PT1814993E - Inibidores de angiogénese multifuncionais e multivalentes - Google Patents
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Description
7899
DESCRIÇÃO
INIBIDORES DE ANGIOGÉNESE MULTIFUNCIONAIS E MULTIVALENTES A invenção está relacionada com proteínas de fusão úteis como inibidores de angiogénese multifuncionais e multivalentes que compreendem um polipéptido que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, e um polipéptido que compreende um domínio de oligomerização e uma região de inibidor ou modulador funcionalmente activo, do processo de angiogénese, separadas por uma região sensível à proteinase. A invenção também está relacionada com construções de gene e vector úteis para produzir as referidas proteínas de fusão.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A angiogénese é o processo biológico que conduz à formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos pré-existentes num órgão ou tecido. A angiogénese começa com a decomposição da membrana basal devido à acção das proteinases secretadas pelas células endoteliais, continua com a migração e proliferação das referidas células endoteliais, para concluir com a formação do lúmen, a membrana basal e o envolvimento com células periféricas. A angiogénese não existe em condições fisiológicas normais num adulto saudável, com excepção dos fenómenos associados ao ciclo menstrual feminino e à cicatrização de feridas. Contudo, um desequilíbrio no processo de angiogénese contribui para o desenvolvimento de distúrbios patológicos, tais como artrite reumatóide, psoríase, bartonelose, rejeição 7899 do órgão transplantado, neovascularização hemorrágica e ocular (um dos casos mais frequentes de cegueira), retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, degeneração macular, glaucoma neovascular, oclusão da veia retinal, oclusão da artéria retinal, pterigio, rubeose, neovasculatura da córnea, tumores sólidos, hemangioma e proliferação e metástase tumoral, entre outros. A angiogénese desempenha ainda um papel importante no crescimento progressivo e na disseminação metastática de tumores. Um tumor deve estimular continuamente o desenvolvimento de novos capilares de modo a ser capaz de crescer. Os novos vasos criados no tumor proporcionam células malignas com uma via através da qual eles podem entrar na circulação e formar metástase em sítios distantes. Se esta actividade angiogénica puder ser suprimida ou eliminada, mesmo se o tumor estiver presente, não se pode desenvolver.
Por esta razão, diferentes grupos de investigação estão a trabalhar para encontrar compostos que exercem uma acção inibidora sobre a angiogénese (inibidores de angiogénese ou agentes antiangiogénicos) úteis como agentes terapêuticos para tratar ou prevenir as patologias que ocorrem com o desenvolvimento da angiogénese.
Em relação aos tumores, é aceite que os tumores não podem crescer ou metastatizar para outro órgão sem a génese de novos vasos sanguíneos, constituindo assim a mudança angiogénica uma evento precoce na progressão tumoral. Foram descritas várias estratégias anti-angiogénicas que interferem a diferentes níveis da via angiogénica: bloqueamento da actividade do factor de crescimento; inibição das proteinases 2 7899 da matriz extracelular (ECM); indução directa às células endoteliais (EC); regular excessivamente os inibidores endógenos, etc. Os inibidores endógenos da angiogénese receberam atenção especial na terapia do cancro na medida em que parecem ser agentes não tóxicos e não imunogénicos. Foram identificados pelo menos 10 inibidores de angiogénese endógenos [0'Reilly, M.S. et al., Cell, 88: 277-285, 1997], dos quais os mais bem conhecidos são a angiostatina e a endostatina.
As endostatinas (ES) são inibidores da migração de células endoteliais e de angiogénese, e foi demonstrado que elas reduzem o crescimento tumoral em modelos animais. Os mecanismos envolvidos nos referidos efeitos não são claros, embora tenha sido proposto que estejam envolvidas na ligação ao receptor da superfície celular (sulfatos de integrinas e heparano, VEGFR-2), metaloproteinases e componentes de ECM. As ES derivam do domínio de NCI dos colagénios XV e XVIII, a partir dos quais são libertadas proteoliticamente na forma trimérica e elas são ainda convertidas em endostatinas monoméricas de cerca de 20 kDa. Na extremidade N-terminal de NCI, existe um domínio de trimerização de cerca 60 resíduos ligados ao módulo ES de 180 resíduos aproximadamente, por meio de uma região da dobra flexível contendo diferentes sítios sensíveis à proteinase que libertam endostatina após a clivagem proteolítica.
Boehm et al. [Nature, 390:404 (1997)] descrevem a utilização de, como um modelo experimental, murganhos em que vários tumores (carcinoma pulmonar de Lewis, fibrossarcoma e melanoma) foram transplantados. Nos murganhos não tratados com ES, os referidos tumores cresceram rapidamente, 3 7899 provocando a morte do animal. Em contraste, nos murganhos tratados com ES após o desenvolvimento do tumor, foi observada uma redução do volume tumoral até atingir um tamanho quase microscópico. 0 tratamento cíclico com ES de murganhos que possuem um tumor provocou uma regressão completa dos tumores em modelos animais. Contudo, os ensaios clínicos que são realizados com ES não reportaram uma inibição do crescimento tumoral significativa e a regressão tumoral foi raramente observada. Infelizmente, este não é um exemplo isolado e outros ensaios clínicos que incluem moléculas antiangiogénicas diferentes são também decepcionantes, apesar de quão significativos terem sido os efeitos antitumorais em modelos animais. Neste contexto, parece lógico para combinar vários inibidores de angiogénese para tratar os cancros humanos. Alternativamente, a actividade biológica aumentada (ES + angiostatina) e a acção dirigida ao tumor [ES + RGD (arginina-glicina-ácido aspártico)] pode melhorar potencialmente a inibição do crescimento tumoral.
Por outro lado, o potencial terapêutico de um fragmento de cadeia simples Fv (scFv) de um anticorpo anti-laminina (L36) com actividade antiangiogénica foi demonstrado tanto in vivo como in vitro. Os resultados demonstraram que a alteração do potencial morfogenético das matrizes associadas às células é um modo eficaz de prevenir in vivo a formação de vasos sanguíneos associados ao tumor.
Apesar dos esforços produzidos até agora, é ainda necessário desenvolver compostos inibidores de angiogénese úteis como agentes terapêuticos para tratar ou prevenir as patologias que ocorrem com o desenvolvimento da angiogénese. 4 7899
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção enfrenta o problema de proporcionar compostos com actividade antiangiogénica potencialmente úteis como agentes terapêuticos para prevenir e/ou tratar patologias que ocorrem com angiogénese, por exemplo psoríase, artrite reumatóide, retinopatias, cancro, etc. A solução proporcionada por esta invenção é baseada nas proteínas de fusão, potencialmente úteis como inibidores de angiogénese multifuncionais e multivalentes, que compreendem (a) um polipéptido que compreendem uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, e (b) um polipéptido que compreende um domínio de oligomerização e um inibidor funcionalmente activo, ou região moduladora no processo de angiogénese, separado por uma região sensível à proteinase. A invenção é ilustrada por meio da construção de várias quimeras proteináceas. Uma das proteínas de fusão (ver o Exemplo) compreende o fragmento de cadeia simples Fv (scFv) do anticorpo monoclonal anti-laminina L36 e o domínio NC1 do colagénio XVIII que compreendem um domínio de trimerização e um domínio de endostatina (ES) ligado por um péptido de dobra contendo sítios sensíveis à ES monomérica que liberta a proteinase após clivagem proteolítica. Os níveis de proteinase são aumentados nas micro-vizinhanças tumorais, por isso a referida proteína de fusão liberta in situ tanto monómeros de ES como trímeros scFv. A referida proteína de fusão foi secretada por células humanas geneticamente modificadas numa forma funcionalmente activa. A forma intacta possui uma massa molecular de aproximadamente 210 kDa, que 5 7899 indica que, em condições fisiológicas, as unidades individuais estão covalentemente associadas de um modo não covalente para produzir uma estrutura trimérica. A referida proteína de fusão trimérica inibiu consideravelmente a capacidade das células endoteliais para migrarem em resposta a factores de crescimento e para se tornarem desenvolvidas em túbulos de tipo capilar quando eles crescem em substratos de Matrigel. A referida proteína de fusão foi igualmente tratada com várias proteinases diferentes. Os resultados demonstram que a catepsina L, elastase pancreática e várias metaloproteinases de matriz (MMP) criam ambos monómeros de tipo ES e fragmento de anticorpo trimérico (scFv). As proteínas de fusão foram ainda processadas correctamente quando foram produzidas através de células tumorais geneticamente modificadas que produzem MMP, mas não quando foram produzidas por células geneticamente modificadas que não produzem MMPs. Estes resultados abrem o caminho para uma nova estratégia de terapia genética contra o cancro utilizando este tipo de proteínas de fusão, que formam parte de uma nova geração de inibidores de angiogénese úteis como agentes terapêuticos para tratar doenças associadas a desequilíbrios na referida angiogénese.
Por isso, num aspecto a invenção refere-se a uma construção genética que compreende, ligada operacionalmente, pelo menos uma sequência de ácido nucleico (A) , que compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e uma sequência de ácido nucleico (B) que compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende (i) um domínio de oligomerização, 6 7899 (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese, em gue a referida extremidade 3' da referida primeira sequência de ácido nucleico (A) está ligada à extremidade 5' da referida segunda sequência de ácido nucleico (B).
Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma cassete de expressão que compreende a referida construção genética, ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão.
Noutro aspecto, a invenção refere-se a um vector recombinante que compreende a referida construção genética ou a referida cassete de expressão.
Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende a referida construção genética, ou a referida cassete de expressão, ou o referido vector recombinante.
Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma proteína de fusão que se pode obter através da expressão da sequência de ácido nucleico contida na referida construção genética. A referida proteína de fusão compreende tipicamente um polipéptido {A' ) que compreende uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e um polipéptido (B') que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido 7 7899 domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese.
Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende quer a referida proteína de fusão juntamente com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, ou um vector que compreende uma construção genética da invenção, ou uma cassete de expressão da invenção, e opcionalmente, pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização da referida proteína de fusão, ou da referida construção genética ou da referida cassete de expressão ou do referido vector recombinante, no fabrico de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar, impedir ou minimizar o desenvolvimento da angiogénese.
Noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização da referida proteína de fusão ou da referida construção genética ou da referida cassete de expressão ou do referido vector recombinante no fabrico de uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir patologias que ocorrem com angiogénese.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - é uma representação cartográfica apresentando o efeito na morfogénese capilar do tratamento individual e tratamento combinado com diferentes concentrações de um anticorpo monoclonal recombinante (L36) com formato scFv [fragmento de cadeia simples Fv do anticorpo monoclonal anti-laminina L36] e de uma proteína de fusão 8 7899 dimérica Fc-ES (proteína de fusão entre o domínio ES e o fragmento Fc de uma imunoglobulina).
Figura 2 - ilustra a produção de uma proteína de fusão proporcionada por esta invenção e o seu processamento proteolítico.
Figura 2A apresenta esquematicamente o gene al (colagénio XVIII) e o domínio NC1 que codifica a sequência. Figura 2B apresenta esquematicamente o referido domínio NC1 que compreende um péptido conector, o domínio de trimerização, o péptido da dobra e o domínio ES .
Figura 2C - apresenta esquematicamente uma proteína de fusão ou quimera formada por um anticorpo monoclonal recombinante anti-laminina (L36) com formato scFv e o domínio NC1 do colagénio XVIII.
Figura 2D - apresenta o resultado do processamento proteolítico da referida proteína de fusão, é observada a formação de um anticorpo de ES trimérico e monomérico.
Figura 3A - apresenta esquematicamente a estrutura genética de um anticorpo, em formato scFv e várias construções genéticas contendo (ou não) a sequência que codifica o domínio ES.
Figura 3B - apresenta os resultados de uma análise de transferência de Western de proteínas de fusão 9 7899 purificadas; a transferência imunológica foi desenvolvida com um anticorpo monoclonal (mAb) anti-myc e/ou com um mAb anti-ES [pista 1: L36 scFv, pista 2: L36 scFv-NClES~, pista 3: L36 scFv-NClES+, pista 4: NC1 e pista 5: ES].
Figura 4A - apresenta um gradiente de equilíbrio de sedimentação do domínio scFv-NClES (1 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) a 11 000 rpm e 20°C. Os círculos a branco representam resultados, as três linhas a cheio representam os gradientes teóricos de um monómero de scFv (37 148 Da), dímero (74 296 Da) e trímero (111 444 Da). É apresentada na caixa superior da referida Figura 4A, a distribuição da taxa de sedimentação da proteína de fusão L36 scFv-NC1es~ (1 mg/mL em tampão PBS) a 42 000 rpm e 20°C.
Figura 4B - é um gráfico apresentando a afinidade de ligação a laminina imobilizada num suporte de plástico [superior no caso da proteína de fusão L36 scFv-NClES~ (trimérico) do que no caso de L36 scFv (monomérico)].
Figura 4C - é um gráfico apresentando a modulação dependente da dose da diferenciação das células endoteliais (em resposta a diferentes concentrações de scFv ou L36 scFv-NClES_) num ensaio de Matrigel típico. Cada ponto representa a média de dois poços +/- desvio padrão.
Figura 4D - apresenta os resultados de sujeitar a proteína de fusão L36 scFv- NC1ES~ à acção de diferentes 10 7899 proteinases (MMPs, elastase pancreática porcina e catepsina L).
Figura 5 - apresenta a distribuição da taxa de sedimentação de L36 scFv-NClES+ (Figura 5A) e NC1 (Figura 5B) .
Figura 5C - apresenta as curvas de saturação obtida com as concentrações indicadas de L36 scFv-NClES+ e NC1.
Figura 5D - é um gráfico representando a modulação dependente da dose da diferenciação das células endoteliais (em resposta a diferentes concentrações de L36 scFv, L36 scFv-NC1Ees+, NC1 ou Fc-ES) num ensaio típico de Matrigel. Cada ponto representa a média de dois poços +/- o desvio padrão.
Figura 5E - é um diagrama de barras que apresenta a modulação num ensaio de células endoteliais HUVEC através de L36 scFv (L36) , NC1, L36 scFv-NClES+ ou Fc-ES (ES) [foi utilizado PBS como um controlo].
Figura 6A - apresenta o resultado de tratar L36 scFv-NC1es+ com diferentes proteinases (MMPs, elastase pancreática porcina e catepsina L), enquanto que a
Figura 6B - apresenta os resultados do mesmo tratamento para NC1. As proteínas purificadas foram incubadas durante os tempos indicados com as diferentes proteinases como mencionado no Exemplo (ver a secção de Materiais e Métodos) e as misturas de reacção foram analisadas por meio de SDS-PAGE (Figura 6C) ou por meio 11 7899 de Transferência de Western com e mAb anti-endostatina. As distâncias de migração do peso molecular e marcadores NC1 estão indicadas para a esquerda das referidas figuras. A seta a branco que aponta nas Figuras 6A e 6B indica os produtos proteolíticos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Num aspecto, a invenção está relacionada com a construção genética, de aqui em diante designada construção genética da invenção, que compreende, ligada operacionalmente, pelo menos: a) uma primeira sequência de ácido nucleico (A) , que compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que reconhece e bloqueia a região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e b) uma segunda sequência de ácido nucleico (B) , que compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese, em que a extremidade 3' da referida primeira sequência de ácido nucleico (A) está ligada à extremidade 5' da referida segunda sequência de ácido nucleico (B). 12 7899 A sequência de ácido nucleico (A) compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese. Exemplos ilustrativos de moléculas envolvidas no processo de angiogénese incluem proteínas da matriz extracelular (ECM), factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc. Estão incluídas entre as proteínas de ECM colagénio, proteoglicanos, fibronectina, laminina, tenascina, entactina e trombospondina. Numa forma de realização particular, a referida molécula envolvida no processo de angiogénese é uma laminina, tal como uma laminina de mamífero, por exemplo uma laminina de rato, murganho ou humano. Incluídos entre os factores angiogénicos estão a família de factores de crescimento endotelial vascular (VEGF), etc. Os receptores dos referidos factores angiogénicos, por exemplo o receptor 2 de VEGF (VEGFR-2), integrinas, etc., pode igualmente ser citado entre os receptores de membrana celular envolvidos na angiogénese.
Virtualmente qualquer polipéptido que compreenda uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese pode ser utilizado nesta invenção, tal como um anticorpo, por exemplo um anticorpo monoclonal ou policlonal, que reconhece uma molécula envolvida no processo de angiogénese, ou um seu fragmento recombinante contendo a região que reconhece a referida molécula envolvida no processo de angiogénese, por exemplo, no seu formato de cadeia simples recombinante (fragmento de cadeia simples Fv ou scFv), bifuncional (diacorpo) , total (Fab + Fc) , etc.; todavia, numa forma de realização particular, a sequência de ácido nucleico (A) 13 7899 codifica para um anticorpo de cadeia simples recombinante (scFv) derivado do mAb anti-laminina L36 (Exemplo 1) contendo a região de cadeia pesada variável (VH) do anticorpo monoclonal L36 fundido, através de um ligante, tal como um péptido que compreende a sequência G4S, à região da cadeia leve variável (VL) do mAb L36 (Figura 2C), cuja sequência foi descrita por Sanz L et al. [Câncer Immunology and Iimnunotherapy, 2001 Dec; 50(10) 557-65], em que a extremidade 3' da sequência que codifica VL está ligada à extremidade 5' da sequência que codifica o referido ligando e a extremidade 3' da sequência de nucleótidos que codifica o referidos ligando está ligada à extremidade 5' da sequência que codifica o VL. 0 mAb L36 reconhece lamininas de diferentes espécies animais, por exemplo, de murganhos, ratos, humanos, etc., uma vez que interage com uma região que é muito preservada ente diferentes espécies animais [Sanz L et al. EMBO J 2003, Vol. 22 (7) : 1508-1517] .
Devido às suas propriedades, o referido polipéptido que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, tal como um anticorpo, em qualquer um dos seus formatos (scFv, bifuncional ou completo) pode reconhecer e bloquear uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, e pode dirigir um polipéptido antiangiogénico fundido com o referido polipéptido às moléculas envolvidas no processo de angiogénese, por exemplo, proteínas ECM, factores angiogénicos, receptores de membranas celulares, etc., e bloquear regiões funcionalmente activas das referidas moléculas. 14 7899 A sequência de ácido nucleico (B) compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização (i) e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese (ii) . 0 domínio de oligomerização é um domínio que permite a formação de oligómero (e.g., dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc., de péptidos ou proteínas). Virtualmente qualquer domínio de oligomerização, por exemplo um domínio de dimerização, trimerização, ou tetramerização, etc. presente em diferentes proteínas, tanto eucarióticas como procarióticas de origem, capazes de serem expressas de forma recombinante e formando um oligómero proteináceo da proteína que o compreende, podem ser utilizadas para colocar a invenção em prática. Numa forma de realização particular, o referido domínio de oligomerização é um domínio de trimerização, tal como o domínio de trimerização do domínio NC1 do colagénio XVIII ou colagénio XV. A região funcionalmente activa no processo de angiogénese compreende qualquer péptido funcionalmente activo ou proteína no processo de angiogénese, tal como um péptido ou proteína inibidor ou modulador do processo de angiogénese. Virtualmente qualquer péptido ou proteína funcionalmente activo no processo de angiogénese pode ser utilizado na presente invenção; todavia, numa forma de realização particular, a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese compreende uma endostatina de 15 7899 mamífero (ES) , tal como a ES presente no domínio NC1 do colagénio XV ou colagénio XVIII. A região sensível à proteinase está localizada entre o referido domínio de oligomerização (i) e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese (ii), e compreende uma sequência polipeptídica susceptível à acção de proteinases. Embora qualquer sequência peptídica susceptível a qualquer proteinase possa ser utilizada na invenção, na prática é vantajoso para a referida proteinase ser uma proteinase expressa apenas na vizinhança tumoral, de modo a que a proteína de fusão da invenção seja "processada", criando monómeros de péptido ou proteína funcionalmente activa no processo de angiogénese e moléculas triméricas de polipéptido capazes de reconhecer e bloqueando uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese. Por isso, numa forma de realização particular, a referida região sensível à proteinase compreende a região da dobra presente no domínio NC1 de colagénio XV ou XVIII de mamífero, entre o domínio de trimerização e o domínio ES ou região do referido domínio NC1, uma vez que a referida região é sensível à acção das proteinases expressas apenas na vizinhança do tumor.
