RS50720B - 3,11 b-cis-dihidrotetrabenazin za lečenje proliferativne bolesti ili inflamacije - Google Patents

Abstract

Jedinjenje 3,1 lb-m-dihidrotetrabenazina formule (Ia):ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za profilaksu ili lečenje inflamatorne bolesti.Prijava sadrži još 9 patentnih zahteva.

Description

3,11 B-CIS-

DIHIDROTETRABENAZIN ZA LECENJE

PROLIFERATIVNE BOLESTI ILI

INFLAMACIJE

Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu dihidrotetrabenazina u profilaksi ili lečenju inflamatornih bolesti i kancera.

Stanje tehnike

Sigma receptori su receptori koji se nalaze na površini ćelija koji su svojevremeno smatrani podvrstom opijatnih receptora, ali je posle karakterizacije receptora i otkrića specifičnih liganada za receptore, pokazano da se razlikuju od opijatnih receptora (videti Bourrie et al, Current Opinion in Investigational Drugs, 5(11): 1158-63) (2004)).

Sigma receptori se mogu klasifikovati na sigma-1 (a-1) i sigma-2 (c-2) podvrste, o-l receptor, za koji se veruje da sadrži 223 amino kiseline, je kloniran (Hanner et al, Proc. Natl Acad. Set USA, (1996) 93:8072-8077) i nađeno je da ne pokazuje homologiju primarne sekvence sa bilo kojim drugim klasama eceptora. Međutim, ima 30.3% identičnu sekvencu sa fungalnom sterol C8-C7 izomerazom i takođeje nađeno daje sličan drugom proteinu nepoznate funkcije, SRBP2 (SR-31747 vezujući-protein 2), koji deli visoku homologiju sa ovim enzimom. o-2 receptor još nije kloniran.

Objavljeno je da ligandi sigma receptora imaju anti-inflamatornu aktivnost. Na primer, Bourrie et al, Eur. J. Pharmacol, (2002), 456(1-3): 123-31 je objavio da Sanofi-Svnthelabo Recherche jedinjenje SSR125329A (hemijsko ime [(Z)-3-(4-adamantan-2-il-3,5-đihlor-fenil)-allil]-cikloheksil-etilamin) je visoko afinitativni sigma receptor ligand sa snažnim anti-inflamatornim osobinama. Bourrie et al, je zaključio da rezultati njihovih ispitivanja daju suštinski dokaz da sigma receptor ligandi mogu da predstave novi efikasan pristup lečenju reumatoidnog artritisa.

Drugi Sanofijev sigma receptor antagonist (SR31747) je trentuno u postupku kliničkog ispitivanja za lečenje reumatoidnog artritisa.

Tetrabenazin (hemijski naziv: 1, 3, 4,6,7,1 lb-heksahidro-9,10-dimetoksi-3-(2-metilpropil)-2H-benzo(a)hinazolizin-2-on) je bio u upotrebi kao farmaceutski lek od kasnih 1950-ih godina. Prvobitno razvijen kao anti-psihotik, tetrabenazin se trenutno koristi u simptomatičkom lečenju hiperkinetičkih poremećaja, kao što je Huntington'ova bolest, hemibalizam, senilna korea, tik, tardivna diskinezija i Tourette'ov sindrom, videti na primer Jankovic et ah, Am. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156(8): 1279-81 i Jankovic et al, Neurology (1997) Feb; 48(2):358-62.

Hemijska struktura tetrabenazina je prikazana na slici 1 u daljem tekstu.

Jedinjenje ima hioralnc centre na 3 i 1 lb atomima ugljenika i tako može, teorijski, da postoji ukupno u četiri izomerna o blika, kao stoje dato na slici 2.

Na Slici 2, stereohemija za svaki izomer je definisan "R i S" nomenklaturom koju su razvili Cahn, Ingold i Prelog, videti Advanced Organic Chemistrv, Jerry March, 4th Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, strane 109-114. Na slici 2 i u tekstu patentne prijave, oznake "R" ili "S" su date po redosledu položaja atoma ugljenika. Tako, na primer, RS je skraćenica za 3R,1 lbS. Slično, kada su prisutna tri hiralna centra, kao u dihidrotetrabenazinima opisanim u daljem tekstu, oznake "R" ili "S" su navedene po redosledu atoma ugljenika 2, 3 i 1 lb. Tako, 2S,3R,1 lbR izomer je ukratko označen kao SRR itd.

Komercijalno dostupan tetrabenazin je raccmska smeša RR i SS izomera i sledi da su RR i SS izomeri (u daljem tekstu naznačeni posebno ili zajedno trans-tetrabenazin zato što atomi vodonika na položajima 3 i 1 lb imaju relativnu trans orijentaciju) termodinamički najstabilniji izomeri.

Tetrabenazin ima donekle salbu i varijabilnu bioraspoloživost. Produženo je metabolisan metabolizmom prvog prolaza, i neizmenjen ili malo izmenjen tetrabenazin se obično detektuje u urinu. Glavni metabolit je dihidrotetrabenazin (hemijski naziv: 2-hidroksi-3-(2-metilpropil)-l,3,4,6,7,l lb-heksahidro-9,10- dimetoksi-benzo(a)hinazolizin) koji je nastao redukcijom 2-keto grupe u tetrabenazin, i pretpostavlja se daje primarno odgovoran za aktivnost leka (videti Mehvar et al., Drug Metab.Disp, 15, 250-255 (1987) i J. Pharm. Sci., 16, No.6, 461-465 (1987)).

Prethodno je identifikovano i okarakterisano četiri izomera dihidrotetrabenazina, koji su izvedeni od stabilnijih RR i SS izomera osnovnog tetrabenazina i imaju trans relativnu orijentaciju između atoma na položajima 3 i 1 lb (videti Kilbourn et al, Chiralitv, 9:59-62 (1997) i Brossi et al, Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, ppl793-1806 (1958). Četiri izomera su (+)-a-dihidrotetrabenazin, (-)-a-dihidrotetrabenazin, (+)-(3-dihidrotetrabenazin i (-)-P-dihidrotetrabenazin. Smatra se da su strukture četiri poznata izomera dihidrotetrabenazina kao što je dato na slici 3.

Kilbourn et al.,(videti Eur. J. Pharmacol., 278:249-252 (1995) i Med. Chem. Res., 5:113-126 (1994)) su ispitivali specifično vezivanje individualnih radioaktivno-obeleženih izomera dihidrotetrabenazina u mozgu pacova koji su pri svesti. Našli su daje (+)-<x-[11 CJdihidrotctrabcnazin (2R,3R,1 lbR) izomer akumuliran u delovima mozga povezan sa visokim koncentracijama neuronskih membranskih dopamin transportera (DAT) i vezikularnim transporterima monoamina (VMAT2). Međutim, u osnovi neaktivan izomer (-)-a-[l lCJdihidrotetrabenazina je skoro uniformno distribuiran u mozgu, što ukazuje na to da nije došlo do specifičnog vezivanja za DAT i VMAT2. In vivo ispitivanja povezana sa in vitro ispitivanjima pokazala su da izomer (+)-a-[l lCJdihidrotetrabenazina ima Ki [3H]metoksitetrabenazina >2000-puta veću od Ki izomera (-)-a-[1 lCJdihidrotetrabenazina.

Naša prethodna međunarodna patentna prijava br. PCT/GB2005/000464 opisuje dobijanje i terapeutsku upotrebu izomera (3,1 lb-cis)-dihidrotetrabenazina gde su atomi vodonika na položajima 3 i 1 lb u relativnoj cis orijentaciji.

Postoje četiri moguća izomera dihidrotetrabenazina sa 3,1 lb-cis konfiguracijom i to su 2S,3S,1 lBr izomer, 2R,3R,1 lbS izomer, 2R,3S,1 lbR izomer i 2S,3R,1 lbS izomer koji imaju sledeće strukture: (a) 2S,3S,1 lbR izomer3,1 lb- cisdihidrottetrabenazina formule (Ia) (b) 2R,3R, 112bS izomer 3,11b- cisdihidrottetrabenazina formule (lb) (c) 2R,3E,1 lbR izomer3,1 lb- cisdihidrottetrabenazina formule (Ic) (d) 2S,3R,1 lbS izomer3,1 lb- cisdihidrottetrabenazina formule (Id)

PCT/GB2005/00464 sadrži eksperimentalne podatke koji pokazuju da izomeri se cis-dihidrotetrabenazina vezuju za sigma-1 i sigma-2 receptore ali ne opisuje bilo kakvu terapeutsku upotrebu sigma receptor vezujuće aktivnosti.

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu cis-dihidrotetrabenazina opisanog u ranijoj prijavi br. PCT/GB2005/000464 za lečenje inflamatornih bolesti i kancera.

Shodno tome, u prvom apsketu, pronalazak obezbeđuje jedinjenje 3, 1\ h- cis-dihidrotetrabenazin formule (Ia)

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu u profilaksi ili lečenju inflamatorne bolesti.

Pronalazak takođe obuhvata upotrebu jedinjenja formule (Ia) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli kao što je prethodno definisano za proizvodnju leka za profilaksu ili lečenje inflamatorne bolesti.

Jedinjenje formule (Ia) je ovde označen kao Izomer B.

Primeri inflamatornih bolesti i stanja su, ali nisu ograničena na, reumatoidni artritis, osteoartritis, traumatski artritis, gihtni artritis, artritis izazvan rubelom, psorijazni artritis, i druga artitisna stanja; akutni ili hronična stanja inflamatorne bolesti kao što su inflamatorne reakcije idnukovane endotoksinom i inflamatorna bolest creva; Reiter'ov sindrom, giht, reumatoidni spondilitis, hronična pulmonarna inflamatorna bolest, Crohn'ova bolest i ulcerativni kolitis.

Posebne inflamatorne bolesti i stanja su ona koja su senzitivna na sigma receptor ligande, na primer, sigma receptor antagonisti.

Jedna posebna inflaatorna bolesti je reumatoidni artritis.

3,11 b-c/s-dihidrotetrabenazin upotrebljen u pronalasku može biti u čistom obliku, na primer izomerne čistoće veće od 90%, obično veće od 95% a još bolje veće od 98%.

Izraz "izomerna čistoća " u trenutnom kontekstu odnosi se na količinu 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazina prisutnog u odnosu na ukupnu količinu ili koncentraciju dihidrotetrabenazina svih izmoernih oblika. Na primer, ako 90% ukupnog dihidrotetrabenazina prisutnog u kompoziciji je 3,1 lb-c/s-dihidrotetrabenazin, onda jeizomema čistoća 90%. 1 lb-cis-dihidrotetrabenazin upotrebljen u pronalasku može da bude u obliku kompozicije koja u suštini ne sadrži 3,1 lb-/ra«5-dihidrotetrabenazin, poželjnoo sadrži manje od 5% 3,1 lb-rran^-dihidrotetrabenazina, još bolje ako sadrži manje od 3% 3,1 lb-/ra/zs-dihidrotetrabenazina, a najbollje ako sadrži manje od 1%3,1 Ib- trans-dihidrotetrabenazina.

Izraz"3,l lb- cis-"kao što je ovde upotreblljen označva da su atomi vodonika na položajima 3-i 1 lb- strukture dihidrotetrabenazina ucisrelativnoj orijentaciji.

Jedinjenje formula (la) (Izomer B) može da bude prisutno u suštinski enantiomerno čistom obliku ili kao smeša sa drugim enantiomerima 3,11b- cis-dihidrotetrabenazina.

Izrazi "enantiomerna čistoća " i "enantiomerno čist" u trenutnom kontekstu odnosi se na količinu prisutnog Izomera B u odnosu na iukupnu količinu ili koncentraciju dihidrotetrabenazina svih enantiomernih i izomernih oblika. Na primer, ako 90% ukupnog dihidrotetrabenazina prisutnog u kompoziciji je u obliku Izomera B, ona je enantiomerna čistoća 90%.

Kao na primer, ui svakom spektu i realizaciji pronalaska, Izomer B može da bude prisutan u enantiomemoj čistoći od najamnje 55% (npr. najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 100%).

Izomer pronalaska takođe može da bude prisutan u obliku smeše Izomera B i jednog ili više Izomera A, C i D. Ove smeše mogu da budu racemske smeše i ne-racemske smeše. Primeri racemskih smeša uključuju racemsku smešu Izomera A i Izomera B.

Farmaceutski prihvatljive soli

Osim ako kontekst drugačije nalaže, reference u predmetnoj prijavi na jedinjenje formule (Ia) ili Izomer B obuhvata ne samo slobodne baze jedinjenja već i njihove soli, i posebno adicione soli kiselina.

Naznačene kiseline koje formiraju adicione soli su kiseline koje imaju pKa vrednosti manje od 3.5 i češće manje od 3. na primer, adicione soli kiselina mogu se dobiti od kiselina sa pKa u opsegu od +3.5 to -3:5.

Poželjne soli adicionih kiselina su one đobijene sa sulfonskim kiselinama kao što je metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, benzen sulfonska kiselina, toluen sulfonska kiselina, kamfor sulfonska kiselina i naftalen sulfonska kiselina.

Posebno preferenta kiselina od koje se mogu dobiti adicione soli je metansulfonska kiselina.

Soli adicionih kiselina mogu se dobiti prema ovde opisanim postupcima ili uobičajenim hemijskim postupcima kao što je opisano uFarmaceutske Salts: Properties, Selection, and Use,P. Heinrich Stahl (Editor), Čamile G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 strane, August 2002. Generalno, ove soli mogus e dobiti reakcijom oblika slobodne baze jedinjenja sa odgovarajućom bazom ili kiselinom u vodi ili organskom rastvaraču ili u smeši ova dva; generalno, upotrebljava se nevodeni medijum kao što je etar, etil acetate, etanol, izopropanol, ili acetonitril.

Soli su obično farmaceutski prihvatljive soli. Međutim,soli koje nisu farmaceutski prihvatljive se takođe mogu pripremiti kao intermedijerni oblici koji se zatim mogu konvertovati u farmaceutski prihvatljive soli. Ove nefarmaceutski prihvatljive soli su takođe obuvhaćene pronalaskom.

Postupci za dobijanje izomera dihidrotetrabenazina

U ovom delu, opisani su postupci za dobijanje sva četiri izomera3,1 Ib- cis-dihidrotetrabenazina, mada se pronalazak odnosi na terapeutski primenu jedinjenja formula (Ia) (Izomer B).

3,1 lb-cw-dihidrotetrabenazini mogu se dobiti prema postupkom koji obuhvata reakciju jedinjenja formule (II):

sa reagensom ili reagensimakoji su pogodni za hidrataciju 2,3-dvostruke veze ujedinjenju formule (II) i zatim razdvajanjem i izolovanje željeno izomernog oblika dihidrotetrabenazina.

Hidratacija 2,3-dvostruke veze može se izvesti hidroboracjom pomoću borana reagensa kao što je diboran ili boran-etar (npr.. boran-tetrahidrofuran (THF)) dajući intermedijer alkil boran adukst nakon čega sledi oksidacija adukta alkil borana i hidroliza u prisustvu baze. Hdroboracija se obično izvodi u suvom polarnom nc-protičnom rastvaraču kao što je etar (npr. THF), obično ne na povišenoj tempraturia, na primer sobnoj temperaturi. Adukt borane-alken se obično oksiduje agensom za oskidaciju kao što je vodonik peroksid u prisustvu baze koja obezbeđuje izvod hidroksidnih jona, kao što je, amonijum hidroksid ili hidroksid alkalnog metala, npr. kalijum hidroksid ili natrijum hidroksid. Sekvenca reakcija hidroboracija-oksidacija-hidroliza Procesa A obično daje izomere dihidrotetrabenazina gde su atomi vodonika na položajima 2-i 3-i imajutransrelativnu orihentaciju.

Jedinjenja formule (II) mogu se pripremiti redukcijom tetrabenazina dajući dihidrotetrabenazin, nakon čega sledi dehidratacija dihidrotetrabenazina. Redukcija tetrabenazina može se izvesti pomoću aluminijum hidndnog reagensa kao stoje litijum alumininijum hidrid, ili borhidridni reagens, kao što je natrijum borhidrid, kalijum borhidrid ili borhidridni derivat, na primer alkil borohidrid kao što je litijum\ x\- sek- b\ xi\\borhidrid. Alternativno,redukcioni korak se može izvesti katalitičkom hidrogenizacijom, na primer, pomoću Raney-evog nikla ili platina oksid katalizatora. Pogodni uslovi za izvođenje redukcionog koraka su detaljnije opisani u daljem tekstu ili se mogu naći u US 2,843,591 (Hoffmann-La Roche) i Brossi et al.,Helv. Chim. Acta.,vol. XLI, No. 193, ppl793-1806(1958).

Budući da tetrabenazin upotrebljen kao polazni materijal za reakciju redukcije je tipično smeša RR i SS izomera (tj. trans-tetrabenazin), dihidrotetrabenazin dobijen u koraku redukcije će imati istu trans konfiguraaciji oko položaja 3-i libi uzeće oblik jednog ili višep oznatih izomera dihidrotetrabenazina prikazanih na slici 3. Tako Proces A može da obuhvati trans izomere dihidrotetrabenazina, njihovu dehidrataciju pri čemu se dobija alken (II) i zatim "rehidracija" alkena (II) pod uslovima koji daju tražene izomere cis dihidrotetrabenazina.

Dehidraticija dihidrotetrabenazina do alkena (II) može se izvesti pod različitim standardnim uslovima za dehidratciju alkohola za dobijanje alkena, videti na primer J. March( idem)strane 389-390 i tamo navedene referenceme. Primeri datih uslova uključuju primenu agenasa za dehidrataciju baziranog na fosforu kao štosu fosfor halidi ili fosfor oksihalidi, npr, POCl3i PCI5. Kao alternativa direktnoj dehidrataciji, hidroksilna grupa dihidrotetrabenazina semože konvertovati u odlazeću grupu L kao što je halogen (npr. hlorin ili bromin) i zatim izložiti uslvima (npr.prisustvu baze) za eliminaciju H-L. konverzija hidroksilne grupe u halid može se postići prema postupcima koji su poznati iskusnom hemičaru, na primer reakcijom sa ugljentetrahloridom ili ugljentetrabromidom u prisustvu trialkil ili triaril fosfina kaošto je trifenil fosfin ili tributil fosfin.

Tetrabenazin upotrebljen kao plazni materijal za redukciju za dobijanje dihidrotetrabenazina može se komercijalno nabaviti ili se može sintetisati prema postupku opisanom u US 2,830,993 (Hoffmann-La Roche).

Sledeći proces (Proces B) za dobijanje jedinejnja 3,1 lb-c/s-dihidrotetrabenazina obuhvata izlaganje jedinjenja formule (III):

uslovima za otvaranje prstena 2,3-epoksidne grupe ujedinjenju formule (III), i zatim po potrebi razdvajanje i izolovanje željenog izomernog oblika dihidrotetrabenazina.

Otvaranje prstena može se izvesti u skladu sapoznatim metodama za otvaranje epoksidnih prstenova. Međutim, trenutno preferentan metod ua otvaranje epoksidnog prstena koji se može postući reduktivnim otvaranjem prstea upotrebom redukcionog agensa kao što je boran-THF. Reakcija sa boran-THF-om može se izvesti u polarnom neprotičnom rastvaraču kao što je etar (npr. tetrahidrofuran) obično na temperaturi ambijenta, ovako dobijen kompleks borana je naknadno hidrolizo van zagrevanjem u prisustvu vode i baze na temperaturi relukovanja rastvarača. Proces B obično daje prednost izmoerima dihidrotetrabenazina u kojima atomi vodonika na položajima 2- i 3- imaju cis relativnu orijantaciju.

Epoksidna jedinjenja formule (III) mogu se dobiti epoksidacijom alkena prethodno date formule (II). Reakcija epoksidacije može se izvesti pod sulvima i sa reagensima koji su pozanti prosečnom hemičaru, videti na primer J. March( idem),strane 826-829 i tamo navedene reference. Tipično, per-kiselina kao što je meta-hlorperbenzojeva kiselina (MCPBA), ili smeša per-kiseline i agensa za oskidaciju kao što je perhlorna kiselina, mogu se upotrebiti za reakciju epoksidacije.

Kada polazni materijali za prethodno date procese A i B su smeše enantiomera, onda će proizvodi procesa tipično biti parovi enantiomera, na primer racemske smeše, moguće zajedno sa dijastereoizomernim nečistoćama. Neželjni đijastereoizomeri mogu se ukloniti tehnikama kaošto je hromatogradija (npr. HPLC) i individualni enantiomeri se mogu razdvojiti različitim metodama poznatim prosečnom hemičaru , na primer , mogu se razdvojiti:

(i) hiralnom hromatografijom (hromatografija na hiralnoj podlozi); ili

(ii) formiranjem soli sa optički čistom hiralnom kiselinom, razdvajanjem soli dva dijastereoizomera frakcionom kristalizacijom i zatim oslobađanjem dihidrotetrabenazina iz soli; ili (iii) formiranjem derivata (kao što je estar) sa optički čistim hiralnim agensom za derivatizaciju(npr. Agens za esterifikaciju), razdvajanjem dobijenih epimera (npr. hromatografijom) i zatim konvertovanjem derivata u dihidrotetrabenazin.

Jedan postupak razdvajanja para enantiomera dobijenih svakim od Procesa A i B, i za koji je nađeno daje posebno efikasan, je esterifikovati hidroksilnu grupu dihidrotetrabenazina sa optički aktivnim oblikom Mosher'ove kiseline, kao što je R (+) izomer prikazan u daljem tekstu, ili nejgov aktivni oblik:

Dobijeni estri dva enantiomera dihidrobenazina se zatim mogu razdvojiti hromatografski (npr. HPLC) i odvojeni estri hidrolizovani dajući individualne izomere dihidrobenazina pomoću baze kao što je hidroksid alkalnog metala (npr. NaOH) u polarnom rastvaraču kao što je metanol.

Kao alternativa za upotrebu smeša enantiomera kao polaznih materijala u procesima A i B i zatim izvođenje razdvajanja enantiomera, procesi A i B se mogu izvesti na individualnim enantiomerima kao polaznim materijalima dajući tako proizvode u kojima dominisra jedan enantiomer. Pojedinačni enantiomeri alkena (II) mogu se dobiti podvrgavanjem RR/SS tetrabenazina stereoselektivnoj redukciji pomoću litijumtri- sek-butil borhidrida dajući tako smešu SRR i RSS enantiomera dihidrotetrabenazina, razdvajanje enantiomera (npr.frakcionom kristalizacijom) i zatim dehidratacija razdvojenih pojedinačnih enantiomera dihidrotetrabenazina pri čemu se dobija pretežno ili isključivo pojedinačan enantiomer jedinjenja formule (II).

Procesi A i B su detaljnije oilustrovani u Shemama 1 i 2 datim u daljem tekstu.

Shema 1 ilustruje dobijanje individualnih izomera dihidrotetrabenazina sa konfiguracijama 2S,3S,1 lbR i 2R,3R,1 lbS gde atomi vodinika vezani za položaje 2-i 3-namešteni se nalaze u trans relativnoj orijentaciji. Ova reakciona shema uključuje prethodno definisan Proces A.

Poazna tačka za redosled reakcija u Shemi 1 je komercijalno dostupan tetrabenazin (IV) koji je racemska smeša RR i SS optičkih izomera tetrabenazina. U svakom od RR i SS izomera, atomi vodonika na položajima 3-i 1 lb-zauzeli su trans relativnu orijentaciju. Kao alternativa upotrebi komercijalno dostupnog jedinjenja, tetrabenazin se mo\e sintetisati prema proceduri opisanoj u US patentu broj 2,830,993 (videti primer 11).

Racemska smeša RR i SS tetrabenazina je redukovana pomoću borohidrid redukujućeg agensa litijum tri-seA'-butil borohidrid(" L- Selectride")dajući smešu poznatih 2S,3R,1 lbR i 2R,3S,1 lbS izomera (V) dihidrotetrabenazina, od kojih jcprikazan samo izomer 2S,3R,1 lbR iz prakitčnih razloga. Upotrebom sterno zahtevnijegL- Selectridakao stoje borhidridni redukujući agens pre nego natrijum borhidrid, formiranje R.RR i SSS izomera dihidrotetrabenazina je minimizirano ili potisnuto.

Izomeri dihidrotetrabenazina (V) reaguju sadehidratacionim agensom kao što je fosfor pentahlorid u neprotičnom rastvaraču kao što je hlorisan ugljovodonik (na primer hloroform dihlormetan, poželjno dihlormetan) pri čemu se dobija nezasićeno jedinjenje (II) kao par enantiomera, pri čemu je u Shemi 1 prikazan samo R-enantiomer. Reakcija dehidratacije se obično izvosi na temperaturi nižoj od sobne temperature, na primer na oko 0-5°C.

Nezasićeno jedinjenje (II) je zatim podvrgnuto a stereoselektivnoj re-hidrataciji za dobijanje dihidrotetrabenazina (VI) i njegovog lika u ogledalu ili antipoda (nije prikazan ) gde se atomi vodonika na položajima 3-i 11b- nalaze u cis relativnoj orijentaciji i atomi vodonika na položajima 2-i 3- se nalaze u trans relativnoj orijentaciji. Stereoselektivna rehidratacija je postignuta procedurom hidroboracije upotrebom boran-THF u tetrahidrofuranu (THF) dajući intennedijerni kompleks borana (nije prikazan) koji je zatim oksidovan vodonik peroksidom u prisustvu baze kao što je natrijum hidroksid.

Može se zatim izvesti početni korak prečišćavanja (npr. HPLC-om) dajući proizvod (V) reakcije rehidratacije kao smešu 2S,3S,1 lbR i 2R,3R,1 lbS izomera od kojih jeprikazan samo 2S,3S,1 lbR izomer u Shemi. Da bi se razdvojili izomeri, smeša je tretirana sa R (+) Mosher'ovom kiselinom, u prisustvu oksalil hlorida i dimetilaminopiridina (DMAP) u dihlorometanu dajući par dijastereoizomernih estara (VII)

(od kojih je prikazan samo jedan dijastereoizomer) koji se zatim može razdvojiti HPLC-om. Individualni estri se mogu hidrloizovati pomoću hidroksida alkalnog metala kao što je natrijum hidroksid dajući tako jedan izomer (VI).

U varijacijama redosleda koraka prikazanim u Shemi 1, posle redukcije RR/SS tetrabenazina, dobijena smeša enantiomera dihidrotetrabenazina (V) može se razdvojiti dajući individualne enantiomere. Razdvajanje s emože izvesti formiranjem soli sa hiralnom kiselinom kao što je (+) ili (-) kamfor sulfonska acid, razdvajanjem dobijenih dijastereoizomera frakcionom kristalizacijom dajući so pojedinačnog enantiomera i zatim oslobađanjem slobodne baze iz soli.

Razdvojeni enantiomer dihidrotetrabenazina može se dehidratisati dajući pojedinačan enantiomer od alkena (II). Naknadnom rehidratacijom alkena (II) dobija se pretežno ili isključivo pojednačan enantiomer cis-dihidrotetrabenazina (VIPrednost ovih varijacija je u tome što ne uključuje stvaranje estara Mosher'ove kiseline i tako nema potrebe za hrmoatografskim razdvajanjem koje se obično koristi za razdvajanje estara Mosher'ove kiseline.

Shema 2 ilustruje dobijanje individualnih izomera dihidrotetrabenazina sa 2R,3S,1 lbR i 2S,3R,1 lbS konfiguracijama u kojima su atomi vodonika vezani za položaje 2- i 3-nalaze u cis relativnoj orijentaciji. Ova reakciona shema uključuje porethodno defmisan Process B.

U Shemi 2, nezasićeno jedinjenje (II) je dobijeno redukcijom tetrabenazina dajući 2S,3R, 11 bR i 2R,3S,llbS izomere (V) dihidrotetrabenazina i dehidratacijom sa PC15 na način opisan u prethodnoj Shemi 1. Međutim, umesto izlaganja jedinjenja (II) hidroboraciji, 2,3-dvostruka veza je konvertovanau epoksid reakcijom sa meta-hloroperbenzojevom kiselinom (MCPBA) i perhlornom kiselinom. Reakcija epoksidacije se obično odvija u alkoholnom rastvaraču kao što je metanol, obično oko sobne temperature.

Epoksid (VII) je zatim podvrgnut reduktivnom otvaranju prstena pomoću boran-THF -a kao elektrofilnog redukujućeg agensa dajući intermedijerni kompleks borana (nije prikazan) koji je zatim oksidovan i rascepan vodonik peroksidom u prisustu alkalija kao što je natrijum hidroksid dajući dihidrotetrabenazin (VIII) kao smešu 2R,3S, 1 lbR i 2S,3R,1 lbS izomera, od kojih samo je prikazan 2R,3S,1 lbR , iz praktičnih razloga. Tretiranje smeše izomera (VIII), R (+) Mosher'ovom kiselinom u prisustvu oksalil hlorida i dimethilaminopiridine (DMAP) u dihlormetanu daje par epimernih esatera (IX) (prikazan samo jedan epimer) koji se mogu hromatografski razdvojiti i hidrolizovati natrijum hidroksidom u metanolu na način kao što je prethodno opisano u Shemi 1.

Biološka aktivnost

Četiri izomera cis-dihidrotetrabenazina vezano je za sigma-1 i sigma-2 receptore, kao što je ilustrovanou u primerima u daljem tekstu. Četiri izomera su približno eqkvipotentni kao ligandi za sigma-2, ali izmoeri B i D se jače vezuju za sigma-1 receptor nego izomeri A i C.

Razmatrano je da će izomeri cis-dihidrotetrabenazina izomers biti aktivni kao anti-inflamatorni agensi. Antiinflamatorne aktivnosti jedinjenja mogus e testirati različitim metodama koji su dobro poznati za prosečnog stručnjaka.

Sposobnost jedienjnja da leci artiris može se demonstrirati na jedan ili više od sledećih testova (proba) i modela: (i) Model mišijeg kolagen-indukovanog arhritisa kao što je opisnao u Kakimoto et al.,Cell Immunol.142: 326-337, 1992. (ii) Model kolagen-indukovanog arhritisa kod pacova kao što je opisano u Knoerzer et al.,Toxicol. Pathol.25:13-19, 1997. (iii) Model adjuvansgnog artitirisa kod pacova kao što je opisano u Halloran et al.,Artritis Rheum.39: 810-819, 1996. (iv) Model artritisa indukovanog ćelijskim zidom streptokoka( SCW- induced arthtitis)kod pacova kao što je opisano u Schimmer, et al.,J. Immunol.160: 1466-1477, 1998. (v) Model SCID-mišijeg humanog reumatoidnog artritisa kao što je opsao Oppenheimer-Marks et al, J. Clin. Invest.101: 1261-1272, 1998.

Sposobnot jedinjenja da leči inflamatornu povredu pluća može se demonstrirati prema sledećim probama i test modelima:

(vi) Model kiseonikom-indukovane povrede pluća kod miša kao što je opisano u Wegneretai, Lung170:267-279, 1992. (vii) model imunim kompleksom-indukovane povrede pluća kopd miša kao što je opisanou Mulligan etai, J. Immunol.154:1350-1363, 1995. (viii) model kiselinom -indukovane povredee pluća kod miša kao što je opisano u Nagaseetai, Am. J. Respir. Crit. Care Med.154: 504-510, 1996.

Sposobnost jedinjenja da leći inflamatornu bolest creva može se demonstrirati na meodelu hemijski-indukovanog kolitisa kod zečeva kao stoje opisano u Bennetet al, J. Pharmacol. Exp. Ther.280:988-1000, 1997.

Sposobnost jedinjenja da leči inflamatornu povredu jetre može se demonstrirati na modelu povrede jetre kod miševa kao što je opisano u Tanakaet al., J. Immunol.151:5088-5095, 1993.

Sposobnost jedinjenja da leči inflamatonu glomerularnu povredu može se demonstrirai na modelu nefrotoksičnog serum nefritisa kod pacova kao što je opisano u Kawasaki, et al., J. Immunol. 150:1074-1083, 1993.

Anti-inflamatorna aktivnost jedinjenja je takođe naznačena svojom sposobnošću da msanje proizvodnju pro-inflamatornih citokina i inhibiraju proliferaciju T-ćelija kao što je opisano u Primerima ud alejm tekstu.

Farmaceutske formulacije

Jedinjenje formule (Ia) obično se administrira u obliku farmaceutske kopozicije.

Farmaceutske kompozicije mogu biti u bilo kojem obliku koji je pogodan za oralnu, parenteralnu, topikalnu, intranazalnu, intrabronhjialnu, oftalmičnu, ušnu, rektalnu, intra-vaginalnu, ili transdermalnu administraciju. Kada su kompozicije namenjc za parenteralnu administraciju, mogu se formulisati za intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, subkutanu administraciju ili za direktu distribuciju u cilji organ ili tkivo injekcijom, infuzijom ili na druge načine.

