ES2318909T3

ES2318909T3 - Uso de neurregulina para tratar la funcion de musculo cardiaco.

Info

Publication number: ES2318909T3
Application number: ES99967856T
Authority: ES
Inventors: Mingdong Zhou
Original assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Current assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2009-11-24
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: AUPP785098A0; AU2422400A; US7964555B2; EP1158998A1; EP2027869A2; US20060194734A1; EP2351573A1; ATE442156T1; EP2027869A3; US20070129296A1; EP1158998B1; US20060199767A1; US20070264254A1; US7226907B1; US20170189489A1; EP1158998A4; WO2000037095A1; ES2392596T3; EP2027869B1; DE69939950D1

Abstract

La proteína neurregulina que consiste en la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2, para utilizar en el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardiaca en un mamífero.

Description

Uso de neurregulina para tratar la función de músculo cardiaco.

Esta memoria se refiere a una proteína neurregulina específica, de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizar en el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardiaca en un mamífero; la combinación de la proteína neurregulina; y un método para identificar un agente para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca.

La insuficiencia cardiaca afecta al 1,5% de la población, aproximadamente a tres millones de americanos, desarrollándose a un ritmo de aproximadamente 400.000 nuevos casos por año en EE UU. El tratamiento actual para la insuficiencia cardiaca se dirige primariamente a la utilización de inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina (ECA) y diuréticos. Los inhibidores de la ECA parecen enlentecer la progresión de la insuficiencia cardiaca terminal; sin embargo, son incapaces de aliviar los síntomas en más del 50% de los pacientes con insuficiencia cardiaca, y reducen la mortalidad por insuficiencia cardiaca solo en aproximadamente el 15-20%. El transplante cardiaco está limitado por la disponibilidad de donantes de corazón. Con la excepción de la digoxina, la administración crónica de agentes inotrópicos positivos no ha dado como resultado un fármaco útil sin efectos secundarios adversos, incluyendo el aumento de arritmias, o la muerte súbita. Estas deficiencias en la terapia actual sugieren la necesidad de aproximaciones terapéuticas adicionales.

El crecimiento de las células musculares cardiacas cambia desde la proliferación a la hipertrofia durante el desarrollo del corazón. El primer proceso se caracteriza por un aumento en el número de células musculares cardiacas, y el segundo por un aumento del tamaño del tamaño celular sin síntesis de DNA ni división celular. Este cambio se asocia con la diferenciación definitiva (terminal) de las células musculares cardiacas y ocurre gradualmente durante el desarrollo cardiaco, comenzando durante los últimos estadios embrionarios y finalizando unas cuantas semanas después del nacimiento. Durante este periodo, la expresión génica, particularmente la que incluye el ciclo y señalización celulares, se reprograma. Por ejemplo, la expresión de un número de receptores de proteínas tirosín quinasas y otros componentes del ciclo celular disminuye. El fenotipo celular también cambia, ya que las adhesiones célula-célula y las proteínas contráctiles están más organizadas en las células miocárdicas definitivamente diferenciadas.

La hipertrofia cardiaca del adulto es una importante respuesta fisiológica adaptativa al aumento de las demandas para el trabajo cardiaco, o después de una variedad de estímulos patológicos que llevan a daño cardiaco. Las células hipertróficas normales tienen un tamaño grande y unidades contráctiles bien organizadas, así como adhesiones fuertes célula-célula. Aunque las células patológicamente hipertróficas también tienen un tamaño grande y una acumulación de proteínas, frecuentemente muestran desorganización de las proteínas contráctiles (desorganización de las estructuras sarcoméricas), y una adhesión pobre célula-célula (desorganización de las miofibras). Así, en la hipertrofia patológica, el aumento del tamaño y la acumulación de proteínas contráctiles están asociados con un ensamblaje desorganizado de las estructuras sarcoméricas y una ausencia de interacciones robustas célula-célula (Brawnwald (1994), en Pathophysiology of Heart Failure, [Brawnwald, ed]; Saunders, Filadelfia; Vol 14, páginas 393-402).

La desorganización de las miofibras y las sarcómeras son datos importantes en la miocardiopatía. La primera es una alteración de la asociación célula-célula, y la última es una desorganización de las proteínas contráctiles musculares cardiacas. Éstas están influenciadas por señales celulares específicas. Así, un número de señales, como factores de crecimiento y hormonas, alteran la adhesión celular y la estructura sarcomérica. Sin estos estímulos, los cardiomiocitos muestran descorganización del citoesqueleto y de las estructuras sarcoméricas, así como una disociación de las interacciones célula-célula. Como la diferenciación de las células musculares cardiacas está estrechamente asociada con el remodelado de las células cardiacas, la organización de las proteínas de adhesión y contráctiles, factores que estimulan la diferenciación de las células miocárdicas, pueden ser críticos para aumentar el ensamblaje de las estructuras sarcoméricas de las células musculares cardiacas adultas.

Estudios realizados en un modelo in vitro de células musculares cardiacas, han llevado a la identificación de un número de estímulos mecánicos, hormonales, de factores de crecimiento, y patológicos, que pueden activar varios signos de hipertrofia cardiaca con fenotipo independiente (Chien et al. (1991) FASEB J 5:3037-3046; Zhou et al. (1995) PNAS USA 92:7391-7395). Actualmente, existen al menos tres vías de transducción de señal celular, que implican tanto a ras-, rho- y G_{q}, efectores dependientes de proteína aguas abajo, implicados en la activación de los signos de la respuesta hipertrófica en estos modelos in vitro. Mientras que se ha realizado un gran progreso en descubrir las vías de señalización que activan la respuesta hipertrófica de la célula muscular ventricular, se sabe relativamente poco sobre los mecanismos que estimulan específicamente la diferenciación definitiva (terminal) de las células musculares cardiacas, y el ensamblaje de las proteínas contráctiles asociado con la diferenciación definitiva. Los compuestos que puedan influenciar estos procesos pueden formar una nueva clase principal de fármacos terapéuticos para el tratamiento de una diversidad de enfermedades cardiacas.

Las neurregulinas, una familia de factores de crecimiento similares a EGF, activan el receptor ErbB de las tirosín quinasas, que pertenecen a la superfamilia del receptor EGF, y están implicadas en un conjunto de respuestas biológicas: estimulación de la diferenciación de las células del cáncer de mama y la secreción de las proteínas de la leche; inducción de la diferenciación de las células de la cresta neural a células de Schwann; estimulación de la síntesis de receptores de acetil-colina en las células del músculo esquelético; y promoción de la supervivencia y la síntesis de DNA de las células miocárdicas. Estudios in vivo de embriones de ratón homocigotos, con alteraciones dirigidas al gen de neurregulina, con defectos graves en la formación de las trabéculas ventriculares y en el desarrollo de los ganglios de la raíz dorsal, indican que la neurregulina es esencial para el desarrollo cardiaco y neural. Sin embargo, la información sobre como la neurreguina controla la diferenciación celular, y sus vías de señalización aguas abajo, es limitada.

Dentro del corazón, la neurregulina y los receptores ErbB son expresados respectivamente en la capa interna del endocardio y la capa muscular cardiaca en los estadios tempranos de desarrollo. Como estas dos capas están ampliamente separadas, el ligando neurregulina debe atravesar el espacio entre las dos capas celulares para activar a sus receptores correspondientes ErbB. La activación de estos receptores en las células miocárdicas es necesaria para promover el crecimiento de las células musculares o la migración hacia el endocardio, que dan como resultado la formación de estructuras similares a dedos (trabéculas ventriculares), entre estas dos capas. No está claro previamente si la neurregulina estimula la diferenciación de las células miocárdicas.

You-yan Zhao et al (The Journal of Biological Chemistry, Vol 273; nº 17, página 10261, 1998), describe que la señalización de la neurregulina puede estar implicada en la adaptación cardiaca al estrés fisiológico (es decir, al "remodelado" ventricular).

El documento WO 96/15812 describe las neurregulinas para el tratamiento de las enfermedades neurológicas, y Jack Jiagong Zhaoeral (Development, Vol 125, 1998; páginas 1899-1907), describe la disrupción selectiva de la función de la neurregulina-1 en vértebras de embriones, utilizando transgenes de ribozyma – tRNA.

El presente inventor ha encontrado ahora que la neurregulina y/o su acción celular pueden ser adecuadas para utilizar en la detección, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad cardiaca. Es más, el inventor cree que los beneficios potenciales de la neurregulina y/o su acción celular pueden ser específicos para las células musculares cardiacas, y no necesariamente aplicable a las células musculares esqueléticas o lisas, ya que, 1) las células musculares cardiacas, esqueléticas y lisas son tanto embriológicamente como funcionalmente distintas; 2) los factores implicados en el crecimiento y diferenciación del músculo esquelético, tales como MyoD, tienen un papel pequeño, o no tienen ningún papel, en el crecimiento y la diferenciación del músculo cardiaco; 3) la inactivación de los genes para los receptores ErbB2 ó 4, o la neurregulina, produce defectos importantes en el desarrollo del músculo cardiaco, pero no el del músculo esquelético o liso; 4) como se muestra aquí, el factor de crecimiento I similar a insulina (IGF-I), produce proliferación de miocitos embrionarios pero, al contrario que la neurregulina, no estimula la diferenciación de estas células. Por el contrario, el IGF-I, pero no la neurregulina, ha demostrado inducir hipertrofia muscular.

La presente memoria está basada en parte en el descubrimiento de que la neurregulina aumenta la diferenciación de las células musculares cardiacas y la organización de las estructuras sarcoméricas y del citoesqueleto, así como la adhesión célula-célula. La neurregulina, los péptidos de neurregulina, los derivados de neurregulina, o los compuestos que simulan las actividades de la neurregulina, entran dentro del alcance de los métodos de la presente invención, y a partir de aquí se abreviarán como NRG.

