TWI242601B

TWI242601B - Carrier for gene detection and its use for detecting validity of interferon therapy

Info

Publication number: TWI242601B
Application number: TW090105865A
Authority: TW
Inventors: Minako Hijikata; Shunji Mishiro; Yasuhiko Oota; Koji Hashimoto
Original assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2005-11-01
Also published as: JP2001333786A; KR20010096612A; EP1136570A2; JP4021627B2; US6667155B2; ES2316420T3; EP1136570B1; EP1136570A3; DE60136669D1; CN1268766C; KR100481115B1; US20050100909A1; ATE415488T1; WO2001071031A3; US20020048758A1; CN1333377A; WO2001071031A2; US7659068B1

Description

1242601 A7 ________ B7 五、發明説明（”）發明的領域 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於基因檢測用載體，以及使用於對個體的干擾素治療法有效性之檢測方法、對個體的干擾素治療法有效性作檢測時的基因檢測用裝置，以及檢測干擾素治療法之有效性時的基因檢測用套組。過去技術近年來C型肝炎病毒（以下稱爲HCV)之感染者有曰漸增加的現象，造成嚴重的社會問題。已知與其他病毒性疾病相同，既使對於C型肝炎干擾素治療法具有一定的效果，干擾素治療法並非對於所有感染者皆有效，其中對於干擾素治療未顯示其效果之感染者並不少。若對干擾素治療未顯示效果的感染者繼續作干擾素治療時，不僅會引起感染者的發燒或貧血等副作用，對於開始施行其他治療法而言已有太遲之問題。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製因此，對於必須作治療的H C V感染者而言，干擾素治療法是否爲有效的方法，期望於治療前可作預測，但至今有關此預測的進行幾乎不可能。發明的內容本發明的目的在於提供一種對患者作干擾素治療時是否有效，可於治療前作預測之方法。上述目的可由下述本發明而達成。依據本發明的第一發明，提供一種基因檢測用載體， -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明説明（3 ) 的序列之聚核苷酸、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (d g )含有序列號碼2的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之聚核苷酸、 (e g )這些互補鏈所成群的聚核苷酸。依據本發明的第三發明，提供一種基因檢測用載體，其特徵爲具備基體、以及可固定化該基體的聚核苷酸、該聚核苷酸含有選自 (a a )下述序列表的序列號碼3所示之聚核苷酸、 (b a )除該（a a )所示的聚核苷酸中的4 5 5位置之外，1或數個核苷酸經缺失、取代、或加成的修飾聚核苷酸、 (c a )含有序列號碼3的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之聚核苷酸、 (d a )含有序列號碼3的4 4 9〜4 5 9位置所示經濟部智慧財產局員工消費合作社印製的序列之聚核苷酸、 (e a )這些互補鏈所成群的聚核苷酸。依據本發明的第四發明，提供一種基因檢測用載體，其特徵爲具備基體、以及可固定化該基體的聚核苷酸、 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明説明（4 ) 該聚核苷酸含有選自 (a c )下述序列表的序列號碼4所示之聚核苷酸、 (b c )除該（a c )所示的聚核苷酸中的4 5 5位置之外’ 1或數個核苷酸經缺失、取代、或加成的修飾聚核脊酸、 (c c )含有序列號碼4的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之聚核苷酸、 (d c )含有序列號碼4的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之聚核苷酸、 (e c )這些互補鏈所成群的聚核苷酸。依據本發明的第五發明，提供一種使用該基因檢測用載體之D N A晶片。依據本發明的第六發明，提供一種對個體而言干擾素治療法的有效性之檢測方法、其具備 1 )由該個體中採取的試料聚核苷酸與該基因檢測用載體接觸的步驟、與 2 )檢測該試料聚核苷酸與固定化於該基因檢測用載體的聚核脊酸之雜交反應，進而決定該試料中聚核苷酸之鹼基序列的步驟。又’依據本發明的第七發明，提供一種對個體而言的干擾素治療法有效性之檢測方法、其具備 1 ) §亥個體中採取的試料聚核苷酸固定化於基體上所成之基因檢測用載體，與探查物聚核苷酸接觸的步驟、以 I--------•本丨— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1242601 A7 B7 五、發明説明（5 ) 及 2)檢測固定化於該基體上的試料聚核醫酸與該聚核脊酸之雜交反應’進而決定該試料聚梭苷酸之鹼基序列的步驟。該探查物聚核苷酸爲含有選自， (a t )下述序列表的序列號碼丨所示之聚核苷酸、 (b t )除( a t )所不的聚核脊酸中的4 5 5位置之外，1或數個核脊酸經缺失、取代、或加成的修飾聚核苷酸、 (c t )含有序列號碼1的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之聚核苷酸、 (d t )含有序列號碼1的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之聚核苷酸、 (e t )這些互補鏈 (a g )下述序列表的序列號碼2所示之聚核脊酸、 (b g )除該（a g )所示的聚核苷酸中的4 5 5位置之外，1或數個核苷酸經缺失、取代、或加成的修飾聚核苷酸、 (c g )含有序列號碼2的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之聚核苷酸、 (d g )含有序列號碼2的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之聚核苷酸、 (e g )這些互補鏈 (a a )下述序列表的序列號碼3所示之聚核:g：酸、 «^^1 m -..... In —ϋ Γ m 1^1 n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 -8 - 1242601 A7 B7 五、發明説明（6 ) (b a )除該（a a )所不的聚核：g：酸中的4 5 5位置之外’ 1或數個核苔酸經缺失、取代、或加成的修飾聚 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 核苷酸、 (c a )含有序列號碼3的44 1〜4 5 5位置所示的序列之聚核苷酸、 (d a )含有序列號碼3的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之聚核苷酸、 (e a )這些互補鏈 (a c )下述序列表的序列號碼4所示之聚核苷酸、 (b c )除該（a c )所示的聚核苷酸中的4 5 5位置之外，1或數個核苷酸經缺失、取代、或加成的修飾聚核苷酸、 (c c )含有序列號碼4的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之聚核苷酸、 (d c )含有序列號碼4的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之聚核苷酸、 (e c )這些互補鏈經濟部智慧財產局員工消費合作社印製所成群的聚核苷酸。依據本發明的第八發明，提供一種檢測千擾素治療法有效性之基因檢測用裝置，其至少具備該基因檢測用載體、固定化於該基體上的聚核苷酸與含有附予標識的聚核苷酸之試料接觸，使固定化於該基體的聚核苷酸與附予該標識的聚核苷酸的進行雜交的反應條件下之反應部' 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ Q _ 1242601 A7 ----- --B7 五、發明説明（7 ) 與具備檢測出該附予標識聚核苷酸所附的標識之裝置者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據本發明的第九發明，提供一種檢測干擾素治療法有效性之基因檢測用裝置，其具備該基因檢測用載體、與對電極、與該基因檢測用載體以及該對電極之間外加電壓的電壓外加部、與固定化於該基因檢測用載體的該聚核苷酸與含有聚核苷酸的試料接觸，使固定化於該基體上的聚核苷酸與該試料中的聚核苷酸進行雜交的反應條件下設置反應部、與測定該雜交反應後經由該電壓外加方法外加電壓時 ’於該基因檢測用載體以及該對電極間所產生的電信號之測定部。依據本發明的第十發明，提供一種測定干擾素治療有效性之套組，其特徵爲具備該基因檢測用載體與緩衝液。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製依據本發明的第十一發明，提供一種測定對個體的干擾素治療的有效性之套組，其特徵爲具備該基因檢測用載體、雙股辨識體與緩衝液。圖形簡單說明圖1表示有關本發明實施例的基因檢測用裝置之一例圖。圖2表示有關本發明實施例的經自動化之本發明電子 -10- 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明说明（8 ) 檢測用裝置一例圖。圖3表示Μ X A基因的啓動子區域之鹼基序列圖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖4表示使用有關實施例的H h a I之R F L P的電泳結果圖。圖5表示對具有4種類SNP (T型、G型、A型、 C型）的各Μ X A啓動子而言，H e 1 a細胞內的干擾素 α之反應性，以該啓動子控制下之干擾素活性作爲指標之比較結果圖。圖6表示對具有4種類SNP (Τ型、G型、Α型、 C型）的各Μ X A啓動子而言，卵巢癌細胞內的干擾素α 之反應性，以該啓動子控制下的干擾素活性作爲指標之比較結果圖。圖7表示對具有4種類SNP (Τ型、G型、Α型、 C型）的各Μ X A啓動子而言，H e 1 a細胞內的干擾素石之反應性，以該啓動子控制下的干擾素活性作爲指標之比較結果圖。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖8表示對具有4種類SNP (T型、G型、A型、 C型）的各Μ X A啓動子而言，卵巢癌細胞內的干擾素冷之反應性以，該啓動子控制下的干擾素活性作爲指標之比聿父結果圖。圖9表示本發明的一實施例之基因檢測用載體表示圖 0 圖1 0表示本發明的其他實施例之基因檢測用載體表示圖。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 1242601 A7 五、發明説明（9 ) 圖1 1表示本發明的另一實施例之基因檢測用載體表示圖。主要元件對照表經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 1 電極 1 2 聚核苷酸 1 3 反應槽 1 4 電源 1 5 電流計 1 6 電壓計 1 7 可變電阻 2 〇檢測裝置 2 1 電極支架 2 2 反應槽 2 3 第1洗淨槽 2 4 插入劑反應槽 2 5 第2洗淨槽 2 6 電化學測定槽 2 7 移動裝置 2 8 分析單位 2 9 的實施型態操作單位以下對本發明作詳細說明 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -12- 1242601 A7 B7___ 五、發明説明（彳〇 ) 序列號碼1 、序列號碼2、序列號碼3、以及序列號 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 碼4的聚核苷酸係包含人類Μ X A基因的啓動子區域之聚核苷酸，本發明者初次發現存在於這些聚核苷酸的4 5 5 位置的一鹼基多型（single nucleotide polymorphism )(以下稱爲S N P )，其與對於干擾素治療效果的反應性具有關連性。各個聚核普酸之4 4 1至4 5 6位置中存在著干擾素反應序歹!J ( interferon-stimulated response element )(以下稱爲 I S R E： ) 〇序列號碼1的44 1至45 6位置之I SRE驗基序列爲「GGTTTCGTTTCTGCTC」（序列號碼 5 ) ，I S R E的第1 5 (相當於序列號碼1的4 5 5位置，序列號碼1的4 5 5位置係以轉錄起始位置作爲+ 1 ，此以一般表示則相當於一 8 8位置）位置爲胸腺嚼η定。序列號碼2的4 4 1至4 5 6位置之I S R Ε鹼基序列爲「G G T T T C G T T T C T G C G C」（序列號碼 6 ) ，：[ S R Ε的第1 5 (相當於序列號碼2的4 5 5位經濟部智慧財產局員工消費合作社印製置，序列號碼2的4 5 5位置係以轉錄起始位置作爲+ 1 ，此以一般表示則相當於- 8 8位置）位置爲鳥嘌呤。又，序列號碼3的4 4 1至4 5 6位置之I S R Ε鹼基序列爲「G G T T T C G T T T C T G C A C」（序列號碼7 ) ，I S R E的第1 5 (相當於序列號碼3的 4 5 5位置，序列號碼3的4 5 5位置係以轉錄起始位置作爲+ 1 ，此以一般表75則相當於一 8 8位置）位置爲腺 -13- 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 Α7 Α7 Β7 五、發明説明（11 ) 嘌呤。序列號碼4的4 4 1至4 5 6位置之I SRE鹼基序列爲「G G T T T C G T T T C T G C C C」（序列號碼 8 ) ，I S R E的第1 5 (相當於序列號碼4的4 5 5位置，序列號碼4的4 5 5位置係以轉錄起始位置作爲+ 1 ，此以一般表示則相當於- 8 8位置）位置爲胞嘧啶。以下本發明說明書內容中，序列號碼1、序列號碼2 、序列號碼3、以及序列號碼4的4 5 5位置稱爲S N P 部位（SNP site )。這些I S R E的S N P部位以外的區域與各序列皆相同。具有這些I S R E的第1 5號核脊酸爲胸腺_ D定之 I S R E (序列號碼5 )的H C V感染者，對於干擾素治療法係爲有效而言，第1 5號核苷酸不爲胸腺嘧啶之 I S R Ε (序列號碼5 )的H C V感染者，其對於干擾素治療法係爲無效的事實已由本發明者於免疫學上作驗證。換言之，如實施例詳述一般，以同型接合方式具有（以下簡稱爲G / G同型）第4 5 5位置的核苷酸爲鳥嘌呤的序列號碼1之聚核苷酸的H C V感染者，與以異型接合方式具有（以下簡稱爲G / Τ異型）第4 5 5位置核苷酸爲胸腺嘧啶之序列號碼1的聚核苷酸、以及第4 5 5位置的核苷酸爲鳥嘌呤之序列號碼1的啓動子區域之H C V感染者、或以同型接合方式具有（以下簡稱爲Τ/Τ同型）序列號碼1的聚核苷酸之H C V感染者作比較，驗證干擾素治療係爲無效。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） I. i - i-:-- SI - - - — i _...... I ........ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1242601 A7 B7 __ 五、發明説明（12 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 或以同型接合方式具有第4 5 5位置核苷酸非胸腺嘧啶之MxA基因的啓動子區域2HCV感染者（以下’簡稱爲 n〇n — T/non — T 同型）’與 T/non — T 異型或Τ /Τ同型的H C V感染者作比較’顯示干擾素治療法係爲無效。作爲與η ◦ η - Τ / η ο η — Τ同型的組合，有 G/G、G/A、G/C、A/A、A/C、C/ C。作爲 Τ/η ο η — T 的組合’有 T/G、T/A、T / C。因此，預先實施干擾素治療法，例如H C V感染者所具有的包含人類Μ X Α基因之啓動子區域的聚核有2酸之 I S R E，因決定其S N P部位的核苷酸’對於該H C V 感染者而言，可檢測出干擾素治療法之有效性。本發明的基因檢測用載體等，作爲檢測由被驗者取出的聚核苷酸之核酸鏈序列之探查物’使用含有前述S Ν Ρ 部位的該S Ν Ρ部位之鹼基序列爲胸腺嘧啶之序列號碼1 的聚核苷酸之片段或這些互補鏈。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製僅使用此本發明的基因檢測用載體等，對被驗者具有的包含人類Μ X Α基因之啓動子區域的聚核苷酸’其前述 S Ν P部位是否爲胸腺嘧定作治療前調查。由此可預測對前述被驗者而言干擾素治療之有效性。又，本發明的基因檢測用載體等係由被驗體所取得之聚核苷酸，作爲檢測其核酸鏈序列之探查物，含有前述 S Ν P部位，使用該S Ν P部位的鹼基序列爲g之序列號碼2的聚核苷酸，其片段或這些互補鏈，或該S Ν P部位 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 A7 _B7___ 五、發明説明（13 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的鹼基序列爲a之序列號碼3的聚核笞酸，其片段或适些互補鏈，或該S N P部位的鹼基序列爲c之序列號碼4的聚核苷酸，其片段或這些互補鏈。僅使用此本發明的基因檢測用載體等，可對被驗者具有的包含人類Μ X A基因之啓動子區域的聚核苷酸’調查其前述S N P部位的序列。由此可預測對前述被驗者而言干擾素治療之有效性。必須施行干擾素治療法的疾病除C型肝炎之外包含膠芽腫瘤、骨髓芽腫瘤、星細胞腫瘤、皮膚惡性黑色腫瘤、 B型肝炎、腎臟癌、多發性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、惡急性硬化性全腦炎、病毒性腦炎、免疫抑制患者之全身性帶狀泡疹以及水痘、上喉頭未分化癌、隨者聽力降低之病毒性內耳感染症、泡疹性角膜炎、扁平濕疣、尖狀濕疣、經由腺病毒以及泡疹病毒感染的結膜炎、性器泡疹、口唇泡疹、子宮頸癌、癌性胸水症、角化棘細胞腫瘤、基底細胞癌、δ型慢性活動性肝炎等。作爲使用於干擾素治療法的干擾素有干擾素α、^或ω等。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明的基因檢測用載體等，使用於對罹患這些疾病的被驗者實施干擾素治療法前檢測出干擾素治療法之有效性。另外，對於本發明的各個層面，作詳細說明。本發明主要提供一種基因檢測用載體’其可使用於先實施干擾素治療法後，對罹患干擾素治療法係爲有效的疾病之患者，檢測其干擾素治療法之有效性。 16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明説明（14 ) 〈基因檢測用載體的槪略〉本發明的基因檢測用載體，係由基板、多孔質體、微滴定培養皿（microtiter plate )、粒子等基體上固定化前述所定的聚核苷酸而做成。必須固定化聚核苷酸的基體之材質、尺寸、形狀等特別無限定，僅可固定化聚核苷酸可使用任意基體。作爲基體材質，例如可使用矽、玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍寶石、鎂橄欖石、碳化矽素、氧化矽素、氮化矽素、磁性體等的無機材料、或聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、不飽和聚酯、含氟素樹脂、聚氯化乙烯、聚氯化乙烯叉、聚乙酸乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙酸鹽、丙烯基樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、乙醯基樹脂、聚碳酸酯、聚醯胺、酚樹脂、脲樹脂、環氧基樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈丁苯橡膠聚合物、聚矽氧烷樹脂、聚二苯醚、聚碼、硝基纖維素、尼龍、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚苯撐碼、聚醚碼、聚醚酮、每化乙嫌共聚物、聚甲基戊院％之有基材料。且可使用上述無基材料與有機材料之複合體。基體上固定化聚核替酸之方法，例如可使用S c i e n c e 2 5 1 ·· 7 6 7 - 7 7 3 ( 1 9 9 1 )所揭示的方法。又，該方法以外，已知有固定化聚核苷酸於基體之改良方法，可使用此改良方法作聚核苷酸的固定化。使用由有機材料或玻璃所成之基體時，若基體表面以聚賴胺酸或胺基矽烷等覆蓋於表面，可安定地固定化聚核 — I:--------- f ! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -17- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1242601 A7 _ B7 ___ 五、發明説明（15 ) 苷酸。關於本發明說明書，「聚核苷酸」意味者2個以上的核苷酸以磷酸酯鍵結而結合所成之物質。「核苷酸」含有脫氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸，但不限定於此。且，固定化於本發明基體的聚核苷酸，可使用R N A 、DNA、PNA、甲基磷酸鹽核酸、S -寡等寡核苷酸、或cDNA、 cRNA等之聚核苷酸等。且，關於本發明說明書中的「啓動子區域」非僅意味直接與T A T A b ο x等轉錄起始反應有關連之區域，係指含有影響到存在於該區域的旁邊或較遠處之轉錄起始反應效率之調節序列。因此，必須注意到「啓動子區域」等用語係含有僅與轉錄起始反應有關之序列、或僅調節序列、以及連結兩者之序列。又，「I S R Ε」意味著，經干擾素α、/9或r的刺激所誘導出之存在於基因的轉錄調節區域的約1 2至1 5 個核苷酸所成之鹼基序列。作爲固定化於基體之聚核苷酸，可舉出含有以下（a )至（e )者。序列號碼1、2、3、4任一所示的聚核苷酸。前述（a )所示的聚核苷酸，除4 5 5位置之外1或數個核苷酸被缺失、取代、加成後之聚核苷酸。作爲缺失的例子，以第1 2 8位置、1 3 3位置、 1 5 2位置、5 0 8位置、以及5 4 3位置的缺失、取代例子可舉出第330位置取代（g-t)、第5 4 2位竃本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297^Ϊ ---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