Por isso, numa forma de realização particular e preferida, a sequência de ácido nucleico (B) compreende a sequência de nucleótidos que codifica o domínio NC1 do colagénio XVIII de mamífero, ou para o domínio NC1 de colagénio XV de mamífero. Como é conhecido, o referido domínio NC1 do colagénio XVIII (e do colagénio XV) compreende um domínio de trimerização e um domínio ES ligado por um péptido da dobra (Figura 2B) . As sequências dos referidos 16 7899 domínio NC1 do colagénio XV e XVIII são conhecidas; a título de ilustração, a sequência do domínio NC1 do colagénio XVIII foi revelada anteriormente por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3; 17 (15) :4249-56] . 0 Exemplo 1 descreve a obtenção da sequência de nucleótidos que compreende a região que codifica o domínio NC1 de colagénio XVIII de murganho.
Qualquer outro domínio semelhante ao domínio NC1 do colagénio XVIII que compreende (i) um domínio de oligomerização, (i i) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese, vantajosamente, uma região sensível à proteinases expressa na vizinhança do tumor, pode ser utilizada para colocar esta invenção em prática.
Geralmente, a sequência de ácido nucleico (A) não está fundida directamente com a sequência de ácido nucleico (B) , mas é vantajoso introduzir um péptido de ligação flexível (ou péptido espaçador) entre os polipéptidos codificados pelas referidas sequências de ácido nucleico (A) e (B) . Por isso, se desejado, a construção genética da invenção pode também conter adicionalmente uma terceira sequência de ácido nucleico (C) contendo a sequência de nucleótidos que codifica um péptido de ligação flexível localizado entre as referidas sequências de ácido nucleico (A) e (B) , em que a extremidade 5' da referida sequência de ácido nucleico (C) está ligada à extremidade 3' da referida sequência de ácido nucleico (A) e 17 7899 a extremidade 3' da referida sequência de ácido nucleico (C) está ligada à extremidade 5' da referida sequência de ácido nucleico (B) . Vantajosamente, o referido péptido espaçador (C) é um péptido com flexibilidade estrutural. Virtualmente, pode ser utilizado qualquer péptido com flexibilidade estrutural. A título de ilustração, o referido péptido flexível pode conter repetições de resíduos de aminoácidos, particularmente resíduos Gly e Ser, ou qualquer outra repetição adequada de resíduos de aminoácidos. Virtualmente, pode ser utilizada nesta invenção qualquer sequência peptídica definindo um péptido de ligação flexível. Exemplos ilustrativos de proteínas de ligação flexível incluem sequências tais como Gly-Ser-Pro-Gly (GSPG) ou sequência (Gly-Ser)4. Todavia, numa forma de realização particular a referida proteína de ligação flexível compreende a sequência Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. Por isso, numa forma de realização particular, a construção genética da invenção compreende, adicionalmente às referidas sequências de ácido nucleico (A) e (B) , uma terceira sequência de ácido nucleico (C) que compreende a sequência de nucleótidos que codifica o péptido Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
Também, com o objectivo de facilitar o isolamento e a purificação da proteína de fusão obtida por meio da presente invenção, a construção genética da invenção pode conter, se assim for desejado, uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido capaz de ser utilizado para os objectivos de isolamento ou purificação de proteína de fusão. Por isso, numa forma de realização particular a construção genética da invenção inclui, se assim desejado, uma sequência de ácido 18 7899 nucleico (D) contendo a sequência de nucleótidos que codifica um péptido capaz de ser utilizada para os objectivos de isolamento ou purificação, conhecida como um péptido "tag". A referida sequência de ácido nucleico (D) pode estar localizada em qualquer posição que não altera a funcionalidade de qualquer um dos polipéptidos expressos pelas referidas sequências de ácido nucleico (A) e (B) . A titulo de ilustração, a referida sequência de ácido nucleico (D) pode estar localizada a jusante da extremidade 3' da referida sequência de ácido nucleico (B). Virtualmente, qualquer péptido ou sequência peptídica que permite o isolamento ou purificação da proteína de fusão pode ser utilizado, por exemplo, sequências de poli-histidina, sequências de péptido capazes de serem reconhecidas pelos anticorpos que podem ser utilizadas para purificar a proteína de fusão resultante por cromatografia de afinidade, tal como péptidos "tag", etc., por exemplo epitopos derivados a partir da hemaglutinina do vírus da peste ou epitopo C-myc, etc. A construção genética da invenção pode ser obtida por meio da utilização de técnicas bem conhecidas no estado da arte [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. A referida construção genética da invenção pode incorporar, ligada operacionalmente, uma sequência reguladora da expressão das sequências de ácido nucleico que codificam polipéptidos codificados pelas sequências de ácido nucleico (A) e (B), constituindo desse modo uma cassete de expressão. Como utilizado nesta descrição, a expressão "ligado operacionalmente" significa que os polipéptidos codificados pelas sequências de ácido nucleico (A) e (B) , e, quando apropriado (C) , são expressos na grelha de leitura 19 7899 aberta correcta sob o controlo de sequências do controlo de expressão ou sequências de regulação.
Por isso, noutro aspecto, a invenção proporciona uma cassete de expressão que compreende a construção genética da invenção ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão da sequência de nucleótidos que codifica a proteína de fusão proporcionada por esta invenção, que compreende (a) um polipéptido que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, e (b) um polipéptido que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese. As sequências de controlo são sequências que controlam e regulam a transcrição e, quando apropriado, a tradução da referida proteína de fusão, e incluem sequências de promotor, sequências que codificam reguladores de transcrição, sequências de ligação ao ribossoma (RBS) e/ou sequências de terminador de transcrição. Numa forma de realização particular, a referida sequência de controlo de expressão é funcional em células e organismos procarióticos, por exemplo bactérias, etc., enquanto que numa outra forma de realização particular, a referida sequência de controlo de expressão é funcional em células e organismos eucarióticos, por exemplo, células de insectos, células vegetais, células de mamíferos, etc. Exemplos ilustrativos de promotores que podem estar presentes na cassete de expressão proporcionada por esta invenção incluem o promotor do citomagalovírus humano (hCMV), etc. 20 7899
Vantajosamente, a referida cassete de expressão compreende ainda um marcador ou gene que codifica um motivo ou um fenótipo que permite a selecção da célula hospedeira transformada com a referida cassete de expressão. Exemplos ilustrativos dos referidos marcadores que podem estar presentes na cassete de expressão da invenção incluem genes resistentes a antibióticos, genes resistentes a compostos tóxicos, e de um modo geral todos aqueles genes que permitem seleccionar as plantas geneticamente transformadas. A construção genética da invenção, ou a cassete de expressão proporcionada por esta invenção pode ser inserida num vector adequado. Por isso, noutro aspecto, a invenção está relacionada com um vector, tal como um vector de expressão, que compreendem a referida construção genética da invenção ou a referida cassete de expressão. A selecção do vector irá depender da célula hospedeira na qual será subsequentemente introduzido. A titulo de ilustração, o vector no qual a referida sequência de ácido nucleico é introduzida pode ser um plasmideo ou um vector no qual, quando introduzido numa célula hospedeira, ou se torna integrado ou não no genoma da referida célula. 0 referido vector pode ser obtido através de métodos convencionais conhecidos das pessoas que são especialistas na arte [Sambrok et al., 1989, citado acima]. Numa forma de realização particular, o referido vector recombinante é um vector que é útil para transformar células animais. 0 referido vector pode ser utilizado para transformar, transfectar ou infectar células capazes de serem transformadas, transfectadas ou infectadas pelo referido vector. As referidas células podem ser células procarióticas 21 7899 ou eucarióticas. Por isso, noutro aspecto, a invenção está relacionada com uma célula hospedeira que tenha sido transformada, transfectada ou infectada com um vector proporcionado por esta invenção. A referida célula transformada, transfectada ou infectada compreende, por isso, uma construção genética da invenção, ou a referida cassete de expressão ou vector proporcionado por esta invenção. As células transformadas, transfectadas ou infectadas podem ser obtidas através de métodos convencionais conhecidos por pessoas especialistas na arte [Sambrok et al., 1989, citado acima]. Numa forma de realização particular, a referida célula hospedeira é uma célula animal que tenha sido transformada, transfectada ou infectada com um vector adequado, sendo a referida célula animal transformada, transfectada ou infectada capaz de expressar a proteína de fusão proporcionada por esta invenção, por isso os referidos vectores podem ser utilizados para expressar em células animais a proteina de fusão proporcionada por esta invenção. A construção genética da invenção pode ser utilizada para produzir proteínas de fusão que compreendem (a) um polipéptido (A' ) que compreende uma região que reconhece e bloqueia a região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e (b) um polipéptido (B') que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese.
Por isso, noutro aspecto, a invenção está relacionada com um método para produzir a referida proteína de fusão 22 7899 proporcionada por esta invenção, que compreende cultivar uma célula ou organismo proporcionado por esta invenção nas condições que permitem a produção da referida proteina de fusão. As condições para optimizar a cultura da referida célula ou organismo irão depender da célula ou organismo utilizado. Se assim desejado, o método para produzir um produto de interesse proporcionado por esta invenção inclui ainda o isolamento e purificação da referida proteina de fusão.
