JP2009060798A - 核酸の検出方法および核酸検出キット - Google Patents
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Abstract
【課題】既存のインターカレーターによる核酸の検出方法において生じる非特異的なノイズを抑制し、安全かつ簡便な方法でかつコストを抑えた標的核酸の検出が可核酸の検出方法およびキットを提供することにある。
【解決手段】核酸とプローブとの間で二本鎖複合体を形成させ、該二本鎖複合体を凝集させる。該凝集した二本鎖複合体に含まれるグアニン及び/又はアデニンに由来する電気化学的シグナル検出する。
【選択図】図2
【解決手段】核酸とプローブとの間で二本鎖複合体を形成させ、該二本鎖複合体を凝集させる。該凝集した二本鎖複合体に含まれるグアニン及び/又はアデニンに由来する電気化学的シグナル検出する。
【選択図】図2
Description
本発明は、核酸の検出方法及び核酸の検出キットに関連する。
ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の核酸塩基配列解析が精力的に進められ、その結果として、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の決定、治療後の管理、予後予想等が行われるようになってきた。また、別の分野では、同様に遺伝子を解析することにより、食肉、穀物等の食品の流通管理も行われようとしてきている。
特定の塩基配列を有するDNAを検出する技術としては、従来では、ハイブリダイゼーション法、特にサザンハイブリダイゼーション法(サザンブロッティング法)が広く一般的に用いられている。
サザンハイブリダイゼーション法では、まず、試料から遺伝子を抽出し、抽出したDNAを必要があれば適当な制限酵素でフラグメントとし、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行う。そしてDNAフラグメントを分子量サイズに応じて分離する。ゲル上で分離された各DNAフラグメントを一本鎖DNAに変性し、ナイロンフィルターまたはニトロセルロースペーパーに固定化する。次に目的とするDNAに対して相補的な塩基配列を有する標識化核酸プローブ(標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質が使用される)を適当な条件下ハイブリダイズさせる。続いて、ハイブリダイズしなかった標識化核酸プローブを洗浄操作により除去した後、標識の検出を行うことにより、特定の塩基配列を検出することができる。
しかしながら、前記のハイブリダイゼーション法では電気泳動用の被検試料が比較的多量に必要であるだけでなく、操作が煩雑で検出までに比較的時間を要するという問題点がある。
特定の塩基配列を有するDNAを検出する技術としては、電極型センサと二本鎖核酸挿入剤(インターカレーター)とを利用する電気化学検出方法も知られている。
例えば、特許文献1には、出力端子を備えると共にプローブDNAを固定化した電極と検出対象DNAとを、インターカレーター存在下に反応させる。続いて反応後の電極の電流を測定することにより、プローブDNAと検出対象DNAとで形成されるハイブリッドDNAの存在を検出する方法が記載されている。
また、特許文献2は、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質を用いて被検試料より遺伝子合成反応によって得られる検出対象遺伝子を検出する方法である。また、利用可能な電気化学的に活性な遺伝子結合性物質としてヘキスト33258などを挙げている。
特開平9−288080号公報
特登録3511596号公報
特許文献1に開示されている方法では、DNAの検出にインターカレーターを用いる必要がある。このインターカレーターは、核酸と非特異的に相互作用するため、ハイブリダイゼーションした標的核酸とプローブの二本鎖核酸以外の核酸にも作用し、検出時のノイズとなる。また、インターカレーターは核酸に作用する物質であるため、変異原性を有し、実際の検査実施者が、その扱いに注意しなければならないという課題を有している。
また、インターカレーターを用いる方法では、インターカレーターの結合領域に配列依存性があるため、分析物に対応したインターカレーターを選択する必要があるという課題があった。
特許文献2に開示されている方法においても同様の課題を有している。二本鎖核酸認識体は、遺伝子合成反応において、非特異的に合成されうる非検出対象遺伝子をも認識してしまい、配列特異的な検出ができない場合があった。
そして、上記のような従来の電気化学的検出方法では、検出を可能とするために酸化還元物質やインターカレーターまたは標識化合物を使用しなければならない課題があった。また、電極表面上に標的核酸またはプローブを固定化する必要がある、といった煩雑な操作を要し、測定のコストも高くなるという課題もあった。
以上のような状況に鑑み、本発明は検出を簡便、高効率、高精度に行うことを可能とする検出方法に関するものである。医療分野における診断、治療、予後予想または食品分野の流通管理など、遺伝子検出をベースとした分野で広範囲に簡便に利用される核酸の検出方法を提供することを目的とする。
本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する方法であって、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブと、標的核酸との間で二本鎖複合体を形成させる工程と、前記二本鎖複合体を凝集させる工程と、前記二本鎖複合体中のグアニン及び/又はアデニンに由来する電気化学的シグナルを検出する工程と、を有することを特徴とする。
