ES2330508T3 - Composiciones de interferon estabiladas. - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende IFN-ß biológicamente activo y manitol altamente purificado, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 20 partes por millón.

Description

Composiciones de interferón estabilizadas.
Campo de la invención
La invención se refiere generalmente a composiciones farmacéuticas, más particularmente a formulaciones de proteínas estabilizadas liofilizadas o líquidas, que incluyen el interferón \beta y otros.
Antecedentes de la invención
Los interferones son una familia de glucoproteínas cuya secreción a partir de células está inducida por un número de señales que incluyen virus, ARNs de doble hebra, otros polinucleótidos, antígenos, y mitógenos. Los interferones exhiben múltiples actividades biológicas, que incluyen actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras. Al menos se han distinguido tres tipos distintos de interferones humanos, \alpha, \beta y \gamma, en base a un número de factores, que incluyen actividades anti-virales y anti-proliferativas.
El interferón \beta (IFN-\beta) es el primer tratamiento eficaz identificado para aquellos con esclerosis múltiple (EM), y se ha demostrado que reduce el número de ataques sufridos por pacientes con EM con recaída o con remisiones. Las composiciones de interferón \beta también son útiles en el tratamiento de las infecciones de Hepatitis B y C.
Como con todos los fármacos basados en proteínas, un obstáculo principal que debe ser superado en el uso del IFN \beta como agente terapéutico es la pérdida de utilidad farmacéutica que puede resultar de su estabilidad en formulaciones farmacéuticas. Las inestabilidades físicas que amenazan la actividad y la eficacia del polipéptido en formulaciones farmacéuticas incluyen desnaturalización y formación de agregados solubles e insolubles, mientras que las inestabilidades químicas incluyen hidrólisis, formación de iminas, oxidación, racemización, y desaminación. Algunos de estos cambios se conoce que llevan a la pérdida o reducción de la actividad farmacéutica de la proteína de interés. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios son desconocidos, pero los productos de degradación resultantes todavía se consideran farmacéuticamente inaceptables debido al potencial para efectos secundarios no deseados.
La inestabilidad de polipéptidos en preparaciones farmacéuticas impacta directamente su utilidad farmacéutica, tal como las directrices establecidas para la aprobación de fármacos basados en proteínas enfatizan que cambios en la actividad y las características moleculares del polipéptido deben ser mínimas. Véase, por ejemplo, la descripción del 30 de Noviembre de 1995 sobre el ensayo de estabilidad de productos Biotecnológicos/Biológicos emitido por la Conferencia Internacional sobre la Harmonización de los Requerimientos Técnicos para el Registro del Uso Fármacos para Seres Humanos (una organización tripartita que hace recomendaciones de política relacionada con fármacos para la puesta en marcha en la Unión Europea, Japón, y los EE.UU.), que establece que "donde los cambios indicativos significativos de cualidad y cantidad de la formación de productos de degradación son detectados durante estudios a largo plazo, acelerados y/o de estrés, se deben tener en cuenta los peligros potenciales y la necesidad de caracterización y cuantificación de los productos de degradación dentro del programa de estabilidad a largo plazo".
Consecuentemente, existe la necesidad de composiciones farmacéuticas de proteína adicionales que sustancialmente están libres de impurezas reductoras, estabilizando así la proteína y potenciando su utilidad farmacéutica.
Compendio de la invención
Se proporcionan composiciones que comprenden IFN-\beta como componente terapéuticamente activo y manitol altamente purificado, que tiene una actividad reductora de menos de 20 ppm, como excipiente. Las composiciones se caracterizan por estabilidad mejorada durante el almacenamiento en comparación con composiciones de IFN-\beta que contienen manitol que no está altamente purificado. También se proporcionan métodos para hacer estas composiciones.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una comparación de los cromatogramas de RP-HPLC para la masa de IFN-\beta formulada con dextrosa y polvo liofilizado incubado a 50ºC durante una semana. La formación de aductos de IFN-\beta glicosilado en la formulación mantenida a 50ºC se ve como la aparición de un segundo pico (B1) (a aproximadamente la fracción 48) que precede al pico principal de IFN-\beta (a aproximadamente las fracciones 49-50). Véase el Ejemplo 1.
La Figura 2 muestra el espectro de masas para la masa de IFN-\beta formulado con dextrosa. Se detectan varios picos pequeños además del pico principal de IFN-\beta a 19878 amu. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 3 muestra el espectro de masas para una muestra liofilizada de IFN-\beta formulada con dextrosa a partir de la composición de masa y almacenada a 50ºC durante 1 semana. Al contrario que la Figura 2, el pico predominante corresponde a aductos de IFN-\beta. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 4 muestra una comparación de los cromatogramas de RP-HPLC para la masa de IFN-\beta formulada con manitol USP y polvo liofilizado incubado a 50ºC durante una semana. No se ve la formación de aductos de IFN-\beta glicosilado en la formulación mantenida a 50ºC (aparición del pico B1). Véase el Ejemplo 1.
La Figura 5 muestra el espectro de masas de la masa de IFN-\beta formulada con manitol. El IFN-\beta es detectado como un pico a 19880 amu. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 6 muestra el espectro de masas de IFN-\beta formulado con manitol USP que ha sido liofilizado e incubado a 50ºC durante 1 semana. La formación de picos adicionales (representando aductos) se puede ver en el espectro. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 7 muestra el espectro de masas de IFN-\beta formulado con manitol no purificado. Se puede ver en este espectro la formación de numerosos picos adicionales (representando aductos). Véase el Ejemplo 1.
La Figura 8 muestra el espectro de masas del IFN-\beta formulada con manitol extraído con metanol para el mismo lote usado en la Figura 7. El tamaño y número de los picos del aducto se ha reducido sustancialmente. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 9 muestra el espectro de masas de una formulación de IFN-\beta que comprende manitol altamente purificado (extraído con metanol, tratado con carbón, ultrafiltrado, y recristalizado). Sólo se ven tres picos pequeños, además del pico predominante que representa IFN-\beta no modificado.
La Figura 10 muestra el espectro de masas del IFN-\beta formulado en ausencia de manitol. De este espectro, se puede ver que los picos secundarios predominantes presentes en la Figura 9 no están formados por la interacción con manitol altamente purificado, además de que aparecen en ausencia del excipiente. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 11 muestra el espectro de masas del IFN-\beta formulado con manitol USP, probado el mismo día que en la Figura 9 de más arriba. Este espectro confirma que el IFN-\beta formulado con manitol USP forma picos adicionales (aductos) que no están presentes en una formulación de IFN-\beta que comprende manitol altamente purificado. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 12 muestra los datos de evaluación de estabilidad para formulaciones de IFN-\beta dextrosa tal como se describen en el Ejemplo 2.
La Figura 13 muestra los datos de evaluación de estabilidad para la formulación del IFN-\beta que comprende manitol altamente purificado tal como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 14 muestra los datos de evaluación de estabilidad para el Lote 006 de las formulaciones de IFN-\beta que comprende manitol altamente purificado tal como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 15 muestra los datos de evaluación de estabilidad para el Lote 008 de las formulaciones de IFN-\beta que comprende manitol altamente purificado tal como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 16 muestra los datos de evaluación de estabilidad para el Lote 009 de las formulaciones de IFN-\beta que comprende manitol altamente purificado tal como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 17 muestra la actividad reductora presente en varias muestras de manitol. Las muestras 1-3 son manitol USP que no ha sido extraído con metanol, filtrado con carbón, o ultrafiltrado; las muestras 4-6 son manitol USP que ha sido extraído con metanol, y las muestras 7-9 son manitol que ha sido extraído con metanol, tratado con carbón, ultrafiltado, y recristalizado.
Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida a composiciones farmacéuticas de IFN-\beta con estabilidad aumentada y métodos para su preparación. Las composiciones comprenden IFN-\beta y manitol altamente purificado. El manitol altamente purificado aumenta la estabilidad de la formulación al disminuir la formación de productos de degradación. La formulación de IFN-\beta estabilizada es ventajosa debido a que es más segura (debido a la reducción del potencial de los efectos secundarios dañinos) y más económica (debido a un aumento del periodo útil de la formulación).
La aumentada estabilidad de las composiciones descritas se da como resultado del uso de manitol que ha sido altamente purificado. El nuevo descubrimiento de la presente invención es que el manitol que no ha sido altamente purificado contiene una actividad reductora que interacciona con el IFN-\beta para producir aductos indeseables (productos de degradación), mientras que el manitol que ha sido altamente purificado no contiene esta actividad reductora y no causa formación de estos aductos en las formulaciones de IFN-\beta. Los resultados experimentales presentados en la presente memoria (véase el Ejemplo 1 en la Sección Experimental) indican que la actividad reductora presente en el manitol no purificado que es responsable de la formación de aductos de IFN-\beta no es una actividad reductora de azúcar debido a que los aductos formados en presencia de manitol que no ha sido altamente purificado se pueden diferenciar claramente de los aductos formados en presencia de excipientes con actividad reductora de azúcar conocida (por ejemplo, dextrosa).
"Manitol altamente purificado" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a manitol que tiene un bajo nivel de actividad reductora. La actividad reductora del manitol altamente purificado es menos de 20 partes por millón USP tal como se mide por el ensayo de actividad reductora descrito en cualquier parte de la presente memoria. En varias realizaciones, la actividad reductora del manitol altamente purificado es menos de 19 partes por millón, menos de 18 partes por millón, menos de 17 partes por millón, menos de 16 partes por millón, menos de 15 partes por millón, menos de 14 partes por millón, o menos de 13 partes por millón. En una realización, el manitol altamente purificado es manitol de grado USP (Farmacopea de los Estados Unidos), de sus siglas en ingles) o ACS (Sociedad Americana de Química, de sus siglas en inglés) que ha sufrido las etapas de: 1) extracción con metanol; 2) tratamiento con carbón; 3) untrafiltración; y 4) recristalización. El manitol altamente purificado está presente en una concentración suficiente para estabilizar la formulación. Las formulaciones abarcadas por la invención pueden tener tan poco como aproximadamente 0,1% de manitol altamente purificado o tanto como aproximadamente 7,5% de manitol altamente purificado (peso/volumen). En varias realizaciones, el manitol está presente en una concentración de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 7,0%, aproximadamente 0,25% a aproximadamente 2,5%, y aproximadamente 1,25%.
Se describen ambas composiciones líquida y liofilizada que comprenden IFN-\beta como componente terapéuticamente activo y manitol altamente purificado como excipiente. Para los propósitos de la presente invención, el término "líquido" con respecto a las composiciones o formulaciones farmacéuticas pretende incluir el término "acuoso". El término "liofilizado" con respecto a las formulaciones farmacéuticas de IFN-\beta pretende referirse a liofilizado rápido bajo presión reducida de una pluralidad de viales, cada uno de los cuales contiene una dosis única de la formulación del interferón de la presente invención. Los liofilizadores, que realizan la liofilización arriba descrita, están comercialmente disponibles y funcionan fácilmente para los expertos en la materia. En una realización de la presente invención, la composición líquida está liofilizada.
Las formulaciones de IFN-\beta líquidas o liofilizadas de la presente invención están "estabilizadas". Por composiciones "estabilizadas" o por composiciones que tienen "estabilidad aumentada" o "estabilidad aumentada", se pretende composiciones que tienen estabilidad de almacenamiento aumentada en relación a composiciones de IFN-\beta formuladas con manitol que no ha sido altamente purificado. Este aumento en la estabilidad se manifiesta por un descenso en la formación de aductos de IFN-\beta o productos de degradación durante el almacenamiento en comparación con las formulaciones con manitol que no ha sido altamente purificado. La formación de aductos o productos de degradación se puede medir usando el ensayo espectrométrico de masas descrito en la presente memoria. Una composición estabilizada de IFN-\beta formulado con manitol altamente purificado de la invención se caracteriza por la ausencia de los picos adicionales que se observan en IFN-\beta formulado con manitol USP cuando se compara con una composición de IFN-\beta formulada sin manitol, tal como se determina por el ensayo espectrométrico de masas descrito en la presente memoria. Véase, por ejemplo, el espectro de masas del IFN-\beta formulado con manitol altamente purificado mostrado en la Figura 9, que no muestra picos adicionales en comparación con el espectro de masas del IFN-\beta formulado sin manitol mostrado en la Figura 10. Por el contrario, el espectro de masas del IFN-\beta formulado con manitol USP mostrado en la Figura 11 resuelve numerosos picos adicionales (aductos) en comparación con el espectro de masas del IFN-\beta formulado sin manitol. Las formulaciones farmacéuticas de IFN-\beta estabilizadas de la invención conservan su potencia y contienen menos de 0,02 mg/ml de IFN-\beta glicosilado durante un periodo de hasta aproximadamente dos años cuando se almacena a 30ºC y al menos dos años cuando se almacena a 25ºC.
Las formulaciones farmacéuticas estabilizadas de la invención comprenden IFN-\beta y variantes del mismo. El término "IFN-\beta" tal como se usa en la presente memoria se refiere a IFN-\beta o variantes del mismo, a veces referidos como polipéptidos del tipo IFN-\beta. Los variantes humanos del IFN-\beta, que se pueden dar de forma natural (por ejemplo, variantes alélicos que ocurren en el locus del IFN-\beta) o se producen de forma recombinante, tienen secuencias aminoacídicas que son las mismas que, similares a, o sustancialmente similares a la secuencia natural madura del IFN-\beta. También están abarcados los fragmentos de IFN-\beta o formas truncadas de IFN-\beta que conservan su actividad. Estos fragmentos o formas truncadas de IFN-\beta biológicamente activos se generan separando restos de aminoácidos de la secuencia aminoacídica total del IFN-\beta usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el estado de la técnica. Los polipéptidos de IFN-\beta pueden estar glicosilados o no glicosilados, ya que se ha descrito en la literatura que los IFN-\beta glicosilados y no glicosilados muestran actividades específicas cualitativamente similares y que, por ello, los restos glicosilo no están implicados y no contribuyen en la actividad biológica del IFN-\beta.