Noutro aspecto, a invenção está relacionada com uma proteina de fusão obtida pela expressão da sequência de ácido nucleico contida na construção genética da invenção. Mais especificamente, a invenção proporciona uma proteína de fusão que compreende: (a) um polipéptido (A' ) que compreende uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e (b) um polipéptido (B') que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese.
Exemplos ilustrativos de moléculas envolvidas no processo de angiogénese incluem proteínas ECM, factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc. Colagénio, proteoglicanos, fibronectina, laminina, tenascina, entactina e trombospondina estão entre as proteínas ECM. Numa forma de 23 7899 realização particular, a referida molécula envolvida no processo de angiogénese está uma laminina, tal como laminina de mamíferos, por exemplo laminina de rato, murganho ou humano.
Virtualmente, qualquer polipéptido que compreende uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese pode ser utilizado nesta invenção, tal como um anticorpo, por exemplo um anticorpo monoclonal, que reconhece uma molécula envolvida no processo de angiogénese, ou um seu fragmento recombinante que reconhece a referida molécula envolvida no processo angiogénico, por exemplo, um fragmento de cadeia simples Fv (scFv) de um anticorpo que reconhece a referida molécula envolvida no processo angiogénico ou um anticorpo bi-específico ou diacorpo que reconhece a referida molécula envolvida no processo angiogénico ou no seu formato recombinante completo (Fab + Fc) ; todavia, numa forma de realização particular, o referido polipéptido (A') compreende uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese é um scFv recombinante derivado de mAb anti-laminina L36 (Exemplo 1) contendo a região da cadeia pesada variável (VH) do anticorpo monoclonal L36 fundido, através de um ligante, tal como um péptido que compreende a sequência G4S, com a região da cadeia leve variável (VL) do mAb L36 (Figura 2C), e cuja sequência foi revelada por Sanz L et al. [Câncer Immunology and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557-65], em que a extremidade 3' da sequência que codifica a VL está ligada à extremidade 5' da sequência que codifica o referido ligante, e a extremidade 3' da sequência de nucleótidos que codifica o referido ligante está ligada à extremidade 5' da sequência 24 7899 que codifica a VL. Como é conhecido, o mAb L36 reconhece lamininas de diferentes espécies animais, por exemplo murganhos, ratos, humanos, etc., uma vez que interactua com uma região que está muito preservada entre diferentes espécies animais [Sanz L et al. EMBO J 2003, Vol. 22(7):1508-1517] . O referido polipéptido (A') pode reconhecer e bloquear uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, e pode dirigir um péptido antiangiogénico fundido com o referido polipéptido às moléculas envolvidas no processo de angiogénese, por exemplo, proteínas ECM, factores angiogénicos, receptores de membrana celular, etc., e bloquear regiões funcionalmente activas das referidas moléculas. O polipéptido (B') compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese. Como mencionado anteriormente, o referido domínio de oligomerização pode ser virtualmente qualquer domínio que permite a formação de oligómero, por exemplo dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc., de péptidos ou proteínas, capaz de ser expresso de forma recombinante e formando um oligómero proteináceo da proteína que o compreende. Todavia, numa forma de realização particular, o referido domínio de oligomerização é um domínio de trimerização, tal como o domínio de trimerização do domínio NC1 de colagénio XVIII ou colagénio XV de mamífero. 25 7899 A região funcionalmente activa no processo de angiogénese compreende qualquer péptido ou proteína funcionalmente activa no processo de angiogénese, tal como um péptido ou proteína inibidor ou modulador do processo de angiogénese. Virtualmente, qualquer péptido ou proteína funcionalmente activo no processo de angiogénese pode ser utilizado nesta invenção; todavia, numa forma de realização particular, a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese compreende uma endostatina de mamífero (ES) , tal como a ES presente no domínio NC1 do colagénio XV ou colagénio XVIII. A região sensível à proteinase está localizada entre o referido domínio de oligomerização (i) e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese (i i), e compreende uma sequência peptídica susceptível à acção de uma proteinase. Embora virtualmente qualquer sequência peptídica susceptível à acção de qualquer proteinase possa ser utilizada na presente invenção, a referida proteinase será vantajosamente uma proteinase expressa apenas na vizinhança do tumor, de modo a que a proteína de fusão da invenção será "processada", criando monómeros de péptidos ou proteínas funcionalmente activos no processo de angiogénese (e.g.r ES) e moléculas de polipéptido trimérico capazes de reconhecer e bloquear uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese (e.g., scFv). Por isso, numa forma de realização particular, a referida região sensível à proteinase compreende a região da dobra presente no domínio NC1 do colagénio XV ou XVIII de mamífero, entre o domínio de trimerização e a região ES ou domínio do referido domínio NC1, uma vez que a referida região é sensível à acção 26 7899 das proteinases que são expressas apenas na vizinhança do tumor.
Como é sabido, o referido domínio NC1 do colagénio XVIII (e colagénio XV) compreende um domínio de trimerização e um domínio ES ligados pelos péptidos da dobra (Figura 2B) . Por isso, numa forma de realização particular, a proteína de fusão da invenção compreende um polipéptido (B' ) que compreende o domínio NC1 do colagénio XV ou o domínio NC1 do colagénio XVIII contendo a timerização e os domínios ES dos referidos domínios NC1 ligados através dos péptidos da dobra dos referidos domínios NC1. As sequências dos referidos domínios NC1 do colagénio XV e colagénio XVIII são conhecidas; a título de ilustração, a sequência do domínio NC1 do colagénio XVIII foi previamente revelado por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3; 17 (15) :4249-56] .
Por isso, a título de ilustração, numa forma de realização particular a invenção proporciona uma proteína de fusão que compreende: (i) um polipéptido seleccionado a partir do grupo formado por mAbL36 total, mAbL36 em formato bifuncional e um scFv recombinante contendo a região variável da cadeia pesada (VH) do mAb L36 fundido, através de um péptido flexível, com a região variável da cadeia leve (VL) de mAb L36; e 27 7899 (ii) um polipéptido (B') que compreende o domínio NC1 de colagénio XVIII de mamífero.
Todavia, qualquer outro domínio semelhante ao domínio NC1 de colagénio XVIII que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese, vantajosamente, a região sensível à proteinase expressa na vizinhança do tumor, pode ser utilizada para colocar esta invenção em prática, para o objectivo de obter inibidores de angiogénese multifuncionais e multivalentes. A proteína de fusão proporcionada por esta invenção pode conter ainda, se assim for desejado, um terceiro polipéptido (C') que compreende a sequência de aminoácidos de um péptido de ligação flexível entre os referidos polipéptidos (A' ) e (B') e/ou (b) um péptido (D') para facilitar o isolamento e purificação da proteína de fusão.
Como mencionado anteriormente, o referido polipéptido (C') pode compreender virtualmente qualquer sequência peptídica que define um péptido de ligação flexível. Exemplos ilustrativos de péptidos de ligação flexível incluem sequências tais como Gly-Ser-Pro-Gly ou a sequência (Gly-Ser)4. Todavia, numa forma de realização particular, o referido péptido de ligação flexível compreende a sequência Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. 28 7899
Com o objectivo de facilitar o isolamento e purificação da proteína de fusão da invenção, a referida proteína de fusão pode conter igualmente, se assim for desejado, um péptido (D' ) capaz de ser utilizado para o objectivo de isolamento ou purificação da proteína de fusão, tal como um péptido "tag". 0 referido péptido (D') pode estar localizado em qualquer posição da proteína de fusão que não altera a funcionalidade de qualquer um dos polipéptidos (A') e (B'), por exemplo, o referido péptido (D' ) pode estar localizado após o polipéptido (B' ) . Virtualmente pode ser utilizado qualquer péptido ou sequência peptídica que permite o isolamento ou purificação da proteína de fusão, por exemplo sequências de poli-histidina, sequências peptídicas capazes de serem reconhecidos por anticorpos que podem ser úteis para purificar a proteína de fusão resultante por cromatografia de afinidade, tal como péptidos "tag", etc., por exemplo epitopos derivados da hemaglutinina do vírus da peste ou epitopo C-myc, etc. A proteína de fusão proporcionada por esta invenção compreende um polipéptido (A') que compreende uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e um polipéptido (B' ) que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) uma região funcionalmente activa no processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e a referida região funcionalmente activa no processo de angiogénese. Como um resultado desta fusão e devido à acção de certas proteinases expressas apenas na vizinhança do tumor, a proteína de fusão é "processada", criando monómeros de péptidos ou proteínas funcionalmente activos no processo 29 7899 de angiogénese (e.g., ES) e moléculas de polipéptido trimérico capazes de reconhecer e bloguear uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese (e.g., scFv). A invenção proporciona desse modo compostos inibidores de angiogénese multifuncionais e multivalentes, uma vez gue o processo de angiogénese é atacado por várias vias diferentes de um modo conjunto.
Consequentemente, devido às suas próprias caracteristicas, a proteína de fusão da invenção pode ser utilizada no tratamento e/ou prevenção do desenvolvimento do processo de angiogénese e, por isso, no tratamento e/ou prevenção de patologias que ocorrem com o processo de angiogénese.
Por isso, noutro aspecto, a invenção está relacionada com um composição farmacêutica que compreende quer uma proteína de fusão proporcionada por esta invenção juntamente com, pelo menos, um excipiente farmaceuticamente aceitável, ou um vector que compreende uma construção genética da invenção, ou uma cassete de expressão da invenção, e opcionalmente pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Numa forma de realização particular, a composição farmacêutica da invenção compreende pelo menos uma proteína de fusão proporcionada por esta invenção numa quantidade terapeuticamente eficaz. No sentido utilizado nesta descrição, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de proteína de fusão da invenção calculada para produzir o efeito desejado e será geralmente determinada, entre outras razões, a partir das próprias 30 7899 características da proteína de fusão e o efeito terapêutico a ser obtido.