更に、本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する検出方法であって、標的核酸と標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブとを用いて、標的核酸を増幅させる工程と、前記増幅された核酸を凝集させる工程と、前記凝集された核酸中のグアニン及び又はアデニンに由来する電気化学的シグナルを検出する工程と、を有することを特徴とする。
また、本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する検出キットであって、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブと、凝集促進剤と、を含むことを特徴とする。
更に、本発明は、試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する核酸の検出キットであって、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含む核酸増幅反応を起こすことが可能なプローブと、核酸増幅試薬と、凝集促進剤と、を含むことを特徴とする。
本発明の検出方法及び検査キットを用いることによって、配列特異的な標的核酸の検出が可能となり、安全かつ簡便な方法で、およびコストを抑えた標的核酸の検出が可能となる。また、液中に分散した標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応は、基板表面等に固定したプローブを用いる場合と比較して反応効率が高いことがわかる。つまり、遺伝子検出のスループット化、簡便化、低コスト化、高精度化が可能となり、遺伝子検出をベースとした分野で広範囲に利用できる。
以下に本発明の方法およびキットについて詳細に説明する。
図1に本発明における検出方法の一例となる工程を示す。各工程における詳細を以下に示す。
<標的核酸>
本発明の検出方法が適用可能である標的核酸は、核酸プローブとの間で形成する二本鎖複合体(詳細は後述)中にグアニン及び/又はアデニンを少なくとも1以上含むこと以外は、前記プローブを用いてハイブリダイゼーション反応、核酸増幅反応が可能な核酸である限り、特に限定されない。天然に存在する核酸(例えば、動物、植物、微生物、ウイルスに由来する核酸)および人工的に合成した核酸(例えば、化学的に合成した核酸、または核酸工学的に合成した核酸)のいずれもが可能である。なお、本明細書における「核酸」および「核酸分子」には、一本鎖および二本鎖の遺伝子、DNA、RNA、人工DNA、人工RNA、ペプチド核酸などが含まれる。
本発明の検出方法が適用可能である標的核酸は、核酸プローブとの間で形成する二本鎖複合体(詳細は後述)中にグアニン及び/又はアデニンを少なくとも1以上含むこと以外は、前記プローブを用いてハイブリダイゼーション反応、核酸増幅反応が可能な核酸である限り、特に限定されない。天然に存在する核酸(例えば、動物、植物、微生物、ウイルスに由来する核酸)および人工的に合成した核酸(例えば、化学的に合成した核酸、または核酸工学的に合成した核酸)のいずれもが可能である。なお、本明細書における「核酸」および「核酸分子」には、一本鎖および二本鎖の遺伝子、DNA、RNA、人工DNA、人工RNA、ペプチド核酸などが含まれる。
本発明の検出方法が適用可能である試料は、標的となる核酸を含む可能性がある限り、特に限定されるものではない。例えば、生物学的試料(例えば、動物の体液、例えば、血液、血清、血漿、ずい液、汗、唾液、尿など、もしくは毛髪、排泄物、臓器、組織、または動植物それ自体もしくは、それらの乾燥体)を挙げることができる。あるいは環境由来の試料(例えば、河川水、湖沼水、海水、土壌など)を挙げることができる。または、病原体ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、成人T細胞白血病ウイルス、パピローマウイルスポリオーマウイルス、ヘルペスウイルス)や細菌(例えば、ブドウ球菌、病原性大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、連鎖球菌、カンピロバクター菌)の核酸が挙げられる。
<プローブ>
本発明で用いられるプローブは、標的核酸を検出するための核酸分子である。標的核酸との間で形成する二本鎖複合体中にグアニン及び/又はアデニンを1以上含み、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基対を形成する核酸を含むものであればいかなるものでもよい。なお、上記条件を満たすプローブであれば、用いられるプローブは1種でもよいし、複数種のプローブを同時に用いることも可能である。
本発明で用いられるプローブは、標的核酸を検出するための核酸分子である。標的核酸との間で形成する二本鎖複合体中にグアニン及び/又はアデニンを1以上含み、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基対を形成する核酸を含むものであればいかなるものでもよい。なお、上記条件を満たすプローブであれば、用いられるプローブは1種でもよいし、複数種のプローブを同時に用いることも可能である。
電気化学シグナルをより増幅させ高感度に検出するために、本発明におけるプローブは、核酸増幅のためのプライマーとして利用することもできる。好ましくは標的核酸を増幅させる、さらに好ましくはポリメラーゼ連鎖反応に利用可能な設計ができる。
本発明におけるプローブ核酸の塩基長は、本発明における電気化学検出が可能であれば限定されない。標的核酸への非特異的な相互作用を抑制するという点から、10塩基以上が好ましく、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上が望ましい。
<二本鎖複合体>
本発明における二本鎖複合体とは、相補的な塩基配列を有する標的核酸中の核酸分子とプローブ中の核酸分子とが塩基対を形成する複合体を意味する。核酸が二本鎖となる場合には、対となる塩基は決まっている。具体的には、グアニン(G)にはシトシン(C)、アデニン(A)にはチミン(T)が対を成し、これらの塩基対間で形成される水素結合によって二本鎖が安定化される。なお、本発明における二本鎖複合体は、二本鎖核酸の全体が二本鎖を形成するものでもよいし、核酸の一部が二本鎖を形成し、その他の部分が一本鎖でもよい。
本発明における二本鎖複合体とは、相補的な塩基配列を有する標的核酸中の核酸分子とプローブ中の核酸分子とが塩基対を形成する複合体を意味する。核酸が二本鎖となる場合には、対となる塩基は決まっている。具体的には、グアニン(G)にはシトシン(C)、アデニン(A)にはチミン(T)が対を成し、これらの塩基対間で形成される水素結合によって二本鎖が安定化される。なお、本発明における二本鎖複合体は、二本鎖核酸の全体が二本鎖を形成するものでもよいし、核酸の一部が二本鎖を形成し、その他の部分が一本鎖でもよい。
なお、本明細書において「ハイブリダイゼーション反応」とは、上記二本鎖複合体を形成させる反応を指す。
<核酸増幅反応>
本発明における核酸の検出方法において、標的核酸が微量しか存在しない場合、標的核酸を増幅反応した後に検出を行ってもよい。本発明の検出方法で実施する核酸増幅反応は、核酸を鋳型として核酸増幅反応を行うことができる反応である限り特に限定されるものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応が好ましい。なお、本発明において核酸増幅反応における産物は二本鎖複合体となる。
本発明における核酸の検出方法において、標的核酸が微量しか存在しない場合、標的核酸を増幅反応した後に検出を行ってもよい。本発明の検出方法で実施する核酸増幅反応は、核酸を鋳型として核酸増幅反応を行うことができる反応である限り特に限定されるものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応が好ましい。なお、本発明において核酸増幅反応における産物は二本鎖複合体となる。
前記核酸増幅反応が実施可能な試薬として、従来一般的に実施されているポリメラーゼ連鎖反応が実施可能な試薬を利用することができる。例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ、バッファー、McGill、dent混合液、フォワードプライマー、リバースプライマー、標的遺伝子を含む試料、滅菌水、を含有する混合液を挙げることができるが、これに限定されるものではない。さらに反応促進試薬などを添加してもよい。
標的核酸がDNAである場合には、PCR法により実施することができる。即ち、耐熱性DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)を用いて、初期変性反応(例えば、97℃で2〜3分間)を実施した後、(1)DNAの変性工程(90〜94℃で30秒間)、(2)一本鎖DNAとプライマーとのアニーリング工程(50〜55℃で30秒間)、及び(3)耐熱性DNAポリメラーゼによるDNA合成工程(70〜75℃で1〜2分間)からなる増幅サイクルを繰り返す(例えば、15〜45回)ことにより、遺伝子増幅を実施することができる。
また、標的核酸がRNAである場合には、例えば逆転写PCR(RT−PCR)法により実施することができる。すなわち、逆転写酵素とランダムヘキサマーまたはオリゴ(dT)プライマーなどを用いて逆転写反応を実施する。続いて、前記DNAの場合と同様に、耐熱性DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)を用いて初期変性反応及びそれに続く増幅サイクルを繰り返すことができる。
<二本鎖複合体の凝集>
本発明における二本鎖複合体を凝集させる工程においては、種々の方法を利用することができる。本明細書における「凝集促進剤」とは、前記二本鎖複合体を凝集させるために用いるものを指し、本発明の目的を達成しうるものであればいかなるものでも良い。例えば、ラテックス微粒子や金コロイド粒子、磁性ビーズ等の不溶性担体、ビオチン−アビジン相互作用、抗体−抗原相互作用、基質−酵素相互作用などの複合体を形成できるものが挙げられ、従来既知の方法を用いて凝集させることができる。
本発明における二本鎖複合体を凝集させる工程においては、種々の方法を利用することができる。本明細書における「凝集促進剤」とは、前記二本鎖複合体を凝集させるために用いるものを指し、本発明の目的を達成しうるものであればいかなるものでも良い。例えば、ラテックス微粒子や金コロイド粒子、磁性ビーズ等の不溶性担体、ビオチン−アビジン相互作用、抗体−抗原相互作用、基質−酵素相互作用などの複合体を形成できるものが挙げられ、従来既知の方法を用いて凝集させることができる。
凝集促進剤は予めプローブに標識されていてもよく、またはプローブとは別に添加してもよい。なお、凝集促進剤は単独で利用可能なものでもよく、異なる2種類以上を利用して二本鎖複合体を凝集させるものでもよい。
本発明に利用できる前記不溶性担体としては、本発明に適用し得るものであればいかなるものでもよい。例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、亜鉛、またはこれらの少なくとも2種以上からなる合金、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどの天然高分子担体、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体などの合成高分子担体、ラテックスを挙げることができ、これらの1種以上を含むことができる。また、前記不溶性担体は、公知の種々の形状が可能である。例えば、球形、ロッド型、針状、中空素子、1以上の異なる材質の層状構造、チューブ型等を挙げることができ、本発明の効果を達成し得る形状であれば特に制限されるものではない。例えば、凹凸、突起を有していてもよい。上記不溶性担体の表面上に核酸プローブを固定化させる方法としては、従来既知の方法を用いることができる。例えば、金コロイド粒子の表面上に核酸プローブを固定化するためには、硫黄原子を持つ有機物が金などの金属表面に硫黄原子を介して共有結合することを利用する方法がある。
例えば、一本鎖DNAを固定した金コロイド粒子は、金コロイド粒子溶液にチオール化したDNAを添加して加熱すると、金表面にチオール基が結合し、結合しなかったチオール化DNAを遠心分離によって取り除くことにより得られる。この核酸プローブにチオール基を導入する方法は、当該業者に知られている一般的な方法を用いることができる。
また、二本鎖複合体を凝集させる方法としては、卵白などに含まれるタンパク質の一種であるアビジンと、ビタミンB複合体の一種であるビオチンの相互作用を利用することができる。アビジンとビオチンの結合反応は公知であり、生化学検出反応に用いられている。例えば、ビオチン修飾核酸プローブおよびビオチン修飾標的核酸を用いて、ハイブリダイゼーションした二本鎖複合体をストレプトアビジンに選択的に結合させて凝集化する方法が挙げられる。または、ビオチン修飾プライマーを用いて標的核酸を増幅させ、増幅した標的核酸に修飾されているビオチンと、アビジンの結合を利用して凝集させることもできる。本発明において用いられるアビジンは、通常四量体として卵白から得られるものであるが、ビオチンと結合能を有するものであれば、微生物から得られるストレプトアビジン、単量体のアビジンまたはビオチン結合能を失わない程度に化学修飾したアビジンでもよい。本発明において用いられるビオチンは、本発明において用いられるアビジンと結合能を有するものであればいかなるものでもよく、動植物および微生物由来のビオチン、またはビオチン類似化合物を用いることができる。
<検出方法>
本発明における検出方法においては、被検液(標的核酸を含む液、または標的核酸を含まない液)に電位を印加した時に発生する電流値を測定することによって、電気化学的シグナルの検出することができる。具体的には、種々の電気化学測定方法、例えば、リニアスイープボルタンメトリー(LSV)、クロノアンペアメトリー(CA)、クロノクーロメトリー(CC)、またはサイクリックボルタンメトリー(CV)、方形波ボルタンメトリー(SWV)を挙げることができる。
本発明における検出方法においては、被検液(標的核酸を含む液、または標的核酸を含まない液)に電位を印加した時に発生する電流値を測定することによって、電気化学的シグナルの検出することができる。具体的には、種々の電気化学測定方法、例えば、リニアスイープボルタンメトリー(LSV)、クロノアンペアメトリー(CA)、クロノクーロメトリー(CC)、またはサイクリックボルタンメトリー(CV)、方形波ボルタンメトリー(SWV)を挙げることができる。
なお、本発明における電気化学測定では、核酸塩基中のグアニン及び/又はアデニンに由来する酸化電流を測定するものであり、グアニン及び/又はアデニンが特徴的な酸化電流値をもつことは公知である。測定される電流値は、標的核酸、プローブおよび核酸増幅反応試薬に含まれるグアニン及び/又はアデニンの濃度または数に依存する。電極反応は電極表面近傍においてのみ起こることから、二本鎖複合体形成後に凝集反応を生じさせることによって、電極表面近傍のみかけのグアニン及び/又はアデニンの濃度が減少し、電流値が低下する。この電流値の低下率は、核酸プローブと二本鎖複合体を形成する標的核酸の量に依存するため、電流値の低下率から、検体に含まれる標的核酸の濃度、数もしくは有無がわかる。本発明の検出方法では、未知濃度の標的核酸の検出時に、予め既知濃度の標準核酸試料を段階的に希釈したサンプルを用いて検出を実施し、標準試料の濃度または数と電流値との関係を示す検量線または関係式を決定することが好ましい。
なお、本発明において、検出対象となる二本鎖複合体を凝集させる工程と二本鎖複合体中のグアニン及び/又はアデニンに由来する電気化学的シグナルを検出する工程とを同時に行うこともでき、複合体形成反応をリアルタイムで検出できる。
<核酸の検出キット>
本発明における標的核酸の検出キットは、試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する核酸の検出キットであって、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブと、凝集促進剤と、を含むことを特徴とする。
本発明における標的核酸の検出キットは、試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する核酸の検出キットであって、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブと、凝集促進剤と、を含むことを特徴とする。
本発明における検出キットにおいて、二本鎖複合体を形成させるための反応容器と、二本鎖複合体を凝集させるための反応容器と、電気化学的検出を行うための検出容器とを備えることが可能である。また、前記反応容器と検出容器は、各々別々でも同一でもよい。容器の形状は上記二本鎖複合体を形成させる反応と、二本鎖複合体を凝集させるための反応と、電気化学的検出とが行える限り、特に限定されるものではない。前記二本鎖複合体を形成させるための反応容器に標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含む少なくとも1種のプローブが予め含まれていてもよく、別であってもよい。また、前記二本鎖複合体を凝集させるための反応容器に凝集促進剤が予め含まれていてもよく、別であってもよい。
本発明で用いられる容器とは、上記二本鎖複合体の形成および電気化学測定のための支持体としての役割を果たすものであって、溶剤に不溶であり且つ常温若しくはその付近の温度範囲内(0〜100℃)で固体またはゲル状であれば特に制限されない。容器の材質として、例えば、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミックが挙げられる。前記プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびアクリル樹脂等が挙げられる。また、前記無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲルおよびグラファイト等が挙げられる。前記金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネットおよびアパタイト等が挙げられる。前記天然高分子としては、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸およびこれらの誘導体等が挙げられる。前記セラミックとして具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等が挙げられる。上記容器の形状としては、例えば、フィルム、平板、繊維等であり、またその大きさは特に制限はない。
複数の被検物質を測定するために、二本鎖複合体を形成させるための反応容器と、二本鎖複合体を凝集させるための反応容器と、電気化学的検出を行うための検出容器とは複数用意されていることが好ましい。なお、それらが一体化されていると取り扱いが容易になることからより好ましい。
前記反応容器または検出容器としては、免疫検査などで一般的に用いられている、複数の容器が一体化された24、48、96、384、1536穴のマイクロタイタープレート等を使用することが可能である。あるいは、フォトリソグラフフィーやコンタクトプリンティング法を用いて、容器表面上にパターンを形成させることによって得ることもできる。
また、本発明における標的核酸の検出キットは、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含む核酸増幅反応を起こすことが可能なプローブと、核酸増幅試薬と、凝集促進剤と、を含む。
前記プローブと、前記核酸増幅試薬とを用いることで、被検試料中に標的核酸が微量しか存在しない場合でも、標的核酸を増幅させることができる。上記核酸増幅試薬としては、本発明の目的である標的核酸を増幅することが可能であるならば如何なるものであってもよい。例えば、トリス−塩酸緩衝液などのpH緩衝液、MgCl2、KCl、NaClなどの塩類、デオキシリボヌクレオチド類、DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、などを含む。また、必要に応じて、界面活性剤やグリセロール、DNAポリメラーゼを安定化させるためのウシ血清アルブミンなどのタンパク質、逆転写酵素などの物質を添加することができる。また、前記検出キットにおいて、核酸増幅反応を起こさせるための反応容器と、前記核酸増幅反応により得られた二本鎖複合体を凝集させるための反応容器と、電気化学的検出を行うための検出容器とを備えることも可能である。また前記反応容器と検出容器とが、各々、別々でも同一でもよい。また、容器の形状は、上記核酸増幅反応と、上記核酸増幅反応により得られた二本鎖複合体を凝集させるための反応と、上記電気化学的検出とが行える限り、特に限定されるものではない。また、前記核酸増幅反応を起こさせるための反応容器に、標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含む核酸増幅反応を起こすことが可能な少なくとも1以上のプローブが予め含まれていてもよく、別であってもよい。また、前記核酸増幅反応により得られた二本鎖複合体を凝集させるための反応容器に凝集促進剤が予め含まれていてもよく、別であってもよい。
また、本発明における検出キットには、グアニン及び/又はアデニンに由来する電気化学検出を行うための測定用の電極を含むことができる。前記検出容器に、予め電気化学的測定が可能な電極を備えておくこともできるし、あるいは、前記検査素子とは独立した電気化学的測定が可能な電極を、測定の度に検出部位内の検査対象中に挿入し、測定することができる。
本発明で用いられる電極は特に限定されるものではない。使用可能な電極として、金以外にも、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Si、Ge、ZnO、CdS等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができる。金またはグラシーカーボンを用いることが特に好ましい。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても良く、これによって安定な電極を調製することができる。また、単分子膜で被覆することもできる。
本発明で用いられる電極は、導電性を持たない、容器上に複数の電極が配置されたものが好ましい。この場合、電極は、導電性を持たない容器上に、互いに接しないように、かつ規則的に配置されていることが好ましい。例えば、板上の容器上に電極が規則的に配置された電極を好ましく用いることができる。また底面に電極を備えたウエル(穴)が容器に規則的に配置された電極、および先端に電極を備えている棒状の容器を規則的に配置したものも好ましく用いることができる。上記複数の電極を利用することにより、複数の標的核酸の検出が可能となる。
導電性を持たない容器としては、電気絶縁性の疎水性担体または電気絶縁性の低親水性担体であることが好ましい。また、容器の表面が凹凸を有する平面性の低いものも好ましく用いることができる。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールAのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げることができる。表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さから、上記各種ポリマー、ガラスまたはシリコンが特に好ましい。容器の厚さは特に限定されないが、板状である場合には100乃至100000μmの範囲にあることが好ましい。
導電性を持たない容器上に複数の電極が配置されたものとしては、導電性を持たない容器の表面を上記の電子伝導体で処理したものを用いることが好ましく、金を蒸着したものを用いることが特に好ましい。容器は、電子伝導体で表面処理をする前に、容器上に電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって容器の凹凸を軽減することができる。また、容器によっては、その容器中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した容器も好ましく用いることができる。
導電性を持たない容器上に複数の電極が配置されたものとしては、シリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線基板のように、複数の電極が容器上に印刷されてなるものであってもよい。
本発明における検出キットは、一例として図2に示す検出装置によって測定できる。
前記検出装置は、作用電極と、参照電極と、対極と、作用電極と対極間に印加する電圧を制御するための制御部と、及び電流値の測定のための電気化学測定器とを含む。対極(及び参照極)の材料は特に限定されるものではなく、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いることができる。これらの作用電極、対極、および/または参照極は反応容器の底面あるいは内側面にあってもよい。
以下、本発明が適用できる実施例を説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。試薬類に関しては、記載がないものに関しては、シグマ社から購入する。
(実施例1)
本実施例は、図1に示す工程に基づいた一例である。5'末端をビオチンで標識した標的核酸およびプローブを用いてハイブリダイゼーションした二本鎖複合体を、10μmストレプトアビジン(プロメガ社)溶液を用いて凝集させた後に、電気化学的検出により標的核酸の有無もしくは数を検出する。図3に基づいて説明する。
本実施例は、図1に示す工程に基づいた一例である。5'末端をビオチンで標識した標的核酸およびプローブを用いてハイブリダイゼーションした二本鎖複合体を、10μmストレプトアビジン(プロメガ社)溶液を用いて凝集させた後に、電気化学的検出により標的核酸の有無もしくは数を検出する。図3に基づいて説明する。
標的核酸として、15塩基からなる5'末端をビオチンで修飾した一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号1:ATGATAGTGGGAACG)を用いる。核酸プローブとして、5'末端をビオチンで修飾した、標的核酸と相補的な塩基配列を有する15塩基からなる一本鎖ビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号2:CGTTCCCACTATCAT)を用いる。また、対照プローブとして標的核酸との間で非相補的な塩基配列を有する15塩基対からなるオリゴヌクレオチドプローブ(配列番号3:TTTTTTTTTTTTTTT)を用いる。上記のようなビオチン標識オリゴヌクレオチドは、目的の塩基配列を含むように設計して購入することができる(シグマジェノシス社)。
(2)ハイブリダイゼーション
上記のようにして得られる標的核酸を、TEバッファー(ナカライテスク社、10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解させ、20μMに調製する。
上記のようにして得られる標的核酸を、TEバッファー(ナカライテスク社、10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解させ、20μMに調製する。
前記標的核酸溶液1μlと、20μMのオリゴヌクレオチドプローブ溶液1μlとを、予め作製し洗浄された反応容器内に滴下し、30℃の恒温容器内で4時間反応させ、二本鎖複合体を形成させる。これにより、二本鎖複合体が形成された反応容器Xを得る。
さらに、本実施例においては、比較対象として、二本鎖複合体が形成されない反応容器Yを作製する。この二本鎖核酸が形成されないYは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用して、前記二本鎖核酸が形成された反応容器Xを得る時と同様の処理をする。さらに、対照として、ハイブリダイセーション溶液を滴下、オリゴヌクレオチドプローブを含まないTEバッファー1μlを加え、上記の反応容器Xを得るときと同様の処理を行う反応容器Zを得る。
(凝集反応)
上記のハイブリダイゼーション反応後に、各反応容器に10μMのストレプトアビジン溶液1μlを添加する。標的核酸と二本鎖複合体を形成すると、標的核酸及びプローブのビオチンを介して各々ストレプトアビジンと結合することができる。複数の二本鎖複合体がストレプトアビジンに捕捉されることから、二本鎖複合体の凝集がおこる。
上記のハイブリダイゼーション反応後に、各反応容器に10μMのストレプトアビジン溶液1μlを添加する。標的核酸と二本鎖複合体を形成すると、標的核酸及びプローブのビオチンを介して各々ストレプトアビジンと結合することができる。複数の二本鎖複合体がストレプトアビジンに捕捉されることから、二本鎖複合体の凝集がおこる。
(検出)
電気化学測定はパルスボルタメトリーの一種であるSWV(Square Wave Voltammetry)法(掃引速度=100mV/S)を用いて行う。標的核酸と二本鎖複合体を形成されない反応容器YおよびZにおいては、730mV付近にグアニンに由来する電流が強く観測される。他方、二本鎖複合体が形成され、前記二本鎖複合体の凝集がおこる反応容器Xでは、グアニンに由来する電流値の減少が測定される。
電気化学測定はパルスボルタメトリーの一種であるSWV(Square Wave Voltammetry)法(掃引速度=100mV/S)を用いて行う。標的核酸と二本鎖複合体を形成されない反応容器YおよびZにおいては、730mV付近にグアニンに由来する電流が強く観測される。他方、二本鎖複合体が形成され、前記二本鎖複合体の凝集がおこる反応容器Xでは、グアニンに由来する電流値の減少が測定される。
(実施例2)
本実施例は、金コロイドで修飾されたプローブを用いて、特定の条件下、標的核酸とハイブリダイゼーションさせることによって、標的核酸とプローブが二本鎖複合体を形成する。二本鎖複合体形成後、金コロイドを介して凝集が起こり、グアニンに由来する電気化学的シグナルが減少するのを検出する例であり、図4に基づいて説明する。
本実施例は、金コロイドで修飾されたプローブを用いて、特定の条件下、標的核酸とハイブリダイゼーションさせることによって、標的核酸とプローブが二本鎖複合体を形成する。二本鎖複合体形成後、金コロイドを介して凝集が起こり、グアニンに由来する電気化学的シグナルが減少するのを検出する例であり、図4に基づいて説明する。
プローブに金コロイドを修飾化する方法として金表面がチオール基と強く結合する性質を利用することができる。コロイド粒径約15nmのAuクエン酸コロイド溶液(田中貴金属社)を購入する。プローブに金コロイドを修飾するために、3nmolのチオール化プローブを1mlのAuクエン酸コロイド溶液と50℃で16時間反応する。この溶液を、0.1MのNaCl、10mMのリン酸緩衝溶液(pH=7.0)に変え、50℃で40時間反応させる。未反応のプローブを除去するために、溶液を14000rpmで25分間遠心分離し、上清を上記組成のリン酸緩衝液1mlで置換する。上記と同様の遠心分離操作を2回繰り返し、沈殿を上記のリン酸緩衝液0.5mlで置換する。
標的核酸として、実施例1と同じく配列番号1の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる。二本鎖複合体を形成するためのオリゴヌクレオチドプローブとして、チオール化オリゴヌクレオチド(配列番号4:HS−(CH2)6−CGTTCCCACTATCAT)を用いる。標的核酸を含む試料溶液(0.1M NaCl、10mMリン酸緩衝液、pH=7.0)10μlを反応容器X2に滴下する。次にオリゴヌクレオチドプローブを固定化した金コロイドを含むプローブ溶液をX2に滴下し、塩を加えてNaCl濃度が0.5Mとなるように調製する。また、比較対象として、反応容器Y2に前記標的核酸を含む試料を滴下し、上記と同様にして得られる非相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ(配列番号5:HS−(CH2)6−TTTTTTTTTTTTTTT)溶液をY2に添加する。また、対照として反応容器Z2に標的核酸を含む試料とオリゴヌクレオチドを含まないこと以外は組成が同様のプローブ溶液を添加する。
各々の反応容器でハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション条件は実施例1と同様の反応条件を用いることができる。本実施例では、30℃で30分間反応させる。
ハイブリダイゼーション反応後、実施例1と同様にして電気化学測定を行う。標的核酸と二本鎖複合体が形成されない反応容器Y2およびZ2においては、730mV付近にグアニンに由来する電流が強く観測される。一方、二本鎖複合体が形成され、前記二本鎖複合体の凝集がおこる反応容器X2では、730mV付近にグアニンに由来する電流値の減少が測定される。
(実施例3)
本実施例では、標的核酸が微量しか存在しない場合に、標的核酸を核酸増幅反応により増幅した後に検出を行う例であり、図5に基づいて説明する。標的核酸としてB型肝炎ウイルスDNAを用いる。
本実施例では、標的核酸が微量しか存在しない場合に、標的核酸を核酸増幅反応により増幅した後に検出を行う例であり、図5に基づいて説明する。標的核酸としてB型肝炎ウイルスDNAを用いる。
デキストラン1μl(分子量50万、10μg)を分注した容量0.5mlのサンプリングチューブにB型肝炎患者血清20μlを分注する。試薬(2.4Mチオシアン酸グアニジン、15mMクエン酸ナトリウム、60%イソプロピルアルコール)を100μl添加後、20秒程攪拌し、15000rpmで2分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出する。上清を捨て、200mM塩化カリウムを含む40%イソプロピルアルコールを100μl添加した後、20秒程攪拌し、15000rpmで1分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物を回収する。
この沈殿物に対し、核酸増幅反応試薬(TOYOBO製)を添加する。各試薬の添加量は、dNTP mix:2.5μl、10×buffer:2.5μl、25mM−MgCl2:4μl、DNAポリメラーゼ(KOD−Plus):0.5μl、10μM フォワードプライマー:2.5μl、10μM リバースプライマー:2.5μl、滅菌水:10.5μlを混合し、25μlの溶液を調整する。以下に、用いる1組のプライマー(プローブA、プローブB)の塩基配列を示す。なお、本実施例で用いるプライマー対には、各々5’末端にビオチン標識をした。
プローブA:(配列番号6:5'−GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG−3')
プローブB:(配列番号7:5'−CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC−3')。
プローブA:(配列番号6:5'−GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG−3')
プローブB:(配列番号7:5'−CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC−3')。
PCR反応は、Thermal Cycler(Perkin-Elmer社製)を用いて、初期変性反応(95℃:5分間)を実施後、(1)DNAの変性工程(95℃:60秒間)、(2)一本鎖DNAとプライマーとのアニーリング工程(55℃:45秒間)、及び(3)耐熱性DNAポリメラーゼによるDNA伸長工程(72℃:60秒間)を1サイクルとする温度サイクルを40回サイクルさせる。
PCR反応終了後、実施例1と同様にしてPCR反応液10μlを反応容器X3の表面に滴下する。また、参照として標的核酸を含まない試料を用い、PCR反応を実施した反応液10μlを反応容器Y3に、また、標的核酸を含む試料に核酸増幅試薬を添加しPCR反応を実施しない溶液10μlを反応容器Z3の表面に滴下する。
次に、各サンプルに20μMストレプトアビジン溶液を10μl添加し、室温で30分間静置する。
実施例1と同様の方法で電気化学測定を行う。標的核酸に対して増幅反応が起こらない反応容器Y3およびZ3においては、730mV付近にグアニンに由来する電流が強く観測される。他方、標的核酸に対して増幅反応が起こり、二本鎖複合体が形成され、前記二本鎖複合体の凝集がおこる反応容器X3では、グアニンに由来する電流値の減少が測定される。
Claims (4)
- 試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する方法であって、
標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブと、標的核酸との間で二本鎖複合体を形成させる工程と、
前記二本鎖複合体を凝集させる工程と、
前記二本鎖複合体中のグアニン及び/又はアデニンに由来する電気化学的シグナルを検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸の検出方法。 - 試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する検出方法であって、
標的核酸と標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブとを用いて、標的核酸を増幅させる工程と、
前記増幅された核酸を凝集させる工程と、
前記凝集された核酸中のグアニン及び又はアデニンに由来する電気化学的シグナルを検出する工程と、
を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する検出キットであって、
標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含むプローブと、
凝集促進剤と、
を含むことを特徴とする核酸の検出キット。 - 試料中の標的核酸の有無、もしくは数を検出する核酸の検出キットであって、
標的核酸と少なくとも部分的に相補的な塩基配列を含む核酸増幅反応を起こすことが可能なプローブと、
核酸増幅試薬と、
凝集促進剤と、
を含むことを特徴とする核酸の検出キット。
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JP2007228848A JP2009060798A (ja) | 2007-09-04 | 2007-09-04 | 核酸の検出方法および核酸検出キット |
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