Los variantes de IFN-\beta abarcados en la presente memoria incluyen muteínas de la secuencia de IFN-\beta natural madura (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5.814.485), donde uno o más restos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica han sido delecionados de forma deliberada o reemplazados por otros aminoácidos para eliminar sitios para reticulación intermolecular o formación de enlaces disulfuro intramolecular incorrectos. Variantes de IFN-\beta de este tipo incluyen aquellas que contienen la cisteína encontrada en el aminoácido 17 de la secuencia aminoacídica natural madura sustituida por una glicina, valina, alanina, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina, histidina, triptófano, serina, treonina, o metionina. Serina y treonina son los reemplazos más preferidos debido a su analogía química con cisteína. Las sustituciones con serina son las más preferidas. Véase, por ejemplo, el variante de IFN-\beta donde la cisteína encontrada en el aminoácido 17 de la secuencia natural madura es reemplazada con serina (Patente de EE.UU. No. 5.814.485). La cisteína 17 también puede ser delecionada usando métodos conocidos en el estado de la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 4.588.584), que da como resultado una muteína madura de IFN-\beta que es un aminoácido más corta que el IFN-\beta natural maduro. Véase también, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 4.530.787; 4.572.798; y 4.588.585. Por ello, los variantes de IFN-\beta con una o más mutaciones que mejoran, por ejemplo, su utilidad farmacéutica también están abarcados por la presente invención.
El experto en la materia apreciará que se pueden introducir por mutación cambios adicionales dentro de las secuencias nucleotídicas que codifican el IFN-\beta, dando lugar con ello a cambios en la secuencia aminoacídica del IFN-\beta, sin alterar la actividad biológica del interferón. Por ello, se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un variante de IFN-\beta que tiene una secuencia que difiere de la secuencia aminoacídica para al IFN-b introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones nucleotídicas dentro de la secuencia nucleotídica correspondiente descrita en la presente memoria, de forma que una o más sustituciones, adiciones o deleciones aminoacídicas se introducen dentro del IFN-\beta codificado. Las mutaciones pueden ser introducidas por técnicas clásicas, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Tales variantes del IFN-\betatambién están abarcados por la presente invención.
Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservados se pueden hacer en uno o más restos aminoacídicos predichos, preferiblemente no esenciales. Un resto aminoacídico "no esencial" es un resto que puede estar alterado de la secuencia de IFN-\beta salvaje sin alterar su actividad biológica, mientras que un resto aminoacídico "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservado" en una en la que el resto de aminoácido es reemplazado por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en el estado de la materia familias de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Tales sustituciones no se podrían hacer para restos de aminoácidos conservados, o para restos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado.
Alternativamente, las secuencias nucleotídicas del variante de IFN-\beta se pueden hacer introduciendo mutaciones al azar a lo largo de todo o parte de una secuencia codificante de IFN-\beta, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden escrutar para la actividad biológica del IFN-\beta para identificar mutantes que conservan la actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada de forma recombinante, y la actividad de la proteína se puede determinar usando técnicas de ensayo clásicas descritas en la presente memoria.
Los variantes de IFN-\beta biológicamente activos generalmente tendrán al menos 80%, más preferiblemente aproximadamente 90% a aproximadamente 95% o más, y lo más preferiblemente aproximadamente 96% a aproximadamente 99% o más de identidad de secuencia aminoacídica con el polipéptido de IFN-\beta de referencia que sirve de base para la comparación, por ejemplo IFN-\beta natural humano. Por "identidad de secuencia" se pretende que los mismos restos aminoacídicos se encuentren dentro del polipéptido variante y la molécula de polipéptido que sirve como referencia cuando se alinea y compara un segmento continuo y específico de la secuencia aminoacídica del variante con la secuencia aminoacídica de la molécula de referencia.
Para propósitos de alineación óptima de las dos secuencias para los propósitos de determinación de identidad de secuencia, el segmento contiguo de la secuencia aminoacídica del variante puede tener restos aminoacídicos adicionales o restos aminoacídicos delecionados con respecto a la secuencia aminoacídica de la molécula de referencia. El segmento contiguo usado para la comparación con la secuencia aminoacídica de referencia comprenderá al menos 20 restos aminoacídicos contiguos. Las correcciones para la identidad de secuencia aumentada asociadas con la inclusión de espacios en la secuencia aminoacídica del variante se pueden hacer asignando una penalización de espacio. Los métodos para la alineación de secuencia son bien conocidos en le estado de la técnica.
Por ello, la determinación del porcentaje de identidad entre cualquiera de dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante preferido de algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) Comput. Appl. Biosci., 4:11-7. Tal algoritmo se utiliza en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de la alineación GCG. Se puede usar con el programa ALIGN una tabla PAM120 de peso residual, una penalización de longitud de espacio de 12, y una penalización de espacio de 4 cuando se comparan secuencias aminoacídicas. Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático para uso en la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado dentro de los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsquedas de secuencias aminoacídicas por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, marca=50, longitud de palabra=3, para obtener una secuencia aminoacídica similar al polipéptido de interés. Para obtener alineaciones espaciadas con propósitos comparativos, se puede utilizar BLAST espaciado tal como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389-3402. Alternativamente, se puede usar PSI-BLAST para realizar una búsqueda integrada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) más arriba. Cuando se usan programas BLAST, BLAST espaciada, o PSI-BLAST, se puede usar el parámetro por defecto. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Véase también el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Supl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) y programas en el Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 (disponible por Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), por ejemplo, el programa GAP, donde se utilizan los parámetros de los programas por defecto.
Cuando se considera el porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica, algunas posiciones de restos de aminoácidos pueden diferir como resultado de sustituciones de aminoácidos conservados, que no afectan a las propiedades de función de la proteína. En estos casos, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse al alza para explicar la similitud en aminoácidos sustituidos de forma conservada. Tales ajustes son bien conocidos en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, Myers y Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-7.
Los variantes de IFN-\beta biológicamente activos abarcados por la invención también incluyen polipéptidos de IFN-\beta que se han unido de forma covalente con, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o albúmina. Estas moléculas covalentes híbridas de IFN-\beta poseen ciertas propiedades farmacéuticas deseables tales como una semi-vida sérica extendida tras administración al paciente. Los métodos para crear aductos PEG-IFN implican modificación química de monometoxipolietilenglicol para crear un compuesto activado que reaccionará con IFN-\beta. Los métodos para hacer y usar polipéptidos unidos a PEG se describen, por ejemplo en Delgado et al. (1992) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 9:249-304. Los métodos para crear polipéptidos de fusión de albúmina implican la fusión de secuencias codificantes para el polipéptido de interés (por ejemplo, IFN-\beta) y la albúmina y se describen en la Patente de EE.UU. No. 5.876.969. Estas moléculas híbridas de IFN-\beta reaccionarán con las impurezas presentes en el manitol USP y serán más estables cuando se formulan con manitol altamente purificado.
Los variantes de IFN-\beta biológicamente activos abarcados por la invención deben conservar las actividades de IFN-\beta, particularmente la capacidad de unirse a receptores de IFN-\beta. En algunas realizaciones, el variante de IFN-\beta conserva la capacidad al menos aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 95%, aproximadamente 90%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de la actividad biológica del polipéptido de IFN-\beta de referencia, por ejemplo IFN-\beta natural humano. También se abarcan los variantes de IFN-\beta cuya actividad está aumentada en comparación con la actividad del polipéptido de IFN-\beta de referencia. La actividad biológica de los variantes de IFN-\beta se puede medir por cualquier método conocido en el estado de la técnica. Ejemplos de tales ensayos se pueden encontrar en Fellous et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:8382-3086; Czerniecki et al. (1984) J. Virol. 49(2):490-496 ; Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5666; Branca et al. (1981) Nature 277:221-223; Williams et al. (1979) Nature 282:582-586; Herberman et al. (1979) Nature 277:221-223; Anderson et al. (1982) J. Biol. Chem. 257(19):11301-11301; y el ensayo de potencia del IFN-\beta descrito en la presente memoria (véase el Ejemplo 2).