En un primer aspecto, la presente memoria se refiere a una proteína neurregulina que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEQ ID NO:2, para utilizar en el tratamiento o prevención de la insuficiencia cardiaca en un mamífero.

En un segundo aspecto, la presente memoria se refiere a una combinación; dicha combinación comprende una cantidad efectiva de una proteína neurregulina y una cantidad efectiva de un agente que causa hipertrofia o insuficiencia cardiaca congestiva, donde dicha proteína neurregulina consiste en la SEQ ID NO:2, donde el agente es acetato de fludrocortisona o herceptina.

En un tercer aspecto, la presente memoria se refiere a una combinación, dicha combinación comprende una cantidad efectiva de proteína neurregulina, y una cantidad efectiva de un agente que actúa para suprimir una vía de inducción de la hipertrofia diferente de la vía suprimida por dicha proteína neurregulina, donde dicha proteína neurregulina consiste en la SEQ ID NO:2, donde el agente se selecciona de un grupo que consiste en un inhibidor de la ECA, la hormona de crecimiento humana, el IGF-I, un factor antiarrítmico, y un factor inotrópico.

En un cuarto aspecto, la presente memoria se refiere a una combinación; dicha combinación comprende una cantidad efectiva de proteína neurregulina, y una cantidad efectiva de un agente para tratar o prevenir la hipertensión, donde dicha proteína neurregulina consiste en la SEQ ID NO:2, donde el agente es un anticuerpo contra el receptor de la endotelina, o un antagonista de alfa o beta-adrenorreceptor.

En un quinto aspecto, la presente memoria se refiere a un método de identificación de un agente para tratar la insuficiencia cardiaca; dicho método comprende la valoración de la unión de la neurregulina y/o activación de los receptores ErbB-2-ErbB-3 o ErbB-2-ErbB-4, en presencia o ausencia de un polipéptido o un compuesto de ensayo, y la identificación de un polipéptido o un compuesto de ensayo que aumenta la unión de la neurregulina o la activación de los receptores ErbB-2-ErbB-3 o ErbB-2-ErbB-4, como un agente para tratar la insuficiencia cardiaca.

La presente memoria además se refiere a la utilización de la proteína neurregulina, de acuerdo con la SEQ ID NO:2, o las presentes combinaciones, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca congestiva en un mamífero.

\newpage

También se describe un método para producir crecimiento y/o diferenciación de los cardiomiocitos; el método comprende exponer los cardiomiocitos a NRG, activando así la vía de las MAP quinasas en los cardiomiocitos, y ocasionando crecimiento y/o diferenciación de los cardiomiocitos.

También se describe un método de inducir remodelación de las estructuras sarcoméricas y del citoesqueleto de las células musculares, o las adhesiones célula-célula; el método comprende tratar las células con neurregulina, activando así la vía de las MAP quinasas en las células y causando remodelación de las estructuras celulares y de las adhesiones célula-célula.

Se apreciará que la neurregulina puede proporcionarse directamente a la célula, o proporcionarse indirectamente induciendo que la neurregulina sea producida en las células, mediante la inducción de la expresión del gen o los genes implicados en la producción de neurregulina. La producción puede ser en la misma célula hacia la cual se dirige el método, de una forma autocrina, o por otra célula de una forma paracrina.

También se describe un método de identificar polipéptidos o compuestos que estimulan la diferenciación de las células musculares cardiacas; el método comprende poner en contacto a las células cardiacas con un polipéptido o un compuesto de ensayo, en presencia de un inductor de la proliferación de las células musculares cardiacas en la forma de la neurregulina, y medir el desarrollo de la diferenciación de las células musculares cardiacas.

La diferenciación de las células musculares cardiacas se mide preferiblemente en células expuestas a neurregulina u otros polipéptidos de ensayo, o a una mezcla de neurregulina con el polipéptido de ensayo. La diferenciación de las células musculares cardiacas puede medirse con una variedad de formas, incluyendo el cálculo del aumento o la disminución de la síntesis de DNA, el análisis del curso de tiempo de fosforilación de las MAP quinasas en las células musculares cardiacas, la evaluación de la expresión del inhibidor del ciclo celular p21^{CIP1}, la organización de las unidades contráctiles, la acumulación de unidades contráctiles, la alteración fenotípica de las fibras de actina del citoesqueleto, y el fenotipo de las adhesiones célula-célula.

En el método de identificación de polipéptidos o compuestos que estimulan la diferenciación de las células musculares cardiacas, las células con incubadas preferiblemente con diferentes concentraciones de varios péptidos o compuestos y se mide el efecto del péptido o compuesto de ensayo a diferentes concentraciones sobre la diferenciación de las células musculares cardiacas.

En el método de identificación de polipéptidos o compuestos que inducen diferenciación de las células musculares cardiacas que predomina sobre el posible inductor de la proliferación de las células musculares cardiacas, el factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1), las células son incubadas preferiblemente con IGF-1, con o sin el polipéptido o compuesto de ensayo, y se miden la capacidad del polipéptido o compuesto de ensayo para inhibir la síntesis de DNA de las células musculares cardiacas mediada por IGF-1, el ensamblaje de las estructuras sarcoméricas y la adhesión célula-célula.

Las células también pueden ser incubadas con fenilefrina (PE) con y sin el polipéptido o compuesto de ensayo, y se determina la capacidad del polipéptido o compuesto de ensayo para aumentar la diferenciación de las células musculares cardiacas inducida por PE. Un polipéptido de ensayo que estimula la diferenciación de las células musculares cardiacas puede estimular el ensamblaje de las sarcómeras y aumentar así la función del corazón de una variedad de formas, incluyendo la activación de los receptores específicos de neurregulina, por ejemplo ErbB2, ErbB3 y ErbB4.

También se describe la identificación de polipéptidos o compuestos que inhiben la estimulación por la neurregulina de la diferenciación de las células ventriculares; el método comprende poner en contacto las células musculares ventriculares con el polipéptido o compuesto de ensayo, en presencia de neurregulina, y medir cualquier inhibición de la estimulación de las células musculares ventriculares por la neurregulina.

Un compuesto puede inhibir la estimulación de la diferenciación de las células musculares ventriculares mediante el bloqueo, la supresión, la reversión o el antagonismo de la acción de la neurregulina. La medición puede ser mediante detección de la síntesis de DNA de las células musculares vetriculares.

También se describe un método terapéutico para tratar o prevenir la disociación de la adhesión célula-célula del músculo cardiaco, y/o la desorganización de las estructuras sarcoméricas en un mamífero; el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una neurregulina o sus derivados.

El método terapéutico se dirige preferiblemente a tratar la insuficiencia cardiaca que resulta de la disociación de la adhesión célula-célula del músculo cardiaco y/o la desorganización de las estructuras sarcoméricas en el mamífero.

También se describe un método para prevenir o disminuir la incidencia de enfermedad cardiaca en un mamífero; el método comprende prevenir o disminuir la interferencia o efectos de los polipéptidos o compuestos sobre la acción de la neurregulina y sus receptores, ErbBs, que producen insuficiencia cardiaca.

Un agente terapéutico que simula los efectos de la neurregulina puede utilizarse para tratar o prevenir la disfunción de las células musculares cardiacas mediada por PE o IGF-1.

También se describe un método para determinar la predisposición a la enfermedad cardiaca en un sujeto; el método comprende analizar células cardiacas del sujeto o células relacionadas, para su capacidad de expresar y/o producir niveles normales o adecuados de neurregulina o de sus receptores ErbB. La incapacidad para expresar y/o producir niveles normales o adecuados de neurregulina sería indicativa de predisposición a enfermedad cardiaca o insuficiencia cardiaca.

Utilizando células miocárdicas primarias en cultivo como modelo, el presente inventor evaluó la señalización de la neurregulina en la diferenciación, maduración y ensamblaje o mantenimiento de las estructuras sarcomérica y del citoesqueleto del miocito cardiaco. Para analizar el efecto de la nuerregulina en la señalización celular, se incubaron células musculares cardiacas embrionarias con el ligando de la neurregulina humana purificado recombinante (rhNRG\beta2). La neurregulina a 10^{-8} M dio como resultado una activación sostenida de las MAP quinasas durante al menos 21 horas, mientras que solo se observó activación transitoria con concentraciones menores (10^{-10} M) de rhNRG\beta2. La expresión del inhibidor de Cdk, p21^{CIP1}, aumentó con la concentración de 10^{-8} M, pero no con la concentración 10^{-10} M del ligando. La concentración de ligando más alta, concomitantemente con este aumento en la expresión de p21^{CIP1}, dio como resultado una disminución en la síntesis de DNA, que se asociaba con la diferenciación definitiva (terminal), mientras que se observó un aumento en la síntesis de DNA y una proliferación continuada con una dosis menor. Además, cuando la neurregulina se mezclaba con IGF-1, el rhNRG\beta2 a cualquier concentración (10^{-8} M ó 10^{-10} M), no mostró un efecto negativo sobre la síntesis de DNA y bloqueó significativamente la proliferación de cardiomiocitos estimulados con IGF-1. Para evaluar mejor la diferenciación de las células miocárdicas estimuladas por NRG, se examinaron las estructuras sarcoméricas y del citoesqueleto de células musculares cardiacas de rata recién nacida, mediante tinción con Faloidina y tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-\alpha-actinina. El rhNRG\beta2 mejoró dramáticamente las estructuras sarcoméricas y del citoesqueleto, así como las adhesiones célula-célula. Dicho efecto no se encontró en células estimuladas con IGF-1 o con PE. Cuando el rhNRG\beta2 se mezcló con IGF-1 o PE, el rhNRG\beta2 mejoró las estructuras celulares. La concentración 10^{-8} M de rhNRG\beta2 mostró el máximo efecto en la mejoría de las sacómeras y las adhesiones célula-célula. Además, la neurregulina superó la regulación negativa de la expresión de MHC-\alpha mediada por la estimulación de PE. Estos hallazgos indican que la NRG funciona a través de dos vías diferentes: una activada a concentraciones bajas de ligando, que da como resultado el crecimiento de los cardiomiocitos, mientras que la otra, activada a concentraciones altas, está mediada por la activación sostenida de la vía de las MAP quinasas, y da como resultado la diferenciación y maduración definitivas (terminales).

