ES2316420T3 - Soporte para la deteccion de genes y su uso para la deteccion de la eficacia de la terapia con interferon. - Google Patents

Soporte para la deteccion de genes y su uso para la deteccion de la eficacia de la terapia con interferon. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, comprendiendo el procedimiento determinar la identidad nucleotídica de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la región promotora del gen MxA en una muestra del individuo, correspondiendo la posición del polimorfismo con la posición 455 de la SEC ID No. 1, siendo la presencia de timina en dicha posición indicativa de la validez del tratamiento y siendo la presencia de un nucleótido distinto de timina en dicha posición indicativa de la invalidez del tratamiento.

Description

Soporte para la detección de genes y su uso para la detección de la eficacia de la terapia con interferón.
La presente invención se refiere a un vehículo para la detección génica, un procedimiento para detectar la validez del tratamiento con interferón en los individuos, un aparato para la detección génica que permita detectar la validez del tratamiento con el interferón en los individuos y un kit de detección de genes para detectar la validez del tratamiento con interferón.
En los últimos años, el número de pacientes infectados por el virus de la hepatitis C (denominado a partir de ahora VHC) ha aumentado rápidamente, llevando a un gran problema social.
Aunque se ha descubierto que el tratamiento con interferón tiene un determinado efecto sobre la hepatitis C, así como sobre otras enfermedades víricas, dicho tratamiento no es eficaz para todos los pacientes infectados y no pocos de ellos no muestran sensibilidad al interferón y no se benefician del tratamiento con esta citoquina. La continuación del tratamiento con interferón en estos pacientes que no muestran sensibilidad al interferón podría causar no sólo efectos secundarios, como fiebre y anemia, sino que también el retraso del inicio de otros tratamientos previstos.
Ronni y col. (Journal of Interferon and Cytokine Research, vol. 18, No. p 1998, pág. 773-781) describen que en los macrófagos humanos, los niveles de ARNm del gen MxA están sobrerregulados por dosis muy bajas de IFN alfa y, en menor grado, de IFN gamma, de forma dependiente de la dosis. También describen secuencias ISRE.
Chang y col. (Arch. Virol., vol. 117, 1991, pág. 1-15), Bashkirov y col, 1999, (número de acceso al EMBL X91617) e Iwashita y col, 1999, (número de acceso al EMBL AB021982) describen diversas secuencias de nucleótidos IRSE humanas o murinas o fragmentos de las mismas.
Souteyard y col. (J. Phys. Chem. B, vol. 101, 1997, pág. 2980-2985) describen la inmovilización de cadenas homooligoméricas de ADN sobre electrodos de silicona/dióxido de silicona usando 3-aminopropiltrietoxisilano.
Kikuchi y col. (Euro J. of Gastroenterology and Hepatology, vol. 10, No. 101, oct. 1998, pág. 859-863) describen el efecto de los alelos HLA sobre la respuesta al tratamiento con interferón en pacientes con hepatitis C crónica, concluyendo que HLA-B54 y HLA-A24-B54-DR4 podrían ser factores pronósticos de una mala respuesta al tratamiento con IFN en los pacientes.
El documento WO 94/02606 (Sanidad de EE.UU.) describe polipéptidos inducibles por IFN que se emplean para inhibir la expresión de genes estructurales virales y, por tanto, la replicación viral. También se describen procedimientos para evaluar la eficacia del tratamiento con interferón en los pacientes comparando los niveles de transcripción originados a partir de productos de expresión de un miembro de la familia de genes 1-8 inducidos por IFN.
El documento WO 90/14593 (Universidad de Texas) describe segmentos de ADN y procedimientos para la identificación de pacientes con cáncer que son sensibles al tratamiento con IFN alfa.
El documento WO 95/28492 (Ligand Pharma, Inc.) se refiere a elementos reguladores de ADN que comprenden mutaciones puntuales del elemento GAS Ly6E que se unen a proteínas reguladoras transcripcionales activadas en respuesta a moléculas de señalización, tales como citoquinas.
Por tanto, se ha buscado durante tiempo un procedimiento para predecir si el tratamiento con interferón es eficaz o no en los pacientes infectados por el VHC que se van a tratar pero esta predicción no ha sido en ningún momento posible.
Un objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para predecir si el tratamiento con interferón es eficaz en un paciente, antes de que se efectúe dicho tratamiento.
Según el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, comprendiendo el procedimiento determinar la identidad del nucleótido de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la región promotora del gen MxA en una muestra de un individuo, correspondiendo la posición del polimorfismo con la posición 455 de la SEC ID No. 1, siendo indicativo de la validez del tratamiento la presencia de timina en dicha posición y siendo indicativo de la invalidez del tratamiento la presencia de un nucleótido distinto a timina en dicha posición.
Según el segundo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un vehículo para la detección del gen en un procedimiento según la reivindicación 6 en el que el vehículo comprende:
\quad
un cuerpo base; y
\quad
un polinucleótido inmovilizado sobre dicho cuerpo base,
\quad
comprendiendo dicho polinucleótido inmovilizado un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC 4; y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Según el tercer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un chip de ADN en un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el chip comprende:
\quad
un cuerpo base; y
\quad
primer y segundo electrodos formados en el cuerpo base,
\quad
comprendiendo dicho primer electrodo un cuerpo conductor y al menos una secuencia polinucleotídica inmovilizada sobre dicho cuerpo conductor, seleccionándose la secuencia polinucleotídica entre el grupo compuesto por (a) a (d) mostrados a continuación;
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1 del listado de secuencias;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionada entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente,
\quad
comprendiendo dicho segundo electrodo un cuerpo conductor y al menos una secuencia polinucleotídica inmovilizada en dicho cuerpo conductor, seleccionándose la secuencia polinucleotídica entre el grupo compuesto por (e) a (h) mostrados a continuación;
(e)
el polinucleótido de SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(f)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(g)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4 y
(h)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (e), (f) y (g) mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Según el cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC según la reivindicación 1, que comprende:
1)
poner en contacto una muestra de polinucleótido de dicho individuo con un vehículo para la detección génica como se define en la reivindicación 7 y
2)
determinar la secuencia de nucleótidos del polinucleótido en dicha muestra, detectando la reacción de hibridación entre dicha muestra de polinucleótidos y el polinucleótido inmovilizado en dicho vehículo para la detección génica.
3)
determinar que el tratamiento con interferón es válido para dicho individuo si la secuencia de nucleótidos de dicha muestra de polinucleótido determinada en la etapa de determinación es la del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1 del listado de secuencias;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Según el quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:
1)
poner en contacto un polinucleótido sonda con un vehículo para la detección génica que tiene una muestra polinucleotídica tomada de dicho individuo inmovilizada en un sustrato y
2)
determinar la secuencia de nucleótidos de dicha muestra polinucleotídica detectando la reacción de hibridación entre la muestra polinucleotídica inmovilizada en dicho sustrato y dicho polinucleótido sonda;
comprendiendo dicho polinucleótido sonda un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente y
3)
determinar que el tratamiento con interferón es válido para dicho individuo cuando la secuencia de nucleótidos de dicha muestra polinucleotídica determinado comprende la secuencia del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (e) a (h) siguientes:
(e)
el polinucleótido de SEC ID No. 1 del listado de secuencias;
(f)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1;
(g)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1 y
(h)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (e), (f) y (g) mencionados anteriormente.
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Según el sexto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un aparato para la detección génica en un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, en el que el aparato comprende:
\quad
un vehículo para la detección génica como se define anteriormente;
\quad
una sección de reacción para poner en contacto un primer polinucleótido inmovilizado sobre un cuerpo base de dicho vehículo con una muestra que contiene un segundo polinucleótido marcado con un marcador, y colocar los polinucleótidos primero y segundo en condiciones de reacción de hibridación y
\quad
un aparato de detección del marcador para detectar el marcador unido a dicho segundo polinucleótido.
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Además, según el séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un aparato para la detección génica en un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, en el que el aparato comprende:
\quad
un vehículo para la detección génica como se define anteriormente,
\quad
un contraelectrodo,
\quad
un medio para la aplicación de voltaje para aplicar un voltaje entre dicho vehículo para la detección génica y dicho contraelectrodo,
\quad
una sección de reacción para poner en contacto un primer polinucleótido inmovilizado sobre un cuerpo base de dicho vehículo con una muestra que contiene un segundo polinucleótido y colocar los polinucleótidos primero y segundo en condiciones de reacción de hibridación y
\quad
una sección de medición para medir una señal eléctrica generada entre dicho vehículo para la detección génica y dicho contraelectrodo cuando se aplica voltaje mediante dicho medio de aplicación de voltaje después de dicha reacción de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Según el octavo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un kit en un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, en el que el kit comprende:
\quad
un vehículo para la detección génica como se define anteriormente; y
\quad
una solución tampón.
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Según el noveno aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un kit en un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, en el que el kit comprende:
\quad
un vehículo para la detección génica como se define anteriormente;
\quad
un agente electroactivo que reconoce la cadena doble que se une específicamente a un polinucleótido de cadena doble; y
\quad
una solución tampón.
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Según el décimo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un polinucleótido en un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, en el que el polinucleótido comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 ó SEC ID No. 4;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente,
\quad
siendo la presencia de timina en la posición 455 indicativa de la validez del tratamiento y siendo la presencia de otro nucleótido diferente a timina en dicha posición indicativa de la invalidez del tratamiento.
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La invención puede entenderse más en profundidad a partir de la siguiente descripción detallada cuando se considera junto con los dibujos que acompañan al texto, en los que:
La fig. 1 muestra un aparato para la detección génica según una realización de la presente invención.
La fig. 2 muestra un ejemplo de un aparato para la detección génica automatizada según una realización de la presente invención.
La fig. 3 muestra la secuencia de nucleótidos de la región del promotor del gen MxA.
La fig. 4 muestra el resultado de la electroforesis de RFLP usando Hhal según una realización de la presente invención.
La fig. 5 es una gráfica que muestra la comparación de la capacidad de respuesta frente a interferón \alpha, entre los promotores de MxA que tienen cuatro tipos de SNP (tipo T, tipo G, tipo A y tipo C). Los resultados se obtuvieron en células Hela usando la actividad de la luciferasa bajo el control de dichos promotores.
La fig. 6 es una gráfica que muestra la comparación de la sensibilidad al interferón \alpha, entre los promotores de MxA que tienen cuatro tipos de SNP (tipo T, tipo G, tipo A y tipo C). Los resultados se obtuvieron en células de carcinoma ovárico usando la actividad de la luciferasa bajo el control de dichos promotores.
La fig. 7 es una gráfica que muestra la comparación de la sensibilidad al interferón \beta, entre los promotores de MxA que tienen cuatro tipos de SNP (tipo T, tipo G, tipo A y tipo C). Los resultados se obtuvieron en células HeLa usando la actividad de la luciferasa bajo el control de dichos promotores.
La fig. 8 es una gráfica que muestra la comparación de la sensibilidad al interferón \beta, entre los promotores de MxA que tiende cuatro tipos de SNP (tipo T, tipo G, tipo A y tipo C). Los resultados se obtuvieron en células de carcinoma ovárico usando la actividad de la luciferasa bajo el control de dichos promotores.
La fig. 9 muestra un vehículo para la detección génica según una realización de la presente invención.
La fig. 10 muestra un vehículo para la detección génica según otra realización de la presente invención.
La fig. 11 muestra un vehículo para la detección génica según aun otra realización de la presente invención.
Los polinucleótidos de las Secuencias ID Nos. 1, 2, 3 y 4 son aquellos que contienen regiones promotoras de los genes MxA humanos, y los presentes inventores han encontrado por primera vez que el polimorfismo de un único nucleótido (denominado a partir de ahora SNP) que está presente en la posición 455 de estos polinucleótidos contribuye a la sensibilidad al efecto del tratamiento con interferón.
Los elementos de respuesta al estímulo con interferón (denominados a partir de ahora ISRE) aparecen desde la posición 441 a la 456 de cada polinucleótido.
La secuencia de nucleótidos del ISRE de la posición 441 a la 456 de la Secuencia ID No. 1 es [GGTTTCGTTTCTG
CGC] (Secuencia ID No. 5). La posición 15 del ISRE (que se corresponde con la posición 455 de la Secuencia ID No. 1) es timina. Obsérvese que según la representación habitual en la que el sitio de inicio de transcripción se denomina posición +1, la posición 455 en la Secuencia ID No. 1 se denomina posición -88.
La secuencia de nucleótidos del ISRE de la posición 441 a la 456 de la Secuencia ID No. 2 es [GGTTTCGTTTCTG
CTC] (Secuencia ID No. 6). La posición 15 del ISRE (que se corresponde con la posición 455 de la Secuencia ID No. 1) es guanina. Obsérvese que según la representación habitual en la que el sitio de inicio de la transcripción se denomina posición +1, la posición 455 en la Secuencia ID No. 1 se denomina posición -88.
La secuencia de nucleótidos del ISRE de la posición 441 a la 456 de la Secuencia ID No. 3 es [GGTTTCGTTTCTG
CAC] (Secuencia ID No. 7) y la posición 15 del ISRE (que se corresponde con la posición 455 de la Secuencia ID No. 3) es adenina. Obsérvese que según la representación habitual en la que el sitio de inicio de la transcripción se denomina posición +1, la posición 455 en la Secuencia ID No. 3 se denomina posición -88.
La secuencia de nucleótidos del ISRE de la posición 441 a la 456 de la secuencia de ID No. 4 es [GGTTTCGTTTCT
SAGCCC] (Secuencia ID No. 8) y la posición 15 del ISRE (que se corresponde con la posición 455 de la Secuencia ID No. 4) es citosina. Obsérvese que según la representación habitual en la que el sitio de inicio de la transcripción se denomina posición +1, la posición 455 en la Secuencia ID No. 4 se denomina posición -88.
A partir de ahora a lo largo de la presente memoria descriptiva, la posición 455 de las Secuencias ID Nos. 1, 2, 3 y 4 se denominan sitio SNP.
Las regiones de estos ISRE son iguales para cada secuencia, excepto en dichos sitios SNP. Se ha comprobado epidemiológicamente que aunque el tratamiento con interferón es eficaz en pacientes infectados por VHC que presentan ISRE (Secuencia ID No. 5) en los que el nucleótido 15 es una timina, dicho tratamiento no es eficaz en los pacientes infectados por VHC en los que el nucleótido 15 del ISRE (Secuencia ID No. 5) no es timina.
En otras palabras, como se describe en detalle en los ejemplos descritos más adelante, se ha comprobado que el tratamiento con interferón es menos eficaz en pacientes infectados por VHC que poseen una región promotora homocigótica que comprende el polinucleótido de Secuencia ID No. 2 que tiene guanina en la posición 455 (denominado a partir de ahora en este documento homo G/G) en comparación con los que poseen regiones promotoras heterocigóticas que comprenden el polinucleótido de Secuencia ID No. 1 que tiene timina en la posición 455 y el polinucleótido de Secuencia ID No. 2 que tiene guanina en la posición 455 (denominados a partir de ahora en este documento hetero G/T) o aquellos que tienen una región promotora homocigótica que comprende el polinucleótido de Secuencia ID No. 1 (denominado a partir de ahora en este documento como T/T).
Alternativamente, se demostró que el tratamiento con interferón era menos eficaz en pacientes infectados por VHC que tenían regiones promotoras homocigóticas de los genes MxA que no presentaban timina en la posición 455 (denominados a partir de ahora en este documento como homo no T/no T) en comparación con aquellos hetero T/no T u homo T/T. Se consideran combinaciones homo no T/no T las siguientes G/G, G/A, G/C, A/A, A/C y C/C. Las combinaciones T/no T incluyen T/G, T/A y T/C.
Por tanto, la validez del tratamiento con interferón en un paciente infectado por VHC puede detectarse antes de la administración de dicho tratamiento determinando, por ejemplo, el nucleótido del sitio SNP en el ISRE del polinucleótido que contiene las regiones promotoras del gen MxA humano que posee el paciente infectado por VHC.
En el vehículo para la detección génica según la presente invención, se utiliza el polinucleótido de Secuencia ID No. 1 que tiene timina en el sitio SNP, un fragmento o una cadena complementaria de la misma como sonda para detectar la secuencia de la cadena de ácido nucleico del polinucleótido extraído de un sujeto.
El uso de los vehículos para la detección génica, etc. de la presente invención permite examinar si dicho sitio SNP de la región promotora del gen MxA humano del sujeto es timina o no, permitiendo de ese modo predecir la validez del tratamiento con interferón en el sujeto.
Además, en los vehículos para la detección génica de la presente invención se utilizan como sondas para detectar la secuencia de ácido nucleico de los polinucleótidos extraídos del sujeto el polinucleótido de Secuencia ID No. 2 que tiene guanina en el sitio SNP, un fragmento o una cadena complementaria del mismo; el polinucleótido de Secuencia ID No. 3 que tiene adenina en los sitios SNP, un fragmento o una cadena complementaria del mismo y el polinucleótido de Secuencia ID No. 4 que tiene citosina en los sitios SNP, un fragmento o una cadena complementaria del mismo.
El uso del vehículo para la detección génica según una realización de la presente invención permite la identificación del nucleótido en el sitio SNP de las regiones promotoras del gen MxA humano del sujeto, permitiendo de este modo predecir la validez del tratamiento con interferón en el sujeto.
Los interferones utilizados en el tratamiento con interferón son los interferones \alpha, \beta, \gamma, \omega, etc.
El vehículo para la detección génica de la presente invención puede usarse para detectar la validez del tratamiento con interferón antes de aplicar el tratamiento a los pacientes que padecen estas enfermedades mencionadas anteriormente.
A continuación se describen los aspectos de la presente invención más detalladamente.
Según un aspecto, la presente invención proporciona un vehículo para la detección génica que puede utilizarse para detectar la validez del tratamiento con interferón en el paciente que padece una enfermedad en la que está indicado el tratamiento con interferón antes de la aplicación del tratamiento.
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Descripción de un vehículo para la detección génica
El vehículo para la detección génica según la realización de la presente invención puede prepararse inmovilizando el polinucleótido predeterminado sobre un cuerpo base, como una lámina sustrato, un cuerpo poroso, una placa de microvaloración, una partícula y perlas, etc.
No se limitan los materiales, el tamaño ni la forma del cuerpo base sobre el cual se inmoviliza el polinucleótido y puede usarse cualquier cuerpo base capaz de inmovilizar al polinucleótido.