Noutra forma de realização particular, a composição farmacêutica proporcionada por esta invenção é uma composição pretendida para a sua utilização em terapia genética que compreende um vector virai ou não virai proporcionado por esta invenção, que compreende uma construção genética da invenção ou uma cassete de expressão da invenção. A título de ilustração, os referidos vectores podem ser vectores virais, por exemplo, com base em retrovírus, adenovírus, etc., ou não virais, tais como complexos DNA-lipossoma, DNA-polímero, DNA-polímero-lipossoma, etc. [ver "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)]. Os referidos vectores, que contêm a construção genética da invenção ou a referida cassete de expressão podem ser administrados directamente ao corpo humano ou animal através de métodos convencionais. Os referidos vectores podem ser alternativamente utilizados para transformar, transfectar ou infectar células, por exemplo células de mamíferos, incluindo células humanas, ex vivo, e, subsequentemente implantá-las no corpo humano ou animal para obter o efeito terapêutico desejado. A composição farmacêutica proporcionada por esta invenção pode ser administrada através de qualquer método de administração adequado, por exemplo oralmente ou parentericamente. Os excipientes que podem ser utilizados no fabrico da composição farmacêutica proporcionada por esta invenção irão depender, entre outros factores, do método de administração da referida composição farmacêutica. Uma revisão dos diferentes métodos de administração do 31 7899 ingrediente activo, dos excipientes a serem utilizados e dos processos para os produzir pode ser encontrada no Tratado de Farmacia Galénica, C. Fauli i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.
Noutro aspecto, a invenção está igualmente relacionada com a utilização de uma proteína de fusão proporcionada por esta invenção, ou de uma construção genética da invenção ou uma cassete de expressão proporcionada por esta invenção ou um vector recombinante proporcionado por esta invenção, no fabrico de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar, impedir ou minimizar o desenvolvimento da angiogénese.
Noutro aspecto, a invenção está relacionada com a utilização de uma proteína de fusão proporcionada por esta invenção, ou de uma construção genética da invenção ou uma cassete de expressão proporcionada por esta invenção ou um vector recombinante proporcionado por esta invenção, no fabrico de uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir patologias que ocorrem com angiogénese. Exemplos ilustrativos, não limitantes de patologias que ocorrem com angiogénese incluem cancro, hemangioma, artrite reumatóide, psoríase, bartonelose, rejeição do órgão transplantado, hemorragia, neovascularização ocular (um dos casos mais frequentes de cegueira), retinopatias (retinopatias diabéticas ou precoces, etc.), degeneração macular, glaucoma neovascular, oclusão da veia retinal, oclusão da artéria retinal, pterígio, rubeose, ou neovascularização da córnea. Numa forma de realização particular, a proteína de fusão da invenção, a construção genética da invenção, a cassete de expressão proporcionada por esta invenção ou o vector recombinante proporcionado por esta invenção é 32 7899 particularmente útil para o tratamento de cancro, incluindo para tratar tumores sólidos, e proliferação do tumor e metástases. 0 exemplo seguinte pode ser utilizado par ilustrar a invenção e não deve ser considerado limitante do seu âmbito. EXEMPLO 1
Concepção e expressão e vim inibidor de angiogénese produzido a partir de vim fragmento de anticorpo e oligómeros de colagénio XVIII.
Foram criadas várias construções genéticas (Figura 3A) capazes de expressar os seguintes produtos: - o fragmento de cadeia simples Fv (scFv) do anticorpo monoclonal anti-laminina L36 (L36 scFv), - a proteína de fusão identificada como L36 scFv- NC1es~ constituída de L36 scFv fundida com o domínio de trimerização presente no domínio NC1 de colagénio XVIII de murganho (resíduos 10 até 60) através de um péptido conector flexível (ligante), - a proteína de fusão identificada como L36 scFv- NC1es+ constituída de L36 scFv fundida com o domínio NC1 de colagénio XVIII de murganho (resíduos 10 até 325) através do referido ligante, - o domínio NC1 de colagénio XVIII de murganho (resíduos 10 até 315) (NC1), e - a endostatina (ES) do domínio NC1 de colagénio XVIII de murganho (resíduos 130 até 315), gue é libertada proteoliticamente na forma trimérica e 33 7899 subsequentemente convertida na ES monomérica de aproximadamente 20 kDa (Figuras 2A e 2B).
Com o objectivo de facilitar a imunodetecção das proteínas, as construções genéticas preparadas continham ainda uma sequência que codifica uma "tag", especificamente a sequência que codifica his6myc, de modo a que a referida "tag" estava ligada à extremidade C-terminal das diferentes proteínas.
As referidas construções genéticas foram clonadas em vectores de expressão de mamíferos sob o controlo do promotor do vírus citomegalovírus humano (hCMV) contendo a sequência sinal de oncostatina M humana [Sanz L et al. Gene Therapy (2002) 15:1049]. Os vectores de expressão para ES (posições 130-315) e NC1 de murganho (1-315) foram utilizados como controlos.
As referidas proteínas recombinantes foram utilizadas nos ensaios de formação de estrutura capilar em Matrigel assim como em ensaios de migração celular para o objectivo de avaliar o seu potencial como um agente antiangiogénico.
I. MATERIAIS E MÉTODOS Células e condições de cultura Células HEK-293 (epiteliais de rim humano; ATCC CRL-1573), células HT-1080 (fibrossarcoma humano; ATCC CCL- 121) e células B16-F10 (melanoma de murganho; ATCCCRL-6475) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) 34 7899 enriquecido com 10% de soro de bovino fetal (FBS) (Life
Technologies, Gaithersburg, MD, U.S.A.).
As células endoteliais primárias da veia do cordão umbilical humano (HUVEC) foram proporcionadas por Dr. B. Giménez (Instituto de Investigaciones Biomédicas, Madrid, Espanha) e foram cultivadas me meio F12K de Ham (Life Technologies) com 10% de FBS, 50 mg/mL de suplemento de crescimento das células endoteliais (ECGS) com origem na pituitária bovina e 100 mg/mL de heparina (Sigma Biosciences, St. Louis, MO, U.S.A.). A linha celular endotelial microvascular humana HMEC-1 (Ades EW et al. , 1992, Journal of Investigative Dermatology, 99:683-690) foi fornecida por Dr. E. W. Ades (Center for Disease Control, Atlanta, GA, U.S.A.) e foi cultivada em meio MCBD 131 (Life Technologies) enriquecido com 10% de FBS, 10 ng/mL de EGF (factor de crescimento da epiderme) e 1 mg/mL de hidrocortisona (Sigma Biosciences).
Construção do vector de expressão A sequência do domínio NC1, contendo a sequência que codifica o péptido conector, o domínio de trimerização, o péptido da dobra e o domínio ES (Figura 2B), foi amplificada através da reacção em cadeia pela polimerase (PCR) a partir do clone al mc3b. (colagénio XVIII) de murganhos [Oh et al. Genomics. 1994 Feb; 19(3):494-9] fornecido pelo Dr. B. Olsen (Harvard Medicai School, Boston, MA, U.S.A.), com o par de iniciadores 1 e 2 (ver Tabela 1, contendo as sequências dos diferentes 35 7899 iniciadores utilizados para a construção do vector e subsequente verificação das sequências do vector)
Tabela 1 Sequências de oligonucleótidos Número sequência (5' -3')
1. AT T CAGAT C T T GGGCAGGTGAGGAT
2. TTCATGACCTCTTTCTCCAAAGCGGCCGCTAAACTAT
3. ATATAGCGCGGCCGCGAATTCAGATCTTGGGCAGGTGAGGAT
4 . TAGAAGGCACAGT C GAGG
5. TCTGGCTCCAAGTCTGGC
6. AATTCAGGCGCCGGTGGATCTGGTGGCTCCTCTGGCTCAGACGGAGCGTC GGGTTCGCGA
7 . GATCTCGCGGAACCCGACGCTCCGTCTGAGCCAGAGGAGCCACCAGATCCA
CCGGCGCCTG
8 . CGATACA
9. GATCTGTAT
10 . CCTAGATCTTGCTCATACTCATCAGGACTTTCAG
11. GTCCTAGGTGCGGCCGCGAAT
12 . ATAGTTTAGCGGCCGCCTCATTGCCCGTGCCTCTCAG O produto de PCR foi novamente amplificado com o par de iniciadores 2 e 3 (Tabela 1), e o produto de PCR resultante foi clivado com Notl, foi ligado ao sitio No ti do plasmídeo pCR3.1-L36 [Sanz L et al. Gene Therapy (2002) 15:1049], para obter o plasmídeo pCR3.1-L36-NC1. A sequência foi verificada utilizando os iniciadores 4 e 5 (Tabela 1).
Para criar a construção genética identificada como L36 scFv-NClES+ (Figura 3A) , o "péptido conector", que liga a hélice tripla do colagénio com o domínio NC1 de trimerização, responsável pela libertação do domínio NC1 de colagénio XVIII 36 7899 parental é substituído com um "péptido conector flexível" ("ligante flexível") Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser [LEGAGGSGGSSGSDGASGS] (Figuras 2B e 2C) , para o objectivo de prevenir a possível clivagem do domínio NC1 da extremidade amino de L36 scFv uma vez que o referido "conector peptídico" é sensível à acção de diferentes metaloproteinases (MMPs). Com essa finalidade, um par de oligonucleótidos (iniciadores 6 e 7) (Tabela 1) contendo a sequência que codifica o referido "péptido conector flexível" ("ligante flexível") foi ligado ao sítio EcoRI-Bg-Z.il de pCR3.1-L36-NC1, resultando no plasmídeo pCR3.1-L3 6-linker-NCl. 0 plasmídeo pCR3.1-NC1 foi construído eliminando o fragmento Clal-BglII do plasmídeo pCR3.l-L36-linker-NCl (contendo todo o L36 scFv) e inserindo um par de oligonucleótidos (iniciadores 8 e 9) (Tabela 1) contendo um sítio NruI.
Para construir o plasmídeo pCR3.1-ES, o modulo da endostatina de murino (ES) (resíduos 130 até 315 do domínio NC1) [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3; 17(15) :4249-56] foi amplificado a partir do plasmídeo pCR3.1-NCl com o par de iniciadores 2 e 10 (Tabela 1). 0 fragmento de PCR clivado por BglII/Notl foi ligado no plasmídeo pCR3.1-NCl digerido por BglII/NotI. A sequência foi verificada utilizando o iniciador 4 (Tabela 1). 0 domínio de trimerização presente no domínio NC1 [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms of the C- 37 7899 terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17 (15):4249-56] foi amplificado a partir do plasmídeo pCR3.1-NC1 com o par de iniciadores 11 e 12 (Tabela 1). 0 fragmento de PCR digerido com NotI foi ligado ao plasmídeo pCR3.1-L36 digerido com Notl, para obter o plasmídeo pCR3.1-L36-Trimer. A sequência foi verificada utilizando o iniciador 4 (Tabela D .
Transfecções de células
Foram transfectadas células HEK-293, HT-1080 e B16-F10 com os vectores de expressão adequados (pCR3.1, pCR3.1-L36, pCR3.1-L36-Trimer, pCR3.1-ES, pCR3.1-NCl ou pCR3.1-L36- linker-NCl) utilizando o sistema baseado em lipofectamina (Life Technologies). Para criar linhas celulares estáveis, as células HEK-293, HT-1080 e B16-F10 transfectadas foram seleccionadas em DMEM com 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL ou 3 mg/mL de G-418 (Life Technologies). A proliferação de células tumorais parentais transduzidas pelos vários vectores foi analisada diariamente durante 4 dias consecutivos em ensaios com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoílo (MTT, Promega) . Os sobrenadantes de populações de células transitórias e estáveis foram analisados para determinar a expressão proteica por meio de SDS-PAGE [Sanz L et al. Gene Therapy (2002) 15:1049], ELISA [Sanz L. et al. Gene Therapy (2002) 15:1049] e Transferência de Western (imunotransferência) [Blanco et al. J. Immunol (2003) 171:1070] utilizando mAbs (anticorpos monoclonais) anti-myc (Life Technologies) ou anti-endostatina (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, U.S.A.). 38 7899
Expressão e purificação de proteínas recombinantes
Foram utilizadas células HEK-293 transfectadas estáveis para cultivar meios condicionados sem soro. Foi adicionada uma combinação ("cocktail") de inibidores de proteinase (aprotinina, bestatina, leupeptina, pepstatina A e E-64) (Sigma Biosciences) ao meio para reduzir a proteólise. 0 meio (aproximadamente 1 L) foi concentrado (xlO) com um filtro 10,000 MWCO Vivaflow 50 (Vivascience AG, Alemanha), dialisado contra PBS (solução salina tamponado com fosfato), pH 7,4 e aplicado numa coluna de 1 mL HisTrap HP (Amersham
Biosciences, Uppsala, Suécia). As proteínas contendo ES foram adicionalmente purificadas numa coluna 1 mL HiTrap Heparin HP (Amersham Biosciences). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 0,1-2,0 NaCl. As proteínas purificadas foram dialisadas contra PBS e armazenadas a -20°C. A proteína de fusão ES domínio Fc (Fc-ES) [Cuo CJ et al. J Cell Biol. 2001 152:1233] foi proporcionada pelo Dr. K. Javaherian (Boston Children's Hospital, Boston, MA, U.S.A.). A referida proteína de fusão Fc-ES é uma proteína de fusão dimérica (entre o domínio ES e o fragmento Fc de uma imunoglobulina) e bloqueia a morfogénese capilar.
Centrifugação analítica
Foram realizadas experiências de centrifugação a 20°C numa ultracentrífuga analítica Óptima XL-A (Beckman-Coulter Inc.) equipada com óptica visível aos UV, utilizando um rotor An50Ti com peças centrais do sector duplo de 3 mm de carvão Epon. O equilíbrio de sedimentação a baixa velocidade foi ensaiada numa coluna curta (23 mL) a três velocidades sucessivas (5 000, 6 000 e 11 000 rpm), e foram retiradas 39 7899 imagens do equilíbrio (após 20 horas) a um comprimento de onda de 280 nm. A atenção foi focada na preservação da massa proteica na forma solúvel durante a experiência. As experiências de controlo da taxa de sedimentação não apresentaram qualquer agregação num intervalo de tempo de 45 horas. O sinal de referência foi medido após centrifugação a velocidade elevada (5 horas a 42 000 rpm) . O peso molecular médio pelo peso aparente das células inteiras foi obtido através da utilização do programa EQASSOC [Minton, A. P. (1994) em Modern Analytical Ultracentrifugation (Schuster, T., e Laue, T., eds), pp. 81-93, Birkhauser Boston, Inc., Cambridge, MA] . A experiência da taxa de sedimentação foi realizada a 42 000 rpm e as imagens de absorvência foram retiradas a 280 nm. Os coeficientes de sedimentação foram calculados por meio do modelo da equação de Lamm de distribuição contínua c(s) [P. Schuck. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp. 1606-1619] como implementado no programa SEDFIT. Estes valores de sedimentação experimental foram corrigidos para as condições habituais para obter os valores de S2o,w correspondentes utilizando o programa SEDNTERP [T.M. Laue, B.D. Shah, T.M. Ridgeway e S.L. Pelletier, Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins. In: S.E. Harding, A.J. Rowe e J.C. Horton, Editors, Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK (1992), pp. 90-125]. Uma análise hidrodinâmica adicional (i. e., cálculo da proporção do coeficiente friccionai) com o programa SEDFIT para obter a distribuição c (Μ) [P. Schuck. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm 40 7899
Equation Modeling. Biophysical Journal 78 (2000), pp. 1606- 1619].
Cromatografia de filtração em gel analítico
Estas experiências foram realizadas à temperatura ambiente com um sistema ÀKTA FPLC utilizando uma coluna Superdex 200 10/300GL: amostras de 0,1 mL das diferentes proteínas recombinantes (L36 scFv, L36 scFv-NClES~, L36 scFv-NC1es+ e NC1) em PBS foram injectadas a uma concentração de 0,5-1,0 mg/mL e foram separadas a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. A coluna foi calibrada com marcadores de peso molecular elevado e baixo (Amersham). As proporções dos volumes de eluição em relação ao volume de exclusão e pesos moleculares dos marcadores foram ajustadas para uma curva exponencial que foi utilizada para calcular o peso molecular das amostras.
Proteinases
As metaloproteinases da matriz MMP-1 e MMP-9 humanas (MMP) foram adquiridas de Oncogene Research Products (San Diego, CA, U.S.A.), enquanto que as MMPs MMP-3, MMP-8 e MMP-14 humanas (MT1-MMP) foram adquiridas de Calbiochem (San Diego, CA, U.S.A.). A catepsina L humana e a elastase pancreática porcina foram também adquiridas de Calbiochem.
Processamento proteolítico
As proteínas recombinantes L36 scFv-NClES~, L36 scFv-NC1es+ e NC1 foram incubadas a uma concentração de 0,6 mM, a 37°C durante 10 minutos com: 41 7899 - 10 nM de catepsina L humana em acetato de sódio a 50 mM, pH 5,5, ditiotreitol (DTT) a 2 mM, ácido etilenodiamina-tetra-acético a 5 mM (EDTA) (para tratamento com catepsina L humana); - 25 nM de elastase porcina em acetato de sódio a 50 mM, pH 6,0 (para o tratamento com elastase porcina); e - 25 nM de metaloproteinases em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl, 0,05% de Brij-35, 50 mM de ZnS04 (para o tratamento com as metaloproteinases utilizadas).
Depois, as fracções foram sujeitas a electroforese em gel de poliacrilamida a 12% em condições de redução na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). Os géis foram corados com nitrato de prata (Sigma BioScience) ou foram sujeitos a Transferência de Western, utilizando mAb anti-ES de murganho.
Formação do tubo em Matrigel
Para ensaios de formação de estrutura de tipo capilar (CLS), foi preparada uma matriz de membrana à base de Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA, U.S.A.) numa placa pré-congelada de 72 poços Terasaki (Nunc, Roskilde, Dinamarca) com 2 mL/poço e foi depois deixada a solidificar a 37°C durante 30 minutos. Foram semeadas 3 x 103 ECs (HMEC-1 ou HUVEC) em 10 mL de meio adequado enriquecido com 0,5% FBS na matriz em gel. O volume total do meio no poço foi ajustado para 25 mL enquanto que ao mesmo tempo as células foram preparadas e foram incubadas durante 16 horas a 37 °C numa atmosfera humedecida com 5% de C02. O efeito inibidor da formação do tubo das proteínas recombinantes ensaiadas (L36 42 7899 scFv, L36 scFv-NClES , L36 scFv-NClES+, NC1 e ES) foi determinado através da adição de 15 mL de proteina recombinante purificada, diluída no meio adequado de acordo com a linha celular utilizada (HMEC-1 ou HUVEC) a diferentes concentrações (Figura 5D) , às placas revestidas de Matrigel no momento do plaqueamento das células. As experiências foram realizadas em triplicado.
Análise de imagem digital
As imagens digitais de cada poço foram obtidas a partir de um microscópio Axiovert 100 (Cari Zeiss, Alemanha), utilizando uma câmara SPOT (Diagnostics Instruments, Inc.) e foram armazenadas como imagens BMP com 328x256 pixels 8 bit na escala cinzenta. As imagens foram processadas utilizando o novo software AD baseado em Matlab 5.3 [Sanz, L. et al. Microvasc Res. 2002 May; 63(3):335].
Ensaio de migração celular
Para estudos de migração de EC, inserções de filtros de tereftalato de polietileno com um tamanho de poro de 3, 0 mm e diâmetro de 6,5 mm (Becton Dickinson) foram revestidas com Matrigel a uma concentração de 1,25 mg/mL em meio sem soro a 4°C durante a noite. As células HUVEC (1,5 x 105) foram pré-incubadas em meio sem soro durante 30 minutos a 37 °C em atmosfera de 5% de C02 humedecida na presença de 20 mg/mL de proteína purificada (L36 scFv, L36 scFv-NClES^, ES, NC1 e L36 scFv-NClES+) , e depois eles foram transferidos para o compartimento de topo. Foram adicionados 600 mL de meio contendo soro, ao compartimento do fundo. Após 16 horas, as células foram fixadas com 1% de glutaraldeído em PBS, foram 43 7899 coradas com 0,1% de violeta cristal e examinadas sob um microscópio.
