ES2317564T3 - 3,11b.cis.dihidrotetrabenazina para el tratamiento de enfermedades proliferativas o inflamaciones. - Google Patents

Abstract

Compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina de fórmula (Ia): o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para ser utilizado en la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Description

3,11b-cis-dihidrotetrabenazina para el tratamiento de enfermedades proliferativas o inflamaciones.

Esta invención se refiere a la utilización de una dihidrotetrabenazina en la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Antecedentes de la invención

Los receptores sigma son receptores de la superficie celular que antes se consideraban un subtipo de receptores opiáceos. Pero ahora, después de la caracterización del receptor y del descubrimiento de ligandos específicos para los receptores, se ha demostrado que son diferentes a los receptores opiáceos (véase Bourrie y col., Current Opinion in Investigational Drugs, 5 (11):1158-63) (2004)).

Los receptores sigma se pueden clasificar en los subtipos sigma-1 (\sigma-1) y sigma-2 (\sigma-2). El receptor \sigma-1, que se cree contiene 223 aminoácidos, ha sido clonado (Hanner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, (1996) 93:8072-8077) y se ha comprobado que no presenta ninguna homología de secuencia primaria con ninguna otra clase de receptores. No obstante, sí tiene un 30,3% de identidad con la secuencia de una isomerasa esterol C8-C7 fúngica y también se ha comprobado que está relacionado con otra proteína de función desconocida, la SRBP2 (proteína 2 de unión a SR-31747), que comparte una gran homología con esta enzima. El receptor \sigma-2 todavía no ha sido clonado.

Existen estudios que indican que existen ligandos de los receptores sigma que tienen actividad antiinflamatoria.

Por ejemplo, Bourrie y col., Eur. J. Pharmacol, (2002) 456(1-3):123-3, muestran que el compuesto SSR125329A, de Sanofi-Synthelabo Recherche (nombre químico [(Z)-3-(4-adamantan-2-il-3,5-diclorofenil)alil]ciclohexil-etilamina) es un ligando de los receptores sigma de alta afinidad, con potentes propiedades antiinflamatorias. Bourrie y col. concluyen que los resultados de sus estudios proporcionan una prueba sustancial de que los ligandos de los receptores sigma pueden representar un nuevo enfoque eficaz para el tratamiento de la artritis reumatoide.

Otro antagonista de los receptores sigma de Sanofi (SR31747) está actualmente en fase de ensayo clínico para el tratamiento de la artritis reumatoide.

La tetrabenazina (nombre químico: 1,3,4,6,7,11b-hexahidro-9,10-dimetoxi-3-(2-metilpropil)-2H-benzo(a)quinolizin-2-ona) se ha utilizado como fármaco desde finales de los años 50. Desarrollada inicialmente como antipsicótico, la tetrabenazina se utiliza en la actualidad en el tratamiento sintomático de trastornos del movimiento hipercinéticos como la enfermedad de Huntington, el hemibalismo, la corea senil, tics, discinesia tardía y el síndrome de Tourette, véase por ejemplo Jankovic y col., Am. J. Psychiatry. (1999) Agosto; 156(8):1279-81 y Jankovic y col., Neurology (1997) Febrero; 48(2):358-62.

La Figura 1 siguiente muestra la estructura química de la tetrabenazina.

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El compuesto tiene centros quirales en los átomos de carbono 3 y 11b y, por tanto, teóricamente pueden existir en total cuatro formas isoméricas, como se muestra en la Figura 2.

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En la Figura 2, la estereoquímica de cada isómero se define utilizando la nomenclatura "R" y "S" desarrollada por Cahn, Ingold y Prelog, véase Advanced Organic Chemistry de Jerry March, 4ª edición, John Wiley & Sons, Nueva York, 1992, páginas 109-114. En la Figura 2 y en cualquier otro lugar de esta solicitud de patente, las designaciones "R" y "S" se dan en el orden de los números de posición de los átomos de carbono. Por ejemplo, RS es una notación abreviada de 3R,11bS. De forma similar, cuando hay tres centros quirales presentes, como en el caso de las dihidrotetrabenazinas descritas más abajo, las designaciones "R" o "S" están enumeradas en el orden de los átomos de carbono 2, 3 y 11b. Por consiguiente, el isómero 2S,3R,11bR se denomina de forma abreviada SRR y así sucesiva-
mente.

La tetrabenazina comercial es una mezcla racémica de los isómeros RR y SS y, según parece, los isómeros RR y SS (denominados en lo sucesivo de forma individual o colectiva como trans-tetrabenazina, ya que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 11b tienen una orientación relativa trans) son los isómeros termodinámicamente más estables.

La tetrabenazina tiene una biodisponibilidad más bien pobre y variable. Se metaboliza en gran parte mediante el metabolismo en el primer paso, y en la orina típicamente se detecta muy poca o ninguna tetrabenazina no metabolizada. El metabolito principal es la dihidrotetrabenazina (nombre químico: 2-hidroxi-3-(2-metilpropil)-1,3,4,6,7,11b-hexahidro-9,10-dimetoxi-benzo(a)quinolizina), que se forma por reducción del grupo 2-ceto de la tetrabenazina y se cree que es el principal responsable de la actividad del fármaco (véase Mehvar y col., Drug Metab. Disp, 15, 250-255 (1987) y J. Pharm. Sci., 76, nº 6, 461-465 (1987)).

Ya se han identificado y caracterizado cuatro isómeros de la dihidrotetrabenazina, todos ellos derivados de los isómeros RR y SS más estables de la tetrabenazina precursora y con una orientación relativa trans entre los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 11b (véase Kilbourn y col., Chirality, 9:59-62 (1997) y Brossi y col., Helv. Chim. Acta, vol. XLI, nº 193, páginas 1793-1806 (1958). Los cuatro isómeros son: (+)-\alpha-dihidrotetrabenazina, (-)-\alpha-dihidrotetrabenazina, (+)-\beta-dihidrotetrabenazina y (-)-\beta-dihidrotetrabenazina. Se considera que los cuatro isómeros de la trans-dihidrotetrabenazina conocidos tienen la estructura mostrada en la Figura 3.

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Kilbourn y col. (véase Eur. J. Pharmacol., 278:249-252 (1995) y Med. Chem. Res., 5:113-126 (1994)) investigaron la unión específica de isómeros de la dihidrotetrabenazina radio-marcados individuales en el cerebro de ratas conscientes. Descubrieron que el isómero (+)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina (2R,3R,11bR) se acumulaba en las regiones del cerebro asociadas a mayores concentraciones del transportador de dopamina de la membrana neuronal (DAT) y del transportador vesicular de monoaminas (VMAT2). Sin embargo, el isómero (-)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina, esencialmente inactivo, se distribuía de forma prácticamente uniforme en el cerebro, lo que sugería que no se estaba produciendo una unión específica con DAT y VMAT2. Los estudios in vivo estaban en correlación con estudios in vitro que demostraban que el isómero (+)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina presentaba una K_{i} para [^{3}H]metoxitetrabenazina más de 2.000 veces mayor que la K_{i} para el isómero (-)-\alpha-[^{11}C]dihidrotetrabenazina.

Nuestra anterior solicitud de patente internacional número PCT/GB2005/000464 describe la preparación y los usos terapéuticos de isómeros de dihidrotetrabenazina (3,11b-cis-dihidrotetrabenazina), en los que los átomos de hidrógeno de las posiciones 3 y 11b de la tetrabenazina tienen una orientación relativa cis.

Existen cuatro isómeros posibles para la dihidrotetrabenazina con la configuración 3,11b-cis y éstos son el isómero 2S,3S,11bR, el isómero 2R,3R,11bS, el isómero 2R,3S,11bR y el isómero 2S,3R,11bS, que tienen las siguientes estructuras:

(a) el isómero 2S,3S,11bR de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina tiene la fórmula (Ia):

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(b) el isómero 2R,3R,11bS de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina tiene la fórmula (Ib):

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(c) el isómero 2R,3S,11bR de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina tiene la fórmula:

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y

(d) el isómero 2S,3R,11bS de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina tiene la fórmula (Id):

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El documento PCT/GB2005/000464 incluye datos experimentales que demuestran que los isómeros de la cis-dihidrotetrabenazina se unen a los receptores sigma-1 y sigma-2, pero no describe ningún uso terapéutico que emplee la actividad de unión a los receptores sigma.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de las cis-dihidrotetrabenazinas descritas en nuestra anterior solicitud número PCT/GB2005/000464 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina de fórmula (Ia):

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para ser utilizado en la profilaxis o en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

La invención también proporciona la utilización de un compuesto de fórmula (Ia), o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como se han definido más arriba, para la producción de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

El compuesto de fórmula (Ia) también se denomina aquí Isómero B.

Como ejemplos de enfermedades y estados inflamatorios se incluyen, pero no exclusivamente, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis traumática, artritis gotosa, artritis por rubéola, artritis psoriásica y otros estados artríticos; enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, como la reacción inflamatoria inducida por endotoxina o la enfermedad inflamatoria intestinal; síndrome de Reiter, gota, espondilitis reumatoide, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

Algunas enfermedades y estados inflamatorios particulares son aquellos sensibles a los ligandos de los receptores sigma, por ejemplo antagonistas de los receptores sigma.

Una enfermedad inflamatoria particular es la artritis reumatoide.

La 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina utilizada en la invención se puede encontrar en forma esencialmente pura, por ejemplo con una pureza isomérica superior al 90%, típicamente superior al 95% y preferiblemente superior al 98%.

En este contexto, la expresión "pureza isomérica" se refiere a la cantidad de 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina presente en relación con la cantidad total o la concentración de dihidrotetrabenazina de todas la formas isoméricas. Por ejemplo, si el 90% de toda la dihidrotetrabenazina presente en la composición es 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina, la pureza isomérica es del 90%.

La 11b-cis-dihidrotetrabenazina utilizada en la invención se puede encontrar en forma de una composición esencialmente libre de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina, preferentemente como una composición que contiene menos de un 5% de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina, de forma especialmente preferente menos de un 3% de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina y de forma totalmente preferente menos de un 1% de 3,11b-trans-dihidrotetrabenazina.

Tal como se utiliza aquí, la expresión "3-11b-cis-" significa que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 11b de la estructura dihidrotetrabenazina están en la orientación relativa cis.

