ES2322819T3 - Procedimiento de purificacion de g-csf. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de purificación de factor recombinante estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), que comprende al menos una cromatografía de intercambio catiónico y al menos una cromatografía de interacción hidrofóbica, donde estos pasos de cromatografía se siguen inmediatamente unos a otros en cualquier orden de sucesión.
Description
Procedimiento de purificación de
G-CSF.
La presente invención se refiere a un
procedimiento que es para la obtención de factor recombinante
estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) y
comprende al menos una cromatografía de intercambio catiónico y al
menos una cromatografía de interacción hidrofóbica, siendo estas dos
clases de cromatografía efectuadas de manera inmediatamente
consecutiva y en cualquier orden de sucesión. La invención se
refiere en particular a un procedimiento que es para la
purificación G-CSF a partir de una mezcla de
G-CSF y otras proteínas y comprende dos pasos de
cromatografía de intercambio catiónico que son respectivamente
efectuados antes y después de una cromatografía de interacción
hidrofóbica.
El G-CSF (factor estimulador de
colonias de granulocitos) es un factor de crecimiento que se da de
manera natural y pertenece a la familia de las citoquinas en el
sentido más amplio y aquí al grupo de los factores estimuladores de
colonias. El G-CSF desempeña un papel decisivo en la
hematopoyesis y promueve la proliferación y diferenciación de
células precursas hematopoyéticas y la activación de neutrófilos.
Debido a estas propiedades, el G-CSF ha encontrado
aplicación en distintos ámbitos médicos, como p. ej. la
reconstitución de las poblaciones de células sanguíneas normales
tras quimioterapia o irradiación, o la estimulación de la respuesta
inmune frente a patógenos infecciosos. Así, el G-CSF
se aplica en la clínica principalmente en la lucha antitumoral y en
particular para el tratamiento la neutropenia sobrevenida como
consecuencia de una quimioterapia, y encuentra además utilización
también en los transplantes de médula ósea y en el tratamiento de
enfermedades infecciosas.
En su forma que se da de manera natural, el
G-CSF humano es una glicoproteína con un peso
molecular de aproximadamente 20.000 daltons y presenta cinco
residuos de cisteína. Cuatro de estos residuos forman dos puentes
disulfuro intramoleculares que son de gran importancia para la
actividad de la proteína. Puesto que el G-CSF puede
ser obtenido tan sólo en pequeñas cantidades a partir de sus fuentes
naturales, para la fabricación de fármacos se usan principalmente
formas recombinantes de G-CSF, que por ejemplo
pueden ser obtenidas mediante expresión en células de mamífero
tales como las células CHO (células de ovario de hámster chino) o en
células procarióticas tales como E. coli. Las proteínas
recombinantes que son expresadas en células de mamífero se
diferencian del G-CSF que se da de manera natural en
un distinto patrón de glicosilación, mientras que en las proteínas
que son expresadas en E. coli, las cuales como consecuencia
de la expresión bacteriana pueden presentar un adicional residuo de
metionina N-terminal, está completamente ausente la
glicosilación.
La fabricación recombinante de
G-CSF fue descrita en la literatura de patentes por
primera vez en 1987, en la WO 87/01132 A1. El primer preparado de
G-CSF comercial a base de G-CSF
recombinante fue homologado en Alemania en 1991 y es fabricado y
comercializado con el nombre comercial de Neupogen® por la firma
Amgen.
La producción de G-CSF en
células procarióticas ciertamente se prefiere a la producción en
células de mamífero, ya que pueden utilizarse sistemas de expresión
y condiciones de cultivo más sencillos, si bien en la fabricación
de proteínas recombinantes en células procarióticas un problema que
surge frecuentemente es el de la formación de agregados
intracelulares poco solubles de formas desnaturalizadas de la
proteína expresada, que son los llamados cuerpos de inclusión, que
presentan en parte una estructura secundaria y pueden encontrarse
en el citoplasma de las células bacterianas.
La formación de estos cuerpos de inclusión
conduce a que las proteínas, tras el aislamiento de los cuerpos de
inclusión mediante centrifugación a velocidad moderada, deban ser
solubilizadas y renaturalizadas mediante medios adecuados, para
mantener su configuración activa. Por ello, la reacción de
concurrencia entre una conversión de la proteína desnaturalizada en
el correcto intermedio de plegamiento y una agregación de varias
moléculas de proteína constituye un importante factor que limita la
producción de proteína renaturalizada.
En el estado de la técnica diversos documentos
de patente se ocupan del aspecto de la solubilización y
renaturalización de proteínas obtenidas en cuerpos de inclusión. En
la EP-A-0 719 860, por ejemplo, se
describen el aislamiento y la purificación de
G-CSF, incluyendo la solubilización y el
replegamiento. Han sido descritas en los documentos
EP-A-0 512 097,
EP-A-0 364 926,
EP-A-0 219 874 y WO 01/87925 y
pueden además sacarse de la literatura científica y de las obras
estándar de la química de las proteínas técnicas generales para la
solubilización y renaturalización de proteínas desnaturalizadas.
La proteína replegada es a continuación
purificada mediante métodos cromatográficos, es decir que es
separada de otras proteínas y demás impurezas que están contenidas
tras la solubilización y renaturalización.
También se ocupa de la purificación
cromatográfica el documento WO 87/01132 A1 ya anteriormente
mencionado, en el cual fue descrita por primera vez la fabricación
de G-CSF en células huésped E. coli. Dentro
del marco de la purificación del G-CSF recombinante
se efectúa en el documento WO 87/01132 A1 en el Ejemplo 7 una
cromatografía de intercambio catiónico utilizando una columna de
CM-celulosa (CM-celulosa =
carboximetilcelulosa).
En la EP 0 719 860 A1 el G-CSF
es purificado a continuación de la solubilización y oxidación
mediante resina Dowex para la eliminación del medio solubilizante,
seguidas por una cromatografía de intercambio aniónico y una
cromatografía de intercambio catiónico. También en la EP 0 719 860
A1 se utiliza CM-Sepharose (=
carboximetil-Sepharose) (N.d.T.- o también podría
decirse en español CM-Sefarosa, o
carboximetil-Sefarosa) para la cromatografía de
intercambio catiónico.
En la WO 03/051922 A1 se describe un
procedimiento de purificación de G-CSF en el que se
efectúa una cromatografía de afinidad metálica, o dicho más
exactamente, una cromatografía por metal inmovilizado (immobilized
metal affinity chromatography, IMAC). A continuación de la
cromatografía de afinidad metálica pueden tener lugar en la WO
03/051922 una cromatografía de intercambio catiónico y/o una
filtración en gel.
En la WO 01/04154 A1 está descrito un
procedimiento de purificación de G-CSF en el que se
efectúan primeramente una cromatografía de interacción hidrofóbica
y a continuación de la misma una cromatografía en hidroxiapatita. A
continuación de la cromatografía en hidroxiapatita se efectúa una
cromatografía de intercambio catiónico.
Es una finalidad de la presente invención la de
indicar un procedimiento de purificación de G-CSF
humano recombinante biológicamente activo con el que el
G-CSF pueda ser obtenido con una pureza y un
rendimiento satisfactorios. El procedimiento debe ser además de
ejecución lo más sencilla y supervisable posible. Es deseable un
procedimiento de purificación en el que baste con tan pocos pasos
cromatográficos como sea posible, para mantener a bajo nivel la
complejidad técnica y los costes y para evitar grandes pérdidas de
proteína.
Estas y otras finalidades son alcanzadas
mediante el procedimiento que se indica en la reivindicación 1.
Están descritas en las reivindicaciones dependientes formas de
realización preferidas.
Se descubrió que con la purificación
cromatográfica de G-CSF renaturalizado mediante una
cromatografía de intercambio catiónico y una cromatografía de
interacción hidrofóbica puede alcanzarse una aceptable pureza del
G-CSF recombinante biológicamente activo con un
rendimiento satisfactorio. La pureza puede ser adicionalmente
incrementada mediante un segundo paso de cromatografía de
intercambio catiónico.
La invención se refiere con ello a un
procedimiento de purificación de G-CSF humano
biológicamente activo fabricado recombinantemente, en el que se
efectúan al menos una cromatografía de intercambio catiónico y al
menos una cromatografía de interacción hidrofóbica, teniendo lugar
estos pasos cromatográficos en cualquier orden de sucesión y
ciertamente sin que entre estos pasos tenga lugar otro paso
cromatográfico u otro paso de purificación. Así pues, la
cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía de
interacción hidrofóbica se siguen inmediatamente una a otra.
Por "G-CSF humano
biológicamente activo" se entiende según la invención que el
G-CSF purificado mediante el procedimiento según la
invención está en condiciones de promover la diferenciación y
proliferación de células precursoras hematopoyéticas y producir la
activación de células maduras del sistema hematopoyético. Por
consiguiente, el G-CSF que ha sido obtenido
mediante el procedimiento según la invención es adecuado para el
tratamiento de indicaciones en las que es ventajosa la
administración de G-CSF. Se entiende que el concepto
"G-CSF humano biológicamente activo" también
incluye a los mutantes y modificaciones de G-CSF
cuya secuencia de aminoácidos está modificada con respecto a la
secuencia de tipo salvaje, pero que presentan una actividad
biológica similar a la del G-CSF de tipo salvaje,
como se describe p. ej. en los documentos WO 01/87925 y EP 0 456
200. Esto mismo es válido para los conjugados de
G-CSF. En cuanto al G-CSF a
purificar, se trata preferiblemente de
Met-G-CSF humano, fabricado en
células E. coli.
En una forma de realización de la invención, el
procedimiento de purificación de G-CSF comprende dos
pasos de cromatografía de intercambio catiónico que son
respectivamente efectuados antes y después de la cromatografía de
interacción hidrofóbica.
En una adicional forma de realización de la
invención, el procedimiento comprende una filtración en flujo
tangencial a continuación de la única cromatografía de intercambio
catiónico, o bien, para el caso de que se efectúen más de un paso
de cromatografía de intercambio catiónico, a continuación de la
última cromatografía de interacción
catiónico.
catiónico.
En una adicional forma de realización, en el
procedimiento de purificación de G-CSF se prescinde
de la realización de una cromatografía de intercambio aniónico.
En una adicional forma de realización, en el
procedimiento de purificación según la invención se prescinde de la
cromatografía de filtración en gel.
En una adicional forma de realización de la
invención se renuncia a la realización de una HPLC (HPLC =
cromatografía de líquidos de alta resolución) preparativa. Esto
mismo es válido para la cromatografía de fase inversa, que hay que
distinguir de la cromatografía de interacción hidrofóbica según la
invención y a la cual se renuncia asimismo en lo posible en la
preparación. La HPLC de fase inversa se aplica únicamente a efectos
analíticos.
En una adicional forma de realización, dentro
del marco del procedimiento no tiene lugar cromatografía de
afinidad alguna, y en particular no se efectúa cromatografía de
afinidad de colorante, cromatografía de afinidad metálica o
cromatografía de afinidad de inmunoglubolina.
En una adicional forma de realización, dentro
del marco del procedimiento de purificación se renuncia a la
realización de una cromatografía en hidroxiapatita.
En una forma de realización preferida, el
procedimiento de purificación según la invención hace con ello uso
de únicamente dos distintos métodos de separación cromatográfica,
que son concretamente el del intercambio iónico sobre la base de la
interacción competitiva de iones cargados y el de la interacción
hidrofóbica, que se distingue por el hecho de que a altas
concentraciones salinas las regiones superficiales apolares de una
proteína se adsorben en los ligandos débilmente hidrofóbicos de una
fase estacionaria.
Hay que distinguir de esto al principio de
separación cromatográfica de la afinidad, que se basa en la
adsorción específica y reversible de una molécula en una contraparte
de fijación individual fijada a una matriz. En el caso de la
cromatografía en hidroxiapatita, que se basa en la utilización de
cristales de hidroxiapatita inorgánicos, se trata de un adicional
método de separación que se diferencia de la cromatografía de
intercambio iónico en forma de la cromatografía de intercambio
catiónico y de la cromatografía de interacción hidrofóbica.
Estos principios de cromatografía anteriormente
mencionados son también correspondientemente diferenciados en los
círculos técnicos (véase p. ej. Bioanalytik, F. Lottspeich, H.
Zorbas (Hrsg.), Heidelberg, Berlin, Spektrum Akad. Verlag
1998).
En una forma de realización preferida, la
purificación cromatográfica comprende no más de tres pasos de
cromatografía en los cuales se utilizan tan sólo dos distintos
métodos de separación cromatográfica.
Como material de partida para la purificación
cromatográfica se utiliza G-CSF renaturalizado que
debe ser llevado a una pureza que permita su utilización en forma
de una preparación farmacéutica.
La solubilización y el replegamiento de la
proteína pueden efectuarse según los métodos que son conocidos en
la técnica, p. ej. como se describe en la
EP-A-1 630 173.
El G-CSF replegado puede ser
elaborado después del replegamiento y antes del primer paso de
cromatografía, siendo dicha elaboración efectuada p. ej. por
filtración, concentración, precipitación, acidificación y/o
diálisis.
En muchos casos será ventajoso clarificar la
preparación de plegamiento antes del primer paso de cromatografía,
o sea retirar las partículas de más alto peso molecular, con
respecto a las cuales se trata ante todo de agregados proteicos que
fueron formados en el plegamiento. Esta clarificación puede
efectuarse mediante filtración en lecho profundo, en la cual sirve
de medio filtrante un apilamiento no compacto de un material
granular. Las partículas sólidas son mayores que los poros del
medio filtrante o bien son retenidas por absorción en la superficie
interior del
apilamiento.
apilamiento.
Para la filtración en lecho profundo se utilizan
preferiblemente como medio filtrante fibras de éster de celulosa.
Adecuados materiales filtrantes, así como las correspondientes
prescripciones de utilización, pueden p. ej. obtenerse de la firma
Millipore con los nombres comerciales Millistak Plus COHC y
Millistak + B1HC.
Preferiblemente, antes de la filtración en lecho
profundo se procede a acidificar la preparación de plegamiento,
para que el filtrado pueda ser utilizado de manera particularmente
eficaz directamente para la cromatografía de intercambio catiónico.
El valor pH de la preparación de plegamiento es aquí preferiblemente
ajustado a menos de 4,0, y con particular preferencia a 3,2.
Para la cromatografía de intercambio catiónico
pueden utilizarse matrices habituales de las que están a la venta
en el mercado. Dentro de una determinada gama de valores pH, debido
a su carga total positiva el G-CSF se fija a la
matriz de intercambio catiónico, mientras que la mayoría de las
sustancias contaminantes tales como ácidos nucleicos,
lipopolisacáridos y proteínas que proceden de las células huésped,
así como isómeros iónicos de G-CSF y formas
modificadas de G-CSF con otros valores pI, no se
fijan o bien pueden ser retiradas por lavado.
Aunque sin quedar limitadas a éstas, las
adecuadas matrices de intercambio catiónico incluyen a los miembros
del grupo que consta de carboximetil (CM)-celulosa,
AG 50 W, Bio-Rex 70, Carboximetil
(CM)-Sephadex, Sulfopropil
(SP)-Sephadex, Carboximetil
(CM)-Sepharose CL-6B,
CM-Sepharose HP, Hyper
D-S-Ceramic (Biosepra) y Sulfonato
(S)-Sepharose, SP Sepharose FF, SP Sepharose HP, SP
Sepharose XL, CM Sepharose FF, TSK gel SP 5PW, TSK gel
SP-5PW-HR, Toyopearl
SP-650M, Toyopearl SP-650S,
Toyopearl SP-650C, Toyopearl
CM-650M, Toyopearl CM-650S,
Macro-Prep High S Support,
Macro-Prep S Support, Macro-Prep CM
Support, etc.
Las matrices y los protocolos adecuados para la
realización de la cromatografía de intercambio catiónico puede
sacarlos el experto en la materia de las informaciones de productos
de ofertantes tales como Amersham Biosciences
(http://www.amershambiosciences.com, entretanto GE Healthcare) o
Bio-Rad
(http://www.bio-rad.com).
Preferiblemente se utilizan como matriz para la
cromatografía de intercambio catiónico matrices sulfopropílicas, y
en particular los productos SP Sepharose XL y
SP-Sepharose FF (Fast Flow), que son suministrados
por Amersham Biosciences, de Friburgo, Alemania (entretanto GE
Healthcare).
En una forma de realización preferida de la
invención en la que se efectúan dos cromatografías de intercambio
catiónico, concretamente una antes y una después de la cromatografía
de interacción hidrofóbica, se utiliza en ambos casos una matriz
sulfopropílica, y con particular preferencia en la primera
cromatografía de intercambio catiónico SP Sepharose XL y en la
segunda cromatografía de intercambio catiónico SP Sepharose FF.
Los tampones adecuados para la cromatografía de
intercambio catiónico incluyen a un tampón de maleato, malonato,
citrato, lactato, acetato, fosfato, HEPES y bicina. La concentración
del tampón está preferiblemente situada entre 10 y 100 mM, y
preferiblemente entre 20 mM y 50 mM. Para la purificación del
G-CSF el pH del tampón no debería en lo posible ser
de más de 7,0, y preferiblemente no debería ser de más de 6,5.
En una forma de realización preferida se usa
para la cromatografía de intercambio catiónico acetato sódico 20 mM
pH 5,0, que se utiliza para el equilibrado y el lavado.
Si se efectúa una segunda cromatografía de
intercambio de catiónico, se usa para el equilibrado y el lavado
preferiblemente fosfato sódico 50 mM, pH 5,4.
Tras el lavado, el G-CSF puede
ser eluido de la columna mediante una modificación, y en el caso de
la cromatografía de intercambio catiónico mediante un incremento,
del valor pH o mediante un incremento de la fuerza iónica.
La elución se provoca preferiblemente mediante
un incremento de la fuerza iónica. Si se utiliza como tampón
acetato sódico 20 mM pH 5,0, es adecuada para la elución por ejemplo
una solución de acetato sódico 20 mM pH 5,0 y NaCl 200 mM.
Las adicionales condiciones adecuadas para la
cromatografía de intercambio catiónico pueden sacarse de la
correspondiente literatura especializada, como es por ejemplo el
manual "Ion Exchange Chromatography - Principles and Methods"
de Amersham Biosciences, de Friburgo, Alemania (entretanto GE
Healthcare), 2002.
La concentración salina en el tampón de carga
para la cromatografía de intercambio catiónico debería ser lo
suficientemente baja como para permitir la fijación a la matriz,
siendo la fijación también dependiente del valor pH de la
solución.
Dentro del marco de la cromatografía de
intercambio catiónico pueden utilizarse distintos tampones para la
carga y la fijación a la matriz, como p. ej. tampones seleccionados
de entre los miembros del grupo que consta de tampones de acetato,
citrato, Tris/HCl, Tris/acetato, fosfato, succinato, malonato y
2-(N-morfolinoetanosulfonato) (MES) y otros
tampones.
Tras la carga de la columna se procede a lavar
la columna, y a continuación se procede a eluir las proteínas de la
columna. La elución puede hacerse mediante un incremento de la
fuerza iónica, lo cual se hace mediante un incremento de la
concentración salina en la solución tampón. Se ofrece como
alternativa un incremento del valor pH. Pueden además utilizarse
gradientes escalonados discontinuos, gradientes lineales o bien una
adecuada combinación de tales gradientes.
Los tampones de elución que son adecuados para
el lavado y la elución pueden ser seleccionados de entre los
miembros del grupo que consta de tampones de acetato, citrato,
Tris/HCl, Tris/acetato, fosfato, succinato, malonato y MES y otros
tampones adecuados con adición de sales tales como NaCl o KCl. La
fuerza iónica y la concentración salina por medio de las cuales se
logra la elución son dependientes del valor pH de la solución
tampón. Cuanto más alto sea el valor pH del tampón, tanto más baja
será la fuerza iónica necesaria para la elución de las proteínas de
la columna.
También la cromatografía de interacción
hidrofóbica puede efectuarse con matrices habituales. Son adecuadas
matrices tales como las de Butil-, Fenil- u
Octil-Sepharose (Amersham Biosciences, entretanto GE
Healthcare), Makro-Prep-Methyl o
t-Butyl (Bio-Rad) y Fractogel EMD
con ligandos propílicos o fenílicos (Merck).
En cuanto a los ligandos hidrofóbicos, se trata
preferiblemente de grupos butilo, fenilo u octilo, y con particular
preferencia se trata de grupos fenilo. Pueden utilizarse los
productos de Amersham Biosciences (entretanto GE Healthcare).
Matrices y protocolos adecuados para la
realización de la cromatografía de interacción hidrofóbica puede
sacarlos el experto en la materia de las informaciones de productos
de ofertantes tales como Amersham Biosciences
(http://www.amershambiosciences.com, entretanto GE Healthcare) o
Bio-Rad
(http://www.bio-rad.com).
En cuanto a la matriz, se trata preferiblemente
de Fenil Sepharose HP (High Performance), que es un producto que es
suministrado por Amersham Biosciences (entretanto GE
Healthcare).
Como tampones para la cromatografía de
interacción hidrofóbica son adecuados los tampones habituales que
se utilizan también en otras clases de cromatografía. En una forma
de realización preferida se utiliza un tampón de citrato. La
elución se efectúa ventajosamente mediante el incremento del valor
pH. Ha demostrado ser particularmente adecuado un gradiente de pH
de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente 6,0.
Las adicionales condiciones adecuadas para la
cromatografía de interacción hidrofóbica pueden sacarse de la
correspondiente literatura especializada, como es por ejemplo el
manual "Hydrophobic Interaction Chromatography - Principles and
Methods" de Amersham Biosciences, de Friburgo, Alemania,
2002.
El experto en la materia está en general al
corriente de los principios cromatográficos de los que se hace uso
en el procedimiento según la invención, estando dichos principios en
todo caso detalladamente descritos en los manuales o protocolos de
uso corriente de los ofertantes de matrices, columnas y otros medios
auxiliares para la cromatografía.
La Filtración en Flujo Tangencial (TFF) que se
efectúa dentro del marco de una forma de realización de la
invención a continuación de la purificación cromatográfica, y en
particular a continuación de la única o la última cromatografía de
intercambio catiónico, puede hacerse con sistemas y protocolos de
TFF tradicionales como los que son por ejemplo ofrecidos por las
firmas Millipore y Pall Corporation. En cuanto a la TFF, se trata
de una filtración que se hace en calidad de adicional paso de
purificación a diferencia de los precedentes pasos de purificación
de la cromatografía de intercambio catiónico y de interacción
hidrofóbica.
El G-CSF que se purifica dentro
del marco de la invención es expresado mediante tradicionales
métodos de tecnología genética en células huésped. Se trata
preferiblemente a este respecto de G-CSF humano.
Para la expresión en células E. coli están a la venta en el
mercado distintos sistemas de expresión. Es por ejemplo adecuada la
expresión de G-CSF humano bajo el control de un
promotor inducible, y por ejemplo de un promotor inducible por IPTG
(IPTG =
isopropil-\beta-D-tiogalactosido);
véanse, p. ej., Sambrook and Russel, Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, 3ª edición 2001, Coldspring Harbour Laboratory
Press, Coldspring Harbour, NY, Capítulo 15, o protocolos de
fabricante de uso corriente, como son p. ej. los de Promega o
Stratagene.
La fermentación se efectúa según protocolos
estándar como los que están descritos en la literatura de patentes
y en la literatura científica, por ejemplo en un proceso bietápico
que consta de un cultivo discontinuo y un cultivo discontinuo
alimentado.
La recolección de los llamados cuerpos de
inclusión, que contienen el G-CSF sobreexpresado en
E. coli, y la desagregación de estos cuerpos de inclusión,
están descritas en parte en la literatura de patentes sobre la que
se ha tratado anteriormente. Sin embargo, se encuentran protocolos
adecuados también en obras estándar de la química de las proteínas,
así como en manuales de laboratorio. Lo mismo es válido para la
solubilización y el replegamiento, que, como se ha expuesto
anteriormente, son objeto de diversas descripciones impresas de
patente.
La invención se refiere también a preparaciones
farmacéuticas que contienen el G-CSF obtenido según
la invención. El G-CSF obtenido puede almacenarse ya
sea en forma de liofilizado o bien en forma líquida. Dicho factor
es administrado por vía subcutánea o por vía intravenosa. Adecuadas
sustancias auxiliares en las formulaciones del
G-CSF expresado recombinantemente son por ejemplo
estabilizadores tales como azúcares y alcoholes de azúcar,
aminoácidos y agentes tensioactivos como p. ej. polisorbato 20/80,
así como adecuadas sustancias tampón. Ejemplos de formulaciones
están descritos en los documentos EP 0 674 525, EP 0 373 679 y EP 0
306 824; véanse también los productos comerciales Neupogen® y
Granocyte en la LISTA ROJA 2004.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos siguientes están destinados a
aclarar la invención sin limitarla.
El G-CSF humano fue expresado en
células E. coli bajo el control de un promotor inducible por
IPTG. Ejemplos de adecuados sistemas de expresión pueden p. ej.
sacarse del manual de laboratorio Sambrook y Russell, Molecular
Cloning - A Laboratory Manual, 3ª edición 2001, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Capítulo 15, o de
protocolos de fabricante de uso corriente, como p. ej. los de
Promega o Stratagene.
La fermentación se hizo según protocolos
estándar como los que están descritos en la literatura de patentes
y en la literatura científica, en un proceso bietápico que comprende
un cultivo discontinuo y un cultivo discontinuo alimentado. Las
bacterias se tuvieron en cultivo por espacio de un periodo de tiempo
de 17 a 18 horas, antes de inducirlas a la formación del
G-CSF
\hbox{recombinante mediante adición de IPTG 1 mM. El tiempo de inducción fue de 4,0 horas.}
La recolección de las bacterias se hizo mediante
centrifugación en vasos por espacio de 20 minutos a 5000 g y 4ºC.
Tras la centrifugación fue desechado el supernatante y las células
fueron llevadas de nuevo al volumen de fermentación con tampón
(fosfato sódico 20 mM, pH 7,0; EDTA 1 mM) (EDTA = ácido
etilendiaminotetraacético), antes de ser desintegradas mediante
tres pases a 800 bares. A continuación se clarificó el lisado
mediante separación (separador CSA1, Westfalia, Oelde).
\vskip1.000000\baselineskip
La suspensión de los cuerpos de inclusión
obtenida mediante la recolección puede en principio ser utilizada
directamente para la subsiguiente solubilización. La máxima
concentración de proteína alcanzable en el solubilizado queda en
este caso ciertamente limitada en gran medida, lo cual puede dar
lugar a una limitación durante el plegamiento. Por consiguiente, la
suspensión de los cuerpos de inclusión debería ser concentrada
mediante centrifugación tras la recolección y el lavado, para
alcanzar una alta concentración de proteína en el solubilizado.
La suspensión de los cuerpos de inclusión fue
centrifugada por espacio de 20 minutos a 10.000 g en una
centrifugadora de vasos. La pasta de cuerpos de inclusión obtenida
mediante la centrifugación puede ser almacenada por espacio de al
menos 12 semanas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para poder solubilizar en un periodo de tiempo
relativamente corto los pellets de cuerpos de inclusión de mayor
tamaño, es además necesaria una trituración mecánica de estos
pellets, por ejemplo mediante tratamiento Ultraturrax. La pasta de
cuerpos de inclusión obtenida mediante centrifugación fue pesada,
mezclada con 9,0 ml de tampón de solubilización (Tris 30 mM, EDTA 1
mM, guanidina-HCl 6,0M, GSH 100 mM, pH 8,0) por
gramo de cuerpos de inclusión y desmenuzada mediante tratamiento
Ultraturrax. La preparación fue sometida a agitación vorticial a
fondo y fue luego incubada en un mezclador de rodillos o un agitador
magnético a temperatura ambiente por espacio de aproximadamente 2
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de proteína en el solubilizado
fue determinada con el método de Bradford con BSA (BSA =
seroalbúmina bovina) como proteína patrón. Para el plegamiento fue
añadida al tampón de replegamiento (Tris 30 mM, GSSG 2 mM, GSH 2
mM, urea 3M, pH 7,5; 4ºC) la cantidad de solubilizado que era
necesaria para alcanzar en una deseada cantidad de tampón una
concentración de proteína de 700 \mug/ml. La correspondiente
cantidad de solubilizado fue añadida lenta y uniformemente bajo
agitación con un agitador magnético, para evitar las
concentraciones localmente incrementadas de solubilizado, o
respectivamente proteína. La velocidad de aportación y la modalidad
de mezcla pueden adaptarse para el volumen de preparación de
solubilización que respectivamente se utilice. Una vez concluida la
adición del solubilizado, la preparación fue incubada por espacio de
al menos 12 horas a 4ºC. Durante este tiempo no fue necesaria una
mezcla adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación del replegamiento se filtra la
preparación de replegamiento, antes de que tenga lugar el primer
paso de cromatografía. Puede utilizarse para la filtración por
ejemplo un filtro de lecho profundo, como p. ej. un filtro adecuado
de la firma Millipore, de Schwalbach. Antes de la filtración se
ajusta el valor pH a pH 3,2 con ácido cítrico 2M.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer paso de cromatografía sirve para la
captura de la proteína objetivo y separa de la proteína objetivo a
los agentes de replegamiento tales como urea, GSH y GSSG, en tanto
que los mismos estén presentes en la preparación de plegamiento. En
este paso son también separadas las proteínas de las células huésped
y las especies proteicas incorrectamente plegadas. Aquí se hace uso
de una cromatografía de intercambio catiónico. Se emplea como
matriz SP Sepharose XL de Amersham Biosciences (entretanto GE
Healthcare). La cromatografía tiene lugar a pH
5,0.
5,0.
La matriz de SP Sepharose XL fue equilibrada con
1,5 volúmenes de columna de acetato sódico 20 mM, pH 5,0. La
preparación de replegamiento filtrada fue cargada en la columna y
fue a continuación lavada con 1,5 volúmenes de columna de tampón de
lavado (acetato sódico 20 mM, pH 5,0). A continuación fue eluido de
la columna el G-CSF con 3 volúmenes de columna de
tampón de elución (acetato sódico 20 mM, NaCl 200 mM, pH 5,0). La
pureza del G-CSF eluido fue determinada mediante
HPLC de fase inversa, y era de más de un 80%. El rendimiento,
referido a la preparación de plegamiento filtrada, era asimismo de
más de un 80%.
\vskip1.000000\baselineskip
Partiendo del eluido de la SP Sepharose XL, en
el segundo paso de cromatografía tiene lugar una adicional
purificación del G-CSF. En particular tiene lugar un
considerable empobrecimiento en impurezas emparentadas con el
producto. Aquí se hace uso de una cromatografía de interacción
hidrofóbica con Fenil Sepharose HP de Amersham Biosciences
(entretanto GE Healthcare).
La columna de Fenil Sepharose HP fue
primeramente equilibrada con 2 volúmenes de columna de un 12% de
tampón B y un 88% de tampón A (tampón B: citrato sódico 20 mM, pH
6,7; tampón A: citrato sódico 20 mM, pH 2,7, NaCl 110 mM). Entonces
fue aplicado a la columna el eluido de la columna de SP Sepharose
XL, que había sido previamente diluido con 5 volúmenes de tampón A
(citrato sódico 20 mM, pH 2,7, NaCl 110 mM). A continuación la
columna fue lavada con 2 volúmenes de columna de un 12% de tampón B
y un 88% de tampón A, y se pasó por la misma un gradiente lineal de
un 12% a un 90% de tampón B en 5-8 volúmenes de
columna. La elución tuvo lugar dentro del marco de este gradiente
lineal de pH de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente 6,0. La
columna fue finalmente enjuagada con 3 volúmenes de columna de un
90% de tampón B y un 10% de tampón
A.
A.
Las fracciones de elución fueron verificadas en
cuanto a su pureza mediante HPLC de fase inversa, y fueron reunidas
las fracciones que tenían una pureza de más de un 95%.
El G-CSF obtenido tras la
cromatografía de interacción hidrofóbica tenía una pureza de más de
un 96%. El rendimiento del paso de cromatografía de interacción
hidrofóbica correspondía a casi un 80%.
\vskip1.000000\baselineskip
Partiendo del eluido de la Fenil Sepharose HP,
en el tercer paso de cromatografía tiene lugar una adicional
purificación del G-CSF hasta una pureza de más del
99%. Se efectúa un considerable empobrecimiento en impurezas
emparentadas con el producto. Aquí se hace de nuevo uso de una
cromatografía de intercambio catiónico. Se utiliza SP Sepharose FF
de Amersham Biosciences (entretanto GE Healthcare).
La columna de SP Sepharose FF fue equilibrada
con 3 volúmenes de columna de un 100% de tampón A (fosfato sódico
50 mM, pH 5,4). A continuación fue aplicado a la columna el eluido
de la cromatografía de interacción hidrofóbica, y se enjuagó la
columna con 2 volúmenes de columna de un 100% de tampón A (fosfato
sódico 50 mM, pH 5,4). La muestra de aplicación contenía NaCl
aproximadamente 60 mM y tenía un valor pH de
4,0-4,2. La elución se hizo mediante una
combinación de gradiente escalonado y lineal de pH. El primer
escalonamiento fue a un 10% de tampón P (fosfato sódico 50 mM, pH
6,4) y mantuvo esta concentración para 1,5 volúmenes de columna. A
continuación de ello siguió un gradiente por 1 volumen de columna de
un 10 a un 15% de tampón B (fosfato sódico 50 mM, pH 6,4). El
G-CSF fue eluido en un gradiente lineal de un 15% a
un 35% de tampón B (fosfato sódico 50 mM, pH 6,4) por 12,5
volúmenes de columna, teniendo lugar la recogida del eluido con
aumento de la absorción a 280 mm. La columna fue finalmente
enjuagada con un escalonamiento a un 100% de tampón B (fosfato
sódico 50 mM, pH
6,4).
6,4).
Las fracciones de elución fueron verificadas en
cuanto a su pureza mediante HPLC de fase inversa, y fueron reunidas
las fracciones que tenían una pureza de más de un 99%. El
rendimiento total fue del orden de un 80%.
El Met-G-CSF
obtenido como resultado de los pasos de cromatografía anteriormente
descritos tenía una pureza de al menos un 99,5% según todos los
análisis por HPLC (de fase inversa, SEC e IEX).
La determinación de las impurezas arrojó
asimismo un muy marcado empobrecimiento en DNA, endotoxina y
proteína de células huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad del G-CSF obtenido
mediante el procedimiento según la invención fue determinada
mediante un bioanálisis y fue comparada con la de un
G-CSF estándar que está disponible comercialmente
(Neupogen®). Se empleó para ello la línea celular de ratón
NFS-60, que responde al G-CSF. Esta
línea celular fue cultivada en medio RPMI 1640 (firma Bachem, de
Heidelberg), que contenía 1,5 g/l de bicarbonato sódico, 4,5 g/l de
glucosa, Hepes 10 mM y piruvato sódico 1,0 mM y había sido
suplementado con glutamina 2 mM, un 10% de FCS,
2-mercaptoetanol 0,05 mM y 60 ng/ml de
G-CSF.
Para el ensayo de actividad, las células fueron
lavadas dos veces con medio sin G-CSF, fueron
sembradas en una concentración de 2 x 10^{4} células por pocillo
en placas de cultivo de 96 pocillos, y fueron incubadas por espacio
de tres días a 37ºC y con un 4,5% de CO_{2} con distintas
concentraciones del G-CSF purificado y del
estándar. Las células fueron a continuación coloreadas con reactivo
XTT, y la absorción fue medida a 450 nm en un lector de placas de
microtitulación. Quedó de manifiesto que las células que habían sido
tratadas con el G-CSF purificado según la invención
crecieron exactamente igual de bien como las células que habían
sido tratadas con el estándar, por lo cual puede partirse de la base
de una igual actividad biológica de ambas muestras de
G-CSF.
G-CSF.
También en los análisis por electroforesis en
gel (SDS-PAGE, Western Blot, enfoque isoeléctrico)
el Met-G-CSF obtenido tras la
purificación cromatográfica se comportó como el Neupogen® utilizado
como estándar.
Para la determinación del rendimiento de
plegamiento, tras la obtención del G-CSF puede
efectuarse una HPLC de fase inversa en la que se desnaturaliza la
proteína. Debido a los puentes disulfuro, que se mantienen, las
especies puenteadas con disulfuro de maneras distintas poseen
frecuentemente distintas superficies hidrofóbicas y pueden ser con
ello separadas en la HPLC de fase inversa. Por consiguiente, con
este método se logra tan sólo la demostración del correcto puenteo
con puentes disulfuro. Éste es ciertamente un criterio decisivo y
para muchas pequeñas y correspondientemente puenteadas proteínas un
criterio que es ya suficiente para establecer el correcto
plegamiento. Como adicional método de análisis puede también
realizarse una HPLC de exclusión por tamaño
(SE-HPLC).
(SE-HPLC).
Materiales y protocolos adecuados para la
realización de la HPLC de fase inversa o de la
SE-HPLC puede el experto en la materia sacarlos de
las informaciones de productos de ofertantes como Vydac
(http://www.vydac.com) o TOSOH Bioscience
(http://www.tosohbiosep.de). La determinación del rendimiento de la
producción de Met-G-CSF está
también descrita en Herman et al. (1996) Pharm. Biotechnol.
9: 303-328. El exacto porcentaje de
Met-G-CSF se determina mediante
integración del área de pico y conversión a base del coeficiente de
extinción.
Tras la purificación, el G-CSF
puede ser analizado con respecto a su cantidad y su actividad. Puede
hacerse un análisis cualitativo por medio de un análisis por
SDS-PAGE con subisiguiente coloración con Azul
Brillante Coomassie o por medio de una HPLC de fase inversa. Como
estándar para los análisis puede emplearse un preparado de
G-CSF de los que están a la venta en el mercado.
Adicionalmente puede realizarse un mapa peptídico o una
espectroscopia de masas. La actividad del G-CSF
purificado puede determinarse con distintos procedimientos de
ensayo biológico, como son los que están descritos por ejemplo en
Shirafuji et al. (1989) Exp. Hematol. 17(2):
116-119; Oh-Eda et al. (1990)
J. Biol Chem. 265(20): 11432-11435; Stute
et al. (1992) Blood 79(11): 2849-2854
y Oshima et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun.
267(3): 924-927.
Todas las cromatografías se realizan por lo
demás según las recomendaciones y los protocolos de los ofertantes
de las matrices y de las columnas (p. ej. con respecto a la
velocidad de flujo, a los volúmenes de columna a utilizar para el
lavado y para la elución, a los diámetros y a las alturas de lecho
de las columnas, etc.).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 8701132 A1 [0004] [0009] [0009]
- \bullet WO 03051922 A [0011]
- \bullet EP 0719860 A [0007]
- \bullet WO 0104154 A1 [0012]
- \bullet EP 0512097 A [0007]
- \bullet EP 0456200 A [0017]
- \bullet EP 0364926 A [0007]
- \bullet EP 1630173 A [0030]
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- \bullet EP 0674525 A [0061]
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- \bullet EP 0373679 A [0061]
- \bullet EP 0719860 A1 [0010] [0010]
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\bullet WO 03051922 A1 [0011]
\bullet F. LOTTSPEICH; H.
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\bullet Ion Exchange Chromatography -
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\bullet Hydrophobic Interaction
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Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Coldspring Harbour
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Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
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Blood, 1992, vol. 79 (11), 2849-2854
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Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, vol. 267 (3),
924-927 [0088]
Claims (11)
1. Procedimiento de purificación de factor
recombinante estimulador de colonias de granulocitos
(G-CSF), que comprende al menos una cromatografía
de intercambio catiónico y al menos una cromatografía de interacción
hidrofóbica, donde estos pasos de cromatografía se siguen
inmediatamente unos a otros en cualquier orden de sucesión.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende dos cromatografías de intercambio catiónico que son
efectuadas respectivamente antes y después de la cromatografía de
interacción hidrofóbica.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,
que comprende además una filtración en flujo tangencial a
continuación de la última cromatografía de intercambio
catiónico.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa cromatografía de
intercambio aniónico alguna.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa filtración en gel
alguna.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa HPLC alguna.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa cromatografía de
afinidad alguna.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa cromatografía en
hidroxiapatita alguna.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde para la cromatografía de
intercambio catiónico se emplea una matriz sulfopropílica.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde para la cromatografía de
interacción hidrofóbica se usan grupos fenilo como ligandos
hidrofóbicos.
11. Procedimiento de fabricación de una
preparación farmacéutica que contiene G-CSF
recombinante y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables
tales como tampones, sales y estabilizadores, que comprende un
procedimiento de purificación de G-CSF según una de
las reivindicaciones precedentes.
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