II. RESULTADOS O efeito combinado de endostatina e um scFv de vim anticorpo anti-laminina (L36) no ensaio de formação do tubo endotelial
Foi demonstrado que ES oligomérico modula a morfogénese das células epiteliais (EC) dependente da matriz extracelular (ECM) [Cuo CJ et al. J Cell Biol. 2001 152:1233]. O tratamento com ES dimérica, na forma Fc-ES, no momento do plaqueamento das células em Matrigel, inibiram significativamente a montagem em estruturas tubulares, mantendo as EC dispersas e apresentando uma morfologia que foi semelhante à das células em plástico. Estas alterações morfológicas foram semelhantes àquelas observadas quando as culturas de EC foram tratadas com L36 scFv (Figura 1).
Concepção e expressão de proteínas de fusão L36 scFv-ES ES deriva do dominio NC1 libertado proteoliticamente subsequentemente convertido aproximadamente 20 kDa (Figuras diferentes genes quiméricos proteínas. do colagénio XVIII, que é na forma trimérica e em ES monomérico de 2A e 2B). Foram construídos que expressam diferentes
Numa forma de realização particular, o gene quimérico denominado L36 scFv-NClES+ foi construído, construído de scFv do mAb anti-laminina L36 fundido com o domínio NC1 de colagénio XVIII de murganho (resíduos 10 até 315) (Figuras 2C 44 7899 e 3A) . Na extremidade N-terminal de NC1 do colagénio XVIII, existe um domínio de trimerização de cerca de 60 resíduos de aminoácidos aproximadamente ligados com o módulo ES, de cerca de 180 resíduos de aminoácidos, por meio de uma região da dobra flexível de cerca de 70 resíduos de aminoácidos aproximadamente, contendo vários sítios que são sensíveis às proteinases que libertam o ES monomérico após a clivagem proteolítica (Figura 2B) . 0 "péptido conector" que liga a hélice tripla do colagénio com o domínio de trimerização de NC1 responsável pela libertação do domínio NC1 de colagénio XVIII parental é sensível à acção de diferentes MMPs. Por isso, para prevenir uma possível clivagem do domínio NC1 da extremidade amino de L36, o referido "péptido conector" foi substituído por um "ligante flexível" de 17 aminoácidos (Figuras 2B e 2C).
Igualmente, noutra forma de realização particular, foi construído o gene quimérico denominado L36 scFv-NClES~, mais curto do que o anterior, contendo as sequências codificantes para L36 scFv, o referido ligante flexível e apenas o domínio de trimerização de NC1 (Figura 3A). O "tag" his6myc foi ligado á extremidade C-terminal das proteínas de fusão para facilitar a imunodetecção.
As construções genéticas foram clonadas nos vectores de expressão de mamíferos adequados sob o controlo do promotor de hCMV contendo a sequência principal de oncostatina M humana. Foram utilizados vectores de expressão para ES (posições 130-315) e NC1 de murganho (1-315) como um controlo (Figura 3A). 45 7899
Foram criadas linhas celulares estáveis em células HEK 293 e as proteínas de fusão do meio condicionado foram purificadas. A análise de Transferência de Western demonstrou que o padrão de migração das proteínas purificadas foi consistente com o peso molecular previsto (Figura 3B) [pista 1: L36 scFv, pista 2: L36 scFv-NClES_, pista 3: L36 scFv-NC1es+, pista 4: NC1, e pista 5: ES].
Em condições de redução, o mAb 9E10 anti-myc desenvolveu bandas únicas com um peso molecular aparente (MW) de 26, 36, 67,5 e 22 kDa (Figura 3B) , que correspondeu ao MW calculado de 28,8, 37,6, 65,6 e 23,8 kDa para L36 scFv monomérico, L36 scFv trimérico, L36 scFv-NCl e ES monomérico, respectivamente. Nas análises de Transferência de Western com proteínas contendo o domínio NC1, o mAb 9E10 reconheceu uma banda única de aproximadamente 24 kDa correspondendo ao ES monomérico e uma banda de um dupleto de 39-44 kDa correspondendo à proteína não processada (Figura 3B) . Ambas as bandas no dupleto foram positivas na Transferência de Western com mAb anti-ES (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA) . 0 dupleto pode ser devido a uma modificação pós-tradução ou a efeitos de dobragem de proteína interna. 0 mAb anti-ES também desenvolveu a banda de 24 kDa e uma banda adicional com um MW aparente de aproximadamente 23 kDa que pode corresponder a monómeros de tipo ES não marcados (Figura 3B) . Através da análise de Transferência de Western com proteínas L36 scFv -NC1ES+, o mAb anti-ES reconheceu a fusão não processada de 67,5 kDa e uma banda de 24 kDa não detectada por meio do mAb 9E10, correspondendo ao domínio ES processado (Figura 3B). 0 ES purificado surgiu com um dupleto 46 7899 22-23 kDa quando foi desenvolvido com o mAb anti-ES (Figura 3B) .
Caracterização da proteína de fusão L36 scFv-NC1es_ 0 estado de oligomerização das diferentes proteínas de fusão foi avaliado por meio de cromatografia analítica com filtração em gel e por meio de experiências de centrifugação analítica com amostras idênticas. A proteína de fusão L36 scFv-NCl ES~ purificada por meio de IMAC (cromatografia de afinidade imobilizada em metal) eluída a partir da filtração em coluna de gel essencialmente como um único pico (90% da área total) a um volume que correspondeu ao peso molecular de 109 kDa, que indicou que a proteína foi um trímero. A taxa de sedimentação também apresentou um pico único principal com uma massa de 112 kDa e a experiência de equilíbrio de sedimentação resultou numa distribuição de massa que pode ser ajustada a espécies triméricas e não a um monómero ou um dímero (Figura 4A) . Como um todo, todos estes resultados demonstraram a natureza trimérica da proteína de fusão L36 scFv-NClES“, uma característica conferida pelo domínio NC1 de trimerização, uma vez que L36 scFv é monomérico nas mesmas condições, como apresentado na filtração em gel e experiências de taxa de sedimentação (resultados não apresentados) . L36 scFv trimérico (L36 scFv-NClES~) apresentou afinidade de ligação superior para laminina imobilizada em plástico e foi muito mais eficaz do que o monómero no bloqueamento da diferenciação de EC em substratos em Matrigel (Figuras 4B e 4C).
Para fins experimentais, é essencial que a proteína de fusão L36 scFv-NClES~ permaneça estável e funcional na 47 7899 presença de proteinases. Por isso, foi determinada a sua funcionalidade após incubação com uma vasta variedade de proteinases a concentrações molares conhecidas de enzima activa. As proteinases incluídas representativas de várias classes de proteinases, i. e. catepsina L da família da proteinase de cisteína; MMP-1, MMP-3; MMP-8; MMP-9, MMP-14 da família da metaloproteinase, e elastase pancreática da família da proteinase de serina. Como apresentado na Figura 4D, L36 scFv trimérico (L36 scFv-NClES~) não foi clivado na presença da maioria das proteinases testadas. MMP-14 processou parcialmente o trímero (L36 scFv-NC1es“) mas mesmo após 4 horas de reacção, o anticorpo funcionalmente activo foi detectado por meio de ELISA. Apenas a catepsina L degradou completamente a proteína de fusão L3 6 scFv-NC ES“.
Caracterização da proteína de fusão L36 scFv-NClES+ A cromatografia de exclusão demonstrou que a proteína de fusão purificada L36 scFv-NClES+ eluiu como um pico principal com um peso molecular aproximado de 210 kDa, consistente com um trímero, e outro pico com um peso molecular aparente de 117 kDa, que pode corresponder a um fragmento que não tem parte do ES (Figura 5A) . A taxa de sedimentação também identificou duas espécies com pesos de 181 kDa e 83 kDa. A proteína NC1 recombinante eluída como um pico principal com um peso molecular aproximado de 123 kDa, que correspondeu com uma espécie trimérica, e outros picos mais pequenos, um deles com um peso de 19 kDa que correspondeu com monómeros ES (Figura 5B) . Uma espécie principal com um peso molecular de 116 kDa foi identificada por meio de experiências da taxa de sedimentação. Estes dados indicaram 48 7899 que a proteína NC1 recombinante foi principalmente trimérica mas heterogénea, possivelmente devido a degradação, que foi consistente com os resultados obtidos por outros investigadores que tinham observado uma heterogeneidade semelhante em proteínas NC1 recombinantes [Sasaki T. et al. EMBO J. 1998 17:4249-56].
Como esperado, a proteína de fusão L36 scFv-NClES+ demonstrou afinidade de ligação para laminina imobilizada em plástico, um pouco superior à da proteína NC1 recombinante (Figura 5C). Do mesmo modo, a referida proteína de fusão L36 scFv-NClES+ (bi-especí f ica) era muito mais eficaz do que a proteína NC1 recombinante (monoespecífica) no bloqueamento da diferenciação de EC em substratos Matrigel (Figura 5D). A Figura 5E inclui os resultados do ensaio de migração de EC e demonstra que a migração de células HUVEC na presença de proteína de fusão L36 scFv-NClES+ é inferior à alcançada na presença de outras proteínas recombinantes ensaiadas (L36 scFv e NC1) e da mesma ordem de grandeza que a alcançada com ES recombinante.
Processamento proteolítico da proteína de fusão L36 scFv-NC1es+. Criação de ES monomérico e scFv multimérico.