Entre los ejemplos de materiales para el cuerpo base se incluyen, por ejemplo, materiales inorgánicos como silicona, vidrio, cristal de vidrio, alúmina, zafiro, forsterita, carburo de silicona, óxido de silicona, nitruro de silicona y materiales magnéticos, y materiales orgánicos como polietileno, polipropileno, poliisobutileno, tereftalato de polietileno, poliéster insaturado, resinas que contienen flúor, cloruro de polivinilo, cloruro de polivinilideno, acetato de polivinilo, alcohol de polivinilo, acetato de polivinilo, resina acrílica, poliacrilonitrilo, poliestireno, resina acetálica, policarbonato, poliamida, resina fenólica, resina de urea, resina epoxi, resina de melamina, copolímero estireno-acrilonitrilo, copolímero acrilonitrilo-butadieno-estireno, resina de silicona, óxido de polifenileno, polisulfona, nitrocelulosa, nailon, metacrilato polimetílico, polifenilensulfona, polietersulfona, cetona poliéter, copolímero de fluoroetileno y polimetilpenteno.
Adicionalmente, pueden usarse mezclas de los materiales inorgánicos y orgánicos mencionados anteriormente.
Puede usarse como procedimiento para inmovilizar el polinucleótido sobre el cuerpo base el procedimiento descrito en Science 251:767-773 (1991). Además de este procedimiento, se conoce un procedimiento mejorado para la inmovilización del polinucleótido sobre el cuerpo base y también puede usarse para inmovilizar el polinucleótido sobre el cuerpo base.
Cuando se utiliza el cuerpo base fabricado con material orgánico o de vidrio, puede lograrse una inmovilización estable de los polinucleótidos recubriendo la superficie del cuerpo base con polilisina o aminosilano.
En la presente memoria descriptiva, "polinucleótido" significa sustancias químicas formadas por la conjugación de dos o más nucleósidos mediante enlaces fosfato. "Nucleósidos" incluye, pero no están limitados a, desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos.
Además, entre los ejemplos de polinucleótidos que pueden inmovilizarse sobre el cuerpo base de la presente invención se incluyen ARN, ADN, APN, ácidos nucleicos con metilfosfonato, oligonucleótidos como S-oligo y polinucleótidos como ADNc y ARNc.
En la presente memoria descriptiva, "región promotora" indica no sólo la región directamente implicada en la reacción de inicio de la transcripción como la caja TATA, sino también se incluyen las secuencias control que se encuentran muy próximas o distantes a dicha región con influencia sobre la eficacia de la reacción de inicio de la transcripción. Por tanto, debe apreciarse que la expresión "región promotora" incluye una secuencia implicada en la reacción de inicio de la transcripción sola, una secuencia control sola y una secuencia conjugada entre ambas secuencias.
Dicho sea de paso, "ISRE" significa una secuencia de nucleótidos compuesta por aproximadamente 12 a 15 nucleótidos que se encuentra en la región de control de la transcripción del gen inducido por el estímulo de los interferones \alpha, \beta, \gamma o \omega.
Entre los ejemplos de polinucleótidos que se pueden inmovilizar sobre el cuerpo base según la presente invención se incluye el polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a) a (e) siguientes.
(a)
Polinucleótido indicado por cualquiera de las Secuencias ID Nos. 1, 2, 3 ó 4.
(b)
Un polinucleótido modificado derivado de los polinucleótidos enumerados en (a) incluyendo una o varias deleciones, sustituciones o adiciones en cualquier posición excepto en la posición 455.
Entre los ejemplos de deleción, sustitución y adición se incluyen las deleciones en las posiciones 128, 133, 152, 508 y 543, la sustitución en la posición 330 (G \rightarrowT) y la adición en la posición 501.
Además, es posible utilizar un polinucleótido combinado en el cual el polinucleótido de Secuencia ID Nos. 1, 2, 3 ó 4 o fragmentos de los mismos se conjuga(n) con al menos un polinucleótido funcional seleccionado entre el grupo compuesto por promotores, potenciadores, secuencia activadora antes del extremo 5', silenciadores, secuencia de supresión antes del extremo 5', atenuadores, cola poli A, señales de transición del núcleo, secuencia Kozak, ISRE, factores de resistencia a fármacos, genes de péptido señal, genes de dominios transmembrana, gen de la luciferina, gen de la proteína verde fluorescente, gen de ficocianina, genes de proteínas marcadores que contienen peroxidasa de rábano picante, genes de proteínas que responden a interferón y genes de proteínas que no responden a interferón.
Además, en las secuencias de nucleótidos de dichos polinucleótidos de Secuencias ID Nos. 1, 2, 3 y 4, sólo un nucleótido del sitio SNP (localizado en la posición 455) está implicado en la validez del tratamiento con interferón. Por tanto, el polinucleótido que se va a inmovilizar sobre el cuerpo base puede ser un fragmento de dicho polinucleótido que contenga el sitio SNP en la posición 455.
Cuando se usa dicho fragmento como el polinucleótido que se va a inmovilizar sobre el cuerpo base, preferiblemente este tiene una longitud no inferior a 11 nucleótidos y no superior a 30 nucleótidos. Más preferiblemente, tiene una longitud no inferior a 15 nucleótidos. Cuando el polinucleótido que se va a inmovilizar sobre el cuerpo base es demasiado largo, es difícil identificar la diferencia de un nucleótido. Por otro lado, cuando el polinucleótido que se va a inmovilizar sobre el cuerpo base es demasiado corto, es difícil de hibridar y determinar la secuencia de nucleótidos del polinucleótido incluido en la muestra.
Los polinucleótidos especialmente preferibles para su inmovilización sobre el cuerpo base son:
(c)
Un fragmento del polinucleótido de Secuencia ID Nos. 1, 2, 3 ó 4 que incluyen el sitio SNP en la posición 455, un fragmento que contiene el polinucleótido de Secuencia ID Nos. 5, 6, 7 u 8 (denominados ISRE) que se corresponde con la secuencia de la posición 441 a 456 de la Secuencia ID Nos. 1, 2, 3 ó 4.
(d)
Un fragmento de los polinucleótidos de Secuencia ID Nos. 1, 2, 3 ó 4 que incluye el sitio SNP en la posición 455, un fragmento que contiene el polinucleótido de dicha Secuencia ID Nos. 9, 10, 11 ó 12 que se corresponden con la secuencia de las posiciones 449 a 459 de la Secuencia ID Nos. 1, 2, 3 ó 4. Especialmente, puesto que el fragmento (d) tiene dicho sitio SNP aproximadamente en el centro del mismo y contiene secuencias de nucleótidos de una longitud igual en ambos lados, puede lograrse una determinación de la secuencia de nucleótidos de alta precisión. Para realizar la detección con una precisión aún mayor, es preferible un fragmento que incluya el polinucleótido correspondiente a la secuencia de las posiciones 447 a 461 de las Secuencias ID Nos. 1 a 4.
Además, un polinucleótido que se va a inmovilizar sobre el cuerpo base puede ser:
(e)
Cadenas complementarias del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente.
Apréciese que las cadenas complementarias de los polinucleótidos indicados por las Secuencias ID Nos. 5, 6, 7 y 8 (es decir, los ISRE) son las cadenas polinucleotídicas de las Secuencias ID Nos. 13, 14, 15 y 16, respectivamente.
Apréciese que las cadenas complementarias de los polinucleótidos indicados por las Secuencias ID Nos. 9, 10, 11 y 12 son las cadenas polinucleotídicas de las Secuencias ID Nos. 17, 18, 19 y 20, respectivamente.
Los vehículos para la detección génica según las realizaciones de la presente invención se usan para detectar la reacción de hibridación del polinucleótido extraído del sujeto con una sonda, usando el polinucleótido predeterminado inmovilizado sobre el cuerpo base como sonda, para determinar la secuencia polinucleotídica que contiene la región promotora del gen MxA humano del sujeto y para examinar qué tipo de nucleótido aparece en el sitio SNP.
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Procedimiento de uso de los vehículos para la detección génica
Se explica especialmente el procedimiento para la determinación de las secuencias de los polinucleótidos extraídos de un sujeto usando dicho vehículo para la detección génica.
Para llevar a cabo la secuenciación de los polinucleótidos extraídos de un sujeto usando dicho vehículo para la detección génica, pueden utilizarse dos clases de procedimientos: (1) el procedimiento que utiliza una sustancia marcadora y (2) el procedimiento electroquímico.
En primer lugar, se explica específicamente el procedimiento (1) que utiliza una sustancia marcadora.
Las muestras que contienen los polinucleótidos (fluido corporal como sangre, células sanguíneas, tejido biopsiado o células en cultivo) se toman de un sujeto en particular, que es un ser humano. Pueden ser muestras tomadas de forma arbitraria procedentes de un individuo, ya que los polinucleótidos se distribuyen ampliamente en el organismo. Una muestra preferida es la sangre.
A continuación, si es necesario, se realizan procedimientos de extracción y separación, como extracción fenólica y precipitación con etanol. Posteriormente, se realizan procedimientos de amplificación, como PCR y, luego, se extraen los polinucleótidos muestra contenidos en dicha muestra. Para la extracción de los polinucleótidos muestra pueden usarse, por ejemplo, procedimientos de extracción opcionales, distintos de la extracción fenólica y precipitación con etanol. Cuando se extrae el ARNm, puede utilizarse una columna de oligo-dT. Cuando la cantidad de polinucleótido muestra es pequeña, puede realizarse, si es necesario, una amplificación opcional de los polinucleótidos muestra.
A continuación, se lleva a cabo un procedimiento de marcaje que proporcione el polinucleótido muestra marcado con el marcador. Alternativamente, pueden mezclarse polinucleótidos marcados que contienen una sonda secundaria con las sustancias marcadoras en lugar de marcar el polinucleótido muestra.
Como marcadores detectables pueden utilizarse, pero sin limitaciones, sustancias emisoras de luz, como sustancias fluorescentes, haptenos, enzimas, isótopos radiactivos y sustancias activas del electrodo. El marcaje de los polinucleótidos muestra se realiza preferiblemente marcando la región promotora. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos para marcar la región promotora. En especial, puede ser útil la reacción de PCR usando cebadores marcados ya que pueden realizarse simultáneamente la amplificación y el marcaje.
A continuación, los polinucleótidos muestra se someten a la reacción de hibridación con el polinucleótido inmovilizado sobre el cuerpo base del vehículo de detección génica. En otras palabras, después de añadir en primer lugar dicho polinucleótido muestra marcado a la solución de la reacción para su hibridación, dicha solución de reacción se pone en contacto con el vehículo de detección génica. Cuando la muestra contiene un determinado polinucleótido complementario a la cadena polinucleotídica inmovilizada sobre el cuerpo base, el polinucleótido muestra se hibrida con el polinucleótido del cuerpo base y se inmoviliza sobre el mismo.
Con respecto a las condiciones de la reacción de hibridación, la temperatura de reacción puede oscilar de 10 a 90ºC y el tiempo de reacción puede oscilar de 1 minuto o más, a toda la noche. Durante la reacción, la velocidad de reacción puede acelerarse mediante acciones, por ejemplo de agitación y removiendo. La solución de reacción para la hibridación puede ser una solución tampón con una intensidad iónica en el intervalo de 0,01 a 5 y pH en el intervalo de 5 a 10. Pueden añadirse a la solución de reacción promotores de hibridación, como sulfato de dextrano, ADN de esperma de salmón, ADN de pectus bovino, EDTA y tensioactivos.
Posteriormente, se realiza un lavado adecuado.
A continuación, para determinar qué tipo de nucleótidos posee el sujeto en dicho sitio SNP, se realiza la detección para determinar si se ha producido o no la reacción de hibridación entre el polinucleótido de la muestra y el polinucleótido del cuerpo base.
Si se detecta que el polinucleótido de la muestra se ha hibridado con un polinucleótido que contiene timina en el sitio SNP o su cadena complementaria entre los polinucleótidos (a) a (e) se ha inmovilizado en el cuerpo base, el sitio SNP del polinucleótido que contiene la región promotora del gen MxA humano del sujeto es timina. Por otro lado, si se detecta que el polinucleótido de la muestra se ha hibridado con un polinucleótido que contiene guanina en el sitio SNP o su cadena complementaria, el sitio SNP del polinucleótido que contiene la región promotora del gen MxA humano del sujeto es guanina. Se considera igualmente válido en los casos de adenina y citosina.
Esta detección se realiza detectando el marcador en el polinucleótido marcado o la sonda secundaria marcada de la muestra, usando un aparato de detección adecuado dependiendo del tipo de marcadores. Por ejemplo, cuando el marcador es una sustancia fluorescente, éste puede detectarse usando un detector de fluorescencia. El vehículo para la detección génica puede comprender cualquier polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por los polinucleótidos (a) a (e) descritos anteriormente, inmovilizados en el cuerpo base. Específicamente, el polinucleótido puede ser al menos un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por el polinucleótido que tiene timina en el sitio SNP o su cadena complementaria, el polinucleótido que tiene guanina en el sitio SNP o su cadena complementaria, el nucleótido que tiene adenina en el sitio SNP o su cadena complementaria y el polinucleótido que tiene citosina en el sitio SNP o su cadena complementaria. En este caso, sin embargo, es necesario que el tipo de SNP del polinucleótido inmovilizado sobre el cuerpo base, así como al menos uno de los sentidos de cada polinucleótido sobre la superficie del cuerpo base y el tipo de marcador se hayan determinado con antelación. Al menos uno de los sentidos y el tipo de marcador detectable permiten determinar qué polinucleótido del cuerpo base se ha hibridado con el polinucleótido de la muestra.
En el procedimiento (1) que utiliza la sustancia marcadora, la secuencia del polinucleótido muestra puede determinarse incluso cuando el polinucleótido muestra obtenido del sujeto está inmovilizado en el cuerpo base del vehículo para detección génica. A saber, el polinucleótido muestra inmovilizado sobre el cuerpo base se pone en contacto con soluciones de polinucleótidos seleccionados de entre (a) a (e) descritos anteriormente que tienen secuencias conocidas y marcadas con antelación con marcadores diferentes en función de la diferencia de dichas SNP, para colocar ambos polinucleótidos en las condiciones de la reacción de hibridación. Si la solución contiene una cadena polinucleotídica complementaria al polinucleótido muestra inmovilizada sobre el cuerpo base, la cadena polinucleotídica complementaria se hibrida con el polinucleótido muestra del cuerpo base y queda inmovilizada en dicho cuerpo base. A continuación, detectando el tipo de sustancia marcadora inmovilizada sobre el cuerpo base, es posible detectar qué polinucleótido se ha hibridado con el polinucleótido muestra y, adicionalmente, conocer la secuencia del polinucleótido muestra en función de la secuencia conocida del polinucleótido marcado.
En el procedimiento mencionado anteriormente, cuando el polinucleótido muestra se hibrida con el polinucleótido marcado que tiene timina en el sitio SNP o su cadena complementaria, el sujeto tiene timina en dicho sitio SNP y, por tanto, puede predecirse que el tratamiento con interferón es válido en el sujeto. Por otro lado, cuando el polinucleótido muestra se hibrida con el polinucleótido marcado que tiene timina en el sitio SNP o su cadena complementaria y no se hibrida con el nucleótido marcado que tiene timina en el sitio SNP, el sujeto no tiene timina en dicho sitio SNP y, por tanto, puede predecirse que el tratamiento con interferón puede no ser válido.
A continuación, se explica especialmente el procedimiento electroquímico (2).
A diferencia del procedimiento (1) en el que la reacción de hibridación entre el polinucleótido muestra y el polinucleótido sonda se determina mediante la detección de sustancias marcadoras como se describe anteriormente, el procedimiento electroquímico (2) detecta electroquímicamente la reacción de hibridación.
En el procedimiento electroquímico, se usa un electrodo con un polinucleótido inmovilizado como vehículo para la detección génica. El electrodo con el polinucleótido inmovilizado (que se denomina a partir de ahora el electrodo de la presente invención) comprende un cuerpo base fabricado de material conductor y al menos cualquiera de los polinucleótidos (a) a (e) descritos anteriormente inmovilizados en el cuerpo base.
Aunque el material conductor preferido para el cuerpo base es el oro, pueden usarse otros materiales. Por ejemplo, pueden usarse aleación de oro, metales elementales y sus aleaciones, tales como plata, platino, paladio, silicio, germanio, galio, tungsteno y carbonos como grafito y carbón vítreo, así como sus óxidos y compuestos. Estos materiales conductores pueden moldearse sobre un sustrato independiente como una película mediante recubrimiento electrolítico, impresión, pulverización catódica y deposición por vapor.
El procedimiento de inmovilización del polinucleótido sobre el cuerpo base fabricado de material conductor no esta especialmente limitado. Por ejemplo, la inmovilización puede realizarse fácilmente utilizando la unión por afinidad entre los grupos tiol introducidos en los polinucleótidos y la superficie de oro del cuerpo base. Además, la inmovilización puede ser posible mediante adsorción física, adsorción química, enlace hidrófobo, inclusión y enlace covalente. Además, puede emplearse la unión biotina-avidina y el uso de agentes de condensación como las carbodiimidas. En estos casos, la inmovilización puede facilitarse cuando la superficie conductora del cuerpo base se modifica con moléculas que tienen grupos funcionales. Además, para suprimir la absorción inespecífica de los polinucleótidos sobre la superficie del cuerpo base, la superficie se recubre deseablemente con mercaptanos como mercaptoetanol o lípidos como estearilamina.
Como ejemplo, a continuación se describe un procedimiento para inmovilizar el polinucleótido sobre un cuerpo base de oro. En primer lugar, el cuerpo base de oro se somete a un tratamiento de activación tras el cual se lava con agua desionizada. Para la activación se emplea una solución de ácido sulfúrico de 0,1 a 10 mmol/l. En esta solución, el voltaje se registra en los intervalos de -0,5 a 2 V (frente a Ag/AgCl) y 1 v/s a 100.000 v/s. Este tratamiento activa la superficie del sustrato de oro en las condiciones en las que se inmovilizan los polinucleótidos sobre la misma.