El IFN-\beta de las formulaciones de la invención puede ser de cualquier especie animal incluyendo, pero no limitándose a, aviar, canina, bovina, porcina, equina, y ser humano. Preferiblemente, el IFN-\beta es de una especie de mamífero cuando la formulación se usa en el tratamiento de una enfermedad de IFN-\beta en mamífero, y más preferiblemente es de un mamífero de la misma especia que el mamífero que sufre el tratamiento para tal enfermedad.
Ejemplos no limitantes de polipéptidos de IFN-\beta y polipéptidos variantes de IFN-\beta abarcados por la invención se muestran en Nagan et al. (1980) Nature 284:316-320; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411-416; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731-741; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848-2852; EP028033B1 y EP109748B1. Véanse también las Patentes de EE.UU. Nos. 4.518.584; 4.569.908; 4.588.585; 4.738.844; 4.753.795; 4.769.233; 4.914.033; 4.959.314; 5.545.723; y 5.814.485. Estas citas también proporciona una guía que considera restos y regiones del polipéptido de IFN-\beta que pueden ser alterados sin pérdida de actividad biológica.
En una realización de la presente invención, el IFN-\beta dentro de las formulaciones farmacéuticas estabilizadas es el polipéptido de IFN-\beta natural maduro. En otra realización; el IFN-\beta de estas formulaciones es el polipéptido de IFN-\beta maduro donde la cisteína encontrada en el aminoácido 17 de la secuencia natural madura está reemplazada por serina tal como se discute más arriba. Sin embargo, la presente invención abarca otras realizaciones donde el IFN-\beta dentro de la formulación farmacéutica estabilizada es cualquier polipéptido de IFN-\beta biológicamente activo o un variante como se describe en la presente memoria.
El algunas realizaciones de la presente invención, el IFN-\beta se produce de forma recombinante. Por "IFN-\beta producido de forma recombinante" es el IFN-\beta que tiene actividad biológica comparable al IFN-\beta natural maduro y que ha sido preparado por técnicas de ADN recombinante. El IFN-\beta puede ser producido cultivando una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de IFN-\beta. La célula hospedadora es una que puede transcribir la secuencia nucleotídica y producir la proteína deseada, y puede ser procariota (por ejemplo, E. coli) o eucariota (por ejemplo levadura, célula de insecto o de mamífero). Ejemplos de la producción recombinante del IFN-\beta se dan en Mantei et al. (1982) Nature 297:128; Ohno et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:967; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y la Patente de EE.UU. No. 4.463.940; 5.702.699, y 5.814.485. Véase también la Patente de EE.UU. No. 5.795.779, donde el IFN-\beta-1a se produce de forma recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO). Los genes del interferón humano han sido clonados usando la tecnología del ADN recombinante ("ADNr") y han sido expresados en E. coli (Nagora et al. (1980) Nature 284:316; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411 ; Yelverton et al. (1981) Nuc. Acid Res. 9:731; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848). Alternativamente, el IFN-\beta puede ser producido por un animal o planta transgénicos que han sido manipulados genéticamente para expresar la proteína de IFN-\beta de interés según los métodos conocidos en el estado de la técnica.
Alternativamente, el IFN-\beta puede ser sintetizado químicamente, por cualquier técnica conocida por aquellos expertos en la materia en la técnica de péptidos. Véase, por ejemplo, Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:2216-2220, Steward y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois), y Baraney y Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, ed. Gross y Meinhofer, Vol. 2 (Academic Press, Nueva York, 1980), págs. 3-254, que discuten técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y Bodansky (1984) Principles of peptide Síntesis (Springler-Verlag, Berlin) y Gross y Meinhofer, eds. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 (Academic Press, Nueva York), que discuten las síntesis clásica en solución. El IFN-\beta también puede ser preparado químicamente por el método múltiple de síntesis simultánea de péptidos. Véase, por ejemplo, Houghten (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135; y la Patente de EE.UU. No. 4.631.211.
Las composiciones abarcadas por la invención pueden tener tan poco como aproximadamente 0,01 mg/ml de IFN-\beta y tanto como aproximadamente 15 mg/ml de IFN-\beta (peso / volumen). En varias realizaciones, el IFN-\beta está presente en una concentración de aproximadamente 0,015 mg/ml a aproximadamente 12,5 mg/ml, aproximadamente 0,025 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 0,075 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 0,125 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 0,175 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,3 mg/ml, y aproximadamente 0,25 mg/ml.
En algunas realizaciones, las formulaciones de la invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un vehículo que se usa convencionalmente en el estado de la técnica para facilitar el almacenamiento, la administración y/o el efecto curativo de los ingredientes terapéuticos. Un vehículo también puede reducir cualquier efecto secundario indeseable del IFN-\beta. Un vehículo adecuado debe ser estable, es decir, incapaz de reaccionar con otros ingredientes de la formulación. No debe producir efectos adversos locales o sistémicos significativos en los envases en las posologías y concentraciones empleadas para el tratamiento. Tales vehículos generalmente son conocidos en el estado de la técnica. Vehículos adecuados para esta invención son grandes macromoléculas estables que se usan de forma convencional tales como albúmina, gelatina, colágeno, polisacárido, monosacáridos, polivinilpirrolidona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, aminoácidos poliméricos, aceites de fijación, oleato de etilo, liposomas, glucosa, sacarosa, lactosa, manosa, dextrosa, dextrano, celulosa, sorbitol, polietilenglicol (PEG), y similares. También pueden ser adecuados vehículos de liberación lenta tales como ácido hialurónico. Véase particularmente Prisell et al. (1992) Int. J. Pharmaceu. 85:51-56, y la Patente de EE.UU. No. 5.166.331. Otros componentes aceptables en la composición incluyen, pero no se limitan a, agentes farmacéuticamente aceptables que modifican la isotonicidad, que incluyen agua, sales, azúcares, polioles, aminoácidos, y tampones. Ejemplos de tampones adecuados incluyen fosfato, citrato, succinato, acetato, y otros ácidos orgánicos o sus sales y sales que modifican la tonicidad tales como cloruro sódico, fosfato sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, y también pueden incluir los tampones arriba enumerados.
En algunas realizaciones de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es albúmina humana. La albúmina humana puede se albúmina humana natural o albúmina humana producida de forma recombinante; estas dos formas son denominadas colectivamente en la presente memoria como "albúmina humana". Las formulaciones abarcadas por la invención pueden tener tan poco como aproximadamente 0,01% de albúmina humana y tanto como aproximadamente 15% de albúmina humana (peso/volumen). En varias realizaciones, la albúmina humana está presente en una concentración de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 12,5%, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 9%, aproximadamente 0,25% a aproximadamente 8%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 7%, aproximadamente 0,6% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,7% a aproximadamente 1,75%, aproximadamente 0,75% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1,2% a aproximadamente 1,3%, y aproximadamente 1,25%.
La composición farmacéutica adicionalmente puede comprender un agente solubilizante o potenciador de la solubilidad. Los compuestos que contienen un grupo guanidinio, más preferiblemente arginina, son potenciadores de solubilidad adecuados para el IFN-\beta. Ejemplos de tales potenciadores de solubilidad incluyen el aminoácido arginina, así como análogos aminoacídicos de la arginina que conservan la capacidad de potenciar la solubilidad del IFN-\beta. Tales análogos incluyen, sin límite, dipéptidos y tripéptidos que contienen arginina. Agentes solubilizantes adicionales adecuados se describen en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.816.440; 4.894.330; 5.004.605; 5.183.746; 5.643.566; y en Wang et al. (1980) J. Parenteral Drug Assoc. 34:452-462.
Ejemplos no limitantes de agentes solubilizantes abarcados por la presente invención incluyen agentes tensioactivos (detergentes) que tienen un equilibrio hidrofóbico-hidrofílico adecuado para solubilizar el IFN-\beta. Se pueden usar agentes tensioactivos aniónicos fuertes naturales o sintéticos tales como sales de ácidos grasos de metales alcalinos y sulfatos de alquilo de metales alcalinos. Tales agentes normalmente contendrán 10 a 14 átomos de carbono. Agentes solubilizantes particularmente preferidos son dodecil sulfato sódico (SDS, de sus siglas en inglés) y laurato sódico. Ejemplos de otros agentes solubilizantes que se pueden usar en composiciones de la invención incluyen pero no se limitan a dodecil sulfonato sódico, decil sulfato sódico, tetradecil sulfato sódico, tridecil sulfonato sódico, miristato sódico, caproilato sódico, dodecil N-sarcosinato sódico, y tetradecil N-sarcosinato sódico. La estabilización clásica de fármacos por agentes tensioactivos o emulsificantes se describe, por ejemplo, en Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3):160-165. Agentes tensioactivos adicionales adecuados se describen en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.507.281; 4.816.440; y 5.183.746.
Además de esos agentes descritos más arriba, se pueden añadir otros agentes estabilizantes, tales como ácido etilendiamiotetraacético (EDTA) o una de sus sales tales como EDTA disódica, para potenciar de forma adicional la estabilidad de las composiciones farmacéuticas líquidas. El EDTA actúa como depurador de iones metálicos que se conoce por catalizar muchas reacciones de oxidación, proporcionando así un agente estabilizante adicional.
Cuando la formulación de IFN-\beta se usa para disposición a un mamífero tal como un ser humano, también se considera la isotonicidad de la composición. Por ello, en una realización, la composición para una solución inyectable de IFN-\beta proporcionará la misma isotonicidad que, o similar, al suero o fluidos corporales del paciente. Para lograr la isotonicidad, se puede añadir a la solución, en una concentración adecuada, una sal, tal como cloruro sódico, potasio, cloro, o tampón fosfato.
También se considera el pH de la formulación. Las formulaciones estabilizadas de IFN-\beta de la invención tienen un pH en un intervalo de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0. Intervalos de pH adecuados incluyen, por ejemplo, aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,8, aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,6, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,4, aproximadamente 6,8 a aproximadamente 8,2, aproximadamente 6,9 a aproximadamente 8,0, aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6, y aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,5.
Una cantidad farmacéuticamente eficaz de una formulación estabilizada de IFN-\beta líquida, o una formulación farmacéutica estabilizada liofilizada reconstituida de IFN-\beta de la invención es administrada a un individuo. Por "cantidad farmacéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que es útil en el tratamiento, prevención, o diagnóstico de una enfermedad o condición. Las rutas típicas de administración incluyen, pero no se limitan a, administración oral, liberación nasal, liberación pulmonar, y administración parenteral, que incluye inyección o infusión intradérmica, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarterial, e intraperitoneal. En una realización, la administración es por inyección, preferiblemente inyección subcutánea. Las formas inyectables de las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones, y emulsiones. Típicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz del IFN-\beta comprende aproximadamente 0,01 \mug/kg a aproximadamente 5 mg/kg de la composición, preferiblemente aproximadamente 0,05 \mug/kg a aproximadamente 1000 \mug/kg, más preferiblemente aproximadamente 0,1 \mug/kg a aproximadamente 500 \mug/kg, incluso más preferiblemente aproximadamente 0,5 \mug/kg a aproximadamente 30 \mug/kg.
En una realización, la composición farmacéutica estabilizada que comprende el IFN-\beta es formulada en una posología única y puede ser en una forma inyectable o de infusión tal como solución, suspensión o emulsión. Además, se puede almacenar congelada o preparada en forma seca, tal como polvo liofilizado, que puede ser reconstituido dentro de la solución, suspensión o emulsión líquida antes de la administración por cualquiera de los métodos varios que incluyen rutas de administración oral o parenteral. La composición farmacéutica estabilizada puede ser esterilizada por filtración por membranas y se almacena en envases de una sola dosis o multi-dosis tal como viales o ampollas selladas. Se pueden usar métodos adicionales para formulas una composición farmacéutica conocidos generalmente en el estado de la técnica para potenciar de forma adicional la estabilidad de almacenamiento de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria siempre y cuando no afecten de forma adversa a los efectos beneficiosos del manitol altamente purificado tal como se describe. Una discusión más amplia de formulación y selección de vehículos, estabilizantes, etc, farmacéuticamente aceptables se puede encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18ª ed., Mack Pub. Co., Eaton, Pensilvania).
En algunas realizaciones, las composiciones líquidas de la invención se envasan en una jeringa (la jeringa "pre-cargada" de la invención). En una realización, la jeringa pre-cargada que comprende una composición de la invención luego puede ser congelada. Esta jeringa pre-cargada congelada es útil para propósitos de almacenamiento o transporte.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como modo de ilustración y no como modo de limitación.
Experimentos
Ejemplo 1 Desarrollo de una Formulación Farmacéutica de IFN-\beta con Estabilidad Aumentada I. Introducción
Las formulaciones farmacéuticas de INF-\beta que contienen dextrosa como excipiente principal son conocidas en el estado de la técnica. Cuando tales formulaciones se incuban a una temperatura de 37ºC o más, la dextrosa de estas formulaciones forma aductos covalentes con el INF-\beta que pueden ser detectados por RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa). El INF-\beta formulado con manitol USP no forma aductos detectables por RP-HPLC en las mismas condiciones. Sin embargo, el manitol USP contiene impurezas que se combinan con el INF-\beta para formar especies de aductos detectados por espectrometría de masas en electropulverizado. La naturaleza de las impurezas en el manitol USP es desconocida. La formación de estos aductos (o productos de degradación) se considera farmacéuticamente indeseable e incluso farmacéuticamente inaceptable, ya que las directrices actuales para los fármacos basados en polipéptidos enfatizan la importancia de minimizar la formación de productos de degradación en las formulaciones. Los productos de degradación se consideran indeseables o inaceptables porque aumentan el riesgo de que el fármaco basado en polipéptidos cause efectos secundarios indeseados. Esto es el nuevo descubrimiento de la presente invención, que el INF-\beta muestra estabilidad aumentada cuando se formula con manitol que está altamente purificado de forma que su actividad reductora es menos de 20 partes por millón en comparación cuando se formula con manitol que no está altamente purificado. El descubrimiento adicional de la presente invención es que la purificación de manitol USP por extracción con metanol, tratamiento con carbón, ultrafiltración y recristalización da como resultado una preparación de manitol con una actividad reductora de menos de 20 partes por millón.