De modo a estudar a criação de ES através de várias proteinases, a proteína de fusão L36 scFv-NClES+ foi incubada e a mistura de reacção foi analisada através de Transferência de Western utilizando um mAb anti-ES (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946, USA). A proteína de fusão foi tratada com os cinco MMPs ensaiados (MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9 e MMP-14), sendo observadas diferenças significativas na 49 7899 eficiência do processamento da proteína L36 scFv-NClES+ entre os referidos MMPs, MMP-3 e sendo MMP-14 a mais eficaz. 0 processamento completo da proteína de fusão L36 scFv-NClES+ foi observado e 4 horas. Os principais produtos de acumulação foram polipéptidos com pesos moleculares compreendidos entre 20 e 25 kDa (Figura 6A) . MMP-3, MMP-8, MMP-9 e MMP-14 produziram fragmentos ES que se acumularam após 4 horas, o que sugere que as referidas MMPs não os podem degradar. Como apresentado na Figura 6A, a elastase e catepsina L não apenas criaram fragmentos de tipo ES da proteína de fusão L36 scFv-NC1es+, mas eles também as degradaram rapidamente, apenas pequenas quantidades de ES que restaram após 4 horas de incubação. Este padrão de processamento proteolítico foi quase idêntico ao observado com a proteína NC1 de murino nativa não modificada (Figura 6B) . Os resultados indicaram que a adição à extremidade N-terminal de um fragmento de anticorpo contendo um sítio para reconhecer um epitopo, tal como scFv, no domínio NC1 não interferiu com o processamento proteolítico da proteína de fusão pelas proteinases nem com a criação de ES.
Para o objectivo de investigar a eficácia das proteinases para criar fragmentos de anticorpo (L36 scFv), as misturas de reacção foram sujeitas a SDS-PAGE em condições de redução e foram coradas com nitrato de prata. Como apresentado na Figura 6C, a proteinase mais eficaz na criação de ES foi MMP-14, que também gerou L36 scFv. As L36 scFv e ES geradas foram estáveis e acumularam-se após 4 horas, o que indicou que nestas condições experimentais, a proteinase não as pode degradar. A relação entre a intensidade de L36 scFv trimérico e a intensidade de ES sugere um processamento da proteína de fusão L36 scFv-NClES+ equilibrado. Foram 50 7899 observados resultados semelhantes com outras MMPs (resultados não apresentados).
Lisboa, 1 de Abril de 2010 51
Claims (28)
- 7899 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína oligomérica que compreende 2, 3, ou 4 proteínas de fusão, em que cada proteína de fusão compreende: a) um polipéptido (A' ) que compreende uma região que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, sendo o referido polipéptido um anticorpo que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese ou um seu fragmento recombinante que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e b) um polipéptido (B') que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) um péptido ou proteína inibidor ou modulador do processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e o referido péptido ou proteína inibidor ou modulador do processo de angiogénese.
- 2. Proteína oligomérica de acordo com a reivindicação 1, em que a referida molécula envolvida no processo de angiogénese é uma proteína da matriz extracelular (ECM), um factor angiogénico ou um receptor de membrana celular.
- 3. Proteína oligomérica de acordo com a reivindicação 2, em que a referida molécula envolvida no processo de angiogénese é colagénio, um proteoglicano, fibronectina, laminina, tenascina, entactina, trombospondina, factor de crescimento 1 7899 endotelial vascular (VEGF), receptor VEGF 2 (VEGFR-2) ou uma integrina.
- 4. Proteína oligomérica de acordo com a reivindicação 3, em que a referida laminina é uma laminina de mamífero, de um modo preferido um rato, murganho ou laminina humana.
- 5. Proteína oligomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, em que o referido polipéptido (A') é um fragmento de cadeia simples Fv (scFv) de um anticorpo que reconhece uma molécula envolvida no processo de angiogénese ou um diacorpo que reconhece a referida molécula envolvida no processo de angiogénese.
- 6. Proteína oligomérica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipéptido (B' ) compreende o domínio NC1 de colagénio XV de mamífero ou o domínio NC1 de colagénio XVIII de mamífero.
- 7. Proteína oligomérica de acordo com a reivindicação 1, que compreende, entre os referidos polipéptidos (A' ) e (B'), um terceiro polipéptido (C' ) que compreende a sequência de aminoácidos de um péptido de ligação flexível.
- 8. Proteína oligomérica de acordo com a reivindicação 1, sendo a referida proteína oligomérica um trímero que consiste em 3 proteínas de fusão, em que cada proteína de fusão compreende: a) um polipéptido (A'), sendo o referido polipéptido (A' ) um fragmento de cadeia simples Fv (scFv) de um anticorpo que reconhece uma laminina, e 2 7899 b) um polipéptido (B'), referido polipéptido (B' ) que compreende o domínio NC1 de colagénio XVIII de mamífero.
- 9. Composição farmacêutica que compreende uma proteína oligomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 8 juntamente com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 10. Utilização de uma proteína oligomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 8, no fabrico de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar, impedir ou minimizar o desenvolvimento da angiogénese.
- 11. Utilização de uma proteína oligomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 8, no fabrico de uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir patologias que ocorrem com angiogénese.
- 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a referida patologia que ocorre com angiogénese compreende cancro, hemangioma, artrite reumatóide, psoríase, bartonelose, rejeição do órgão transplantado, hemorragia, neovascularização ocular, retinopatias, degeneração macular, glaucoma neovascular, oclusão da veia retinal, oclusão de artéria retinal, pterígio, rubeose, ou neovascularização da córnea.
- 13. Cassete de expressão que compreende, ligada operacionalmente a uma sequência de controlo da expressão, uma construção genética que compreende, ligada operacionalmente, pelo menos: 3 7899 a) uma primeira sequência de ácido nucleico (A) , que compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese, sendo o referido polipéptido um anticorpo que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese ou um seu fragmento recombinante que reconhece e bloqueia uma região funcionalmente activa de uma molécula envolvida no processo de angiogénese; e b) uma segunda sequência de ácido nucleico (B) , que compreende a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende (i) um domínio de oligomerização, (ii) um péptido ou proteína inibidor ou modulador do processo de angiogénese, e (iii) uma região sensível à proteinase entre o referido domínio de oligomerização e o referido péptido ou proteína inibidor ou modulador do processo de angiogénese, em que a extremidade 3' da referida primeira sequência de ácido nucleico (A) está ligada à extremidade 5' da referida segunda sequência de ácido nucleico (B).
- 14. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 13, em que a referida molécula envolvida no processo de angiogénese é uma proteína da matriz extracelular (ECM), um factor angiogénico ou um receptor de membrana celular.
- 15. Cassete de expressão de acordo com reivindicação 14, em que a referida molécula envolvida no processo de angiogénese é colagénio, um proteoglicano, fibronectina, laminina, 4 7899 tenascina, entactina, trombospondina, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), receptor VEGF 2 (VEGFR-2) ou uma integrina.
- 16. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 15, em que a referida laminina é uma laminina de mamífero, de um modo preferido, uma laminina de rato, murganho ou humano.
- 17. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 13, em que a referida primeira sequência de ácido nucleico (A) compreende a sequência de nucleótidos que codifica um fragmento de cadeia simples Fv (scFv) de um anticorpo que reconhece a referida molécula envolvida no processo de angiogénese ou um diacorpo que reconhece a referida molécula envolvida no processo de angiogénese.
- 18. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 13, em que a referida segunda sequência de ácido nucleico (B) compreende a sequência de nucleótidos que codifica o domínio NC1 de colagénio XV de mamífero ou a sequência de nucleótidos que codifica o domínio NC1 de colagénio XVIII de mamífero, contendo a sequência de nucleótidos que corresponde aos domínios de trimerização e endostatina (ES) dos referidos domínios de NC1, e a sequência de nucleótidos que codifica os péptidos da dobra dos referidos domínios de NC1.
- 19. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 13, que compreende, adicionalmente às referidas sequências de ácido nucleico (A) e (B) , uma terceira sequência de ácido nucleico (C) contendo a sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de ligação flexível, em que a extremidade 5' da referida terceira sequência de ácido nucleico (C) está ligada 5 7899 à extremidade 3' da referida primeira sequência de ácido nucleico (A).
- 20. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 13, em que a referida primeira sequência de ácido nucleico (A) compreende a sequência de nucleótidos que codifica um fragmento de cadeia simples Fv (scFv) de um anticorpo que reconhece uma laminina e a referida segunda sequência de ácido nucleico (B) compreende a sequência de nucleótidos que codifica o domínio NC1 de colagénio XVIII de mamífero, contendo a sequência de nucleótidos que corresponde ao domínio de trimerização e endostatina (ES) do referido domínio NC1.
- 21. Vector recombinante que compreende uma cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 até 20.
- 22. Célula hospedeira que compreende uma cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 até 20, ou um vector recombinante de acordo com a reivindicação 21.
- 23. Proteína oligomérica obtida através da expressão da sequência de ácido nucleico contida numa cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 até 20.
- 24. Processo para obter uma proteína oligomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 8, que compreende cultivar uma célula de acordo com a reivindicação 22 em condições que permitem a produção da referida proteína 6 7899 oligomérica e, se assim for desejado, isolar e purificar a referida proteína oligomérica.
- 25. Composição farmacêutica que compreende um vector que compreende uma cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 até 20, juntamente com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 26. Utilização de uma cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 até 20, ou de um vector de acordo com a reivindicação 21, no fabrico de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar, impedir ou minimizar o desenvolvimento da angiogénese.
- 27. Utilização de uma cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 até 20, ou de um vector de acordo com a reivindicação 21, no fabrico de uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir patologias que ocorrem com angiogénese.
- 28. Utilização de acordo com a reivindicação 27, em que a referida patologia que ocorre com angiogénese compreende cancro, hemangioma, artrite reumatóide, psoríase, bartonelose, rejeição do órgão transplantado, hemorragia, neovascularização ocular, retinopatias, degeneração macular, glaucoma neovascular, oclusão da veia retinal, oclusão da artéria retinal, pterígio, rubeose, ou neovascularização da córnea. Lisboa, 1 de Abril de 2010 7
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