A7 1242601 ___ B7 五、發明説明（16) 取代（C — G ) ’作爲加成例可舉出對第5 0 1位置的加成（C )。且，可使用前述序列號碼1、2、3、4的聚核苷酸或前述聚核苷酸片段’連結至少一種選自啓動子、增強子、上游活性化序列、沈默子（s i 1 e n c e r )、上游抑制序列、衰減子、多腺苷酸尾巴、核移動信號、Kozak序列、 I S R E、藥物耐性因子、信號肽之基因、膜貫通區域之基因、蟲熒光素、綠色螢光蛋白質、藻青蛋白、含有西洋芥末過氧化酶的標記蛋白質基因、干擾素反應性蛋白質之基因、非干擾素反應性蛋白質的基因所成群之功能性聚核苷酸所成的修飾聚核脊酸。又，序列號碼1、2、3、4所示的前述聚核苷酸之鹼基序列中，與干擾素治療法有效性有關連者係位於第 4 5 5位的S N P部位所存在的1個核苷酸，必須固定化於基體的聚核苷酸可係爲含有前述第4 5 5位置之S N P 部位的聚核苷酸片段。使用作爲固定化於基體的聚核苷酸之前述片段時’以 1 1個核苷酸以上3 0個核苷酸以下爲佳。若固定化於基體聚核苷酸之長度過於長時，辨識一個核苷酸之相異較爲困難。另一方面，固定化於基體的聚核苷酸之長度若過於短時，決定含於試料中聚核苷酸之鹼基序列亦困難。特別作爲必須固定化於基體的較佳聚核苷酸爲’ 含有前述第4 5 5位置的S N P部位之序列號碼1、序列號碼2、 !:____.__费 II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） -19- 1242601 A7 B7 _____ 五、發明説明（17 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列號碼3、序列號碼4的聚核苷酸之片段’含有具有相當於序列號碼1、序列號碼2、序列號碼3、序列號碼4的第4 4 1至第4 5 6位置的序列號碼5、序列號碼 6、序列號碼7、序列號碼8所示序列之聚核苷酸（即前述I S R E )片段。 (d )含有前述第4 5 5位置的S N P部位之序列號碼1、序列號碼2、序列號碼3、序列號碼4的聚核苷酸之片段，含有具有相當於序列號碼1至序列號碼4的第 4 4 9至第4 5 9位置的序列號碼9、序列號碼1 〇、序列號碼1 1、序列號碼1 2所示序列之聚核有1酸片段。特別於（d )中前述S N P作爲中心’因其含有前後相等長度的鹼基序列者，故可精確地決定其鹼基序列。欲進行更精確的檢測，較佳爲含有相當於序列號碼1至序列號碼4. 之第4 4 7至4 6 1位置的聚核苷酸之片段。 (e )亦爲前述（a )至（d )所示的聚核普酸之互補鏈。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製前述序列號碼5、序列號碼6、序列號碼3、序列號碼7、序列號碼8所示的序列（即前述的1 s R E )之互補鏈爲、序列號碼1 3、1 4、1 5、1 6所表示的序列 0 前述序列號碼9、序列號碼1 〇、序列號碼1 1、序列號碼1 2所示序列的互補鏈，分別爲序列號碼1 7、序列號碼1 8、序列號碼1 9、序列號碼2 0所示序列。本發明的基因檢測用載體’固定化於基體的上述所定 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 A 7 _B7 _ 一五、發明説明（18 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 聚核苷酸作爲探查物，檢測此探查物與由被驗者取出之^ 核苷酸作雜交反應，決定包含被驗者的人類Μ X A基因胃動子區域之聚核苷酸序列，使用於調查前述S N P部位含有物。〈基因檢測用載體的使用法〉以下對使用前述基因檢測用載體，具體決定由被驗者取出之聚核苷酸的序列之方法作說明。使用前述基因檢測用載體，決定由被驗者取出之聚核苷酸的序列之方法，有（1 )使用標識物質的方法、（2 )電化學的方法等2種方法。首先，對（1 )使用之標識物質的方法作具體說明。首先，由含人類的哺乳動物等之被驗者中取得含有聚核苷酸的試料（血液等體液、血球成分、生體組織、培養細胞等）。因聚核苷酸廣泛地含於體內，故可任意使用由個體取出之試料。較佳的試料爲血液。再因應必須，經酚萃取或乙醇沈澱等分離萃取方法、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 P C R等增幅方法後’可竿取出含於則述試料中的試料聚核苷酸。作爲聚核苷酸的萃取方法，例如可使用酚萃取法、乙醇沈澱法，以及其他任意的萃取方法。萃取m R ^ A 時’可使用寡d T柱子（oligo dT column )。試料聚核脊酸的量較少時可因應必要進行試料聚核苷酸的增幅操作。其後將標識物質加成於試料聚核苷酸上，進行取得^ 識聚核苷酸的標識操作。又，混和含有未經標識的試料聚

1242601 A7 B7 五、發明説明（19 ) 核苷酸而付予標識物質的聚核苷酸之2次探查物亦可。 I- 1—...... 11 I -- - II * _ II I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 作爲標識物質，雖可舉出螢光物質等之發光物質、半抗原、酵素、放射性同位體、電極活物質等可檢測物質，但無特別限定。對試料聚核苷酸的標識，以標識在啓動子區域爲佳。標識啓動子區域時，可使用各種公知的方法，使用經標識的引子的P C R反應，可同時進行增幅操作與標識操作故較有利用性。