II. Métodos
El INF-\beta-1b para uso en estos experimentos se produjo en E. coli esencialmente como se describe en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.462.94. y 5.702.699. El dodecil sulfato sódico y las sales se separaron del INF-\beta por cromatografía; y el INF-\beta-1b se combinó con una solución de albúmina humana a un pH de 11,5-12,0; el pH de la solución se ajustó a 7,5 con HCl; y se añadió una solución que contiene el excipiente (manitol o dextrosa) para hacer la concentración final a 1,25%. La concentración final de albúmina humana en la formulación fue de 1,25% p/v.
El INF-\beta-1b de estas formulaciones se preparó para espectrometría de masas por RP-HPLC. Este método permite la cuantificación de INF-\beta-1b glicosilado tras resolverlo como un pico separado (B1) en el cromatograma. El límite de detección para INF-\beta-1b glicosilado con este método es de 0,02 mg/ml. Cuando la cantidad de este pico es menos de 0,02 mg/ml, las dos áreas de pico se suman y comparan con un INF-\beta no formulado de referencia para obtener el contenido total de INF-\beta-1b. Cuando el área de pico es mayor de 0,02 mg/ml, su concentración se determina independientemente y se describe.
Para el análisis se usó el siguiente equipo y sus respectivos manuales de instrucciones del fabricante.
Sistema de Liberación de Disolvente: Bomba de Gradiente Waters 626
Sistema de Inyección: Bucle de inyección de 200 ml Autocargador Waters 717 plus
Viales de autocargador de polipropileno con empaquetado de Teflón
Conjunto de control de temperatura del autocargador refrigerado a 4ºC
Acetonitrilo al 84% usado como lavado de agujas
Calentador de columna: Waters 600
Conjunto de calentador de columna a 40ºC.
Columna: columna RP C4 de Butilo de Poro Ancho BAKERBOND, 300ª 5 \mum, 4,6 mm (ID) 250 mm, J.T Baker número de parte 22010.
La columna se conecta en la dirección de flujo del disolvente, tal como se indica en la etiqueta de la columna, y se coloca en un calentador de columna.
Detector: Detector UV Waters 486.
La longitud de onda se coloca a 214 nm.
La entrada del sistema de datos no está atenuada.
Sistema de Datos: Sistema de Datos P.E. Nelson Turbochrom
Las muestras de la formulación de INF-\beta liofilizado se reconstituyeron con 1,20 ml de cloruro sódico al 0,54%, se pusieron al revés para mezclar, e incubaron a temperatura ambiente durante 30\pm15 minutos. El calibrador es un INF-\beta de referencia no formulado. La solución reserva calibradora se diluye a aproximadamente 0,5 mg/ml, y la concentración de la solución calibradora diluida se determina por absorbancia UV (media de 6 replicados). La concentración final de la solución calibradora diluida es la media de las lecturas de absorbancia UV dividida por 1,7 (el coeficiente de extinción del INF-\beta-1b). La concentración de la solución calibradora diluida se determina por absorbancia en 3 figuras significativas. La solución calibradora luego se diluyó a 0,25 mg/ml para uso como solución calibradora de trabajo.
El autocargador se programó para inyectar 20 \mul por inyección a intervalos de 70 minutos. El intervalo de voltaje del sistema de datos fue 1 voltio, el ritmo de muestras fue 1 punto por segundo, y el tiempo de adquisición fue de 70 minutos. El Eluyente A fue TFA al 1% (ácido trifluoroacético, grado HPLC), y el Eluyente B fue acetonitrilo al 84% (grado HPLC) y TFA al 0,084% (grado HPLC). El ritmo de flujo del eluyente se colocó a 1,0 ml/minuto (70% del Eluyente A y 30% del Eluyente B), y la columna se equilibró durante una hora. Tras equilibrar el recuento base del detector y el sistema, se analizó un gradiente en blanco. El análisis empezó cuando no hubo picos significativos presentes en el segundo gradiente en blanco.
La concentración de INF-\beta se determina a partir de la suma del área de los picos que corresponden al INF-\beta no modificado (el pico "B") y al INF-\beta glicosilado (el pico "B1"). Por ejemplo, cuando la solución calibradora es INF-\beta no formulado a 0,25 mg/ml, la concentración de INF-\beta (mg/ml)=(área B1+ B total del pico de la muestra de ensayo/área B1+B total del pico del calibrador) x 0,25 mg/ml.
Los datos del espectro de masas por electropulverizado (ES-MS) se obtuvieron usando fracciones de esta cromatografía. Se recogieron las fracciones de cada pico y se concentraron antes del análisis. Los espectros de masa por electropulverizado se obtuvieron usando un espectrómetro de masas simple-cuádruple API 100 (Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Notario, Canada) interconectado a una bomba de jeringa Harvard (Harvard Apparatus, South Natick, MA) y un inyector Rheodyne 8125 con una tubería de sílice100 \muM fusionada. Los espectros de masas se grabaron en el modo positivo por escrutinio de un intervalo de relación masa/carga (m/z) de 140 a 2500 a 6 s/escáner usando un tamaño de etapa de 0,2 Da. El espectrómetro de masas se calibró usando una mezcla de polipropilenglicol que contiene PPG 3,3 x 10^{-5} M, PPG 1000 425,1 x 10^{-4} M y PPG 2000 2 x 10^{-4} M (Aldrich Chemical Co.) en agua:metanol:ácido fórmico 50:50:0,1 (v:v:v) que contiene acetato amónico 2 mM. Se introdujo una alícuota de la solución proteica (20-50 pM en 2 \mul) dentro de la fuente iónica del espectrómetro de masas en agua:acetonitrilo:ácido acético 49:40:1 a 2\muL/min. Mientras las proteínas se introducen en la fuente iónica a bajo pH, los sitios básicos (por ejemplo, átomos de nitrógeno en las cadenas laterales de los restos de arginina, lisina, e histidina) se protonan en grados variables dando como resultado iones moleculares con múltiples estados de carga, por ejemplo [M+H]^{+},
[M+2H]^{2+}, dependiendo del número de sitios accesibles para la protonización. Los registros del detector de las relaciones m/z de los iones moleculares en los variados estados de carga y en los espectros de masas se pueden simplificar usando un software Biotoolbox (Perkin-Elmer Sciex Instruments) para obtener la masa molecular de la proteína. La exactitud de la masa de la medida de la masa molecular a 20 kDa estaba dentro de 2 kDa.
La actividad reductora del manitol se determinó por una modificación del protocolo USP. El protocolo mide la reducción de Cu^{2+} en solución alcalina en presencia de ácido bicinconínico (BCA, Pierce, preparado según las instrucciones del fabricante). El BCA se acompleja con Cu^{2+}, y este complejo tienen un color azul con un pico de absorbancia (A) a 562 nm.
Se probaron dos muestras de manitol (500 \mul de una solución de manitol 150 mg/ml) para cada condición. La curva clásica se generó usando diluciones seriadas de una solución de glucosa con actividad reductora conocida. Se añadieron 500 \mul de la solución de BCA preparada a cada muestra de prueba, muestra estándar, y blanco y se incubaron a 60ºC durante 40 minutos. Los estándares de glucosa se ajustaron a una curva lineal, se calculó y la actividad reductora de las muestras de ensayo de manitol (en ppm) como ((A_{562} de muestra de manitol/pendiente de curva estándar)/(contenido en manitol en mg/ml) (1000)) x 10^{6}.
III. Resultados y Discusión
La glicosilación se detectó en la formulación de dextrosa usando espectrometría de masas como múltiplos de 162 Daltons añadidos a la masa molecular del IFN-\beta-1b. El análisis de los péptidos de IFN-\beta-1b ha sugerido que estos aductos son resultado de la reacción de azúcares reductores con restos de lisina de proteínas (reacciones Amadori). La Figura 1 compara el cromatograma RP-HPLC de la masa formulada de la formulación de dextrosa con la formulación liofilizada almacenada a 50ºC durante 1 semana. Las figuras muestran que el IFN-\beta-1b en la formulación de dextrosa reacciona fácilmente a 50ºC para producir el pico B1 en el estado liofilizado. El ES-EM de la masa liofilizada (Figura 2) no tiene picos asociados con aductos de glucosa (mas 162). Por el contrario, los espectros de masas de la formulación de dextrosa incubada liofilizada (Figura 3) muestran modificación amplia. Así, la glucosa reacciona con el IFN-\beta-1b para formar especies que son detectadas por RP-HPLC cuya estructura se confirma por ES-MS.
Por el contrario, una formulación de IFN-\beta-1b hecha con manitol USP no forma especies que son detectables por RP-HPLC como pico B1. La Figura 4 compara la masa de manitol formulada con la formulación liofilizada mantenida durante 7 días a 50ºC. Claramente, no se formó el pico B1. Sin embargo, el espectro de masas de la masa formulada en la Figura 5 muestra la presencia de un pico a 20040, y el espectro de masas de la formulación de manitol incubada liofilizada en la Figura 6 tiene un nuevo pico a 20201. La cantidad de aductos formados con manitol no pueden ser cuantificada por ES-MS; sin embargo, normalmente, las señales de los aductos están cerca del límite de detección del instrumento. El mecanismo de formación de estos picos no se conoce. La reacción del manitol con IFN-\beta-1b no forma especies como las especies formadas con dextrosa o glucosa; no se forma pico B1. Por ello, los datos indican que es necesaria una forma más pura de manitol para prevenir la formación de aductos de IFN-\beta-1b.
El manitol que ha sido extraído con metanol para reducir las impurezas después se ensayó para sus efectos sobre la estabilidad del IFN-\beta-1b. El IFN-\beta-1b se formuló con tres lotes diferentes de manitol extraído con metanol, y las muestras de ensayo de la masa formulada y del envase final se ensayaron usando los ensayos de RP-HPLC y ES-MS descritos más arriba. La Figura 7 muestra el espectro de masas del IFN-\beta-1b formulado con manitol no tratado, y la Figura 8 muestra el espectro de masas del IFN-\beta-1b formulado con el mismo lote de manitol que se purificó con metanol. Los tres lotes de manitol mostraron un patrón similar. La Figura 17 muestra que el tratamiento con metanol elimina más de la mitad de la actividad reductora. Claramente, el tratamiento con metanol elimina las impurezas que forman complejos con el IFN-\beta-1b, pero algunas no son eliminadas completamente por este tratamiento.
Para reducir las impurezas restantes en el manitol, se añadieron tres etapas adicionales al proceso de purificación. Estas etapas adicionales son tratamiento con carbón, ultrafiltración, y recristalización. Se analizaron tres lotes de manitol extraído con metanol, tratados con carbón, ultrafiltrados y recristalizados como se describe más arriba. El ensayo de reducción de actividad por colorimetría demostró que las etapas adicionales de purificación disminuyeron el contenido de actividad reductora a aproximadamente 10 ppm (véase Figura 17, muestras 7-9). Se preparó una formulación con el manitol altamente purificado. Un espectro de masas de la formulación preparada con el manitol altamente purificado (Figura 9) no reveló picos adicionales que no estaban presentes en la masa formulada preparada sin manitol y probada el mismo día que el control negativo (Figura 10). También se probó el mismo día como control positivo un espectro de masas de una formulación preparada con manitol USP (Figura 11). Por ello, el tratamiento adicional del manitol rinde un producto que tiene baja actividad reductora y no parece que reaccione con IFN-\beta-1b por ES-MS.
Ejemplo 2 Estabilidad de Formulaciones de IFN-\beta que comprenden Manitol Altamente Purificado: Estudio Acelerado a Corto Plazo I. Introducción
Las formulaciones experimentales del IFN-\beta-1b se prepararon con dextrosa y manitol, tal como se describe más arriba, y se llevó a cabo un estudio de estabilidad acelerada para comparar estas formulaciones. La estabilidad de las formulaciones se ensayó en dos condiciones diferentes. La primera fue someter la formulación a estrés por alta temperatura, y la segunda fue medir la estabilidad en almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente. No se detectaron cambios en la formulación que comprende manitol altamente purificado tras almacenamiento a 25ºC durante 3 meses, y la potencia de la formulación permaneció esencialmente sin cambios tras almacenar a 37ºC durante 3 meses o a 50ºC durante 1 mes.
II. Métodos
Se almacenaron muestras de cada formulación a 8ºC, 25ºC, o 37ºC durante 3 meses. Además, en el punto temporal de dos meses, se tomaron muestras de cada temperatura y se almacenaron a 50ºC durante un mes adicional. El propósito del cambio a 50ºC fue el de exacerbar los cambios potenciales que pueden haberse dado en los dos primeros meses de almacenamiento y así permitir una mejor determinación de cómo la colocación a 25ºC y 37º C durante 2 meses predispone el producto a una degradación más rápida cuando se devuelve a la temperatura de almacenamiento original de 8ºC.
La actividad específica del IFN-\beta-1b se ensayó como sigue. Se obtuvieron células de carcinoma de pulmón humano A549 (ATCC CCL 185) y virus de la encefalomiocarditis de múrido, cepa EMC (ATCC VR-129B) a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Las muestras de la formulación se reconstituyeron con 1,2 ml de diluyente (NaCl al 0,54%), diluido en serie en Medio de Crecimiento/Ensayo, y se añadieron a una placa de ensayo de 96 pocillos junto con controles de IFN-\beta-1b. El volumen del IFN-\beta diluido en cada pocillo fue de 100 \mul. Se añadieron células A549 en Medio de Crecimiento/Ensayo (MEM de Eagle con sales de Earle y bicarbonato sódico 2,2 g/l, Suero Fetal Bovino al 8,9%, L-glutamina 1,79 mM, penicilina 89 U/ml, 89 \mug de estreptomicina/ml) a una concentración de 1 x 10^{4}] células/pocillo. Luego, la placa se incubó en un incubador humidificado a 37º \pm 2ºC, CO_{2} al 5 \pm 1%. Al final de la incubación, las células se infectaron con virus EMC a un multiplicidad de infección de entre 5 y 16. Las placas se incubaron durante 24 \pm 1 horas en un incubador humidificado a 37º \pm 2ºC, CO_{2} al 5 \pm 1%. Las células se tiñeron con MTT precalentado (37ºC) (Bromuro de 3-[4,5 Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio, 5 mg/ml, 50 \mul/pocillo), y se incubaron como antes durante 3,5 a 4,5 horas. El medio se aspiró de las células, y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de solución de tinción solubilizante (2-propanol al 81% v/v, dodecil sulfato sódico al 3% p/v, HCl 0,04 N). Luego, las placas se incubaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, las placas se agitaron durante 8 \pm 3 minutos en un agitador de microplacas. Finalmente, se midió la absorbancia de cada pocillo a 570 nm en un espectrofotómetro de microplacas. Los controles de actividad de la actividad del IFN-\beta se ajustaron a una curva de regresión lineal, y las actividades de las muestras del ensayo se determinaron a partir de esta curva. La actividad específica de cada muestra se calculó basada en la masa de muestra usada.
El análisis de RP-HPLC de la concentración del IFN-\beta-1b se llevó a cabo tal como se describe más arriba. La formación de aductos también se monitorizó en transferencias Western de SDS-PAGE con un aumento aparente en el peso molecular de la banda del IFN-\beta-1b.
III. Resultados y Discusión
La potencia (actividad específica) de las formulaciones de manitol permaneció esencialmente sin cambios durante el estudio, mientras que la de las formulaciones de dextrosa aumentó. La exposición a temperaturas de 37º C durante 1 mes no tuvo efecto sobre la potencia (Véanse Figuras 14 y 15). Para la formulación de IFN-\beta-1b con manitol, la cantidad de IFN-\beta-1b glicosilado permaneció por debajo del límite de detección durante la duración del estudio, incluso a 50ºC. Por el contrario, se detectó glicosilación en la formulación de dextrosa tras 2 meses a 37ºC y tras 2 semanas a 50ºC. La extensa glicosilación modificó demasiado el cromatograma para medir el contenido total de IFN-\beta-1b. La formación de aductos en la formación de dextrosa también se detectó en las transferencias Western de SDS-PAGE tras almacenamiento de 2 meses a 37ºC o almacenamiento de 1 mes a 50ºC, pero no tras el almacenamiento de 3 meses a 25ºC. Por el contrario, no se observaron cambios en la transferencia Western de SDS-PAGE para la formulación de manitol en cualquiera de las condiciones de almacenamiento.
Ejemplo 3 Estabilidad a Largo Plazo de Formulaciones del IFN-\beta que Comprenden Manitol Altamente Purificado
Se almacenaron a 4ºC, 25ºC, o 30ºC tres lotes (N006, N008, y N009) de formulaciones de IFN-\beta-1b que comprenden manitol altamente purificado y se ensayó la estabilidad a intervalos de tres meses durante un año, y a intervalos de seis meses durante un año adicional. La estabilidad se ensayó por los métodos arriba descritos.
Los tres lotes conservaron la potencia a lo largo de los veinticuatro meses a 4ºC y 30ºC. Los datos están presentados en las Figuras 14-16. Además, los tres lotes demostraron no más de 0,02 mg/ml del pico B1 (especies de IFN-\beta glicosilado) a todas las temperaturas y puntos temporales ensayados.

Claims (25)

1. Una composición que comprende IFN-\beta biológicamente activo y manitol altamente purificado, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 20 partes por millón.
2. La composición de la reivindicación 1, donde dicho manitol altamente purificado está presente en una concentración de 0,25% a 5% en peso por volumen.
3. La composición de la reivindicación 1, donde dicho IFN-\beta está presente en una concentración de 0,01 mg/ml a 15 mg/ml.
4. La composición de la reivindicación 1, donde dicha composición tiene un pH dentro de un intervalo de pH 3,0 a pH 9,0.
5. La composición de la reivindicación 1 que también comprende albúmina humana.
6. La composición de la reivindicación 5, donde dicha albúmina humana está presente en una concentración de 0,01% a 15% en peso por volumen.
7. La composición de la reivindicación 1, donde dicho IFN-\beta es IFN-\beta recombinante humano, dicho IFN-\beta recombinante humano está presente en una concentración de 0,01 mg/ml a 15 mg/ml, dicho manitol altamente purificado está presente en una concentración de 0,25% a 5% en peso por volumen, el pH de la composición es 3,0 a 9,0, y la composición adicionalmente comprende albúmina humana a una concentración de 0,01% a 15% en peso por
volumen.
8. La composición de la reivindicación 1, donde el IFN-\beta es IFN-\beta recombinante humano, dicho IFN-\beta recombinante humano está presente en una concentración de 0,05 mg/ml a 1 mg/ml, dicho manitol altamente purificado está presente en una concentración de 0,25% a 2,5% en peso por volumen, el pH de la composición es 6,8 a 8,2, y la composición adicionalmente comprende albúmina humana a una concentración de 0,25% a 2,5% en peso por volumen.
9. La composición de la reivindicación 1, donde el IFN-\beta es IFN-\beta recombinante humano, dicho IFN-\beta recombinante humano está presente en una concentración de 0,25 mg/ml, dicho manitol altamente purificado está presente en una concentración de 1,25% en peso por volumen, el pH de la composición es 7,3 a 7,5, y la composición adicionalmente comprende albúmina humana a una concentración de 1,25% en peso por volumen.
10. La composición de la reivindicación 8 que además comprende suficiente cloruro sódico para hacer isotónica la composición.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde dicha composición es un líquido, o dicha composición está liofilizada.
12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde dicho IFN-\beta biológicamente activo es el polipéptido con la secuencia aminoacídica del IFN-\beta natural maduro humano o el polipéptido con la secuencia aminoacídica del IFN-\beta natural maduro humano con un resto resto de serina en vez de un resto de cisteína encontrado en el aminoácido 17 de la secuencia del IFN-\beta natural maduro humano.
13. La composición de la reivindicación 12, donde dicho IFN-\beta está glicosilado o no glicosilado.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde dicho IFN-\beta es producido de forma recombinante.
15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 15 partes por millón.
16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 13 partes por millón.
17. Una jeringa pre-cargada que comprende la composición de la reivindicación 1.
18. La jeringa pre-cargada de la reivindicación 17, donde dicha composición está congelada.
19. Un método de producción de una formulación de IFN-\beta biológicamente activo caracterizado por estabilidad aumentada, comprendiendo dicho método producir una formulación que comprende IFN-\beta y manitol altamente purificado en una cantidad suficiente para estabilizar dicho IFN-\beta, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 20 partes por millón.
\newpage
20. El método de la reivindicación 19, que comprende las etapas de:
a)
separar el dodecil sulfato sódico y sales del IFN-\beta por cromatografía;
b)
combinan dicho IFN-\beta con una solución de albúmina humana a un pH de 11,5 a 12,0.
c)
ajustar el pH de la solución a 7,5 con HCl; y
d)
añadir una solución de dicho manitol altamente purificado.
21. El método de la reivindicación 20, que comprende además la etapa de añadir suficiente cloruro sódico para hacer isotónica la formulación.
22. El método de la reivindicación 20, comprendiendo además la etapa de liofilizar la formulación.
23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19-22, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 15 partes por millón.
24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, donde dicho manitol altamente purificado tiene una actividad reductora de menos de 13 partes por millón.
25. Una formulación producida según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 19-24.
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