservada entre
diferentes especies de animales [Sanz L et al. EMBO J 2003,
Vol. 22(7):1508-1517].
Debido a sus propiedades, dicho polipéptido que
reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula
implicada en el proceso de angiogénesis, tal como un anticuerpo, en
cualquiera de sus formatos (scFv, bifuncional o completo) puede
reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de una
molécula implicada en el proceso de angiogénesis, y puede dirigir a
un péptido antiangiogénico fusionado a dicho polipéptido hacia las
moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis, por ejemplo,
proteínas de la MEC, factores angiogénicos, receptores de membrana
celular, etc., y bloquear regiones funcionalmente activas de dichas
moléculas.
La secuencia de ácido nucleico (B)
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región
funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una
región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización
(i) y dicha región funcionalmente activa en el proceso de
angiogénesis (ii).
El dominio de oligomerización es un dominio que
permite la formación de oligómeros (e.g., dímeros, trímeros,
tetrámeros, etc., de péptidos o proteínas). Para la puesta en
práctica de la invención puede utilizarse virtualmente cualquier
dominio de oligomerización, por ejemplo, un dominio de dimerización,
trimerización, tetramerización, etc., presente en distintas
proteínas, tanto de origen eucariótico como procariótico,
susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un
oligómero proteico de la proteína que lo comprende. En una
realización particular, dicho dominio de oligomerización es un
dominio de trimerización, tal como el dominio de trimerización del
dominio NC1 de colágeno XVIII o del colágeno XV.
La región funcionalmente activa en el proceso de
angiogénesis comprende cualquier péptido o proteína funcionalmente
activo en el proceso de angiogénesis, tal como un péptido o proteína
inhibidor o modulador del proceso de angiogénesis. Prácticamente
cualquier péptido o proteína funcionalmente activo en el proceso de
angiogénesis puede ser utilizado en la presente invención; no
obstante, en una realización particular, dicha región funcionalmente
activa en el proceso de angiogénesis comprende una endostatina (ES)
de mamífero, tal como la ES presente en el dominio NC1 de colágeno
XV o de colágeno XVIII.
La región sensible a proteinasas está situada
entre dicho dominio de oligomerización (i) y dicha región
funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis (ii), y
comprende una secuencia peptídica susceptible a la acción de
proteinasas. Aunque podría utilizarse en la invención cualquier
secuencia peptídica susceptible a la acción de cualquier
proteinasa, en la práctica resulta ventajoso que dicha proteinasa
sea una proteinasa que solo se expresa en el entorno tumoral con lo
que la proteína de fusión de la invención será "procesada"
originando monómeros de péptidos o proteínas funcionalmente activos
en el proceso de angiogénesis y moléculas triméricas de polipéptido
capaz de reconocer y bloquear una región funcionalmente activa de
una molécula implicada en el proceso de angiogénesis. Por tanto, en
una realización particular, dicha región sensible a proteinasas
comprende la región bisagra presente en el dominio NC1 de colágeno
XV ó XVIII de mamífero, entre el dominio de trimerización y el
dominio o región de la ES de dicho dominio NC1, ya que dicha región
es sensible a la acción de proteinasas que solo se expresan en el
entorno tumoral.
Por tanto, en una realización particular y
preferida, la secuencia de ácido nucleico (B) comprende la secuencia
de nucleótidos que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de
mamífero o para el dominio NC1 del colágeno XV de mamífero. Como es
conocido, dicho dominio NC1 del colágeno XVIII (y del colágeno XV)
comprende un dominio de trimerización y un dominio de ES unidos por
un péptido bisagra (Figura 2B). Las secuencias de dichos dominios
NC1 de colágeno XV y XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la
secuencia del dominio NC1 del colágeno XVIII ha sido descrita
previamente por Sasaki et al. [Sasaki et al.
Structure, function and tissue forms of the
C-terminal globular domain of collagen XVIII
containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug
3;17(15):4249-56]. En el Ejemplo 1 se
describe la obtención de la secuencia de nucleótidos que comprende
la región que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de
ratón.
Cualquier otro dominio similar al dominio NC1 de
colágeno XVIII que comprenda (i) un dominio de oligomerización,
(ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis,
y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de
oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso
de angiogénesis, ventajosamente, una región sensible a proteinasas
que se expresan en el entorno tumoral, puede ser utilizada en la
puesta en práctica de la presente invención.
En general, la secuencia de ácido nucleico (A)
no se fusiona directamente a la secuencia de ácido nucleico (B)
sino que resulta ventajoso introducir un péptido de unión flexible
(o péptido espaciador) entre los polipéptidos codificados por
dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B). Por tanto, si se
desea, la construcción génica de la invención también puede
contener, además, una tercera secuencia de ácido nucleico (C)
que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de
unión flexible situada entre dichas secuencias de ácido nucleico
(A) y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido
nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido
nucleico (A) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico
(C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico
(B). Ventajosamente, dicho péptido espaciador (C) es un péptido con
flexibilidad estructural. Prácticamente, cualquier péptido con
flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo,
dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de
aminoácidos, en particular de restos de Gly y Ser o cualquier otra
repetición de restos de aminoácidos adecuada. Prácticamente
cualquier secuencia peptídica que defina un péptido de unión
flexible puede ser utilizada en la presente invención. Ejemplos
ilustrativos de péptidos de unión flexibles incluyen secuencias de
tipo Gly-Ser-Pro-Gly
(GSPG) o la secuencia (Gly-Ser)_{4}. No
obstante, en una realización particular, dicho péptido de unión
flexible comprende la secuencia
Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
Por tanto, en una realización particular, la construcción génica de
la invención comprende, además de dichas secuencias de ácido
nucleico (A) y (B) una tercera secuencia de ácido nucleico (C) que
comprende la secuencia de nucleótidos
que codifica el péptido Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
que codifica el péptido Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento
y purificación de la proteína de fusión obtenida mediante la
presente invención, la construcción génica de la invención puede
contener, si se desea, una secuencia de ácido nucleico que codifica
un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o
purificación de la proteína de fusión. Por tanto, en una
realización particular, la construcción génica de la invención
incluye, si se desea, una secuencia de ácido nucleico (D) que
contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido
susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o
purificación, conocido como péptido etiqueta o tag. Dicha
secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada en cualquier
posición que no altere la funcionalidad de ninguno de los
polipéptidos expresados por dichas secuencias de ácidos nucleicos
(A) y (B). A modo ilustrativo, dicha secuencia de ácido nucleico
(D) puede estar situada aguas abajo del extremo 3' de dicha
secuencia de ácido nucleico (B). Prácticamente cualquier péptido o
secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación de la
proteína de fusión puede ser utilizado, por ejemplo, secuencias de
polihistidina, secuencias peptídicas susceptibles de ser
reconocidas por anticuerpos que pueden servir para purificar la
proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad,
tales como péptidos etiqueta, etc., por ejemplo, epítopos derivados
de de la hemaglutinina del virus de la gripe o epítopo
C-myc, etc.
La construcción génica de la invención puede
obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en
el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular
cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. Dicha
construcción génica de la invención puede incorporar,
operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de
las secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos
codificados por las secuencias de ácido nucleico (A) y (B),
constituyendo de este modo un cassette de expresión. Tal como se
utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente
unida" significa que los polipéptidos codificados por las
secuencias de ácido nucleico (A) y (B), y, en su caso (C), son
expresados en el marco de lectura correcto bajo el control de las
secuencias de control o reguladoras de expresión.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un cassette de expresión que comprende la construcción
génica de la invención operativamente unida a una secuencia de
control de expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína de fusión proporcionada por esta invención que comprende
(a) un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente
activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, y
(b) un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización,
(ii) una región funcionalmente activa en el proceso de
angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho
dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en
el proceso de angiogénesis. Las secuencias de control son secuencias
que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la
traducción de dicha proteína de fusión, e incluyen secuencias
promotoras, secuencias codificantes para reguladores
transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o
secuencias terminadoras de transcripción. En una realización
particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en
células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc.,
mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de
control de expresión es funcional en células y organismos
eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células vegetales,
células de mamífero, etc. Ejemplos ilustrativos de promotores que
pueden estar presentes en el cassette de expresión proporcionado por
esta invención incluyen el promotor de citomegalovirus humano
(hCMV), etc.
Ventajosamente, dicho cassette de expresión
comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o para
un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora
transformada con dicho cassette de expresión. Ejemplos ilustrativos
de dichos marcadores que podrían estar presentes en el cassette de
expresión de la invención incluyen genes de resistencia a
antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y, en
general, todos aquellos que permitan seleccionar a las plantas
transformadas genéticamente.
La construcción génica de la invención, o el
cassette de expresión proporcionado por esta invención, pueden ser
insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la
invención se relaciona con un vector, tal como un vector de
expresión, que comprende dicha construcción de génica de la
invención o dicho cassette de expresión. La elección del vector
dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir
posteriormente. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce
dicha secuencia de ácido nucleico puede ser un plásmido o un vector
que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no
en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede
realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en
la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En
una realización particular, dicho vector recombinante es un vector
útil para transformar células animales.
Dicho vector puede ser utilizado para
transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser
transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas
células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro
aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora
transformada, transfectada o infectada con un vector proporcionado
por esta invención. Dicha célula transformada, transfectada o
infectada comprende, por tanto, una construcción génica de la
invención, o bien dicho cassette de expresión o vector proporcionado
por esta invención. Células transformadas, transfectadas o
infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales
conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al.,
1989, citado supra]. En una realización particular, dicha
célula hospedadora es una célula animal transformada, transfectada o
infectada con un vector apropiado, siendo dicha célula animal
transformada, transfectada o infectada capaz de expresar la proteína
de fusión proporcionada por esta invención, por lo que dichos
vectores pueden utilizarse para la expresión en células animales de
la proteína de fusión proporcionada por esta invención.
La construcción génica de la invención puede ser
utilizada para producir proteínas de fusión que comprenden (a) un
polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una
región funcionalmente activa de una molécula implicada en el
proceso de angiogénesis; y (b) un polipéptido (B') que comprende (i)
un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente
activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a
proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región
funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un método para producir dicha proteína de fusión
proporcionada por esta invención que comprende crecer una célula u
organismo proporcionado por esta invención bajo condiciones que
permiten la producción de dicha proteína de fusión. Las condiciones
para optimizar el cultivo de dicha célula u organismo dependerán de
la célula u organismo utilizado. Si se desea, el método para
producir un producto de interés proporcionado por esta invención
incluye, además, el aislamiento y purificación de dicha proteína de
fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una proteína de fusión obtenida por expresión de la secuencia de
ácido nucleico contenida en la construcción génica de la invención.
De modo más concreto, la invención proporciona una proteína de
fusión que comprende:
- (a)
- un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y
- (b)
- un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos ilustrativos de moléculas implicadas en
el proceso de angiogénesis incluyen proteínas de la MEC, factores
angiogénicos, receptores de membrana celular, etc. Entre las
proteínas de la MEC se encuentran el colágeno, los proteoglicanos,
la fibronectina, la laminina, la tenasina, la entactina y la
trombospondina. En una realización particular, dicha molécula
implicada en el proceso de angiogénesis es una laminina, tal como
una laminina de mamífero, por ejemplo, una laminina de rata, ratón o
ser humano.
Prácticamente cualquier polipéptido que
comprenda una región que reconozca y bloquee una región
funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de
angiogénesis puede ser utilizado en esta invención, tal como un
anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que reconoce una
molécula implicada en el proceso de angiogénesis, o un fragmento
recombinante del mismo que reconoce dicha molécula implicada en el
proceso de angiogénesis, por ejemplo, un fragmento Fv de cadena
única (scFv) de un anticuerpo que reconoce dicha molécula implicada
en el proceso de angiogénesis o un anticuerpo biespecífico o
diabody que reconoce dicha molécula implicada en el proceso
de angiogénesis o bien en su formato recombinante completo (Fab +
Fc); no obstante, en una realización particular, dicho polipéptido
(A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región
funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de
angiogénesis es un scFv recombinante derivado del AcM L36
anti-laminina (Ejemplo 1) que contiene la región
variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal L36
fusionada, a través de un linker, tal como un péptido que comprende
la secuencia G_{4}S, a la región variable de la cadena ligera
(VL) del AcM L36 (Figura 2C), y cuya secuencia ha sido descrita por
Sanz L et al. [Cancer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec;
50(10)557-65], en donde el extremo 3'
de la secuencia codificante de VL está unido al extremo 5' de la
secuencia codificante de dicho linker y el extremo 3' de la
secuencia de nucleótidos codificante de dicho linker está unido al
extremo 5' de la secuencia codificante de VL. Como es conocido, el
AcM L36 reconoce lamininas de diferentes especies de animales, por
ejemplo, de ratón, rata, humanos, etc., ya que interacciona con una
región que está muy conservada entre diferentes especies de
animales [Sanz L et al. EMBO J 2003, Vol.
22(7):1508-1517].
Dicho polipéptido (A') puede reconocer y
bloquear una región funcionalmente activa de una molécula implicada
en el proceso de angiogénesis, y puede dirigir a un péptido
anti-angiogénico fusionado a dicho polipéptido
hacia las moléculas implicadas en el proceso de angiogénesis, por
ejemplo, proteínas de la MEC, factores angiogénicos, receptores de
membrana celular, etc., y bloquear regiones funcionalmente activas
de dichas moléculas.
El polipéptido (B') comprende (i) un dominio de
oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el
proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas
entre dicho dominio de oligomerización y dicha región
funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis. Como se ha
mencionado previamente, dicho dominio de oligomerización puede ser
prácticamente cualquier dominio que permite la formación de
oligómeros, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc., de
péptidos o proteínas, susceptible de ser expresado de forma
recombinante y de formar un oligómero proteico de la proteína que lo
comprende. No obstante, en una realización particular, dicho
dominio de oligomerización es un dominio de trimerización, tal como
el dominio de trimerización del dominio NC1 de colágeno XVIII o del
colágeno XV de mamífero.
La región funcionalmente activa en el proceso de
angiogénesis comprende cualquier péptido o proteína funcionalmente
activo en el proceso de angiogénesis, tal como un péptido o proteína
inhibidor o modulador del proceso de angiogénesis. Prácticamente
cualquier péptido o proteína funcionalmente activo en el proceso de
angiogénesis puede ser utilizado en la presente invención; no
obstante, en una realización particular, dicha región funcionalmente
activa en el proceso de angiogénesis comprende una endostatina (ES)
de mamífero, tal como la ES presente en el dominio NC1 de colágeno
XV o de colágeno XVIII.
La región sensible a proteinasas está situada
entre dicho dominio de oligomerización (i) y dicha región
funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis (ii), y
comprende una secuencia peptídica susceptible a la acción de
proteinasas. Aunque prácticamente cualquier secuencia peptídica
susceptible a la acción de cualquier proteinasa puede ser utilizada
en la presente invención, ventajosamente, dicha proteinasa será una
proteinasa que solo se expresa en el entorno tumoral con lo que la
proteína de fusión de la invención será "procesada" originando
monómeros de péptidos o proteínas funcionalmente activos en el
proceso de angiogénesis (e.g., ES) y moléculas triméricas de
polipéptido capaz de reconocer y bloquear una región funcionalmente
activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis
(e.g., scFv). Por tanto, en una realización particular, dicha región
sensible a proteinasas comprende la región bisagra presente en el
dominio NC1 de colágeno XV ó XVIII de mamífero, entre el dominio de
trimerización y el dominio o región de la ES de dicho dominio NC1,
ya que dicha región es sensible a la acción de proteinasas que solo
se expresan en el entorno tumoral.
Como es conocido, dicho dominio NC1 del colágeno
XVIII (y del colágeno XV) comprende un dominio de trimerización y
un dominio de ES unidos por unos péptidos bisagra (Figura 2B). Por
tanto, en una realización particular, la proteína de fusión de la
invención comprende un polipéptido (B') que comprende el dominio NC1
del colágeno XV o el dominio NC1 del colágeno XVIII que contiene
los dominios de trimerización y ES de dichos dominios NC1 unidos a
través de los péptidos bisagra de dichos dominios NC1. Las
secuencias de dichos dominios NC1 de colágeno XV y de colágeno
XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del dominio
NC1 del colágeno XVIII ha sido descrita previamente por Sasaki
et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue
forms of the C-terminal globular domain of collagen
XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J.
1998 Aug 3;17(15):4249-56].
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, a modo ilustrativo, en una
realización particular, la invención proporciona una proteína de
fusión que comprende:
- (i)
- un polipéptido seleccionado del grupo formado por el AcM L36 completo, el AcM L36 en formato bifuncional y un scFv recombinante que contiene la región variable de la cadena pesada (VH) del AcM L36 fusionada, a través de un péptido flexible, a la región variable de la cadena ligera (VL) del AcM L36; y
- (ii)
- un polipéptido (B') que comprende el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
No obstante, cualquier otro dominio similar al
dominio NC1 de colágeno XVIII que comprenda (i) un dominio de
oligomerización, (ii) una región funcionalmente activa en el proceso
de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre
dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente
activa en el proceso de angiogénesis, ventajosamente, una región
sensible a proteinasas que se expresan en el entorno tumoral, puede
ser utilizada en la puesta en práctica de la presente invención, con
el fin de obtener inhibidores de la angiogénesis multivalentes y
multifuncionales.
La proteína de fusión proporcionada por esta
invención puede contener, además, si se desea, un tercer polipéptido
(C') que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de
unión flexible entre dichos polipéptidos (A') y (B') y/o (b) un
péptido (D') para facilitar el aislamiento o purificación de la
proteína de fusión.
Como se ha mencionado previamente, dicho
polipéptido (C') puede comprender prácticamente cualquier secuencia
peptídica que defina un péptido de unión flexible. Ejemplos
ilustrativos de péptidos de unión flexibles incluyen secuencias de
tipo Gly-Ser-Pro-Gly
o la secuencia (Gly-Ser)_{4}. No obstante,
en una realización particular, dicho péptido de unión flexible
comprende la secuencia
Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento
y purificación de la proteína de fusión de la invención, dicha
proteína de fusión puede contener, si se desea, un péptido (D')
susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o
purificación de la proteína de fusión, tal como un péptido etiqueta
o tag. Dicho péptido (D') puede estar situado en cualquier
posición de la proteína de fusión que no altere la funcionalidad de
ninguno de los polipéptidos (A') y (B'), por ejemplo, dicho péptido
(D') puede estar situado a continuación del polipéptido (B').
Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el
aislamiento o purificación de la proteína de fusión puede ser
utilizado, por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias
peptídicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos que
pueden servir para purificar la proteína de fusión resultante por
cromatografía de inmunoafinidad, tales como péptidos etiqueta, etc.,
por ejemplo, epítopos derivados de de la hemaglutinina del virus de
la gripe o epítopo C-myc, etc.
La proteína de fusión proporcionada por esta
invención comprende un polipéptido (A') que comprende una región
que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una
molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y un polipéptido
(B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) una
región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis, y (iii)
una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de
oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso
de angiogénesis. Como consecuencia de esta fusión y debido a la
acción de determinadas proteinasas que solo se expresan en el
entorno tumoral la proteína de fusión es "procesada"
originando monómeros de péptidos o proteínas funcionalmente activos
en el proceso de angiogénesis (e.g., ES) y moléculas triméricas de
polipéptido capaz de reconocer y bloquear una región funcionalmente
activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis
(e.g., scFv). De este modo, la invención proporciona unos
compuestos inhibidores de la angiogénesis multivalentes y
multifuncionales ya que se ataca al proceso de la angiogénesis por
diferentes vías y de forma conjunta.
Consecuentemente, la proteína de fusión de la
invención, debido a sus características propias, puede ser utilizada
en el tratamiento y/o prevención de desarrollo de procesos de
angiogénesis y, por tanto, en el tratamiento y/o prevención de
patologías que cursan con procesos de angiogénesis.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una composición farmacéutica que comprende bien una
proteína de fusión proporcionada por esta invención junto con, al
menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable, o bien un vector
que comprende una construcción génica de la invención, o un cassette
de expresión de la invención, y, opcionalmente, al menos, un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular, la composición
farmacéutica de la invención comprende, al menos, una proteína de
fusión proporcionada por esta invención en una cantidad
terapéuticamente eficaz. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se
refiere a la cantidad de proteína de fusión de invención calculada
para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada,
entre otras causas, por las características propias de proteína de
fusión y el efecto terapéutico a conseguir.
En otra realización particular, la composición
farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición
destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector,
viral o no viral, proporcionado por esta invención que comprende
una construcción génica de la invención o un cassette de expresión
de la invención. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser
vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus,
etc., o no virales tales como los complejos
ADN-liposoma, ADN-polímero,
ADN-polímero-liposoma, etc. [véase
"Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y
Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen la
construcción génica de la invención o dicho cassette de expresión
pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por
métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden
ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por
ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo,
y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para
obtener el efecto terapéutico deseado.
La composición farmacéutica proporcionada por
esta invención puede ser administrada por cualquier forma de
administración apropiada, por ejemplo, por vía oral o parenteral.
Los excipientes que pueden utilizarse en la elaboración de la
composición farmacéutica proporcionada por esta invención
dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de
dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas
de administración de principios activos, de los excipientes a
utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse
en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A.
de Ediciones, 1993.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de una proteína de fusión proporcionada por
esta invención, o de una construcción génica de la invención o de un
cassette de expresión proporcionado por esta invención o de un
vector recombinante proporcionado por esta invención, en la
elaboración de una composición farmacéutica para prevenir, tratar,
impedir o minimizar el desarrollo de angiogénesis.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de una proteína de fusión proporcionada por esta
invención, o de una construcción génica de la invención o de un
cassette de expresión proporcionado por esta invención o de un
vector recombinante proporcionado por esta invención, en la
elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o
prevención de patologías que cursan con angiogénesis. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de patologías que cursan con
angiogénesis incluyen cáncer, hemangioma, artritis reumática,
psoriasis, bartonelosis, rechazo de órganos trasplantados,
hemorragias, neovascularización ocular (uno de los casos más
frecuentes de ceguera), retinopatías (diabética, del prematuro,
etc.), degeneración macular, glaucoma neovascular, oclusión de las
venas de la retina, oclusión arterial de la retina, pterigium,
rubeosis, o neovascularización corneal. En una realización
particular, la proteína de fusión de la invención, la construcción
génica de la invención, el cassette de expresión proporcionado por
esta invención o el vector recombinante proporcionado por esta
invención, es particularmente útil para el tratamiento del cáncer,
incluyendo el tratamiento de tumores sólidos, la proliferación y
metástasis de los tumores.
El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la
invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de
la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han generado diversas construcciones génicas
(Figura 3A) capaces de expresar los siguientes productos:
- el fragmento Fv de cadena única (scFv) del
anticuerpo monoclonal L36 anti-laminina (L36
scFv),
- la proteína de fusión identificada como L36
scFv-NC1^{ES-} compuesta por L36 scFv fusionado al
dominio de trimerización presente en el dominio NC1 del colágeno
XVIII de ratón (residuos 10 a 60) a través de un péptido conector
flexible (linker),
- la proteína de fusión identificada como L36
scFv-NC1^{ES+} compuesta por L36 scFv fusionado al
dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 10 a 325) a
través de dicho linker,
- el dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón
(residuos 10 a 315) (NC1), y
- la endostatina (ES) procedente del dominio NC1
del colágeno XVIII de ratón (residuos 130 a 315), que se libera
proteolíticamente en forma trimérica y posteriormente se convierte
en ES monomérica de aproximadamente 20 kDa (Figuras 2A y 2B).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de facilitar la inmunodetección de
las proteínas, las construcciones génicas preparadas contenían,
además, una secuencia codificante de una etiqueta (tag), en
concreto, la secuencia codificante de his6myc, de manera que dicha
etiqueta estaba unida al extremo C-terminal de las
distintas proteínas.
Dichas construcciones génicas se clonaron en
vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor de
citomegalovirus humano (hCMV) que contenía la secuencia señal de la
oncostatina M humana [Sanz L et al Gene Therapy (2002)
15:1049]. Los vectores de expresión para ES (posiciones
130-315) y NC1 (1-315) de ratón se
utilizaron como controles.
Dichas proteínas recombinantes fueron utilizadas
en ensayos de formación de estructuras capilares en Matrigel así
como en ensayos de migración celular con el fin de evaluar su
potencial como agente antiangiogénico.
En un medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
enriquecido con el 10% de suero bovino fetal (SBF) (Life
Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) se cultivaron células
HEK-293 (epitelios de riñón humano; ATCC
CRL-1573), células HT-1080
(fibrosarcoma humano; ATCC CCL-121) y células
B16-F10 (melanoma de ratón; ATCC
CRL-6475).
Las células endoteliales primarias de vena de
cordón umbilical humano (HUVEC) fueron cedidas por el Dr. B.
Giménez (Instituto de Investigaciones Biomédicas, Madrid, España) y
se cultivaron en medio F12K de Ham (Life Technologies) con 10% de
SBF, 50 \mug/ml de suplemento de crecimiento de células
endoteliales (ECGS, del inglés "endothelial cell growth
supplement") procedente de pituitaria bovina y 100 \mug/ml
de heparina (Sigma Biosciences, St. Louis, MO, EE.UU.).
La línea celular endotelial microvascular humana
HMEC-1 (Ades EW et al., 1992, Journal of
Investigative Dermatology, 99:683-690) fue
suministrada por el Dr. E. W. Ades (Center for Disease Control,
Atlanta, GA, EE.UU.) y se cultivó en medio MCBD 131 (Life
Technologies) enriquecido con el 10% de SBF, 10 ng/ml de EGF (factor
de crecimiento epidérmico) y 1 mg/ml de hidrocortisona (Sigma
Biosciences).
La secuencia del dominio NC1, conteniendo la
región codificante del péptido conector, el dominio de
trimerización, el péptido bisagra y el dominio de ES (Figura 2B),
se amplificó, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a
partir del clon mc3b de \alpha1 (colágeno XVIII) procedente de
ratón [Oh et al. Genomics. 1994 Feb;
19(3):494-9] suministrado por el Dr. B. Olsen
(Harvard Medical School, Boston, MA, EE.UU.), con el par de
cebadores 1 y 2 (véase la Tabla 1, que contiene las secuencias de
los diferentes iniciadores utilizados para la construcción de los
vectores y la verificación posterior de las secuencias de los
vectores).
El producto de la PCR se volvió a amplificar con
el par de cebadores 2 y 3 (Tabla 1) y, el producto resultante de la
PCR, escindido con NotI, se ligó al sitio NotI del plásmido
pCR3.1-L36 [Sanz L et al Gene Therapy (2002)
15:1049], para obtener el plásmido
pCR3.1-L36-NC1. La secuencia
se comprobó usando los cebadores 4 y 5 (Tabla 1).
Para la generación de la construcción génica
identificada como L36 scFv-NC1^{ES+} (Figura 3A)
se reemplazó el "péptido conector" que conecta la triple
hélice de colágeno con el dominio de trimerización de NC1,
responsable de la liberación del dominio NC1 procedente del
colágeno XVIII parental, por un "péptido conector flexible"
("linker flexible")
Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser
[LEGAGGSGGSSGSD
GASGS] (Figuras 2B y 2C), con el fin de evitar una posible escisión del dominio NC1 del extremo amino del L36 scFv dado que dicho "conector peptídico" es sensible a la acción de diferentes metaloproteinasas (MMPs). Para ello, un par de oligonucleótidos (cebadores 6 y 7) (Tabla 1) que contenía la secuencia codificante de dicho "péptido conector flexible" ("linker flexible") se ligó al sitio EcoRI-BglII de pCR3.1-L36-NC1, dando como resultado el plásmido pCR3.1-L36-linker-NC1.
GASGS] (Figuras 2B y 2C), con el fin de evitar una posible escisión del dominio NC1 del extremo amino del L36 scFv dado que dicho "conector peptídico" es sensible a la acción de diferentes metaloproteinasas (MMPs). Para ello, un par de oligonucleótidos (cebadores 6 y 7) (Tabla 1) que contenía la secuencia codificante de dicho "péptido conector flexible" ("linker flexible") se ligó al sitio EcoRI-BglII de pCR3.1-L36-NC1, dando como resultado el plásmido pCR3.1-L36-linker-NC1.
El plásmido pCR3.1-NC1 se
construyó eliminando el fragmento ClaI-BglII del
plásmido
pCR3.1-L36-conector-NC1
(que contiene todo el L36 scFv) e insertando un par de
oligonucleótidos (cebadores 8 y 9) (Tabla 1) que contenían un sitio
NruI.
Para construir el plásmido
pCR3.1-ES, el módulo de la endostatina (ES)
murina (residuos 130 a 315 del domino NC1) [Sasaki et al.
Structure, function and tissue forms of the
C-terminal globular domain of collagen XVIII
containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug
3;17(15):4249-56] se amplificó a partir del
plásmido pCR3.1-NC1 con el par de cebadores 2 y 10
(Tabla 1). El fragmento de PCR escindido por BglII/NotI se ligó en
el plásmido pCR3.1-NC1 digerido por BglII/NotI. La
secuencia se comprobó usando el cebador 4 (Tabla 1).
El dominio de trimerización presente en el
dominio NC1 [Sasaki et al. Structure, function and tissue
forms of the C-terminal globular domain of collagen
XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J.
1998 Aug 3;17(15):4249-56] se amplificó a
partir del plásmido pCR3.1-NC1 con los pares de
cebadores 11 y 12 (Tabla 1). El fragmento de PCR digerido con NotI
se ligó al plásmido pCR3.1-L36 digerido con NotI,
para obtener el plásmido
pCR3.1-L36-Trimer. La
secuencia se comprobó usando el cebador 4 (Tabla 1).
Las células HEK-293,
HT-1080 y B16-F10 se transfectaron
con los vectores de expresión adecuados (pCR3.1,
pCR3.1-L36,
pCR3.1-L36-Trimer,
pCR3.1-ES, pCR3.1-NC1 o
pCR3.1-L36-linker-NC1)
usando el sistema basado en la lipofectamina (Life Technologies).
Para generar líneas celulares estables, las células transfectadas
HEK-293, HT-1080 y
B16-F10 se seleccionaron en DMEM con 0,5 mg/ml, 0,6
mg/ml ó 3 mg/ml de G-418 (Life Technologies). La
proliferación de células tumorales parentales y transducidas por
los distintos vectores se analizó diariamente durante 4 días
consecutivos en ensayos con bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazoilo (MTT, Promega). Los sobrenadantes de poblaciones
celulares transfectadas transitorias y estables se analizaron para
determinar la expresión proteica mediante SDS-PAGE
[Sanz L et al. Gene Therapy (2002) 15:1049], ELISA [Sanz L.
et al Gene Therapy (2002) 15:1049] y western blotting
(inmunotransferencia) [Blanco et al. J. Immunol (2003)
171:1070] usando AcM (anticuerpos monoclonales)
anti-myc (Life Technologies) o
anti-endostatina (Upstate Biotechnology, Lake
Placid, NY, EE.UU.).
Se usaron células HEK-293
transfectadas estables para cultivar medios condicionados sin suero.
Se añadió una combinación ("cocktail") de inhibidores
de proteinasas (aprotinina, bestatina, leupeptina, pepstatina A y
E-64) (Sigma Biosciences) al medio para reducir la
proteolisis. El medio (aproximadamente 1 l) se concentró (x10) con
un filtro Vivaflow 50 de 10.000 MWCO (Vivascience AG, Alemania), se
dializó frente a PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH
7,4 y se cargó sobre una columna HisTrap HP de 1 ml (Amersham
Biosciences, Uppsala, Suecia). Las proteínas que contenían ES se
purificaron adicionalmente sobre una columna HiTrap Heparin HP de 1
ml (Amersham Biosciences). La elución se realizó con un gradiente
lineal de 0,1-2,0 de NaCl. Las proteínas
purificadas se dializaron frente a PBS y se almacenaron a -20ºC. La
proteína de fusión purificada Fc-dominio de ES
(Fc-ES) [Cuo CJ et al. J Cell Biol. 2001
152:1233] fue suministrada por el Dr. K. Javaherian (Hospital
Infantil de Boston "Children's Hospital Boston", Boston, MA,
EE.UU.). Dicha proteína de fusión Fc-ES es una
proteína de fusión (entre el dominio ES y el fragmento Fc de una
inmunoglobulina) dimérica y bloquea la morfogénesis capilar.
Los experimentos de centrifugación se realizaron
a 20ºC en una ultracentrífuga analítica Optima XL-A
(Beckman-Coulter Inc.) equipada con óptica
UV-visible, usando un rotor An50Ti,con ejes de
sector doble de 3 mm decarbón vegetal de Epon. El equilibrio de
sedimentación a baja velocidad se ensayó en una columna corta (23
\mul) a tres velocidades sucesivas (5.000, 6.000 y 11.000 rpm), y
se tomaron imágenes del equilibrio (después de 20 h) a una longitud
de onda de 280 nm. Se prestó atención a la conservación de la masa
proteica en forma soluble durante el experimento. Los experimentos
de control de velocidad de sedimentación no pusieron de manifiesto
ninguna agregación en un intervalo de tiempo de 45 h. La señal de
referencia se midió después de centrifugación a alta velocidad (5 h
a 42.000 rpm). El peso molecular promedio en peso aparente de las
células completas se obtuvo usando el programa EQASSOC [Minton, A.
P. (1994) in Modern Analytical Ultracentrifugation (Schuster,
T., and Laue, T., eds), pp. 81-93, Birkhauser
Boston, Inc., Cambridge, MA]. El experimento de velocidad de
sedimentación se llevó a cabo a 42.000 rpm y las imágenes de
absorbancia se tomaron a 280 nm. Se calcularon los coeficientes de
sedimentación mediante el modelo de la ecuación de Lamm de
distribución continua c(s) [P. Schuck.
Size-Distribution Analysis of Macromolecules by
Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation
Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp.
1606-1619] tal como se implementa en el programa
SEDFIT. Estos valores de sedimentación experimental se corrigieron
para las condiciones habituales para obtener los valores
s_{20,w} correspondientes usando el programa SEDNTERP [T.M.
Laue, B.D. Shah, T.M. Ridgeway and S.L. Pelletier,
Computer-aided interpretation of analytical
sedimentation data for proteins. In: S.E. Harding, A.J. Rowe and
J.C. Horton, Editors, Analytical Ultracentrifugation in
Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry,
Cambridge, UK (1992), pp. 90-125]. Se realizó un
análisis hidrodinámico adicional (es decir, cálculo de la razón de
coeficiente friccional) con el programa SEDFIT para obtener la
distribución c(M) [P. Schuck.
Size-Distribution Analysis of Macromolecules by
Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation
Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp.
1606-1619].
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos se realizaron a temperatura
ambiente con un sistema ÄKTA FPLC usando una columna Superdex 200
10/300GL. Se inyectaron en la columna muestras de 0,1 ml de las
diferentes proteínas recombinantes (L36 scFv, L36
scFv-NC1^{ES-}, L36
scFv-NC1^{ES+} y NC1) en PBS a una concentración
de 0,5-1,0 mg/ml y se separaron a una velocidad de
flujo de 0,5 ml/min. La columna se calibró con marcadores de peso
molecular alto y bajo (Amersham). Las razones de los volúmenes de
elución con respecto al volumen de exclusión y los pesos moleculares
de los marcadores se ajustaron a una curva exponencial, que se usó
para calcular el peso molecular de las muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Las metaloproteinasas de la matriz (MMP)
MMP-1 y MMP-9 humanas fueron
adquiridas a Oncogene Research Products (San Diego, CA, EE.UU.),
mientras que las MMPs MMP-3, MMP-8 y
MMP-14 (MT1-MMP) humanas fueron
adquiridas a Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.). La catepsina L
humana y la elastasa pancreática porcina fueron también adquiridas
a Calbiochem.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas recombinantes L36
scFv-NC1^{ES-}, L36
scFv-NC1^{ES+} y NC1 se incubaron a una
concentración de 0,6 \muM, a 37ºC durante 10 minutos con:
- catepsina L humana 10 nM en acetato de sodio
50 mM, pH 5,5, ditiotreitol (DTT) 2 mM, ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM (para el tratamiento con
catepsina L humana);
- elastasa porcina 25 nM en acetato de sodio 50
mM, pH 6,0 (para el tratamiento con elastasa porcina); y
- metaloproteinasas 25 nM en
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM, NaCl 150
mM, el 0,05% de Brij-35, ZnSO_{4} 50 \muM (para
el tratamiento con las metaloproteinasas utilizadas).
A continuación, se sometieron alícuotas a
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% bajo condiciones
reductoras en presencia de dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE). Los geles se tiñeron con nitrato de
plata (Sigma BioScience) o se sometieron a Western blot, usando un
AcM anti-ES de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los ensayos de formación de estructura de
tipo capilar (CLS, del inglés "capillary-like
structure"), se preparó una matriz de membrana base de
Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA, EE.UU.) en una placa
Terasaki precongelada de 72 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca),
con 2 \mul/pocillo y después se dejó que solidificara a 37ºC
durante 30 minutos. Se sembraron 3 x 10^{3} CEs
(HMEC-1 o HUVEC) en 10 \mul de medio adecuado
enriquecido con SBF al 0,5% sobre la matriz gelificada. El volumen
total de medio en el pocillo se ajustó hasta 25 \mul al mismo
tiempo que se preparaban las células, y se incubaron durante 16
horas a 37ºC en atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%. El
efecto inhibidor de formación de tubo de las proteínas
recombinantes ensayadas (L36 scFv, L36
scFv-NC1^{ES-}, L36
scFv-NC1^{ES+}, NC1 y ES) se determinó mediante
la adición de 15 \mul de proteína recombinante purificada, diluida
en el medio adecuado en función de la línea celular empleada
(HMEC-1 o HUVEC) a concentraciones diferentes
(Figura 5D), a las placas recubiertas con Matrigel en el momento de
plaquear las células. Los experimentos se realizaron por
triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las imágenes digitales de cada pocillo se
obtuvieron a partir de un microscopio Axiovert 100 (Carl Zeiss,
Alemania), usando una cámara SPOT (Diagnostics Instruments, Inc.) y
se almacenaron como archivos BMP de 328x256 píxeles y escala de
grises de 8 bits. Las imágenes se trataron usando el nuevo software
AD basado en Matlab 5.3 [Sanz, L. et al. Microvasc Res. 2002
May; 63(3):335].
Para los estudios de migración de CEs, insertos
de filtro de tereftalato de polietileno con un tamaño de poro de
3,0 \mum y un diámetro de 6,5 mm (Becton Dickinson) se recubrieron
con Matrigel a una concentración de 1,25 \mug/ml en medio sin
suero a 4ºC durante la noche. Las células HUVEC (1,5 x 10^{5}) se
preincubaron en medio sin suero durante 30 minutos a 37ºC en
atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada en presencia de 20
\mug/ml de proteína purificada (L36 scFv, L36
scFv-NC1^{ES-}, ES, NC1 y L36
scFv-NC1^{ES+}) y después, se transfirieron al
compartimento superior. Se añadieron 600 \mul de medio que
contenía suero al compartimento inferior. Después de 16 horas, las
células se fijaron con glutaraldehído al 1% en PBS, se tiñeron con
cristal de violeta al 0,1% y se examinaron al microscopio.
Se ha demostrado que la ES oligomérica modula la
morfogenia dependiente de la matriz extracelular (MEC) de las
células epiteliales (CE) [Cuo CJ et al. J Cell Biol. 2001
152:1233]. El tratamiento con ES dimérica, en forma de
Fc-ES, en el momento de plaquear las células sobre
Matrigel, inhibe significativamente el ensamblaje en estructuras
tubulares, manteniendo las CE dispersas y mostrando una morfología
que se parecía a la de las células sobre plástico. Estos cambios
morfológicos son similares a los observados cuando los cultivos de
CE se tratan con L36 scFv (Figura 1).
La ES deriva del dominio NC1 del colágeno XVIII,
que se libera proteolíticamente en forma trimérica y posteriormente
se convierte en ES monomérica de aproximadamente 20 kDa (Figuras 2A
y 2B). Se han construido diversos genes quiméricos que expresan
distintas proteínas.
En una realización particular, se construyó el
gen quimérico denominado L36 scFv-NC1^{ES+}
compuesto por el scFv del AcM anti-laminina L36
fusionado al dominio NC1 del colágeno XVIII de ratón (residuos 10 a
315) (Figuras 2C y 3A). En el extremo N-terminal de
NC1 del colágeno XVIII hay un dominio de trimerización de unos 60
residuos de aminoácidos aproximadamente conectado con el módulo de
la ES, de unos 180 residuos de aminoácidos, mediante una región
bisagra flexible de unos 70 residuos de aminoácidos aproximadamente,
que contiene diversos sitios sensibles a las proteinasas que
liberan la ES monomérica después de la escisión proteolítica (Figura
2B). El "péptido conector" que conecta la triple hélice de
colágeno con el dominio de trimerización de NC1, responsable de la
liberación del dominio NC1 procedente del colágeno XVIII parental,
es sensible a la acción de diferentes MMPs. Por tanto, para evitar
una posible escisión del dominio NC1 del extremo amino del L36,
dicho "péptido conector" fue reemplazado por un
"linker flexible" de 17 aminoácidos (Figuras 2B y
2C).
Asimismo, en otra realización particular, se
construyó el gen quimérico denominado L36
scFv-NC1^{ES-}, más corto que el anterior, que
contenía las secuencias codificantes para el L36 scFv, dicho
linker flexible y el dominio de trimerización de NC1
únicamente (Figura 3A).
La etiqueta his6myc tag se unió al
extremo C-terminal de las proteínas de fusión para
facilitar la inmunodetección.
Las construcciones genéticas se clonaron en los
vectores de expresión de mamífero apropiados, bajo el control del
promotor de hCMV, que contenía la secuencia principal de la
oncostatina M humana. Como control, se obtuvieron vectores de
expresión para ES (posiciones 130-315) y NC1
(1-315) de ratón (Figura 3A).
Se generaron líneas celulares estables en
células HEK 293 y se purificaron las proteínas de fusión del medio
condicionado. El análisis mediante western blot demostró que el
patrón de migración de las proteínas purificadas era coherente con
el peso molecular pronosticado (Figura 3B) [carril 1: L36 scFv,
carril 2: L36 scFv-NC1^{ES-}, carril 3: L36
scFv-NC1^{ES+}, carril 4: NC1, y carril 5:
ES].
En condiciones reductoras, el AcM 9E10
anti-myc reveló bandas únicas con un peso molecular
(PM) aparente de 26, 36, 67,5 y 22 kDa (Figura 3B), que
correspondían al PM calculado de 28,8, 37,6, 65,6 y 23,8 kDa para
L36 scFv monomérico, L36 scFv trimérico, L36
scFv-NC1 y ES monomérica, respectivamente. En los
análisis mediante western blot con proteínas que contienen el
dominio NC1, el AcM 9E10 reconoce una banda única de aproximadamente
24 kDa que corresponde a la ES monomérica y una banda de un doblete
de 39-44 kDa que corresponde a la proteína no
procesada (Figura 3B). Ambas bandas dentro del doblete eran
positivas en los western blot con un AcM anti-ES
(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). El doblete
podría ser debido a una modificación tras la traducción o a efectos
de plegamiento interno.
El AcM anti-ES también reveló la
banda de 24 kDa y una banda adicional con un PM aparente de
aproximadamente 23 kDa que podía corresponder a monómeros de tipo
ES no marcados (Figura 3B). Mediante el análisis de western blot
con proteínas L36 scFv -NC1^{ES+}, el AcM anti-ES
reconoce la fusión no procesada de 67,5 kDa y una banda de 24 kDa
no detectada mediante el AcM 9E10, que corresponde al dominio de la
ES procesado (Figura 3B). La ES purificada aparece como un doblete
de 22-23 kDa cuando se revela con el AcM
anti-ES (Figura 3B).
El estado de oligomerización de las diferentes
proteínas de fusión se valoró mediante cromatografía analítica con
filtración en gel y mediante experimentos de centrifugación
analítica con muestras idénticas. La proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES-} purificada mediante IMAC
(cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados) eluyó
de la columna de filtración en gel esencialmente como un pico único
(90% del área total) a un volumen que correspondía a un peso
molecular de 109 kDa, lo que indica que la proteína es un trímero.
La velocidad de sedimentación también mostró un pico principal
único con una masa de 112 kDa y el experimento de equilibrio de
sedimentación dio como resultado una distribución de masas que
podría ajustarse a especies triméricas y no a un monómero o un
dímero (Figura 4A). En su conjunto, todos estos resultados
demuestran la naturaleza trimérica de la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES-}, una característica conferida por
el dominio de trimerización de NC1, ya que L36 scFv es monomérico
en las mismas condiciones tal como se muestra en los experimentos de
filtración en gel y de velocidad de sedimentación (datos no
mostrados). El L36 scFv trimérico (L36
scFv-NC1^{ES-}) mostró mayor afinidad de unión a
laminina inmovilizada en plástico y era mucho más eficaz que el
monómero en el bloqueo de la diferenciación de CE sobre sustratos
de matrigel (Figuras 4B y 4C).
Para fines experimentales es esencial que la
proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES-} permanezca
estable y funcional en presencia de proteinasas. Por tanto, se
determinó su funcionalidad tras la incubación con una amplia
variedad de proteinasas a concentraciones molares conocidas de
enzima activa. Las proteinasas incluyeron representantes de
diversas clases de proteinasas, es decir, catepsina L de la familia
de las cisteín proteinasas; MMP-1,
MMP-3; MMP-8; MMP-9,
MMP-14 de la familia de las metaloproteinasas; y
elastasa pancreática de la familia de las serín proteinasas. Tal
como se muestra en la Figura 4D, el L36 scFv trimérico (L36
scFv-NC1^{ES-}) no se escindió en presencia de la
mayoría de las proteinasas probadas. MMP-14 procesó
parcialmente el trímero (L36 scFv-NC1^{ES-}) pero
incluso después de 4 h de reacción, se detectó anticuerpo
funcionalmente activo mediante ELISA. Sólo la catepsina L degradó
completamente la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES-}.
La cromatografía por exclusión de tamaños mostró
que la proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+}
purificada eluye como un pico principal con un peso molecular
aproximado de 210 kDa, coherente con un trímero, y otro pico con un
peso molecular aparente de 117 kDa, que podría corresponder a un
fragmento que carece de la parte de la ES (Figura 5A). La velocidad
de sedimentación también identifica a dos especies con pesos de 181
kDa y 83 kDa.
La proteína recombinante NC1 eluyó como pico
principal con un peso molecular aproximado de 123 kDa, que se
corresponde con una especie trimérica, y otros picos menores, uno de
ellos con un peso de 19 kDa que se corresponde con monómeros de ES
(Figura 5B). Mediante experimentos de velocidad de sedimentación se
identificó una especie principal con un peso molecular de 116 kDa.
Estos datos indicaron que la proteína recombinante NC1 es
principalmente trimérica pero heterogénea, posiblemente debido a la
degradación, lo que está en consonancia con los resultados
obtenidos por otros investigadores que han observado una
heterogeneidad similar en proteínas NC1 recombinantes [Sasaki T.
et al. EMBO J. 1998 17:4249-56].
Tal como se esperaba, la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES+} mostró una afinidad por la unión a
la laminina inmovilizada en plástico algo mayor que la de la
proteína NC1 recombinante (Figura 5C). Del mismo modo, dicha
proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+}
(bi-específica) resultó ser mucho más eficaz que la
proteína NC1 recombinante (monoespecífica) en el bloqueo de la
diferenciación de las CEs sobre sustratos de Matrigel (Figura
5D).
La Figura 5E recoge los resultados del ensayo de
migración de CEs y pone de manifiesto que la migración de células
HUVEC en presencia de la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES+} es inferior a la alcanzada en
presencia de otras proteínas recombinantes ensayadas (L36 scFv y
NC1) y del mismo orden de magnitud que la alcanzada con la ES
recombinante.
Para estudiar la generación de ES mediante
diversas proteinasas, se incubó la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES+} y se analizó la mezcla de reacción
mediante western blot usando un AcM anti-ES (Upstate
Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). La proteína de fusión
se trató con las cinco MMPs ensayadas (MMP-1,
MMP-3, MMP-8, MMP-9
y MMP-14), observándose diferencias significativas
en la eficacia de procesamiento de la proteína L36
scFv-NC1^{ES+} entre dichas MMPs, siendo
MMP-3 y MMP-14 las más eficaces. El
procesamiento completo de la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES+} se observó en 4 horas. Los
principales productos de acumulación fueron polipéptidos con pesos
moleculares comprendidos entre 20 y 25 kDa (Figura 6A). Las
MMP-3, MMP-8, MMP-9
y MMP-14 produjeron fragmentos de ES que se
acumularon después de 4 h, lo que sugiere que dichas MMPs no pueden
degradarlos. Tal como se muestra en la Figura 6A, la elastasa y la
catepsina L no sólo generaron fragmentos de tipo ES a partir de la
proteína de fusión L36 scFv-NC1^{ES+}, sino que
también lo degradaron rápidamente quedando tan solo pequeñas
cantidades de ES después de 4 h de incubación. Este patrón de
procesamiento proteolítico fue casi idéntico al observado con la
proteína NC1 murina nativa sin modificar (Figura 6B). Los resultados
indican que la adición al extremo N-terminal de un
fragmento de un anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento
de un epítopo, tal como un scFv, al dominio NC1
no interfiere con el procesamiento proteolítico de la proteína de fusión por las proteinasas ni con la generación de ES.
no interfiere con el procesamiento proteolítico de la proteína de fusión por las proteinasas ni con la generación de ES.
Con el fin de investigar la eficacia de las
proteinasas para generar fragmentos de anticuerpo (L36 scFv), las
mezclas de reacción se sometieron a SDS-PAGE en
condiciones reductoras y se tiñeron con nitrato de plata. Tal como
se muestra en la Figura 6C, la proteinasa más eficaz para generar ES
fue la MMP-14, que también generó L36 scFv. Los L36
scFv y las ES generados eran estables y se acumulaban después de 4
h, lo que indicaba que en esas condiciones experimentales, la
proteinasa no podía degradarlos. La relación entre la intensidad del
L36 scFv trimérico y la intensidad de las ES sugiere un
procesamiento equilibrado de la proteína de fusión L36
scFv-NC1^{ES+}. Se han observado resultados
similares con otras MMP (datos no mostrados).