、1T 繼續將試料聚核苷酸與基體上聚核苷酸置於進行雜交反應條件下。即，將經前述標識的試料聚核苷酸添加於雜交用反應溶液中後，該反應溶液中與本發明的基因檢測用載體接觸。僅試料聚核苷酸上存在基體上的核苷酸互補鏈，其試料聚核苷酸與基體上的聚核苷酸進行雜交反應使其固定化於基體上。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製雜交反應條件爲，1 0至9 0 °C範圍的反應溫度，反應時間爲1分鐘以上至1晚的程度。反應中可藉由攪拌、或振動等操作提高反應速度。雜交用的反應溶液爲離子強度爲0 · 0 1至5範圍，P Η 5至1 0的範圍之緩衝液。反應溶液中添加雜交促進劑的硫酸葡聚糖、或鮭魚精子 D N A、牛胸D N A、E D T A、界面活性劑等。其後進行適宜的洗淨步驟。繼續欲決定被驗者的前述S N P部位，可檢測出試料聚核苷酸與基體上聚核苷酸之間是否進行雜交反應。基體上含有固定化的前述（a )至（e )任一的聚核苷酸中，僅檢測出前述S N P部位爲胸腺嘧D定之聚核苷酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 22- 1242601 A7 _____B7_ 五、發明説明（20 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 或其互補鏈與試料聚核苷酸有雜交現象，便得知包含被驗者人類Μ X A基因的啓動子區域之聚核苷酸S N P部位爲胸腺嘧啶。另一方面，若檢測出前述S N P部位鳥嘌呤的聚核苷酸或其互補鏈與試料聚核苷酸有雜交現象，便得知包含被驗者人類Μ X A基因的啓動子區域之聚核苷酸 S N P部位爲鳥嘌呤。腺嘌呤、胞嘧啶時亦相同。此檢測方法可因應標識種類使用適當的檢測裝置，檢測出試料中經標識的聚核苷酸或2次探查物中之標識。標識爲螢光物質時，例如可使用螢光檢測器檢測出標識。作爲基因檢測用載體，於一個基體上，可至少一種選自前述 (a )至（e )的任一聚核苷酸之中前述S N P部位爲胸腺嘧啶者或其互補鏈、與鳥嘌呤或其互補鏈、與腺嘌呤或其互補鏈、與胞嘧啶或其互補鏈所成群一齊固定化亦可，但此時聚核苷酸的的種類與基體上的各聚核苷酸的位置以及標識種類至少一邊必須預先特定，則可明確試料中聚核苷酸與基體上的何種聚核苷酸進行雜交。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對於使用（1 )的標識物質之方法，使用由被驗者所取出之試料聚核苷酸固定化於基體上之基因檢測用載體時，可決定試料聚核苷酸之序列。即，重新付予相異標識的序列係爲選自既知（a )至（e )之聚核苷酸，與前述 S N P鹼基種類相異的聚核苷酸溶液接觸，溶液中的聚核苷酸與電極上的試料聚核苷酸置於雜交反應條件下。溶液中若存在基體上的試料聚核苷酸之互補鏈，其試料聚核苷酸與基體上的試料聚核苷酸進行雜交反應可固定化於基體本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 23 - 1242601 A 7 B7 _____ 五、發明説明（21 ) 上。其後與何等序列之聚核苷酸會產生雜交反應，由檢測出標識物質的種類而測得，便可得知試料聚核苷酸的序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇由以上方法，試料聚核苷酸與前述S N P部位具有胸腺嘧啶之聚核該酸或其互補鏈作雜交時，表示被驗者的前述S N P部位具有胸腺嘧啶，因此可預測出干擾素治療法之有效性。對於此，試料中的聚核苷酸與前述S N P部位具有鳥嘌呤之聚核苷酸或其互補鏈無進行雜交時，表示被驗者的前述S N P部位不具有胸腺嘧啶，因此可預測出干擾素治療法之無效性。再對（2 )的電化學方法做具體說明。使用上述（1 )的標示物質的方法中，試料聚核苷酸與基體上的聚核苷酸是否有雜交反應，可進行標示物質的檢測，（2 )的電化學方法中以電化學檢測出雜交反應的有無。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製電化學方法中，作爲基因檢測用載體可使用聚核苷酸固定化電極。聚核苷酸固定化電極（以下，稱爲本發明的電極）係爲，於導電性物質所成之基體上固定化前述（a )至（e )任一的聚核苷酸。必須固定化聚核苷酸的較佳導電性物質爲金亦可使用其他材料。例如可使用金的合金、銀、粗鈾、汞、鎳、鈀、矽、鍺、鎵、鎢等金屬單體以及其合金、或石墨等碳素等，或這些氧化物、化合物。這些導電性物質可於其他基板上經鍍金、印刷、濺射、蒸著等方式形成。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7?4- ' 1242601 A7 _____ B7 五、發明説明（22 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經導電性物質所成之基體上固定化聚核苷酸的方法無特別限定。例如可利用導入聚核苷酸的硫醇基與金作鍵結而可簡單進行。其他使用物理吸著、化學吸著、疏水鍵結、包埋、共鍵結等方式進行固定化。又，可使用生物素一抗生物素蛋白或碳化二亞胺等縮合劑。此時因改以具有官能基的分子修飾導電性物質表面，即容易進行固定化。且爲抑制基體表面上的聚核苷酸之非特異性吸著，可望基體面以氫硫基乙醇等硫醇、或硬脂醯胺等脂質包覆。以下作爲一例子，對金基體上固定化聚核苷酸之方法作說明。首先，以去離子水洗淨金基體後進行活性化處理。活性化處理則使用〇 · 1至1 〇 m m 〇 1 / L的硫酸溶液。此溶液中，於一〇 · 5至2 V ( v s A g / AgCl)的範圍下，iv/s 至 i〇〇〇〇〇v/s 的範圍下進行電位掃瞄。由此可活性化至金基體表面可固定化聚核的狀態。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製必須固定化的聚核苷酸於5 /或3 /末端導入硫醇基。經硫醇化的聚核苷酸，於固定化之前溶解於D T T等還原劑之溶液，使用前以膠體過濾或乙酸乙基作萃取操作將 D T T除去。固定化步驟則於離子強度0 · 0 1至5範圍下P Η 5至1 〇的範圍內之緩衝液中溶解1 n g / m 1至 1 m g / m L範圍的探查物，於活性化後馬上浸漬基體。固定化反應於4至1 0 0 °C範圍下進行1 〇分鐘至1晚的程度。固定化聚核苷酸後之基體，於無存在核酸分解酵素 (核酸酶）條件下，可望以遮光保存。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 25 一 1242601 A7 ___ B7_ 五、發明説明（23 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 基體上固定化聚核苷酸時，可使用稱爲D N A定位器或D N A排列器的固定化裝置較容易固定化聚核苷酸。此時爲不傷害基體的表面，可使用插入或靜電方式的定位爲佳。又，可直接於基體表面進行聚核苷酸的合成。本發明的電極係由，導電體以及與該導電體通電之前述本發明的電極，將其配置於基板上構成所謂的D N A晶片爲佳。D N A晶片係於基板上，較佳爲絕緣性基板上，配置以絕緣材料適切地包覆之金屬線等的導電體後，將預先固定化前述所定聚核苷酸之前述電極，與前述導電體通電而做成。具有相異序列之聚核苷酸，必須固定於各別互相絕緣之相異複數電極上。設置複數電極於基板上時，基板上必須設置的電極數目，實用上爲1 0 1至1 0 5個。於基板上設置複數個本發明電極時，更設置掃猫線，可於前述導電體與掃瞄線的交叉點上配置開關元件。藉由此，各電極上經各電極作階段式外加電壓，可於每電極上迅速決定雜交反應是否發生。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製使用本發明的電極檢測出是否發生雜交反應，與其他一般的電化學檢測法相同，除本發明的電極之外，至少設置對電極、因應必要設置適宜的對照電極。設置對照電極時，例如可使用銀/氯化銀電極或汞/氯化汞電極等一般對照電極。這些電極較佳爲配置於與本發明電極同一之基板上。使用本發明的電極，決定由被驗者採出之聚核苷酸序 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明説明（24 ) 列可由下述操作完成。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先’含人類的哺乳動物等的被驗者中採出含有核酸的試料’因應必須進行上述的萃取操作、增幅操作、及付予標識的操作。這些操作與（1 )的方法相同。但付予標識的操作並非必須。其次’含有前述試料的溶液與本發明的電極接觸，使試料聚核苷酸與電極上的聚核苷酸進行雜交之反應條件下。若試料聚核普酸中基體上存在者核脊酸的互補鏈，其試料聚核苷酸與基體上的聚核苷酸經雜交反應可固定化於基體上。其操作以及條件如（1 )的方法。其後洗淨本發明的電極。且’藉由本發明的電極旁邊添加導電性的雙股辨識體之溶液，固定於電極的聚核苷酸與試料聚核苷酸進行雜交所形成的雙股聚核苷酸中插入雙股辨識體。對於檢測有無進行試料聚核苷酸與基體上聚核苷酸的雜交反應，係由檢測於電極上外加電壓時，於電極上雙股聚核苷酸上被插入之雙股辨識體所產生的電信號而進行。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製於此所使用的雙股辨識體雖無特別限定，例如可使用 hext 3 3 2 5 8、d、/d定橘、@昆茜、dounomaicin、金屬插入體、雙吖啶等雙插入體、三插入體、聚插入體等。可使用被稱爲金屬插入體之釕、鈷、鐵等金屬錯合物或溴化乙錠等有機化合物。又，這些之外亦可使用hext 3 3 2 5 8或喹啉藍等粘合劑、抗體、酵素等生物體高分子。雙股辨識體的濃度雖依其種類而相異，但一般使用i -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 1242601 ___B7 五、發明説明（25 ) n g / m 1至1 m g / m 1的範圍。此時，離子強度〇 · 0 0 1至5的範圍下使用p Η 5至1 0範圍的緩衝液 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇本發明的電極與雙股辨識體作反應後，因應必要再洗淨電極。且本發明的電極作爲有效電極，此有效電極與以其他用途所設置之對電極之間作外加電壓，經由測定兩極間的電流，檢測出電化學性信號。電化學性信號的檢測可以如此2電極（有效電極以及對電極）方式進行，或使用有效電極、對電極、對照電極等3電極進行亦可。對於電化學性信號的檢測，可以電位爲定速下掃瞄、或以脈衝作外加電壓、或外加定電位。測定時使用電位測試器、數字式萬用表、函數發生器等裝置進而控制電流電壓。所得之 .電流値爲準，由校正曲線中算出目標基因的濃度。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製前述（a )至（e )的任一聚核苷酸中，前述S Ν Ρ 部位爲胸腺嘧啶者或其互補鏈、與前述S N P部位爲鳥嘌呤者或其互補鏈、前述S Ν P部位爲胸嘧啶者或其互補鏈，分別互相固定化於經絕緣的相異電極上，構成配置於同一基體上的D Ν A晶片，此對於進行高精確度測定而言爲較佳。此時可檢測出由各電極的各聚核苷酸所對應的電化學性信號。使用（2 )的電化學性方法，既使使用由被驗者取出的試料聚核苷酸固定化於電極上之電極，可決定試料聚核苔酸的序列。即，首先經由與已知序列的（a )至（e ) 中任一聚核苷酸之溶液接觸，溶液中聚核苷酸與電極上的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 〇8 - 1242601 A7 ____ B7 _ 五、發明説明（26 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 試料聚核苷酸至於雜交條件下。溶液中若存在者基體上試料聚核苷酸之互補鏈，其試料聚核苷酸即可與基體上得聚核苷酸進行雜交反應固定化於基體上。經由檢測出其雜交反應，可得知試料聚核苷酸的序列。上述方法中，檢測出試料聚核苷酸與前述S N P部位具有胸腺嘧啶的聚核苷酸或其互補鏈可進行雜交反應時，被驗者即於前述S N P部位具有胸腺嘧啶，其可預測出干擾素治療法係爲有效。對於此，測定出試料中的聚核苷酸與於前述S N P部位具有胸腺嘧啶之外之聚核苷酸或其互補鏈作雜交反應，且未測定出與於前述S N P部位具有胸腺嘧啶之聚核苷酸或其互補鏈之雜交反應時，表示被驗者的前述S N P部位不具有胸腺嘧啶，故可測預測出干擾素治療法無效。〈電性檢測裝置〉經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以下則表示使用本發明電極，決定由被驗者取出聚核苷酸之序列時之基因檢測裝置一例子。即，具備有前述本發明的電極、與固定化於電極上之聚核苷酸進行雜交反應的反應部、固定化於前述電極的核酸作電壓外加之方法、以及測定因該電壓外加方法的動作所產生的信號之測定方法等的基因檢測用裝置。〈電性檢測裝置的基本構成〉圖1中表示如此基因檢測用裝置的基本實施形態。圖 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 1242601 _ B7 _ 五、發明説明（27 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2中，係由1 1爲將聚核苷酸1 2固定化的電極。1 3爲反應槽、電源1 4則介於電極1 1與反應槽1 3連接形成回路。又回路的內部中設有電流計1 5、電壓計1 6、以及可變電阻1 7，反應槽1 3內進行雜交反應後，外加電壓，測定流入回路的電流等所構成。使用圖1的基因檢測用裝置進行測定時，反應槽1 3 的內部中保存緩衝液與由被驗者取出之含聚核苷酸試料，試料聚核苷酸與電極1 1上的聚核苷酸1 2進行雜交反應。雜交的溫度以及時間等條件如上述。其次洗淨反應槽 1 3以及電極1 1爲佳，將含有插入劑的雜交溶液注滿於反應槽1 3中開動電源1 4，使用電流計1 5或電壓計 1 6，測定出電源値或電壓値等。圖1中係表示本發明的基因檢測用裝置最爲基本之形態，但因欲使檢測過程能完全地自動化，本發明的基因檢測用裝置可如圖2等更爲複雜的構造。〈自動化電性檢測裝置之構成〉經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖2所示檢測裝置2 0係保持聚核苷酸固定化電極，具備有電極支架2 1、反應槽22、第1洗淨槽2 3、插入劑反應槽2 4、第2洗淨槽2 5、與電化學測定槽2 6 、以及載持反應槽2 2、第1洗淨槽2 3、插入劑反應槽 2 4、第2洗淨槽2 5、與電化學測定槽2 6的移動裝置 2 7、以及分析單位28、以及操作單位29。這些槽之間的電極移動，使用移動裝置2 7而達到反應槽等移動。本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ % _ 1242601 A7 _ B7 ' ------------------------ 五、發明説明（28 ) 〈自動化電性檢測裝置使用法〉檢測裝置2 0的使用方法如下述。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先’於反應槽2 2中放入含有試料或預先由試料萃取出的聚核苷酸之溶液，固定化於電極固定支架2 1的上述電極浸漬於反應槽2 2中。再於反應槽2 2中進行雜交反應後’電極固疋支架2 1移至第1洗淨槽2 3中。於第 1洗淨槽2 3中進行洗淨，除去非特異性與電極結合之核酸或蛋白質等。洗淨後，電極固定支架2 1移至插入劑反應槽2 4中，經由雜交反應所形成的雙股聚核苷酸中插入插入劑。再將電極固定支架21移至第2洗淨槽25，進行洗淨後，將電極固定支架2 1移至電化學測定槽2 6，進行電化學性測定。測定終了後，參考於分析單位2 8作預先記錄之校正曲線，測定出試料中聚核苷酸之濃度。以上的操作，連通各個槽，以及與單位作電相連之操作單位 2 9而進行。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明提供一種具備本發明基因檢測用載體與緩衝液之套組。如此本發明的基因檢測用載體與緩衝液以套組方式提供時，可直接進行檢測而十分方便。於本發明套組所必須的緩衝液，可使用於雜交反應的任意緩衝液皆可。例如可舉出磷酸緩衝液、碳酸緩衝液、 Tns緩衝液等，但不限定於此。套組中可附有除緩衝液外或取代緩衝液使用基因增幅用引子、螢光色素標識核苷酸、酵素、純化用柱等。本發明提供一種具備電極與雙股辨識體之套組。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ΙΊ 一 1242601 A7 ____ B7 五、發明説明（29 ) 本發明套組中必須使用的雙股辨識體，例如可係爲有關本發明的電極之上述雙股辨識體。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 套組中可同時附有雙股辨識體，或取代雙股辨識體使用基因增幅用引子、酵素、緩衝液、核苷酸等。以下以實施例對本發明作更詳細的說明。實施例1 : 此實施例中，具有MxA基因的啓動子區域之一 8 8 位（序列號碼1的鹼基序列中相當於第4 5 5位）核苷酸爲胸腺嘧啶之基因（以下以Μ X A ( T )表示）以異型或同型接合的H C V感染者，與具有該核苷酸爲鳥嘌呤之基因（以下以MxA (G)表示）以同型接合的HCV感染者作比較，證實其對干擾素治療法之反應性較爲佳。〈被驗者〉經濟部智慧財產局員工消費合作社印製組織學上證明患有慢性C型肝炎，且以干擾素治療法進行治療的1 1 5個患者，與抗H C V陰性的健康者4 2 人參加本硏究。這些成員全爲日本人，且彼此間無血緣關係。 1 1 5的患者中，5 2個患者終了干擾素治療後至少作6個月的追蹤時間，其間這些人的血淸丙胺酸轉胺酶爲正常範圍，且爲H C V的R Ν Α持續保持陰性反應者（以下以S R表示），6 3個患者與A L T値無關，於追蹤期間中H C V的R Ν A保持陽性反應者，或爲復發C型肝炎 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明説明（30 的非反應帛（以下以NR表示）。所有患者皆投與超過總用量爲3 0 0萬單位之干擾素以以及/或卢。〈Μ x A基因分析〉作爲對照實驗，由患者與健康人中取出來自p B M c 的核酸。該核酸使用P C R方法增幅包含Μ χ A基因啓動子區域之5 9 9核苷酸的d N A。 P C R的槪略如下述。 Ο · Ο 5 M g的核酸與Taq-Gold (帕金—埃爾默）、序列號碼1 2的寡核苷酸引子#MXAF〇l (正向引子，—569 〜一 5 4 0位）、以及序列號碼6的寡核苷酸引子 # Μ X A F 〇 2 (逆向引子，+ 3 0〜+ 1位）混合後，以〔9 5 °C 1 0 分鐘〕、〔9 5 °C 1 0 秒，6 8 °C 6 0秒〕χ 5 5 ，〔 7 2 °C 7分鐘〕的循環條件下使其反應。藉由直接解讀P C R產物決定1 5 7的試料中1 2 個序列。藉由序列決定，定義增幅的區域中的S N P部位後，構築欲檢測可辨識相對基因的核苷酸之R F L P系統。全部患者的5 9 9核苷酸之P C R產物以H h a I ( G C G i C )消化，以瓊脂糖膠作電泳，對4 8 2核苷酸之染色帶以及5 3 3核苷酸染色帶之一或兩者是否生成作調查。 —-----.--衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） -33- 1242601 A7 B7 五、發明説明（31 ) 〈統計分析〉 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 進行葉兹校正，或以費歇爾之或然率測試比較這些數據’以p & L T ; 〇 · 〇 5於統計學上作爲顯著差。〈結果〉藉由決定1 2個樣品的序列，定義Μ X A基因的啓動子區域中多型部位。該啓動子區域的一 8 8位存在著 S N P ( G與T )，該S N P含於類似圖3所示的 I S R E之區域中。再以H h a I的r f L P中，對全1 5 7個樣品決定 Μ X A基因的基因型。該測定中多型部位具有鳥嘌呤的試料’於電泳中顯不4 8 2核苷酸染色帶。對於此，若將鳥嘌呤由胸腺嘧啶取代時，因H h a I所辨識的特定部位已消失，故顯示5 3 3核苷酸染色帶。多型部位爲鳥嘿呤的啓動子區域與多型不爲爲胸腺嘧啶的啓動子區域以異型接合時’可同時檢測出4 8 2核苷酸染色帶與5 3 3核苷酸染色帶（參照圖4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如表1所示，N R群中，6 2 %的患者，雖以同型接合方式具有前述多型部位爲鳥嘌呤之啓動子區域（G · G 同型）、SR群中3 1%的患者爲G · G同型（p = 0 · 0 0 0 9 ; S R V S NR)。相對地，N R 群中 3 5 %的患者以異型接合方式具有前述多型部位爲鳥嘌呤之啓動子區域，與前述多型部位爲胸腺嘧啶之啓動子區域 (G · T異型）、S R群中6 0 %的患者爲G · T異型（ -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 1242601 B7 五、發明説明（32 ) P = 〇.〇〇82;SR vs NR) °Τ·Τ同型的患者分別NR群爲3 · 2%，SR群爲10% (ρ = 〇.2956;SR vs NR)。具有前述多型部位爲鳥嘌呤的啓動子區域之相對基因的頻度，對SR群爲0·606而言，NR群爲 0.794(p = 0.0018；SR vs NR)。【表1】 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

MxA啓動子的 SR患者 NR 健康對照組 P: -88位多型 (n=52) (n=63) (n=42) SR vs NR 相對基因頻率 G 0 606 0 794 0 714 0.0018 T 0 394 0.296 0.286 0.0018 接合型 G.G同型 16(31%) 39(62%) 20(48%) 0.0009 G.T異型 31(60%) 22(35%) 20(48%) 0.0082 T.T同型 5(10%) 2(32%) 2(4.8%) 0.2956* *進行葉茲校正 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1242601 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（34 ) 如表2可明瞭，感染到基因型爲1 b的H C V之患者群（HCV 1 b群）與感染到基因型爲2 a或2b的 HCV之患者群（HCV 2a/2b群）中，其62% 的N R群同時爲G · G同型之個體，相對於此S R群則分別爲2 8%以及3 2%爲G · G同型。由表2所不結果可知，患者所感染的H C V之基因型無論爲何，顯示S R群中G · G同型之個體顯著地較爲少（H C V 1 b群；ρ = 0.0 321、HCV 2a/2b 群；p = 0·0318)〇由上述本發明實施例可知，以異型接合或同型接合方式具有前述多型部位爲胸腺嘧啶之Μ X A啓動子區域之 HCV感染者，無論其所感染的HCV基因型爲何，皆證實其顯示較高干擾素治療法之反應性。又，本發明實施例中，以異型接合或同型接合方式具有前述多型部位非爲鳥嘌呤之Μ X A啓動子區域之H C V 感染者，顯示對干擾素治療法有著較高反應性。且，因前述多型部位存在於I SRE中，故亦適用於 C型肝炎以外的疾病。實施例2 如實施例1所示，Μ X Α啓動子的S Ν Ρ爲Τ型的 H C V感染者以投與干擾素的肝炎治療其效果高。另一方面，其S Ν Ρ爲G型時則治療效果則低。此理由爲，雖達成I S R Ε功能的鹼基序列之Τ型對干擾素的刺激有正反本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -37- I - 衣------1Τ------·— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1242601 A7 __B7 _______ 五、發明説明（35 ) 應，但G型若與其序列的1鹼基相異，對干擾素的刺激未反應，可解釋爲Mx A蛋白質的生成量較爲低。考慮到如此狀況，Μ X A啓動子的S N P爲C型以及 A型的H C V肝炎患者亦與G型同樣，其MxA啓動子對干擾素未反應，推定其治療效果較低。欲證明這些，構築於Μ X A啓動子下游的蟲螢光素酶基因的質體，將此轉移感染至人類細胞（H e L a細胞、以及卵巢癌細胞），因此對具有4種類的S N P ( T型、 G型、A型、C型）的各MxA啓動子，作爲這些對干擾素的反應結果，調查其所產生的蟲螢光素酶活性。其結果如圖5至圖8所示。圖5爲使用干擾素α於 H e 1 a細胞內進行誘導之例子，圖6爲使用干擾素α於卵巢癌細胞內進行誘導之例子，圖7爲使用干擾素/5於 H e 1 a細胞內進行誘導之例子，圖8爲使用干擾素/3於卵巢癌細胞內進行誘導之例子。又，對於這些圖，+表示添加干擾素時的蟲螢光素酶活性，-表示不添加干擾素時的蟲螢光素酶活性。這些結果皆爲3次實驗的平均値，其標準差以柱狀圖表示。由圖可知，任何狀況下，T型的Μ X A啓動子顯示最高値，具有A型與C型的SNP之HCV肝炎患者與G型時相同，對於干擾素α以及干擾素A顯示較低反應性。因此，預測出以干擾素的治療效果低。本實施例中以參照圖9對於使用本發明基因檢測用載體預測干擾素治療法的有效性之操作作說明。 — — ：----Γ — f ! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- 1242601 A7 _____ _ 五、發明説明（36 ) 首先，欲做成本發明的基因檢測用載體，使用序列號碼2與序列號碼2 2的引子，增幅序列號碼1的聚核苷酸片段，含有前述S N P部位，該S N P部位爲胸腺嘧啶之 T型片段3 1 ’與含有序列號碼2的聚核苷酸之前述 S N P部位，該S N P部位爲鳥嘌呤之g型片段3 2，以蒸餾水調製出2 // g/// L。其次’各片段中添加等量的4 m g / m L的硝基纖維素（D Μ S〇溶液），經熱變性後，將片段點於以聚賴胺酸包覆的玻璃片3 3上。充分乾燥後，此片段點以紫外線照射進行固定化處理，得到固定化的丁型片段3 1與G型片段3 2之基因檢測用載體。再經由序列號碼2 0與序列號碼2 1的引子，作由被驗者血液取得之試料聚核苷酸的增幅處理後，進行falmaS1a 製E C L資料庫系統的F I T C標識，與預先調製的前述基因檢測用載體作1 2小時6 5 °C的反應。反應後，於螢光檢測器測定其信號。其結果，由固定化T型的片段點觀察到螢光信號，並判斷出使用於本試驗的試料聚核苷酸之S N P爲T型。實施例4 本實施例中以參照圖1 0對於使用本發明基因檢測用載體預測干擾素治療法的有效性之操作作說明。由被驗者檢測出的聚核苷酸使用序列號碼2 1 、序列號碼2 2的引子增幅之片段（試料A : 4 1、試料B : — .—41^衣— (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39- 1242601 Α7 Β7 五、發明説明（37 ) 4 2) ’以蒸I留水調製至2 // g / // L。再添加等量的4 m g / L硝基纖維（D M S 0溶液），經熱變性後，將片段點於以聚賴胺酸包覆的玻璃片4 3上。充分乾燥後，此片段點以紫外線照射進行固定化處理。預先作螢光標識的序列號碼1之聚核苷酸片段，其含有前述S Ν Ρ部位且該S Ν Ρ部位爲胸腺嘧啶之τ型片段 (J〇Ε標識），與預先作螢光標識的序列號碼2的聚核苷酸片段，其含有前述S Ν Ρ部位且該S Ν Ρ部位爲鳥嘌呤之G型片段（5 - F A Μ標識）、預先作螢光標識的序列號碼3的聚核苷酸片段，其含有前述S Ν Ρ部位且該

5 Ν Ρ部位爲腺嘌呤之Α型片段（T A M R Α標識）、預先作螢光標識的序列號碼4的聚核苷酸片段，其含有前述 S Ν P部位且該S Ν P部位爲胞嘧啶之C型片段（R〇X 標識），與預先調製的D Ν A晶片作1小時、5 0 °C反應〇

反應後以螢光檢測器測定其信號。其結果僅得到來自 Η Ε X的螢光信號，判斷本試料聚核苷酸的S Ν P僅爲T 型。實施例5 本實施例以參考圖1 1 ，對於利用電化學性檢測之基因檢測用載體作說明。使用序列號碼2 1與序列號碼2 2的引子’增幅序列號碼1的Τ型片斷5 1與G型片段5 2，以蒸餾水調製至本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） —-----·—衣— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1242601 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（38 ) 2 β g/ # L。再與2 —經基乙基一*硫化物與1 環己基 —3 -（ 2 -碼啉乙基）一碳化二亞胺進行反應’於增幅產物的末端導入硫醇基。此片段點於預先製作的金屬極 5 3上，使其未乾燥的情況下反應1小時。樣品則使用序列號碼2 1與序列號碼2 2的引子進行增幅’經熱變性後，與預先調製的D N A晶片作1小時、6 5 °C的反應。反應後，1 0 // m ο 1 / L的hext 3 3 2 5 8溶液中進行伏安測定，測定hext 3 3 2 5 8的氧化電流値。其結果’若由固定化G型片段的電極得到顯著的信號’判斷本試料爲 G型。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -41 - 本纸張尺度逍用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 1242601 A7 B7 五、發明説明（39) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA <120λ基因檢測用載體，以及使用於干擾素治療法有效之檢測 <130〉 Α000001162 <140〉 <141〉 <160〉 22 <170> Patentln Ver. 2.0 <210〉 1 <211> 581 、 <212> DNA <213〉人種經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 1 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcc.tggtta ggggtgggag tgctggacgg ^gttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcGtccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tccc.gcgagg caagtgctgm 420 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1242601 A7 ______B7 五、發明説明（40 ) aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgctcccgg agccgcc.ctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagc.g gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 2 <211> 581 <212〉 DNA <213> 人種 <400〉 2 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ! ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcgcccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 ac.cgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210〉 3 <211〉 581 . <212> DNA <213>人種 <400> 3 atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60 ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I *--衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -43- 1242601 A7 B7 五、發明説明（41 ) ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180 gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240 gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300 gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360 ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420 aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcacccgg agccgccctc agcacagggt 480 ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540 accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581 <210> 4 <211〉 581 <212〉 DNA <213> 人種 •衣· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

<400〉 4 atgagccaga ggtat.gggtg ctgcagccat gccctgggag gggaaggaca gagcctccgg ggcctgggtt aggtgcgggg ctgtgagttt accgagagcg <210〉 5 <211> 16 <212〉 DNA ctccagggag tgcctggtta tggcacac.aa ggaactgaag tgcctaggtt agcaccttga cgggcccgag ccaggagcta cat ttcttcg gaggccgcac gcctagaagt ggggtfggag tgcctgggag acccccaatt caaggatacg tcctc.agacg aacctgcgtc ggtttcgttt ccggcgcggg tccagcactg gggcaagggg tgctggacgg tccctgctgg accaatgcat tgcaggcttg ggcctgatga tcccgcgagt ctgcccccgg gcggggctgg cgcagggacc aaacgggaaa agttcgggac tgctgggatc ctgttttcaa gatgactccg aacgagcatc tcccgcgagg agccgccctc gcgcggggtg g ggaggaagat 60 aagaggggct 120 atcccagtga 180 aaccgacggg 240 ggccattagg 300 tgattcagca 360 caagtgctgm 420 agcacagggt 480 aaagaggcga 540 581 訂 I Ψ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44- 1242601 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（42 ) <213〉人種 <400> 5 ggtttcgttt ctgctc <210〉 6 <211〉 16 <212〉 DNA <213〉人種 <400> 6 ggtttcgttt ctgcgc <210〉 7 <211〉 16 <212〉 DNA <213〉人種 <400〉 7 ggtttcgttt ctgcac <210〉 8 <211〉 16 <212> DNA <213〉人種 <400> 8 ggtttcgttt ctgccc 16 ΚΓ， 16 16 16 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 45 _ 1242601 A7 B7 五、發明説明（43 ) <210〉 9 <211〉 1〇 <212> DNA <213〉人種 <400〉 9 ttctgc t.cccg <210> 1〇 <211〉 1〇 <212> DNA <213〉人種 10 —------i--衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 1〇 ttctgcgc.ccg 10 、11

<210> 11 <211〉 1〇 <212> DNA <213〉人 S f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400〉 11 ttctgcacccg <210> 12 <211> 1〇 <212> DNA <213〉人種本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 46- 10 1242601 A7 B7 五、發明説明（44 <400> 12 ttctgcccc.cg 10 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213〉人種 <400〉 13 gagcag aaacgaaacc 16 <210> 14 <211〉 16 <212〉 DNA <213〉人種 <400〉 14 gcgcag aaacgaaacc 16 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 15 <211> 16 <212〉 DNA 〈213>人種 <400〉 15 gtgcag aaacgaaacc <210〉 16 <211〉 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -47- 16 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1242601 A7 _B7 五、發明説明（45 )

<212〉 DNA <213〉人種 <400〉 16 gggcag aaacgaaacc 16 <210〉 17 <211〉 10 <212〉 DNA <213〉人種 <400〉 17 cgggagcagaa 10 <210〉 18 ' <211〉10 价，' <212〉 DNA <213〉人種 <400> 18 cgggc.gcagaa 10 <210〉 19 <211> 10 * <212〉 DNA ' <213〉人種 <400> 19 · cgggtgcagaa 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I V--·裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1242601 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（46 ) <21〇> 20 <211> 1〇 <212> DNA <213〉人種卜，r，’ <400> 20 cgggggcagaa <210> 21 · <211> 30 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223〉人造序列的決定：引子 <400> 21 acac.acccgt ttccaccctg gagaggccag <210> 22 <211〉 30 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223〉人造序列的決定：引子 <400> 22 ---------衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -49- 1242601 A7 B7 五、發明説明（47 卜:P， tgcgcagtgc tggagtgcgg cctccgctct 30 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 5〇 _

Claims

補充公 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍第90 1 05 865號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國9 4年1月 6日修正 1 . 一種基因檢測用載體，其特徵爲含有具備基體、以及可固定化該基體的聚核苷酸、該聚核苷酸則含有選自 (a t )下述序列表的序列號碼1所示之聚核苷酸、 (c t )至少含有序列號碼1的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼1所示聚核苷酸、 (d t )至少含有序列號碼1的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼1所示聚核苷酸、 (e t ) (at)、 ( c t ) 、（ d t )序列的互補鏈所成群的聚核苷酸。 2 . —種基因檢測用載體，其特徵爲含有具備基體、以及可固定化該基體的聚核苷酸、該聚核苷酸則含有選自 (a g )下述序列表的序列號碼2所示之聚核苷酸、 (c g )至少含有序列號碼2的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼2所示聚核苷酸、 (d g )至少含有序列號碼2的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼2所示聚核苷酸、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言. 經濟部智慧財羞局員工涓脅合作社邱製 1242601 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (eg) ( a g ) 、（ c g ) 、（ d g )序列的互補鏈 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所成群的聚核苷酸。 3 . —種基因檢測用載體，其特徵爲含有具備基體、以及可固定化該基體的聚核苷酸、該聚核苷酸則含有選自 (a a )下述序列表的序列號碼3所示之聚核苷酸、 (c a )至少含有序列號碼3的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼3所示聚核苷酸、 (d a )至少含有序列號碼3的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼3所示聚核苷酸、 (e a ) ( a a ) 、 ( c a ) 、（ d a )序列的互補鏈所成群的聚核苷酸。 4 . 一種基因檢測用載體，其特徵爲含有基體、經濟部智慧財產局員工涓黄合作社印製以及選自 (a c )下述序列表的序列號碼4所示之聚核苷酸、 (c c )至少含有序列號碼4的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼4所示聚核苷酸、 (d c )至少含有序列號碼4的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼4所示聚核苷酸、 (e c ) ( a c ) 、（ c c ) 、（ d c )序列的互補本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -2 - 1242601 as C8 D8 六、申請專利範圍鏈所成群的聚核苷酸。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 .如申請專利範圍第1項至第4項中任一項的基因檢測用載體，其中固定化於該基體上之聚核苷酸之長度爲 1 5個核苷酸以上3 〇個核苷酸以下者。 6 .如申請專利範圍第1項至第4項中任一項的基因檢測用載體，其中該基體係由導電物質所成，該基因檢測用載體爲電極者’。 7 . —種D N A晶片，其特徵爲具備基板' 以及形成於基板上的第1以及第2電極’ 該第1電極具備導電性基體、與固定化於該導電性基體上的至少一種選自於下述（a t )至（e t )之聚核苷酸， (a t )下述序列表的序列號碼1所示之聚核苷酸、 (c t )至少含有序列號碼1的4 4 1〜4 5 5位置聚示所經濟部智慧財產局員工消費合作社印製碼列 1 序碼有號含列少序至之 3 rnu t 歹序 d 的 C 示所碼列序C 之 } o t 歹序 e 的 C 示所鏈第該少 a 至 CD 之 C 上至體 } 基 a 張 -紙本準檩一家國 !國中用 I適置位 9 5 4 一 9 4 、4 酸的一甘1β 核酸苷核聚示所 C d 補互的列序該於化定固與基成所質物性電導由係極 3 3 /IV 述下於自選一 1311 種 C 6 /^V 至 \)y C 3 酸 e 苷 (核至聚 >的 1242601 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 (a g )下述序列表的序列號碼2所示之聚核苷酸、 (c g )至少含有序列號碼2的4 4 1〜4 5 5位置 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所示的序列之序列號碼2所示聚核苷酸、 (d g )至少含有序列號碼2的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼2所示聚核苷酸、 (eg) ( a g ) 、（eg) 、（ d g )序列的互補鏈 (a a )下述序列表的序列號碼3所示之聚核苷酸、 (c a )至少含有序列號碼3的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼3所示聚核苷酸、 (d a )至少含有序列號碼3的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼3所示聚核苷酸、 (e a ) ( a a ) 、（ c a ) 、（ d a )序列的互補鏈 (a c )下述序列表的序列號碼4所示之聚核苷酸、 (c c )至少含有序列號碼4的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼4所示聚核苷酸、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (d c )至少含有序列號碼4的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼4所示聚核苷酸、 (e c ) (ac) 、（cc) 、（dc)序列的互補鏈。 8 .如申請專利範圍第7項之DNA晶片，其中固定化於該導電性基體的聚核苷酸之長度爲1 5個核苷酸以上 3 0個核苷酸以下。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 4 - 1242601 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 9 · 一種檢測方法，其特徵爲對個體的千擾素治療法有效性之檢測方法，其具備 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由該個體取出的試料聚核苷酸，與申請專利範圍第1 至4項中任一項之基因檢測用載體進行接觸的步驟、與檢測出該試料聚核苷酸，與固定化於該基因檢測用載體之聚核苷酸之雜交反應，決定該試料中的聚核苷酸之鹼基序列之步驟，更具備經由該鹼基序列的決定步驟所決定的該試料聚核脊酸之鹼基序列，其若含有如下述（a t ) 至（e t )，即可檢測出對於該個體而言干擾素治療法的有效性之步驟， (a t )序列號碼1所示之聚核苷酸、 (c t )至少含有序列號碼1的4 4 1〜4 5 6位置所不的序列之序列號碼1所示聚核脊酸、 (d t )至少含有序列號碼1的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼1所示聚核苷酸、 (e t )該（a t )至（d t )的聚核苷酸之互補鏈〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 〇 ·如申請專利範圍第9項之檢測方法，其中進行接觸基因檢測用載體之步驟前，進行附予標識於該個體所取出的聚核苷酸之步驟。 1 1 ·如申請專利範圍第1 0項之檢測方法，其中該標識爲至少一種選自於螢光色素、半抗原、酵素、放射性同位體、電極活性物質。 1 2 ·如申請專利範圍第9項之檢測方法，其中該基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5 - ~~~ 1242601 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 因檢測用載體係使用如申請專利範圍第6項之基因檢測用載體，對於該試料中聚核苷酸的鹼基序列決定步驟之雜交反應的檢測，由檢測伴隨該雜交反應所產生的電性化學性變化而進行。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之檢測方法，其特徵爲伴隨該雜交反應所產生的電性化學性變化之檢測爲，對基因檢測用載體以及對電極作外加電壓時，測定該基因檢測用載體以及該對電極之間所產生的電信號而進行。 1 4 ·如申請專利範圍第‘ 1 3項之檢測方法，其特徵爲該雜交反應時，添加以特異性加成於雙股聚核苷酸的導電性雙股辨識體，該基因檢測用載體與該對電極之間所產生的電信號爲，直接或間接由導電性之雙股辨識體所產生者。 1 5 · —種檢測方法，其特徵爲對個體的干擾素治療法有效性之檢測方法，其具備曰亥個體所取出之I式料聚核甘酸固定化於基體上所成之基因檢測用載體，與探查物聚核苷酸接觸之步驟，以及經濟部智慧財產局員工消費合作社印製檢測固定化於該基體上的試料聚核脊酸，與該聚核脊酸的雑父反應’進而決定該試料聚核脊酸的鹼基序列之步驟，其中該探查物聚核苷酸係含有選自於， (a t )下述序列表的序列號碼1所示之聚核苷酸、 (c t )至少含有序列號碼1的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列之序列號碼1所示聚核苷酸、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- 1242601 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (d t )至少含有序列號碼1的4 4 9〜4 5 9位g 所示的序列之序列號碼1所示聚核苷酸、 (e t ) ( a t ) 、（ c 1 ) 、（ d t )序列的互補鏈 (a g )下述序列表的序列號碼2所示之聚核:g： g变、 (c g )至少含有序列號碼2的4 4 1〜4 5 5丨立置所示的序列之序列號碼2所示聚核苷酸、 (d g )至少含有序列號碼2的4 4 9〜4 5 9丨立® 所示的序列之序列號碼2所示聚核苷酸、 (e g ) ( a g ) 、（eg)、（ d g )序列的互補鏈 (a a )下述序列表的序列號碼3所示之聚核:g： _、 (c a )至少含有序列號碼3的4 4 1〜4 5 5位置所示的序列序列號碼3所示之聚核苷酸、 (d a )至少含有序列號碼3的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼3所示聚核苷酸、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) a a rv a 6 \)/ a c 補互的列序 \)/ οα d 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製鏈酸苷核聚之示所 4 碼列序的表列序述下 C a 號列序有ί 含號少列至序 } 之列序的示所 C C 的酸 , 苷馬核石聚示所置位 5 5 置位 9 5 4 一 9 4 4 、的酸 4苷 f 核 0聚 5 一不歹斤序U 有碼含號少列至序ί } 之 3 C列 C d 序 e C 勺 C 白示所 3 C C C 補互的列序 \1/ C d 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 1242601 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍鏈所成群的聚核苷酸，更具備經由該鹼基序列的決定歩驟所決定的該試料聚核苷酸之鹼基序列，其若含有如下述 (a t )至（e t )，即可檢測出對於該個體而言干擾素治療法的有效性之步驟， (a t )序列號碼1所示之聚核苷酸、 (c t )至少含有序列號碼1的4 4 1〜4 5 6位置所不的序列之序列號碼1所示聚核脊酸、 (d t )至少含有序列號碼1的4 4 9〜4 5 9位置所示的序列之序列號碼1聚核苷酸、 (e t )該（a t )至（e t )的聚核苷酸之互補鏈〇 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項的檢測方法，其中進行接觸基因檢測用載體之步驟前，進行附予標識於該個體所取出的聚核苷酸之步驟。 1 7 .如申請專利範圍第1 6項之檢測方法，其中該標識爲至少一種選自於營光色素、半抗原、酵素、放射性同位體、電極活性物質。 1 8 ·如申s靑專利範圍第1 6項之檢測方法，宜中言亥基因檢測用載體爲，固定化於導電基體上的該個體所取出之試料聚核有:酸的電極，對於該試料中聚核苷酸的鹼基序列決定步驟之雜交反應的檢測，由檢測伴隨該雜交反應所產生的電化學性變化本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ^ " ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T .1# 1242601 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍而進行。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 9 ·如申請專利範圍1 8項之檢測方法，其中伴隨該雜交反應所產生的電化學性變化之檢測爲，對基因檢測用載體以及對電極作外加電壓時，測定該基因檢測用載體以及該對電極之間所產生的電信號而進行。 2 〇 ·如申請專利範圍第1 9項之檢測方法，其特徵爲該雜交反應時，添加以特異性加成於雙股聚核苷酸的導電性雙股辨識體，該基因檢測用載體與該對電極之間所產生的電信號爲，直接或間接由導電性之雙股辨識體所產生者。 2 1 _ —種使用於檢測干擾素治療法有效性的基因檢測用裝置，其特徵爲至少一種選自於申請專利範圍第1項至第4項的基因檢測用載體、以及至少具備固定化於該基體上的聚核苷酸，與含有附予標識的聚核苷酸的試料接觸，使固定於該基體上的聚核苷酸與附予該標識的聚核苷酸進行雜交之反應條件下的反應部、以及檢測附予該標識的聚核苷酸所附的標識之標識檢測裝置。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 2 ·如申請專利範圍第2 1項之基因檢測用裝置，其中該標識爲至少一種選自於螢光色素、半抗原、酵素、放射性同位體、電極活性物質。 2 3 . —種使用於檢測干擾素治療法有效性的基因檢測用裝置，其特徵爲具備如申請專利範圍第6項之基因檢測用載體，以及本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -9 - ABCD 1242601 六、申請專利範圍對電極、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 外加電壓於該基因檢測用載體以及該對電極之間的外加電壓部、固定化於該基因檢測用載體的該聚核苷酸，與含有聚核苷酸的試料接觸，使固定化於該基體上的聚核苷酸與該試料中的聚核苷酸進行雜交反應的條件下之反應部、以及該雜交反應後以該外加電壓手段外加電壓時，測定該基因檢測用載體以及該對電極之間所產生的電信號的測定部。 2 4 ·如申請專利範圍第‘ 2 3項之使用於檢測干擾素治療法有效性的基因檢測用裝置，其中對該反應部而言，該雜交反應所產生的雙股聚核苷酸中添加特異性加成之導電性雙股辨識體，該基因檢測用載體以及該對電極之間所產生的電信號係由該雙股辨識體所產生者。 2 5 . —種測定干擾素治療法有效性之套組，其特徵爲具備如申請專利範圍第1項至第4項之基因檢測用載體，與緩衝液者。 2 6 · —種測定對個體的干擾素治療法有效性之套組經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ’其特徵爲具備如申請專利範圍第6項之基因檢測用載體、雙股辨識體、及緩衝液。 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐）