ES2336007T3 - Procedimiento de obtencion de g-csf humano biologicamente activo a partir de inclusion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión, comprendiendo dicho procedimiento los pasos siguientes: a) Solubilización del G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un tampón de solubilización que contiene un agente desnaturalizante y glutationa reducida; b) Replegamiento del G-CSF mediante dilución de la preparación de solubilización con un tampón de replegamiento que contiene glutationa reducida y oxidada en cantidades equimolares; y c) Purificación del G-CSF replegado mediante al menos un paso de cromatografía.
Description
Procedimiento de obtención de
G-CSF humano biológicamente activo a partir de
cuerpos de inclusión.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de obtención de G-CSF humano
biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión, o sea de
los llamados Inclusion Bodies, que está caracterizado por el hecho
de que en la solubilización del G-CSF se usa como
agente reductor glutationa reducida y para el replegamiento del
G-CSF se usa como sistema redox una mezcla de
glutationa reducida y glutationa oxidada.
El G-CSF (factor estimulador de
colonias de granulocitos) pertenece al grupo de los factores
estimuladores de colonias que regulan la diferenciación y
proliferación de células precursoras hematopoyéticas y la activación
de neutrófilos. Debido a estas propiedades el G-CSF
ha encontrado aplicación en varios sectores médicos, como p. ej. en
la reconstitución de las poblaciones normales de células de la
sangre tras quimioterapia o irradiación, o bien para la
estimulación de la respuesta inmune frente a patógenos infecciosos.
Además se le usa para el tratamiento de determinadas leucemias
(Bronchud et al. (1987) Br. J. Cancer 56:
809-813; Morstyn et al. (1988) Lancet 1:
667-672) y en trasplantes de médula ósea.
Debido a las múltiples posibilidades de
aplicación que hay para el G-CSF, el mismo debe
estar disponible en cantidades suficientemente grandes. Gracias a
la primera descripción de la secuencia de DNA del
G-CSF en el año 1986 fue posible la fabricación por
tecnología genética. El primer preparado de G-CSF,
que fue fabricado a partir de G-CSF recombinante,
fue homologado en 1991 en Alemania y es fabricado y comercializado
con el nombre comercial de Neupogen® por la firma Amgen.
La proteína G-CSF contiene un
único sitio de O-glicosilación, no influenciando la
glicosilación de la proteína a la estabilidad y actividad de la
proteína. Por consiguiente es posible fabricar el
G-CSF recombinante mediante el uso de adecuados
vectores de expresión tanto en células bacterianas como en células
de mamífero. A la forma no glicosilada de G-CSF de
células bacterianas se la denomina filgrastim y su producción está
descrita entre otros sitios en la
EP-A-0 237 545, y en cambio a la
forma glicosilada del G-CSF de células de mamífero
se la denomina lenograstim, cuya producción ha sido descrita p. ej.
en la EP-A-0 169 566.
Se prefiere la producción en células
procarióticas a la producción en células de mamífero, puesto que
pueden usarse sistemas de expresión y condiciones de cultivo más
sencillos. Un problema que surge frecuentemente en la fabricación
de proteínas recombinantes en células procarióticas es sin embargo
la formación de agregados intracelulares difícilmente solubles de
formas desnaturalizadas de la proteína expresada, que son los
llamados cuerpos de inclusión, que presentan en parte una
estructura secundaria y pueden encontrarse en el citoplasma de las
células bacterianas.
La formación de estos cuerpos de inclusión
conduce a que tras el aislamiento de los cuerpos de inclusión las
proteínas tengan que ser solubilizadas y renaturalizadas mediante
centrifugación a velocidad moderada con ayuda de agentes adecuados,
para conservar su configuración activa. Además la reacción de
concurrencia entre una transformación de la proteína
desnaturalizada en el correcto intermedio de plegamiento y una
agregación de varias moléculas de proteína constituye un importante
factor que limita la producción de proteína renaturalizada.
En el estado de la técnica han sido ya descritos
varios procedimientos con los cuales una proteína contenida en
cuerpos de inclusión puede ser transformada en su forma activa.
La EP-A-0 512
087 describe un procedimiento de solubilización y renaturalización
de proteína desnaturalizada donde la proteína es tratada con un
tampón de Tris que presenta una concentración de al menos 400
mmoles/l de base Tris o de una sal de Tris.
En la EP-A-0 719
860 se describe el aislamiento y la purificación de
G-CSF, donde el G-CSF es
solubilizado y oxidado en presencia de un agente desnaturalizante y
de un agente oxidante tal como sulfato de cobre, que cataliza la
oxidación con aire, antes de ser retirado el agente desnaturalizante
y de someter al G-CSF a una cromatografía de
intercambio iónico. Este procedimiento conduce a que las de
aproximadamente un 70% de las moléculas de G-CSF
sean oxidadas adoptando la correcta forma monómera, si bien es
cierto que un tercio de los grupos tiol no es convertido en la
forma deseada. Adicionalmente la eficiencia de la oxidación con aire
depende de la superficie y es por consiguiente difícil de
controlar.
La EP-B-0 364
926 describe un procedimiento de activación de proteínas
biológicamente activas expresadas en procariotas y producidas por
tecnología genética mediante solubilización y subsiguiente
reactivación, aplicándose una concentración de proteína de 1 a 1000
mg/ml y efectuándose una diálisis entre la solubilización y la
reactivación. Además de la costosa ejecución, una desventaja
principal de este procedimiento es la de que debido a la diálisis
entre la solubilización y la reactivación no pueden evitarse
pérdidas de rendimiento de producción.
En la EP-A-0 219
874 se describe un procedimiento de activación de proteínas
eucarióticas producidas por tecnología genética mediante expresión
en procariotas, en el cual las proteínas son solubilizadas bajo
condiciones desnaturalizantes y reductoras antes de separar el
agente reductor/desnaturalizante y de reactivar las proteínas bajo
condiciones oxidantes. Así pues, también en este procedimiento tiene
lugar entre la solubilización y la reactivación un paso de
separación que va ligado a pérdidas de rendimiento de
producción.
Por último describe la WO 01/87925 un
procedimiento de solubilización y replegamiento de una proteína
insoluble donde la proteína insoluble es solubilizada tratándola con
un agente desnaturalizante, un agente reductor y un agente
bloqueador de cisteína y replegándola a continuación mediante la
reducción de las concentraciones del agente desnaturalizante y del
agente reductor. Un ejemplo que se ocupa del replegamiento y de la
solubilización de G-CSF utiliza para la
solubilización urea y cisteína o DTT (DTT = ditiotreitol) y para el
replegamiento sulfato de cobre.
La finalidad de la presente invención es la de
presentar un procedimiento de obtención de G-CSF
humano biológicamente activo con el cual pueda obtenerse
G-CSF con un alto nivel de pureza y de rendimiento
mediante un procedimiento lo más sencillo posible, no debiendo
tener lugar entre la solubilización y el replegamiento adicionales
pasos de procesamiento, y en particular separación alguna del agente
reductor, sino debiendo producirse el replegamiento mediante
dilución del tampón de solubilización. Esta y otras finalidades son
alcanzadas mediante el procedimiento que se indica en la
reivindicación 1. Se describen en las reivindicaciones dependientes
formas de realización preferidas.
La invención se refiere con ello a un
procedimiento de obtención de G-CSF humano
biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión,
comprendiendo dicho procedimiento los pasos siguientes:
a) Solubilización del G-CSF
contenido en los cuerpos de inclusión con un tampón de
solubilización que contiene un agente desnaturalizante y glutationa
reducida en cantidades equimolares;
b) Replegamiento del G-CSF
mediante dilución de la preparación de solubilización con un tampón
de replegamiento que contiene glutationa reducida y oxidada; y
c) Purificación del G-CSF
replegado mediante al menos un paso de cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Una ventaja de este procedimiento es la de que
el agente reductor no es separado después de la solubilización,
sino que permanece en la solución de proteína. Gracias al hecho de
que se evita un costoso paso de separación, pueden limitarse las
pérdidas de producción de la proteína recombinante. Esto se hace
posible ante todo gracias al hecho de que tanto en el tampón de
solubilización como en el tampón de replegamiento está contenida
glutationa reducida.
En una forma de realización preferida, en cuanto
al paso de cromatografía que es al menos uno se trata de una
cromatografía de intercambio catiónico.
Con el procedimiento según la invención se
obtiene un rendimiento de producción de G-CSF
recombinante de un 25-35%, referido a la proteína
total en el solubilizado determinada según el método de Bradford.
Referido a la cantidad de met-G-CSF
en el solubilizado se alcanza un rendimiento de replegamiento de
aproximadamente un 50-70%, como puede determinarse
mediante rpHPLC (rpHPLC = cromatografía de líquidos de alta
resolución de fase inversa).
El G-CSF obtenido mediante el
procedimiento según la invención presenta tras el primer paso de
cromatografía una pureza de más de un 80%, que puede ser
incrementada mediante posteriores pasos de cromatografía.
Por "G-CSF humano
biológicamente activo" se entiende según la invención que el
G-CSF producido por el procedimiento según la
invención está en condiciones de promover la diferenciación y
proliferación de células precursoras hematopoyéticas y producir la
activación de células maduras del sistema hematopoyético. Por
consiguiente, el G-CSF que ha sido obtenido
mediante el procedimiento según la invención es adecuado para el
tratamiento de indicaciones en las que es ventajosa la
administración de G-CSF. Se entiende que el concepto
de "G-CSF humano biológicamente activo"
también incluye a mutantes y modificaciones de G-CSF
cuya secuencia de aminoácidos está modificada con respecto a la
secuencia de tipo salvaje pero que presentan una actividad biológica
similar a la del G-CSF de tipo salvaje, como p. ej.
los descritos en los documentos WO 01/87925 y EP 0 456 200. Lo
mismo es válido para los conjugados de G-CSF.
El concepto de "cuerpos de inclusión"
designa a agregados compactos insolubles intracelulares de proteína
expresada recombinantemente y plegada incorrectamente o bien plegada
en parte correctamente que pueden ser aislados mediante
centrifugación.
Por "solubilización" se entiende según la
invención que el G-CSF que forma los cuerpos de
inclusión es disuelto tratándolo con un agente desnaturalizante y
glutationa reducida, con lo cual se quiebran las interacciones
inter- e intramoleculares que no se producen en la proteína nativa.
Debido a ello se produce una dispersión monomolecular de la
proteína recombinante.
Los agentes desnaturalizantes son agentes en
cuya presencia no se conserva la conformación nativa de las
proteínas. Por consiguiente, la actividad biológica de las proteínas
está reducida o no está presente en presencia de agentes
desnaturalizantes. Los agentes desnaturalizantes que son adecuados
para ser usados en tampones de solubilización incluyen a los
miembros del grupo que consta de una urea,
guanidina-HCl, arginina, tiocianato sódico,
extremos de pH (bases o ácidos diluidos), detergentes (como p. ej.
SDS y sarcosil), sales (cloruros, nitratos, tiocianatos y
tricloroacetatos), derivatización química (sulfitólisis, reacción
con anhídrido citracónico), solventes
(2-amino-2-metil-1-propanol
u otros alcoholes, DMSO, DMS) o fuertes resinas de intercambio
aniónico como por ejemplo Q-Sefarosa.
Son adecuadas concentraciones de urea las de
1-9 moles/l, y preferiblemente las de
5-9 moles/l. Son adecuadas concentraciones de
guanidina-HCl las de 1-8 moles/l, y
preferiblemente las de 4-8 moles/l. En el
procedimiento de la presente invención se usa como agente
desnaturalizante preferiblemente guanidina-HCl. Con
particular preferencia la concentración de
guanidina-HCl es de 5,0 a 7,0 moles/l, y con la
máxima preferencia es de 6,0 moles/l.
El tampón de solubilización según la invención
contiene además aparte del agente desnaturalizante glutationa
reducida en una concentración de 10-200 mmoles/l,
preferiblemente de 40-150 mmoles/l, con particular
preferencia de 60-120 mmoles/l, y con la máxima
preferencia, de 100 mmoles/l.
Además se prefiere añadir al tampón de
solubilización formadores de quelatos tales como por ejemplo EDTA
(EDTA = ácido etilendiaminotetraacético) o DMAE (DMAE =
dimetilaminoetilo), que pueden complejar iones metálicos. Si estos
iones metálicos estuviesen en forma libre, existiría la posibilidad
de que los mismos pudiesen catalizar la oxidación con aire del
agente reductor usado, que entonces ya no estaría disponible para
la reducción de la proteína.
Como componente tampón propiamente dicho del
tampón de solubilización son en particular adecuados Tris o
fosfato, que deben presentar un valor pH ligeramente básico para
posibilitar la reducción de puentes disulfuro.
Para garantizar una solubilización lo más eficaz
y completa posible, debe usarse una adecuada relación de cuerpos de
inclusión y tampón de solubilización. Preferiblemente se usan por
gramo de cuerpos de inclusión 4-20 ml de tampón de
solubilización, con particular preferencia 7-15 ml
de tampón de solubilización, y con la máxima preferencia 9 ml de
tampón de solubilización.
Mediante la solubilización anteriormente
descrita se alcanzan concentraciones de proteína en los
solubilizados de respectivamente 20-40 mg/ml,
preferiblemente de 25-35 mg/ml, y con la máxima
preferencia de aproximadamente 30 mg/ml, referidas a la parte de
met-G-CSF.
El solubilizado no debe ser acidificado después
de la solubilización y antes del replegamiento, puesto que se
prescinde de una eliminación del agente reductor.
Tras la solubilización de los cuerpos de
inclusión debe ser replegada la proteína para llevarla a su forma
activa. Además la proteína debe adoptar su conformación nativa y
formar sus puentes disulfuro nativos. En el procedimiento según la
invención este replegamiento se efectúa sin que previamente sea
separado el tampón de solubilización, y antes bien se diluye la
preparación de solubilización mediante mezcla con el tampón de
replegamiento. Debido a ello es reducida la concentración de agente
desnaturalizante, para que la proteína pueda renaturalizarse
pasando a adoptar su forma soluble biológicamente activa. Gracias a
la dilución de la preparación de solubilización se impide una
pérdida de rendimiento, que se produciría si el agente
desnaturalizante fuese retirado p. ej. mediante diálisis o
filtración en
gel.
gel.
El tampón de replegamiento contiene glutationa
reducida y oxidada, preferiblemente en cantidades equimolares. El
uso de este sistema redox a base de disulfuro y tiol posibilita la
correcta formación de los puentes disulfuro en la proteína,
promoviendo la rápida transformación de los puentes disulfuro
formados incorrectamente. El uso de la pareja redox que consta de
glutationa reducida y oxidada ofrece además la ventaja de que el
plegamiento es más controlable que en el caso de un plegamiento
producido por ejemplo mediante oxidación con aire, puesto que el
plegamiento no es dependiente de la relación de
superficie/volumen.
Preferiblemente la concentración de glutationa
reducida y oxidada es respectivamente de 0,2-10
mmoles/l, preferiblemente de 0,5-5 mmoles/l, con
particular preferencia de 1-3 mmoles/l, y con la
máxima preferencia de 2 mmoles/.
Además de la pareja redox de glutationa reducida
y oxidada, el tampón de replegamiento contiene preferiblemente un
aditivo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de
los agentes desnaturalizantes arginina, urea y
guanidina-HCl, estando estos agentes
desnaturalizantes en una concentración que promueve el
replegamiento. El concepto "en una concentración que promueve el
replegamiento" significa en el sentido de la invención que la
concentración de agentes desnaturalizantes en el tampón de
replegamiento es menor que la concentración en el tampón de
solubilización. Debido a ello son desestabilizados los intermedios
de plegamiento no productivos, lo cual conduce a su nuevo
desplegamiento. Las proteínas así desplegadas se aportan a un
adicional paso de replegamiento en el que pueden adoptar su
configuración activa, lo cual produce un incremento de la producción
de proteína activa. Los agentes desnaturalizantes posibilitan
además el plegamiento de la proteína a elevadas concentraciones de
proteína en la preparación de replegamiento.
De manera particularmente preferida, en cuanto
al aditivo se trata de urea. La concentración de urea en el tampón
de replegamiento es de 1,5-4,5 moles/l,
preferiblemente de 2,0-4,0 moles/l, y con particular
preferencia de 3,0 moles/l.
El tampón de replegamiento puede adicionalmente
contener EDTA, y preferiblemente la concentración de EDTA en el
tampón de replegamiento se sitúa al nivel de 1 mM.
En una forma de realización el tampón de
replegamiento no contiene, aparte de arginina dado el caso,
aminoácidos sin mercapto, y en particular no contiene, aparte de
arginina dado el caso, aminoácidos en absoluto.
El valor pH del tampón de replegamiento tiene
una amplia influencia en toda la reacción de plegamiento, puesto
que entre otras cosas condiciona las condiciones de carga en la
proteína y puede así favorecer la formación de la estructura
nativa, pero también puede conducir a una más importante formación
de especies incorrectamente plegadas. El valor pH influencia además
la velocidad de intercambio de puentes disulfuro, que es un paso
importante en el plegamiento de proteínas con puentes disulfuro.
Puesto que la formación de los puentes disulfuro en las proteínas
puede producirse tan sólo en la zona neutra y en la zona básica, el
valor pH del tampón de replegamiento debería estar situado dentro
de la gama de valores que va desde 7,0 hasta 11,0. Dicho valor pH
está preferiblemente situado entre 7,5 y 8,0, y es con la máxima
preferencia de 7,5.
La eficacia del replegamiento es también
influenciada por la concentración de proteína en la preparación de
plegamiento. Para proteínas monómeras los rendimientos de
plegamiento más favorables se dan por regla general cuando la
concentración de proteína es lo más baja posible. Las elevadas
concentraciones de proteína favorecen a las reacciones secundarias
en el proceso de plegamiento, tales como la agregación de
intermedios más fuertemente hidrofóbicos. Es cierto que la
concentración de proteína no puede elegirse de forma que sea tan
baja como se desee, puesto que el volumen de la mezcla de reacción
de plegamiento a escala de producción está limitado por razones de
carácter técnico y relacionadas con los costes. En el procedimiento
según la invención se aplica por consiguiente una concentración de
proteína de menos de 2000 \mug/ml, según determinación efectuada
mediante un ensayo de Bradford con el solubilizado, preferiblemente
de menos de 1200 \mug/ml, y con particular preferencia, de menos
de 700 \mug/ml.
Otro parámetro que influencia al procedimiento
según la invención es la temperatura a la que tiene lugar el
replegamiento. Frecuentemente se alcanzan a bajas temperaturas (de
menos de 10ºC) mejores rendimientos que a 20ºC o más. Ciertamente
el proceso de plegamiento se enlentece a temperaturas más bajas, con
lo cual también tiene que adaptarse el tiempo de plegamiento a la
temperatura que se use. En el procedimiento según la invención el
replegamiento tiene lugar a 4ºC. El replegamiento se produce por
espacio de al menos 3 horas, preferiblemente por espacio de al
menos 10 horas, con particular preferencia por espacio de al menos
12 horas, y con la máxima preferencia por espacio de al menos 15
horas.
Tras la solubilización y el replegamiento del
G-CSF éste es purificado mediante al menos un paso
de cromatografía. Antes de este paso puede dado el caso efectuarse
un procesamiento de otra clase, como p. ej. una filtración, una
concentración, una precipitación, una acidificación y/o una
diálisis. Para G-CSF son en principio
particularmente adecuados ambos métodos de cromatografía que
consisten en la cromatografía de intercambio iónico y la
cromatografía de interacción hidrofóbica. Preferiblemente se efectúa
una cromatografía de intercambio iónico, y con particular
preferencia se efectúa una cromatografía de intercambio catiónico,
en la que para un determinado pH del tampón y debido a su carga
total positiva el G-CSF se fija a la matriz de la
matriz de intercambio catiónico, mientras que las de la mayoría de
las sustancias contaminantes, tales como ácidos nucleicos,
lipopolisacáridos y proteínas que proceden de las células huésped,
así como isómeros iónicos de G-CSF y formas
modificadas de G-CSF con otros valores pl no se
fijan y pueden eliminarse mediante lavado.
Las adecuadas matrices de intercambio catiónico
incluyen, aunque sin carácter limitativo, a los miembros del grupo
que consta de carboximetil (CM)-celulosa, AG 50 W,
Bio-Rex 70, carboximetil
(CM)-sefadex, sulfopropil
(SP)-sefadex, carboximetil
(CM)-sefarosa CL-6B y sulfonato
(S)-sefarosa. Preferiblemente se usa como matriz
para la cromatografía de intercambio catiónico
SP-sefarosa XL, que es suministrada por la Amersham
Biosciences, de Friburgo, Alemania.
Las adecuadas matrices y los adecuados
protocolos para la realización de la cromatografía de intercambio
catiónico puede sacarlos el experto en la materia de las
informaciones de productos de ofertantes tales como la Amersham
Biosciences (http://www.amersham-bioscience.com) o
la Bio-Rad (http://www.biorad.com).
Los tampones adecuados para la cromatografía de
intercambio caitónico incluyen a los miembros del grupo que consta
de un tampón de maleato, de malonato, de citrato, de lactato, de
acetato, de fosfato, de HEPES y de bicina. La concentración del
tampón está preferiblemente situada entre la de 20 mM y la de 50 mM.
Para la purificación del G-CSF el pH del tampón de
ser posible no deberá ser de más de 8,0, y preferiblemente no deberá
ser de más de 7,0.
Con particular preferencia se usa para la
cromatografía de intercambio catiónico acetato sódico 20 mM pH 5,0,
que se utiliza para el equilibrado y el lavado.
El G-CSF puede ser eluído de la
columna tras el lavado mediante una modificación, y en el caso de la
cromatografía de intercambio catiónico mediante un incremento, del
valor pH o un incremento de la fuerza iónica.
Preferiblemente la elución se produce mediante
un incremento de la fuerza iónica. Si se usa acetato sódico 20 mM
pH 5,0 para el equilibrado y el lavado, para la elución se aplica
una mezcla de acetato sódico 20 mM pH 5,0 y NaCl 200 mM.
Las adicionales condiciones adecuadas para la
cromatografía de intercambio catiónico pueden sacarse de la
literatura especializada, tal como por ejemplo el manual "Ion
Exchange Chromatography - Principles and Methods" de la Amersham
Biosciences, de Friburgo, Alemania, 2002.
\newpage
También la cromatografía de interacción
hidrofóbica puede efectuarse con matrices habituales. Son adecuadas
matrices tales como butil-, fenil- u octil-sefarosa
(Amersham Biosciences),
Makro-Prep-Methyl o
t-Butyl (Bio-Rad) y Fractogel EMD
con ligandos con propilo o fenilo (Merck).
Para poder purificar cromatográficamente el
G-CSF tras el replegamiento, antes hay que
clarificar la preparación de plegamiento, es decir que deben
eliminarse las partículas de elevado peso molecular, con respecto a
las cuales se trata ante todo de agregados proteicos que se formaron
en el plegamiento. Esta clarificación se efectúa mediante
filtración en lecho profundo, en la cual sirve de medio filtrante un
apilamiento suelto de un material granular. Las partículas sólidas
son más pequeñas que los poros del medio filtrante o bien son
retenidas por adsorción en la superficie interior del
apilamiento.
Preferiblemente se usan para la filtración en
lecho profundo fibras de éster de celulosa como medio filtrante.
Adecuados materiales filtrantes y las correspondientes
prescripciones de uso pueden obtenerse p. ej. de la firma Millipore
con los nombres comerciales Millistak Plus C0HC y Millistak +
B1HC.
Preferiblemente se acidifica la preparación de
plegamiento antes de la filtración en lecho profundo, para que el
filtrado pueda usarse directamente para la cromatografía de
intercambio catiónico. Aquí se ajusta preferiblemente el valor pH
de la preparación de plegamiento a un valor de menos de 4,0, y con
particular preferencia dicho valor pH se ajusta a 3,2
aproximadamente.
Para la determinación del rendimiento de
plegamiento puede efectuarse tras la obtención del
G-CSF una rpHPLC, en la que es desnaturalizada la
proteína. Debido a los puentes disulfuro que se mantienen, las
especies puenteadas con disulfuro de manera distinta frecuentemente
poseen distintas superficies hidrofóbicas y pueden ser con ello
separadas en la rpHPLC. Por consiguiente, con este método se produce
tan sólo la demostración de la correcta formación de puentes
disulfuro. Ciertamente éste es un criterio decisivo y para muchas
pequeñas y correspondientemente puenteadas proteínas es ya un
criterio suficiente para el correcto plegamiento. Como adicional
método de análisis puede también efectuarse una
SE-HPLC (SE-HPLC = HPLC de exclusión
por tamaño).
Los adecuados materiales y protocolos para la
realización de la rpHPLC o de la SE-HPLC puede
sacarlos el experto en la materia de las informaciones de productos
de ofertantes tales como la Vydac (http://www.vydac.com) o la TOSOH
Bioscience (http://www.tosohbiosep.de). La determinación del
rendimiento de producción de
met-G-CSF está también descrita en
Herman et al. (1996) Pharm. Biotechnol. 9:
303-328. El exacto porcentaje de
met-G-CSF se determina mediante
integración de la superficie de pico y conversión a base del
coeficiente de extin-
ción.
ción.
Tras la purificación puede analizarse el
G-CSF con respecto a su cantidad y su actividad.
Puede efectuarse un análisis cualitativo mediante un análisis
SDS-PAGE con coloración azul brillante de Coomassie
a continuación o una rpHPLC. Como patrón para los análisis puede
usarse un preparado de G-CSF de los que están
disponibles en el mercado. Adicionalmente puede efectuarse un mapa
peptídico o una espectroscopia de masas. La actividad del
G-CSF purificado puede determinarse con distintos
procedimientos de ensayo biológico, como son por ejemplo los que
están descritos en Shirafuji et al. (1989) Exp. Hematol.
17(2): 116-119; Oh-Eda et
al. (1990) J. Biol. Chem. 265(20):
11432-11435; Stute et al. (1992) Blood
79(11): 2849-2854 y Oshima et al.
(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 267(3):
924-927.
La invención se refiere también a preparaciones
farmacéuticas que contienen el G-CSF obtenido según
la invención. El G-CSF obtenido puede guardarse como
liofilizado o bien en forma líquida. Se le administra por vía
subcutánea o intravenosa. Son adecuadas sustancias auxiliares en las
formulaciones de G-CSF expresado recombinantemente
por ejemplo estabilizadores tales como azúcar y alcoholes de azúcar,
aminoácidos y agentes tensioactivos como p. ej. polisorbato 20/80,
así como adecuadas sustancias tampón. Están descritos ejemplos de
formulaciones en los documentos EP 0 674 525, EP 0 373 679 y EP 0
306 824; véanse también los productos comerciales Neupogen® y
Granocyte en la LISTA ROJA 2004.
Los ejemplos siguientes están destinados a
aclarar la invención sin limitarla.
\vskip1.000000\baselineskip
El G-CSF humano fue expresado
bajo el control de un promotor inducible por IPTG en células E.
coli. Ejemplos de adecuados sistemas de expresión pueden
sacarse p. ej. del manual de laboratorio Sambrook and Russell,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3ª edición 2001, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Capítulo
15, o de corrientes protocolos de fabricante, como p. ej. los de
Promega o Stratagene.
La fermentación se hizo según protocolos
estándar como los descritos en la literatura científica y de
patentes, en un proceso bietápico que comprendía un cultivo
discontinuo y un cultivo discontinuo alimentado. Las bacterias
fueron cultivadas por espacio de 17 a 18 horas antes de activarlas
para la formación del G-CSF recombinante mediante
la adición de IPTG (IPTG =
isopropil-\beta-D-tiogalactósido)
1 mM. El tiempo de inducción fue de 4,0 horas.
\newpage
La recolección de las bacterias fue efectuada
mediante centrifugación en vasos por espacio de 20 minutos a 5000 g
y 4ºC. Después de la centrifugación fue desechado el supernatante, y
con tampón (fosfato sódico 20 mM, pH 7,0; EDTA 1 mM) se procedió a
llevar a las células de nuevo al volumen de fermentación, antes de
desagregarlas mediante tres pases a 800 bares. A continuación se
procedió a clarificar el lisado mediante separación
(CSA1-Separator, Westfalia, Oelde).
\vskip1.000000\baselineskip
La suspensión de los cuerpos de inclusión
obtenida mediante la recolección puede en principio usarse para la
siguiente solubilización. Ciertamente está en este caso muy limitada
la máxima concentración de proteína que puede alcanzarse en el
solubilizado, lo cual puede conducir a una limitación durante el
plegamiento. Por consiguiente, la suspensión de los cuerpos de
inclusión debería ser concentrada mediante centrifugación después
de la recolección y del lavado, para así alcanzar una alta
concentración de proteína en el solubilizado.
La suspensión de los cuerpos de inclusión fue
centrifugada en una centrifugadora de vasos por espacio de 20
minutos a 10.000 g. La pasta de los cuerpos de inclusión obtenida
mediante la centrifugación puede tenerse almacenada por espacio de
al menos 12 semanas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para poder solubilizar eficazmente los pellets
de cuerpos de inclusión de mayor tamaño en un tiempo relativamente
corto, es además necesario un desmenuzamiento mecánico de estos
pellets, por ejemplo mediante tratamiento Ultraturrax. La pasta de
cuerpos de inclusión obtenida mediante centrifugación fue pesada,
mezclada con 9,0 ml de tampón de solubilización (Tris 30 mM, EDTA 1
mM, guanidina-HCl 6,0M, glutationa reducida 100 mM,
pH 8,0) por gramo de cuerpos de inclusión, y desmenuzada mediante
tratamiento Ultraturrax. La preparación fue sometida a agitación
vorticial a fondo y fue luego incubada en un mezclador de rodillos a
temperatura ambiente y por espacio de unas 2 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de proteína en el solubilizado
fue determinada con el método según Bradford con BSA (BSA =
albúmina de suero bovino) como proteína patrón. Para el plegamiento
se procedió a añadir al tampón de replegamiento (Tris 30 mM,
glutationa reducida 2 mM, glutationa oxidada 2 mM, urea 3,0M, pH
7,5) la cantidad de solubilizado que era necesaria para alcanzar en
la deseada cantidad de tampón una concentración de proteína de 700
mg/ml. La correspondiente cantidad de solubilizado fue añadida lenta
y uniformemente bajo agitación con un agitador magnético, para
evitar las localmente elevadas concentraciones de solubilizado o de
proteína. La velocidad de aportación y la modalidad de mezcla
pueden adaptarse al volumen de preparación de solubilización que
respectivamente se utilice. Una vez concluida la adición del
solubilizado se procedió a incubar la preparación por espacio de al
menos 12 horas a 4ºC. Durante este tiempo no era necesaria una
mezcla adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de replegamiento fue primeramente
ajustada a un valor pH de 3,2 con ácido cítrico 2M y fue
clarificada con un filtro Millistak B1HC (de la firma Millipore, de
Schwalbach) según las indicaciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
El filtrado fue a continuación sometido a una
cromatografía de intercambio iónico. Se usó como matriz la
SP-Sefarosa XL de Amersham Biosciences, que fue
equilibrada con acetato sódico 20 mM, pH 5,0. Las muestras fueron
cargadas en la columna y lavadas con 1,5 volúmenes de columna de
tampón de lavado (acetato sódico 20 mM, pH 5,0). A continuación fue
eluído por etapas el G-CSF con 3 volúmenes de
columna de tampón de elución (acetato sódico 20 mM, pH 5,0; NaCl
200 mM).
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento de la purificación en total fue
determinado mediante rpHPLC y análisis SDS-PAGE.
Dicho rendimiento era del orden un 35% aproximadamente, referido a
la proteína total en el solubilizado, como se determinó en el
ensayo Bradford. La pureza del eluído era de más de un 80%.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad del G-CSF obtenido
mediante el procedimiento según la invención fue determinada
mediante un bioensayo y comparada con la de un
G-CSF estándar que está disponible comercialmente
(Neupogen®). Se usó para ello la línea celular murina
NFS-60, que es responsiva al G-CSF.
Esta línea celular fue cultivada en medio RPMI 1640 (de la firma
Bachem, de Heidelberg), que contenía 1,5 g/l de bicarbonato sódico,
4,5 g/l de glucosa, Hepes 10 mM y piruvato sódico 1,0 mM y había
sido suplementado con glutamina 2 mM, un 10% de FCS,
2-mercaptoetanol 0,05 mM y 60 ng/ml de
G-CSF.
Para el ensayo de la actividad las células
fueron lavadas dos veces con medio sin G-CSF,
sembradas en una concentración de 2 x 10^{4} células por pocillo
en placas de 96 pocillos, e incubadas por espacio de tres días a
37ºC y con un 4,5% de CO_{2} con distintas concentraciones del
G-CSF purificado y del patrón. A continuación de
ello fueron coloreadas con reactivo XTT, y se midió la absorción a
450 nm en un lector de placas de microtitulación. Se puso de
manifiesto que las células que habían sido tratadas con el
G-CSF purificado según la invención crecieron
exactamente igual de bien como las células que habían sido tratadas
con el patrón, por lo cual puede partirse de la base de una igual
actividad biológica de ambas muestras de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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- \bullet WO 0187925 A [0012]
- \bullet EP 0169566 A [0004]
- \bullet WO 0187925 A [0019]
- \bullet EP 0512087 A [0008]
- \bullet EP 0456200 A [0019]
- \bullet EP 0719860 A [0009]
- \bullet EP 0674525 A [0055]
- \bullet EP 0364926 B [0010]
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\vskip1.000000\baselineskip
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924-927 [0054]
Claims (18)
1. Procedimiento de obtención de
G-CSF humano biológicamente activo a partir de
cuerpos de inclusión, comprendiendo dicho procedimiento los pasos
siguientes:
a) Solubilización del G-CSF
contenido en los cuerpos de inclusión con un tampón de
solubilización que contiene un agente desnaturalizante y glutationa
reducida;
b) Replegamiento del G-CSF
mediante dilución de la preparación de solubilización con un tampón
de replegamiento que contiene glutationa reducida y oxidada en
cantidades equimolares; y
c) Purificación del G-CSF
replegado mediante al menos un paso de cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde el agente desnaturalizante es
guanidina-HCl.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
donde la concentración de guanidina-HCl es de 4,0 a
8,0 moles/l.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la concentración de glutationa
reducida en el tampón de solubilización es de 10 a 200
mmoles/l.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el tampón de solubilización
contiene además un formador de quelatos.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde por gramo de cuerpos de
inclusión se usan de 4 a 20 ml de tampón de solubilización.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde entre la solubilización y el
replegamiento no se efectúa separación alguna del tampón de
solubilización.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el tampón de replegamiento
contiene un aditivo seleccionado de entre los miembros del grupo
que consta de arginina, urea y guanidina-HCl en una
concentración que promueve el replegamiento.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
donde el aditivo es urea.
10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9,
donde el tampón de replegamiento contiene urea en una concentración
de 1,5 a 4,5 moles/l.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la concentración de glutationa
reducida y oxidada es respectivamente de 0,2 a 10 mmoles/l.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la concentración de proteína que
se aplica para el replegamiento es de menos de 2000 \mug/ml.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el replegamiento se produce a
4ºC por espacio de al menos tres horas.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde en cuanto al paso de
cromatografía que es al menos uno se trata de una cromatografía de
intercambio iónico.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
donde en cuanto a la cromatografía de intercambio iónico se trata
de una cromatografía de intercambio catiónico.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
donde la preparación de plegamiento es acidificada antes de la
cromatografía de intercambio catiónico.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 o
16, donde la elución del G-CSF se efectúa a un valor
pH de
4,0-6,0.
4,0-6,0.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde después del replegamiento pero
antes del paso de cromatografía que es al menos uno se efectúa una
filtración en lecho profundo.
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