RU2398878C2 - Многофункциональные и поливалентные ингибиторы ангиогенеза - Google Patents
Многофункциональные и поливалентные ингибиторы ангиогенеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2398878C2 RU2398878C2 RU2007120521/13A RU2007120521A RU2398878C2 RU 2398878 C2 RU2398878 C2 RU 2398878C2 RU 2007120521/13 A RU2007120521/13 A RU 2007120521/13A RU 2007120521 A RU2007120521 A RU 2007120521A RU 2398878 C2 RU2398878 C2 RU 2398878C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- angiogenesis
- domain
- polypeptide
- nucleic acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 115
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 62
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims abstract description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 9
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 claims description 108
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 90
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 66
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 61
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 41
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 claims description 37
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 claims description 37
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 25
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 23
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 21
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 21
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 21
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 claims description 16
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 8
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 7
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 5
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010044583 Bartonella Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 4
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 4
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 claims description 4
- 201000002154 Pterygium Diseases 0.000 claims description 4
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 4
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 claims description 4
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 4
- 206010004145 bartonellosis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 4
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 4
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 claims description 4
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims 4
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 claims 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 claims 2
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims 2
- 210000001927 retinal artery Anatomy 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 206010048628 rheumatoid vasculitis Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 101800000353 Non-collagenous domain 1 Proteins 0.000 description 70
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 17
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 16
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 15
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 14
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 8
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 7
- 108010076557 Matrix Metalloproteinase 14 Proteins 0.000 description 7
- 102100030216 Matrix metalloproteinase-14 Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 7
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 6
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 6
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 5
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 5
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 4
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 4
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 4
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 4
- 102100030411 Neutrophil collagenase Human genes 0.000 description 4
- 101710118230 Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000983583 Homo sapiens Procathepsin L Proteins 0.000 description 3
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 102000050937 human CTSL Human genes 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000992170 Homo sapiens Oncostatin-M Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 101500026379 Mus musculus Non-collagenous domain 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 201000007527 Retinal artery occlusion Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 2
- -1 VEGFR-2) Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000001286 analytical centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 102000043703 human OSM Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000972 4,5-dimethylthiazol-2-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C1=C(N=C(*)S1)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- LTLYEAJONXGNFG-DCAQKATOSA-N E64 Chemical compound NC(=N)NCCCCNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(O)=O LTLYEAJONXGNFG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101500026380 Mus musculus Endostatin Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Получены многофункциональные и поливалентные ингибиторы на основе слитых белков, содержащих полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, и полипептид, содержащий домен олигомеризации и функционально активный модулирующий или ингибирующий процесс ангиогенеза участок, отделенный чувствительным к протеиназам участком. Эти ингибиторы пригодны для лечения и профилактики патологий, возникающих посредством процесса ангиогенеза, например злокачественной опухоли, ревматоидного артрита или псориаза. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к слитым белкам, пригодным в качестве многофункциональных и поливалентных ингибиторов ангиогенеза, содержащим полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, и полипептид, содержащий домен олигомеризации и функционально активный ингибирующий или модулирующий процесс ангиогенеза участок, разделенные чувствительным к протеиназам участком. Настоящее изобретение также относится к генным конструкциям и конструкциям векторов, пригодным для получения указанных слитых белков.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ангиогенез представляет собой биологический процесс, приводящий к формированию новых кровеносных сосудов из ранее существующих сосудов в органе или ткани. Ангиогенез начинается с разрушения базальной мембраны вследствие действия протеиназ, секретируемых эндотелиальными клетками, продолжается миграцией и пролиферацией указанных эндотелиальных клеток, завершаясь формированием просвета, базальной мембраны и окружения из периферических клеток.
Ангиогенез не происходит в нормальных физиологических условиях у здоровых взрослых, за исключением процессов, связанных с менструальным циклом у женщин и заживлением ран. Однако дисбаланс в процессе ангиогенеза приводит к развитию патологических нарушений, например, таких как ревматоидный артрит, псориаз, бартонеллез, отторжение трансплантированного органа, геморрагия и неоваскуляризация глаза (один из наиболее частых случаев слепоты), диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, дегенерация желтого пятна, неоваскулярная глаукома, окклюзия вен сетчатки, окклюзия артерий сетчатки, птеригий, покраснение радужки, вновь образованные сосуды, солидные опухоли, гемангиома и пролиферация и метастазы опухоли.
Кроме того, ангиогенез играет важную роль в прогрессирующем росте и метастатическом распространении опухолей. Для того чтобы иметь возможность роста, опухоль должна постоянно стимулировать развитие новых капилляров. Новые сосуды, образованные в опухоли, обеспечивают путь для злокачественных клеток, с помощью которого они могут проникать в кровообращение и формировать метастазы в отдаленных областях. Если ангиогенную активность подавить или устранить, тогда, несмотря на существование опухоли, она не может развиваться.
По этой причине различные исследовательские группы проводят работу для выявления соединений, выполняющих ингибирующее воздействие на ангиогенез (ингибиторы ангиогенеза или антиангиогенные средства), пригодных в качестве лекарственных средств для лечения или профилактики патологий, возникающих при развитии ангиогенеза.
В отношении опухолей полагают, что опухоли не могут расти или образовывать метастазы в другом органе без образования новых кровеносных сосудов, таким образом, в качестве раннего события при прогрессировании опухоли происходит ангиогенное переключение. Было описано несколько антиангиогенных стратегий, вмешивающихся на различных уровнях ангиогенного каскада: блокирование активности фактора роста; ингибирование протеиназ внеклеточного матрикса (ECM); направление непосредственно на эндотелиальные клетки (EC); повышенное регулирование эндогенных ингибиторов и т.д. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза получили особое внимание в отношении лечения злокачественных опухолей, поскольку оказалось, что они являются нетоксичными и неиммуногенными средствами. Было выявлено по меньшей мере 10 эндогенных ингибиторов ангиогенеза [O'Reilly, M.S. et al., Cell, 88: 277-285, 1997], среди которых наиболее хорошо известными являются ангиостатин и эндостатин.
Эндостатины (ES) представляют собой ингибиторы миграции эндотелиальных клеток и ангиогенеза, и в моделях на животных было показано, что они снижают рост опухоли. Механизмы, вовлеченные в указанные действия, не ясны, хотя было предположено, что в них участвуют связывание рецепторов клеточной поверхности (интегрины и гепарансульфаты, VEGFR-2), металлопротеиназы и компоненты ECM. Источником ES является домен NCI коллагенов XV и XVIII, откуда они протеолитически высвобождаются в форме тримера, и далее они превращаются в мономерные эндостатины массой приблизительно 20 кДа. На N-конце NC1 находится домен тримеризации приблизительно из 60 остатков, соединенный с элементом ES из приблизительно 180 остатков посредством гибкой шарнирной области, содержащей различные чувствительные к протеиназам участки, посредством которых после протеолитического расщепления высвобождается эндостатин.
Boehm et al. [Nature, 390:404 (1997)] описывают использование в качестве экспериментальной модели мышей, которым трансплантировали несколько опухолей (карцинома легких Льюиса, фибросаркома и меланома). У мышей, которым не вводили ES, указанные опухоли росли быстро, приводя к смерти животных. Напротив, у мышей, которым вводили ES после развития опухоли, наблюдалось уменьшение объема опухоли вплоть до достижения почти микроскопического размера. Циклическое введение ES мышам с опухолью приводило к полной регрессии опухолей в моделях на животных. Однако клинические испытания, проведенные для ES, не подтвердили существенного ингибирования роста опухоли, и регрессия опухоли наблюдалась редко. К сожалению, это не является единичным примером, и другие клинические испытания, включающие различные антиангиогенные молекулы, также не оправдали надежд, несмотря на значительные противоопухолевые эффекты в моделях на животных. В связи с указанным кажется логичным сочетать несколько ингибиторов ангиогенеза для лечения злокачественных опухолей у человека. Альтернативно повышенная биологическая активность (ES + ангиостатин) и направленное против опухоли действие [ES + RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота)] потенциально могут улучшить ингибирование роста опухоли.
С другой стороны, был продемонстрирован терапевтический потенциал одноцепочечного фрагмента Fv (scFv) антитела против ламинина (L36) с антиангиогенной активностью как in vivo, так и in vitro. Результаты показали, что изменение морфогенетического потенциала матриксов, ассоциированных с клетками, является эффективным способом предотвращения формирования ассоциированных с опухолью кровеносных сосудов in vivo.
Несмотря на проведенные к настоящему времени попытки, все еще является необходимой разработка соединений ингибиторов ангиогенеза, пригодных в качестве лекарственных средств для лечения или профилактики патологий, возникающих вследствие развития ангиогенеза.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является предоставление соединений с антиангиогенной активностью, потенциально пригодных в качестве лекарственных средств для профилактики и/или лечения патологий, возникающих вследствие ангиогенеза, например псориаза, ревматоидного артрита, ретинопатий, злокачественной опухоли и т.д.
Решение проблемы в соответствии с настоящим изобретением основано на слитых белках, потенциально пригодных в качестве многофункциональных и поливалентных ингибиторов ангиогенеза, содержащих (a) полипептид, содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, и (b) полипептид, содержащий домен олигомеризации и функционально активный ингибирующий или модулирующий процесс ангиогенеза участок, разделенные чувствительным к протеиназе участком.