Por otro lado, se introducen grupos tiol en los extremos 5' y 3' de los polinucleótidos sonda que se van a inmovilizar. Los polinucleótidos tiolados se mantienen disueltos en una solución de agente reductor como DTT, y el DTT se elimina justo después de su uso mediante filtración en gel o extracción con acetato de etilo. Para la inmovilización, se disuelve la sonda en el intervalo de 1 ng/ml a 1 mg/ml en una solución tampón de intensidad iónica de 0,011 a 5 y pH de 5 a 10, y el sustrato se sumerge en la solución justo antes de la activación. La reacción de inmovilización se realiza de 4 a 100ºC durante 10 minutos durante toda la noche. Tras la inmovilización del polinucleótido, el cuerpo base se mantiene deseablemente en condiciones en las que no existan enzimas que descompongan el ácido nucleico (nucleasas) y, posiblemente, en la oscuridad.
Para la inmovilización de los polinucleótidos sobre el cuerpo base pueden usarse aparatos de inmovilización como el aplicador en manchas de ADN y el distribuidor de ADN en matrices para inmovilizar los polinucleótidos de forma relativamente fácil. Se utiliza deseablemente un aplicador de tipo inyección o tipo electricidad estática para evitar dañar la superficie del sustrato. Adicionalmente, es posible sintetizar los polinucleótidos directamente sobre el sustrato.
Es deseable que el electrodo de la presente invención se construya como el denominado chip de ADN en el cual el conductor y el electrodo estén conectados eléctricamente y se dispongan sobre el mismo cuerpo base. El chip de ADN se fabrica disponiendo los conductores como conexiones metálicas adecuadamente recubiertas con materiales aislantes sobre el cuerpo base (deseablemente un cuerpo base aislante), seguido de la conexión eléctrica del electrodo (en el cual se han inmovilizado previamente los polinucleótidos predeterminados) a los conductores.
Es necesario inmovilizar polinucleótidos de secuencias diferentes sobre una pluralidad de electrodos diferentes que estén aislados entre sí. En la disposición de los diversos electrodos sobre un cuerpo base, el número de electrodos que se disponen sobre un sustrato pueden ser prácticamente de 10^{1} a 10^{5}.
Cuando los diversos electrodos de la presente invención se disponen sobre un mismo cuerpo base, las líneas de análisis pueden disponerse además para localizar elementos de cambios en cada cruce entre dichos conductores y las líneas de análisis. Esto permite una determinación rápida de si se produce reacción de hibridación o no en cada electrodo, aplicando voltaje a un electrodo tras otro. Para detectar que se produce la reacción de hibridación usando el electrodo, se proporciona al menos un contraelectrodo y un electrodo de referencia, si es necesario, del mismo modo que en otros procedimientos de detección electroquímica normales. Cuando se emplea el electrodo de referencia, puede usarse un electrodo de referencia normal, como un electrodo de plata/cloruro de plata y de mercurio/cloruro de mercurio. Estos electrodos se disponen deseablemente sobre el mismo cuerpo base sobre el que dispone el electrodo de la realización de la presente invención.
Para determinar la secuencia de los polinucleótidos tomados de los sujetos usando el electrodo de la presente invención, se realizan las siguientes acciones.
En primer lugar, se toma un polinucleótido muestra de un ser humano en el cual, opcionalmente, se realizan la extracción, amplificación y marcaje con un marcador, mencionados anteriormente. Estos procedimientos son similares a los del procedimiento (1). Sin embargo, no se requiere necesariamente el marcaje.
A continuación, la solución que contiene dicha muestra se pone en contacto con el electrodo para colocar el polinucleótido muestra y el polinucleótido inmovilizado sobre el cuerpo base en las condiciones de la reacción de hibridación. En caso de que el polinucleótido muestra contenga la cadena complementaria del polinucleótido del cuerpo base, el polinucleótido muestra complementario hibrida con el polinucleótido inmovilizado sobre la base. El procedimiento y las condiciones son las mismas que las del procedimiento (1). A continuación se lavan los
electrodos.
Posteriormente, se añade una solución de un agente electroactivo que reconoce la cadena doble al sistema de la reacción de hibridación intercalándose así el agente que reconoce la cadena doble dentro del polinucleótido de cadena doble formado por hibridación del polinucleótido inmovilizado en el electrodo y el polinucleótido muestra. La aparición de hibridación entre el polinucleótido muestra y el polinucleótido inmovilizado sobre el cuerpo base puede detectarse aplicando voltaje al electrodo y al contraelectrodo. Cuando se aplica voltaje, se genera la señal eléctrica a partir del agente que reconoce la cadena doble intercalado en el polinucleótido de cadena doble que se ha formado mediante la hibridación. Por tanto, la señal eléctrica indica que se ha producido la hibridación.
El agente electroactivo que reconoce la cadena doble utilizado aquí no está especialmente limitado y, por ejemplo, pueden usarse Hoechst 33258, naranja de acridina, quinacrina, daunomicina, metalointercalador, bisintercaladores como bisacridina, trisintercaladores, polintercaladores, etc. Pueden usarse complejos de metales como rutenio, cobalto y hierro denominados metalointercaladores, así como compuestos orgánicos como dibromuro de etileno. Además, también pueden usarse compuestos de unión a surcos como Hoechst 33258 y los colorantes de cianina y sustancias biológicas de alto peso molecular como antibióticos y enzimas.
La concentración del agente que reconoce la cadena doble varía dependiendo de los tipos, pero generalmente se utilizan en el intervalo de 1 ng/ml a 1 mg/ml. Aquí se usa una solución tampón con intensidad iónica en el intervalo de 0,001 a 5 y pH en el intervalo de 5 a 10.
Después de que el electrodo reaccione con el agente que reconoce la cadena doble, opcionalmente puede lavarse de nuevo el electrodo. Posteriormente, el electrodo de la presente invención se utiliza como electrodo de trabajo y se aplica voltaje entre el electrodo de trabajo y un contraelectrodo proporcionado por separado para detectar la señal electroquímica determinando la corriente eléctrica entre los dos electrodos. Aunque puede detectarse una señal electroquímica con estos dos electrodos (electrodos de trabajo y contraelectrodo), la detección también puede realizarse usando tres electrodos, es decir, electrodos de trabajo, contraelectrodo y de referencia. Para la detección de la señal electroquímica, puede analizarse el voltaje a velocidad constante o aplicado por pulsos, o puede aplicarse un voltaje constante. Para su determinación, la corriente eléctrica y el voltaje se controlan usando aparatos como potenciostatos, polímetros digitales y generadores de funciones. La concentración de genes diana puede calcularse a partir de curvas de calibrado basadas en los valores reales obtenidos.
Entre los polinucleótidos (a) a (e) descritos anteriormente, el polinucleótido que tiene timina en el sitio SNP y su cadena complementaria, el polinucleótido que tiene guanina en el sitio SNP y su cadena complementaria, el polinucleótido que tiene adenina en el sitio SNP y su cadena complementaria y el polinucleótido que tiene citosina en el sitio SNP y su cadena complementaria se inmovilizan deseablemente sobre electrodos independientes que están aislados entre sí y compuestos del mismo sustrato para formar un chip de ADN para realizar una determinación de gran precisión. En este caso, la señal electroquímica correspondiente con cada polinucleótido se detecta a partir de cada electrodo.
La secuencia del polinucleótido muestra también puede determinarse mediante el procedimiento electroquímico (2) usando un electrodo sobre el que se inmoviliza el polinucleótido muestra tomado de un sujeto. Por tanto, el polinucleótido en la solución y el polinucleótido muestra sobre el electrodo se colocan en las condiciones de la reacción de hibridación poniendo en contacto una solución de uno cualquiera de los polinucleótidos (a) a (e) de los que se conocen previamente sus secuencias. Si la cadena complementaria del polinucleótido muestra está presente en la solución, el polinucleótido complementario se inmoviliza sobre el cuerpo base a través de la hibridación con el polinucleótido muestra previamente inmovilizado sobre el cuerpo base. La secuencia del polinucleótido muestra puede conocerse detectando la reacción de hibridación.
Cuando se detecta la reacción de hibridación del polinucleótido muestra con el polinucleótido que tiene timina en el sitio SNP, o su cadena complementaria se detecta mediante el procedimiento mencionado anteriormente, el sujeto posee timina en el sitio SNP y, por tanto, puede predecirse que el tratamiento con interferón es válido. Por otro lado, cuando se detecta la reacción de hibridación del polinucleótido de la muestra con el polinucleótido que tiene otras bases diferentes a timina en el sitio SNP o su cadena complementaria, y no se detecta la reacción de hibridación con el polinucleótido que tiene timina en dicho sito SNP o su cadena complementaria, el sujeto no tiene timina en dicho sitio SNP y, por tanto, se detecta que el tratamiento no es válido.
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Aparato de detección eléctrica
A continuación se describe un ejemplo del aparato de detección génica para determinar la secuencia del polinucleótido que se extrae de un sujeto usando el electrodo de la realización de la presente invención. A saber, este es un aparato de detección génica que comprende un electrodo de la realización de la presente invención, una sección de reacción para realizar la reacción de hibridación con el polinucleótido inmovilizado sobre el electrodo, un medio para aplicar voltaje al polinucleótido inmovilizado sobre el electrodo y un medio para medir la señal generada mediante la acción del voltaje aplicado.
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Construcción básica del aparato de detección eléctrica
La fig. 1 muestra la realización de este aparato para la detección génica. En la fig. 1, el número 11 indica el electrodo que tiene el polinucleótido 12 inmovilizado sobre el mismo. El número 13 muestra el recipiente de reacción. Una fuente de alimentación 14 se conecta de modo que forme un circuito con el electrodo 11 y el recipiente de reacción 13. Se disponen en el circuito un amperímetro 15, un voltímetro 16 y una resistencia eléctrica variable 17 para permitir la aplicación de voltaje y medir la corriente en el circuito después de que tenga lugar la reacción de hibridación en el recipiente de reacción 13.
Para realizar la detección usando el aparato para la detección génica de la fig. 1, la solución tampón y la muestra que contiene el polinucleótido tomado de un sujeto se colocan en el recipiente de reacción 13 y se realiza la reacción de hibridación entre el polinucleótido muestra y el polinucleótido 12 inmovilizado sobre el electrodo 11. Las condiciones de temperatura y tiempo para la hibridación son las descritas previamente. A continuación, preferiblemente después de lavar el recipiente de reacción 13 y el electrodo 11, el recipiente de reacción 13 se llena con la solución de hibridación que contiene una sustancia intercalante. Posteriormente, se enciende la fuente de alimentación 14 y se mide la corriente o el voltaje usando el amperímetro 15 y el voltímetro 16.
Aunque la fig. 1 muestra la realización del aparato para detección génica de la presente invención, el aparato para detección génica de la presente invención puede tener una construcción más sofisticada como se muestra en la fig. 2, para una detección completamente automatizada.
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Construcción de un aparato de detección eléctrica automático
El aparato de detección 20 mostrado en la fig. 2 comprende un soporte para el electrodo 21 para mantener el electrodo con el polinucleótido inmovilizado, un recipiente de reacción 22, el primer recipiente de lavado 23, un recipiente de reacción de intercalado 24, el segundo recipiente de lavado 25, un sistema de transferencia 27 que porta el recipiente de medición electroquímica 26, una unidad de análisis 28 y una unidad de operación 29. La transferencia de electrodos entre estos recipientes se consigue moviendo el electrodo usando el sistema de transferencia 27.
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Procedimiento de uso del aparato de detección eléctrica
El procedimiento de uso del aparato de detección 20 es el siguiente.
En primer lugar, la solución que contiene la muestra o el polinucleótido previamente extraído de la muestra se aloja en el recipiente de reacción 22 y el electrodo fijado al soporte del electrodo 21 se sumerge en el recipiente de reacción 22. A continuación, después de que la reacción de hibridación tenga lugar en el recipiente de reacción 22, el soporte del electrodo 21 se transfiere al primer recipiente de lavado 23. Se realiza el lavado en el primer recipiente de lavado 23 para eliminar los ácidos nucleicos y proteínas unidas no específicamente al electrodo. Tras el lavado, el soporte del electrodo 21 se transfiere al recipiente de reacción de intercalación 24, para insertar la sustancia intercalante dentro del polinucleótido de cadena doble formado mediante la reacción de hibridación. A continuación, el soporte del electrodo 21 se transfiere al segundo recipiente de lavado 25. Tras el lavado, el soporte del electrodo 21 se transfiere de nuevo al recipiente de medida electroquímica 26 para realizar las determinaciones electroquímicas. Tras completar las determinaciones, se obtiene la concentración del polinucleótido en la muestra en referencia con la línea de calibrado previamente registrada en la unidad de análisis 28. La operación descrita anteriormente se realiza mediante la unidad de operación 29 conectada eléctricamente con cada recipiente y unidad.
La presente invención proporciona el uso de un kit que comprende el vehículo para la detección génica de la presente invención y una solución tampón.
Es conveniente proporcionar el vehículo para la detección génica y la solución tampón en un kit puesto que la detección puede realizarse inmediatamente.
La solución tampón que se va a usar en el kit puede ser una solución tampón arbitraria utilizada en reacciones de hibridación. Por ejemplo, pueden utilizarse, pero sin limitaciones, una solución tampón fosfato, una solución tampón carbonato y tampón tris.
Se aprecia que pueden incluirse en el kit los cebadores para la amplificación de genes, los nucleótidos marcados con colorante fluorescentes, enzimas, columnas para purificación, etc., junto o en lugar de las soluciones
tampón.
La presente invención proporciona el uso de un kit que comprende el electrodo y el agente que reconoce la cadena doble.
Los agentes que reconocen la cadena doble que se utilizan en el kit de la presente invención pueden ser, por
ejemplo, los agentes que reconocen la cadena doble descritos anteriormente con el electrodo de la presente
invención.
Los cebadores para la amplificación de genes, enzimas, soluciones tampón, nucleótidos, etc., pueden incluirse en el kit junto con o en lugar del agente de cadena doble.
La presente invención se explicará a continuación con más detalle mediante ejemplos.
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Ejemplo 1
En este ejemplo, se ha comprobado que los pacientes con VHC que tienen un gen MxA homocigótico o heterocigótico que tiene timina en la posición 88 (que se corresponde con la posición 455 de la secuencia de nucleótidos de la Secuencia ID No. 1) en la región promotora (descrito a partir de ahora como MxA(T)) muestran mejor respuesta al tratamiento con interferón que los pacientes con VHC que tienen un gen MxA homocigótico con guanina en esta posición (descrito a partir de ahora como MxA(G)).
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Sujeto
Tomaron parte en este estudio 115 pacientes en los que se comprobó histológicamente que sufrían de hepatitis C crónica y que estaban recibiendo tratamiento con interferón y 42 personas sanas con prueba negativa para anticuerpos anti-VHC. Todos ellos eran japoneses y no presentaban relación de consanguinidad entre sí.
Entre los 115 pacientes, 52 estaban en el nivel normal de alanina aminotransferasa sérica durante el periodo de seguimiento de al menos 6 meses después de completar el tratamiento con interferón, y presentaron una respuesta mantenida (descritos a partir de ahora como RM) con el ARN del VHC siempre negativo y 63 pacientes siguieron siendo positivos para el ARN del VHC durante el periodo de seguimiento independientemente del nivel de ALT, o sin respuesta con recaída de la hepatitis C (denominados a partir de ahora como SR). Se administró a todos los pacientes una dosis total de más de 300 millones de unidades de interferón \alpha y/o \beta.
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Análisis del gen MxA
Se extrajeron los ácidos nucleicos de las muestras de PBMC procedentes de los pacientes y los controles sanos. Dichos ácidos nucleicos se sometieron a PCR para amplificar un ADN con 599 nucleótidos que contiene la región promotora de los genes MxA.
El esquema de la PCR fue el siguiente.
Tras mezclar 0,05 \mug de ácido nucleico con Taq-Gold (Perkin-Elmer), el cebador oligonucleotídico #MXAF01 de Secuencia ID No. 12 (cebador sentido, posiciones 569 a 540) y el cebador oligonucleotídico #MXAF02 de Secuencia ID No. 6 (cebador antisentido, posiciones 30 a 1), la reacción se realizó en las condiciones de ciclo de [95ºC/10 minutos], [95ºC/10 segundos, 68ºC/60 segundos] x 55, [72ºC/ 7 minutos]. Mediante la secuenciación directa de los productos de PCR, se determinaron las secuencias de 12 de las 157 muestras.
Tras la identificación de los sitios SNP en las regiones amplificadas por secuenciación, se establecieron sistemas de RFLP para la detección de nucleótidos de alelos de forma distinguible. Los productos de PCR de 599 nucleótidos de todos los pacientes se digirieron con Hhal (GCG \downarrow C) y se examinó si se formaban o no una o ambas bandas de 482 nucleótidos y 533 nucleótidos mediante electroforesis en un gel de agarosa.
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Análisis estadístico
Los datos de grupo se compararon mediante la prueba de probabilidad precisa de Fischer con o sin la corrección de Yate. En la prueba se consideró 0,05 como estadísticamente significativo.
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Resultado
A partir de la secuenciación de 12 muestras, se identificaron los sitios SNP en la región promotora de los genes MxA. Se encontraron SNP (G y T) en la posición 88 de dicha región promotora, estando contenido dicho SNP en las regiones similares al ISRE mostradas en la fig. 3.
En el RFLP mediante HhaI que siguió, se determinaron los tipos de genes MxA de las 157 muestras. En este ensayo, las muestras que tenían guanina en los sitios SNP mostraban una banda de 482 pares de bases en el gel de electroforesis. Por otro lado, cuando la guanina se sustituye por timina, aparece una banda de 533 pares de bases, ya que desaparece el sitio de restricción reconocido por Hhal. En el caso del heterocigoto en el que una región promotora tiene guanina en el sitio SNP y la otra región promotora tiene timina en el sitio SNP, se detectan ambas bandas de 482 y 533 pares de bases (véase la fig. 4).
Como se muestra en la Tabla 1, el 62% de los pacientes del grupo NR presentaban la región promotora homocigótica que tenía guanina en el sitio SNP (Homo G\cdotG), mientras que el 33% de los pacientes en el grupo RM eran Homo G\cdotG (p=0,0009; RM frente a SR). Por el contrario, el 35% de los pacientes del grupo SR eran heterocigóticos que poseían una región promotora con guanina en el sitio SNP y otra región promotora con timina en el sitio SNP (Hetero G\cdotT), mientras que el 60% de los pacientes del grupo RM eran Hetero G\cdotT (p=0,0082; RM frente a SR). Los pacientes de Homo T\cdotT eran el 3,2% en el grupo SR y el 10% en el grupo RM, respectivamente (p=0,018; RM frente a SR).
Mientras que la frecuencia de alelos que tenía regiones promotoras en las que el sitio SNP es guanina era del 0,606 en el grupo SR, ésta era del 0,794 en el grupo NR (p=0,0018; SR frente a NR).
TABLA 1
1
*Se aplicó la revisión de Yate
Además del resultado anterior que indica que los individuos con Homo G\cdotG son significativamente menos en el grupo RM que en el grupo SR, estaba claro que era independiente del tipo de genes del VHC con el que están infectados los pacientes.
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TABLA 2
2
*Se aplicó la revisión de Yate
Resulta evidente a partir de la Tabla 2 que tanto en el grupo de pacientes infectados con VHC (grupo 1b del VHC) del tipo génico 1b como el grupo de pacientes infectados con VHC (grupo 2a/2b del VHC) del tipo génico 2a o 2b, el 62% eran individuos Homo G\cdotG en el grupo NR, mientras que en el grupo SR el 28% y el 32% eran individuos Homo G\cdotG. El resultado mostrado en la Tabla 2 revelaba que los individuos Homo G\cdotG son significativamente menos en el grupo SR independientemente del tipo génico del VHC con que los pacientes estaban infectados (grupo 1b del VHC, p=0,0321, grupos 2a/2b del VHC; p=0,0318).
En resumen, el ejemplo presente probaba que los pacientes infectados con VHC que poseían una región promotora del gen MxA homocigótica o heterocigótica que tenía timina en el sitio SNP respondían mucho más al tratamiento con interferón independientemente del tipo génico del VHC con el que estaba infectados.
Además, el ejemplo presente también sugiere que los pacientes infectados por el VHC que tenían regiones promotoras del gen MxA homocigóticas o heterocigóticas que no tenían guanina en el sitio SNP eran muy sensibles al tratamiento con interferón.
Además, este hallazgo puede ser aplicable a enfermedades diferentes a la hepatitis C, ya que dichos sitios SNP se encuentran en los ISRE.
Ejemplo 2
Como queda claro en el Ejemplo 1, el tratamiento de la hepatitis mediante la administración de interferón es muy eficaz en los pacientes infectados por VHC cuya SNP del promotor del gen MxA sea del tipo T. Por otro lado, en el caso en que el SNP sea de tipo G, el tratamiento es menos eficaz. Estos hechos se interpretan como sigue: mientras que el tipo T de secuencia de nucleótidos del ISRE responde correctamente al estímulo del interferón para conseguir suficiente producción de proteínas MxA, el tipo G con una base diferente en la secuencia no responde al estímulo del interferón, lo que da lugar a una menor producción de proteínas MxA.
Desde este punto de vista de la situación, también se asume que el tratamiento con interferón es menos eficaz en pacientes con hepatitis por VHC que tienen SNP de los tipos C y A del promotor del gen MxA, ya que los promotores del MxA no responden al interferón como en el caso del tipo G.
Para comprobarlos, se construyó un plásmido que tenía el gen de la luciferasa después del extremo 3' del promotor del gen MxA y se transfectó en células humanas (células HeLa y células de carcinoma ovárico). A continuación, se examinaron las actividades de la luciferasa resultado de la respuesta del promotor del gen MxA al interferón en cada caso de promotores de MxA con alguno de los 4 tipos de SNP (tipos T, G, A y C).
Los resultados se muestran en las figs. 5 a 8. La fig. 5 es el ejemplo de inducción en células HeLa usando interferón \alpha, la fig. 6 es el ejemplo de inducción en células de carcinoma ovárico usando interferón \alpha, la fig. 7 es el ejemplo de inducción en células HeLa usando interferón \beta y la fig. 8 es el ejemplo de inducción en células de carcinoma ovárico usando interferón \beta. En estas figuras, + indica actividad de la luciferasa cuando se añadía interferón, y - indica actividad de la luciferasa cuando no se añadía interferón. Todos los resultados son valores medios de tres experimentos y las desviaciones típicas se muestran mediante barras.
Resulta evidente a partir de las figuras que el promotor del gen MxA de tipo T muestra los valores más altos en todos los casos. Por otro lado, la respuesta a los interferones \alpha y \beta de los pacientes con hepatitis por VHC que tienen SNP de tipos A y C es baja en el caso del tipo G y, por tanto, se predice que el efecto del tratamiento con interferón será bajo.
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Ejemplo 3
En el presente ejemplo, el procedimiento para predecir la validez del tratamiento con interferón usando el vehículo para la detección génica de la presente invención se explica en referencia a la fig. 9.
En primer lugar, en la preparación del vehículo para la detección génica se usaron los cebadores de Secuencias ID Nos. 21 y 22 para amplificar el fragmento de tipo T 31, que es un fragmento del polinucleótido de Secuencia ID No. 1 que contiene timina en el sitio SNP y el fragmento de tipo G 32 que es un polinucleótido de Secuencia ID No. 2 que contiene guanina en el sitio SNP. El producto se ajusta para obtener soluciones de 2 \mug/\mul usando agua destilada.
A continuación, se añadieron cantidades iguales de nitrocelulosa a 4 mg/ml (solución en DMSO) a la solución y, después se realizó la desnaturalización térmica, seguida de la colocación de la solución resultante en portaobjetos recubiertos de polilisina 33. Tras el secado, las manchas se fijaron mediante radiación UV para obtener vehículos para la detección génica en los que estaban inmovilizados el fragmento de tipo T 31 y el fragmento de tipo G 32.
A continuación, tras la amplificación del polinucleótido muestra extraído a partir de la sangre del sujeto usando cebadores de Secuencias ID Nos. 20 y 21, se usó el sistema de marcaje ECL de Pharmacia para realizar el marcaje con FITC y la muestra se hizo reaccionar con los vehículos preparados previamente para la detección génica durante 12 horas a 65ºC. Después de la reacción, se midieron las señales usando un detector de fluorescencia.
Como resultado, se observó la señal de fluorescencia de las manchas en las que estaba inmovilizado el fragmento de tipo T, lo que mostraba que el SNP del polinucleótido muestra usado en el experimento era de tipo T.
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Ejemplo 4
En el presente ejemplo, el análisis usando el vehículo para la detección génica en el cual el fragmento del nucleótido muestra derivado de un sujeto está inmovilizado, se explica en referencia a la fig. 10.
Los fragmentos de polinucleótidos derivados de un sujeto se amplificaron usando cebadores de Secuencias ID Nos. 21 y 22 (muestra A: 41, muestra B: 42) y el producto resultante se ajustó para obtener soluciones de 2 \mug/\mul usando agua destilada. A continuación se añadieron a la solución cantidades iguales de nitrocelulosa a 4 mg/ml (solución en DMSO). Tras la desnaturalización térmica, la solución se colocó en portaobjetos recubiertos de polilisina 43. Además, tras el secado, las manchas se fijaron mediante radiación UV para preparar el vehículo para la detección génica (un chip de ADN).
\newpage
El fragmento de tipo T marcado previamente con fluorescencia que es un polinucleótido de Secuencia ID No. 1 que contiene timina en el sitio SNP (marcaje JOE); el fragmento de tipo G marcado previamente con fluorescencia que es un polinucleótido de Secuencia ID No. 2 que contiene guanina en el sitio SNP (marcaje 5-FAM); el fragmento de tipo A marcado previamente con fluorescencia que es un polinucleótido de Secuencia ID No. 3 que contiene adenina en el sitio SNP (marcaje TAMRA); y el fragmento de tipo C marcado previamente con previamente fluorescencia que es un polinucleótido de Secuencia ID No. 4 que contiene citosina en el sitio SNP (marcaje ROX) se hicieron reaccionar con el chip de ADN preparado previamente durante 1 hora a 50ºC.
Tras la reacción, la señal se midió usando un detector de fluorescencia. Como resultado, sólo se obtuvo la señal debido a la fluorescencia de HEX y se encontró que el SNP del polinucleótido de la muestra era sólo de tipo T.
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Ejemplo 5
En el ejemplo presente, el vehículo para la detección génica que utiliza detección electroquímica se explica en referencia a la fig. 11.
Los cebadores de Secuencias ID Nos. 21 y 22 se utilizaron para amplificar el fragmento de tipo T 51 de Secuencia ID No. 1 y el fragmento de tipo G 52 de Secuencia ID No. 2, y el producto resultante se ajusta para obtener soluciones de 2 \mug/\mul usando agua destilada. A continuación se introdujeron grupos tiol en los extremos de los productos amplificados mediante reacción con disulfuro de 2-hidroxietilo y ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)-carbodiimida. Se colocaron en un electrodo de oro 53 previamente preparado y se hicieron reaccionar durante 1 hora evitando que se secara.
La muestra se amplificó usando cebadores de Secuencias ID Nos. 21 y 22, se desnaturalizó térmicamente y, a continuación, se hizo reaccionar con un chip de ADN previamente preparado. Después de la reacción, se realizó una determinación del voltaje en una solución de Hoechst 33258 a 10 \mumol/l para determinar la oxidación real del Hoechst 33258. Como resultado, se obtuvo una señal significativa sólo a partir del electrodo en el cual se había inmovilizado el fragmento de tipo G, lo que indicaba que la muestra era de tipo G.
<110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA
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<120> Vehículo para detección génica y su uso para detectar la eficacia del tratamiento con interferón
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<130> A000001162
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<140>
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<141>
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<160> 22
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 581
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 581
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 581
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 581
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
24

Claims (30)

1. Un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC, comprendiendo el procedimiento determinar la identidad nucleotídica de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la región promotora del gen MxA en una muestra del individuo, correspondiendo la posición del polimorfismo con la posición 455 de la SEC ID No. 1, siendo la presencia de timina en dicha posición indicativa de la validez del tratamiento y siendo la presencia de un nucleótido distinto de timina en dicha posición indicativa de la invalidez del tratamiento.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la identidad del SNP es timina.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la identidad del SNP es guanina.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la identidad del SNP es adenina.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la identidad del SNP es citosina.
6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende poner en contacto un vehículo para la detección génica con una muestra del individuo y determinar la identidad del nucleótido del SNP en función de la hibridación del promotor con un polinucleótido inmovilizado sobre el vehículo.
7. Uso de un vehículo para detección génica en un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el vehículo comprende:
un cuerpo base; y
un polinucleótido inmovilizado sobre dicho cuerpo base,
comprendiendo dicho polinucleótido inmovilizado un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que la longitud del polinucleótido que se va a inmovilizar sobre dicho cuerpo base no es más corta de 15 nucleótidos ni más larga de 30 nucleótidos.
9. Uso según la reivindicación 7, estando compuesto dicho cuerpo base por una sustancia conductora y en el que dicho vehículo para detección génica se utilizada como un electrodo.
10. Uso de un chip de ADN en un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el chip comprende:
un cuerpo base; y
un primer y segundo electrodos formados en el cuerpo base,
comprendiendo dicho primer electrodo un cuerpo conductor y al menos una secuencia polinucleotídica inmovilizada sobre dicho cuerpo conductor, seleccionándose la secuencia polinucleotídica entre el grupo compuesto por (a) a (d) mostrados a continuación;
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1 del listado de secuencias;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SED ID No. 1;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SED ID No. 1 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente,
comprendiendo dicho segundo electrodo un cuerpo conductor y al menos una secuencia de polinucleótidos inmovilizada sobre dicho cuerpo conductor, seleccionándose el polinucleótido entre el grupo compuesto por (e) a (h) mostrados a continuación;
(e)
el polinucleótido de SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(f)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(g)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4, y
(h)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionada entre el grupo compuesto por (e), (f) y (g) mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Uso según la reivindicación 7 ó 10, en el que la longitud del polinucleótido que se va a inmovilizar sobre dicho cuerpo base no es más corta de 15 nucleótidos ni más larga de 30 nucleótidos.
12. Un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC según la reivindicación 1, que comprende:
1) poner en contacto un polinucleótido muestra de dicho individuo con un vehículo para la detección génica como se define en la reivindicación 7 y
2) determinar la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de dicha muestra, detectando la reacción de hibridación entre dicha muestra de polinucleótidos y el polinucleótido inmovilizado sobre dicho vehículo para la detección génica.
3) determinar que el tratamiento con interferón es válido para dicho individuo si la secuencia de nucleótidos de dicho polinucleótido muestra determinado mediante la etapa de determinación es la del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1 del listado de secuencias;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1.
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SED ID No. 1 y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que la muestra de polinucleótidos se marca con un marcador, antes de la etapa de poner en contacto la muestra de polinucleótidos con el vehículo para la detección
génica.
14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que el marcador comprende al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por colorante fluorescente, hapteno, enzima, isótopo radiactivo y la sustancia activa del electrodo (electroactiva).
15. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que el vehículo para la detección génica es el vehículo para la detección génica que se define en la reivindicación 9 y la detección de la reacción de hibridación en la etapa de determinación de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido en dicha muestra se realiza detectando los cambios electroquímicos que acompañan a dicha reacción de hibridación.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la detección del cambio electroquímico se realiza midiendo una señal eléctrica generada entre dicho vehículo para la detección génica y un contraelectrodo cuando se aplica voltaje entre dicho vehículo para la detección génica y el contraelectrodo.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que se añade un agente electroactivo que reconoce la cadena doble que se une específicamente a un polinucleótido de cadena doble a dicho sistema de reacción de hibridación y la señal eléctrica generada entre dicho vehículo para la detección génica y dicho contraelectrodo se genera directa o indirectamente a partir del agente electroactivo que reconoce la cadena doble.
\newpage
18. Un procedimiento para determinar la validez del tratamiento con interferón en un individuo infectado por VHC según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:
1) poner en contacto un polinucleótido sonda con un vehículo para la detección génica que tiene una muestra de polinucleótidos tomada de dicho individuo, inmovilizada sobre un sustrato y
2) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha muestra de polinucleótidos detectando la reacción de hibridación entre la muestra de polinucleótidos inmovilizada sobre dicho sustrato y dicho polinucleótido sonda;
comprendiendo dicho polinucleótido sonda un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
el polinucleótido de SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(b)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(c)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4; y
(d)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente y
3) determinar que el tratamiento con interferón es válido para dicho individuo si la secuencia de nucleótidos de dicha muestra de polinucleótidos determinada comprende la secuencia del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (e) a (h) a continuación:
(e)
el polinucleótido de SEC ID No. 1 del listado de secuencias;
(f)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SED ID No. 1;
(g)
un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SED ID No. 1 y
(h)
una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (e), (f) y (g) mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un procedimiento según la reivindicación 18 que además comprende:
marcar dicho polinucleótido sonda con un marcador, antes de la etapa de poner en contacto ésta con el vehículo para la detección génica.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19, en el que el dicho marcador comprende al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por colorante fluorescente, hapteno, enzima, isótopo radiactivo y la sustancia activa del electrodo (electroactiva).
21. Un procedimiento según la reivindicación 18,
en el que dicho vehículo para la detección génica es un electrodo que comprende una base conductora y dicho polinucleótido muestra tomado de dicho individuo inmovilizado sobre la base, y
la detección de la reacción de hibridación en la etapa de determinación de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido muestra se realiza mediante la detección del cambio electroquímico que acompaña a dicha reacción de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un procedimiento según la reivindicación 21, en el que la detección del cambio electroquímico se realiza midiendo una señal eléctrica generada entre dicho vehículo para la detección génica y un contraelectrodo cuando se aplica un voltaje entre el vehículo para la detección génica y un contraelectrodo.
23. Un procedimiento según la reivindicación 22, en el que se añade un agente electroactivo que reconoce la cadena doble, que se une específicamente a un polinucleótido de cadena doble, se añade al sistema de reacción de hibridación y la señal eléctrica generada entre dicho vehículo para la detección génica y dicho contraelectrodo se genera directa o indirectamente a partir del agente electroactivo que reconoce la cadena doble.
\newpage
24. Uso de un aparato para la detección génica en un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el aparato comprende:
un vehículo para la detección génica como se define en la reivindicación 7;
una sección de reacción para poner en contacto un primer polinucleótido inmovilizado sobre un cuerpo base de dicho vehículo con una muestra que contiene un segundo polinucleótido marcado con un marcador, y colocar los polinucleótidos primero y segundo en condiciones de reacción de hibridación; y
un aparato de detección del marcador para detectar el marcador unido a dicho segundo polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Uso según la reivindicación 24, en el que el dicho marcador comprende al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por colorante fluorescente, hapteno, enzima, isótopo radiactivo y sustancia activa en el elec-
trodo.
26. Uso de un aparato para la detección génica en un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el aparato comprende:
un vehículo para la detección génica como se define en la reivindicación 9,
un contraelectrodo,
un medio para la aplicación de voltaje para la aplicación de un voltaje entre dicho vehículo para la detección génica y dicho contraelectrodo,
una sección de reacción para poner en contacto un primer polinucleótido inmovilizado sobre un cuerpo base de dicho vehículo con una muestra que contiene un segundo polinucleótido y colocar los polinucleótidos primero y segundo en condiciones de reacción de hibridación; y
una sección de medición para medir una señal eléctrica generada entre dicho vehículo para la detección génica y dicho contraelectrodo cuando se aplica voltaje mediante dicho medio de aplicación de voltaje después de dicha reacción de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Uso según la reivindicación 26, en el que un agente electroactivo que reconoce la cadena doble que se une específicamente a un polinucleótido de cadena doble se añade en la sección de reacción y la señal eléctrica se genera a partir de dicho agente electroactivo que reconoce la cadena doble.
28. Uso de un kit en un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el kit comprende:
un vehículo para la detección génica como se define en la reivindicación 7; y
una solución tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Uso de un kit en un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el kit comprende:
un vehículo para la detección génica según se define en la reivindicación 9;
un agente electroactivo que reconoce la cadena doble, que se une específicamente a un polinucleótido de cadena doble; y
una solución tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
30. Uso de un polinucleótido en un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a) el polinucleótido de SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 ó SEC ID No. 4;
(b) un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 441 a la posición 455 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4;
(c) un polinucleótido que contiene la secuencia que se extiende desde la posición 449 a la posición 459 de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3 o SEC ID No. 4; y
(d) una cadena complementaria del polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por (a), (b) y (c) mencionados anteriormente,
siendo la presencia de timina en la posición 455 indicativa de la validez del tratamiento y siendo la presencia de un nucleótido distinto de timina en dicha posición indicativa de la invalidez del tratamiento.
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