El compuesto de fórmula (Ia) (Isómero B) se puede presentar en una forma esencialmente enantioméricamente pura o en forma de una mezcla con otros enantiómeros de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina.

En este contexto, las expresiones "pureza enantiomérica" y "enantioméricamente puro" se refieren a la cantidad de Isómero B presente en relación con la cantidad total o concentración de dihidrotetrabenazina de todas las formas enantioméricas e isoméricas. Por ejemplo, si el 90% de la cantidad total de dihidrotetrabenazina presente en la composición se encuentra en forma del Isómero B, la pureza enantiomérica es del 90%.

A modo de ejemplo, en cada aspecto y realización de la invención, el Isómero B puede estar presente con una pureza enantiomérica de como mínimo el 55% (por ejemplo como mínimo el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100%).

El isómero de la invención también se puede presentar en forma de mezcla del Isómero B con uno o más Isómeros A, C y D. Estas mezclas pueden ser mezclas racémicas o mezclas no racémicas. Los ejemplos de mezclas racémicas incluyen la mezcla racémica del Isómero A y el Isómero B.

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Sales farmacéuticamente aceptables

A no ser que el contexto lo requiera de otra manera, una referencia en esta solicitud al compuesto de fórmula (Ia) o al Isómero B incluye dentro de su alcance no sólo la base libre del compuesto, sino también sus sales, y en particular sus sales de adición de ácido.

Los ácidos particulares a partir de los cuales se forman las sales de adición de ácido incluyen aquellos ácidos que tienen un valor pKa inferior a 3,5, normalmente inferior a 3. Por ejemplo, las sales de adición de ácido se pueden formar a partir de un ácido con un pKa de entre +3,5 y -3,5.

Las sales de adición de ácido preferentes incluyen las formadas con ácidos sulfónicos, como ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido canforsulfónico y ácido naftalenosulfónico.

Un ácido particular a partir del cual se pueden formar sales de adición de ácido es el ácido metanosulfónico.

Las sales de adición de ácido se pueden preparar mediante los métodos aquí descritos o mediante métodos químicos convencionales, como los descritos en Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, tapa dura, 388 páginas, agosto de 2002. En general, estas sales se pueden preparar sometiendo a reacción la forma de base libre del compuesto con el ácido o la base apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de ambos. Generalmente se utilizan medios no acuosos, como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo.

Las sales son típicamente sales farmacéuticamente aceptables. No obstante, también se pueden preparar sales farmacéuticamente no aceptables como formas intermedias para convertirlas después en sales farmacéuticamente aceptables. Estas sales farmacéuticamente no aceptables también forman parte de la invención.

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Métodos de preparación de los isómeros de dihidrotetrabenazina

En esta sección se describen métodos para preparar los cuatro isómeros de la 3,11-cis-dihidrotetrabenazina, aunque la invención se refiere únicamente a los usos terapéuticos del compuesto de fórmula (Ia) (Isómero B).

Las 3,11b-cis-dihidrotetrabenazinas se pueden preparar mediante un proceso que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (II):

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con uno o más reactivos adecuados para hidratar el doble enlace 2,3 del compuesto de fórmula (II) y después, si así se requiere, la separación y el aislamiento de la forma isomérica de la dihidrotetrabenazina deseada.

La hidratación del doble enlace 2,3 se puede llevar a cabo mediante hidroboración utilizando un reactivo borano, tal como diborano o un éter de borano (por ejemplo borano-tetrahidrofurano (THF)), para obtener un aducto de alquil-borano intermedio, seguida de oxidación del aducto de alquil-borano e hidrólisis en presencia de una base. La hidroboración se lleva a cabo típicamente en un disolvente aprótico polar seco (por ejemplo THF), normalmente a una temperatura no elevada, por ejemplo a temperatura ambiente. El aducto de borano-alqueno típicamente se oxida con un agente oxidante, tal como peróxido de hidrógeno, en presencia de una base que proporcione una fuente de iones hidróxido, por ejemplo hidróxido de amonio o un hidróxido de metal alcalino, por ejemplo hidróxido de potasio o hidróxido de sodio. La secuencia de reacciones hidroboración-oxidación-hidrólisis del Proceso A produce típicamente isómeros de dihidrotetrabenazina en los que los átomos de hidrógeno de las posiciones 2 y 3 tienen una orientación relativa trans.

Los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar reduciendo la tetrabenazina para obtener una dihidrotetrabenazina y deshidratando después la dihidrotetrabenazina. La reducción de la tetrabenazina se puede llevar a cabo utilizando un reactivo de hidruro de aluminio, tal como un hidruro de litio-aluminio, o un reactivo borohidruro como borohidruro de sodio, borohidruro de potasio o un derivado de borohidruro, por ejemplo un borohidruro de alquilo como borohidruro de tri-sec-butilo-litio. Alternativamente, el paso de reducción se puede llevar a cabo empleando una hidrogenación catalítica, por ejemplo con un catalizador de níquel Raney o de óxido de platino. Las condiciones adecuadas para llevar a cabo el paso de reducción se describen más detalladamente posteriormente o se pueden encontrar en el documento US 2,843,591 (Hoffmann - La Roche) y en Brossi y col., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, nº 193, páginas 1793-1806 (1958).

Dado que la tetrabenazina utilizada como material de partida para la reacción de reducción consiste típicamente en una mezcla de los isómeros RR y SS (es decir, trans-tetrabenazina), la dihidrotetrabenazina formada mediante el paso de reducción tendrá la misma configuración trans alrededor de las posiciones 3 y 11b y adoptará la forma de uno o más de los isómeros de dihidrotetrabenazina conocidos mostrados más arriba en la Figura 3. Por consiguiente, el Proceso A puede consistir en tomar los isómeros trans de la dihidrotetrabenazina, deshidratarlos para formar el alqueno (II) y después "rehidratar" el alqueno (II) empleando condiciones que den como resultado los isómeros de la cis-dihidrotetrabenazina requeridos.

La deshidratación de la dihidrotetrabenazina para formar el alqueno (II) se puede llevar a cabo utilizando diversas condiciones estándar para deshidratar alcoholes y formar alquenos, véase por ejemplo J. March (ídem) páginas 389-390 y las referencias incluidas en dicho documento. Los ejemplos de estas condiciones incluyen el uso de agentes deshidratantes basados en fósforo, como haluros de fósforo u oxihaluros de fósforo, por ejemplo POCl_{3} y PCl_{5}. Como alternativa a la deshidratación directa, el grupo hidroxilo de la dihidrotetrabenazina se puede convertir en un grupo saliente L, tal como un halógeno (por ejemplo cloro o bromo), y después someterse a condiciones (por ejemplo la presencia de una base) para eliminar H-L. La conversión del grupo hidroxilo en un haluro se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos por los químicos especializados, por ejemplo mediante reacción con tetracloruro de carbono o con tetrabromuro de carbono en presencia de una trialquilfosfina o triarilfosfina, como trifenilfosfina o tributilfosfina.

La tetrabenazina utilizada como material de partida para la reducción produciendo la dihidrotetrabenazina se puede obtener comercialmente o se puede sintetizar mediante el método descrito en el documento US 2,830,993 (Hoffmann-La Roche).

Otro proceso (Proceso B) para preparar un compuesto 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina consiste en someter un compuesto de fórmula (III):

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a las condiciones necesarias de apertura de anillo del grupo 2,3-epóxido en el compuesto de fórmula (III), y después, si así se requiere, separar y aislar la forma isomérica de la dihidrotetrabenazina deseada.

La apertura de anillo se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos conocidos para abrir anillos epóxido. Sin embargo, un método actualmente preferente para abrir el anillo epóxido consiste en una apertura de anillo por reducción, que se puede conseguir utilizando un agente reductor tal como borano-THF. La reacción con borano-THF se puede llevar a cabo en un disolvente aprótico polar, como éter (por ejemplo tetrahidrofurano), normalmente a temperatura ambiente, e hidrolizando a continuación el complejo de borano así formado mediante calentamiento en presencia de agua y una base a temperatura de reflujo del disolvente. El Proceso B da lugar típicamente a isómeros de dihidrotetrabenazina en los que los átomos de hidrógeno de las posiciones 2 y 3 tienen una orientación relativa
cis.

Los compuestos epóxido de fórmula (III) se pueden preparar mediante epoxidación de un alqueno de fórmula (II) arriba mostrada. La reacción de epoxidación se puede llevar a cabo empleando condiciones y reactivos muy conocidos por los químicos especializados, véase por ejemplo J. March (ídem), páginas 826-829 y las referencias incluidas en dicho documento. Típicamente, para provocar la epoxidación se puede utilizar un perácido, como ácido meta-cloroperbenzoico (MCPBA), o una mezcla de un perácido y otro agente oxidante, como ácido perclórico.

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Cuando los materiales de partida para los procesos A y B sean mezclas de enantiómeros, los productos de los procesos serán típicamente pares de enantiómeros, por ejemplo mezclas racémicas, posiblemente junto con impurezas diastereoisoméricas. Los diastereoisómeros no deseados se pueden eliminar mediante técnicas tales como cromatografía (por ejemplo HPLC) y los enantiómeros individuales se pueden separar mediante diversos métodos conocidos por los químicos especializados. Por ejemplo, se pueden separar mediante:

(i)

cromatografía quiral (cromatografía sobre un soporte quiral); o

(ii)

por formación de una sal con un ácido quiral ópticamente puro, separación de las sales de los dos diastereoisómeros mediante cristalización fraccionada y después separación de la dihidrotetrabenazina de la sal; o

(iii)

formación de un derivado (por ejemplo un éster) con un agente de derivación quiral ópticamente puro (por ejemplo un agente de esterificación), separación de los epímeros resultantes (por ejemplo mediante cromatografía) y después conversión del derivado en la dihidrotetrabenazina.

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Un método para separar los pares de enantiómeros obtenidos de cada uno de los Procesos A y B y que ha demostrado ser particularmente eficaz consiste en esterificar el grupo hidroxilo de la dihidrotetrabenazina con una forma ópticamente activa de un ácido de Mosher, tal como el isómero R(+) mostrado más abajo, o con una forma activa del mismo:

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Los ésteres de los dos enantiómeros de la dihidrobenazina resultantes se pueden separar después mediante cromatografía (por ejemplo HPLC) y los ésteres separados se pueden hidrolizar para obtener los isómeros de dihidrobenazina individuales utilizando una base, como un hidróxido de metal alcalino (por ejemplo NaOH), en un disolvente polar tal como metanol.