Иллюстрацией настоящего изобретения являются конструкции нескольких белковых химер. Один из слитых белков (смотрите пример) содержит одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) моноклонального антитела против ламинина L36 и домен NC1 коллагена XVIII, содержащий домен тримеризации и домен эндостатина (ES), связанные шарнирным пептидом, содержащим чувствительные к протеиназам участки, посредством которых после протеолитического расщепления высвобождаются мономерные ES. Уровни протеиназ повышаются в микроокружении опухоли, таким образом, из указанного слитого белка высвобождаются in situ как мономеры ES, так и тримеры scFv. Секреция указанного слитого белка осуществлялась посредством генетически модифицированных клеток человека в функционально активной форме. Полная форма обладала молекулярной массой приблизительно 210 кДа, что указывает на то, что в физиологических условиях отдельные субъединицы являются не ковалентно связанными с образованием тримерной структуры. Указанный тримерный слитый белок значительно ингибировал способность эндотелиальных клеток мигрировать в ответ на факторы роста и образовывать сосуды капиллярного типа при выращивании на субстрате матригель. Более того, указанный слитый белок обрабатывали несколькими различными протеиназами. Данные показали, что катепсин L, панкреатическая эластаза и некоторые матриксные металлопротеиназы (MMP) образуют как мономеры типа ES, так и тримерные фрагменты антитела (scFv). Кроме того, слитые белки преобразовывались правильно, когда они продуцировались генетически модифицированными продуцирующими MMP клетками опухоли, но не тогда, когда они продуцировались генетически модифицированными клетками, которые не продуцировали MMP. Эти результаты открывают путь для новой стратегии генной терапии против злокачественной опухоли с использованием указанного типа слитых белков, которые составляют часть нового поколения ингибиторов ангиогенеза, пригодных в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний, обусловленных дисбалансом в указанном ангиогенезе.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к генной конструкции, содержащий функционально связанные по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты (A), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и последовательность нуклеиновой кислоты (B), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком, где 3'-конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты (A) связан с 5'-концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты (B).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующей кассете, содержащей указанную генную конструкцию, функционально связанную с контролирующей экспрессию последовательностью.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему указанную генную конструкцию или указанную экспрессирующую кассету. В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей указанную генную конструкцию, или указанную экспрессирующую кассету, или указанный рекомбинантный вектор.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, получаемому посредством экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, находящейся в указанной генной конструкции. Указанный слитый белок, как правило, содержит полипептид (A'), содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и полипептид (B'), содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей либо указанный слитый белок совместно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом, либо вектор, содержащий генную конструкцию по настоящему изобретению или экспрессирующую кассету по настоящему изобретению, и необязательно по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанного слитого белка или указанной генной конструкции, или указанной экспрессирующей кассеты, или указанного рекомбинантного вектора для изготовления фармацевтической композиции для предотвращения, лечения, торможения или минимизации развития ангиогенеза.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанного слитого белка или указанной генной конструкции, или указанной экспрессирующей кассеты, или указанного рекомбинантного вектора для изготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики патологий, возникающих вследствие ангиогенеза.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлено картографическое изображение, на котором показано действие на морфогенез капилляров отдельного лечения и сочетанного лечения различными концентрациями рекомбинантного моноклонального антитела (L36) в форме scFv [одноцепочечный фрагмент Fv моноклонального антитела L36 против ламинина] и димерного слитого белка Fc-ES (слитый белок домена ES и фрагмента Fc иммуноглобулина).
На фиг.2 представлена иллюстрация продукции слитого белка в соответствии с настоящим изобретением и его протеолитической обработки. На фиг.2A схематично представлена последовательность, кодирующая ген α1 (коллаген XVIII) и домен NC1. На фиг.2B схематично представлен указанный домен NC1, содержащий соединительный пептид, домен тримеризации, шарнирный пептид и домен ES. На фиг.2C схематично представлен слитый белок, или химера, образованный рекомбинантным моноклональным антителом против ламинина (L36) в форме scFv и доменом NC1 коллагена XVIII. На фиг.2D представлен результат протеолитической обработки указанного слитого белка, где наблюдалось формирование тримерного и мономерного антитела против ES.
На фиг.3A схематично представлена структура гена антитела в форме scFv и несколько генных конструкций, содержащих (или не содержащих) кодирующую последовательность домена ES. На фиг.3B представлены результаты вестерн-блот анализа очищенных слитых белков; иммуноблотинг проводили с моноклональным антителом против myc (mAb) и/или с mAb против ES [дорожка 1: scFv L36; дорожка 2: scFv L36-NC1ES-; дорожка 3: scFv L36-NC1ES+; дорожка 4: NC1; и дорожка 5: ES].
На фиг.4A представлен градиент седиментационного равновесия для доменА scFv NC1ES- (1 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS)) при 11000 об/мин и 20°C. Светлыми кружками показаны данные, тремя сплошными линиями представлены теоретические градиенты мономера scFv (37148 Да), димера (74296 Да) и тримера (111444 Да). В верхнем квадрате указанной фиг.4A представлено распределение скорости седиментации слитого белка scFv L36-NC1ES- (1 мг/мл в буфере PBS) при 42000 об/мин и 20°C. На фиг.4B представлен график, показывающий аффинность связывания ламинина, иммобилизованного на пластмассовой подложке [в большей степени в случае слитого белка scFv L36-NC1ES- (тримерный), чем в случае scFv L36 (мономерный)]. На фиг.4C представлен график, на котором показано зависимое от дозы модулирование дифференцировки клеток эндотелия (в ответ на различные концентрации scFv или концентрации scFv L36-NC1ES-) в стандартном анализе с матригелем. Каждая точка отображает среднее значение для двух лунок +/- стандартное отклонение. На фиг.4D представлены результаты воздействия на слитый белок scFv L36-NC1ES- различных протеиназ (MMP, панкреатической эластазы свиньи и катепсина L).
На фиг.5 представлено распределение скорости седиментации scFv L36-NC1ES+ (фиг.5A) и NC1 (фиг.5B). На фиг.5C представлены кривые насыщения, полученные с указанными концентрациями scFv L36-NC1ES+ и NC1. На фиг.5D представлен график, отображающий зависимое от дозы модулирование дифференцировки клеток эндотелия (в ответ на различные концентрации scFv L36, scFv L36-NC1ES+, NC1 или Fc-ES) в стандартном анализе с матригелем. Каждая точка отображает среднее значение для двух лунок +/- стандартное отклонение. На фиг.5E представлена гистограмма, на которой показано модулирование в анализе эндотелиальных клеток HUVEC посредством scFv L36 (L36), NC1, scFv L36-NC1ES+ или Fc-ES (ES) [PBS использовали в качестве контроля].
На фиг.6A представлен результат обработки scFv L36-NC1ES+ различными протеиназами (MMP, панкреатической эластазой свиньи и катепсином L), а на фиг.6B представлены результаты указанной обработки для NC1. Очищенные белки инкубировали в течение указанных периодов времени с различными протеиназами, как указано в примере (смотрите раздел "Материалы и способы"), и реакционные смеси анализировали посредством SDS-PAGE (фиг.6C) или посредством вестерн-блота с mAb против эндостатина. Расстояния пробега маркеров молекулярной массы и NC1 показаны слева от указанных фигур. Указателями в виде пустых стрелок на фиг.6A и 6B показаны протеолитические продукты.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение относится к генной конструкции, в дальнейшем в настоящем описании генной конструкции по настоящему изобретению, содержащей функционально связанные по меньшей мере:
a) первую последовательность нуклеиновой кислоты (A), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и
b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты (B), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком;
где 3'-конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты (A) связан с 5'-концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты (B).
Последовательность нуклеиновой кислоты (A) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза. Иллюстративные примеры молекул, вовлеченных в процесс ангиогенеза, включают белки внеклеточного матрикса (ECM), ангиогенные факторы, рецепторы клеточной мембраны и т.д. Белки ECM включают коллаген, протеогликаны, фибронектин, ламинин, тенасцин, энтактин и тромбоспондин. В конкретном варианте осуществления указанная молекула, вовлеченная в процесс ангиогенеза, представляет собой ламинин, такой как ламинин млекопитающих, например ламинин крысы, мыши или человека. Ангиогенные факторы включают семейство сосудисто-эндотелиальных факторов роста (VEGF) и т.д. Рецепторы указанных ангиогенных факторов, например рецептор 2 VEGF (VEGFR-2), интегрины и т.д., также можно упомянуть в качестве рецепторов клеточной мембраны, вовлеченных в ангиогенез.
В соответствии с настоящим изобретением можно использовать практически любой полипептид, содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, такой как антитело, например моноклональное или поликлональное антитело, которое распознает молекулу, вовлеченную в процесс ангиогенеза, или ее рекомбинантный фрагмент, содержащий участок, который распознает указанную молекулу, вовлеченную в процесс ангиогенеза, например, в его рекомбинантной одноцепочечной форме (одноцепочечный фрагмент Fv или scFv), бифункциональной форме (димер), полной форме (Fab + Fc) и т.д.; кроме того, в конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (A) кодирует рекомбинантное одноцепочечное антитело (scFv), полученное из mAb, против ламинина L36 (пример 1), содержащее вариабельный участок тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела L36, слитое посредством линкера, такого как пептид, содержащий последовательность G4S, с вариабельным участком легкой цепи (VL) mAb L36 (фиг.2C), последовательность которого описана Sanz L. et al. [Cancer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557-65], где 3'-конец последовательности, кодирующей VL, связан с 5'-концом последовательности, кодирующей указанный линкер, и 3'-конец нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный линкер, связан с 5'-концом последовательности, кодирующей VL.
mAb L36 распознает ламинины различных видов животных, например мыши, крысы, человека и т.д., поскольку оно взаимодействует с участком, который является высоко консервативным среди различных видов животных [Sanz L. et al., EMBO J 2003, Vol. 22(7):1508-1517].
Благодаря своим свойствам, указанный полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, такой как антитело в любой его форме (scFv, бифункциональной или полной), может распознавать и блокировать функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, и может направлять антиангиогенный полипептид, слитый с указанным полипептидом, к молекулам, вовлеченным в процесс ангиогенеза, например белкам ECM, ангиогенным факторам, рецепторам клеточной мембраны и т.д., и блокировать функционально активные участки указанных молекул.
Последовательность нуклеиновой кислоты (B) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации (i) и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком (ii).
Домен олигомеризации представляет собой домен, который обеспечивает образование олигомеров (например, димеров, тримеров, тетрамеров и т.д., пептидов или белков). Для осуществления настоящего изобретения на практике можно использовать практически любой домен олигомеризации, например домен димеризации, тримеризации или тетрамеризации и т.д., представленный в различных белках как эукариотического, так и прокариотического происхождения, способных рекомбинантно экспрессироваться и формировать белковый олигомер белка, который его содержит. В конкретном варианте осуществления указанный домен олигомеризации представляет собой домен тримеризации, такой как домен тримеризации домена NC1 коллагена XVIII или коллагена XV.
Функционально активный в процессе ангиогенеза участок включает любой функционально активный в процессе ангиогенеза пептид или белок, такой как ингибитор процесса ангиогенеза или модулирующий пептид или белок. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать практически любой функционально активный в процессе ангиогенеза пептид или белок; хотя в конкретном варианте осуществления указанный функционально активный в процессе ангиогенеза участок включает эндостатин (ES) млекопитающих, такой как ES, находящийся в домене NC1 коллагена XV или коллагена XVIII.
Чувствительный к протеиназам участок расположен между указанным доменом олигомеризации (i) и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком (ii) и содержит полипептидную последовательность, чувствительную к действию протеиназ. Несмотря на то что в соответствии с настоящим изобретением можно использовать любую пептидную последовательность, чувствительную к любой протеиназе, на практике предпочтительной для указанной протеиназы является протеиназа, экспрессируемая только в области опухоли, чтобы слитый белок по настоящему изобретению "преобразовывался" с образованием функционально активных в процессе ангиогенеза пептидных или белковых мономеров и тримерных полипептидных молекул, способных распознавать и блокировать функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза. Таким образом, в конкретном варианте осуществления указанный чувствительный к протеиназам участок содержит шарнирный участок, находящийся в домене NC1 коллагена XV или XVIII млекопитающих между доменом тримеризации и доменом ES или участком указанного домена NC1, поскольку указанный участок является чувствительным к действию протеиназ, экспрессируемых только в области опухоли.
Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (B) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих или домен NC1 коллагена XV млекопитающих. Как известно, указанный домен NC1 коллагена XVIII (и коллагена XV) содержит домен тримеризации и домен ES, связанные шарнирным пептидом (фиг.2B). Последовательности указанных доменов NC1 коллагена XV и XVIII известны; в качестве иллюстрации, последовательность домена NC1 коллагена XVIII описана ранее Sasaki et al. [Sasaki et al., Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3; 17(15):4249-56]. В примере 1 описано получение нуклеотидной последовательности, содержащей участок, кодирующий домен NC1 коллагена XVIII мыши.
Для осуществления настоящего изобретения на практике можно использовать любой другой домен, сходный с доменом NC1 коллагена XVIII, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком, предпочтительно участок, чувствительный к протеиназам, экспрессируемым в области опухоли.
Как правило, последовательность нуклеиновой кислоты (A) не является непосредственно слитой с последовательностью нуклеиновой кислоты (B), а предпочтительным является введение гибкого связующего пептида (или спейсерного пептида) между полипептидами, кодируемыми указанными последовательностями нуклеиновых кислот (A) и (B). Таким образом, если необходимо, генная конструкция по настоящему изобретению также может дополнительно содержать третью последовательность нуклеиновой кислоты (C), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую подвижный связывающий пептид, расположенный между указанными последовательностями нуклеиновой кислоты (A) и (B), где 5'-конец указанной последовательности нуклеиновой кислоты (C) связан с 3'-концом указанной последовательности нуклеиновой кислоты (A) и 3'-конец указанной последовательности нуклеиновой кислоты (C) связан с 5'-концом указанной последовательности нуклеиновой кислоты (B). Предпочтительно указанный спейсерный пептид (C) представляет собой пептид со структурной гибкостью. Можно использовать практически любой пептид со структурной гибкостью. В качестве иллюстрации, указанный гибкий пептид может содержать повторы аминокислотных остатков, в частности остатков Gly и Ser, или любой другой пригодный повтор аминокислотных остатков. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать практически любую пептидную последовательность, определяющую гибкий связующий пептид. Иллюстративные примеры гибких связующих белков включают последовательности, такие как Gly-Ser-Pro-Gly (GSPG), или последовательность (Gly-Ser)4. Тем не менее, в конкретном варианте осуществления указанный гибкий связующий белок содержит последовательность Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. Таким образом, в конкретном варианте осуществления генная конструкция по настоящему изобретению в дополнение к указанным последовательностям нуклеиновых кислот (A) и (B) содержит третью последовательность нуклеиновой кислоты (C), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
Также в целях упрощения выделения и очистки слитого белка, полученного с помощью настоящего изобретения, генная конструкция по настоящему изобретению может содержать, если это необходимо, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, который можно использовать в целях выделения и очистки слитого белка. Таким образом, в конкретном варианте осуществления генная конструкция по настоящему изобретению включает, если это необходимо, последовательность нуклеиновой кислоты (D), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, который можно использовать в целях выделения или очистки, известный как маркерный пептид. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты (D) может быть расположена в любом положении, которое не изменяет функциональности любого из полипептидов, экспрессируемых указанными последовательностями нуклеиновых кислот (A) и (B). В качестве иллюстрации, указанная последовательность нуклеиновой кислоты (D) может быть расположена в направлении 5'→3' от 3'-конца указанной последовательности нуклеиновой кислоты (B). Можно использовать практически любой пептид, или пептидную последовательность, который обеспечивает выделение и очистку слитого белка, например полигистидиновые последовательности, пептидные последовательности, которые могут распознавать антитела, которые могут использоваться для очистки полученного слитого белка посредством иммуноаффинной хроматографии, такие как маркерные пептиды и т.д., например эпитопы, полученные из гемагглютинина вируса лихорадки, или эпитоп C-myc и т.д.
Генную конструкцию по настоящему изобретению можно получать посредством применения хорошо известных в данной области способов [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd; ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989. Vol 1-3]. Указанная генная конструкция по настоящему изобретению может включать функционально связанную регуляторную последовательность экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот (A) и (B), таким образом, составляя экспрессирующую кассету. Как используют в настоящем описании, выражение "функционально связанный" означает, что полипептиды, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот (A) и (B), и, когда это целесообразно, (C), экспрессируются в правильной открытой рамке считывания под контролем последовательностей контроля экспрессии и регуляторных последовательностей.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующей кассете, содержащей генную конструкцию по настоящему изобретению, функционально связанную с последовательностью контроля экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, содержащий (a) полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, и (b) полипептид, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком. Контролирующие последовательности представляют собой последовательности, которые контролируют и регулируют транскрипцию, и, когда это целесообразно, трансляцию указанного слитого белка, и включают промоторные последовательности, последовательности, кодирующие регуляторы транскрипции, связывающие рибосомы последовательности (RBS) и/или последовательности терминатора транскрипции. В конкретном варианте осуществления указанная последовательность контроля экспрессии является функциональной в прокариотических клетках и организмах, например бактериях и т.д., в то время как в другом конкретном варианте осуществления указанная последовательность контроля экспрессии является функциональной в эукариотических клетках и организмах, например в клетках насекомых, клетках растений, клетках млекопитающих и т.д. Иллюстративные примеры промоторов, которые могут быть представлены в экспрессирующей кассете в соответствии с настоящим изобретением, включают промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и т.д.
Предпочтительно указанная экспрессирующая кассета дополнительно содержит маркер или ген, кодирующий мотив или фенотип, которые позволяют проводить селекцию клетки-хозяина, трансформированной указанной экспрессирующей кассетой. Иллюстративные примеры указанных маркеров, которые могут находиться в экспрессирующей кассете по настоящему изобретению, включают гены устойчивости к антибиотикам, гены устойчивости к токсичным соединениям, и, главным образом, все гены, которые обеспечивают селекцию генетически трансформированных растений.
Генная конструкция по настоящему изобретению или экспрессирующая кассета в соответствии с настоящим изобретением могут быть встроены в пригодный вектор. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, содержащему указанную генную конструкцию по настоящему изобретению или указанную экспрессирующую кассету. Выбор вектора зависит от клетки-хозяина, в которую его затем вводят. В качестве иллюстрации, вектор, в который встраивают последовательность нуклеиновой кислоты, может представлять собой плазмиду или вектор, которые при введении в клетку-хозяина либо встраиваются, либо не встраиваются в геном указанной клетки. Указанный вектор можно получать общепринятыми способами, известными специалистам в данной области [Sambrook et al., 1989, смотрите выше]. В конкретном варианте осуществления указанный рекомбинантный вектор представляет собой вектор, который пригоден для трансформации в клетки животных.
Указанный вектор можно использовать для трансформации, трансфекции или инфицирования клеток, способных быть трансформированными, трансфицированными или инфицированными указанным вектором. Указанные клетки могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая трансформирована, трансфицирована или инфицирована вектором в соответствии с настоящим изобретением. Указанная трансформированная, трансфицированная или инфицированная клетка содержит, таким образом, генную конструкцию по настоящему изобретению или указанную экспрессирующую кассету или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Трансформированные, трансфицированные или инфицированные клетки можно получать общепринятыми способами, известными специалистам в данной области [Sambrook et al., 1989, смотрите выше]. В конкретном варианте осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой клетку животных, которая трансформирована, трансфицирована или инфицирована пригодным вектором, где указанная трансформированная, трансфицированная или инфицированная клетка животных способна экспрессировать слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, указанные векторы можно использовать для экспрессии в клетках животных слитого белка в соответствии с настоящим изобретением.
Генную конструкцию по настоящему изобретению можно использовать для получения слитых белков, содержащих (a) полипептид (A'), содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и (b) полипептид (B'), содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения указанного слитого белка в соответствии с настоящим изобретением, который включает выращивание клетки или организма в соответствии с настоящим изобретением в условиях, которые обеспечивают продукцию указанного слитого белка. Условия для оптимизации культуры указанной клетки или организма зависят от используемой клетки или организма. Если это необходимо, способ получения представляющего интерес продукта в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает выделение и очистку указанного слитого белка. В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, получаемому посредством экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в генной конструкции по настоящему изобретению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему:
(a) полипептид (A'), содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и
(b) полипептид (B'), содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком.
Иллюстративные примеры молекул, вовлеченных в процесс ангиогенеза, включают белки ECM, ангиогенные факторы, рецепторы клеточной мембраны и т.д. Белки ECM включают коллаген, протеогликаны, фибронектин, ламинин, тенасцин, энтактин и тромбоспондин. В конкретном варианте осуществления указанная молекула, вовлеченная в процесс ангиогенеза, представляет собой ламинин, такой как ламинин млекопитающих, например ламинин крысы, мыши или человека.
В соответствии с настоящим изобретением можно использовать практически любой полипептид, содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, такой как антитело, например моноклональное антитело, которое распознает молекулу, вовлеченную в процесс ангиогенеза, или его рекомбинантный фрагмент, который распознает указанную молекулу, вовлеченную в ангиогенный процесс, например одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) антитела, который распознает указанную молекулу, вовлеченную в ангиогенный процесс, или биспецифичное антитело или димер, который распознает указанную молекулу, вовлеченную в ангиогенный процесс, или его полную рекомбинантную форму (Fab + Fc); хотя в конкретном варианте осуществления указанный полипептид (A'), который содержит участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, представляет собой рекомбинантный scFv, полученный из mAb против ламинина L36 (пример 1), содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела L36, слитый посредством линкера, такого как пептид, содержащий последовательность G4S, с вариабельным участком легкой цепи (VL) mAb L36 (фиг.2C), и последовательность которого описана Sanz L. et al. [Cancer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557-65], где 3'-конец кодирующей VL последовательности связан с 5'-концом последовательности, кодирующей указанный линкер, и 3'-конец нуклеотидной последовательности, кодирующей указанной линкер, связан с 5'-концом кодирующей VL последовательности. Как известно, mAb L36 распознает ламинины различных видов животных, например мыши, крысы, человека и т.д., поскольку оно взаимодействует с участком, который является высоко консервативным в различных видах животных [Sanz L. et al., EMBO J 2003, vol. 22(7):1508-1517].
Указанный полипептид (A') может распознавать и блокировать функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, и может направлять антиангиогенный пептид, слитый с указанным полипептидом, к молекулам, вовлеченным в процесс ангиогенеза, например к белкам ECM, ангиогенным факторам, рецепторам клеточной мембраны и т.д., и блокировать функционально активные участки указанных молекул.
Полипептид (B') содержит (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком. Как упоминалось ранее, указанный домен олигомеризации может представлять собой практически любой домен, обеспечивающий образование олигомера, например димеров, тримеров, тетрамеров и т.д., пептидов или белков, которые могут рекомбинантно экспрессироваться, и образующий белковый олигомер содержащего его белка. Тем не менее, в конкретном варианте осуществления указанный домен олигомеризации представляет собой домен тримеризации, такой как домен тримеризации домена NC1 коллагена XVIII или коллагена XV млекопитающих.
Функционально активный в процессе ангиогенеза участок содержит любой функционально активный в процессе ангиогенеза пептид или белок, такой как ингибитор процесса ангиогенеза или модулирующий пептид или белок. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать практически любой функционально активный в процессе ангиогенеза пептид или белок; хотя в конкретном варианте осуществления указанный функционально активный в процессе ангиогенеза участок содержит эндостатин (ES) млекопитающих, такой как ES, находящийся в домене NC1 коллагена XV или коллагена XVIII.
Чувствительный к протеиназам участок расположен между указанным доменом олигомеризации (i) и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком (ii) и содержит пептидную последовательность, чувствительную к действию протеиназы. Несмотря на то что в соответствии с настоящим изобретением можно использовать практически любую пептидную последовательность, чувствительную к действию любой протеиназы, указанная протеиназа предпочтительно представляет собой протеиназу, экспрессируемую только в области опухоли, чтобы слитый белок по настоящему изобретению "преобразовывался" с образованием мономеров функционально активных в процессе ангиогенеза пептидов или белков (например, ES) и полипептидных тримерных молекул, способных распознавать и блокировать функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза (например, scFv). Таким образом, в конкретном варианте осуществления указанный чувствительный к протеиназам участок содержит шарнирную область, находящуюся в домене NC1 коллагена XV или XVIII млекопитающих, между доменом тримеризации и участком ES или доменом указанного домена NC1, поскольку указанный участок является чувствительным к действию протеиназ, которые экспрессируются только в области опухли.
Как известно, указанный домен NC1 коллагена XVIII (и коллагена XV) содержит домен тримеризации и домен ES, связанные шарнирными пептидами (фиг.2B). Таким образом, в конкретном варианте осуществления слитый белок по настоящему изобретению содержит полипептид (B'), содержащий домен NC1 коллагена XV или домен NC1 коллагена XVIII, который содержит домены тримеризации и ES указанных доменов NC1, связанные посредством шарнирных пептидов указанных доменов NC1. Последовательности указанных доменов NC1 коллагена XV и коллагена XVIII известны; в качестве иллюстрации, последовательность домена NC1 коллагена XVIII была описана ранее Sasaki et al. [Sasaki et al., Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3; 17(15):4249-56].
Таким образом, в качестве иллюстрации, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему:
(i) полипептид, выбранный из группы, образуемой целым mAb L36, mAb L36 в бифункциональной форме и рекомбинантным scFv, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) mAb L36, слитый, посредством гибкого пептида, с вариабельным участком легкой цепи (VL) mAb L36; и
(ii) полипептид (B'), содержащий домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих.
Однако для осуществления настоящего изобретения на практике в целях получения многофункциональных и поливалентных ингибиторов ангиогенеза можно использовать любой другой домен, сходный с доменом NC1 коллагена XVIII, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком, предпочтительно участок, чувствительный к протеиназам, экспрессируемым в области опухоли.
Cлитый белок в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать, если это необходимо, третий полипептид (C'), содержащий аминокислотную последовательность гибкого связующего пептида между указанными полипептидами (A') и (B') и/или (b) пептид (D') для упрощения выделения и очистки слитого белка.
Как упоминалось выше, указанный полипептид (C') может содержать практически любую пептидную последовательность, определяющую гибкий связующий пептид. Иллюстративные примеры гибких связующих белков включают последовательности, такие как Gly-Ser-Pro-Gly, или последовательность (Gly-Ser)4. Однако в конкретном варианте осуществления указанный гибкий связующий пептид содержит последовательность Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
В целях упрощения выделения и очистки слитого белка по настоящему изобретению указанный слитый белок также может содержать, если это необходимо, пептид (D'), который можно использовать для целей выделения или очистки слитого белка, такой как маркерный пептид. Указанный пептид (D') может быть расположен в любом положении слитого белка, которое не изменяет функциональности любого из полипептидов (A') и (B'), например указанный пептид (D') может быть расположен после полипептида (B'). Можно использовать практически любой пептид или пептидную последовательность, обеспечивающие выделение или очистку слитого белка, например полигистидиновые последовательности, пептидные последовательности, которые могут распознавать антитела, которые могут быть пригодны для очистки полученного слитого белка иммуноаффинной хроматографией, такие как маркерные пептиды и т.д., например эпитопы, полученные из гемагглютинина вируса лихорадки или эпитоп C-myc и т.д.
Слитый белок в соответствии с настоящим изобретением содержит полипептид (A'), содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и полипептид (B'), содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) функционально активный в процессе ангиогенеза участок и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком. В результате такого слияния и вследствие действия определенных протеиназ, экспрессируемых только в области опухоли, слитый белок "преобразуется" с образованием мономеров функционально активных в процессе ангиогенеза пептидов или белков (например, ES) и полипептидных тримерных молекул, способных распознавать и блокировать функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза (например, scFv). Таким образом, настоящее изобретение относится к многофункциональным и поливалентным соединениям ингибиторов ангиогенеза, поскольку на процесс ангиогенеза воздействуют совместно несколькими различными путями.
Таким образом, благодаря собственным свойствам слитого белка по настоящему изобретению, его можно применять для лечения и/или профилактики развития процессов ангиогенеза и, таким образом, для лечения и/или профилактики патологий, возникающих посредством процессов ангиогенеза. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей либо слитый белок в соответствии с настоящим изобретением совместно с, по меньшей мере, одним фармацевтически приемлемым эксципиентом, либо вектор, содержащий генную конструкцию по настоящему изобретению, или экспрессирующую кассету по настоящему изобретению, и необязательно по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один слитый белок в соответствии с настоящим изобретением в терапевтически эффективном количестве. В значении, используемом в настоящем описании, выражение "терапевтически эффективное количество" относится к количеству слитого белка по настоящему изобретению, вычисленному для получения желательного эффекта и, главным образом, определяемому, наряду с другими факторами, собственными свойствами слитого белка и терапевтическим эффектом, который необходимо получить.
В другом конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением представляет собой композицию, предназначенную для применения ее в генной терапии, содержащую вирусный или невирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением, содержащий генную конструкцию по настоящему изобретению или экспрессирующую кассету по настоящему изобретению. В качестве иллюстрации, указанные векторы могут представлять собой вирусные векторы, например, на основе ретровируса, аденовируса и т.д., или невирусные, такие как комплексы ДНК-липосома, ДНК-полимер, ДНК-полимер-липосома и т.д. [смотрите "Nonviral Vectors for Gene Therapy", под редакцией Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)]. Указанные векторы, которые содержат генную конструкцию по настоящему изобретению или указанную экспрессирующую кассету, можно вводить непосредственно в организм человека или животного общепринятыми способами. Указанные векторы альтернативно можно использовать для трансформации, трансфекции или инфицирования клеток, например клеток млекопитающих, включая клетки человека, ex vivo, а затем имплантации их в организм человека или животного с получением требуемого терапевтического эффекта.
Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить любым пригодным способом введения, например перорально или парентерально. Эксципиенты, которые можно использовать для изготовления фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, зависят, наряду с другими факторами, от способа введения указанной фармацевтической композиции. Обзор различных способов введения активного ингредиента, предназначенных для применения эксципиентов и процессов их получения, можно найти в Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, Luzan 5, S. A. de Ediciones, 1993.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к применению слитого белка в соответствии с настоящим изобретением или генной конструкции по настоящему изобретению, или экспрессирующей кассеты в соответствии с настоящим изобретением, или рекомбинантного вектора в соответствии с настоящим изобретением для изготовления фармацевтической композиции для профилактики, лечения, торможения или минимизации развития ангиогенеза.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению слитого белка в соответствии с настоящим изобретением или генной конструкции по настоящему изобретению, или экспрессирующей кассеты в соответствии с настоящим изобретением, или рекомбинантного вектора в соответствии с настоящим изобретением для изготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики патологий, возникающих вследствие ангиогенеза. Иллюстративные неограничивающие примеры патологий, возникающих вследствие ангиогенеза, включают злокачественную опухоль, гемангиому, ревматоидный артрит, псориаз, бартонеллез, отторжение трансплантированного органа, кровотечение, неоваскуляризацию глаза (один из наиболее частых случаев слепоты), ретинопатии (диабетическую или раннюю ретинопатии и т.д.), дегенерацию желтого пятна, неоваскулярную глаукому, окклюзию вен сетчатки, окклюзию артерий сетчатки, птеригий, покраснение радужки или неоваскуляризацию роговицы. В конкретном варианте осуществления слитый белок по настоящему изобретению, генная конструкция по настоящему изобретению, экспрессирующая кассета в соответствии с настоящим изобретением или рекомбинантный вектор в соответствии с настоящим изобретением, в частности, пригодны для лечения злокачественной опухоли, включая лечение солидных опухолей, и пролиферации и метастазов опухоли.
Следующий пример может использоваться для иллюстрации настоящего изобретения, и его не следует рассматривать как ограничивающий объем настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
Разработка и экспрессия ингибитора ангиогенеза, состоящего из олигомеров фрагмента антитела и коллагена XVIII
Было получено несколько генных конструкций (фиг.3A), способных экспрессировать следующие продукты:
- одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) моноклонального антитела против ламинина L36 (scFv L36),
- слитый белок, определяемый как scFv L36-NC1ES-, образованный из scFv L36, слитого с доменом тримеризации, находящимся в домене NC1 коллагена XVIII мыши (остатки с 10 по 60), посредством гибкого соединяющего пептида (линкера),
- слитый белок, определяемый как scFv L36-NC1ES+, образованный из scFv L36, слитого с доменом NC1 коллагена XVIII мыши (остатки с 10 по 325), посредством указанного линкера,
- домен NC1 коллагена XVIII мыши (остатки с 10 по 315) (NC1) и
- эндостатин (ES) из домена NC1 коллагена XVIII мыши (остатки с 130 по 315), который протеолитически высвобождается в тримерной форме, а затем превращается в мономерный ES массой приблизительно 20 кДа (фиг.2A и 2B).
В целях упрощения иммунологического анализа белков получают генные конструкции, дополнительно содержащие последовательность, кодирующую маркер, конкретно, последовательность, кодирующую his6myc, чтобы указанный маркер был связан с C-концом различных белков.
Указанные генные конструкции клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих под контролем промотора цитомегаловируса человека (hCMV), содержащего сигнальную последовательность онкостатина M человека [Sanz L. et al., Gene Therapy (2002) 15:1049]. Экспрессирующие векторы для ES (положения 130-315) и NC1 мыши (1-315) использовали в качестве контролей.
Указанные рекомбинантные белки использовали в анализах образования капиллярной структуры в матригеле, а также в анализах миграции клеток в целях оценки их потенциала в качестве антиангиогенного средства.
I. МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Клетки и условия культивирования
Клетки HEK-293 (эпителий почки человека; ATCC CRL-1573), клетки HT-1080 (фибросаркома человека; ATCC CCL-121) и клетки B16-F10 (меланома мыши; ATCC CRL-6475) культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) (Life Technologies, Gaithersburg, MD, U.S.A.).
Первичные эндотелиальные клетки пуповинной вены человека (HUVEC) были предоставлены Dr. B. Gimenez (Instituto de Investigaciones Biomedicas, Madrid, Spain) и их культивировали в среде Хэма F12K (Life Technologies) с 10% FBS, 50 мкг/мл добавки для роста клеток эндотелия (ECGS), полученной из гипофиза быка, и 100 мкг/мл гепарина (Sigma Biosciences, St. Louis, MO, U.S.A.).
Линия клеток эндотелия микрососудов человека HMEC-1 (Ades E.W. et al., 1992, Journal of Investigative Dermatology, 99:683-690) была поставлена Dr. E. W. Ades (Center for Disease Control, Atlanta, GA, U.S.A.) и ее культивировали в среде MCBD 131 (Life Technologies), дополненной 10% FBS, 10 нг/мл EGF (эпидермального фактора роста) и 1 мг/мл гидрокортизона (Sigma Biosciences).
Конструирование экспрессирующего вектора
Последовательность домена NC1, содержащую последовательность, кодирующую соединяющий пептид, домен тримеризации, шарнирный пептид и домен ES (фиг.2B), амплифицировали посредством полимеразной цепной реакций (ПЦР) из клона mc3b α1 (коллаген XVIII) мыши [Oh et al., Genomics. 1994 Feb; 19(3):494-9], предоставленного Dr. B. Olsen (Harvard Medical School, Boston, MA, U.S.A.), посредством пары праймеров 1 и 2 (смотрите таблицу, содержащую последовательности различных праймеров, используемых для конструкции вектора и последующей проверки последовательностей векторов).
Таблица
Последовательности олигонуклеотидов |
|
Номер | Последовательность (5' → 3') |
1. | ATTCAGATCTTGGGCAGGTGAGGAT |
2. | TTCATGACCTCTTTCTCCAAAGCGGCCGCTAAACTAT |
3. | ATATAGCGCGGCCGCGAATTCAGATCTTGGGCAGGTGAGGAT |
4. | TAGAAGGCACAGTCGAGG |
5. | TCTGGCTCCAAGTCTGGC |
6. | AATTCAGGCGCCGGTGGATCTGGTGGCTCCTCTGGCTCAGACGGAGCGTCGGGTTCGCGA |
7. | GATCTCGCGAACCCGACGCTCCGTCTGAGCCAGAGGAGCCACCAGATCCACCGGCGCCTG |
8. | CGATACA |
9. | GATCTGTAT |
10. | CCTAGATCTTGCTCATACTCATCAGGACTTTCAG |
11. | GTCCTAGGTGCGGCCGCGAAT |
12. | ATAGTTTAGCGGCCGCCTCATTGCCCGTGCCTCTCAG |
Продукт ПЦР снова амплифицировали посредством пары праймеров 2 и 3 (таблица) и полученный продукт ПЦР, расщепленный посредством NotI, присоединяли к участку NotI плазмиды pCR3.1-L36 [Sanz L. et al., Gene Therapy (2002) 15:1049] с получением плазмиды pCR3.1-L36-NC1. Последовательность проверяли с использованием праймеров 4 и 5 (таблица).
Для получения генной конструкции, определяемой как scFv L36-NC1ES+ (фиг.3A), "соединительный пептид", соединяющий тройную спираль коллагена с доменом тримеризации NC1, ответственным за высвобождение домена NC1 из исходного коллагена XVIII заменяли "гибким пептидным соединительным элементом" ("гибким линкером") Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser [LEGAGGSGGSSGSDGASGS] (фиг.2B и 2C), в целях предотвращения возможного расщепления домена NC1 на аминоконце scFv L36, с учетом того, что "пептидный соединительный элемент" является чувствительным к действию различных металлопротеиназ (MMP). Для этого пару олигонуклеотидов (праймеры 6 и 7) (таблица), содержащих последовательность, кодирующую указанный "гибкий соединительный пептид" ("гибкий линкер"), присоединяли к участку EcoRI-BglII в рCR3.1-L36-NC1, в результате чего получали плазмиду pCR3.1-L36-линкер-NC1.
Плазмиду pCR3.1-NC1 конструировали посредством удаления фрагмента ClaI-BglII из плазмиды pCR3.1-L36-линкер-NC1 (содержащей полный scFv L36) и встраивания пары олигонуклеотидов (праймеры 8 и 9) (таблица), содержащих участок NruI.
Конструкцию плазмиды pCR3.1-ES, компонента, представляющего собой эндостатин мыши (ES) (остатки с 130 по 315 домена NC1) [Sasaki et al., Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56], амплифицировали из плазмиды pCR3.1-NC1 посредством пары праймеров 2 и 10 (таблица). Фрагмент из ПЦР, расщепленный посредством BglII/NotI, связывали с плазмидой pCR3.1-NC1, расщепленной BglII/NotI. Последовательность проверяли с использованием праймера 4 (таблица).
Домен тримеризации, находящийся в домене NC1 [Sasaki et al., Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56], амплифицировали из плазмиды pCR3.1-NC1 посредством пары праймеров 11 и 12 (таблица). Фрагмент из ПЦР, расщепленный NotI, лигировали с плазмидой pCR3.1-L36, расщепленной посредством NotI, с получением плазмиды pCR3.1-L36-тример. Последовательность проверяли с использованием праймера 4 (таблица).
Трансфекции клеток
Клетки HEK-293, HT-1080 и B16-F10 трансфицировали пригодными экспрессирующими векторами (pCR3.1, pCR3.1-L36, pCR3.1-L36-тример, pCR3.1-ES, pCR3.1-NC1 или pCR3.1-L36-линкер-NC1) с использованием системы на основе липофектамина (Life Technologies). Для получения стабильных клеточных линий проводили селекцию трансфицированных клеток HEK-293, HT-1080 и B16-F10 в DMEM с 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл или 3 мг/мл G-418 (Life Technologies). Пролиферацию исходных клеток опухоли, трансдуцированных различными векторами, анализировали каждые сутки в течение 4 последующих суток в анализах с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразоилбромидом (MTT, Promega). Супернатанты промежуточных и стабильных популяций клеток анализировали для определения экспрессии белка посредством SDS-PAGE [Sanz L. et al., Gene Therapy (2002) 15:1049], ELISA [Sanz L. et al., Gene Therapy (2002) 15:1049] и вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) [Blanco et al., J. Immunol (2003) 171:1070] с использованием mAb (моноклональных антител) против myc (Life Technologies) или против эндостатина (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, U.S.A.).
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
Трансфицированные стабильные клетки HEK-293 использовали в культуральных средах, кондиционированных без сыворотки. Для снижения протеолиза в среду добавляли сочетание ("коктейль") ингибиторов протеиназ (апротинин, бестатин, леупептин, пепстатин A и E-64) (Sigma Biosciences). Среду (приблизительно 1 л) концентрировали (×10) посредством фильтра Vivaflow 50 10000 MWCO (Vivascience AG, Germany), проводили диализ против PBS (фосфатно-солевой буфер), pH 7,4 и помещали в 1-мл колонку HisTrap HP (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Белки, содержащие ES, дополнительно очищали на 1-мл колонке HiTrap Heparin HP (Amersham Biosciences). Элюирование проводили посредством линейного градиента 0,1-2,0 NaCl. Проводили диализ очищенных белков против PBS и хранили при -20°C. Слитый белок домена ES и Fc (Fc-ES) [Cuo C.J. et al., J Cell Biol. 2001 152:1233] был предоставлен Dr. K. Javaherian (Boston Children's Hospital, Boston, MA, U.S.A.). Указанный слитый белок Fc-ES представляет собой димерный слитый белок (домена ES и фрагмента Fc иммуноглобулина), и он блокирует морфогенез капилляров.
Аналитическое центрифугирование
Эксперименты с центрифугированием проводили при 20°C в аналитической ультрацентрифуге Optima XL-A (Beckman-Coulter Inc.), оборудованной оптикой для УФ-области спектра, с использованием ротора An50Ti с 3-мм двухсекторным центральным элементом из активированного угля Epon. Степень седиментации при низкой скорости оценивали в короткой колонке (23 мкл) при трех последовательных скоростях (5000, 6000 и 11000 об/мин) и изображения для степени получали (через 20 часов) при длине волны 280 нм. Внимание сосредотачивали на сохранении белковой массы в растворимой форме в процессе эксперимента. В контрольных экспериментах по скорости седиментации не было показано какой-либо агрегации в течение периода времени 45 часов. Контрольный сигнал определяли после центрифугирования на высокой скорости (5 часов при 42000 об/мин). Среднюю молекулярную массу по кажущейся массе цельных клеток получали с использованием программы EQASSOC [Minton, A. P. (1994) в Modern Analytical Ultracentrifugation (Schuster, T., and Laue, T., eds), pp. 81-93, Birkhauser Boston, Inc., Cambridge, MA]. Эксперимент по скорости седиментации проводили при 42000 об/мин и изображения для поглощения получали при 280 нм. Коэффициенты седиментации вычисляли посредством модели уравнения Ламма для непрерывного распределения c(s) [P. Schuck. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp. 1606-1619], которую осуществляли посредством программы SEDFIT. Эти экспериментальные значения для седиментации корректировали в соответствии с обычными условиями с получением соответствующих значений s20,w с использованием программы SEDNTERP [T.M. Laue, B.D. Shah, T.M. Ridgeway and S.L. Pelletier, Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins. В: S. E. Harding, AJ. Rowe and J. C. Horton, Editors, Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK (1992), pp. 90-125]. Дополнительные гидродинамические анализы (т.е. вычисление соотношения коэффициентов трения) проводили посредством программы SEDFIT с получением распределения c(M) [P. Schuck. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp. 1606-1619].
Фильтрационная хроматография на аналитическом геле
Указанные эксперименты проводили при комнатной температуре с системой ДKTA FPLC с использованием колонки Superdex 200 10/300GL. Образцы различных рекомбинантных белков объемом 0,1 мл (scFv L36, scFv L36-NC1ES-, scFv L36-NC1ES+ и NC1) в PBS инъецировали в концентрации 0,5-1,0 мг/мл и разделяли при скорости потока 0,5 мл/мин. Колонку калибровали посредством высокомолекулярных и низкомолекулярных маркеров (Amersham). Соотношения объемов элюирования относительно объема вытеснения и молекулярных масс маркеров приводили в соответствие экспоненциальной кривой, которую использовали для вычисления молекулярной массы образцов.
Протеиназы
Матриксные протеиназы (MMP) человека MMP-1 и MMP-9 приобретали в Oncogene Research Products (San Diego, CA, U.S.A.), а MMP человека MMP-3, MMP-8 и MMP-14 (MT1-MMP) приобретали в Calbiochem (San Diego, CA, U.S.A.). Катепсин L человека и панкреатическую эластазу свиньи также приобретали в Calbiochem.
Протеолитическая обработка
Рекомбинантные белки scFv L36-NC1ES-, scFv L36-NC1ES+ и NC1 инкубировали в концентрации 0,6 мкМ при 37°C в течение 10 минут с:
- 10 нМ катепсином L человека в 50 мМ ацетате натрия, pH 5,5, 2 мМ дитиотреитоле (DTT), 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) (для обработки катепсином L человека);
- 25 нМ эластазой свиньи в 50 мМ ацетате натрия, pH 6,0 (для обработки эластазой свиньи) и
- 25 нМ металлопротеиназой в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij-35, 50 мкМ ZnSO4 (для обработки используемыми металлопротеиназами).
Затем аликвоты подвергали электрофорезу в 12% полиакриламидном геле в редуцирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Гели окрашивали нитратом серебра (Sigma BioScience) или подвергали вестерн-блоттингу с использованием mAb мыши против ES.
Анализ образования трубки в матригеле
Для анализов образования подобной капилляру структуры (CLS) получали матрикс мембраны на основе матригеля (Becton Dickinson, Bedford, MA, U.S.A.) на предварительно замороженном 72-луночном планшете Terasaki (Nunc, Roskilde, Denmark) с 2 мкл/лунка, а затем оставляли для затвердевания при 37°C на 30 минут. 3×103 EC (HMEC-1 или HUVEC) в 10 мкл пригодной среды, дополненной 0,5% FBS, высевали на загущенный матрикс. Общий объем среды в лунке доводили до 25 мкл, в то время как клетки получали и инкубировали в течение 16 часов при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Ингибиторное действие анализируемых рекомбинантных белков (scFv L36, scFv L36-NC1ES-, scFv L36-NC1ES+, NC1 и ES) на формирование трубки определяли посредством добавления 15 мкл очищенного рекомбинантного белка, разбавленного в среде, пригодной в соответствии с используемой клеточной линией (HMEC-1 или HUVEC), в различных концентрациях (фиг.5D), в покрытые матригелем планшеты во время культивирования клеток. Эксперименты проводили в трех экземплярах.
Анализ цифрового изображения
Цифровые изображения каждой лунки получали посредством микроскопа Axiovert 100 (Carl Zeiss, Germany) с использованием камеры SPOT (Diagnostics Instruments, Inc.) и хранили в качестве изображений BMP с 8-битной шкалой серых тонов с количеством пикселей 328×256. Изображения обрабатывали с использованием нового программного обеспечения AD на основе Matlab 5.3 [Sanz, L. et al., Microvasc Res. 2002 May; 63(3):335].
Анализ миграции клеток
Для исследований миграции EC вкладыши фильтра на основе терефталата полиэтилена с порами размером 3,0 мкм и диаметром 6,5 мм (Becton Dickinson) покрывали матригелем в концентрации 1,25 мкг/мл в не содержащей сыворотки среде при 4°C на ночь. Клетки HUVEC (1,5×105) предварительно инкубировали в не содержащей сыворотки среде в течение 30 минут при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в присутствии 20 мкг/мл очищенного белка (scFv L36, scFv L36-NC1ES-, ES, NC1 и scFv L36-NC1ES+), а затем их переносили в верхнюю камеру. 600 мкл среды, содержащей сыворотку, добавляли в нижнюю камеру. Через 16 часов клетки фиксировали 1% глутаральдегидом в PBS, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым и исследовали под микроскопом.
II. РЕЗУЛЬТАТЫ
Сочетанное действие эндостатина и scFv антитела против ламинина (L36) в анализе формирования эндотелиальной трубки
Было показано, что олигомерный ES модулирует зависимый от внеклеточного матрикса (ECM) морфогенез клеток эндотелия (EC) [Cuo C.J. et al., J Cell Biol. 2001 152:1233]. Обработка димерным ES в форме Fc-ES во время культивирования клеток на матригеле значительно ингибировала сборку в трубчатые структуры, сохраняя EC диспергированными и демонстрируя морфологию, которая была аналогична морфологии клеток на пластмассе. Эти морфологические изменения были сходны с изменениями, наблюдаемыми, когда культуры EC обрабатывали scFv L36 (фиг.1).
Конструирование и экспрессия слитых белков scFv L36-ES
Источником ES, который протеолитически высвобождается в тримерной форме, а затем превращается в мономерную ES массой приблизительно 20 кДа (фиг.2A и 2B), является домен NC1 коллагена XVIII. Были сконструированы различные химерные гены, экспрессирующие различные белки.
В конкретном варианте осуществления был сконструирован химерный ген, называемый scFv L36-NC1ES+, состоящий из scFv mAb против ламинина L36, слитого с доменом NC1 коллагена мыши XVIII (остатки с 10 по 315) (фиг.2C и 3A). На N-конце NC1 коллагена XVIII находится домен тримеризации из приблизительно 60 аминокислотных остатков, присоединенный рядом с элементом ES из приблизительно 180 аминокислотных остатков, посредством гибкой шарнирной области из приблизительно 70 аминокислотных остатков, содержащей несколько участков, которые являются чувствительными к протеиназам, с помощью которых после протеолитического расщепления высвобождается ES (фиг.2B). "Соединительный пептид", соединяющий тройную спираль коллагена с доменом тримеризации NC1, ответственным за высвобождение домена NC1 из исходного коллагена XVIII, является чувствительным к действию различных MMP. Таким образом, для предотвращения возможного расщепления домена NC1 на аминоконце L36 указанный "соединительный пептид" заменяют "гибким линкером" из 17 аминокислот (фиг.2B и 2C).
Также, в другом конкретном варианте осуществления сконструировали химерный ген, называемый scFv L36-NC1ES-, более короткий, чем предыдущий ген, содержащий кодирующие последовательности для scFv L36, указанный гибкий линкер и только домен тримеризации NC1 (фиг.3A).
Для упрощения иммунологического анализа к C-концу слитых белков присоединяли маркер his6myc.
Генные конструкции клонировали в пригодные экспрессирующие векторы млекопитающих под контролем промотора hCMV, содержащего главную последовательность онкостатина M человека. Экспрессирующие векторы для ES (положения 130-315) и NC1 мыши (1-315) использовали в качестве контроля (фиг.3A).
Получали стабильные линии клеток HEK 293 и очищали слитые белки из кондиционированной среды. Вестерн-блот анализ показал, что характер миграции очищенных белков согласовывался с предполагаемой молекулярной массой (фиг.3B) [дорожка 1: scFv L36; дорожка 2: scFv L36-NC1ES-; дорожка 3: scFv L36-NC1ES+; дорожка 4: NC1 и дорожка 5: ES].
В редуцирующих условиях mAb против myc 9E10 формировали отдельные полосы с кажущейся молекулярной массой (MW) 26, 36, 67,5 и 22 кДа (фиг.3B), которая соответствует вычисленной MW 28,8, 37,6, 65,6 и 23,8 кДа для мономерного scFv L36, тримерного scFv L36, scFv L36-NC1 и мономерного ES, соответственно. В вестерн-блот анализах с белками, содержащими домен NC1, mAb 9E10 распознавали единичную полосу массой приблизительно 24 кДа, соответствующую мономерному ES, и парную полосу 39-44 кДа, соответствующую необработанному белку (фиг.3B). Обе полосы в парной полосе были положительными в вестерн-блот анализе с mAb против ES (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). Парная полоса может возникать вследствие посттрансляционной модификации или вследствие собственных действий сборки белка.
Также mAb против ES формировало полосу массой 24 кДа и дополнительную полосу с кажущейся MW приблизительно 23 кДа, которая может соответствовать немаркированным мономерам ES-типа (фиг.3B). Посредством вестерн-блот анализа с белками scFv L36-NC1ES+, mAb против ES распознавало полосу необработанного слитого белка массой 67,5 кДа и 24 кДа, не определяемую посредством mAb 9E10, соответствующую обработанному домену ES (фиг.3B). Очищенные ES представляли собой парную полосу массой 22-23 кДа при обработке mAb против ES (фиг.3B).
Характеризация слитого белка scFv L36-NC1
ES-
Состояние олигомеризации различных слитых белков оценивали посредством аналитической хроматографии с гель-фильтрацией и посредством экспериментов с аналитическим центрифугированием с идентичными образцами. Слитый белок scFv L36-NC1ES- очищали посредством IMAC (аффинная хроматография с иммобилизованным металлом), элюировали из колонки для гель-фильтрации по существу в виде одного пика (90% общей площади) в объеме, который соответствовал молекулярной массе 109 кДа, которая указывала на то, что белок представлял собой тример. Для скорости седиментации также был показан главный отдельный пик с массой 112 кДа, и результатом анализа седиментационного равновесия было распределение масс, которое могло соответствовать тримерным образцам и не соответствовало мономерным или димерным (фиг.4A). В целом, все эти результаты показали тримерную природу слитого белка scFv L36-NC1ES-, свойство, придаваемое доменом тримеризации NC1, поскольку scFv L36 является мономерным в таких же условиях, как показано в экспериментах по гель-фильтрации и скорости седиментации (данные не представлены). Тримерные scFv L36 (scFv L36-NC1ES-) показали более высокую аффинность связывания ламинина, иммобилизованного на пластмассе, и были значительно более эффективными, чем мономер, в отношении блокирования дифференцировки EC на субстратах на основе матригеля (фиг.4B и 4C).
Для экспериментальных целей необходимо, чтобы слитый белок scFv L36-NC1ES- оставался стабильным и функциональным в присутствии протеиназ. Таким образом, определяли его функциональность после инкубации с широким диапазоном протеиназ в известных молярных концентрациях активного фермента. Протеиназы включали представителей нескольких классов протеиназ, т.е. катепсин L семейства цистеиновых протеиназ; MMP-1, MMP-3; MMP-8; MMP-9, MMP-14 семейства металлопротеиназ, и панкреатическую эластазу семейства сериновых протеиназ. Как представлено на фиг.4D, тримерный scFv L36 (scFv L36-NC1ES-) не расщеплялся в присутствии большинства анализируемых протеиназ. MMP-14 частично преобразовывала тример (scFv L36-NC1ES-), однако даже после 4-часового взаимодействия посредством ELISA определяли функционально активное антитело. Только катепсин L осуществлял полную деградацию слитого белка scFv L36-NC1ES-.
Характеризация слитого белка scFv L36-NC1
ES+
Гель-фильтрация показала, что очищенный слитый белок scFv L36-NC1ES+ элюировался в виде главного пика с приблизительной молекулярной массой 210 кДа, соответствующей тримеру, и другого пика с кажущейся молекулярной массой 117 кДа, которая могла соответствовать фрагменту, лишенному части ES (фиг.5A). Для скорости седиментации также было выявлено два вида с массами 181 кДа и 83 кДа.
Рекомбинантный белок NC1 элюировался в качестве главного пика с приблизительной молекулярной массой 123 кДа, которая соответствовала тримерному образцу, и других пиков меньших размеров, один из них с массой 19 кДа, которая соответствовала мономерам ES (фиг.5B). Основной образец с молекулярной массой 116 кДа был выявлен посредством экспериментов по скорости седиментации. Эти данные показали, что рекомбинантный белок NC1 был изначально тримерным, но гетерологичным, возможно, вследствие деградации, что согласовывалось с результатами, полученными другими исследователями, которые наблюдали сходную гетерогенность рекомбинантных белков NC1 [Sasaki T. et al., EMBO J. 1998 17:4249-56].
Как ожидалось, для слитого белка scFv L36-NC1ES+ была показана аффинность связывания ламинина, иммобилизованного на пластмассе, немного более высокая, чем аффинность рекомбинантного белка NC1 (фиг.5C). Аналогично, указанный слитый белок scFv L36-NC1ES+ (биспецифичный) был значительно более эффективным, чем рекомбинантный белок NC1 (моноспецифичный) в отношении блокирования дифференцировки EC на субстратах матригеля (фиг.5D).
Фиг.5E включает результаты анализа миграции EC и на ней показано, что миграция клеток HUVEC в присутствии слитого белка scFv L36-NC1ES+ меньше, чем миграция, достигаемая в присутствии анализируемых рекомбинантных белков (scFv L36 и NC1), и обладает таким же порядком величины, которую достигают посредством рекомбинантного ES.
Протеолитическая обработка слитого белка scFv L36-NC1
ES+
. Образование мономерного ES и мультимерного scFv
В целях проведения исследования образования ES посредством нескольких протеиназ, слитый белок scFv L36-NC1ES+ инкубировали и реакционную смесь анализировали посредством вестерн-блот анализа с использованием mAb против ES (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). Слитый белок обрабатывали пятью анализируемыми MMP (MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9 и MMP-14), наблюдая значительные различия эффективности преобразования белка scFv L36-NC1ES+ между указанными MMP, где MMP-3 и MMP-14 оказались наиболее эффективными. Полное преобразование слитого белка scFv L36-NC1ES+ наблюдали через 4 часа. Основными накопленными продуктами были полипептиды с молекулярными массами, находящимися между 20 и 25 кДа (фиг.6A). MMP-3, MMP-8, MMP-9 и MMP-14 продуцировали фрагменты ES, которые накапливались через 4 часа, что позволяет предположить, что указанные MMP не могут их деградировать. Как представлено на фиг.6A, эластаза и катепсин L не только приводили к образованию фрагментов типа ES из слитого белка scFv L36-NC1ES+, а также они их быстро деградировали, только небольшие количества ES оставались через 4 часа инкубации. Этот характер протеолитического преобразования был почти идентичным характеру, наблюдаемому для природного белка NC1 мыши (фиг.6B). Результаты показали, что добавление к N-концу фрагмента антитела, содержащего участок распознавания эпитопа, такой как scFv, в домене NC1 не препятствовало ни протеолитической обработке слитого белка протеиназами, ни образованию ES.
В целях исследования эффективности протеиназ для получения фрагментов антитела (scFv L36), реакционные смеси подвергали SDS-PAGE в редуцирующих условиях и окрашивали нитратом серебра. Как представлено на фиг.6C, наиболее эффективной для получения ES протеиназой была MMP-14, которая также приводила к образованию scFv L36. Образованные scFv L36 и ES были стабильными и накапливались через 4 часа, что указывало на то, что в этих экспериментальных условиях протеиназа не могла их деградировать. Взаимоотношение между интенсивностью для тримерного scFv L36 и интенсивностью для ES предполагает сбалансированное преобразование слитого белка scFv L36-NC1ES+. Для других MMP наблюдались сходные результаты (данные не представлены).
Claims (25)
1. Олигомерный белок, применяемый как многофункциональный и поливалентный ингибитор или модулятор ангиогенеза, содержащий 2, 3 или 4 слитых белка, где каждый слитый белок содержит:
a) полипептид (А'), содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, где указанный полипептид представляет собой антитело, которое распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, или его рекомбинантный фрагмент, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и
b) полипептид (В'), содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) ингибирующий или модулирующий процесс ангиогенеза пептид или белок, и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком.
a) полипептид (А'), содержащий участок, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, где указанный полипептид представляет собой антитело, которое распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, или его рекомбинантный фрагмент, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и
b) полипептид (В'), содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) ингибирующий или модулирующий процесс ангиогенеза пептид или белок, и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком.
2. Олигомерный белок по п.1, где указанная молекула, вовлеченная в процесс ангиогенеза, представляет собой белок внеклеточного матрикса (ЕСМ), ангиогенный фактор или рецептор клеточной мембраны.
3. Олигомерный белок по п.2, где указанная молекула, вовлеченная в процесс ангиогенеза, представляет собой коллаген, протеогликан, фибронектин, ламинин, тенасцин, энтактин, тромбоспондин, сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF), рецептор 2 VEGF (VEGFR-2) или интегрин.
4. Олигомерный белок по п.3, где указанный ламинин представляет собой ламинин млекопитающих, предпочтительно ламинин крысы, мыши или человека.
5. Олигомерный белок по любому из пп.1-4, где указанный полипептид (А') представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) антитела, которое распознает функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, или димер, распознающий указанную молекулу, вовлеченную в процесс ангиогенеза.
6. Олигомерный белок по п.1, где указанный полипептид (В') содержит домен NC1 коллагена XV млекопитающих или домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих.
7. Олигомерный белок по п.1, содержащий, между указанными полипептидами (А') и (В'), третий полипептид (С'), содержащий аминокислотную последовательность гибкого связующего белка.
8. Олигомерный белок по п.1, где указанный олигомерный белок представляет собой тример, состоящий из 3 слитых белков, где каждый слитый белок содержит:
a) полипептид (А'), где указанный полипептид (А') представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) антитела, которое распознает ламинин, и
b) полипептид (В'), где указанный полипептид (В') содержит домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих.
a) полипептид (А'), где указанный полипептид (А') представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) антитела, которое распознает ламинин, и
b) полипептид (В'), где указанный полипептид (В') содержит домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих.
9. Фармацевтическая композиция для профилактики, лечения, торможения или минимизации развития ангиогенеза у пациента, нуждающегося в этом, содержащая терапевтически эффективное количество олигомерного белка по любому из пп.1-8 совместно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, применяемая для лечения и профилактики патологий, возникающих вследствие ангиогенеза.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанные патологии, возникающие вследствие ангиогенеза, включают злокачественную опухоль, гемангиому, ревматоидный артрит, псориаз, бартонеллез, отторжение трансплантированного органа, кровотечение, неоваскуляризацию глаза, ретинопатии, дегенерацию желтого пятна, неоваскулярную глаукому, окклюзию вен сетчатки, окклюзию артерий сетчатки, птеригий, покраснение радужки или неоваскуляризацию роговицы.
12. Применение олигомерного белка по любому из пп.1-8 для изготовления фармацевтической композиции для профилактики, лечения, торможения или минимизации развития ангиогенеза.
13. Применение олигомерного белка по любому из пп.1-8 для изготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики патологий, возникающих вследствие ангиогенеза.
14. Применение по п.13, где указанная патология, возникающая вследствие ангиогенеза, включает злокачественную опухоль, гемангиому, ревматоидный артрит, псориаз, бартонеллез, отторжение трансплантированного органа, кровотечение, неоваскуляризацию глаза, ретинопатии, дегенерацию желтого пятна, неоваскулярную глаукому, окклюзию вен сетчатки, окклюзию артерий сетчатки, птеригий, покраснение радужки или неоваскуляризацию роговицы.
15. Экспрессирующая кассета, кодирующая олигомерный белок по любому из пп.1-8, содержащая функционально связанную с контролирующей экспрессию последовательностью генную конструкцию, содержащую функционально связанные по меньшей мере:
а) первую последовательность нуклеиновой кислоты (А), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, где указанный полипептид представляет собой антитело, которое распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, или его рекомбинантный фрагмент, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и
b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты (В), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) ингибирующий или модулирующий процесс ангиогенеза пептид или белок, и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком;
где 3'-конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты (А) связан с 5'-концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты (В).
а) первую последовательность нуклеиновой кислоты (А), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, где указанный полипептид представляет собой антитело, которое распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза, или его рекомбинантный фрагмент, который распознает и блокирует функционально активный участок молекулы, вовлеченной в процесс ангиогенеза; и
b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты (В), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий (i) домен олигомеризации, (ii) ингибирующий или модулирующий процесс ангиогенеза пептид или белок, и (iii) чувствительный к протеиназам участок между указанным доменом олигомеризации и указанным функционально активным в процессе ангиогенеза участком;
где 3'-конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты (А) связан с 5'-концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты (В).
16. Экспрессирующая кассета по п.15, где указанная молекула, вовлеченная в процесс ангиогенеза, представляет собой белок внеклеточного матрикса (ЕСМ), ангиогенный фактор или рецептор клеточной мембраны.
17. Экспрессирующая кассета по п.16, где указанная молекула, вовлеченная в процесс ангиогенеза, представляет собой коллаген, протеогликан, фибронектин, ламинин, тенасцин, энтактин, тромбоспондин, сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF), рецептор 2 VEGF (VEGFR-2) или интегрин.
18. Экспрессирующая кассета по п.17, где указанный ламинин представляет собой ламинин млекопитающих, предпочтительно ламинин крысы, мыши или человека.
19. Экспрессирующая кассета по п.15, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты (А) содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) антитела, которое распознает указанную молекулу, вовлеченную в процесс ангиогенеза, или димер, который распознает указанную молекулу, вовлеченную в процесс ангиогенеза.
20. Экспрессирующая кассета по п.15, где указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты (В) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен NC1 коллагена XV млекопитающих, или нуклеотидную последовательность, кодирующую домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих, содержащую нуклеотидную последовательность, соответствующую доменам тримеризации и эндостатину (ES) указанных доменов NC1, и нуклеотидную последовательность, кодирующую шарнирные пептиды указанных доменов NC1.
21. Экспрессирующая кассета по п.15, содержащая, в дополнение к указанным последовательностям нуклеиновых кислот (А) и (В), третью последовательность нуклеиновой кислоты (С), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую гибкий связующий белок, где 5'-конец указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты (С) связан с 3'-концом указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты (А).
22. Экспрессирующая кассета по п.15, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты (А) содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) антитела, которое распознает ламинин, и указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты (В) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен NC1 коллагена XVIII млекопитающих, содержащую нуклеотидную последовательность, соответствующую домену тримеризации и эндостатину (ES) указанного домена NC1.
23. Экспрессирующий вектор, содержащий экспрессирующую кассету по любому из пп.15-22.
24. Клетка-хозяин, применяемая для продуцирования олигомерного белка по любому из пп.1-8, содержащая экспрессирующую кассету по любому из пп.15-22 или вектор по п.23.
25. Способ получения олигомерного белка по любому из пп.1-8, включающий выращивание клетки, где указанная клетка содержит экспрессирующую кассету по любому из пп.15-22 или вектор по п.23, в условиях, которые обеспечивают продукцию указанного олигомерного белка, и, если это необходимо, выделение и очистку указанного олигомерного белка.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ESP200402635 | 2004-11-02 | ||
ES200402635A ES2325344B1 (es) | 2004-11-02 | 2004-11-02 | Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007120521A RU2007120521A (ru) | 2008-12-10 |
RU2398878C2 true RU2398878C2 (ru) | 2010-09-10 |
Family
ID=35592070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007120521/13A RU2398878C2 (ru) | 2004-11-02 | 2005-10-31 | Многофункциональные и поливалентные ингибиторы ангиогенеза |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070253952A1 (ru) |
EP (1) | EP1814993B1 (ru) |
JP (1) | JP2008527974A (ru) |
CN (1) | CN101065486B (ru) |
AT (1) | ATE454454T1 (ru) |
AU (1) | AU2005300737B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0517928A (ru) |
CA (1) | CA2585282A1 (ru) |
DE (1) | DE602005018812D1 (ru) |
ES (2) | ES2325344B1 (ru) |
PT (1) | PT1814993E (ru) |
RU (1) | RU2398878C2 (ru) |
WO (1) | WO2006048252A1 (ru) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8580755B2 (en) * | 2008-02-19 | 2013-11-12 | University Of Rochester | Methods and compositions for treating inflammatory conditions |
TW201012473A (en) * | 2008-09-22 | 2010-04-01 | Tty Biopharm Co Ltd | Composition of inhibiting pathological angiogenesis |
WO2010122181A1 (es) * | 2009-04-20 | 2010-10-28 | Universidad Autónoma de Madrid | Proteínas oligoméricas y sus aplicaciones |
US9503931B2 (en) | 2009-08-12 | 2016-11-22 | Qualcomm Incorporated | Enhancements to the MU-MIMO VHT preamble to enable mode detection |
EP2515930A4 (en) * | 2009-12-21 | 2013-04-10 | Tty Biopharm Co Ltd | METHODS AND COMPOSITIONS BASED ON REDUCED MET PHOSPHORYLATION BY CHEMOTAXIN 2 DERIVED FROM LEUKOCYTE CELLS IN TUMOR CELLS |
EP2420253A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-22 | Leadartis, S.L. | Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain |
ES2701445T3 (es) * | 2010-10-15 | 2019-02-22 | Leadartis S L | Generación de complejos polipeptídicos multifuncionales y multivalentes mediante el dominio de trimerización del colágeno XVIII |
EP2441776A1 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-18 | Leadartis, S.L. | Generation of multifunctional and multivalent polypeptide complexes with collagen XVIII trimerization domain |
EP2561888A1 (en) * | 2011-08-23 | 2013-02-27 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases |
WO2017001990A1 (en) * | 2015-06-28 | 2017-01-05 | Allgenesis Biotherapeutics Inc. | Fusion proteins for inhibiting angiogenesis |
KR20230020443A (ko) | 2020-06-05 | 2023-02-10 | 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 | 4-1bb 표적화 다량체 면역조절제 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2313251A1 (en) * | 1997-12-08 | 1999-06-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Mutants of endostatin, "em 1" having anti-angiogenic activity and methods of use thereof |
PL202057B1 (pl) * | 1998-08-25 | 2009-05-29 | Merck Patent Gmbh | Homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, sposób jego otrzymywania oraz cząsteczka DNA i wektor ekspresyjny zawierający to DNA |
DE19900743A1 (de) * | 1999-01-12 | 2000-07-13 | Aventis Pharma Gmbh | Neue komplexbildende Proteine |
NZ514918A (en) * | 1999-04-28 | 2003-11-28 | Univ Texas | Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting VEGF |
KR20040089608A (ko) * | 2002-02-07 | 2004-10-21 | 델타 바이오테크놀로지 리미티드 | Hiv 억제 단백질 |
US7538088B2 (en) * | 2002-04-26 | 2009-05-26 | California Institute Of Technology | Method for inhibiting angiogenesis by administration of the extracellular domain of D1-1 polypeptide |
JP2005537032A (ja) * | 2002-08-27 | 2005-12-08 | コンパウンド セラピューティクス インコーポレーティッド | アドザイムおよびその用途 |
US20050008649A1 (en) * | 2003-06-02 | 2005-01-13 | University Of Miami | Chimeric molecules and methods of use |
PT1819359E (pt) * | 2004-12-09 | 2015-05-28 | Janssen Biotech Inc | Imunoconjugados anti-integrina, métodos para a sua produção e sua utilização |
-
2004
- 2004-11-02 ES ES200402635A patent/ES2325344B1/es active Active
-
2005
- 2005-10-31 US US11/718,390 patent/US20070253952A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-31 AU AU2005300737A patent/AU2005300737B2/en not_active Ceased
- 2005-10-31 WO PCT/EP2005/011714 patent/WO2006048252A1/en active Application Filing
- 2005-10-31 DE DE602005018812T patent/DE602005018812D1/de active Active
- 2005-10-31 EP EP05806365A patent/EP1814993B1/en active Active
- 2005-10-31 CA CA002585282A patent/CA2585282A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-31 ES ES05806365T patent/ES2339366T3/es active Active
- 2005-10-31 AT AT05806365T patent/ATE454454T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-10-31 CN CN2005800381233A patent/CN101065486B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-10-31 PT PT05806365T patent/PT1814993E/pt unknown
- 2005-10-31 BR BRPI0517928-9A patent/BRPI0517928A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-10-31 RU RU2007120521/13A patent/RU2398878C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-10-31 JP JP2007539527A patent/JP2008527974A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008527974A (ja) | 2008-07-31 |
WO2006048252A1 (en) | 2006-05-11 |
ES2339366T3 (es) | 2010-05-19 |
US20070253952A1 (en) | 2007-11-01 |
AU2005300737B2 (en) | 2011-05-19 |
EP1814993B1 (en) | 2010-01-06 |
DE602005018812D1 (de) | 2010-02-25 |
PT1814993E (pt) | 2010-04-12 |
ES2325344A1 (es) | 2009-09-01 |
ATE454454T1 (de) | 2010-01-15 |
BRPI0517928A (pt) | 2008-10-21 |
AU2005300737A1 (en) | 2006-05-11 |
CA2585282A1 (en) | 2006-05-11 |
CN101065486B (zh) | 2011-08-31 |
ES2325344B1 (es) | 2010-06-09 |
RU2007120521A (ru) | 2008-12-10 |
EP1814993A1 (en) | 2007-08-08 |
CN101065486A (zh) | 2007-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2398878C2 (ru) | Многофункциональные и поливалентные ингибиторы ангиогенеза | |
KR101658247B1 (ko) | 모듈 인식 도메인을 통한 항체 표적화 | |
KR20220075238A (ko) | 인간 히알루로니다제 ph20의 변이체와 약물을 포함하는 피하투여용 약학 조성물 | |
JP2003523768A (ja) | インテグリンアンタゴニスト | |
EP1300419B1 (en) | Antibody of human origin for inhibiting thrombocyte aggregation | |
JP2009515521A (ja) | レセプターアイソフォームおよびリガンドアイソフォームの産生のための方法 | |
CA2354456A1 (en) | Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof | |
AU2001247219A1 (en) | Integrin antagonists | |
IE62855B1 (en) | Novel polypeptides for promoting cell attachment | |
JP6227601B2 (ja) | 好中球活性化に起因する疾患の治療薬及び検査方法 | |
BG107613A (bg) | Фузионен протеин от инхибитор на антитяло-цитокин-цитокин като продрога със специфична мишена | |
AU634733B2 (en) | Tgf-beta 1/beta 2: a novel chimeric transforming growth factor-beta | |
CN101155916A (zh) | 作为血栓溶解剂的靶向性纤溶酶原激活物融合蛋白 | |
WO2000067771A1 (en) | Antiangiogenic endostatin peptides, endostatin variants and methods of use | |
US20040053368A1 (en) | Collagen-binding hybrid polypeptide | |
JP2009536821A (ja) | 新規血栓溶解分子及びその製造法 | |
KR100568755B1 (ko) | Yh 모티프를 포함하는 펩타이드를 유효성분으로함유하는 혈관신생 억제제 | |
MX2007005228A (en) | Multifunctional and multivalent angiogenesis inhibitors | |
KR100612673B1 (ko) | 세포도입성 보톡신 융합단백질 | |
EP2275437A1 (en) | Polypeptide and pharmaceutical composition containing the polypeptide | |
JP2002060400A (ja) | コラーゲン結合活性および血管新生調節活性を有するハイブリッドポリペプチド | |
CN110066340A (zh) | 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151101 |