JP2001333786A - 遺伝子検出用担体、及びインターフェロン療法の有効性を検出するためのその使用 - Google Patents
遺伝子検出用担体、及びインターフェロン療法の有効性を検出するためのその使用Info
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Abstract
るか否かを治療前に予測するための手段を提供するこ
と。 【解決手段】遺伝子検出用担体、個体に対するインター
フェロン療法の有効性の検出方法、遺伝子検出用装置、
及びインターフェロン療法の有効性を検出するためのキ
ットを提供する。
Description
体、個体に対するインターフェロン療法の有効性の検出
方法、個体に対するインターフェロン療法の有効性の検
出するための遺伝子検出用装置、及びインターフェロン
療法の有効性を検出するための遺伝子検出用キットに関
する。
と称する)の感染者が急増しており、大きな社会問題と
なっている。
は、インターフェロン療法が一定の効果を有することが
明らかとなっているが、インターフェロン療法は、全て
の感染者に対して有効なわけではなく、インターフェロ
ン療法が効果を示さない感染者も少なからず存在する。
インターフェロン療法が効果を示さない感染者にインタ
ーフェロン療法を継続することは、感染者に発熱や貧血
などの副作用を引き起こすのみならず、他の治療の開始
を遅らせることになる。
対してインターフェロン療法が有効であるか否かを、治
療前に予測することが切望されていたが、現在まで、か
かる予測を行うことは全く不可能であった。
明は、患者にインターフェロン療法が有効であるか否か
を治療前に予測するための手段を提供することを課題と
するものである。
明によって達成される。
記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え、
前記ポリヌクレオチドは、(at) 下記配列表の配列番号
1に示されるポリヌクレオチド、(bt) 前記(at)に示さ
れるポリヌクレオチド中の455位を除く1もしくは数個
のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリ
ヌクレオチド、(ct) 配列番号1の441〜455位に示され
る配列を含むポリヌクレオチド、(dt) 配列番号1の449
〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、(et)
それらの相補鎖からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドを含むことを特徴とする遺伝子検出用担体が提供さ
れる。
記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え、
前記ポリヌクレオチドは、(ag) 下記配列表の配列番号
2に示されるポリヌクレオチド、(bg) 前記(ag)に示さ
れるポリヌクレオチド中の455位を除く1もしくは数個
のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリ
ヌクレオチド、(cg) 配列番号2の441〜455位に示され
る配列を含むポリヌクレオチド、(dg) 配列番号2の449
〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、(eg)
それらの相補鎖からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドを含むことを特徴とする遺伝子検出用担体が提供さ
れる。
記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え、
前記ポリヌクレオチドは、(aa) 下記配列表の配列番号
3に示されるポリヌクレオチド、(ba) 前記(aa)に示さ
れるポリヌクレオチド中の455位を除く1もしくは数個
のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリ
ヌクレオチド、(ca) 配列番号3の441〜455位に示され
る配列を含むポリヌクレオチド、(da) 配列番号3の449
〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、(ea)
それらの相補鎖からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドを含むことを特徴とする遺伝子検出用担体が提供さ
れる。
記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え、
前記ポリヌクレオチドは、(ac) 下記配列表の配列番号
4に示されるポリヌクレオチド、(bc) 前記(ac)に示さ
れるポリヌクレオチド中の455位を除く1もしくは数個
のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリ
ヌクレオチド、(cc) 配列番号4の441〜455位に示され
る配列を含むポリヌクレオチド、(dc) 配列番号4の449
〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、(ec)
それらの相補鎖からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドを含むことを特徴とする遺伝子検出用担体が提供さ
れる。
検出用担体を用いたDNAチップが提供される。
るインターフェロン療法の有効性の検出方法であって、 1)前記個体から採取した試料ポリヌクレオチドを前記
遺伝子検出用担体に接触させる工程と、 2)前記試料ポリヌクレオチドと前記遺伝子検出用担体
に固定化されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ション反応を検知し、前記試料中のポリヌクレオチドの
塩基配列を決定する工程とを備える方法が提供される。
に対するインターフェロン療法の有効性の検出方法であ
って、 1)前記個体から採取した試料ポリヌクレオチドが基体
上に固定化されてなる遺伝子検出用担体にプローブポリ
ヌクレオチドを接触させる工程と、 2)前記基体上に固定化された試料ポリヌクレオチドと
前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応
を検知し、前記試料ポリヌクレオチドの塩基配列を決定
する工程とを備える方法が提供される。
下記配列表の配列番号1に示されるポリヌクレオチド、
(bt) 前記(at)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、(ct) 配列番号1の4
41〜455位に示される配列を含むポリヌクレオチド、(d
t) 配列番号1の449〜459位に示される配列を含むポリ
ヌクレオチド、(et) それらの相補鎖(ag) 下記配列表の
配列番号2に示されるポリヌクレオチド、(bg) 前記に
示されるポリヌクレオチド中の455位を除く1もしくは
数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾
ポリヌクレオチド、(cg) 配列番号2の441〜455位に示
される配列を含むポリヌクレオチド、(dg) 配列番号2
の449〜459位に示される配列を含むポリヌクレオチド、
(eg) それらの相補鎖(aa) 下記配列表の配列番号3に示
されるポリヌクレオチド、(ba) 前記(aa)に示されるポ
リヌクレオチド中の455位を除く1もしくは数個のヌク
レオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレ
オチド、(ca) 配列番号3の441〜455位に示される配列
を含むポリヌクレオチド、(da) 配列番号3の449〜459
位に示される配列を含むポリヌクレオチド、(ea) それ
らの相補鎖(ac) 下記配列表の配列番号4に示されるポ
リヌクレオチド、(bc) 前記(ac)に示されるポリヌクレ
オチド中の455位を除く1もしくは数個のヌクレオチド
が欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌクレオチド、
(cc) 配列番号4の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、(dc) 配列番号4の449〜459位に示さ
れる配列を含むポリヌクレオチド、(ec) それらの相補
鎖からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む。
検出用担体と、前記基体上に固定化されたポリヌクレオ
チドと標識が付されたポリヌクレオチドとを含む試料と
を接触させ、前記基体上に固定化されたポリヌクレオチ
ドと前記標識が付されたポリヌクレオチドとをハイブリ
タイゼーション反応条件下に置く反応部と、前記標識が
付されたポリヌクレオチドに付された標識を検出する標
識検出装置を少なくとも備えるインターフェロン療法の
有効性を検出するための遺伝子検出用装置が提供され
る。
検出用担体と、対極と、前記遺伝子検出用担体及び前記
対極間に電圧を印加する電圧印加部と、前記遺伝子検出
用担体に固定化された前記ポリヌクレオチドとポリヌク
レオチドとを含む試料とを接触させ、前記基体上に固定
化されたポリヌクレオチドと前記試料中のポリヌクレオ
チドとをハイブリダイゼーション反応条件下に置く反応
部と、前記ハイブリダイゼーション反応後に前記電圧印
加手段により電圧を印加させた際に前記遺伝子検出用担
体及び前記対極間に生じた電気信号を測定する測定部と
を備えたインターフェロン療法の有効性を検出するため
の遺伝子検出用装置が提供される。
検出用担体と、緩衝液とを備えることを特徴とするイン
ターフェロン治療の有効性を測定するためのキットが提
供される。
子検出用担体と、二本鎖認識体と、緩衝液とを備えるこ
とを特徴とする個体に対するインターフェロン治療の有
効性を検出するためのキットが提供される。
び配列番号4のポリヌクレオチドは、ヒトMxA遺伝子
のプロモーター領域を包含するポリヌクレオチドであ
り、本発明者らによって、これらのポリヌクレオチドの
455位に存在する一塩基多型(single nucleotide pol
ymorphism)(以下、SNPと称する)がインターフェロ
ン療法の効果に対する応答性に関与していることが初め
て見出された。
は、インターフェロン応答配列(interferon-stimulate
d response element)(以下、ISREと称する)が存
在している。
配列は、「GGTTTCGTTTCTG CTC」(配列番号5)であ
り、ISREの15番目(配列番号1の455位に相当す
る。配列番号1における455位は、転写開始部位を+1と
する通常の表記によれば、-88位に相当する)がチミン
である。
は、「GGTTTCGTTTCTGCGC」(配列番号6)であり、IS
REの15番目(配列番号2の455位に相当する。配列
番号2における455位は、転写開始部位を+1とする通常
の表記によれば、-88位に相当する)がグアニンであ
る。
の塩基配列は、「GGTTTCGTTTCTGCAC」(配列番号7)で
あり、ISREの15番目(配列番号3の455位に相当
する。配列番号3における455位は、転写開始部位を+1
とする通常の表記によれば、-88位に相当する)はアデ
ニンである。
配列は、「GGTTTCGTTTCTGCCC」(配列番号8)であり、
ISREの15番目(配列番号4の455位に相当する。
配列番号4における455位は、転写開始部位を+1とする
通常の表記によれば、-88位に相当する)はシトシンで
ある。
列番号2、配列番号3及び配列番号4の455位をSNP
部位(SNP site)と称する。
は各配列ともに共通である。これらのISREの15番
目のヌクレオチドがチミンであるISRE(配列番号
5)を有するHCV感染者は、インターフェロン療法が
有効であるのに対して、15番目のヌクレオチドがチミ
ンであるISRE(配列番号5)を持たないHCV感染
者は、インターフェロン療法が有効でないことが本発明
者らにより疫学的に実証された。
455位のヌクレオチドがグアニンである配列番号1のポ
リヌクレオチドをホモ接合で有する(以下、G/Gホモと
略記する) HCV感染者は、455位のヌクレオチドがチミ
ンである配列番号1のポリヌクレオチドと、455位のヌ
クレオチドがグアニンである配列番号1のプロモーター
領域をヘテロ接合で有する (以下、G/Tヘテロと略記す
る)HCV感染者、又は配列番号1のポリヌクレオチドをホ
モ接合で有する(以下、T/Tホモと略記する)HCV感染者
と比べて、インターフェロン療法が有効でないことが実
証された。
でないMxA遺伝子のプロモーター領域をホモ接合で有す
るHCV感染者(以下、non-T/non-Tホモと略記する)は、T/
non-Tヘテロ又はT/TホモのHCV感染者と比べて、インタ
ーフェロン療法が有効でないことが示された。non-T/no
n-Tホモの組み合わせとしては、G/G、G/A、G/C、A/A、A
/C、C/Cがある。T/non-Tの組み合わせとしては、T/G、T
/A、T/Cがある。
立って、例えばHCV感染者が有するヒトMxA遺伝子のプロ
モーター領域を包含するポリヌクレオチドのISREに
おけるSNP部位のヌクレオチドを決定することによっ
て、該HCV感染者に対して、インターフェロン療法の有
効性を検知することができる。
ら抽出されたポリヌクレオチドの核酸鎖の配列を検出す
るプローブとして、前記SNP部位を含み当該SNP部位
の塩基配列がチミンである配列番号1のポリヌクレオチ
ド、その断片又はそれらの相補鎖が用いられている。
ば、被験者が有するヒトMxA遺伝子のプロモーター領
域を包含するポリヌクレオチドの前記SNP部位がチミ
ンであるか否かを治療の前に調べることができる。それ
により前記被験者に対するインターフェロン療法の有効
性を予測することができる。
験者から抽出されたポリヌクレオチドの核酸鎖の配列を
検出するプローブとして前記SNP部位を含み、当該SN
P部位の塩基配列がgである配列番号2のポリヌクレオ
チド、その断片またはそれらの相補鎖、又は当該SNP
部位の塩基配列がaである配列番号3のポリヌクレオチ
ド、その断片またはそれらの相補鎖、又は当該SNP部
位の塩基配列がcである配列番号4のポリヌクレオチ
ド、その断片またはそれらの相補鎖が用いられている。
れば、被験者が有するヒトMxA遺伝子のプロモーター
領域を包含するポリヌクレオチドの前記SNP部位の配
列を調べることができ、それにより前記被験者に対する
インターフェロン療法の有効性を予測することができ
る。
は、C型肝炎以外にも、膠芽腫、髄芽腫瘍、星細胞腫、
皮膚悪性黒色腫、B型肝炎、腎癌、多発性骨髄腫、ヘア
リー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、亜急性硬化性全脳
炎、ウイルス性脳炎、免疫抑制患者の全身性帯状疱疹及
び水痘、上咽頭未分化癌、聴力低下を伴うウイルス性内
耳感染症、ヘルペス性角膜炎、偏平コンジローマ、尖圭
コンジローマ、アデノウイルス及びヘルペスウイルス感
染による結膜炎、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、子宮頚
癌、癌性胸水症、角化棘細胞腫、基底細胞癌、δ型慢性
活動性肝炎などが含まれる。前記インターフェロン療法
で用いられるインターフェロンとしては、インターフェ
ロンα、βまたはω等がある。
疾病に罹患した被験者にインターフェロン療法を実施す
る前に、インターフェロン療法の有効性を検知するため
に使用できる。
に詳細に説明する。
の実施に先立って、インターフェロン療法が有効であり
得る疾病に罹患した患者に対するインターフェロン療法
の有効性を検知するために使用できる遺伝子検出用担体
を提供する。
子検出用担体は、基板、多孔質体、マイクロタイタープ
レート、ビーズ等の基体に、前記所定のポリヌクレオチ
ドを固定化することによって作成することができる。
質、大きさ、形状などは特に限定されるものではなく、
ポリヌクレオチドを固定化することができる任意の基体
を使用できる。
ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイヤ、フォルス
テライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、磁性体など
の無機材料や、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイ
ソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリ
エステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビ
ニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニト
リル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネー
ト、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキ
シ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共
重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン重合体、
シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスル
ホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリメチルメタク
リレート、ポリフェにレンスルホン、ポリエーテルスル
ホン、ポリエーテルケトン、フルオロエチレン共重合
体、ポリメチルペンテン等の有機材料を用いることがで
きる。さらに上記無機材料と有機材料の複合体を用いる
こともできる。
は、例えば、Science 251:767-773(1991)に開示された
方法を用いることができる。また、該方法以外にも、ポ
リヌクレオチドを基体に固定化するための改良法が知ら
れており、このような改良法を用いてポリヌクレオチド
を固定化してもよい。
合には、基体の表面をポリリジンやアミノシラン等で表
面を被覆しておくと、ポリヌクレオチドを安定に固定化
することができる。
とは、2以上のヌクレオシドがリン酸エステル結合で結
合されてなる物質を意味する。「ヌクレオシド」には、
デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドが含ま
れるが、これらに限定されない。
クレオチドは、RNA,DNA,PNA,メチルフォスホネート
核酸、S-オリゴなどのオリゴヌクレオチドや、cDNA、cR
NAなどのポリヌクレオチドなどを用いることができる。
領域」とは、TATAボックス等の転写開始反応に直接関与
する領域のみを指すのではなく、該領域の近傍又は遠隔
に存在して転写開始反応の効率に影響を与える調節配列
を含む配列も指称するものとする。従って、「プロモー
ター領域」なる語には、転写開始反応に関与する配列の
み、調節配列のみ、及びその両者が連結された配列が含
まれることに留意しなければならない。
α、β、又はγの刺激によって誘導される遺伝子の転写
調節領域に存在する約12〜15のヌクレオチドからなる塩
基配列を意味する。
ては、以下の(a)〜(e)を含むものが挙げられる。
に示されるポリヌクレオチド。
チドにおいて、455位を除く1もしくは数個のヌクレオ
チドが欠失、置換、または付加されたポリヌクレオチ
ド。
位、508位、及び543位の欠失、置換の例としては330位
の置換(G→T)、542位の置換(C→G)、付加の例として
は501位への付加(C)を挙げることができる。
ヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの断片に、プロ
モーター、エンハンサー、上流活性化配列、サイレンサ
ー、上流抑制配列、アテニュエーター、ポリAテール、
核移行シグナル、Kozak配列、ISRE、薬物耐性因子、シ
グナルペプチドの遺伝子、膜貫通領域の遺伝子、ルシフ
ェリン、緑色蛍光タンパク質、フィコシアニン、西洋ワ
サビペルオキシダーゼを含むマーカータンパク質の遺伝
子、インターフェロン応答性タンパク質の遺伝子、非イ
ンターフェロン応答性タンパク質の遺伝子からなる群か
ら選択される少なくとも1つの機能的ポリヌクレオチド
が連結されてなる修飾ポリヌクレオチドを用いてよい。
前記ポリヌクレオチドの塩基配列のうち、インターフェ
ロン療法の有効性に関与しているのは455位に位置する
SNP部位に存在する1個のヌクレオチドなので、基体
に固定化すべきポリヌクレオチドは、前記455位のSNP部
位を含むポリヌクレオチドの断片であってよい。
前記断片を用いる場合は、11ヌクレオチド以上30ヌ
クレオチド以下であることが望ましい。基体に固定化す
るポリヌクレオチドの長さが過度に長いと、1個のヌク
レオチドの相違を識別することが困難になる。一方、基
体に固定化するポリヌクレオチドの長さが過度に短いと
試料中に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列の決定が
困難になる。
オチドとしては (c)前記455位のSNP部位を含む配列番号1、配列番号
2、配列番号3、配列番号4のポリヌクレオチドの断片
であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列
番号4の441〜456位に相当する配列番号5,配列
番号6,配列番号7,配列番号8で示される配列を有す
るポリヌクレオチド(すなわち前記ISRE)を含む断片。
番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4のポリヌ
クレオチドの断片であって、配列番号1乃至配列番号4
の449〜459位に相当する配列番号9、10、11、12
のポリヌクレオチドを含む断片。特に(d)は前記SNP
をほぼ中心とし、前後同等の長さの塩基配列を含むもの
であるため、精度の高く塩基配列の決定が行われる。更
に精度の高い検出を行うためには、望ましくは配列番号
1ないし配列番号4の447〜461位に相当するポリヌクレ
オチドを含む断片である。
クレオチドとしては (e)前記(a)〜(d)に示されるポリヌクレオチド
の相補鎖であってもよい。
7,配列番号8で示される配列(すなわち前記ISRE)の
相補鎖は、配列番号13,14、15、16で表される
配列である。
11,配列番号12で示される配列の相補鎖は、それぞ
れ配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番
号20で示される配列である。
化された上記所定のポリヌクレオチドをプローブとし、
このプローブと被験者から抽出したポリヌクレオチドと
のハイブリダイゼーション反応を検出し、被験者のヒト
MxA遺伝子のプロモーター領域を包含するポリヌクレ
オチド配列を決定し、前記SNP部位に何れを有してい
るかを調べるために使用される。
記遺伝子検出用担体を用いて具体的に被験者から抽出し
たポリヌクレオチドの配列を決定する方法について説明
する。
抽出したポリヌクレオチドの配列の決定を行う手段は、
(1)標識物質を用いる方法と、(2)電気化学的方法
の2種類ありえる。
て具体的に説明する。
ポリヌクレオチドを含む試料(血液などの体液、血球成
分、生検組織、培養細胞など)を採取する。ポリヌクレ
オチドは体内に広く含まれているので個体から採取した
任意の試料であってもよい。好ましい試料は血液であ
る。
エタノール沈殿などの分離抽出操作、PCRなどの増幅
操作を行った後、前記試料中に含まれる試料ポリヌクレ
オチドを抽出する。ポリヌクレオチドを抽出する方法と
しては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、
任意の抽出方法を使用し得る。mRNAを抽出する場合に
は、オリゴdTカラムにかけてもよい。試料ポリヌクレオ
チドの量が少ないときには必要に応じて試料ポリヌクレ
オチドを増幅する操作を行っても良い。
付与して、標識ポリヌクレオチドを得る標識操作を行
う。また、試料ポリヌクレオチドに標識付与せずに標識
物質を付与したポリヌクレオチドを含む2次プローブを
混合しても良い。
質、ハプテン、酵素、放射性同位体、電極活物質などの
検出可能な物質をあげることができるが特に限定される
ものではない。試料ポリヌクレオチドに対する標識はプ
ロモーター領域を標識することが望ましい。プロモータ
ー領域を標識するには、様々な公知の手法を使用し得る
が、標識したプライマーを用いたPCR反応によれば、
増幅操作と標識操作を同時に行うことができるので有用
であろう。
ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーション反応条件
下に置く。すなわち、まず、前記標識された試料ポリヌ
クレオチドをハイブリダイゼーション用の反応溶液に添
加した後、該反応溶液を本発明の遺伝子検出用担体と接
触させる。試料ポリヌクレオチドに基体上のヌクレオチ
ドの相補鎖が存在すれば、その試料ポリヌクレオチドは
基体上のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション反
応し基体上に固定化される。
温度は10〜90℃の範囲、反応時間は1分以上1晩程
度であり得る。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの
操作で反応速度を高めることもできる。ハイブリダイゼ
ーション用の反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範
囲、pH5〜10の範囲の緩衝液であり得る。反応溶液
中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキス
トランや、サケ精子DNA、牛胸DNA、EDTA、界
面活性剤などを添加してもよい。
有しているかを決定するために、試料ポリヌクレオチド
と基体上のポリヌクレオチドとの間のハイブリダリゼー
ション反応の有無を検出する。
(e)のいずれかを含むポリヌクレオチドのうち、前記
SNP部位がチミンであるポリヌクレオチド又はその相
補鎖に試料ポリヌクレオチドがハイブリタイズされたこ
とが検出されれば、被験者のヒトMxA遺伝子のプロモ
ーター領域を包含するポリヌクレオチドのSNP部位が
チミンである。一方、前記SNP部位がグアニンである
ポリヌクレオチド又はその相補鎖に試料ポリヌクレオチ
ドがハイブリタイズされたことが検出されれば、被験者
のヒトMxA遺伝子のプロモーター領域を包含するポリ
ヌクレオチドのSNP部位がグアニンである。アデニ
ン、シトシンの場合も同様である。
出装置を用いて、試料中の標識されたポリヌクレオチド
又は2次プローブ中の標識を検出することによって行
う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を
用いて標識を検出すればよい。
に、前記(a)〜(e)のいずれかのポリヌクレオチド
のうち前記SNP部位がチミンであるもの又はその相補
鎖と、グアニンであるものまたはその相補鎖、アデニン
であるものまたはその相補鎖、シトシンであるものまた
はその相補鎖からなる群から選ばれる少なくとも1種と
を共に固定化してもよいが、その場合、ポリヌクレオチ
ドの種類と、基体上の各ポリヌクレオチドの位置および
標識の種類の少なくとも一方を予め特定しておくことが
必要である。検出された標識の位置および標識の種類の
少なくとも一方によって、試料中のポリヌクレオチドが
基体上の何れのポリヌクレオチドとハイブリダイズした
かが明らかとなる。
被験者から採取した試料ポリヌクレオチドを基体上に固
定化した遺伝子検出用担体を用いた場合にも、試料ポリ
ヌクレオチドの配列を決定することができる。すなわ
ち、あらかじめ異なる標識を付与された配列が既知の
(a)〜(e)から選ばれるポリヌクレオチドであって
前記SNPの塩基の種類が異なるポリヌクレオチドの溶
液を接触させ、溶液中のポリヌクレオチドと電極上の試
料ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーション反応条
件下に置く。溶液中に基体上の試料ポリヌクレオチドの
相補鎖が存在すれば、その試料ポリヌクレオチドは基体
上のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション反応し
基体上に固定化される。その後どの配列のポリヌクレオ
チドとハイブリダイゼーション反応が生じたかを標識物
質の種類を検知することによって検知でき、試料ポリヌ
クレオチドの配列を知ることが可能となる。
が、前記SNP部位にチミンを有するポリヌクレオチド
又はその相補鎖とハイブリダイズしたときには、被験者
は、前記SNP部位にチミンを有しており、それ故、イ
ンターフェロン療法が有効であると予測できる。これに
対して、試料中のポリヌクレオチドが、前記SNP部位
にグアニンを有するポリヌクレオチド又はその相補鎖と
ハイブリダイズし、かつ前記SNP部位にチミンを有す
るポリヌクレオチド又はその相補鎖とハイブリダイズし
なかったときには、被験者は、前記SNP部位にチミン
を有しておらず、それ故、インターフェロン療法が有効
でないと予測できる。
的に説明する。
料ポリヌクレオチドと基体上のポリヌクレオチドとのハ
イブリダイゼーション反応の有無を、標識物質の検出に
て行ったが、(2)の電気化学的方法では、ハイブリダ
イゼーション反応の有無を電気化学的に検出する。
してポリヌクレオチド固定化電極電極を用いる。ポリヌ
クレオチド固定化電極(以下、本発明の電極という)
は、導電性物質からなる基体に前記(a)〜(e)のい
ずれかのポリヌクレオチドが固定化されてなる。
導電性物質は金であるが、他の材料も使用可能である。
例えば、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パ
ラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タング
ステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラフ
ァイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの
酸化物、化合物を用いる事ができる。これらの導電性物
質は、別の基板上にメッキ、印刷、スパッタ、蒸着など
で形成されていてもよい。
ドを固定化する方法は特に限定されるものではない。例
えば、ポリヌクレオチドに導入したチオール基と金との
結合を利用すると簡単に行うことができる。その他、物
理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、共有結合等でも固
定化が可能である。また、ビオチン−アビジン結合やカ
ルボジイミドなどの縮合剤を用いることもできる。これ
らの場合、あらかじめ官能基を有する分子で導電性物質
表面を修飾することにより、固定化を容易にすることが
できる。更に、基体表面へのポリヌクレオチドの非特異
的な吸着を抑制するために、基体面をメルカプトエタノ
ール等のメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質
で被覆することが望ましい。
チドを固定化する方法を述べる。
活性化処理を行う。活性化には、0.1〜10 mmol/Lの硫
酸溶液を用いる。この溶液中で、−0.5〜2V (vs Ag/A
gCl)の範囲で、1 v/s〜100000 v/sの範囲で電位を走査
させる。これにより、金基体表面はポリヌクレオチドを
固定化できる状態にまで活性化される。
るいは3’末端にチオール基を導入しておく。チオール
化したポリヌクレオチドは、固定化直前までDTT等の
還元剤の溶液に溶解しておき、使用直前にゲル濾過ある
いは酢酸エチルによる抽出操作等でDTTを除去する。
固定化は、イオン強度0.01〜5の範囲でpH5〜10の範囲内
の緩衝液中にプローブを1 ng/ml〜1 mg/mLの範囲になる
ように溶解し、活性化した直後の基体を浸漬する。固定
化反応は、4〜100℃の範囲で10分から1晩程度行う。
ポリヌクレオチドを固定化した後の基体は、核酸分解酵
素(ヌクレアーゼ)が存在しない条件、できれば遮光し
て保存することが望ましい。
には、DNAスポッターやDNAアレイヤ−と呼ばれる
固定化装置を用いると比較的容易にポリヌクレオチドを
固定化することができる。この際、基体の表面を傷つけ
ないために、インクジェット方式や静電方式のスポッタ
ーを用いることが望ましい。また、基体表面で直接ポリ
ヌクレオチドの合成を行うことも可能である。
気的に接続された前記本発明の電極とが基板上に配置さ
れたいわゆるDNAチップを構成していることが望まし
い。DNAチップは、基板上、望ましくは絶縁性基板上
に、絶縁材料で適切に被覆された金属線などの導電体を
配設した後、予め前記所定のポリヌクレオチドを固定化
した前記電極を前記導電体に通電可能に接続することに
より作成する。
それぞれ、互いに絶縁された異なる複数の電極上に固定
化されていることが必要である。複数の電極を基板上に
設置する場合、基板上に設置すべき電極の数は、実用的
には101〜105個であり得る。
には、さらに走査線を設置し、前記導電体と走査線との
各交点にスイッチング素子を配してもよい。それによ
り、各電極に順次電圧を印加して、電極毎にハイブリダ
イゼーション反応が起こったか否かを迅速に決定するこ
とが可能となる。
ョン反応の有無の検出では、他の一般的な電気化学的検
出法と同じように、本発明の電極の他に、少なくとも対
極、必要に応じて参照極を適宜配置する。参照極を配置
する場合、例えば、銀/塩化銀電極や水銀/塩化水銀電
極などの一般的な参照極を使用し得る。これらの電極は
本発明の電極と同一の基板上に配置されていることが望
ましい。
たポリヌクレオチドの配列の決定するには、以下の操作
を行う。
核酸を含む試料を採取し、必要に応じて上述した抽出操
作、増幅操作、必要に応じて標識付与を行う。これらの
操作は(1)の方法と同じである。但し標識の付与は必
ずしも必要ではない。
と接触させて、試料ポリヌクレオチドと電極上のポリヌ
クレオチドとをハイブリダイゼーション反応条件下に置
く。試料ポリヌクレオチドに基体上のヌクレオチドの相
補鎖が存在すれば、その試料ポリヌクレオチドは基体上
のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション反応し基
体上に固定化される。その操作、及び条件は(1)の方
法と同様である。その後、本発明の電極を洗浄する。
鎖認識体の溶液を添加することにより、電極に固定化さ
れたポリヌクレオチドと試料ポリヌクレオチドとがハイ
ブリダイズすることによって形成された二本鎖のポリヌ
クレオチドに二本鎖認識体をインターカレートさせる。
試料ポリヌクレオチドと基体上のポリヌクレオチドとの
間のハイブリダリゼーション反応の有無の検出は、電極
に電圧を印加したときに、電極上の二本鎖のポリヌクレ
オチドにインターカレートされた二本鎖認識体から生じ
る電気的な信号を検出することによって行われる。
されるものではないが、例えば、ヘキスト33258、アク
リジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロ
インターカレーター、ビスアクリジン等のビスインター
カレーター、トリスインターカレーター、ポリインター
カレーター等を用いることが可能である。メタロインタ
ーカレーターと呼ばれるルテニウム、コバルト、鉄など
の金属錯体や、エチジウムブロマイド等の有機化合物を
用いることができる。また、これら以外にもヘキスト33
258やシアニン色素などのグルーブバインダー、抗体、
酵素などの生体高分子を用いることも可能である。
異なるが、一般的には1 ng/ml〜1 mg/mlの範囲で使用す
る。この際、イオン強度0.001〜5の範囲で、pH5〜10の
範囲の緩衝液を用いる。
後、必要に応じて、さらに電極を洗浄する。さらに本発
明の電極を作用電極とし、この作用電極と別途設けられ
た対極との間に電位を印加し、両極間の電流測定をする
ことによって電気化学的な信号を検出する。電気化学的
な信号の検出は、このような2電極(作用電極及び対
極)で行っても良いが、あるいは作用電極、対極、参照
極を用いた3電極で行っても良い。電気化学的信号の検
出において、電位は定速で掃引するか、あるいはパルス
で印加するか、あるいは、定電位を印加することができ
る。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメ
ーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用い
て電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量
線から標的遺伝子の濃度を算出する。
レオチドのうち、前記SNP部位がチミンであるもの又
はその相補鎖と、前記SNP部位がグアニンであるもの
又はその相補鎖、前記SNP部位がアデニンであるもの
又はその相補鎖、前記SNP部位がシトシンであるもの
又はその相補鎖は、それぞれ互いに絶縁された異なる電
極に固定化されて同一の基板上に配設されたDNAチッ
プを構成していることが精度の高い測定を行う上で望ま
しい。その場合、各電極から各ポリヌクレオチドに対応
した電気化学的信号を検知する。
ら採取した試料ポリヌクレオチドを電極上に固定化した
電極を用いても、試料ポリヌクレオチドの配列を決定す
ることもできる。すなわち、あらかじめ配列が既知であ
る(a)〜(e)のいずれかのポリヌクレオチドの溶液
を接触させることによって、溶液中のポリヌクレオチド
と電極上の試料ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼー
ション反応条件下に置く。溶液中に基体上の試料ポリヌ
クレオチドの相補鎖が存在すれば、その試料ポリヌクレ
オチドは基体上のポリヌクレオチドとハイブリダイゼー
ション反応し基体上に固定化される。そのハイブリダイ
ゼーション反応を検知することによって、試料ポリヌク
レオチドの配列を知ることが可能となる。
と、前記SNP部位にチミンを有するポリヌクレオチド
又はその相補鎖とのハイブリダイズ反応が検出されたと
きには、被験者は、前記SNP部位にチミンを有してお
り、それ故、インターフェロン療法が有効であると予測
できる。これに対して、試料中のポリヌクレオチドと、
前記SNP部位にチミン以外を有するポリヌクレオチド
又はその相補鎖とのハイブリダイズ反応が検出され、か
つ前記SNP部位にチミンを有するポリヌクレオチド又
はその相補鎖とのハイブリダイズ反応が検出されなかっ
たときには、被験者は、前記SNP部位にチミンを有し
ておらず、それ故、インターフェロン療法が有効でない
と予測できる。
を用いて被験者から抽出したポリヌクレオチドの配列の
決定を行うための遺伝子検出装置の一例を示す。即ち、
前記本発明の電極と、電極上に固定化されたポリヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーション反応を実行するため
の反応部と、前記電極に固定化された核酸に電圧を印加
する印加手段と、該印加手段の動作によって生じた信号
を測定する測定手段とを備えた遺伝子検出用装置であ
る。
は、このような遺伝子検出用装置の基本的な実施形態が
示されている。
12が固定化された電極である。13は反応槽であり、
電源14が電極11と反応槽13を介して回路を形成す
るように接続されている。また、回路の内部には、電流
計15、電圧計16、及び可変抵抗17が配置されてお
り、反応槽13内でハイブリダイゼーション反応を行っ
た後に、電圧を印加して回路に流れる電流等を測定する
ように構成されている。
うには、反応槽13の内部に緩衝液と被験者から採取し
たポリヌクレオチド含有試料を保持させ、試料ポリヌク
レオチドと電極11上のポリヌクレオチド12との間で
ハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼー
ションの温度及び時間などの条件は、上述したとおりで
ある。続いて、好ましくは反応槽13及び電極11を洗
浄し、挿入剤を含むハイブリダイゼーション溶液を反応
槽13に満たして電源14を作動させ、電流計15や電
圧計16を用いて電源値あるいは電圧値等を測定する。
も基本的な態様を示したが、検査を完全に自動化するた
めに、本発明の遺伝子検出用装置は、図2のように、さ
らに、複雑な構成をとってもよい。
に示した検出装置20は、ポリヌクレオチド固定化電極
を保持するための電極ホルダ21、反応槽22、第1洗
浄槽23、挿入剤反応槽24、第2洗浄槽25、及び電
気化学測定槽26、並びに反応槽22、第1洗浄槽2
3、挿入剤反応槽24、第2洗浄槽25、及び電気化学
測定槽26を載せた移動装置27、並びに分析ユニット
28、及び操作ユニット29を具備している。これらの
槽の間での電極の移動は、移動装置27を使って反応槽
等を動かすことにより達成される。
出装置20の使用法は以下のとおりである。
ら抽出しておいたポリヌクレオチドを含有した溶液を入
れておき、電極固定ホルダ21に固定された上記電極を
反応槽22に浸漬する。次いで、反応槽22中で、ハイ
ブリダイゼーション反応を行った後、電極固定ホルダ2
1を第1洗浄槽23に移す。第1洗浄槽23では、洗浄
を行って、非特異的に電極に結合した核酸やタンパク質
等を除去する。洗浄後、電極固定ホルダ21を挿入剤反
応槽24に移し、ハイブリダイゼーション反応によって
形成された二本鎖ポリヌクレオチドに挿入剤をインター
カレートする。続いて、電極固定ホルダ21を第2洗浄
槽25に移し、洗浄を行った後、電極固定ホルダ21を
電気化学測定槽26に移し、電気化学的な測定を行う。
測定終了後、分析ユニット28に予め記録されている検
量線を参考にして試料中のポリヌクレオチドの濃度が出
力される。以上の操作は、それぞれの槽及びユニットと
電気的につながれた操作ユニット29を通じて行う。
衝液とを備えたキットを提供する。このように、本発明
の遺伝子検出用担体と緩衝液とをセットにして提供すれ
ば、直ちに検査を行うことができるので便利である。
イブリダイゼーション反応に用いられる任意の緩衝液で
あり得る。例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス
緩衝液などがあげられるが、これらに限定されるもので
はない。
に代えて、遺伝子増幅用のプライマー、蛍光色素標識ヌ
クレオチド、酵素、精製用のカラム等を添付してもよ
い。
を備えたキットを提供する。
は、例えば、本発明の電極について上述した二本鎖認識
体であり得る。
二本鎖認識体に代えて、遺伝子増幅用のプライマー、酵
素、緩衝液、ヌクレオチド等を添付してもよい。
明する。
プロモーター領域の-88位(配列番号1の塩基配列で
は、455位に相当する)のヌクレオチドがチミンである
遺伝子(以下MxA(T)と表記する)をヘテロ又はホモ接合
で有するHCV感染者が、該ヌクレオチドがグアニンであ
る遺伝子(以下MxA(G)と表記する)をホモ接合で有する
HCV感染者に比べて、インターフェロン療法に対する応
答性がよいことを実証した。
と証明され、インターフェロン療法を行っている115人
の患者と、抗HCV陰性の健康な者42人が本研究に参加し
た。これらの者は、全員日本人であり、互いに血縁関係
はない。
ターフェロン療法終了後の少なくとも6月の追跡期間
中、血清アラニンアミノトランスフェラーゼのレベルが
正常な範囲にあり、且つHCVのRNAが常に陰性である持続
的応答者(以下、SRと表記する)であり、63人の患者
は、ALTレベルに関わらず、追跡期間中に、HCVのRNAが
陽性のままであり、又はC型肝炎を再発した非応答者
(以下、NRと表記する)であった。全ての患者には、総
用量300万ユニットを超えるインターフェロンα及び/
又はβを投与した。
採取したPBMCから核酸を抽出した。該核酸をPCRに供
し、MxA遺伝子のプロモーター領域を包含する599ヌクレ
オチドのDNAを増幅した。
マー)、配列番号12のオリゴヌクレオチドプライ マ
ー#MXAF01(フォワードプライマー、-569〜-540位)、
及び配列番号6のオリゴヌクレオチドプライマー#MXAF0
2(リバースプライマー、+30〜+1位)と混合した後、
[95℃10分]、[95℃10秒、68℃60秒]×55、[72℃7
分]のサイクル条件で、反応させた。PCR産物を直接解
読することによって、157の試料のうち12個を配列決定
した。
位を同定した後、対立遺伝子のヌクレオチドを識別可能
に検出するためのRFLPシステムを構築した。全患者の59
9ヌクレオチドのPCR産物をHhaI(GCG↓C)で消化し、アガ
ロースゲル中で電気泳動して、482ヌクレオチドのバン
ド及び533ヌクレオチドバンドの何れか又は両者が生成
するか否かを調べた。
は行わずに、フィッシャーの正確な確率テストによって
グループデータを比較した。p<0.05を統計学的に有
意と見做した。
とによって、MxA遺伝子のプロモーター領域中に、多型
部位が同定された。該プロモーター領域の-88位には、S
NPが存在し(GとT)、該SNPは、図3に示されているISRE
に類似する領域中に含まれていた。
について、MxA遺伝子の遺伝子型を決定した。該アッセ
イでは、多型部位にグアニンを有する試料は、電気泳動
ゲルに482ヌクレオチドのバントを示した。これに対し
て、グアニンがチミンに置換されると、HhaIが認識する
制限部位が消失するので、533ヌクレオチドのバンドを
示した。多型部位がグアニンであるプロモーター領域と
多型部位がチミンであるプロモーター領域をヘテロ接合
で有する場合には、482ヌクレオチドのバンドと533ヌク
レオチドのバンドが共に検出される(図4参照)。
者の62%が、前記多型部位がグアニンであるプロモータ
ー領域をホモ接合で有していたが(G・Gホモ)、SR群で
は、患者の31%がG・Gホモであった(p=0.0009;SR vs N
R)。反対に、NR群では、患者の35%が、前記多型部位が
グアニンであるプロモーター領域と前記多型部位がチミ
ンであるプロモーター領域をヘテロ接合で有していたが
(G・Tヘテロ)、SR群では、患者の60%が、G・Tヘテロで
あった(p=0.0082;SR vs.NR)。T・Tホモの患者は、それ
ぞれ、NR群で3.2%、SR群で10%であった(p=0.2956;SR v
s NR)。
ー領域を有する対立遺伝子の頻度は、SR群では0.606で
あったのに対して、NR群では0.794であった(p=0.0018;
SR vsNR)。
個体が有意に少ないという上記の結果は、患者が感染し
たHCVの遺伝子型に依存しないことも明らかとなった。
あるHCVに感染した患者群(HCV 1b群)と遺伝子型が2a
又は2bであるHCVに感染した患者群(HCV 2a/2b群)で
は、共にNR群は62%がG・Gホモの個体であるのに対し
て、SR群は、それぞれ28%及び32%がG・Gホモの個体であ
った。表2に示した結果から、患者が感染したHCVの遺
伝子型にかかわらず、SR群ではG・Gホモの個体が有意に
少ないことが明らかとなった(HCV 1b群;p=0.0321、HC
V 2a/2b群;p=0.0318)。
チミンであるMxAプロモーター領域をヘテロ接合又はホ
モ接合で有しているHCV感染者は、感染したHCVの遺伝子
型によらず、インターフェロン療法に高い応答性を示す
ことが実証された。
ンでないMxAプロモーター領域をヘテロ接合又はホモ接
合で有しているHCV感染者は、インターフェロン療法に
高い応答性を示すことも示唆している。
ので、これらのことは、C型肝炎以外の疾患についても
当てはまるといえる。
に、MxAプロモーターのSNPがT型であるHCV感染者はイン
ターフェロン投与による肝炎の治療効果が高い。一方、
そのSNPがG型である場合には治療効果が低い。この理由
として、ISREの機能を果たすための塩基配列であるT型
はインターフェロンの刺激に正しく応答するが、G型は
その配列と1塩基だけ異なるために、インターフェロン
の刺激に応答せずMxA蛋白質の生成量が低いためと解釈
される。
ターのSNPがC型並びにA型のHCV肝炎の患者も、G型と同
様にインターフェロンにMxAプロモーターは応答せず、
その治療効果は低いと推定される。
ーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドを構築し、これをヒト細胞(HeLa細胞、並びに卵巣癌
細胞)にトランスフェクションした。そして、4種類の
SNP(T型、G型、A型、C型)を有するMxAプロモーターの
夫々について、これらがインターフェロンに応答した結
果として産生されるルシフェラーゼ活性を調べた。
ンターフェロンαを用いてHela細胞内で誘導した例、図
6は、インターフェロンαを用いて卵巣癌細胞内で誘導
した例、図7は、インターフェロンβを用いてHela細胞
内で誘導した例、図8は、インターフェロンβを用いて
卵巣癌細胞内で誘導した例である。また、これらの図に
おいて、+はインターフェロンを添加した場合のルシフ
ェラーゼ活性を示し、−はインターフェロンを添加しな
いときのルシフェラーゼ活性を示している。これらの結
果は何れも3回の実験の平均値であり、その標準偏差を
バーで表示した。
のMxAプロモーターが最も高い値を示し、A型とC型のSNP
を有するHCV肝炎の患者はG型の場合と同様に、インター
フェロンα並びにインターフェロンβに対する応答が低
い。従って、インターフェロンによる治療効果が低い事
が予測される。
出用担体を用いてインターフェロン療法の有効性を予測
するための操作について説明する。
るために、配列番号21と配列番号22のプライマーを
用いて、配列番号1のポリヌクレオチド断片であって前
記SNP部位を含み当該SNP部位がチミンであるT型
断片31と、配列番号2のポリヌクレオチドの前記SN
P部位を含み当該SNP部位がグアニンであるG型断片
32とを増幅し、2μg/μLになるように蒸留水で調
製した。
ロセルロース(DMSO溶液)を添加し、熱変性後、ポ
リリジンで被覆されているスライドガラス33上にスポ
ッティングした。スポットが充分乾燥した後、紫外線照
射による固定化処理を行い、T型断片31とG型断片3
2が固定化された遺伝子検出用担体を得た。
マーによって、被験者の血液から抽出した試料ポリヌク
レオチドを増幅処理した後、ファルマシア製のECLラ
ベリングシステムでFITC標識を行い、予め調製して
おいた前記遺伝子検出用担体と12時間、65℃で反応
させた。反応後に、蛍光検出器でシグナルを測定した。
トから蛍光シグナルが観察され、本試験に用いた試料ポ
リヌクレオチドのSNPはT型であることが判明した。
固定化した遺伝子検出用担体を用いた検査について説明
する。
列番号21、配列番号22のプライマーを用いて増幅し
た断片(試料A:41、試料B:42)を、2μg/μ
Lになるように蒸留水で調製した。次に、等量の4mg
/Lニトロセルロース(DMSO溶液)を添加した後、
熱変性させ、ポリリジンで被覆されているスライドガラ
ス43上にスポッティングした。スポットが充分乾燥し
た後、紫外線照射による固定化処理を行った。
レオチド断片であって前記SNP部位を含み当該SNP
部位がチミンであるT型断片(JOE標識)と、予め蛍
光標識した、配列番号2のポリヌクレオチド断片であっ
て前記SNP部位を含み当該SNP部位がグアニンであ
るG型断片(5−FAM標識)、予め蛍光標識した、配
列番号3のポリヌクレオチド断片であって前記SNP部
位を含み当該SNP部位がアデニンであるA型断片(TA
MRA標識)、予め蛍光標識した、配列番号4のポリヌク
レオチド断片であって前記SNP部位を含み当該SNP
部位がシトシンであるC型断片(ROX標識)とを予め
調製しておいたDNAチップと1時間、50℃で反応さ
せた。
その結果、HEXの蛍光に由来する信号のみが得られ、
本試料ポリヌクレオチドのSNPは、T型のみであること
が判明した。
出を利用した遺伝子検出用担体について説明する。
を用いて、配列番号1のT型断片51とG型断片52と
を増幅し、2μg/μLになるように蒸留水で調製し
た。次に、2−ヒドロキシエチルジスルフィドと1−シ
クロヘキシル−3−(2−モルフォリノエチル)−カル
ボジイミドと反応させ、増幅産物の末端にチオール基を
導入した。予め作製しておいた金電極53上にスポッテ
ィングし、乾燥しないように1時間反応させた。サンプ
ルは、配列番号21と配列番号22のプライマーを用い
て増幅、熱変性後、予め調製しておいたDNAチップと
1時間、65℃で反応させた。反応後、10μmol/
Lのヘキスト33258溶液中でボルタンメトリーを行
い、ヘキスト33258の酸化電流値を測定した。その
結果、G型の断片を固定化した電極からのみ有意な信号
が得られ、本試料はG型であることが判明した。
置の一例を示す図である。
発明の電子検出用装置の一例を示す図である。
基配列を示す図である。
Pの電気泳動結果を示す写真である。
を有するMxAプロモーターの夫々について、Hela細胞内
におけるインターフェロンαに対する応答性を、該プロ
モータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標として
比較した結果を示すグラフである。
を有するMxAプロモーターの夫々について、卵巣癌細胞
内におけるインターフェロンαに対する応答性を、該プ
ロモータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標とし
て比較した結果を示すグラフである。
を有するMxAプロモーターの夫々について、Hela細胞内
におけるインターフェロンβに対する応答性を、該プロ
モータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標として
比較した結果を示すグラフである。
を有するMxAプロモーターの夫々について、卵巣癌細胞
内におけるインターフェロンβに対する応答性を、該プ
ロモータの支配下にあるルシフェラーゼ活性を指標とし
て比較した結果を示すグラフである。
担体を示す図である。
検出用担体を示す図である。
遺伝子検出用担体を示す図である。
Claims (28)
- 【請求項1】 基体と、 前記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え
てなり、 前記ポリヌクレオチドは、 (at) 下記配列表の配列番号1に示されるポリヌクレオ
チド、 (bt) 前記(at)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (ct) 配列番号1の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dt) 配列番号1の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (et) それらの相補鎖 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むこと
を特徴とする遺伝子検出用担体。 - 【請求項2】 基体と、 前記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え
てなり、 前記ポリヌクレオチドは、 (ag) 下記配列表の配列番号2に示されるポリヌクレオ
チド、 (bg) 前記(ag)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (cg) 配列番号2の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dg) 配列番号2の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (eg) それらの相補鎖 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むこと
を特徴とする遺伝子検出用担体。 - 【請求項3】 基体と、 前記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え
てなり、 前記ポリヌクレオチドは、 (aa) 下記配列表の配列番号3に示されるポリヌクレオ
チド、 (ba) 前記(aa)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (ca) 配列番号3の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (da) 配列番号3の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (ea) それらの相補鎖 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むこと
を特徴とする遺伝子検出用担体。 - 【請求項4】 基体と、 前記基体に固定化されてなるポリヌクレオチドとを備え
てなり、 前記ポリヌクレオチドは、 (ac) 下記配列表の配列番号4に示されるポリヌクレオ
チド、 (bc) 前記(ac)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (cc) 配列番号4の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dc) 配列番号4の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (ec) それらの相補鎖 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むこと
を特徴とする遺伝子検出用担体。 - 【請求項5】 前記基体上に固定化されるポリヌクレオ
チドの長さは15ヌクレオチド以上30ヌクレオチド以
下である請求項1乃至4の何れか1項記載の遺伝子検出
用担体。 - 【請求項6】 前記基体は導電物質よりなり、前記遺伝
子検出用担体が電極であることを特徴とする請求項1乃
至4の何れか1項記載の遺伝子検出用担体。 - 【請求項7】 基板と、 基板上に形成された第1及び第2の電極とを備えてな
り、 前記第1の電極は、導電性基体と、該導電性基体上に固
定化された下記(at)乃至(et)から選択される少なくとも
1種のポリヌクレオチドを備え、 (at) 下記配列表の配列番号1に示されるポリヌクレオ
チド、 (bt) 前記(at)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (ct) 配列番号1の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dt) 配列番号1の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (et) それらの相補鎖 前記第2の電極は、導電性物質からなる基体と、該基体
上に固定化された下記(ag)乃至(eg)、(aa)乃至(ea)、(a
c)乃至(ec)から選択される少なくとも1種のポリヌクレ
オチド (ag) 下記配列表の配列番号2に示されるポリヌクレオ
チド、 (bg) 前記(ag)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (cg) 配列番号2の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dg) 配列番号2の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (eg) それらの相補鎖 (aa) 下記配列表の配列番号3に示されるポリヌクレオ
チド、 (ba) 前記(aa)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (ca) 配列番号3の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (da) 配列番号3の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (ea) それらの相補鎖 (ac) 下記配列表の配列番号4に示されるポリヌクレオ
チド、 (bc) 前記(ac)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (cc) 配列番号4の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dc) 配列番号4の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (ec) それらの相補鎖 を備えてなるDNAチップ。 - 【請求項8】 前記導電性基体に固定化されるポリヌク
レオチドの長さは15ヌクレオチド以上30ヌクレオチ
ド以下である請求項7記載の遺伝子検出用担体。 - 【請求項9】 個体に対するインターフェロン療法の有
効性の検出方法であって、 1)前記個体から採取した試料ポリヌクレオチドを請求
項1、請求項2、請求項3、請求項4のいずれかに記載
の遺伝子検出用担体に接触させる工程と、 2)前記試料ポリヌクレオチドと前記遺伝子検出用担体
に固定化されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ション反応を検知し、前記試料中のポリヌクレオチドの
塩基配列を決定する工程とを備える方法。 - 【請求項10】 請求項9記載の検出方法であって前記
塩基配列を決定する工程によって決定された前記試料ポ
リヌクレオチドの塩基配列が下記(at)〜(et)を含んでい
れば前記個体に対してインターフェロン療法が有効であ
ると検出する工程をさらに備える方法: (at) 配列番号1に記載のポリヌクレオチド (bt) 前記(at)に示される配列番号1に記載のポリヌク
レオチドにおいて455位を除く1もしくは数個のポリヌ
クレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ヌクレオ
チド (ct) 配列番号1の441〜456位に位置する配列を含むポ
リヌクレオチド (dt) 配列番号1の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド (et) 前記(at)〜(dt)に記載のポリヌクレオチドの相補
鎖。 - 【請求項11】 遺伝子検出用担体に接触させる工程の
前に、前記個体から採取されたポリヌクレオチドに標識
を付す工程を行うことを特徴とする請求項9記載の検出
方法。 - 【請求項12】 前記標識は蛍光色素、ハプテン、酵
素、放射性同位体、電極活物質から選ばれる少なくとも
1種であることを特徴とする請求項11記載の検出方
法。 - 【請求項13】 前記遺伝子検出用担体は、請求項6に
記載の遺伝子検出用担体であり、 前記試料中のポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工
程におけるハイブリダイゼーション反応の検知は、前記
ハイブリダイゼーション反応に伴なって生じる電気化学
的変化を検知することにより行なわれることを特徴とす
る請求項9記載の検出方法。 - 【請求項14】 前記ハイブリダイゼーション反応に伴
なって生じる電気化学的変化の検知は、 遺伝子検出用担体及び対極間に電圧を印加したときの、
前記遺伝子検出用担体及び前記対極間に生じた電気信号
を測定することにより行われることを特徴とする請求項
13記載の治療予測方法。 - 【請求項15】 前記ハイブリダイゼーション反応時に
二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に付加する導電性の二
本鎖認識体が添加され、前記遺伝子検出用担体及び前記
対極間に生じた電気信号は導電性の二本鎖認識体から直
接または間接的に生じるものであることを特徴とする請
求項14記載の遺伝子検出用装置。 - 【請求項16】 個体に対するインターフェロン療法の
有効性の検出方法であって、 1)前記個体から採取した試料ポリヌクレオチドが基体
上に固定化されてなる遺伝子検出用担体にプローブポリ
ヌクレオチドを接触させる工程と、 2)前記基体上に固定化された試料ポリヌクレオチドと
前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応
を検知し、前記試料ポリヌクレオチドの塩基配列を決定
する工程とを備え、 前記プローブポリヌクレオチドは、 (at) 下記配列表の配列番号1に示されるポリヌクレオ
チド、 (bt) 前記(at)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (ct) 配列番号1の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dt) 配列番号1の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (et) それらの相補鎖 (ag) 下記配列表の配列番号2に示されるポリヌクレオ
チド、 (bg) 前記(ag)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (cg) 配列番号2の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dg) 配列番号2の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (eg) それらの相補鎖 (aa) 下記配列表の配列番号3に示されるポリヌクレオ
チド、 (ba) 前記(aa)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (ca) 配列番号3の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (da) 配列番号3の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (ea) それらの相補鎖 (ac) 下記配列表の配列番号4に示されるポリヌクレオ
チド、 (bc) 前記(ac)に示されるポリヌクレオチド中の455位を
除く1もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は
付加された修飾ポリヌクレオチド、 (cc) 配列番号4の441〜455位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (dc) 配列番号4の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド、 (ec) それらの相補鎖 からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む方
法。 - 【請求項17】 請求項16記載の検出方法であって前
記塩基配列を決定する工程によって決定された前記試料
ポリヌクレオチドの塩基配列が下記(at)〜(et)を含んで
いれば前記個体に対してインターフェロン療法が有効で
あると検出する工程をさらに備える方法: (at) 配列番号1に記載のポリヌクレオチド (bt) 前記(at)に示される配列番号1に記載のポリヌク
レオチドにおいて455位を除く1もしくは数個のポリヌ
クレオチドが欠失、置換、又は付加された修飾ポリヌク
レオチド (ct) 配列番号1の441〜456位に位置する配列を含むポ
リヌクレオチド (dt) 配列番号1の449〜459位に示される配列を含むポ
リヌクレオチド (et) 前記(at)〜(dt)に記載のポリヌクレオチドの相補
鎖 - 【請求項18】 遺伝子検出用担体に接触させる工程の
前に、前記プローブポリヌクレオチドに標識を付す工程
を行うことを特徴とする請求項18記載の検出方法。 - 【請求項19】 前記標識は蛍光色素、ハプテン、酵
素、放射性同位体、電極活物質から選ばれる少なくとも
1種であることを特徴とする請求項18記載の検出方
法。 - 【請求項20】 前記遺伝子検出用担体は、導電性基体
に前記個体から採取した試料ポリヌクレオチドが固定さ
れた電極であり、 前記試料中のポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工
程におけるハイブリダイゼーション反応の検知は、前記
ハイブリダイゼーション反応に伴なって生じる電気化学
的変化を検知することにより行なわれることを特徴とす
る請求項18記載の検出方法。 - 【請求項21】 前記ハイブリダイゼーション反応に伴
ない生じる電気化学的変化の検知は、遺伝子検出用担体
及び対極間に電圧を印加したときの、前記遺伝子検出用
担体及び前記対極間に生じた電気信号を測定することに
より行われることを特徴とする請求項20記載の検出方
法。 - 【請求項22】 前記ハイブリダイゼーション反応時に
二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に付加する導電性の二
本鎖認識体が添加され、前記遺伝子検出用担体及び前記
対極間に生じた電気信号は導電性の二本鎖認識体から直
接または間接的に生じるものであることを特徴とする請
求項21記載の検出方法。 - 【請求項23】 請求項1、請求項2、請求項3、請求
項4から選ばれる少なくとも1種の遺伝子検出用担体
と、 前記基体上に固定化されたポリヌクレオチドと標識が付
されたポリヌクレオチドとを含む試料とを接触させ、前
記基体上に固定化されたポリヌクレオチドと前記標識が
付されたポリヌクレオチドとをハイブリタイゼーション
反応条件下に置く反応部と、 前記標識が付されたポリヌクレオチドに付された標識を
検出する標識検出装置を少なくとも備えるインターフェ
ロン療法の有効性を検出するための遺伝子検出用装置。 - 【請求項24】 前記標識は蛍光色素、ハプテン、酵
素、放射性同位体、電極活物質から選ばれる少なくとも
一種である事を特徴とする請求項23記載の遺伝子検出
用担体。 - 【請求項25】 請求項6に記載の遺伝子検出用担体
と、 対極と、 前記遺伝子検出用担体及び前記対極間に電圧を印加する
電圧印加部と、 前記遺伝子検出用担体に固定化された前記ポリヌクレオ
チドとポリヌクレオチドとを含む試料とを接触させ、前
記基体上に固定化されたポリヌクレオチドと前記試料中
のポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーション反応条
件下に置く反応部と、 前記ハイブリダイゼーション反応後に前記電圧印加手段
により電圧を印加させた際に前記遺伝子検出用担体及び
前記対極間に生じた電気信号を測定する測定部とを備え
たインターフェロン療法の有効性を検出するための遺伝
子検出用装置。 - 【請求項26】 前記反応部においては、前記ハイブリ
ダイゼーション反応により生じた二本鎖ポリヌクレオチ
ドに特異的に付加する導電性の二本鎖認識体が添加さ
れ、前記遺伝子検出用担体及び前記対極間に生じた電気
信号は前記二本鎖認識体から生じるものであることを特
徴とする請求項25載のインターフェロン療法の有効性
を検出するための遺伝子検出用装置。 - 【請求項27】 請求項1、請求項2、請求項3、請求
項4記載の遺伝子検出用担体と、緩衝液とを備えること
を特徴とするインターフェロン治療の有効性を測定する
ためのキット。 - 【請求項28】 請求項6記載の遺伝子検出用担体と、
二本鎖認識体と、緩衝液とを備えることを特徴とする個
体に対するインターフェロン治療の有効性を検出するた
めのキット。
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