Claims (28)
1. Una proteína oligomérica que comprende 2, 3,
ó 4 proteínas de fusión, en la que cada proteína de fusión
comprende:
- c)
- un polipéptido (A') que comprende una región que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, siendo dicho polipéptido un anticuerpo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un fragmento recombinante del mismo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y
- d)
- un polipéptido (B') que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) un péptido o proteína inhibi- dor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicho péptido o proteína inhibidor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proteína oligomérica según la reivindicación
1, en la que dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis
es una proteína de la matriz extracelular (MEC), un factor
angiogénico o un receptor de membrana celular.
3. Proteína oligomérica según la reivindicación
2, en la que dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis
es colágeno, un proteoglicano, fibronectina, laminina, tenascina,
entactina, trombospondina, factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF), receptor 2 de VEFG (VEFGR-2) o una
integrina.
4. Proteína oligomérica según la reivindicación
3, en la que dicha laminina es una laminina de mamífero,
preferentemente de rata, ratón o ser humano.
5. Proteína oligomérica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polipéptido (A') es un
fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce
una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un diabody
que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de
angiogénesis.
6. Proteína oligomérica según la reivindicación
1, en la que dicho polipéptido (B') comprende el dominio NC1 de
colágeno XV de mamífero o el dominio NC1 de colágeno XVIII de
mamífero.
7. Proteína oligomérica según la reivindicación
1, que comprende, entre dichos polipéptidos (A') y (B'), un tercer
polipéptido (C') que comprende la secuencia de aminoácidos de un
péptido de unión flexible.
8. Proteína oligomérica según la reivindicación
1, siendo dicha proteína oligomérica un trímero constituido por 3
proteínas de fusión, en la que cada proteína de fusión
comprende:
- a)
- un polipéptido (A'), dicho polipéptido (A') siendo un fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce una laminina; y
- b)
- un polipéptido (B'), comprendiendo dicho polipéptido (B') el dominio NC1 de colágeno XVIII de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
10. Empleo de una proteína oligomérica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la elaboración de una
composición farmacéutica para prevenir, tratar, impedir o minimizar
el desarrollo de angiogénesis.
11. Empleo de una proteína oligomérica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la elaboración de una
composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de
patologías que cursan con angiogénesis.
12. Empleo según la reivindicación 11, en la que
dicha patología que cursa con angiogénesis comprende cáncer,
hemangioma, artritis reumática, psoriasis, bartonelosis, rechazo de
órganos trasplantados, hemorragias, neovascularización ocular,
retinopatías, degeneración macular, glaucoma neovascular, oclusión
de las venas de la retina, oclusión arterial de la retina,
pterigium, rubeosis, o neovascularización corneal.
13. Un cassette de expresión que comprende,
operativamente unido a una secuencia de control de expresión, una
construcción génica que comprende, operativamente unidas, al
menos:
- a)
- una primera secuencia de ácido nucleico (A), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis, siendo dicho polipéptido un anticuerpo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un fragmento recombinante del mismo que reconoce y bloquea una región funcionalmente activa de una molécula implicada en el proceso de angiogénesis; y
- b)
- una segunda secuencia de ácido nucleico (B), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) un dominio de oligomerización, (ii) un péptido o proteína inhibidor(a) o modulador(a) del proceso de angiogénesis, y (iii) una región sensible a proteinasas entre dicho dominio de oligomerización y dicha región funcionalmente activa en el proceso de angiogénesis,
en donde el extremo 3' de dicha primera
secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico (B).
\vskip1.000000\baselineskip
14. Cassette de expresión según la
reivindicación 13, en el que dicha molécula implicada en el proceso
de angiogénesis es una proteína de la matriz extracelular (MEC), un
factor angiogénico o un receptor de membrana celular.
15. Cassette de expresión según la
reivindicación 14, en el que dicha molécula implicada en el proceso
de angiogénesis es colágeno, un proteoglicano, fibronectina,
laminina, tenascina, entactina, trombospondina, factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF, receptor 2 de VEFG
(VEFGR-2), una integrina.
16. Cassette de expresión según la
reivindicación 15, en el que dicha laminina es una laminina de
mamífero, preferentemente de rata, ratón o ser humano.
17. Cassette de expresión según la
reivindicación 13, en el que dicha primera secuencia de ácido
nucleico (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un
fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce
dicha molécula implicada en el proceso de angiogénesis o un diabody
que reconoce dicha molécula implicada en el proceso de
angiogénesis.
18. Cassette de expresión según la
reivindicación 13, en el que dicha segunda secuencia de ácido
nucleico (B) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el
dominio NC1 de colágeno XV de mamífero o la secuencia de
nucleótidos que codifica el dominio NC1 de colágeno XVIII de
mamífero, que contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente
a los dominios de trimerización y endostatina (ES) de dichos
dominios NC1, y la secuencia de nucleótidos que codifica los
péptidos bisagra de dichos dominios NC1.
19. Cassette de expresión según la
reivindicación 13, que comprende, además de dichas secuencias de
ácido nucleico (A) y (B), una tercera secuencia de ácido nucleico
(C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido de unión flexible, en donde el extremo 5' de dicha tercera
secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha
primera secuencia de ácido nucleico (A).
20. Cassette de expresión según la
reivindicación 13, en la que dicha primera secuencia de ácido
nucleico (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un
fragmento Fv de cadena única (scFv) de un anticuerpo que reconoce
una laminina y dicha segunda secuencia de ácido nucleico (B)
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio NC1
de colágeno XVIII de mamífero, que contiene la secuencia de
nucleótidos correspondiente al dominio de trimerización y
endostatina (ES) de dicho dominio NC1.
21. Un vector recombinante que comprende un
cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a
20.
22. Una célula hospedadora que comprende un
cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a
20, o un vector recombinante según la reivindicación 21.
23. Una proteína oligomérica obtenida por
expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en un cassette
de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.
24. Un procedimiento para obtener una proteína
oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que
comprende crecer una célula según la reivindicación 22 bajo
condiciones que permiten la producción de dicha proteína
oligomérica y, si se desea, aislar y purificar dicha proteína
oligomérica.
25. Una composición farmacéutica que comprende
un vector que comprende un cassette de expresión según cualquiera
de las reivindicaciones 13 a 20, junto con, al menos, un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
26. Empleo de un cassette de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, o de un vector según la
reivindicación 21, en la elaboración de una composición farmacéutica
para prevenir, tratar, impedir o minimizar el desarrollo de
angiogénesis.
27. Empleo de un cassette de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, o de un vector según la
reivindicación 21, en la elaboración de una composición farmacéutica
para el tratamiento o la prevención de patologías que cursan con
angiogénesis.
28. Empleo según la reivindicación 27, en el que
dicha patología que cursa con angiogénesis comprende cáncer,
hemangioma, artritis reumática, psoriasis, bartonelosis, rechazo de
órganos trasplantados, hemorragias, neovascularización ocular,
retinopatías, degeneración macular, glaucoma neovascular, oclusión
de las venas de la retina, oclusión arterial de la retina,
pterigium, rubeosis, o neovascularización corneal.
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