Como alternativa a la utilización de mezclas de enantiómeros como materiales de partida en los Procesos A y B y separación subsiguiente de enantiómeros, los Procesos A y B se pueden llevar a cabo en cada caso utilizando como materiales de partida enantiómeros simples, conduciendo a productos en los que predomina un enantiómero simple. Los enantiómeros simples del alqueno (II) se pueden preparar sometiendo la RR/SS tetrabenazina a una reducción estereoselectiva utilizando borohidruro de tri-sec-butil-litio para obtener una mezcla de enantiómeros de dihidrotetrabenazina SRR y RSS, separando los enantiómeros (por ejemplo mediante cristalización fraccionada) y deshidratando después el enantiómero único de la dihidrotetrabenazina separado para obtener predominante o exclusivamente un único enantiómero del compuesto de fórmula (II).

Los Procesos A y B se ilustran más detalladamente en los siguientes Esquemas 1 y 2, respectivamente.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 1

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El Esquema 1 ilustra la preparación de isómeros de dihidrotetrabenazina individuales con las configuraciones 2S,3S,11bR y 2R,3R,11bS y en los que los átomos de hidrógeno unidos en las posiciones 2 y 3 están dispuestos en una orientación relativa trans. Este esquema de reacción incluye el Proceso A arriba definido.

El punto de partida para la secuencia de reacciones del Esquema 1 consiste en una tetrabenazina comercial (IV), que es una mezcla racémica de los isómeros ópticos RR y SS de la tetrabenazina. En cada uno de los isómeros RR y SS, los átomos de hidrógeno de las posiciones 3 y 11b están dispuestos en una orientación relativa trans. Como alternativa a la utilización del compuesto comercial, la tetrabenazina se puede sintetizar de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente US número 2,830,993 (véase en particular el ejemplo 11).

La mezcla racémica RR y SS de la tetrabenazina se reduce utilizando el agente reductor de borohidruro, borohidruro de tri-sec-butil-litio ("L-Selectride"), para obtener una mezcla de los isómeros 2S,3R,11bR y 2R,3S,11bS (V) de dihidrotetrabenazina conocidos, de los cuales únicamente se muestra el isómero 2S,3R,11bR para simplificar. La formación de los isómeros RRR y SSS de la dihidrotetrabenazina se reduce al mínimo o se suprime utilizando L-Selectride, estéricamente más exigente, como agente reductor, en lugar de borohidruro de sodio.

Los isómeros de dihidrotetrabenazina (V) se someten a reacción con un agente deshidratante, tal como pentacloruro de fósforo, en un disolvente aprótico, tal como un hidrocarburo clorado (por ejemplo cloroformo o diclorometano, preferentemente diclorometano) para formar el compuesto insaturado (II) en forma de un par de enantiómeros, de los cuáles sólo se muestra el enantiómero R en el Esquema. La reacción de deshidratación se lleva a cabo típicamente a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, por ejemplo a aproximadamente 0-5ºC.

Después, el compuesto insaturado (II) se somete a una rehidratación estereoselectiva para generar la dihidrotetrabenazina (VI) y su imagen especular o antípoda (no mostrada), en la que los átomos de hidrógeno de las posiciones 3 y 11b están dispuestos en una orientación relativa cis y los átomos de hidrógeno de las posiciones 2 y 3 están dispuestos en una orientación relativa trans. La rehidratación estereoselectiva se lleva a cabo mediante un procedimiento de hidroboración utilizando borano-THF en tetrahidrofurano (THF), formando un complejo de borano intermedio (no mostrado), que después se oxida con peróxido de hidrógeno en presencia de una base tal como hidróxido de sodio.

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Después se puede llevar a cabo un paso de purificación inicial (por ejemplo mediante HPLC) para obtener el producto (V) de la secuencia de reacciones de rehidratación en forma de una mezcla de los isómeros 2S,3S,11bR y 2R,3R,11bS, de los cuales únicamente se muestra el isómero 2S,3S,11bR en el Esquema. Para separar los isómeros, la mezcla se trata con un ácido de Mosher R(+) en presencia de cloruro de oxalilo y dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano, para obtener un par de ésteres diastereoisoméricos (VII) (de los cuales sólo se muestra un diastereoisómero), los cuales después se pueden separar mediante HPLC. A continuación, los ésteres individuales se pueden hidrolizar utilizando un hidróxido metálico alcalino, tal como hidróxido de sodio, para obtener un único isómero
(VI).

En una variación de la secuencia de pasos mostrada en el Esquema 1, después de la reducción de la tetrabenazina RR/SS, la mezcla de enantiómeros de la dihidrotetrabenazina (V) resultante se puede separar para obtener los enantiómeros individuales. La separación se puede llevar a cabo formando una sal con un ácido quiral, tal como un ácido (+) o (-) canforsulfónico, separándose los diastereoisómeros resultantes mediante cristalización fraccionada, para obtener una sal de un único enantiómero y separando después la base libre de la sal.

El enantiómero de dihidrotetrabenazina separado se puede deshidratar para obtener un único enantiómero del alqueno (II). La rehidratación subsiguiente del alqueno (II) dará como resultado predominante o exclusivamente un único enantiómero de la cis-dihidrotetrabenazina (VI). Una ventaja de esta variación consiste en que no implica la formación de ésteres de ácido de Mosher y, en consecuencia, evita la separación cromatográfica utilizada típicamente para separar ésteres de ácido de Mosher.

El Esquema 2 ilustra la preparación de isómeros de dihidrotetrabenazina individuales con las configuraciones 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS y en los que los átomos de hidrógeno unidos en las posiciones 2 y 3 están dispuestos en una orientación relativa cis. Este esquema de reacción incluye el Proceso B arriba definido.

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Esquema 2

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En el Esquema 2, el compuesto insaturado (II) se obtiene reduciendo la tetrabenazina para obtener los isómeros 2S,3R,11bR y 2R,3S,11bS (V) de dihidrotetrabenazina y deshidratando éstos con PCl_{5} del modo arriba descrito en el Esquema 1. Sin embargo, en lugar de someter el compuesto (II) a hidroboración, el enlace doble 2,3 se convierte en un epóxido mediante reacción con ácido meta-cloroperbenzoico (MCPBA) y ácido perclórico. La reacción de epoxidación se lleva a cabo convenientemente en un disolvente alcohólico, tal como metanol, típicamente a aproximadamente temperatura ambiente.

El epóxido (VII) se somete después a una apertura de anillo por reducción utilizando borano-THF como agente reductor electrófilo obteniéndose un complejo de borano intermedio (no mostrado), que después se oxida y disocia con peróxido de hidrógeno en presencia de un álcali, tal como hidróxido de sodio, para obtener una dihidrotetrabenazina (VIII) en forma de una mezcla de los isómeros 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS, de los cuales únicamente se muestra el isómero 2R,3S,11bR para simplificar. El tratamiento de la mezcla de isómeros (VIII) con un ácido de Mosher R(+) en presencia de cloruro de oxalilo y dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano produce un par de ésteres epiméricos (IX) (de los que sólo se muestra un epímero), que después se puede separar por cromatografía e hidrolizar con hidróxido de sodio en metanol del modo arriba descrito en relación con el Esquema 1.

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Actividad biológica

Los cuatro isómeros de la cis-dihidrotetrabenazina se unen tanto a los receptores sigma-1 como a los receptores sigma-2, tal como se ilustra más abajo en los ejemplos. Los cuatro isómeros son más o menos equipotentes como ligandos para el receptor sigma-2, pero los Isómeros B y D se unen con más fuerza al receptor sigma-1 que los Isómeros A y C.

Se prevé que los isómeros de la cis-dihidrotetrabenazina serán activos como agentes inflamatorios. La actividad antiinflamatoria de los compuestos se puede analizar utilizando diversos métodos bien conocidos por los especialistas.

La capacidad de los compuestos para tratar la artritis se puede demostrar mediante uno o más de los siguientes ensayos y modelos:

(i)

Un modelo de artritis inducida por colágeno en murinos tal como se describe en Kakimoto y col., Cell Immunol. 142: 326-337, 1992.

(ii)

Un modelo de artritis inducida por colágeno en ratas tal como se describe en Knoerzer y col., Toxicol. Pathol. 25: 13-19, 1997.

(iii)

Un modelo de artritis adyuvante en ratas tal como se describe en Halloran y col., Arthritis Rheum. 39: 810-819, 1996.

(iv)

Un modelo de artritis inducida por pared celular estreptocócica en ratas tal como se describe en Schimmer y col., J. Immunol. 160: 1466-1477, 1998.

(v)

Un modelo de artritis reumatoide humana SCID-ratón tal como se describe en Oppenheimer-Marks y col., J. Clin. Invest. 101: 1261-1272, 1998.

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La capacidad de los compuestos para tratar lesiones pulmonares inflamatorias se puede demostrar mediante los siguientes ensayos y modelos:

(vi)

Un modelo de lesión pulmonar inducida por oxígeno en murinos tal como se describe en Wegner y col., Lung 170: 267-279, 1992.

(vii)

Un modelo de lesión pulmonar inducida por complejo inmune en murinos tal como se describe en Mulligan y col., J. Immunol. 154: 1350-1363, 1995.

(viii)

Un modelo de lesión pulmonar inducida por ácido en murinos tal como se describe en Nagase y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154: 504-510, 1996.

La capacidad de los compuestos para tratar enfermedades inflamatorias intestinales se puede demostrar en un modelo de colitis inducida químicamente en conejos tal como se describe en Bennet y col., J. Pharmacoll. Exp. Ther. 280:988-1000, 1997.

La capacidad de los compuestos para tratar lesiones hepáticas inflamatorias se puede demostrar en un modelo de lesión de hígado en murinos tal como se describe en Tanaka y col., J. Immunol. 151: 5088-5095, 1993.

La capacidad de los compuestos para tratar lesiones glomerulares inflamatorias se puede demostrar en un modelo de nefritis por suero nefrotóxico en ratas tal como se describe en Kaeasaki y col., J. Immunol. 150: 1074-1083, 1993.

La actividad antiinflamatoria de los compuestos también está indicada por su capacidad para reducir la producción de citoquinas proinflamatorias e inhibir la proliferación de células T tal como se describe más abajo en los ejemplos.

Formulaciones farmacéuticas

El compuesto de fórmula (Ia) se administra típicamente en forma de una composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en cualquier forma adecuada para la administración oral, parenteral, tópica, intranasal, intrabronquial, oftálmica, ótica, rectal, intravaginal o transdérmica. Cuando las composiciones están previstas para la administración parenteral, se pueden formular para la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o para el suministro directo a un órgano o tejido diana mediante inyección, infusión u otro medio de suministro. Las formas de dosificación farmacéutica adecuadas para la administración oral incluyen tabletas, cápsulas, comprimidos, píldoras, pastillas, jarabes, soluciones, pulverizaciones, polvos, gránulos, elixires y suspensiones, comprimidos, pulverizaziones, obleas o parches sublinguales y parches bucales.

Las composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de dihidrotetrabenazina de la invención se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas, véase por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company., Easton, PA, USA.

Las composiciones en comprimidos pueden contener una dosis unitaria de compuesto activo junto con un diluyente o excipiente inerte, tal como un azúcar o alcohol azúcar, por ejemplo lactosa, sacarosa, sorbitol o manitol; y/o un diluyente no derivado de azúcar, como carbonato sódico, fosfato de calcio, talco, carbonato de calcio, o una celulosa o un derivado de ésta, como metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, y almidones como almidón de maíz. Los comprimidos también pueden contener ingredientes estándar, por ejemplo agentes aglutinantes y de granulación, tales como polivinilpirrolidona, desintegrantes (por ejemplo polímeros reticulados hinchables como carboximetilcelulosa reticulada), lubricantes (por ejemplo estearatos), conservantes (por ejemplo parabenos), antioxidantes (por ejemplo BHT), agentes tampón (por ejemplo tampones fosfato o citrato) y agentes efervescentes tales como mezclas citrato/bicarbonato. Estos excipientes son bien conocidos y no es necesario describirlos aquí detalladamente.

Las formulaciones en cápsulas pueden ser de la variedad de gelatina dura o de gelatina blanda y pueden contener el componente activo en forma sólida, semisólida o líquida. Las cápsulas de gelatina se pueden formar a partir de gelatina animal o de equivalentes de ésta sintéticos o vegetales.

Las formas de dosificación sólidas (por ejemplo comprimidos, cápsulas, etc.) pueden estar o no revestidas, pero típicamente tienen un revestimiento, por ejemplo un revestimiento de película protectora (por ejemplo una cera o barniz) o un revestimiento de control de liberación. El revestimiento (por ejemplo un polímero de tipo Eudragit^{TM}) se puede diseñar para liberar el componente activo en un lugar deseado dentro del tracto gastrointestinal. Por ejemplo, se puede elegir un revestimiento que se degrade bajo determinadas condiciones de pH dentro del tracto gastrointestinal, liberando así el compuesto selectivamente en el estómago o en el íleon o el duodeno.

En lugar de un revestimiento o además de éste, el fármaco se puede presentar en una matriz sólida que incluya un agente de control de liberación, por ejemplo un agente retardante de la liberación que pueda ser adaptado para liberar selectivamente el compuesto bajo distintas condiciones de acidez o alcalinidad en el tracto gastrointestinal. Alternativamente, el material de matriz o revestimiento retardante de la liberación puede consistir en un polímero erosionable (por ejemplo un polímero de anhídrido maleico) que se va erosionando de forma esencialmente continua a medida que la forma de dosificación atraviesa el tracto gastrointestinal.

Las composiciones para uso tópico incluyen pomadas, cremas, pulverizaciones, parches, geles, gotas líquidas e insertos (por ejemplo insertos intraoculares). Estas composiciones se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos.

Las composiciones para la administración parenteral se presentan típicamente en forma de soluciones o suspensiones finas acuosas u oleaginosas estériles, o se pueden suministrar en forma de un polvo estéril finamente dividido para producir un preparado magistral con agua estéril para inyección.

Los ejemplos de formulaciones para la administración rectal o intravaginal incluyen supositorios y supositorios vaginales, formados por ejemplo a partir de un material moldeable o ceroso conformado que contiene el compuesto activo.

Las composiciones para la administración por inhalación pueden consistir en composiciones en polvo inhalables o pulverizaciones líquidas o en polvo, y se pueden administrar de forma estándar utilizando dispositivos inhaladores de polvo o dispositivos dispensadores de aerosol. Estos dispositivos son bien conocidos. Para la administración por inhalación, las formulaciones en polvo comprenden típicamente el compuesto activo junto con un diluyente en polvo sólido inerte, por ejemplo lactosa.

Los compuestos de la invención se presentarán generalmente en forma de dosis unitarias y, como tales, típicamente contendrán una cantidad suficiente de compuesto para proporcionar el nivel deseado de actividad biológica. Por ejemplo, una formulación prevista para administración oral puede contener entre 2 miligramos y 200 miligramos de ingrediente activo, normalmente entre 10 miligramos y 100 miligramos, por ejemplo 12,5 miligramos, 25 miligramos y 50 miligramos.

El compuesto activo será administrado a un paciente que lo necesite (por ejemplo un paciente humano o animal) en una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado.

El sujeto que necesita dicha administración es típicamente un paciente que sufre o tiene riesgo de sufrir una enfermedad inflamatoria tal como se describe más arriba.

Los compuestos se administrarán típicamente en cantidades terapéutica o profilácticamente útiles y generalmente no tóxicas. No obstante, en determinadas situaciones, las ventajas de la administración del compuesto de dihidrotetrabenazina de la invención pueden pesar más que las desventajas de cualquier efecto tóxico o secundario, en cuyo caso puede considerarse adecuado administrar compuesto en cantidades asociadas con un cierto grado de toxicidad.

Una dosis diaria típica del compuesto puede llegar a ser de 1.000 mg al día, por ejemplo entre 0,01 miligramos y 10 miligramos por kilogramo de peso corporal, más habitualmente entre 0,025 miligramos y 5 miligramos por kilogramo de peso corporal, por ejemplo hasta 3 miligramos por kilogramo de peso corporal, y más típicamente entre 0,15 miligramos y 5 miligramos por kilogramo de peso corporal, aunque se pueden administrar dosis mayores o menores si así se requiere.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: ilustra el efecto de los compuestos Isómero B (RU350) e Isómero D (RU346) en la producción de TNF\alpha por monocitos.

Figura 2: ilustra el efecto de los compuestos Isómero B (RU350) e Isómero D (RU346) en la producción de IL-4 por monocitos.

Figura 3: lustra el efecto de los compuestos Isómero B (RU350) e Isómero D (RU346) en la producción de IL-2 por monocitos humanos.

Figura 4: ilustra el efecto de los compuestos Isómero B (RU350) e Isómero D (RU346) en la producción de IL-5 por monocitos humanos.

Figura 5: ilustra el efecto de los compuestos Isómero B (RU350) e Isómero D (RU346) en la producción de IL-10 por monocitos humanos.

Figura 6: ilustra el efecto de los compuestos Isómero B (RU350) e Isómero D (RU346) en la producción de IL-12 por monocitos humanos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran la síntesis y las propiedades de los isómeros de la 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina. Los ejemplos describen los cuatro isómeros de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina, aunque la invención se refiere únicamente a los usos terapéuticos del Isómero B (el compuesto de la fórmula (Ia)). Los ejemplos relativos a los otros isómeros se conservan como ejemplos comparativos.

Ejemplo 1 Preparación de los isómeros 2S,3S,11bR y 2R,3R,11bS de dihidrotetrabenazina 1A. Reducción de la tetrabenazina RR/SS

14

Se añadió lentamente L-Selectride® 1M en tetrahidrofurano (135 ml, 135 mmol, 2,87 eq), a lo largo de 30 minutos, a una solución agitada del racemato RR/SS de tetrabenazina (15 g, 47 mmol) en etanol (75 ml) y tetrahidrofurano (75 ml) a 0ºC. Una vez completa la adición, la mezcla se agitó a 0ºC durante 30 minutos y después se dejó que se calentara a temperatura ambiente.

La mezcla se vertió sobre hielo triturado (300 g) y se añadió agua (100 ml). La solución se extrajo con dietil éter (2 x 200 ml) y los extractos etéreos combinados se lavaron con agua (100 ml) y se secaron parcialmente sobre carbonato de potasio anhidro. El secado se completó utilizando sulfato de magnesio anhidro y, después de filtración, el disolvente se retiró bajo presión reducida (protegido de la luz, temperatura del baño <20ºC), para obtener un sólido amarillo pálido.

El sólido se suspendió con éter de petróleo (30-40ºC) y se filtró para obtener un sólido en forma de un polvo blanco (12 g, 80%).

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1B. Deshidratación de la tetrabenazina reducida

15

Se añadió pentacloruro de fósforo (32,8 g, 157,5 mmol, 2,5 eq) en porciones a lo largo de 30 minutos a una solución agitada del producto de tetrabenazina reducida del Ejemplo 1A (20 g, 62,7 mmol) en diclorometano (200 ml) a 0ºC. Una vez completa la adición, la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante otros 30 minutos y la solución se vertió lentamente en una disolución de carbonato sódico acuoso 2M que contenía hielo triturado (0ºC). Cuando cesó la formación inicial de gases ácidos, la mezcla se basificó (aproximadamente pH 12) utilizando carbonato sódico sólido.

La solución alcalina se extrajo utilizando acetato de etilo (800 ml) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de filtrar la carga, el disolvente se retiró bajo presión reducida para obtener un aceite marrón, que se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) para obtener el alqueno semipuro en forma de un sólido amarillo (10,87 g, 58%).

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1C. Hidratación del alqueno crudo del Ejemplo 1B

16

Se trató una solución en THF seco (52 ml) del alqueno crudo (10,87 g, 36,11 mmol) del Ejemplo 1B, a temperatura ambiente, con borano-THF 1M (155,6 ml, 155,6 mmol, 4,30 eq) añadido gota a gota. La reacción se agitó durante 2 horas, se añadió agua (20 ml) y la solución se basificó a pH 12 con una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 30%.

Se añadió una disolución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% (30 ml) a la mezcla de reacción alcalina agitada y la solución se calentó a reflujo durante 1 hora y después se dejó enfriar. Se añadió agua (100 ml) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 ml). Los extractos orgánicos se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrar la carga, el disolvente se retiró bajo presión reducida, para obtener un aceite amarillo (9 g).

El aceite se purificó utilizando HPLC de preparación (columna: Lichrospher Si60, 5 \mum, 250 x 21,20 mm, fase móvil: hexano:etanol: diclorometano (85:15:5); UV 254 nm, caudal: 10 ml min^{-1}) a 350 mg por inyección, seguida de concentración de las fracciones de interés a vacío. El aceite obtenido se disolvió después en éter y se concentró otra vez a vacío para obtener el racemato de dihidrotetrabenazina arriba mostrado en forma de una espuma amarilla (5,76 g, 50%).

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1D. Preparación de derivados éster de Mosher

17

Se añadió a diclorometano anhidro (50 ml) ácido R(+)-\alpha-metoxi-\alpha-trifluorometilfenilacético (5 g, 21,35 mmol), cloruro de oxalilo (2,02 ml) y DMF (0,16 ml) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. La solución se concentró bajo presión reducida y el residuo se reabsorbió en diclorometano anhidro (50 ml). La solución resultante se enfrió utilizando un baño de agua helada y después se añadió dimetilaminopiridina (3,83 g, 31,34 mmol), seguidamente una solución presecada (a través de tamices de 4\ring{A}) del producto sólido del Ejemplo 1C (5 g, 15,6 mmol) en diclorometano anhidro. Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 45 minutos, se añadió agua (234 ml) y la mezcla se extrajo con éter (2 x 200 ml). El extracto de éter se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se pasó a través de una compresa de sílice, y el producto se sometió a elución con éter.

El producto de elución de éter recogido se concentró bajo presión reducida para obtener un aceite, que se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, hexano:éter (10:1)). La evaporación de las fracciones de columna de interés recogidas y la retirada del disolvente bajo presión reducida produjo un sólido, que se purificó adicionalmente mediante cromatografía de columna (sílice, hexano:acetato de etilo (1:1)) para obtener tres componentes principales, que se resolvieron parcialmente en los picos 1 y 2 de los ésteres de Mosher.

Mediante HPLC de preparación de los tres componentes (columna: 2 x Lichrospher Si60, 5 \mum, 250 x 21,20 mm, fase móvil: hexano:isopropanol (97:3), UV 254 nm; caudal: 10 ml min^{-1}) con 300 mg de carga y concentración subsiguiente de las fracciones de interés bajo vacío se obtuvieron los derivados éster de Mosher puros.

Pico 1 (3,89 g, 46,5%)

Pico 2 (2,78 g, 33%).

Las fracciones correspondientes a los dos picos se sometieron a hidrólisis para liberar los isómeros de dihidrotetrabenazina individuales identificados y caracterizados como Isómeros A y B. Se cree que cada uno de los Isómeros A y B tiene una de las siguientes estructuras:

18

Más específicamente, de acuerdo con los experimentos de cristalografía de rayos X descrita más abajo en el Ejemplo 4, se cree que el Isómero B tiene la configuración absoluta 2S,3S,11bR.

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1E. Hidrólisis del pico 1 para obtener el Isómero A

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (87,5 ml) a una solución del éster de Mosher del pico 1 (3,89 g, 7,27 mmol) en metanol (260 ml), y la mezcla se agitó y calentó a reflujo durante 150 minutos. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente se añadió agua (200 ml) y la solución se extrajo con éter (600 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se concentró bajo presión reducida.

El residuo se disolvió con acetato de etilo (200 ml), la solución se lavó con agua (2 x 50 ml), la fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se concentró bajo presión reducida, para obtener una espuma amarilla. Este material se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, elución en gradiente de acetato de etilo:hexano (1:1) a acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y el disolvente se retiró bajo presión reducida. El residuo se absorbió en éter y el disolvente se retiró de nuevo bajo presión reducida para obtener el Isómero A en forma de una espuma de color hueso (1,1 g, 47%).

El Isómero A, que se cree tiene la configuración 2R,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó mediante ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS correspondientes al Isómero A se muestran en la Tabla 1 y los datos de HPLC quiral y ORD se muestran en la Tabla 3.

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1F. Hidrólisis del pico 2 para obtener el Isómero B

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (62,5 ml) a una solución del éster de Mosher de pico 2 (2,78 g, 5,19 mmol) en metanol (185 ml), y la mezcla se agitó y calentó a reflujo durante 150 minutos. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, se añadió agua (142 ml) y la solución se extrajo con éter (440 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se concentró bajo presión reducida.

El residuo se disolvió con acetato de etilo (200 ml), la solución se lavó con agua (2 x 50 ml), la fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se concentró bajo presión reducida. Después se añadió éter de petróleo (30-40ºC) al residuo y la solución se concentró de nuevo bajo vacío para obtener el Isómero B en forma de una espuma blanca (1,34 g, 81%).

El Isómero B, que se cree tiene la configuración 2S,3S,11bR, se caracterizó mediante ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral, ORD y cristalografía de rayos X. Los datos de IR, NMR y MS correspondientes al Isómero B se muestran en la Tabla 1 y los datos de HPLC quiral y ORD se muestran en la Tabla 3. Los datos de la cristalografía de rayos X se muestran en el Ejemplo 4.

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Ejemplo 2 Preparación de los isómeros 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS de dihidrotetrabenazina 2A. Preparación de 2,3-deshidrotetrabenazina

Una solución que contenía una mezcla racémica (15 g, 47 mmol) de enantiómeros de tetrabenazina RR y SS en tetrahidrofurano se sometió a reducción con L-Selectride® mediante el método del Ejemplo 1A para obtener una mezcla de los enantiómeros 2S,3R,11bR y 2R,3S,11bS de dihidrotetrabenazina en forma de un sólido en polvo blanco (12 g, 80%). La dihidrotetrabenazina parcialmente purificada se deshidrató después mediante PCl_{5} de acuerdo con el método del Ejemplo 1B, para obtener una mezcla semipura de los isómeros 11bR y 11bS de 2,3-deshidrotetrabenazina (el enantiómero 11bR se muestra más abajo) en forma de un sólido amarillo (12,92 g, 68%).

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19

2B. Epoxidación del alqueno crudo del Ejemplo 2A

20

A una solución agitada del alqueno crudo del Ejemplo 2A (12,92 g, 42,9 mmol) en metanol (215 ml) se le añadió una solución de ácido perclórico al 70% (3,70 ml, 43 mmol) en metanol (215 ml). Después se añadió ácido 3-cloroperoxibenzoico al 77% (15,50 g, 65 mmol) a la reacción y la mezcla resultante se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente protegida de la luz.

La mezcla de reacción se vertió en una disolución acuosa saturada de sulfito de sodio (200 ml) y se añadió agua (200 ml). Luego se añadió cloroformo (300 ml) a la emulsión resultante y la mezcla se basificó con bicarbonato sódico acuoso saturado (400 ml).

Se recogió la capa orgánica y la fase acuosa se lavó con más cloroformo (2 x 150 ml). Las capas de cloroformo combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarlas, se retiró el disolvente bajo presión reducida, para obtener un aceite marrón (14,35 g, rendimiento > 100% - posiblemente queda disolvente en el producto). Este material se utilizó sin purificación adicional.

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2C. Apertura de anillo por reducción del epóxido en 2B

21

Una solución agitada del epóxido crudo del Ejemplo 2B (14,35 g, 42,9 mmol, suponiendo un rendimiento del 100%) en THF seco (80 ml) se trató lentamente con borano 1M/THF (184,6 ml, 184,6 mmol) durante 15 minutos. La reacción se agitó durante dos horas, se añadió agua (65 ml) y la solución se calentó a reflujo con agitación durante 30 minutos.

Después de enfriar la mezcla de reacción, se añadió una disolución de hidróxido de sodio al 30% (97 ml), seguidamenbte una disolución de peróxido de hidrógeno al 30% (48,6 ml) y la mezcla de reacción se agitó y calentó a reflujo durante 1 hora más.

La mezcla de reacción enfriada se extrajo con acetato de etilo (500 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se retiró el disolvente bajo presión reducida para obtener un aceite. Se añadió hexano (230 ml) al aceite y la solución se reconcentró bajo presión reducida.

El residuo oleaginoso se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y el disolvente se retiró bajo presión reducida. El residuo se purificó de nuevo mediante cromatografía en columna (sílice, gradiente, hexano a éter). Las fracciones de interés se combinaron y los disolventes se evaporaron bajo presión reducida para obtener un sólido amarillo pálido (5,18 g, 38%).

2D. Preparación de derivados éster de Mosher de los isómeros 2R,3S,11bR y 2S,3R,11bS de dihidrotetrabenazina

22

A diclorometano anhidro (46 ml) se añadió ácido R(+)-\alpha-metoxi-\alpha-trifluorometilfenilacético (4,68 g, 19,98 mmol), cloruro de oxalilo (1,90 ml) y DMF (0,13 ml) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. La solución se concentró bajo presión reducida y el residuo se reabsorbió en diclorometano anhidro (40 ml). La solución resultante se enfrió utilizando un baño de agua helada y después se añadió dimetilaminopiridina (3,65 g, 29,87 mmol), seguida de una solución presecada (a través de tamices de 4\ring{A}) del producto sólido del Ejemplo 2C (4,68 g, 14,6 mmol) en diclorometano anhidro. Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 45 minutos, se añadió agua (234 ml) y la mezcla se extrajo con éter (2 x 200 ml). El extracto de éter se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se pasó a través de una compresa de sílice, y el producto se sometió a elución con éter.

El producto de elución de éter recogido se concentró bajo presión reducida para obtener un aceite, que se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, hexano:éter (1:1)). La evaporación de las fracciones de columna de interés recogidas y la retirada del disolvente bajo presión reducida produjo un sólido rosa (6,53 g).

Mediante HPLC de preparación del sólido (columna: 2 x Lichrospher Si60, 5 \mum, 250 x 21,20 mm, fase móvil: hexano:isopropanol (97:3), UV 254 nm; caudal: 10 ml min^{-1}) con 100 mg de carga y concentración subsiguiente de las fracciones de interés bajo vacío se obtuvo un sólido, que se suspendió con éter de petróleo (30-40ºC) y se recogió por filtración para obtener los derivados éster de Mosher puros.

Pico 1 (2,37 g, 30%)

Pico 2 (2,42 g, 30%).

Las fracciones correspondientes a los dos picos se sometieron a hidrólisis para liberar los isómeros de dihidrotetrabenazina individuales identificados y caracterizados como Isómeros C y D. Se cree que cada uno de los Isómeros C y D tiene una de las siguientes estructuras:

23

2F. Hidrólisis del pico 1 para obtener el Isómero C

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (53 ml) a una solución agitada del éster de Mosher de pico 1 (2,37 g, 4,43 mmol) en metanol (158 ml), y la mezcla se agitó a reflujo durante 150 minutos. Tras enfriar la mezcla de reacción, se añadió agua (88 ml) y la solución resultante se extrajo con éter (576 ml). El extracto orgánico se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarlo, se retiró el disolvente bajo presión reducida. Después se añadió acetato de etilo (200 ml) al residuo y la solución se lavó con agua (2 x 50 ml). La solución orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se retiró el disolvente bajo presión reducida.

Este residuo se trató con éter de petróleo (30-40ºC) y el sólido suspendido resultante se recogió por filtración. El filtrado se concentró bajo presión reducida y la segunda carga de sólido suspendido se recogió por filtración. Los dos sólidos recogidos se combinaron y se secaron bajo presión reducida para obtener el Isómero C (1,0 g, 70%).

El Isómero C, que se cree tiene la configuración 2R,3S,11bR o 2S,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó mediante ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS correspondientes al Isómero C se muestran en la Tabla 2 y los datos de HPLC quiral y ORD se muestran en la Tabla 4.

2G. Hidrólisis del pico 2 para obtener el Isómero D

Se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 20% (53 ml) a una solución agitada del éster de Mosher de pico 2 (2,42 g, 4,52 mmol) en metanol (158 ml), y la mezcla se agitó a reflujo durante 150 minutos. Tras enfriar la mezcla de reacción, se añadió agua (88 ml) y la solución resultante se extrajo con éter (576 ml). El extracto orgánico se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarlo, se retiró el disolvente bajo presión reducida. Después se añadió acetato de etilo (200 ml) al residuo y la solución se lavó con agua (2 x 50 ml). La solución orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y, después de filtrarla, se retiró el disolvente bajo presión reducida.

Este residuo se trató con éter de petróleo (30-40ºC) y el sólido naranja suspendido resultante se recogió por filtración. El sólido se disolvió en acetato de etilo:hexano (15:85) y se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, gradiente acetato de etilo:hexano (15:85) a acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y el disolvente se retiró bajo presión reducida. El residuo se suspendió con éter de petróleo (30-40ºC) y la suspensión resultante se recogió por filtración. El sólido recogido se secó bajo presión reducida para obtener el Isómero D en forma de un sólido blanco (0,93 g, 64%).

El Isómero D, que se cree tiene la configuración 2R,3S,11bR o 2S,3R,11bS (no se determinó la estereoquímica absoluta), se caracterizó mediante ^{1}H-NMR, ^{13}C-NMR, IR, espectrometría de masas, HPLC quiral y ORD. Los datos de IR, NMR y MS correspondientes al isómero D se muestran en la Tabla 2 y los datos de HPLC quiral y ORD se muestran en la Tabla 4.

En las Tablas 1 y 2, los espectros de infrarrojos se determinaron utilizando el método de disco de KBr. Los espectros ^{1}H-NMR se llevaron a cabo en soluciones en cloroformo deuterado utilizando un espectrómetro Varian Gemini NMR (200 MHz). Los espectros ^{13}C-NMR se llevaron a cabo en soluciones en cloroformo deuterado utilizando un espectrómetro Varian Gemini NMR (50 MHz). Los espectros de masas se obtuvieron utilizando un espectrómetro Micromass Platform II (condiciones ES^{+}). En las Tablas 3 y 4, los datos de Dispersión Rotatoria Óptica (ORD) se obtuvieron utilizando un instrumento Optical Activity PolAAr 2001, en solución de metanol, a 24ºC. Las medidas del tiempo de retención por HPLC se llevaron a cabo utilizando un cromatógrafo HP 1050 HPLC con detección
UV.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLAS 1 y 2 Datos espectroscópicos

24

25

TABLAS 3 y 4 Datos cromatográficos y de ORD

26

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28

Ejemplo 3 Método alternativo para la preparación del Isómero B y preparación de la sal mesilato 3A. Reducción de la RR/SS tetrabenazina

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29

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Se añadió lentamente L-Selectride® 1M en tetrahidrofurano (52 ml, 52 mmol, 1,1 eq), a lo largo de 30 minutos, a una solución agitada y enfriada (baño de hielo) del racemato de tetrabenazina (15 g, 47 mmol) en tetrahidrofurano (56 ml). Una vez completa la adición, la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante otras seis horas. Los análisis por TLC (sílice, acetato de etilo) mostraron que sólo quedaban cantidades muy pequeñas del material de partida.

La mezcla se vertió sobre una mezcla agitada de hielo triturado (112 g), agua (56 ml) y ácido acético glacial (12,2 g). La solución amarilla resultante se lavó con éter (2 x 50 ml) y se basificó mediante la adición lenta de carbonato de sodio sólido (aprox. 13 g). Después se añadió éter de petróleo (30-40ºC) (56 ml) a la mezcla bajo agitación y el \beta-DHTBZ crudo se recogió por filtración en forma de un sólido blanco.

El sólido crudo se disolvió en diclorometano (aprox. 150 ml) y la solución resultante se lavó con agua (40 ml), se secó utilizando sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida hasta aproximadamente 40 ml. Se formó una suspensión espesa de un sólido blanco. Después se añadió éter de petróleo (30-40ºC) (56 ml) y la suspensión se agitó durante quince minutos a la temperatura del laboratorio. El producto se recogió por filtración y se lavó sobre el filtro con éter de petróleo (30-40ºC) (40 a 60 ml) hasta que quedó blanco como la nieve antes de secarlo al aire a temperatura ambiente para obtener \beta-DHTBZ (10,1 g, 67%) en forma de un sólido blanco. Los análisis TLC (sílice, acetato de etilo) mostraron un único componente.

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3B. Preparación y cristalización fraccionada de la sal del ácido canforsulfónico de \beta-DHTBZ racémica

El producto del Ejemplo 3A y 1 equivalente de ácido (S)-(+)-canfor-10-sulfónico se disolvieron, con calentamiento, en una cantidad mínima de metanol. La solución resultante se dejó enfriar y después se diluyó lentamente con éter hasta que se completó la formación del precipitado sólido resultante. El sólido cristalino blanco resultante se recogió por filtración y se lavó con éter antes de secarlo.

La sal de ácido canforsulfónico (10 g) se disolvió en una mezcla de etanol absoluto caliente (170 ml) y metanol (30 ml). La solución resultante se agitó y se dejó enfriar. Dos horas después, el precipitado formado se recogió por filtración en forma de un sólido cristalino blanco (2,9 g). Una muestra del material cristalino se agitó en un embudo de separación con un exceso de carbonato sódico acuoso saturado y diclorometano. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se trituró utilizando éter de petróleo (30-40ºC) y la solución orgánica se concentró de nuevo. El análisis por HPLC quiral de la sal utilizando una columna Chirex (S)-VAL y (R)-NEA 250 x 4,6 mm y un eluyente hexano:etanol (98:2) con un caudal de 1 ml/minuto mostró que el \beta-DHTBZ aislado estaba enriquecido en un enantiómero (e.e. aprox. 80%).

\newpage

La sal de ácido canforsulfónico enriquecida (14 g) se disolvió en etanol absoluto caliente (140 ml) y se añadió 2-propanol (420 ml). La solución resultante se agitó y en un minuto comenzó a formarse un precipitado. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se agitó durante una hora. El precipitado formado se recogió por filtración, se lavó con éter y se secó para obtener un sólido cristalino blanco (12 g).

El material cristalino se agitó en un embudo de separación con un exceso de carbonato sódico acuoso saturado y diclorometano. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se trituró utilizando éter de petróleo (30-40ºC) y la solución orgánica se concentró de nuevo para obtener (después de secado en vacío) (+)-\beta-DHTBZ (6,6 g, ORD +107,8º). El enantiómero aislado tiene un e.e. > 97%.

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3C. Preparación del Isómero B

Se añadió una solución de pentacloruro de fósforo (4,5 g, 21,6 mmol, 1,05 eq) en diclorometano (55 ml), a un ritmo constante a lo largo de diez minutos, a una solución agitada y enfriada (baño de agua helada) del producto del Ejemplo 3B (6,6 g, 20,6 mmol) en diclorometano (90 ml). Una vez completa la adición, la solución amarilla resultante se agitó durante otros diez minutos antes de verterla en una mezcla de carbonato sódico (15 g) en agua (90 ml) y hielo triturado (90 g) sometido a agitación rápida. La mezcla se agitó durante otros 10 minutos y se transfirió a un embudo de separación.

Una vez separadas las fases, la capa de diclorometano marrón se retiró, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida, para obtener el alqueno crudo intermedio en forma de un aceite marrón (aprox. 6,7 g). Los análisis por TLC (sílice, acetato de etilo) mostraron que no quedaba nada de (+)-\beta-DHTBZ en el producto crudo.

El alqueno crudo se absorbió (atmósfera de nitrógeno seco) en tetrahidrofurano anhidro (40 ml) y se añadió una solución de borano en THF (solución 1M, 2,5 eq, 52 ml) bajo agitación a lo largo de quince minutos. Después, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante dos horas. Los análisis por TLC (sílice, acetato de etilo) mostraron que no quedaba nada del alqueno intermedio en la mezcla de reacción.

A la mezcla de reacción agitada se añadió una disolución de hidróxido de sodio (3,7 g) en agua (10 ml), seguidamente una disolución acuosa de peróxido de hidrógeno (50%, aprox. 7 ml), y la mezcla de dos fases formada se agitó bajo reflujo durante una hora. Los análisis por TLC de la fase orgánica en ese momento (sílice, acetato de etilo) mostraron el aspecto de un producto con el Rf esperado para el Isómero B. También se observó un componente no polar característico.

La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en un embudo de separación. La capa orgánica superior se retiró y se concentró bajo presión reducida para eliminar la mayor parte del THF. El residuo se absorbió en éter (estabilizado (BHT), 75 ml), se lavó con agua (40 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida para obtener un aceite amarillo pálido (8,1 g).

El aceite amarillo se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo:hexano (80:20), aumentando hasta el 100% de acetato de etilo) y las fracciones de columna deseadas se recogieron, combinaron y concentraron bajo presión reducida para obtener un aceite pálido, que se trató con éter (estabilizado, 18 ml) y se concentró bajo presión reducida para obtener el Isómero B en forma de una espuma sólida de color amarillo pálido
(2,2 g).

La HPLC quiral utilizando las condiciones indicadas en el Ejemplo 3B confirmó que se había producido el Isómero B en un exceso enantiomérico (e.e.) superior al 97%.

La rotación óptica se midió utilizando un polarímetro Bellingham Stanley ADP220 y dio como resultado una [\alpha_{D}] de +123,5º.

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3D. Preparación de la sal mesilato del Isómero B

La sal de metanosulfonato del Isómero B se preparó disolviendo una mezcla de 1 equivalente del Isómero B del Ejemplo 3C y 1 equivalente de ácido metanosulfónico en la cantidad mínima de etanol y añadiendo después dietil éter. El precipitado blanco resultante formado se recogió por filtración y se secó in vacuo para obtener la sal mesilato con un rendimiento de aprox. un 85% y una pureza (mediante HPLC) de aproximadamente un 96%.

\newpage

Ejemplo 4 Estudios cristalográficos de rayos X del Isómero B

Se preparó la sal del ácido (S)-(+)-canfor-10-sulfónico del Isómero B y un cristal simple se sometió a estudios cristalográficos de rayos X bajo las siguientes condiciones:

\quad

Difractómetro: Nonius KappaCCD area detector (exploraciones t/i y exploraciones OJ para llenar la unidad asimétrica).

\quad

Determinación celular: DirAx (Duisenberg, A.J.M. (1992). J. Appl. Cryst. 25, 92-96).

\quad

Recogida de datos: Collect (Collect: software de recogida de datos, R. Hooft, Nonius B. V., 1998).

\quad

Reducción de datos y refinación celular: Demo (Z. Otwinowski & W. Minor, Methods in Enzymology (1997) vol. 276: Macromolecular Crystallography, parte A, páginas 307-326; C.W. Carter, Jr & R.M. Sweet, Eds., Academic Press).

\quad

Corrección de absorción: Sheldrick, G. M. SADABS - Bruker Nonius area detector scaling and absorption correction - V2.\0.

\quad

Solución estructural: SHELXS97 (G. M. Sheldrick, Acta Cryst. (1990) A46 467-473). Refinación estructural: SHELXL97 (G. M. Sheldrick (1997), Universidad de Göttingen, Alemania).

\quad

Gráficos: Cameron - A Molecular Graphics Package (D.M. Watkin, L. Pearce y C.K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, Universidad de Oxford, 1993).

\quad

Detalles especiales: Todos los átomos de hidrógeno se dispusieron en posiciones ideales y se refinaron utilizando un modelo riding, excepto aquellos de NH y OH, que estaban situados en el mapa de diferencias y se refinaron utilizando restricciones. Quiralidad: NI=R, CI2=S, CI3=S, CI5=R, C21=S, C24=R.

Los resultados de los estudios se muestran en las Tablas A, B, C, D y E.

En las tablas, la etiqueta RUS0350 se refiere al Isómero B.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA A

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30

TABLA B Coordenadas atómicas [x 10^{4}], parámetros de desplazamiento isotrópico equivalente [A^{2} x 10^{3}] y factores de ocupación de posiciones. U_{eq} se define como un tercio de la traza del tensor U^{ij} ortogonalizado

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31

TABLA C Longitudes [A] y ángulos [º] de enlace

32

TABLA D Parámetros de desplazamiento anisotrópico [A^{2} x 10^{3}]. El exponente del factor de desplazamiento anisotrópico adopta la siguiente forma: -2\pi^{2}[h^{2} a^{\text{*}2} U^{11} + ... + 2 h k a^{\text{*}} b^{\text{*}} U^{12}]

33

TABLA E Coordenadas de hidrógeno [x 10^{4}] y parámetros de desplazamiento isotrópico [A^{2} x 10^{3}]

34

TABLA 6 Enlaces de hidrógeno [\ring{A} y ^{o}]

35

36

En base a los datos arriba mostrados, se considera que el Isómero B tiene la configuración 2S,3S,11bR, que corresponde a la fórmula (Ia):

37

Ejemplo 5 Estudios de unión a los receptores sigma

Los cuatro isómeros A, B, C y D de la dihidrotetrabenazina se sometieron a ensayos de unión específicos para comprobar su capacidad para unirse a los receptores sigma-1 y sigma-2. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

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(a) Receptor sigma \sigma_{1}

38

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(b) Receptor sigma \sigma_{2}

39

TABLA 5

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41

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Los datos demuestran que los cuatro isómeros se unen tanto a los receptores sigma-1 como a los receptores sigma-2. Los cuatro isómeros son más o menos equipotentes en los estudios de unión al receptor sigma-2, pero los Isómeros B y D muestran una unión más fuerte al receptor sigma-1.

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Ejemplo 6 Determinación del efecto de los compuestos de la invención en la producción de citoquinas por monocitos humanos estimulada por LPS/IFN

Los compuestos de la invención se analizaron para determinar en qué medida podían modular la producción de citoquinas por monocitos humanos. Los monocitos son precursores de macrófagos y son una fuente clave de citoquinas inflamatorias en una amplia gama de enfermedades. Por consiguiente, la actividad de los compuestos de la invención contra la producción de monocitos es un buen indicador de la probabilidad de que los compuestos tengan actividad antiinflamatoria.

Se establecieron los siguientes grupos de tratamiento.

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42

Procedimientos Modulación de la producción de citoquina por monocitos humanos Materiales

\quad

Tampón MACS: 1 x PBS pH 7,2, EDTA 2 mM (Sigma) 5% suero AB humano.

\quad

Medio de cultivo: 500 ml RPMI 1640 (Invitrogen), 5ml Penstrep (Sigma) 5 ml L-glutamina (Invitrogen), 10 ml HEPES (Sigma), 5% plasma autólogo.

\quad

Compuestos: Reserva a 1 mM en etanol absoluto.

\quad

LPS: Salmonella abortis a 1 mg/ml (Sigma, Cat # L1887).

\quad

IFN_{\gamma}: Humano recombinante a 10 \mug/ml (BD Pharmacia, Cat # 554617).

\quad

Perlas de selección positiva CD14 MACS y columnas LS (Miltenyi Biotech).

\quad

Anticuerpo CD14:FITC (Miltenyi Biotech).

\quad

Células mononucleares de cultivo de Bristol National Blood Services.

\quad

1 ml de sangre debería proporcionar 7 x 10^{6} células totales.

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Preparación de plasma autólogo

\quad

Se centrifugan las células mononucleares de cultivo a 3.500 r.p.m., 10 minutos.

\quad

Se retira la capa superior de plasma y se inactiva por calor a 56ºC, 30 minutos.

\quad

Se centrifuga a 3.500 r.p.m., 10 minutos, para eliminar proteínas de complemento inactivadas por calor, etc.

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Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

1.

Las células mononucleares del cultivo se resuspenden en un volumen igual de medio RPMI 1640 y se mezclan por inversión.

2.

Se precalienta histopaque (Sigma) a temperatura ambiente (TA) y se añaden 10 ml a un universal.

3.

Se cubre con cuidado con 15 ml de una mezcla sangre/medio.

4.

Se centrifuga a 1.600 r.p.m. durante 25 minutos a TA (sin freno).

5.

Las PBMC se separan en la capa intermedia entre el medio y el histopaque. Se retiran las células a un Falcon de 50 ml y se añaden 10 ml de medio.

6.

Se centrifuga a 1.800 r.p.m. durante 10 minutos a TA.

7.

Se lava x3 con 40 ml de medio RPMI y se resuspende en medio de cultivo.

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Aislamiento de células CD14^{+} mediante selección positiva con microperlas CD14^{+}

Se trabaja sobre hielo, con soluciones previamente refrigeradas.

1.

Se determinan el número de células (313 x 10 x 5 x 10^{4} = 1.565 x 10^{8} células totales)

2.

Se retiran 100 \mul de muestra celular para análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (Fluorescence-Activated Cell-Sorting - FACS) (muestra de preselección).

3.

Se centrifuga a 1.800 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC. Se retira el sobrenadante.

4.

La pella se resuspende en 80 \mul de tampón por 1 x 10^{7} células totales (2.400 \mul/células totales).

5.

Se añaden 20 \mul de microperlas CD 14 por 1 x 10^{7} células totales (400 \mul/células totales).

6.

Se mezcla bien y se incuba durante 15 minutos a 4-8ºC.

7.

Las células se lavan con 1-2 ml de tampón y se centrifugan a 300 x g, 10 minutos a 4ºC. Se retira el sobrenadante.

8.

Se resuspenden hasta 1 x 10^{8} células en 500 \mul de tampón (1 ml/células totales).

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Separación magnética con columna LS

1.

La columna se coloca en el campo magnético del MACS® Separator y se lava con 3 ml de tampón MACS.

2.

Se introduce la suspensión celular en la columna.

3.

Se recogen las células no marcadas que atraviesan la columna. Se lava la columna con 3 x 3 ml de tampón, dejando que el depósito de la columna se vacíe entre lavado y lavado. Se recoge el efluente total (fracción celular no marcada).

4.

Se retira la columna del separador y se coloca en el tubo de recogida.

5.

Se añaden 5 ml de tampón a la columna, arrastrando inmediatamente la fracción con células marcadas magnéticamente aplicando el émbolo de columna.

6.

Se centrifugan las células en tampón MACS y la pella celular se resuspende en medio de cultivo.

7.

Se realiza el recuento celular de las células seleccionadas positivamente. 71 x 20 x 5 x 10^{4} = 7,1 x 10^{7} células/ml. Hay 1,75 ml \Box 1,24 x 10^{8} células totales.

8.

Se toma una muestra para comprobar la pureza mediante FACS - se añaden 10 \mul de anticuerpo CD14-FITC y se incuba durante 5 minutos a 4-8ºC.

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Preparación de compuestos

Se preparan compuestos 10 mM en etanol absoluto. Antes de cultivarlos en el medio, se diluyen a las concentraciones requeridas.

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Cultivo celular

Se cultivaron monocitos CD14^{+} aislados en placas de 24 pocillos a razón de 1 x 10^{6} células/ml/pocillo. Los monocitos se cultivaron en presencia de los compuestos de ensayo y de controles con diversas diluciones, tal como se muestra más abajo en la tabla. Después de la incubación durante la noche, se añadieron LPS (10 \mug/ml) e IFN_{\gamma} (100 ng/ml) para estimular la activación de monocitos y aumentar la expresión de CB2. Después de 48 horas se retiraron los sobrenadantes para el análisis de citoquinas CBA.

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Análisis de citoquinas CBA (BenderMedSystems Human Th1/Th2 Kit [Cat # BMS716FF])

Todos los tampones se llevan a temperatura ambiente y se agitan en un vórtex antes de su uso.

1.

Se prepara el tampón de ensayo añadiéndolo a 450 ml de H_{2}O destilada y mezclando con cuidado. Se guarda a 4ºC.

2.

Se prepara la mezcla del conjugado de biotina con 600 \mul de cada conjugado de biotina en un universal.

3.

Se prepara la mezcla de perlas añadiendo 300 \mul de cada grupo de perlas.

4.

Se reconstituye cada estándar con H_{2}O destilada de acuerdo con las recomendaciones de la etiqueta del vial. Se añaden 100 \mul de tampón de ensayo al tubo etiquetado Estándar 1. Se añaden 10 \mul de cada estándar reconstituido y se mezcla. Se diluye en serie la mezcla de estándares (100 \mul de tampón de ensayo a los tubos 2-7, se añaden 50 \mul del estándar 1 al tubo 2, se mezcla y se transfieren 50 \mul al tubo 3, etc.).

5.

Se etiquetan los tubos FACS y se añaden 25 \mul de los estándares 1-7 a los tubos designados. Se añaden 25 \mul de tampón de ensayo a un tubo vacío.

6.

Se añaden 25 \mul de muestra a los tubos de muestra designados.

7.

Se añaden 25 \mul de mezcla de perlas a todos los tubos.

8.

Se añaden 50 \mul de conjugado de biotina a todos los tubos.

9.

Se mezcla por agitación en vortex, después se cubre con lámina y se incuba durante 2 horas a TA.

10.

Se prepara una solución de estreptavidina-PE mezclando 176 \mul en 5.324 \mul de tampón de ensayo. Se añade 1 ml de tampón de ensayo a todos los tubos y éstos se centrifugan a 200 x g durante 5 minutos. Se retira el sobrenadante. Se repite el paso de lavado y se retira el sobrenadante.

11.

Se añaden 50 \mul de estreptavidina-PE a todos los tubos. Se mezcla mediante agitación en vortex, después se cubre con lámina y se incuba durante 1 hora a TA.

12.

Se repite el paso de lavado x2.

13.

Se añaden 500 \mul de tampón de ensayo a todos los tubos.

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Configuración del citómetro de flujo

Se procesan perlas positivas y negativas (suministradas con el kit) para optimizar la configuración y determinar la compensación, etc. Se procesa la curva estándar antes de las muestras, contando 3.000 eventos sobre una población control (300 eventos/analito).

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Resultados

Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 6. En las figuras, la etiqueta RU348 se refiere al Isómero D.

Como se puede observar en las Figuras 1 a 6, los dos isómeros de cis-dihidrotetrabenazina B y D reducen la producción de una serie de citoquinas diferentes en monocitos que han sido estimulados mediante LPS/IFN.

El Isómero B redujo la producción de las citoquinas IL-2 e IL-12 en todas las concentraciones ensayadas y redujo la producción de las citoquinas IL-4, IL-5 e IL-10 en la mayoría de las concentraciones ensayadas.

El Isómero D redujo la producción de las citoquinas IL-2, IL-4, IL-5 e IL-12 en todas las concentraciones ensayadas y redujo la producción de las citoquinas TNFa, IL-4, IL-5 e IL-10 en la mayoría de las concentraciones ensayadas.

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Ejemplo 7 Determinación del efecto de los compuestos de la invención en la proliferación de células T

Los compuestos de la invención se analizaron para determinar en qué medida podían inhibir la proliferación de células T. Las células T son responsables de la coordinación de la respuesta inmune adaptativa y promueven inflamaciones en una amplia gama de enfermedades. Por consiguiente, la actividad de los compuestos de la invención contra la proliferación de células T es un buen indicador de la probabilidad de que los compuestos tengan actividad antiinflamatoria.

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Materiales

Tampón HBSS + 2% HEPES (500 ml + 10 ml), Alpha MEM (500 ml) + 2% HEPES (10 ml) + 1% Pen/strep (5 ml) + 2% L-glutamina (10 ml) + 2-ME 50 \muM (500 \mul) y suero de ratón normal (NMS).

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Métodos

1.

Se revisten 3 x placas de 96 pocillos columnas 1-8, filas A-H con 100 \mul CD3 antirratón a 1 \mug/ml en PBS. Son 192 pocillos en total, por consiguiente se preparan 24 ml en PBS añadiendo 17 \mul de stock a 1,44 mg/ml. Se incuba durante 2 horas a 37ºC.

2.

Se reúne sangre de 2 ratones balb/c después de punción cardíaca para la preparación de NMS y se retiran los bazos en HBSS + Hepes.

3.

La sangre se lleva a 37ºC durante 30 minutos para que se coagule, se centrifuga a 3.000 r.p.m. en Chilspin. Se retira el suero, se esteriliza por filtración y se mantiene en el refrigerador hasta su uso.

4.

Los bazos se trasladan a placas Petri conteniendo 10 ml de HBSS. Se utiliza una tela metálica estéril y limpia dispuesta sobre el bazo para liberar células utilizando una varilla de vidrio. Las células se separan de la tela metálica por lavado utilizando una pipeta Pasteur y se transfieren a un tubo de 15 ml. Se centrifugan a 1.000 r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA).

5.

Se resuspenden las células, se añaden 0,5 ml de agua desionizada estéril para lisar RBC, se mezclan e inmediatamente se diluyen en HBSS, se transfieren a un tubo de 50 ml pasando a través del filtro celular (70 \muM) para eliminar residuos, se centrifugan como se indica más arriba, las células se lavan otra vez en HBSS y finalmente se resuspenden en 2 ml de Alpha MEM con contenido en suplementos (como se indica más arriba).

6.

Recuentos celulares: 252 células x 2 x 5 x 10^{4} = 2,52 x 10^{7} células/ml en 4 ml = 10^{8} células en total. Se diluyen 2 ml a 25 ml para obtener una concentración celular de 2 x 10^{6} células/ml.

7.

Se añaden 250 \mul de NMS para obtener una concentración de un 1%.

8.

Se lavan unas placas revestidas con anti-CD3 con 3 x PBS.

9.

Se transfieren alícuotas de 100 \mul de células a los pocillos revestidos, filas A-H, columnas 1-8, de 3 x placas de 96 pocillos. Se añade un volumen igual de los compuestos diluidos en una placa de 96 pocillos tal como se muestra más abajo.

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Compuestos

Se transfieren 3,5 \mul del compuesto 10 mM a 346,5 \mul de medio (1/100). Después se transfieren 35 \mul de dilución 1/100 a 315 \mul de medio (10) y así sucesivamente bajando por la placa para obtener diluciones 1/10 en serie del compuesto. Se transfieren alícuotas de 100 \mul de diferentes diluciones del compuesto a los pocillos de placas triplicadas que contienen células T.

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44

Se cultiva durante 48 horas, después se añade una gota (16 \mul) de ^{3}H-timidina a cada pocillo y se cultiva a lo largo de la noche a 37ºC, 5% CO_{2}. Se recolecta. Se mide la incorporación de ^{3}H-timidina.

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Resultados

Los datos expuestos en la siguiente tabla demuestran la magnitud de la proliferación de células T, como demuestran los niveles de incorporación de ^{3}H-timidina.

46

47

En la tabla, "Nab" se refiere a Nabilona, "RU346" se refiere al Isómero D y "RU350" se refiere al Isómero B.

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Los resultados demuestran que cada uno de los compuestos en las concentraciones más altas ensayadas inhibe la proliferación de las células T.

Ejemplo 8 Composiciones farmacéuticas (i) Formulación de tabletas - I

Se prepara una composición de tabletas que contiene la dihidrotetrabenazina de la invención mezclando 50 mg de la dihidrotetrabenazina con 197 mg de lactosa (BP) como diluyente y 3 mg de estearato de magnesio como lubricante, y comprimiendo la mezcla para formar una tableta de modo conocido.

(ii) Formulación de tabletas - II

Se prepara una composición de tabletas que contiene la dihidrotetrabenazina de la invención mezclando el compuesto (25 mg) con óxido de hierro, lactosa, estearato de magnesio, almidón de maíz blanco y talco, y comprimiendo la mezcla para formar una tableta de modo conocido.

(iii) Formulación de cápsulas

Se prepara una formulación para cápsulas mezclando 100 mg de la dihidrotetrabenazina de la invención con 100 mg de lactosa y rellenando la mezcla resultante en cápsulas de gelatina dura opacas estándar.

Equivalentes: Es evidente que se pueden realizar numerosas modificaciones y alteraciones a las realizaciones específicas de la invención arriba descritas sin salirse de los principios que sirven de base a la invención.

Claims (10)

1. Compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina de fórmula (Ia):

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para ser utilizado en la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

2. Compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina para su utilización según la reivindicación 1, en el que la enfermedad inflamatoria forma parte del grupo consistente en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis traumática, artritis gotosa, artritis por rubéola, artritis psoriásica y otros estados artríticos; enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, como la reacción inflamatoria inducida por endotoxina o la enfermedad inflamatoria intestinal; síndrome de Reiter, gota, espondilitis reumatoide, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

3. Compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina para su utilización según la reivindicación 2, en el que la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.

4. Compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la 3,11-cis-dihidrotetrabenazina se presenta en forma de una sal de adición de ácido.

5. Compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina para su utilización según la reivindicación 4, en el que la sal es una sal metanosulfonato.

6. Utilización de un compuesto de 3,11-cis-dihidrotetrabenazina de fórmula (Ia):

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o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la producción de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que la enfermedad inflamatoria forma parte del grupo consistente en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis traumática, artritis gotosa, artritis por rubéola, artritis psoriásica y otros estados artríticos; enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, como la reacción inflamatoria inducida por endotoxina o la enfermedad inflamatoria intestinal; síndrome de Reiter, gota, espondilitis reumatoide, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.

9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que la 3,11-cis-dihidrotetrabenazina se presenta en forma de una sal de adición de ácido.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que la sal es una sal metanosulfonato.