Farmaceutske dozne oblike pogodne za oralnu administraciju su tablete, kapsule, kaplete, pilule, lozengete, sirupi, rastvori, sprejovi, praško vi, granule, eliksiri i suspenzije, sublingvalne tablete, sprejovi, vaferi ili flasteri bukalni flasteri.

Farmaceutske kompozicije koe sadrže jedinjenje dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska moguse formulisati prema poznatim tehnikama, videti na primer , Remington's Farmaceutske Sciences, Mack Publishing Companv, Easton, PA, USA.

Tako, kompozicije u obliku tableta mogu da sadrže jediničnu dozu aktivnog

jedinjenja zajedno sa inertnim rastvaračem ili nosačem kao stoje šećer ili šećerni alkohol, npr.; laktoza, sukroza, sorbitol ili manitol; i/ili razblaživači izvedeni od nešećera kao što je natrijum karbonat, kalcijum fosfat, tal, kalcijum karbonat, ili celuloza ili njeni derivati kao što je metil celuloza, etil celuloza, hidroksipropil metil celuloza i škrobovi kao stoje kukuruzni škrob. Tablete mogu takođe da sadrže standardne komponente kao što su vezivni agensi i agensi za granulaciju kao što je polivinilirolidon, dezintegrantc(npr. umrežene polimere koji bubre kao što je umrežena karboksimetilceluloza), sredstva za klizenje (npr. stearati), konzervansi (npr. parabens), antioksidansi (npr. BHT), puferi (na primer fosfatni ili citratni puferi), i agensi z aefervescenciju kao što su smeše citrata/bikarbonata. Ovi eksipijensi su poznati u tehnici i ne treba ih detaljno diskutovati u ovom tekstu.

Formulacije u obliku kapsula mohu da budu tvrde ili meke želatinske kaspule i mogu da sadrže aktivnu komponentu u čvrstom, polu-čvrstom, ili tečnom obliku. Želatinske kapsule mogu se dobiti od životinjskog želatina ili njihovi sintetički ekvivalentni ili ekvivalenti biljnog porekla.

Čvrsti dozni oblici (npr.; tablete, kapsule itd.) moguda budu obložene ili neobložene, ali obično imaju oblogu, na primer oblogu od zaštitnog filma (npr. vosak ili lak) ili obloga koja kontroliše oslobađanje. Obloga (npr. polimer tipa Eudragit™ ) može se dizajnirati tako da oslobodi aktivnu komponentu na željenim mestima unutar gastro-intestinalnog trakta. Tako, obologa može da bude odabrana tako da se razgrađuje pod određenim pH uslovima u gastrointestinalnom traktu, seletivno oslobađajući na taj način jedinjenje u stomaku ili ileumu ili duodenumu.

Umesto ili pored obloge lek može da čini deo čvrstog matriksa koji sadrži agens za kontrolu oslobađanja, na primer agens za odloženo oslobađanje koji se može prilagoditi tako da selektivno oslobađan jedinjenje pod sulovima različite kiseosti ili alkaliniteta u gastrointestinalnom traktt. Alternativno, materijal matriksa ili obloga za usporeno oslobađanje( retard obloga) možeda bude u obliku erodibilnog polimera (npr. polimer anhidrida maleinske kiseline) koji u suštini kontitnualno erodira kako dozni oblik prolazi kroz gastrointestinalni trakt.

Kompozicije za topikalnu upotrebu uključuju meleme, kreme, spejeve, flastere, gelove, tečne kapi i inserte (na primer intraokulami inserti). Ove kompozicije se mogu formulisati u skladu sa poznatim metodama.

Kompozicije za parenteralnu administraciju se obično nalaze kao sterilni vodeni ili uljani rastvori ili fine suspenzije, ili mogu biti u obliku fino podeljenog sterilnog praha za pripremanje improvizovanih injekcije sa sterilnom vodom.

Primeri formulacija za rektalnu ili intra -vaginalnu administraciju uključuju pesare i supozitorije koji mogu, na primer , da budu napravljeni od oblikovanih materijala koji se mogu kalupiti ili voskastog materijala koji sadrže aktivno jedinjenje.

Kompozicije za administraciju inhalacijom mogu da budu u obliku praskaste kompozicije koja se može inhalirati ili tečnih ili praškastih sprejova, i mogu se administrirati u standardnom obliku pomoću uređaja za inhaliranje praška (pumpice) ili uređaja za aerosaolnu distribuciju. Ovakvi uređaji su dobro poznati u tehnici. Za administraciju inhalacijom, praskaste formulacije obično sadrže aktivno jedinjenje zajedno sa inertnim čvrsti praškastim razblaživačem kao što je laktoza.

Jedinjenja pronalaska će generalno biti u boliku jediničnog doznog oblika, i kao takva, obično sadrže dovoljnu količinu jedinjenja za obezbeđivanje željenog n ivoa biološke aktivnosti. Na primer, formulacija nemenjena za oralnu administraciju može da sadrži od 2 miligrama do 200 miligrama aktivne komponetne, češće više od 10 miligrama do 100 miligrama, na primer , 12.5 miligrama, 25 miligrama i 50 miligrama.

Aktivno jedinjenje će se administrirati pacijentu (na primer humanom pacijentu ili životinji) u količini dovoljnoj da postigne željeni terapeutski efekat.

Subjekat kojem je ovakvo administrairanje potrebno, je obično pacijent oboleo od ili pod rizikom od obolevanja od inflamatorne bolesti kao što je prethodno definisano.

Jedinjenja će se obično administrirati u količinama koje su terapeutski ili profilaktički korisne i koje su generalno netoksične. Međutim, u određenim situacijama, benefiti od administrirani a jedinjenja dihidrotetrabenazina mogu da nadmaše nedostatke toksičnih efekata ili sporednih efekata, u kom slučaju se može smtrati poželljnim administrirati jedinjenja u količinama koje su povezane sa stepenom toksičnosti.

Tipična dnevna doza jedinjenja može da bude do 1000 mg na dan, na primer u psegu od 0.01 miligrama do 10 miligrama po kilogramu telesne težine, obično od 0.025 miligrama do 5 miligrama po kilogramu telesne težine, na primer do 3 miligrama po kilogramu telesne težine, a još bolje 0.15 miligrama do 5 miligrama po kilogramu telesne težine mada se po potrebi mogu adminsitrirati i veće i manje doze od ovih.

Kratak opis slika

Slika 1 ilustruje efekat jedinjenja Izomera B (RU350) i Izomera D (RU346) na proizvodnju TNFa, monocitima.

Slika 2 ilustruje efekat jedinjenja Izomera B (RU350) i Izomera D (RU346 na proizvodnju IL-4, monocitima.

Slika 3 ilustruje efekat jedinjenja Izomera B (RU350) i Izomera D (RU346) na proizvodnju IL-2 , humanim monocitima.

Slika 4 ilustruje efekat jedinjenja Izomera B (RU350) i Izomera D (RU346) na proizvodnju IL-5, humanim monocitma.

Slika 5 ilustruje efekat jedinjenja Izomera B (RU350) i Izomera D (RU346) na proizvodnju IL-10, humanim monocitima.

Slika 6 ilustruje efekat jedinjenja Izomera B (RU350) i Izomera D (RU346) na proizvodnju IL-12, humanim monocitima.

Primeri

Sledeći neograničavajući primeri ilustruju sintezu i osobine izomera 3,11 b-cis-dihidrotetrabenazina. Primeri opisuju sva četiri izomera 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazina mada je pronalazak ograničen na teraeputsku primenu Izomera B (jedinjenje formule (Ia)). Primeri koji se odnose na druge izomere su dati kao komparativni primeri.

Primer 1

Dobijanje 2S, 3S, 1 lbR i2R, 3R, l lbS Izomera Dihidrotetrabenazina

1 A. Redukcija RR/ SS Tetrabenazina

IM L-Selectride® u tetrahidrofuranu (135 ml, 135 mmol, 2.87 ekv.) je polako dodat tokom 30 minuta u mešani rastvor RR/SS racemata tetrabenazina (15 g, 47 mmol) u etanolu (75 ml) i tetrahidrofurani (75 ml) na 0 °C. Po završenom dodavanju, smeša je mešana na 0 °C , 30 minuta i zatim ostavljena da se ugreje do sobne temperature.

Smeša je sipana na samlejveni led (300 g) i dodata je voda (100 ml). Rastvor je ekstrahovan dietil etrom (2 x 200 ml) i kombinovani etarski ekstrakti su isprani vodom (100 ml) i delimično osušeni iznad anhidrovanog kalijum karbonata. Sušenje je završeno pomoću anhidroganog magnezijum sulfata i,posle filtracije, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom (zaštićeno od svetla, temperatura kupatila <20 °C) dajući čvrstu suptancu bledo žute boje.

Čvrsta suptanca je razmućena u petroletru (30-40 °C) i profiltrirana dajući praškastu belus suptancu (12 g, 80%).

1B. Dehidrataciia redukovanog Tetrabenazina

Fosfor pentahlorid (32.8 g, 157.5 mmol, 2.5 eq) je u porcijama dodat tokom 30 minuta u mešani rastvor redukovanog tetrabenazina, proizvoda iz primera 1A (20 g, 62.7 mmol) u dihlormetanu (200 ml) na 0 °C. Po završenom dodavanju, reakciona smeša je mešana na 0 °C još 30 minuta i rastvor je polako sipan u 2M vodeni rastvor natrijum karbonata rastvor koji sadrži smrvljeni led (0 °C). Po završenom izdvajanju kiselog gasa, smeši je dodat čvrst natrijum karbonat čime joj je povećana baznost (ca. pH 12).

Alkalni rastvor je ekstrahovan etil acetatom (800 ml) i kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata. Posle filtracije rastvarač jc uparen pod sniženim pritiskom dajući ulje braon boje, koje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, etil acetat) dajući polu-čist alken kao žutu čvrstu supstancu (10.87 g, 25 58%).

1C. hidratacija sirovog alkena iz Primer 1B

Rastvor sirovog alkena (10.87 g, 36.11 mmol) iz Primera 1B u suvom THF -u (52ml) na sobnoj temperaturi je u kapima tretiran sa 1M boran-THF (155.6 ml, 155.6 mmol, 4.30 ekv). Reakciona smeša je mešana 2 sata, dodata je voda (20 ml) i rastvoru je povećana baznost na pH 12 dodatkom 30% vodenog rastvora natrijum hidroksida.

Vodeni 30% rastvor vodonik peroksida (30 ml) je dodat u mešanu alkalnu reakcionu smešu i rastvor je zagrevan da refluksuje 1 sat pre nego što je ohlađen. Dodata je voda (100 ml) i smeša je ekstrahovaana etil acetatom (3 x 250 ml). Organski eksptrakti su kombinovani i osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle flitracije rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom dajući žuto ulje (9 g).

Ulje je prečišćeno preparativnom HPLC (Kolona : Lichrospher Si60, 5 mm, 250 x 21.20 mm, mobilna faza: heksan : etanol: dihlormetan (85:15:5); UV 254 nm, protok: 10 ml min-1) sa 350 mg po injekciji nakon čega su frakcije od interesa koncentrovane pod vakuumom. Dobijeno ulje je zatim rastvoreno u etru i još jednom koncentrovano pod vakuumom dajući racemat dihidrotetrabenazina kao žutu penu (5.76 g, 50%).

1D. Pobijanje derivata Mosher' ovih estara

R-(+)-a-metoksi-a-tirfluoromethilfenil sirćetna kiselina (5 g, 21.35 mmol), oksalil hlorid (2.02 ml) i DMF (0.16 ml) su dodati u anhidrovani dihlormetan (50 ml) i rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 45 minuta. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatku je još jednom dodat anhidrovan dihlormetan (50 ml). Dobijeni rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i dodat je dimetilaminopiridin (3.83 g, 31.34 mmol) pa zatim pred-osušenim rastvorom (kroz sito od 4A) u anhidrovanom dihlormetanu čvrstog proizvoda iz Primera 1C (5 g, 15.6 mmol). Posle mešanja na sobnoj tempraturi od 45 minuta, dodata je voda (234 ml) i smeša je ekstrahovana etrom (2 x 200 ml). Etarski ekstrakti su osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, propušteni kroz sloj silicijum dioksida i proizvod je eluiran etrom.

Sakupljeni etarski eluati su koncentrovani pod sniženim pritiskom dajući ulje koje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, heksan : etar (10:1)). Uparavanje sakupljenih frakcija od interesa sa kolone i uparavanje rastvara;a pod sniženim pritiskom dalo je čvrsti ostatak koji je dalje prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, heksane : etil acetat (1:1)) dajući tri glavne komponente koje su delimično razdvojene u pikove 1 i 2 Mosher'ovog estra.

Preparativnom HPLC tri komponente (kolona: 2 x Lichrospher Si60, 5 mm, 250 x 21.20 mm, mobilna faza: heksan : izopropanol (97:3), UV 254 nm; protok: 10 ml min-1) sa nanetih 300 mg nakon čega sledi konccntrovanje frakcija od interesa, pod vakuumom dajući čiste derivate Mosher'ovog estra

Pik 1 (3.89 g, 46.5%)

Pik 2 (2.78 g, 33%)

Frakcije koje odgovaraju ovim pikovima su hidrolizovani da bi se oslobodili individualni izmoeri dihidrotetrabenazina koji su identifikovani i okarakterisani kao Izomeri A i B. Pretpostavlja se da Izomeri A i B imaju jednu od sledećih struktura

Detaljnije, pretpostavlja se da Izomer B ima 2S,3S,1 lbR apsolutnu konfiguraciju na osnovu rendegenske kritalografske analize opisane u primeru 4 u daljem tekstu.

IE. Hidroliza Pika 1 za dobijanje Izomera A

20% vodeni rastvor natrijum hidroksida (87.5 ml) je dodat u rastvor pika 1 Mosher'ovog estra (3.89 g, 7.27 mmol) u metanolu (260 ml) i smeša je mešana i zagrevana da refluksuje 150 minuta. Posle hlađenja do sobne temperature dodata je voda (200 ml) i rastvor ekstrahovan etrom (600 ml), osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, koncentrovan pod sniženim pritiskom.

Ostatak je rastvoren u etil acetatu (200 ml), rastvor je ispran vodom (2 x 50 ml), organska faza je osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije koncentrovana pod sniženim pritiskom dajući žutu penu. Ovaj materijal je prcčišćan hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, eluiranjem gradijentom etil acetat: heksan (1: 1) do etil acetata). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatku je dodat etar i rastvarač je još jednom uparen pod sniženim pritiskom dajući Izomer A kao beličastu penu (l.lg, 47%).

Izomer A, za koji se pretpostavlja da ima 2R,3R,1 lbS konfiguraaciju (nije određena apsolutna stereohemija), je okarakterisan sa 1H-NMR, 13C-NMR, IR, masenom spektrometrijom, hiralnom HPLC i ORD. IR, NMR i MS podaci za izomer A su dati u Tabeli l,a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 3.

IF. Hidroliza Pika 2 za dobijanje Izomera B

20% vodeni rastvor natrijum hidroksida (62.5 ml) je dodat u rastvor pika 2 Mosher'ovog estra (2.78 g, 5.19 mmol) u metanolu (185 ml) i smeša je mešana i zagrevana da refluksuje 150 minuta. Posle hlađenja do sobne temperature dodat aje voda (142 ml) i rastvor je ekstrahovan etrom (440 ml), osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije,koncentrovan pod sniženim pritiskom.

Ostatak je rastvoren u etil acetatu (200 ml), rastvor je ispran vodom (2 x 50 ml), organska faza je osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije,

koncentrovana pod sniženim pritiskom. U ostatak je dodat petroletar (30-40 °C) i rastvor je još jednom koncentrovan pod vakuumom dajući Izomer B kao belu penu (1.34 g, 81 %).

Izomer B, za koji se pretpostavljada ima konfiguraciju 2S,3S,1 lbR, oakrakterisan je sa 1H-NMR, 13C-NMR, IR, masenom spektrometrijom, hiralnom HPLC, ORD i rendegnskom difraktometrijom. Podaci za IR, NMR i MS za Izomer B dati su Tabeli 1, a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 3. Podaci dobijem rendgenskom difraktometrijom dati u primeru 4.

Primer 2

Pobijanje 2R. 3S. 1 lbR i 2S. 3RJ lbS Izomera Dihidrotetrabenazina

2A. Sobijanje 2, 3- Dehidrotetrabenazina

Rastvor koji sadrži racemsku smešu (15 g, 47 mmol) RR i SS enantiomera tetrabenazina u tetrahidrofuranu je podvrgnuta redukciji sa L-Selectride® prema metodi opisanoj za primer 1A dajući tako smešu 2S,3R, 1 lbR i 2R,3S,1 lbS enantiomera dihidrotetrabenazina kao belu praškastu čvrstu supstancu (1 2 g, 80%). Pelimično prečišćen dihidrotetrabenazin je zatim dehidratisan pomoću PC15 prema metodi iz primera 1B dajući polu-čistu smešu 1 lbR i 1 lbS izomera 2,3-dehidrotetrabenazina ( 1 lbR enantiomer je prikazan u tekstu niže) kao žutu čvrstu suptancu (12.92 g, 68%).

2B. Epoksidacija sirovog alkena iz primera 2A

U mešani rastvor sirovog alkena iz primera 2A (12,92 g, 42.9 mmol) u metanolu (215 ml) dodat je rastvor 70% perhlorne kiseline (3.70 ml, 43 mmol) u metanolu (215 ml). U reakcionu smešu je dodata 77% 3-Hlorperoksibenzojeva kiselina (15.50 g, 65 mmol) i dobijena smeša jemešana 18 sati na sobnoj temperaturi zaštićenoj od svetla.

Reakciona smeša je sipana u zasićeni vodeni rastvor natrijum sulfita (200 ml) i dodata je voda (200 ml). U dobijenu emulziju dodat je hlorform (300 ml) i smeši9 povećana baznost dodatko zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (400 ml).

Organski sloj je sakupljen i voden fazaje isprana sa još hlorforma (2 x 150 ml). Kombinovani hlorformski slojevi su osušeni znad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom dajući braon ulje (14.35 g, prinos > 100% -verovatno je rastvarač zaostao u proizvodu). Ovaj materijal je upotrebljen bez daljeg prečišćavanja.

2C, Reduktivno otvaranje prstena epoksida iz 2B

Mešani rastvor sirovog epoksida iz primera 2B (14.35 g, 42.9 mmol, prtpostavljajući 100% prinosa) u suvom THF-u (80 ml) je polako tretiran IM boran/THF (184.6 ml, 184.6 mmol) tokom 15 minuta. Reakciona smeša je mešana dva sata, dodata je voda (65 ml) i rastvor je uz mešanje zagrevan da refluksuje 30 minuta.

Posle hlađenja, u reakcionu smešu je dodat rastvor 30% natrijum hidroksida (97ml), pa zatim 30% rastvor vodonik peroksida (48.6 ml) i reakciona smeša je mešana da refluksuje još 1 sat.

Ohlađena reakciona smeša je ekstrhovana etil acetatom (500 ml) oušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom dajući ulje. U uLje je dodat heksan (230 ml) i rastvor je ponovo koncentrovan pod sniženim pritiskom.

Uljani ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, etil acetat). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je još jednom prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, gradijent, heksan do etar). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom dajući čvrstu suptancu bledo žute boje (5.18 g, 38%).

2D. Pobijanje derivata 2R, 3S, 1 lbR i 2S. 3R. 1 lbS Izomera Dihidrotetrabenazina

Mosher' ovog estra

R-(+)-a-metoksi-a-tirfluoromethilfenil sirćetna kiselina (4.68 g, 19.98 mmol), oksalil hlorid (1.90 ml) i DMF (0.13 ml) su dodati u anhidrovan dihlormetan (46 ml) i rastvor je mešan na sobnoj temperaturi, 45 minuta. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatku je još jednom dodat anhidrovan dihlormetan (40 ml). Pobijeni rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i dodat je dimethilaminopiridin (3.65 g, 29.87 mmol) pa z atim i pređ-osušen rastvor (kroz sito od 4A) u anhiđrovanom dihlormetanu (20 ml) čvrstog proizvoda iz primera Example 2C (4.68 g, 14.6 mmol). Posle stajanja na sobnoj temperaturi od 45 minuta, dodata je voda (234 ml) i smeša je ekstrhovana etrom (2 x 200 ml). Etarski ekstrakt je osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, propušten kroz sloj silicijum dioksida i proizvod je eluiran etrom.

Sakupljen etarski eluat je koncentrovan pod sniženim pritiskom dajući ulje koje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, heksan : etar (1:1)). Uparavanjem frakcija sakupljenih sa kolone i uklanjanjem rastvarača pod sniženim pritiskom dobijen je ružičast čvrsti ostatak(6.53 g)

Preparativna HPLC čvrstog ostatka (kolona: 2 x Lichrospher Si60, 5 mm, 250 x 21.20 mm; mobilna faza heksan : izopropanol (97:3); UV 254 nm; protok: 10 ml min-1) nanateih 100 mg nakon čega je su frakcije od interesa koncentrovane u vakuumu, dobijena je čvrsta suptanca koja je razmućena u petroletru (30-40 °C) i filtracijom su dobijeni čisti derivati Mosher'ovog estra

Pik 1 (2.37 g, 30%)

Pik 2 (2.42 g, 30%)

Frakcije koje odgovaraju ovim pikovima su hidrolizovani u vilju oslobađanja individualnih izomera dihidrotetrabenazina, identifikovani i okarakterisani kao Izomeri C i P. Pretpostavlja se da Izomeri C i P imaju sledeće strukture.

2F. Hidroliza Pika 1 za dobijan je Izomera C

20% vodeni rastvor natrijum hidroksida (53 ml) je dodat u mešani rastvor Mosher'ovog estra pik 1 (2.37 g, 4.43 mmol) u metanolu (158 ml) i smeša je refluksovana 150 minuta. Posle hlađenja u reakcionu smešu je dodata voda (88 ml) i dobijeni rastvor je ekstrahovan etrom (576 ml). Organski ekstrakti su osušeni iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije rastzvarač je uparen pod sniženim pritiskom. U ostatak je dodat etil acetat (200 ml) i rastvor je ispran vodom (2 x 50 ml). Organski rastvor je osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom.

Ovaj ostatak je tretiran petroletrom (30-40 °C) dobijeni suspendovani čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i druga serija suspendovanog čvrstog ostatja je sakupljena filtracijom. Oba sakupljena čvrsta ostatka su kombinovana i osušena pod sniženim pritiskom dajući Izomer C (1.0 g, 70%).

Izomer C, za koji se pretpostavlja da ima ili 2R,3S,1 lbR ili 2S,3R,1 lbS konfiguraciju (apsolutna stereohemija nije određena), oakrakterisan je sa 1H-NMR, 13C-NMR, IR, masenom spektrometrijom, hiralnom HPLC i ORD. Podaci za IR, NMR i MS za Izomer C dati su u Tabeli 2 , dok su podaci za hiralnu HPLC i ORD dati u Tabeli 4.

2G. Hidroliza Pika 2 za dobijanje Izomera D

20% vodeni rastvor natrijum hidroksida (53 ml) je dodat u mešani rastvor Mosher'ovog estra pik 2 (2.42 g, 4.52 mmol) u metanolu (158 ml) i smeša je uz mešanje refluksovana 150 minuta. Posle hlađenja u reakcionu smešu je dodata voda (88 ml) i dobijeni rastvor je ekstrahovan etrom (576 ml). Organski ekstrakt je osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata i posle filtracije rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. U ostatak je dodat etil acetat (200 ml) i rastvor ispran vodom (2 x 50 ml). Organski rastvor je osušen iznad anhidrovan magnezijum sulfata i posle filtracije rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom.

Ovaj ostatak je tretiran petroletrom (30-40 °C) dobijeni suspendovani narandžasti čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom. Čvrsti ostatak je rastvoren u etil acetat: heksanu (15:85) i prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, gradijent etil acetat: heksan (15:85) do etil acetata). Frakcije od interesa su kombinovane i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je razmućen u petroletru(30-40 °C) i dobijena suspenzija je sakupljena filtracijom. Sakupljen čvrsti ostaje osušen pod sniženim pritiskom dajući Izomer D kao belu čvrstu sutpnacu (0.93 g, 64%).

Izomer D, za koji se pretpostavljad a ima ili 2R,3S,1 lbR ili 2S,3R,1 lbS konfiguraaciju (apsolutna steroehmija nije određena), okarakterisan je sa 'H-NMR,[ iC-NMR, IR, masenpm spektrometrijom, hiralnom HPLC i ORD. Podaci za IR, NMR i MS za Izomer D dati su u Tabeli 2 , a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 4.

U tabelama 1 i 2, infracrveni spektir us određeni metodom KBr tablete.<]>H NMR spekti su izmereni u rastvoru u deterisanom hlorformu na Varian Gemini NMR spektrometru (200 MHz.).<I3>C NMR spektri su izemereni u rastvoru u deuterisanom hlorformu na Varian Gemini NMR specktrometru (50MHz). Maseni spektri su dobijeni na Micromass Platform II (ES+ conditions) spektrometru. U Tabelama 3 i 4, rezultati za optičku rotirajuću disperziju (ORD) su dobijeni na Optical Activitv PolAAr 2001 instrumentu u rastvoru metanola na 24°C. Merenja HPLC retencionih vremena izvedena su na HP 1050 HPLC hromatografu, UV detekcijom.

Primer 3

Alternativni metod dobijanja Izomera B i dobijanje Mezilatne soli

3A. Redukcija RR/ SS Tetrabenazina

IM L-Selectriđe® u tetrahidrofuranu (52 ml, 52 mmol, 1.1 eq) je dodat polako tokom 30 minuta u ohlađen (ledeno kupatilo), šema rastvor racemata tetrabenazina (15 g, 47 mmol) u tetrahidrofuranu (56 ml). Po završenom dodavanju, smeša je ostavljena da se ugreje do sobne temperature i mešana još šest sati. TLC analiza (silicijumdioksid, etil acetat) pokazuju samo manje količine zaostalog polaznog materijala.

Smeša je sipana u mešanu smešu izdrobljenog leda (112 g), vode (56 ml) i glacialne sirćetne kiseline (12.2 g). Dobijeni žuti rastvor je ispran etrom (2 x 50 ml) i povećana mu je baznost dodatkom čvrstog natrijum karbonata (ca. 13 g). Uz mešanje u smešu je dodat pet-etar (30-40 °C) (56 ml) i filtracijom je sakupljen sirov 6-DHTBZ kao bela čvrsta sup tanca.

Sirova čvrsta suptanca je rastvorena u dihlormetanu (ca. 150 ml) i dobijeni rastvor je ispran vodom (40 ml), osušen anhidrovanim magnezijum sulfatom, profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom do ca. 40 ml. Formirana je gusta suspenzija bele čvrste supstance. Pet-etar (30-40 °C) (56 ml) je dodat i suspenzija je mešana petnaest minuta na temperaturi u laboratoriji. Proizvod je sakupljen filtracijom i ispran na filteru pet-etrom (30-40°C) (40 do 60 ml) pre sušenja na vazduhu na sobnoj tepmperaturi dajući fi-DHTBZ (10.1 g, 67%) kao bela čvrsta suptanca. TLC analiza (silicijum dioksid, etil acetat) je pokazala postojanje samo jedne komponente.

3B Pobijanje i frakciona kristalizacija soli kamfor sulfonske kisline racemskog 13- DHTBZ

Proizvodi iz primera 3 A i 1 ekvivalent (S)-(+)-Kamfor -10-sulfonske kiseline jc rastvoreno uz zagrevanjc u minumalnoj količini metanola. Dobijeni rastvor je ostavljen da seohladi do i zatim je polako rastvoren dodatkom etra do prestanka izdvajanja čvrstog taloga. Pobijeni kristali su sakupljeni filtracijom i ispran etrom pre sušenja.

So kamfor sulfonske kiseline (10 g) rastvorena je u smeši vrelog apsolutnog etanola (170 ml) i metanola (30 ml). Pobijeni rastvor je mešan i ostavljen da se ohladi. Posle dva sata, dobijeni talog je sakupljen filtracijom u obliku belih kristala (2.9 g). Uzorak kristalnog materijala je promućkan u levku za odvajanje sa viškom zasićenog vodenog natrijum karbonata i dihlormetana. Organska faza je odvojena, osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profiltrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je triturisan dodatkom pet-etar (30-40 °C) i organski rastvor je još jednom koncentrovan. Hiralna HPLC analiza soli na Chirex (S)-VAL i (R)-NEA 250 x 4.6 mm koloni, i eluent heksan : etanol (98:2) pri brzini protoka 1 ml/minut pokazuje daje izolovan 8-DHTBZ obogaćen jednim enantiomerom (e.e. ca. 80%).

Obogaćena so kamfor sulfonske kiseline (14 g) je rastvorena u vrelom apsolutnom etanolu (140 ml) i dodat je propan2-ol (420 ml). Dobijeni rastvor je mešan i počelo je stvaranje talog za jedan minut. Smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i mešana jedan sat. Fomirani talog je profiltriran, ispran etrom i osušen dajući bele rkistale (12 g).

Kristalni materijal je promućkan u levku zaa odvajanje sa viškom zasićenog vodenog natrijum karbonata i dihlormetanom. Organska faza je odvojena, osušena iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profiltrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je triturisan dodatkom pet-etra (30-40 °C) i organski rastvor je još jednom koncentrovan dajući (posle sušenja u vakuumu) (+)-8-DHTBZ (6.6 g, ORD +107.8°). Izolovani enantiomer ima e.e. >97%.

3C. Dobijanje Izomera B

Rastvor fosfor pentahlorida (4.5 g, 21.6 mmol, 1.05 eq) u dihlormetanu (55 ml) je konstantno dodavan tokom ten minuta u mešani, ohlađen (ledeno kupatilo ) rastvor proizvoda iz Primera 3B (6.6 g, 20.6 mmol) u dihlormetanu (90 ml). Po završenom dodavanju, Dobijeni žuti rastvor jemešan još deset minuta pre nego što je sipan u smešu natrijum karbonat (15 g) u vodi (90 ml) i izmrvljenog leda(90 g) koja je brzo mešana. Smeša je mešana još 10 minuta i prebačena u levak za odvajanje.

Kada su faze razdvojene, braon dihlormetanski sloj je uklonjen, osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom dajući sirov intrermedijerni alken kao braon ulje(ca. 6.7 g). TLC analiza (siliesijum dioksid, etil acetat) kje pokazao da u sirovom proizvod ne zaostaje (+)-13-DHTBZ.

Sirovom alkenu je dodat (u atmosferi suvog azota) u anhidrovani tetrahidrofuran (40 ml) i dodat je rastvor borana u THF-u (1M rastvor, 2.5 ekv, 52 ml) uz mešanje tokom petnaest minuta. Reakciona smeša je zatim dva sata mešana na sobnoj temperaturi. TLC analiza (silicijum dioksid, etil acetat) je pokazala da u reakcionoj smeši ne zaostaje intremedijerni alken.

Rastvor natrijum hidroksida (3.7 g) u ovdi (10 ml) je dodat u reakcionu smešu koja je na mešalici, nakon čega je dodat vodeni rastvor vodonik peroksida (50%, ca. 7 ml) i dobijena dvofazna smeša je mešana uz refluksovanje dva sata. TLC analiza organske faze u ovom trenutku (silicijum dioksid, etil acetat) je pokazala prisustvo proizvoda sa Rf vrednostima kao što je očekivano za Izomer B. Takođe je uočena nepolarna komponenta.

Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i prebačena je u levakza odvajanje. Gornji organski sloj je uklonjen i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se uklonio najveći deo THF-a. Ostaktu je dodat etar (stabilizovan (BHT), 75 ml), ispran vodom (40 ml), osušen iznad anhidrovanog magnezijum sulfata, profdtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom dajući bledo žuto ulje (8.1 g).

Žuto ulje je prečišćeno hromatografijom nakoloni (silicijum dioksid, etil acetat: heksan (80:20), sa promenom do 100% etil acetata) i željene frakcije sa kolone su sakupljene, kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom dajući bledo ulje koje je tretirano etrom (stabilisano, 18 ml) i koncentrovano pod sniženim pritiskom dajući Izomer B kao bledo žutu čvrstu penu (2.2 g).

Hhiralnom HPLC pod uslovima datim u Primeru 3B potvrđeno je daje Izomer B proizveden u enantiomernom višku (e.e.) većem od 97%.

Optička rotacija je merena na Bellingham Stanlev ADP220 polarimetru i ima [aD] os +123.5°.

3D. Dobijanje Mezilatne soli Izomera B

Metansulfonatna so Izomera B je dobijena rastvaranjem smeše 1 ekvivalenta Izomera B iz Primera 3C i 1 ekvivalenta metan sulfonske kiseline u minimalnoj količini etanola i zatim dodavanjem dietil etra. Dobijeni beli talog je profiltriran i osušen u vakuumu dajući mezilatnu so u prinosu od ca. 85% i čistoće ( HPLC-om) od ca. 96%.

Primer 4

Rend genska kristalografska ispitivanja Izomera B

Pripremljena je so (S)-(+)-Kamfor -10-sulfonske kiseline Izomera B i monokristal je podvrgnut rendgenskoj kristalografskoj analizi pod sledećim uslovima: Difraktometar: Nonius KappaCCD površinski detektor (t/i skenovi i OJ skenovi da bi se obuhvatila asimetrična jedinica).

Određivanje jedinične ćelije: DirAx (Duisenberg, A.J.M.(1992). J. Appl. Cryst. 25, 92-96.)

Prikupljanje podataka: Collect (Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B. V, 1998)

Redukcija podataka i utačnjavanje ćelije: Demo (Z. Otwinowski & W. Minor, Methođs in Enzymology (1997) Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307-326; C. W. Čarter, Jr & R. M. Sweet, Eds., Academic Press).

Korekcija za apsorpciju: Sheldrick, G. M. SADABS -Bruker Nonius area detector scaling and absorption correction -V2.\ 0

Rešavanje strukture: SHELXS97 (G. M. Sheldrick, Acta Cryst. (1990) A46 467-473).

Utačnjavanje strukture: SHELXL97 (G. M. Sheldrick (1997), University of Gottingen, Germany)

Crteži: Cameron -A Molecular Graphics Package (D. M. Watkin, L. Pearce and C. K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, University of Oxford, 1993).

Posebni detalji: svi atomi vodonika su postavljeni u idelizovane položaje i utačnjeni zajedno sa njima na tim položajima, osim onih u NH i OH koje su locirane u diferentnoj mapi i utačnjeni ograničenima. Hiralnost: NI=R, CI2=S, CI3=S, CI5=R, C21-S, C24=R

Rezlutati ovih analiza su data u Tablama A, B, C, D i E.

U Tablama, oznaka RUS0350 se odnosi na Izomer B.

Simetrijske transformacije upotrebljene da se dobiju ekvivalentni atomi:

Termalni elipsoidi nactani na nivou verovatnoće od 30%.

Na osnovu gore datih opdataka, pretpostavlja se da Izomer B ima 2S, 3S, 1 lbR konfiguraciju koja odgovara Formuli (Ia):

Primer 5

Ispitivanje vezivanja sigma receptora

Četiri izomera dihidrotetrabenazin A, B, C i D su podvrgnuta ispitivanju specifičnog vezivanja za testiranje njihove sposobnosti da se vežu za sigma-1 i sigma-2 receptore. Rezultati su dati u Tabeli S.

(a) Sigma al Receptor:

Reference: Ganapathy et al., Pharmacol. Exp. Ther., 289:251 -260, (1999) Izvor:Humane jurkatćelije

Ligand: 8 nM [3H] Haloperidol

Nosač: l%DMSO

Vreme inkubacije/Temp: 4 hours @ 25 °C

Inkubacioni pufer: 5 mM K2HPO4/KH2P04 bufer pH 7.5

Ne -specifični ligand: 10 mM Haloperidol

Kd: 5.8 nM

Bmax: 0.71 pmol/mg protein

Specifično vezivanje: 80%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum važnosti: >50% of maksimalme stimulacije ili inhibicije

(b) Sigma «2 Receptor:

Reference: Shimoto et al., Eur. J. Pharmacol., 236:159-163, (1993) Izvor: Mozak pacovaWistax

Ligand: 3nM [3H] Ifenprodil

Nosač: l%DMSO

Vreme inkubacije/Temp: 60 minutes @ 37°C

Inkubacioni pufer: 5 mM Tris-HCl, pH 7.4

Ne -specifični ligand: lOuM Ifenprodil

Kd: 8 nM

Bmax: 3 pmol/mg protein

Specifično vezivanje: 80%

Metod kvantitacije: Vezivanje radioliganda

Kriterijum važnosti: >50% maksimalme stimulacije ili inhibicije Tabela 5

Podaci pokazuju da se sva četiri izomera vezuju za sigma-1 i sigma-z receptora cetin izomera su prubližno ekvipotenta u ispitivanjim vezivanja za sigma-2 receptor, dok se izomeri B i D jače vezuju za sigma-1 receptor.

Primer 6

Određivanje efekta jedinjenja pronalaska na LPS/ IFN stimulisano proizvodnju citokina

humanim monocitima

Jedinjenja pronalaska su testirana na to do koje mere ona mogu da moduliraju proizvodnju citokina humanim monocitima. Monociti su prekursori makrofaga i oni su osnovni izvor inflamatornih citokina u različitim stanjima bolesti. Aktivnost jedinjenja pronalaska na proizvodnju monocita obezbeđuje dobar indikator verovatnoće da jedinjenja poseduju anti-inflamatornu aktivnost.

Pripremljene su sledeće grupe za tretman.

Procedure

Modulacija proizvodnje humanih monocitmh citokina

Materijali

MACS pufer: 1 x PBS pH 7.2,2 mM EDTA (Sigma), 5% humani AB serum

Medijum kulture: 500 ml RPMI1640 (Invitrogen), 5 ml Penstrep (Sigma), 5 ml L-glutamine (Invitrogen), 10 ml HEPES (Sigma), 5% autologous plasma.

Jedinjenja: osnovni kao 10 mM u apsolutnom etanolu.

LPS: Salmonella abortisod 1 mg/ml (Sigma, Cat # LI 887).

1FN.: Recombinant human odlO mg/ml (BD Pharmacia, Cat # 554617).

MACS CD14-pozitivna selekcija kuglica i LS kolone (Miltenvi Biotech).

CD14:FITC antitelo (Miltenvi Biotech)

Podloga dobijena od Bristol National Blood Services.

1 ml krvi bi trebalo da da 7 x 10<6>ukupnih ćelija.

Pripremanje Autnlnpe P1agny»

Podloga 3500 rpm, 10 min.

Ukloniti gornji sloj plazme i inaktivirati toplotom na 56 °C, 30 min.

Centrifugirati 3500 rpm, 10 min za uklanjanje komplementnih proteina inaktiviranih toplotom.

Izolovanje mononuiklearnih ćelija periferne krvi ( PBMC)

1. Resuspenovati preostalu podlogu u ekvivalentnoj zapremini u medijumu RPMI 1640 i pomešati obrtanjem (inverzijom). 2. Prethodno ugrejatihistopaque(Sigma) do sobne temperature (RT) i dodati 10 ml u

universal.

3. Pažljivo prekriti slojem smeše 15 ml krvi/medijum.

4. Centrifugirati na 1600 rpm, 25 minutea ma RT (bek kočenja).

5. PBMC su razdvojene ugranični sloj između medijuma ihistopague,ćelijie prebaciti u 50 ml Falcon i dodati 10 ml medijuma.

6. Centrifugirati na 1800 rpm, 10 min na RT.

7. Isprati x3 sa 40 ml RPMI medijuma i resuspendovati u medijumu kulture.

Izolovanje CD 14+ ćelija pozitivnom selekcijom saCD 14 + MicroBeads

Raditi na ledu, sa predhotdno ohlađenim rastvorima.

1. Odrediti ćelijskebrojeve (313 x 10 x 5 x IO<4>=1.565 x IO<8>ukupnih ćelija)

2. Ukloniti uzorak od 100 ml ćelija zaFluorescence- Activated Cell- Sorting(FACS) analizu (pred-selekcioni uzorak).

3. Centrifugirati na 1800 rpm, 10 minuta na 4 °C. Ukloniti supernatant.

4. Resuspendovati pelete u 80 ml pufera po 1 x 10<7>ukupnih ćelija (2400 ml/ ukupnih ćelija). 5. Dodati 20 mlCD 14 MicroBeadspo 1 x 10<7>ukupnih ćelija (400 ml/ ukupnih ćelija).

6. Dobro promešati i inkubirati 15 minuta na 4-8 °C.

7. Isprati ćelije sa 1-2 ml pufera, centrifugirati na 300 x g, 10 minutea na 4 °C. Ukloniti supernatant. 8. Resuspendovati do 1 x IO<8>ćelija u S00 ml pufera (1 ml/ ukupnih ćelija).

Magnentno razdvajanje sa LS kolonom

1. Postaviti kolonu u magnetno polje MACS® Separator-a. Ipsrati kolonu sa 3 ml MACS pufera.

2. Nanatei suspenziju ćelija na kolonu.

3. Sakupiti neobeležene ćelije koje su prošle korz kolonu. Isprati kolonu sa 3x 3 ml pufera, pustiti da se rezervoar kolone isprazini između svakog sipiranja. Sakupiti ukupan efluent (frakcija sa neobeleženim ćelijama).

4. Ukloniti kolonu sa separatora i postaviti cevčicu sa sakupljanje.

5. Dodati 5 ml puferan na kolonu, odmah izsprati frakciju sa magnento obeleženim ćelijama primenom zatvarača za kolonu. 6. Centrifugirati ćelije u MACS puferu i resuspendovadi pelete ćelija u medijumu.

7. Izvršiti brojanje ćelija na pozitivno sleketovanim ćelijama.

71 x 20 x 5 x IO<4>= 7.1 x 10<7>ćelija/ml. Ima 1.75ml U 1.24 x IO<8>ukupnih ćelija.

8. Uzeti uzorak za proveru čisatoće sa FACS - dodati 10 |il CD14-FITC antitela i inkubirati, 5 minuta na 4-8 °C.

Priprema jedinjenja

Jedinjenja pripremti kao 10 mM u apsolutnom etanolu. Razblažiti do tražene koncentracije, pre gajenja u medijum.

Ćelijska kultura

Izolovani CD14<+>monociti su gajeni na pločama sa 24-ležišta sa 1 x IO<6>ćelija/ml/ležištu. Monociti su gajeni u prisustvu test jedinjenja i kontole pri različitim razblaženjima kao stoje dato u tabeli u daljem tekstu. Posle inkubacije preko noći, dodati su LPS (10 mg/ml) i IFNy (100 ng/ml) za stimulaciju aktivacije monocita i podizanja ekspresije CB2. Posle 48 sati, Supernatanti su uklonjeni za analizu CBA citokina.

Analiza CBAcitokina ( BenderMedSvstemshumani Thl/ Th2 Kit [ Cat # BMS716FFD

Sve pufere ugrejati do sobne temperature i pre upotrebe promućkati na vorteksu

1. Pripremiti pufer za analizu dodavanjem u 450 ml destilovane H2O i pažljivim mešanjem. Čuvati na 4 °C. 2. Pripremiti smešu biotin-konjugat dodatkom 600 ul svakog biotin-konjugata u

universal.

3. Pripremiti smešu za kuglice dodatkom 300 ul seta za sve kuglice.

4. Rekonstituisati svaki standard sa destilovanom H2O kao štoje preporučeno na nalepnici bočice. Dodati 100 ul pufera za analizu u speruvetu obeleženu kao Standard 1. Dodati 10 ul svakog rekonstituisanog standarda i pomešati. Serijski razblažiti standardnu smešu (100 ml pufera za analizu u epruvete 2-7, dodati 50 ml standarda 1 u epruvetu 2, pomešati i prebaciti 50 ul u epruvetu 3 itd.). 5. Obeležiti FACS peruvete i dodati 25 ul standarda 1-7 u označene epruvete. Dodati

25 ul pufera za zanalizu u praznu epruvetu.

6. Dodati 25ul uzorka u nazančene epruvete za uzorke.

7. Dodati 25ul smeše kuglica u sve epruvete.

8. Dodati 50 ml biotin-konjugata u sve epruvete.

9. Promuešati na vorteksu, zatim pokriti folijom i inkubirati 2 sata @ RT.

10. Pripremiti Strepavidin-PE rastvor mešanjem 176 ul u 5324ul pufera za analizu. Dodati 1 ml pufera za analizu u sve epruvete i centrifugirati na 200 x g, 5 min. Ukloniti supernatant. Ponoviti korak ispiranja i uklanjanja supernatanta. 11. Dodati 50 ml Strepavidin-PE u sve epruvete. Promućkati na vorteksu , poklopiti folijom i inkubirati lh @ RT.

12. Ponoviti korak ispiranja x2.

13. Dodati 500 ml pufera za analizu u sve epruvete.

Podešavanje protočne citometri je

Pripremiti pozitivne i negativne kuglice (dobijene sa kompletom) za optimizaciju parametara i odrediti kompenzaciju. Pripremiti standardnu krivu pre uzoraka, brojati 3000 slučajeva na zatvorenoj populaciji (300 slučajeva/analitu).

Rezultati

Rezultati su dati na Slikama 1 do 6. Na slikama, oznaka RU348 se odnosi na Izomer D.

Kao što se vidi na slikama 1 do 6, dva cis-dihidrotetrabenazin izomera B i D smanjuju proizvodnju različitih citokina u monocitima koji su stimulisani sa LPS/IFN.

Tako, Izomer B smanjuje proizvodnju citokina IL-2 i IL-12 pri svim testiranim koncentracijama i smanjuje proizvodnju citokina IL-4, IL-5 i IL-10 pri većini testiranih koncentracija.

Izomer D smanjuje proizvodnju citokina IL-2, IL-4, IL-5 i IL-12 pri svim testiranim koncetracijama i smanjuje proizvodnju citokina TNFa, IL-4, IL-5 i IL-10 pri većini testiranih koncentracija.

Primer 7

Određivanje efekta jedinjenja prredmetnog pronalaska na proliferaciju T ćelija

Jedinjenja predmetnog pronalaska su testirana za određivanje do koje mere oneva jedinjenjam ogu da inhibiraju proliferaciju T 'elija. T ćelije su odgovorne za koordinaciju adaptivnog imunog odgovora i upravljaju inflamacijom u velikom broju bolesnih stanja. Prema tome, aktivnost jedinjenja pronalaska na proliferaciju T ćelija daje dobru indikaciju o mogućnosti jedinjenja da poseduju anti-inflamatornu aktivnost.

Materijali

[0178] HBSS + 2% HEPES buffer (500 ml+10 ml), Alpha MEM(500 ml) + 2% HEPES (10 ml) + 1% Pen/strep(5 ml) + 2% L-Glutamine( 1 Omi) + 50mM 2-ME(500 ml) i Normalni serum miša (NMS)

Metode

1. Obložiti kolone 1 -8, redove A-H ploče sa 3 x 96- ležišta,sa 100ul anti-mišiji( cngl. anti- mouse)CD3 od 1 ug/ml in PBS. Ukupno 192 ležišta, pa prema tome pripremiti 24 ml u PBS-u dodavanjem 17 ul oosnovnog rastvora od 1.44mg/ml. Inkubirati 2 sata na 37 °C. 2. Sakupiti uzorke krvi od 2 balb/c miševa posle srčane punkture za pripremu NMS-a i ukloniti slezinu HBSS + Hepes. 3. Ostaviti krv na 37° C, 30 minuta da se zgruša, centrifugirati na 3,000 rpm, 10 minuta uChilspin- u.Ukloniti serum, filter sterilisati i čuvati u fruižideru do upotrebe. 4. Prebaciti slezine u petri šolje koje sadrže 10 ml HBSS, uzeti čistu metalnu mrežicu postaljenu iznad slezine da bi se ćelije oslobodile pomoću staklenog štapića. Isprati ćelij sa mrežice paterocom pipetom i prebaciti ih u epruvete od 15ml. Centrifugirati na 1000 rpm, 10 minuta na sobnoj temperaturi (RT). 5. Resuspendovati ćelije, dodato 0.5ml sterilne DW za lizu RBC, pomešano i odmah razblaženo u HBSS, prebačeno u 50 ml epruveti prolazeći kroz ćelijski filter (70uM) za uklanjanje ostataka, centrifugirati kao i prehodno, iprati ćelije još jednom u HBSS i konačno resuspendovati u 2ml alfa MEM sa dodacima (kao prethodno). 6. Ćelijsko brojanje -252 ćelija x 2 x 5 x IO<4>= 2.52 x 10<7>ćelija /ml u 4ml = 10<8>ćelija ukupno. Razblažiti 2ml do25ml dajući koncentraciju ćelija od 2 x IO<6>ćelija/ml.

7. Dodato 250 ul NMS u ćelije za koncentraciju od 1 %.

8. Isprati anti-CD3 obložene ploče 3 x PBS.

9. Prebaciti alikvote od lOOul u obložena ležišta, redovi A-H kolone 1-8 ploče sa 3 x 96-ležišta . Dodati jednaku zapreminu jedinjenja razblaženih u ploči sa 96 ležišta kao što je prikazano u daljem tekstu.

Jedinjenja

Prebaciti 3.5 ml jedinjenja 10 mM u 346.5ul medijuma (1/100), prebaciti zatim 35ul 1/100 razblaženjau 315 ul media (1/10) i tako dalje dajući seriju razblaženja 1/10 jedinjenja. Uzeti alkovote od lOOpl različitih razblaženja jedinjenja u ležišta triplkata ploča koje sadrže T ćelije.

Gajiti kulturu 48sati, zatim odati kap (16ml)<3>H-timidina u svako ležište i inkubirati preko noći na 37° C, 5% CO2. Sakupiti Meriti inkorporaciju<3>H-timidina.

Rezultati

Stepen proliferacije T ćelija, kao stoje demonistrirano nivoima inkorporacije<3>H-timidina, prikazano je podacima datim u Tabeli u daljem tekstu.

Proliferaci ja T ćelija

U Tabeli, "Nab" se odnosi naNabilone,"RU346" na Izomer D i "RU350" označava Izomer B.

Rezltati supokazali da svko jedinjenje pri najvišim testiranim koncentracijama inhibira poliferaciju T ćelija.

Primer 8

Farmaceutske Kompozicije

( ij Fomulacija tableta - I

Kompozicija tableta koja sadrži dihidrotetrabenazin predmetnog pronalaska pripremljena je mešanjem 50mg dihidrotetrabenazina sa 197mg laktoze (BP) kao razblaživačem, i 3mg magnezijum stearata kao sredstvo za klizenje i komprimovanjem na poznati način dobijaju se tablete.

( ii) Formualcija tableta-II

Kompozicija tableta koja sadrži dihidrotetrabenazin predmetnog pronalaska pripremljena je mešanjem jedinjenja (25mg) sa oksidom gvožđa, laktozom, magnezijum stearatom, belim kukurznim škrobom i talkom i i komprimovanjem na poznati način dobijaju se tablete

( iii) Formulacije kapsula

Formulacija za kapsule pripremljena je mešanjem lOOmg dihidrotetrabenazina predmetnog pronalaska sa lOOmg laktoze i punjenjem dobijene smeše u standardne neprovidne tvrde želatinske kapsule.

Ekvivalenti

Očigledno je da su moguće brojne modifikacije i izmene u spoecifičnim realizacijama pronalaska koji je prethodno opisan, bez udaljavanja od principa koji leže u osnovi predmetnog pronalaska.

Claims (10)

1. Jedinjenje 3,1 lb-ci's-dihidrotetrabenazina formule (Ia): ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za profilaksu ili lečenje inflamatorne bolesti.

2. Jedinjenje 3,1 lb-cis-dihidrotetrabenazina za upotrebu prema zahtevu 1, naznačeno time, Stoje inflamatorna bolest odabrana od reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, traumatskog artritisa, gihtnog artritisa, rubela artritisa, psoriatic artritisa, ili drugih artritičnih stanja; akutnih ili hroničnih stanja bolesti, kao što je inflamatrona reakcija indukovana endotoksinom ili inflamatorno oboljenje creva; Reiter'ovog sindroma, gihta, reumatoidnog spondilitisa, hronične inflamatorne bolesti pluća, Crohn'ova bolest i ulcerativnog kolitisa.

3. Jedinjenje 3,1 lb-ra-dihidrotetrabenazina za upotrebu prema zahtevu 2, naznačeno time, stoje inflamatorna bolest, reumatoidni artritis.

4. Jedinjenje 3,1 lb-cts-dihidrotetrabenazina za upotrebu prema jednom od zahteva 1 do 3, naznačeno time, što 3,1 lb-c/'s-dihidrotetrabenazin is u obliku adicione soli kiseline.

5. Jedinjenje 3,1 lb-cu-dihidrotetrabenazina za upotrebu prema zahtevu 4, naznačeno time, što je so, metan sulfonatna so.

6. Upotreba jedinjenja 3,11 b-cis-dihidrotetrabenazina formule (Ia): ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za profilaksu ili lečenje inflamatorne bolesti.

7. Upotreba prema zahtevu 6, naznačena time, što je inflamatorna bolesti odabrana od reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, traumatskog artritisa, gihtnog artritisa, rubela artritisa, psoriatic artritisa, ili drugih artritičnih stanja; akutnih ili hroničnih stanja bolesti, kao što je inflamatrona reakcija indukovana endotoksinom ili inflamatomo oboljenje creva; Reiter'ovog sindroma, gihta, reumatoidnog spondilitisa, hronične inflamatorne bolesti pluća, Crohn'ova bolest i ulcerativnog kolitisa.

8. Upotreba prema zahtevu 7, naznačena time, što je inflamatorna bolest, reumatoidni artritis.

9. Upotreba prema jednom od zahteva 6 do 8, naznačena time, što je 3,1Ib- cis-dihidrotetrabenazin is u obliku adicione soli kiseline.

10. Upotreba prema zahtevu 9, naznačena time, što je so, metan sulfonatna so.