A través de esta memoria, a no ser que el contexto indique otra cosa, el término "comprende" o sus variaciones como "comprender" o "comprendiendo", se entenderá que implica la inclusión de un elemento dado, íntegro o parte, o un grupo de elementos, íntegros o partes, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, íntegro o parte, o grupo de elementos, íntegros o partes.

Para que la presente memoria pueda entenderse más claramente, se describirán formas preferidas, con referencia a los siguientes ejemplos y dibujos.

Figura 1. Síntesis de DNA estimulada por factor de crecimiento. Síntesis de DNA (incorporación de [^{3}H] timidina) por cardiomiocitos de ratón embrionarios en respuesta a 20 horas de tratamiento con las concentraciones indicadas de vehículo (péptido Flag purificado) (cuadrados abiertos), NRG\beta2 recombinante humana (rhNRG\beta2) (triángulos cerrados) o factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) (círculos abiertos). Los datos que se muestran son la medias \pm DE de cinco determinaciones con cada tratamiento y a cada concentración. Todas las respuestas a rhNRG\beta2 son significativamente mayores que el control (p<0,001), excepto a la concentración 10^{-7} M, y las respuestas de rhNRG\beta2 a concentración 10^{-9} M son significativas en relación a las respuestas respectivas a IGF-1 (p<0,01).

Figura 2. Fosforilación del receptor ErbB mediada por NRG. (a) Se estimularon cardiomiocitos derivados de suero con vehículo (0) o con rhNRG\beta2 a una concentración de 10^{-10} M ó 10^{-8} M, durante los tiempos indicados. La fosforilación de los receptores ErbB se determinó como se describió en Métodos, utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina (RC20H). Se muestran los incrementos en las intensidades del inmunoblot, que están normalizadas para la carga de proteína, con relación a las intensidades de los inmunoblots de ErbB2 determinadas simultáneamente, mostradas bajo las especies de fosfotirosina. (b) Fosofrilación de ErbB2 i (panel superior) o ErbB4 (panel inferior) inmunoprecipitado, que resulta de la estimulación de cardiomiocitos embrionarios durante 5 minutos con rhNRG\beta2 10^{-10} M ó 10^{-8} M. Los estudios se realizaron como se detalla en Métodos y los productos inmunoprecipitados se evaluaron mediante inmuno-blotting con anti-fosfotirosina, anticuerpos anti-ErbB2 o anti-ErbB4. Se muestran los cambios en las intensidades del inmunoblot, que están normalizadas para la carga de proteína, con relación a las intensidades de los inmunoblots de ErbB2 o ErbB4 determinadas simultáneamente, mostradas bajo las especies de fosfotirosina.

Figura 3. Activación de MAP quinasa estimulada por NRG o IGF-1. (a) Fosforilación de MAP quinasa que resulta de la estimulación de cardiomiocitos embrionarios con rhNRG\beta2 (10^{-10} M ó 10^{-8} M) durante los tiempos mostrados. Después del tratamiento con rhNRG\beta2, se prepararon extractos celulares y se evaluaron para fosforilación de MAP quinasa, utilizando un anticuerpo anti-fosfo MAP quinasa, como se describe en Métodos. Se muestran los cambios en las intensidades de inmunoblot bajo las especies de fosfotirosina. Para controlar para la carga de proteína, los extractos celulares se evaluaron simultáneamente para expresión de ErbB2 mediante análisis de inmunoblot utilizando anticuerpo anti-ErbB2. (b). La actividad catalítica de las MAP quinasas se determinó como se describe en Métodos, utilizando extractos preparados de cardiomiocitos tratados con rhNRG\beta2 (10^{-10} M ó 10^{-8} M) durante los tiempos indicados, y se muestran como los incrementos sobre el nivel de actividad basal de las células que no están estimuladas con rhNRG\beta2. Los valores de los incrementos se muestran como las medias \pm DE de cinco determinaciones con cada tratamiento y a cada concentración. (c) La fosforilación de la MAP quinasa que resulta de la estimulación de cardiomiocitos embrionarios con IGF-1 (10^{-9} M) durante los tiempos indicados, se determinó como se hizo
en (a).

Figura 4. Efectos de NRG sobre la síntesis de DNA y la fosforilación de la MAP quinasa estimulada por IGF-1. (a) La síntesis de DNA (incorporación de [^{3}H timidina]), se examinó en células cultivadas estimuladas con una concentración máxima de IGF-1 (10^{-9} M), en ausencia o presencia de rhNRG\beta2 a concentraciones de 10^{-10} M ó 10^{-8} M durante 20 horas. Las barras muestran los valores medios de los datos de cinco muestras, \pm DE (barras de error). Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. Se indican las diferencias significativas (***, p<0,001) respecto al experimento de control. (b) El curso de tiempo de fosforilación de MAPK en células musculares cardiacas embrionarias en respuesta a una mezcla de IGF-1 10^{-9} M y rhNRG\beta2 10^{-8} M se determinó mediante inmunoblotting, utilizando un anticuerpo anti-fosfo-MAPK específico. La expresión de ErbB se evaluó simultáneamente, para controlar para la carga de proteína.

Figura 5. Inducción de expresión de p21^{CIP1} mediada por NRG. (a) Expresión de p21^{CIP1} en células musculares cardiacas cultivadas, estimuladas con rhNRG\beta2 10^{-10} M ó 10^{-8} M, en ausencia o presencia de suero (5% de FBS) durante 24 horas; o (b) con IGF-1 10^{-10} M ó 10^{-8} M. Después de varios tratamientos, la expresión de p21^{CIP1} se evaluó mediante análisis de inmunoblot utilizando un anticuerpo anti-p21^{CIP1}. Se evaluó simultáneamente la expresión de ErbB2, para controlar para la carga de proteína. Se muestran los cambios en la expresión de p21^{CIP1}, normalizados para la carga de proteína. (c) Efecto del inhibidor MEK (PD98059) (50 \muM) sobre la estimulación de la expresión de p21^{CIP1} mediada por rhNRG\beta2 (a 10^{-10} M ó 10^{-8} M), en células musculares cardiacas embrionarias cultivadas en ausencia de suero. El p21^{CIP1} se detectó mediante análisis de inmunoblotting utilizando un anticuerpo anti-p21^{CIP1}. Se muestran los cambios en la expresión de p21^{CIP1}, normalizados para la carga de proteína. (d) Los efectos de PD98059 sobre la inhibición de las actividades de MAP quinasas activadas por NRG o IGF-1, se monitorizaron mediante la medición de la fosforilación p42/44 de MAP quinasa, después de que las células fueran estimuladas con NRG o IGF-1 durante 5 minutos. La fosforilación p42/44 de MAP quinasa se evaluó mediante análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos anti-fosfo-p42/44 o anti-p42/44 MAP quinasa.

Figura 6. Efectos de NRG sobre el ensamblaje de la sarcómera cardiaca y la expresión de las cadenas pesadas de miosina. (a) células musculares cardiacas de ratón E12.5 se cultivaron en medio libre de suero (control) o estimuladas con rhNRG\beta2 10^{-10} M ó 10^{-8} M (NRG) durante 48 horas. Las células se tiñeron después con faloidina (paneles izquierdos) o se evaluaron para inmunofluorescencia con anti-\alpha-actinina (paneles derechos). (b) Se evaluaron las expresiones de la cadena pesada de la miosina sarcomérica y de \alpha-actina, en células musculares cardiacas embrionarias de ratón, estimuladas con rhNRG\beta2, mediante análisis de inmunoblot, utilizando un anticuerpo anti-cadena pesada de la miosina sarcomérica (MF20) o un anticuerpo anti-\alpha-actina. La misma cantidad de extractos celulares totales (20 \mug de proteína), se cargó en cada carrera para su fraccionamiento mediante SDS-PAGE.

Utilizando un sistema in vitro de diferenciación de células musculares cardiacas, se ha demostrado un papel para la neurregulina sobre la activación de la respuesta de diferenciación en comparación con dos factores de estímulo hormonal y de crecimiento bien definidos, los agonistas \alpha-adrenérgicos y el IGF-1. El presente inventor ha demostrado que existen vías de diferenciación de neurregulina dentro de las células musculares cardiacas, y que los polipéptidos de neurregulina pueden activar estas vías. Como la diferenciación de las células musculares cardiacas incluye los procesos de organización de las estructuras sarcoméricas y las adhesiones célula-célula, se describe un método útil para el tratamiento y la prevención de la célula muscular cardiaca con desorganización de las estructuras sarcoméricas y las adhesiones célula-célula, y el aumento de la función del corazón en la miocardiopatía, y para la identificación de polipéptidos o compuestos que activan las vías de diferenciación muscular cardiaca.

A no ser que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por cualquier experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas aquí, tienen el propósito de describir los materiales en conexión con los cuales se cita la referencia.

Definiciones

"Neurregulina o análogos de neurregulina" son moléculas que pueden activar los heterodímeros de proteína tirosín quinasa ErbB2/ErbB4 o ErbB2/ErbB3, tales como las isoformas de neurregulina, el dominio EGF de la neurregulina solo, los mutantes de neurregulina, y cualquier tipo de producto de un gen similar a la neurregulina, que también activa los receptores anteriores. La "neurregulina" utilizada en esta memoria es el siguiente polipéptido, que es un fragmento de la isoforma \beta2 de neurregulina, que contiene el dominio similar a EGF, el dominio de unión al receptor.

La secuencia de aminoácidos que codifica la proteína neurregulina de la memoria:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ

(SEQ ID NO:2)

"Diferenciación de células musculares cardiacas" es una condición caracterizada por la disminución de la síntesis de DNA en más del 10%, inhibición de la síntesis de DNA estimulada por otros factores de más del 10%, estructuras sarcoméricas y adhesiones célula-célula bien organizadas, activación sostenida de MAP quinasas, y expresión aumentada de p21^{CIP1}.

"Estructuras sarcoméricas organizadas, o aumento de la organización de las sarcómeras" es una condición caracterizada por la disposición recta de las proteínas contráctiles, revelada por tinción de inmunofluorescencia de \alpha-actinina en células musculares cardiacas. La disposición recta de las proteínas \alpha-actinina en las células puede distinguirse por microscopia, y su fotografía se ejemplifica en las Figuras de esta memoria.

"Estructuras sarcoméricas desorganizadas o desorganización de sarcómeras" es el significado opuesto a las anteriores definiciones.

"Estructuras del citoesqueleto organizadas, o aumento de la organización de las estructuras del citoesqueleto" es una condición caracterizada por unas fibras de actina rectas, revelada por la tinción con faloidina de las células musculares cardiacas. Las fibras de actina rectas en las células pueden distinguirse por microscopia y su fotografía se ejemplifica en las Figuras de esta memoria.

"Estructuras del citoesqueleto desorganizadas o desorganización de las estructuras del citoesqueleto" es el significado opuesto de las definiciones anteriores.

"Activación sostenida de las MAP quinasas" significa que el estado fosforilado de las MAP quinasas, p42/44, se mantiene durante al menos 21 horas en las células.

"Expresión aumentada de p21^{CIP1}" significa que la expresión de p21^{CIP1} está aumentada al menos el 50%, que se mantiene durante al menos 24 horas en las células.

"El tratamiento de las enfermedades del corazón", incluye todos los tipos de métodos adecuados, tales como la inyección venosa del polipéptido de neurregulina, y los métodos de terapia génica, en los que a células del corazón u otras células, se les induce a contener un gen que codifica la neurregulina o sus derivados, para el tratamiento de las enfermedades del corazón. Por ejemplo, los Adenovirus, o los Virus Asociados a Adenovirus pueden utilizarse como un transportador para liberar el gen de la neurregulina en las células del corazón u otras células infectadas. La célula infectada puede expresar y secretar el polipéptido neurregulina para activar los ErbBs sobre las células musculares ventriculares.

"La hipertrofia de las células musculares ventriculares" es una condición caracterizada por un aumento del tamaño individual de las células musculares ventriculares, siendo el aumento del tamaño celular suficiente para dar como resultado un diagnóstico clínico del paciente, o suficiente como para permitir que las células sean determinadas como más grandes (por ejemplo, 2 o más veces más grandes que las células no hipertróficas). Puede acompañarse de acumulación de proteínas contráctiles dentro de las células cardiacas individuales y activación de la expresión génica embrionaria.

Se conocen métodos in vivo e in vitro para determinar la presencia de hipertrofia de las células musculares ventriculares. Los ensayos in vitro para la hipertrofia de las células musculares ventriculares incluyen aquellos métodos descritos aquí, es decir, el aumento del tamaño celular y el aumento de la expresión del factor auricular natriurético (AND). Los cambios en el tamaño celular se utilizan en un sistema de recuento por escala, para determinar la extensión de la hipertrofia. Estos cambios pueden verse con un microscopio de fase inversa, y el grado valorado de hipertrofia con una escala arbitraria de 7 a 0, donde 7 significa células completamente hipertrofiadas y 3 significa células no estimuladas. Los estados 3 y 7 pueden verse en Simpson et al. (1982) Circulation Res 51:787-801, Figuras 1, A y B, respectivamente. Se ha determinado que la correlación entre el recuento en la escala de hipertrofia y el área de superficie celular (\mum^{2}) es lineal (coeficiente de correlación 0,99). En la hipertrofia inducida por fenilefrina, las células no expuestas (normales) tienen un recuento en la escala de hipertrofia de 3 y un área de superficie/célula de 58 \mum^{2}, y las células completamente hipertrofiadas tienen un recuento en la escala de hipertrofia de 7 y un área de superficie/célula de 1811 \mum^{2}, o aproximadamente 200% de lo normal. Las células con un recuento en la escala de hipertrofia de 4, tienen un área de superficie/célula de 771 \mum^{2}, o aproximadamente un tamaño un 30% mayor que las células no expuestas; las células con un recuento en la escala de hipertrofia de 5, tienen un área de superficie/célula de 1109 \mum^{2}, o aproximadamente un tamaño un 90% mayor que las células no expuestas; y las células con un recuento en la escala de hipertrofia de 6, tienen un área de superficie/célula de 1366 mm^{2}, o aproximadamente un tamaño un 135% mayor que las células no expuestas. La presencia de hipertrofia de las células musculares ventriculares preferiblemente incluye células que exhiben un aumento de tamaño de alrededor del 15% (recuento en la escala de hipertrofia de 3,5), o más. Los inductores de hipertrofia varían en su capacidad para inducir una respuesta hipertrófica máxima como la evaluada por recuento en escala en los ensayos descritos previamente. Por ejemplo, el máximo aumento en el tamaño celular inducido por endotelina es aproximadamente un recuento en la escala de hipertrofia de 5.

"Supresión" de la hipertrofia de las células musculares ventriculares significa una reducción en uno de los parámetros indicativos de hipertrofia en relación con la condición hipertrófica, o una prevención de un aumento en uno de los parámetros que indican hipertrofia en relación con la condición normal. Por ejemplo, la supresión de la hipertrofia de las células musculares ventriculares puede medirse como una reducción en el tamaño celular, en relación con la condición hipertrófica. La supresión de la hipertrofia de las células musculares ventriculares significa una disminución en el tamaño de las células de un 10% o mayor, en relación con la observada en la condición hipertrófica. Más preferiblemente, la supresión de la hipertrofia significa una disminución en el tamaño celular del 30% o más; más preferiblemente, la supresión de la hipertrofia significa una disminución en el tamaño celular del 50% o más. En relación con el ensayo del recuento en la escala de hipertrofia, cuando se utiliza fenilefrina como el agente inductor, estas reducciones se deberían correlacionar con los recuentos en la escala de hipertrofia de alrededor de 6,5 o menos, 5,0-5,5, y 4,0-5,0, respectivamente. Cuando se utiliza un agente diferente como agente inductor, la supresión se mide en relación al máximo tamaño celular (o recuento en la escala de hipertrofia), medida en presencia de dicho inductor.

La prevención de la hipertrofia de las células musculares ventriculares, se determina mediante la prevención de un aumento en el tamaño celular, en relación a las células normales, en presencia de una concentración del inductor suficiente para inducir plenamente el desarrollo de hipertrofia. Por ejemplo, la prevención de la hipertrofia significa un aumento en el tamaño celular menor que el 200% mayor que en las células no inducidas, en presencia de la concentración inductora máxima del inductor. Más preferiblemente, la prevención de la hipertrofia significa un aumento en el tamaño celular menor que el 135% mayor que en las células no inducidas; y más preferiblemente la prevención de la hipertrofia significa un aumento en el tamaño celular menor que el 90% mayor que en las células no inducidas. En relación con el ensayo de recuento en la escala de hipertrofia, cuando se utiliza fenilefrina como agente inductor, la prevención de la hipertrofia en presencia de la concentración de máximo estímulo de fenilefrina, significa un recuento en la escala de hipertrofia de alrededor de 6,0-6,5, 5,0-5,5, y 4,0-4,5, respectivamente.

La determinación de la hipertrofia in vivo incluye mediciones de los parámetros cardiovasculares, tales como la presión sanguínea, el ritmo cardiaco, las resistencias vasculares sistémicas, la contractilidad, la fuerza del latido cardiaco, la hipertrofia concéntrica o dilatada, la presión sistólica del ventrículo izquierdo, la presión media del ventrículo izquierdo, la presión del final de la diástole del ventrículo izquierdo, el gasto cardiaco, el índice de accidente cerebro-vascular, los parámetros histológicos, y el tamaño ventricular y el grosor de la pared. Los modelos animales disponibles para la determinación del desarrollo y la supresión de la hipertrofia de las células musculares ventriculares in vivo, incluyen el modelo de ratón de sobrecarga de presión, el modelo disfuncional murino RV, modelo de ratón transgénico, y el modelo de rata post infarto de miocardio. Se conocen métodos médicos para evaluar la presencia, desarrollo, y supresión de la hipertrofia de las células musculares ventriculares en pacientes humanos, e incluyen, por ejemplo, mediciones de parámetros diastólicos y sistólicos, estimaciones de la masa ventricular, y flujos de las venas pulmonares.

Los términos "tratamiento", "tratar", y similares, se utilizan aquí para significar de forma general, la obtención de un efecto deseado farmacológico y/o fisiológico. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o uno de sus síntomas, y/o puede ser terapéutico en términos de una curación completa o parcial para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como aquí se utiliza, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye:

prevenir que ocurra la enfermedad en un sujeto que pueda estar predispuesto a la enfermedad, pero que todavía no ha sido diagnosticado de tenerla;

inhibir la enfermedad, es decir, frenar su desarrollo; o

aliviar la enfermedad, es decir, causar regresión de la enfermedad.

La invención se dirige a tratar pacientes con o en riesgo de desarrollar una enfermedad del corazón y condiciones relacionadas, por ejemplo, la insuficiencia cardiaca. Más específicamente, "tratamiento" se entiende que significa proporcionar un efecto terapéuticamente detectable y beneficioso en un paciente que sufre de una enfermedad del corazón.

Mediante la expresión "insuficiencia cardiaca" se quiere expresar una anormalidad en la función cardiaca en la que el corazón no bombea sangre al ritmo necesario para los requerimientos de los tejidos que están metabolizando. La insuficiencia cardiaca incluye un amplio rango de estados de enfermedad, tales como la insuficiencia cardiaca congestiva, el infarto de miocardio, la taquiarritmia, la miocardiopatía hipertrófica familiar, la enfermedad cardiaca isquémica, la miocardiopatía dilatada idiopática, y la miocarditis. La insuficiencia cardiaca puede estar causada por cualquier número de factores, incluyendo las formas isquémica, congénita, reumática o idiopática. La hipertrofia cardiaca crónica es un estado de enfermedad significativo, que es precursor de insuficiencia cardiaca congestiva y de parada cardiaca.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o endentecer (disminuir) la hipertrofia. Aquellos con necesidad de un tratamiento incluyen aquellos que tiene ya la enfermedad, así como aquellos con predisposición a tener la enfermedad o aquellos en los que la enfermedad debe prevenirse. La hipertrofia puede ser producida por cualquier causa que responde a ácido retinoico, incluyendo las causas congénita, viral, idiopática, cardiotrófica o miotrófica, o que ocurre como resultado de isquemia o insultos isquémicos tales como el infarto de miocardio. Típicamente, el tratamiento se realiza para parar o enlentecer la progresión de la hipertrofia, especialmente después de daño cardiaco, tal como cuando ha ocurrido isquemia. Preferiblemente, para el tratamiento del infarto de miocardio, el o los agente(s) se dan inmediatamente después del infarto de miocardio, para prevenir o disminuir la hipertrofia.

Las expresiones "sinérgico" o "efecto sinérgico" y similares, se utilizan aquí para describir las mejorías en los efectos del tratamiento obtenidos mediante combinación de uno o más agentes terapéuticos con uno o mas compuestos de ácido retinoico. Aunque un efecto sinérgico en algunos campos significa un efecto que es más que aditivo (por ejemplo 1+1=3), en el campo de la terapia médica un efecto aditivo (1+1=2) o menos que aditivo (1+1=1,6), puede ser sinérgico. Por ejemplo, si cada uno de dos fármacos funciona para inhibir el desarrollo de hipertrofia de las células musculares ventriculares de un 50% si se dan individualmente, no sería esperable que los dos fármacos pudieran combinarse para parar completamente el desarrollo de hipertrofia de las células musculares ventriculares. En muchos casos, debido a efectos secundarios inaceptables, los dos fármacos no pueden administrarse conjuntamente. En otros casos, los fármacos se contraponen el uno al otro y disminuyen el desarrollo de hipertrofia de las células musculares ventriculares en menos del 50% cuando se administran juntos. Así, se dice que se obtiene un efecto sinérgico si los dos fármacos enlentecen el desarrollo de hipertrofia de las células musculares ventriculares en más del 50%, mientras que no produzcan un aumento inaceptable de los efectos secundarios adversos.

Materiales y métodos Reactivos y anticuerpos

Se utilizaron los siguientes anticuerpos y reactivos: IGF (Boehringer); colagenasa (Worthington); pancreatina (Gibco BRL); inhibidor de MEK1 (MAPKK) (PD98059) (New England); [metil-^{3}H]timidina (Amersham); anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (Novocastra); anticuerpo monoclonal IgG_{2b} p21^{CIP1} [F-5] (Santa Cruz]; anticuerpo monoclonal anti-fosfo-tirosín conjugado con peroxidasa de rábano (HRPO), RC20 (Transduction Laboratoires); anticuerpo monoclonal anti-\alpha-actina sarcomérica (clon 5c5), anti-IgG de conejo y anti-IgG de ratón conjugadas con HPRO (Sigma); Kit de anticuerpos PhosphoPlus® p44/42 MAP quinasa (Thr202/Tyr204) (New England), gel de afinidad anti-FLAG® M1 y anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak), mAB MF20 contra la cadena pesada de la miosina sarcomérica (proporcionado amablemente por R.P. Harvey, Victor Chang Cardiac research Institute); anticuerpo anti-\alpha-actina sarcomérica (Sigma).

Expresión y purificación de NRG\beta2 recombinante humano

Un cDNA que codifica el dominio similar a EGF de la isoforma humana del NRG\beta2 (rhNRG\beta2), residuos 177-237, se insertó en un vector de expresión pFLAG1 (IBI) (un regalo del Dr. Rodney J. Fiddes, Co-operative Research Centre for Biopharmaceutical Research, Australia). El rhNRG\beta2 con un péptido FLAG unido a su extremo N, se expresó en el espacio periplasmático del DH5\alpha de E. coli, y se purificó por cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M1, según las instrucciones del fabricante. La pureza del rhNRG\beta2 era mayor del 90%, como se evidenciaba mediante separación en SDS-PAGE y tinción con Azul de Coomassie de las muestras de proteína purificadas. La concentración de las proteínas purificadas se determinó utilizando el kit de análisis de proteínas de BioRad. La actividad de las proteínas purificadas se analizó mediante estimulación con receptores ErbB de células de cáncer de mama MCF-7, con varias dosis de ligando. Esto reveló un aumento de la fosforilación de los receptores ErbB con un aumento de la concentración de ligando (10^{-12} M ó 10^{-8} M).

Cultivos primarios de miocitos cardiacos de ratón

Se utilizaron embriones de ratón (E11.5-12.5), para preparar miocitos cardiacos primarios. El tejido cardiaco se aisló asépticamente de los embriones. Las células miocárdicas se aislaron mediante digestión por colagenasa, y se separaron de los no cardiomiocitos mediante pre-adhesión en placas de cultivo, que se realizó tres veces. Las células se cultivaron después como se ha descrito previamente. Utilizando este método, es posible rutinariamente obtener cultivos primarios con >90% de miocitos.

Fosforilación de ErbB y MAM quinasa, y actividad de MAP quinasa

Las células miocárdicas embrionarias se cultivaron en medio libre de suero durante al menos 24 horas, y después se estimularon con rhNRG\beta2 o con IGF-I durante diversos tiempos. La estimulación se finalizó lavando rápidamente las células con PBS frío. Para bloquear la activación de la MAP quinasa, se añadió al medio el inhibidor de MEK, PD98059, 30 minutos antes de la administración de rhNRG\beta2 o IGF-I. Las células se recolectaron entonces como se ha descrito previamente para análisis de Western blot, con el anticuerpo monoclonal conjugado a HRPO RC20H (1:2.000), para la detección de los receptores ErbB fosforilados, o un anticuerpo fosfo-específico p42/44 MAP quinasa (razón de dilución 1:1.000), para la detección de MAP quinasas fosforiladas. Se cargó la misma cantidad de proteína de extracto celular en cada carrera, y se separó mediante SDS-PAGE. Se utilizó también inmunoblotting con un anticuerpo anti-receptor ErbB o anti-p42/44 MAP quinasa, para normalizar para la cantidad de proteína cargada. La actividad MAP quinasa (p42/p44) se midió utilizando un kit de análisis enzimático de p42/44 MAP quinasa (RPN84; Amersham, Bucks, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante.

Detección de la proteína p21^{CIP1}

Las células miocárdicas embrionarias cultivadas en medio libre de suero o en medio con FBS al 5%, se estimularon con varias concentraciones de rhNRG\beta2 con o sin el inhibidor del MEK, PD98059, durante 24 ó 48 horas, se recolectaron como se ha descrito previamente, y se sometieron a análisis de inmunoblot utilizando un anticuerpo anti- p21^{CIP1} (1:100). Se cargó la misma cantidad de proteína en cada pocillo de un gel de SDS poliacrilamida. Después del inmunoblotting, la membrana se cortó en tiras y se hizo reaccionar más con un anticuerpo contra el receptor ErbB2 para normalización de la carga de proteína.

Incorporación de timidina

Las células miocárdicas embrionarias se cultivaron con rhNRG\beta2 o IGF-I, en un medio DMEM libre de suero durante 20 horas. Se añadió [metil-^{3}H] Timidina (0,5 \muCi/pocillo), y las células se cultivaron durante 12 horas más. Después de aclararlas dos veces con PBS frío, una vez con ácido tricloroacético al 10% helado, y después cinco veces con PBS helado, las células se disolvieron en 100 \mul de SDS al 1%, y se contaron en un contador de radiactividad líquido.

Inmunofluorescencia y tinción con faloidina

Las células miocárdicas se sembraron en placas Novex de 2 pocillos (Nunc), y se cultivaron con o sin rhNRG\beta2, en medio DMEM libre de suero durante 24-48 horas. Después de aclarar las células con PBS, se fijaron con paraformaldehido al 4% y Triton X-100 al 0,1% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células fijadas se bloquearon con leche descremada al 5% en PBS durante 1 hora, seguido de incubación con un anticuerpo monoclonal anti-\alpha-actinina (Sigma), durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarlas, se añadió IgG anti-ratón conjugado con FICT (Sigma), y las células se incubaron durante otra media hora. Para la tinción con faloidina, las células se fijaron con formaldehído al 4% durante 1 hora, se lavaron, y se tiñeron con solución de tampón de faloidina (100 \mul de PBS, 10 \mul de faloidina de rodamina (6,6 \muM en MeOH)) durante 1 hora. Después de lavado con PBS, las células se montaron con p-fenilendiamina al 1% (1 mg/ml, Sigma) en glicerol, y se cubrieron y se sellaron. Las células se examinaron utilizando un microscopio fluorescente de UV y se fotografiaron con un objetivo de 40x.

Todos los análisis anteriores se repitieron al menos tres veces para cada experimento. Los datos para la síntesis de DNA y para la actividad de MAP quinasa se presentan como la media \pm DE de cinco muestras replicadas. La significación estadística se determinó mediante ANOVA utilizando el paquete estadístico SAS, siendo considerada significativa una p<0,05. Los inmunoblots se cuantificaron mediante análisis de densitometría, con la intensidad de las bandas de proteína evaluadas siendo mostradas debajo de los blots, como los cambios sobre el control (véase Figuras).

Resultados NRG regula la síntesis de DNA en células miocárdicas embrionarias

Se evaluó la síntesis de DNA en cardiomiocitos embrionarios primarios de ratón (E11.5.12.5), para investigar su respuesta de crecimiento a NGR después de estimulación con rhNRG\beta2. Como se muestra en la Figura 1, el rhNRG\beta2 a una concentración de 10^{-10} M producía un incremento aproximadamente dos veces mayor en la síntesis de DNA. Sin embargo, la síntesis de DNA disminuía con concentraciones de ligando > 10^{-10} M. En contraste a la respuesta al rhNRG\beta2, las células miocárdicas mostraron solo una respuesta proliferativa al factor de crecimiento similar a insulina recombinante humano I (IGF-I), en concentraciones en el intervalo de 10^{-11} M a 10^{-7} M. La inhibición de la síntesis de DNA por las concentraciones mayores de NGR no era debida a contaminación por proteínas de E. coli en el rhNRG\beta2 expresado en bacterias, ya que las proteínas purificadas de las bacterias transformadas únicamente con el vector FLAG no inhibían la síntesis de DNA. Además, para evitar posibles efectos de las proteínas de E. coli, tanto el IGF-1 obtenido comercialmente como el rhNRG\beta2 purificado se disolvieron o se diluyeron con preparaciones de proteínas anti-FLAG (10^{-8} M de péptido FLAG). Estos reactivos demostraron actividades idénticas a aquellas preparadas con PBS en la estimulación de la síntesis de DNA por las células miocárdicas.

NRG activa los receptores ErbB de las células miocárdicas embrionarias

De los cuatro miembros de la familia de los receptores ErbB (ErbB1-4), el ErbB2 y el ErbB4 son los más abundantemente expresado en miocitos cardiacos. La fosforilación de los receptores ErbB2 y ErbB4 se evaluó mediante análisis de Western blot de los lisados celulares, después de la estimulación con rhNRG\beta2 10^{-8} M ó 10^{-10} M. Como se muestra en la Figura 2a, era evidente un nivel más alto de fosforilación de las proteínas de 180-185 kDa, correspondientes a los receptores ErbB2/ErbB4, con las concentraciones más elevadas de NRG. Los niveles de fosforilación gradualmente disminuyeron con el tiempo. La dependencia de la concentración de la fosforilación de las proteínas p180-185, correspondía a la de la disminución de la síntesis de DNA con el tratamiento con rhNRG\beta2 (Fig 1). Los receptores ErbB2 y ErbB4 también se inmunoprecipitaron utilizando anticuerpos anti-ErbB2 o anti-ErbB4, y se examinaron mediante Western blotting con anticuerpos anti-fosfo-tirosina. Como se muestra en la Figura 2b, la fosforilación de ambos receptores era dependiente de las concentraciones de rhNRG\beta2. Aunque los niveles de fosforilación de ErbB2 y ErbB4 diferían levemente entre experimentos, la diferencia relativa de fosforilación entre concentraciones altas y bajas de rhNRG\beta2 persistía.

Activación de MAP quinasa dependiente de la concentración de NRG

La activación de la familia de receptores ErbB inicia una cascada de interacciones moleculares, dando como resultado finalmente la estimulación de las MAP quinasas. La duración de la activación de las MAP quinasas es crítica para las decisiones célula-célula. Por lo tanto, el presente inventor investigó el curso de tiempo de la fosforilación de MAP quinasa después de tratamiento con rhNRG\beta2 10^{-8} M ó 10^{-10} M, utilizando un anticuerpo anti-fosfo-MAP quinasa específico, que reconoce las quinasas p42/44 quinasas fosforiladas. Como se muestra en la Figura 3a, la fosforilación de las MAP quinasas p42/p44 permanecía sostenida durante al menos 21 horas con la dosis más alta de rhNRG\beta2. La activación de la MAP quinasa era transitoria a una concentración del ligando menor, y caía hasta niveles basales en menos de tres horas. Como se muestra en la Figura 3b, la actividad catalítica de la MAP quinasa era paralela a estos cambios en la fosforilación. La actividad de la MAP quinasa se mantenía durante al menos 21 horas en las células estimuladas con rhNRG\beta2 10^{-8} M, pero era solo transitoria en las células tratadas con rhNRG\beta2 10^{-10} M. En contraste a estas respuestas a NRG, la fosforilación de la MAP quinasa era transitoria tanto a concentraciones bajas (10^{-9} M) como altas (10^{-8} M ó 10^{-7} M) de IGF-I (Fig 3).

Efecto de NRG sobre la proliferación de células miocárdicas estimuladas por IGF-I

Como las células miocárdicas están expuestas a múltiples hormonas, péptidos y factores de crecimiento in vivo, el presente inventor investigó si al efecto inhibidor del crecimiento de las concentraciones elevadas de NRG, podría oponerse la respuesta proliferativa de otros factores de crecimiento. Esto se consiguió mediante la evaluación de los efectos tanto de rhNRG\beta2 como de IGF-I sobre la síntesis de DNA por los miocitos cardiacos. Como se muestra en la Figura 4a, una concentración 10^{-10} M de NRG tenía escaso efecto sobre la síntesis de DNA estimulada con IGF-I (10^{-9}). Sin embargo, la concentración de 10^{-8} M bloqueó significativamente la respuesta a IGF-I. Esto indicaba que una vía intracelular específica se activaba por las concentraciones más elevadas de NRG. Interesantemente, no se observó efecto aditivo cuando se aplicaron a las células tanto IGF-I como la concentración más baja de NRG, lo que indica que la concentración 10^{-9} M de IGF-I puede ser ya la máxima. Que la(s) vía(s) activadas por la concentración más alta de NRG puede ser dominante sobre las activadas por IGF-I fue apoyado además por la observación de que la combinación de IGF-I (10^{-9} M) y rhNRG\beta2 (10^{-8} M) daba como resultado la fosforilación sostenida de la MAP quinasa (compárese las Figuras 4b y 3c).

Expresión de NRG y p21^{CIP1}

Como la activación sostenida de la MAP quinasa está directamente relacionada con la expresión de p21^{CIP1} en otros tipos de células ^{31}, y la acumulación de p21^{CIP1} lleva a la detención del ciclo celular en la fase G1 ^{32,33}, se preguntó si la activación sostenida de las MAP quinasas lleva a un nivel de expresión de p21^{CIP1} mayor en células musculares cardiacas embrionarias. Como se muestra en la Figura 5a, se observó un aumento de la expresión de p21^{CIP1} solo con la concentración más alta de rhNRG\beta2. Este efecto sobre la expresión de p21^{CIP1} era independiente de las condiciones de cultivo celular utilizadas, ya que se observaron efectos similares con medio de cultivo libre de suero o o que contenía suero. El aumento de la expresión de p21^{CIP1} con rhNRG\beta2 10^{-8} M era sostenido durante al menos 24 horas (una incubación de 48 horas de las células con rhNRG\beta2 daba como resultado una expresión de p21^{CIP1} idéntica), y así, podía ser crítico para la inhibición de la síntesis de DNA en las células musculares cardiacas tratadas con la concentración alta de NRG. Como se muestra en la Figura 5b, el IGF-I no estimulaba la expresión de p21^{CIP1}. Para evaluar si la respuesta de p21^{CIP1} implicaba la activación de la MAP quinasa, los cardiomiocitos se trataron con el inhibidor específico de la MAP quinasa quinasa (MEK1) (PD98059). Tanto en presencia como en ausencia de suero, el PD98059 bloqueaba el aumento de la expresión de p21^{CIP1} inducida por rhNRG\beta2 10^{-8} M (Figura 5c), así como el aumento en la fosforilación de la MAP quinasa p42/44 (Figura 5d).

Estructura sarcomérica de NRG y expresión de MHC

Para examinar si la NRG también afectaba a la estructura y función de las células miocárdicas embrionarias, se evaluaron los efectos de la NRG sobre las estructuras citoesqueléticas y sarcoméricas de los cardiomiocitos. Como se muestra en la Figura 6a, el rhNRG\beta2 (10^{-8} M), estimulaba tanto la reorganización de la actina sarcomérica (tinción con faloidina) como el ensamblaje de las unidades contráctiles cardiacas (tinción de \alpha-actinina en bandas Z). En contraste, los efectos de rhNRG\beta2 10^{-10} M eran mucho menos evidentes (Figura 6a). Era también evidente un papel para la NRG en la regulación de la función de las células miocárdicas, por la observación de que el rhNRG\beta2 aumentaba la expresión de las cadenas pesadas de la miosina sarcomérica, mientras que la expresión de actina sarcomérica permanecía sin cambios (Figura 6b). Es más, los efectos de rhNRG\beta2 sobre los cardiomiocitos eran también sensibles a la inhibición de la MEK1 por PD98059.

Discusión

La evidencia proporcionada indica que la concentración del ligando (NRG) es un factor importante para determinar el estado de activación de las MAP quinasas transitorio o sostenido. La última da como resultado una expresión aumentada de nivel del inhibidor de Cdk, p21^{CIP1}, y se asocia con una disminución de la síntesis de DNA en las células miocárdicas embrionarias. Este hallazgo proporciona un apoyo claro de que el gradiente del ligando puede decidir el destino celular en la diferenciación celular y el desarrollo embrionario, y además proporciona datos moleculares sobre como las vías de señalización intracelulares distinguen la fuerza de la señal de las concentraciones del ligando.

La importancia de las concentraciones del ligando en la diferenciación celular se ha sospechado durante un tiempo, en base a las siguientes observaciones:

i): el patrón de desarrollo embrionario se asocia con el gradiente del ligando;

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ii): la concentración del ligando es crítica para la diferenciación celular in vitro, y

iii): la sobreexpresión de receptores en las células cambia su destino en respuesta a la estimulación del ligando.

Tomando estas observaciones en consideración, la activación de la MAP quinasa dependiente de la concentración de NRG en células miocárdicas embrionarias, establece un modelo para delinear mejor los mecanismos de señalización receptor ErbB-célula acoplada, en relación a los cambios en la concentración del ligando.

La noción de que la NRG es un factor de diferenciación celular miocárdica está apoyada sobre los hallazgos de que la NRG induce la expresión de p21^{CIP1} en células miocárdicas embrionarias. Como está bien documentado que el p21^{CIP1} es un inhibidor de Cdk, que activa el paso de la fase G1 a la fase S del ciclo celular, la expresión aumentada de esta proteína en células miocárdicas podría ser crítica para el inicio de la diferenciación definitiva (terminal). Esto también está apoyado por los hallazgos previos de que la expresión de p21^{CIP1} aumenta in vivo con el comienzo de la diferenciación definitiva (terminal) de las células miocárdicas (Parker et al (1995) Science 267:1024-1027), así como con la diferenciación de las células musculares esqueléticas (Dias et al. (1994) Semin Diagn Pathol 11:3-14). En el último proceso, la expresión aumentada de p21^{CIP1} eventualmente da como resultado una salida del ciclo celular y la diferenciación. Como el aumento de la expresión de p21^{CIP1} ocurre antes que las de otros reguladores del ciclo celular, se utiliza como un marcador precoz para la diferenciación del músculo esquelético. Como se ha demostrado aquí, la expresión de p21^{CIP1} es concomitante con la disminución de la síntesis de DNA en las células miocárdicas activadas por NRG, lo que sugiere un papel fisiológico de la expresión de p21^{CIP1} estimulada por NRG en estas células. Es más, la inhibición tanto de las MAP quinasas como del p21^{CIP1} por el inhibidor de las ERK quinasas, objetivó que la expresión de p21^{CIP1} estimulada por NRG es el resultado directo de la activación de las MAP quinasas.

Se requiere la activación sostenida de las MAP quinasas para la inducción de la expresión constitutiva de p21^{CIP1} en células miocárdicas en cultivo, mientras que la activación transitoria de la MAP quinasa da como resultado una expresión temporal de p21^{CIP1}. Lo último es presumiblemente insuficiente para regular la actividad Cdk, ya que la p21^{CIP1} será degradada rápidamente y la expresión constitutiva es esencial para bloquear el complejo ciclina/Cdk. En células PC12, la activación sostenida de la vía de la MAP quinasa está confinada a una respuesta a señales específicas de los receptores NGF. La activación sostenida de las MAP quinasas produce la diferenciación de las células PC12, transformándose en células neuronales. Esta vía en los miocitos cardiacos, sin embargo, es capaz de responder diferencialmente a la fuerza de la señal, en base a la concentración de NRG.

Otra evidencia más, que apoya que la NRG es un factor de diferenciación, es que la NRG estimula en ensamblaje de las estructuras sarcomérica y del citoesqueleto, que ocurre cuando las células progenitoras miocárdicas se diferencian a células musculares cardiacas. Observaciones previas también indican que las células más diferenciadas tienen sarcómeras más organizadas (Rumynatsev, P.P. (1977) en International Review Cytology 51, pp 187-273). En una comparación de células estimuladas con PE o IGF-1, las células estimuladas con NRG tienen las sarcómeras mejor organizadas. Más importante, cuando la NRG se mezcla con PE o IGF-1, la NRG mejora considerablemente las sarcómeras, lo que indica que la NRG es dominante en la estimulación del ensamblaje de la sarcómera en presencia de otras señales celulares. La NRG sobrepasa a la regulación negativa mediada por PE de la expresión de MHC-\alpha, lo que indica que la NRG está implicada en el mantenimiento de las proteínas contráctiles de tipo adulto. Como estudios previos indicaban que la NRG, el ErbB2 y el ErbB4 se expresan en el corazón adulto, la NRG podría jugar un papel en el mantenimiento del estado de diferenciación de las células miocárdicas.

Dos hechos muy importantes de la insuficiencia cardiaca asociada con la cardiomiopatía en los pacientes son la desorganización de las miofibras y las sarcómeras. La primera es la pérdida de la adhesión célula-célula y la última la pérdida de la organización de la sarcómera. Estas condiciones patológicas existen ampliamente desde en la insuficiencia cardiaca congestiva hasta en la miocardiopatía dilatada, y afectan gravemente a la función cardiaca. Actualmente ningún tratamiento se dirige al ensamblaje de la adhesión célula-célula y de las estructuras de la sarcómera. La NRG claramente juega un papel en el proceso de ensamblaje y mantenimiento de la adhesión célula-célula y las estructuras sarcoméricas. Que la NRG estimule la diferenciación de las células miocárdicas y el ensamblaje de las estructuras sarcoméricas indica que la diferenciación de las células musculares cardiacas está asociada con el remodelado de su estructura celular. Dicha conclusión es consistente con la observación general de la diferenciación de las células musculares del corazón durante el desarrollo del corazón: las células musculares diferenciadas siempre contienen sarcómeras bien organizadas.

En resumen, que la NRG es un factor de diferenciación para las células miocárdicas se apoya en la siguiente evidencia:

i): la NRG estimula la activación sostenida de las MAP quinasas;

ii): la NRG aumenta la expresión de p21^{CIP1};

iii): la NRG inhibe la síntesis de DNA estimulada por IGF-1; y

iv): la NRG estimula el ensamblaje en la células miocárdicas de las estructuras sarcomérica y del citoesqueleto.

v): La NRG estimula la expresión del gen MHC de tipo adulto

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Uso terapéutico

La presente memoria proporciona una proteína neurregulina específica para el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardiaca o la hipertrofia de las células musculares cardiacas en un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano que sufre de, o tiene riesgo de desarrollar, insuficiencia cardiaca.

La presente memoria es útil para prevenir la insuficiencia cardiaca y la miocardiopatía en pacientes que están siendo tratados con un fármaco que produce hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca congestiva, por ejemplo acetato de fludrocortisona o herceptina. En el contexto de la memoria, la proteína neurregulina puede administrarse antes que, simultáneamente con, o después de un fármaco que produce enfermedades cardiacas.

En el método terapéutico descrito aquí, la proteína neurregulina se administra a pacientes humanos crónicamente o agudamente, por ejemplo mediante inyección en la vena del paciente. Opcionalmente, la neurregulina se administra crónicamente en combinación con una cantidad efectiva de un compuesto que actúa para suprimir una vía de inducción de hipertrofia diferente que una neurregulina. Componentes adicionales opcionales incluyen un inhibidor cardiotrófico, tal como un antagonista Ct-1, un inhibidor de la ECA, tal como el captopril, y/o hormona del crecimiento humano y/o IGF-I en el caso de insuficiencia cardiaca congestiva, o con otro factor anti-hipertrófico, miocardiotrófico, antiarrítmico o inotrópico, en el caso de otros tipos de insuficiencia cardiaca o enfermedad cardiaca.

La neurregulina de la presente memoria puede combinarse con aproximaciones terapéuticas actuales para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, por ejemplo, con tratamiento con un inhibidor de la ECA. Los inhibidores de la ECA son fármacos que inhiben la enzima conversora de la angiotensina, por lo que previenen la conversión de angiotensina I en angiotensina II. Los inhibidores de la ECA pueden ser beneficiosos en la insuficiencia cardiaca congestiva, mediante la reducción de las resistencias vasculares sistémicas y el alivio de la congestión circulatoria. Los inhibidores de la ECA incluyen fármacos denominados por las marcas comerciales Accupril® (quinapril), Altace® (ramipril), Capoten® (captopril), Lotensin® (benazapril), Monopril® (fosinopril), Prinivil® (lisinopril), Vasotec® (enalapril) y Zestril® (lisinopril).

La neurregulina de la presente invención puede combinarse con la administración de terapias con fármacos para el tratamiento de las enfermedades cardiacas tales como la hipertensión. Por ejemplo, un polipéptido de neurregulina puede administrarse con antagonistas del receptor de la endotelina, por ejemplo, y un anticuerpo contra el receptor de la endotelina, y un péptido u otras moléculas así de pequeñas antagonistas; antagonistas del \beta-adreno-receptor, como el carvedilol; antagonistas del \alpha_{1}-adreno-receptor; anti-oxidantes; compuestos que tienen múltiples actividades (por ejemplo, \beta-bloqueantes/\alpha-bloqueantes/anti-oxidantes); compuestos similares al carvedilol o combinaciones de compuestos que proporcionan múltiples funciones encontradas en el carvedilol; hormona del crecimiento, etc.

Los agonistas de la neurregulina solos o en combinación con otros agonistas de la vía de supresión de la hipertrofia o con moléculas que son agonistas de vías de inducción de la hipertrofia conocidas, son útiles como fármacos para el tratamiento in vivo de los mamíferos que experimentan insuficiencia cardiaca, de tal forma que previenen o disminuyen los efectos de la insuficiencia cardiaca.

Las formulaciones terapéuticas de agonista(s) para tratar las enfermedades del corazón se preparan para almacenaje mediante la mezcla del agonista(s) que tiene el grado deseado de pureza, con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^{th} edición, Oslo, A, Ed, 1980), en forma de pastel liofilizado o soluciones acuosas. Vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables deben ser no tóxicos para los recipientes a las dosis y las concentraciones empleadas, e incluyen soluciones de tampón tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; los anti-oxidantes incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como la polivinil pirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares de alcohol tales como manitol o sorbitol; contra-iones formadores de sal, tales como el sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween, Pluronics, o polietilén glicol (PEG). Los antagonista(s)
también son adecuadamente ligados a uno o a una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilén glicol, propilén glicol, o polialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de EE UU N^{os} 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337. La cantidad de excipiente utilizado en una formulación puede estar en el intervalo desde alrededor de 1 a 99%, preferiblemente desde alrededor de 80 a 99%, óptimamente entre 90 y 99% por peso.

Los agonista(s) para utilizar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, previo a la liofilización y reconstitución siguientes. Los agonistas ordinariamente se almacenarán en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones agonistas terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica. La administración de agonista(s) es de forma crónica solo, por ejemplo, por una de las siguientes rutas: inyección o infusión a través de vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intalesional, oralmente o utilizando un sistema de liberación sostenida, como se especifica más adelante. Los agonis-
ta(s) se administran continuamente mediante infusión, o mediante bolos de inyección periódicos si la tasa de aclaramiento en suficientemente lenta, o mediante administración en la corriente sanguínea o la linfa. El modo preferido de administración está dirigido al corazón, de tal forma que la molécula se dirija a la fuente y se minimicen los efectos colaterales de los agonistas.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína; las matrices tienen forma de artículos con forma, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli[2-hidroxietil-metacrilato], como lo describieron Langer et al (1981), J Biomed Mater Res 15:167-277 y Langer (1982) Chem Tech 12:98-105, o poli(vinil alcohol)), poliláctidos (Patente de EE UU Nº 3.773.919, Documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547-556), etilén-vinil acetato no degradable (Langer et al. (1981) arriba), copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (Documento EP 133.988).

Los agonista(s) también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas están descritas en Rremington's Pharmaceutical Sciences, arriba.

Mientras que los polímeros tales como el etilén-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan moléculas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las moléculas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse, como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado la pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden realizarse estrategias racionales para la estabilización, dependiendo del mecanismo implicado, por ejemplo utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicos.

Las composiciones de liberación sostenida de agonista(s). Los liposomas que contienen agonista(s) se preparan mediante métodos conocidos per se; DE 3.218.121: Epstein et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:3688-3692; Hwang et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:4030-4034; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Solicitud de patente Japonesa 83-118008; patentes de EE UU N^{os} 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324. Ordinariamente los liposomas son del tipo pequeño (alrededor de 200-800 \ring{A}) unilamelares, en los que el contenido lípido es mayor que alrededor de 30 mol% de colesterol, siendo la proporción seleccionada ajustada para la terapia agonista óptima. Un ejemplo específico de formulación de liberación sostenida adecuada está en el Documento EP 647.449.

Una cantidad efectiva de la proteína neurregulina presente, para ser empleada terapéuticamente, dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y la condición del paciente. De acuerdo con esto, será generalmente necesario para los clínicos, titular la dosis y modificar la vía de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo.

La proteína neurregulina opcionalmente se combina con o se administra en concierto con otros agentes para tratar la insuficiencia cardiaca congestiva, incluyendo los inhibidores de la ECA, los inhibidores de CT-1, la hormona de crecimiento humana, y/o el IGF-I. Las cantidades efectivas de tales agentes, si se emplean, estará a la discreción de los clínicos. La administración y el ajuste de la dosis se determinan por métodos conocidos por los expertos en la técnica, para conseguir el mejor manejo de la insuficiencia cardiaca congestiva, e idealmente tienen en cuenta el uso de diuréticos o digital, y las condiciones tales como hipotensión y alteración renal. La dosis dependerá adicionalmente de factores tales como el tipo de fármaco utilizado y el paciente específico que está siendo tratado. Típicamente la cantidad empleada será la misma dosis que la utilizada si el fármaco fuera a administrarse sin el agonista; sin embargo, pueden emplearse dosis menores dependiendo de factores tales como la presencia de efectos colaterales, la condición que va a ser tratada, el tipo de paciente, y el tipo de agonista y de fármaco, siempre que la cantidad total de agentes proporcione una dosis efectiva para la condición que está siendo tratada.

Así, por ejemplo, en el caso de los inhibidores de la ECA, una dosis de prueba de enalapril de 5 mg, puede aumentarse después hasta 10-20 mg por día, una vez al día, según lo tolere el paciente. Como otro ejemplo, el captopril se administra inicialmente por vía oral a pacientes humanos en una dosis de prueba de 6,25 mg, y la dosis después se va escalando, según la tolere el paciente, hasta 25 mg dos veces por día (BID) o tres veces por día (TID), y puede titularse hasta 50 mg BID o TID. El nivel de tolerancia es estimado determinando si la disminución de la presión sanguínea se acompaña de signos de hipotensión. Si está indicado, la dosis puede aumentarse hasta 100 mg BID o TID. El captopril se produce para administración como ingrediente activo, en combinación con hidorclorotiazida, y como el pH lo estabiliza, tiene una cubierta entérica o de liberación retardada que protege al captopril hasta que llega al colon. El captopril está disponible para administración en forma de comprimido o cápsula. Una discusión de la dosis, administración, indicaciones y contraindicaciones asociadas con el captopril y otros inhibidores de la ECA puede encontrarse en el Physicians Desk Reference, Medical Economics Data Production Co., Montvale, NJ, 2314-2320 (1994).

En un ejemplo de una composición terapéutica inyectable de proteína neurregulina, la formulación contiene 1% de la proteína neurregulina y 99% de solución salina. En otro ejemplo de una composición terapéutica inyectable de la proteína neurregulina, la formulación contiene 5% de la proteína neurregulina, 1% del inhibidor de la ECA captopril y 94% de solución salina.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE

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(A): NOMBRE: The Victor Chang Cardiac Research Institute

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(B): CALLE: St Vincent's Hospital, Nivel 4, Suite 1, 376 Victoria Street

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(C): CIUDAD: Darlinghurst

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(D): ESTADO: New South Wales

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(E): PAÍS: Australia

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(F): CÓDIGO POSTAL: 2010

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Función y Manipulación del Músculo Cardiaco

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 114 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): NÚMERO DE HEBRAS: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCATCTTG TAAATGTGCG GAGAAGGAGA AAACTTTCTG TGTGAATGGA GGGGAGTGCT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATGGTGAA AGACCTTTCA AACCCCTCGA GATACTTGTG AGGAGCTGTA CCAG

\hfill

114

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(3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 58 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): NÚMERO DE HEBRAS: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

1

Claims

1. La proteína neurregulina que consiste en la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2, para utilizar en el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardiaca en un mamífero

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que el mamífero es un ser humano.

3. La proteína de la reivindicación 2, en la que el ser humano tiene una insuficiencia cardiaca.

4. La proteína de la reivindicación 3, en la que la insuficiencia cardiaca es un estado de enfermedad seleccionado del grupo que consiste en insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, taquiarritmia, miocardiopatía hipertrófica familiar, enfermedad isquémica cardiaca, miocardiopatía dilatada idiopática y miocarditis.

5. La proteína de la reivindicación 3, en la que la insuficiencia cardiaca es en la forma de isquémica, congénita, reumática o idiopática.

6. La proteína de la reivindicación 3, en la que la insuficiencia cardiaca es el resultado de una disociación de la adhesión célula-célula del músculo cardiaco y/o la desorganización de las estructuras sarcoméricas en un mamífero.

7. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína esta formulada con un vehículo o excipiente adecuado.

8. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína se utiliza en una formulación para administración intravenosa.

9. El uso de la proteína neurregulina de la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un mamífero.

10. Una combinación, en la que dicha combinación comprende una cantidad efectiva de una proteína neurregulina y una cantidad efectiva de un agente que produce hipertrofia o insuficiencia cardiaca congestiva, donde dicha proteína neurregulina consiste en la SEQ ID NO: 2, donde el agente es acetato de fludrocortisona o herceptina.

11. La combinación de la reivindicación 10, que está formulada para administración intravenosa.

12. El uso de la combinación de la reivindicación 10 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un mamífero.

13. Una combinación, en la que dicha combinación comprende una cantidad efectiva de una proteína neurregulina, y una cantidad efectiva de un agente que actúa para suprimir una vía de inducción de la hipertrofia diferente de la vía suprimida por dicha proteína neurregulina, donde dicha proteína neurregulina consiste en la SEQ ID NO: 2, donde el agente se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la ECA, la hormona de crecimiento humana, el IGF-I, un factor antiarrítmico, y un factor inotrópico.

14. La combinación de la reivindicación 13, que está formulada para administración intravenosa.

15. El uso de una combinación de la reivindicación 13, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un mamífero.

16. Una combinación, en la que dicha combinación comprende una cantidad efectiva de una proteína neurregulina, y una cantidad efectiva de un agente para el tratamiento o la prevención de la hipertensión, donde dicha proteína neurregulina consiste en la SEQ ID NO: 2, donde el agente es un anticuerpo anti-receptor de la endotelina, o un antagonista de alfa- o beta-adrenorreceptor.

17. La combinación de la reivindicación 16, que está formulada para administración intravenosa.

18. El uso de una combinación de las reivindicaciones 16 ó 17 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardiaca y la hipertensión en un mamífero

19. Un método para identificar un agente para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, en el que el método comprende analizar la unión y/o la activación de la neurregulina a los receptores ErbB-2-ErbB-3 ó ErbB-2-ErbB-4, en presencia o ausencia de un polipéptido o un compuesto de ensayo, e identificar un polipéptido o compuesto de ensayo, que aumenta la unión y/o la activación de la neurregulina a los receptores ErbB-2-ErbB-3 ó ErbB-2-ErbB-4, como un agente para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca.