ES2315650T3 - Uso farmaceutico de 1-azabiciclo-2,2,2 octanos y un metodo para ensayar compuetos con respecto a la capacidad de activar wt p53 inactivo. - Google Patents
Uso farmaceutico de 1-azabiciclo-2,2,2 octanos y un metodo para ensayar compuetos con respecto a la capacidad de activar wt p53 inactivo. Download PDFInfo
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Abstract
El uso de un compuesto capaz de transferir p53 de tipo silvestre de una conformación inactiva de la misma, dicha conformación es reactiva a Pab 240 y no a Pab 1620, a una conformación activa capaz de inducir apoptosis, dicho compuesto se selecciona de compuestos que tienen una estructura según la fórmula (I) (Ver fórmula) en donde n es 0, 1 o 2; R 1 y R 2 son iguales o diferentes y se seleccionan de -H, -CH2-R 5 , -CH2-O-R 5 , -CH2-S-R 5 , -CH2-NH-R 5 , -CO-O- R 5 , -CO-NH-R 5 , -CH2-NH-CO-R 5 , -CH2-O-CO-R 5 , -CH2-NH-CO-NHR 5 , CH2-NH-CO-OR 5 , -CH2-NH-CS-NHR 5 y -CH 2-O-CO-NHR 5 ; o R 1 y R 2 son juntos =CH 2; R 3 y R 4 son iguales o diferentes y se seleccionan de H, -OH, -SH, -NH2, -NHR 5 y -O-CO-C6H5; o R 3 y R 4 son juntos =O, =S, =NH o =NR 5 ; R 5 representa grupos iguales o diferentes seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido, alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos arilo sustituidos o no sustituidos o anillo(s) heteroaromático(s) mono-, bi-, tricíclicos sustituidos o no sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos en donde los sustituyentes de los grupos sustituidos se seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR 6 , CONR 6 y COOR 6 ; R 6 se selecciona de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos; R 7 y R 8 forman juntos un resto de puente CH2-CH2; o R 7 y R 8 son ambos hidrógeno; o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de los mismos, para la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento del melanoma maligno.
Description
Uso farmacéutico de
1-azabiciclo-2,2,2 octanos y un
método para ensayar compuestos con respecto a la capacidad de
activar wt p53 inactivo.
La presente invención se refiere al uso de
ciertos compuestos, capaces de transferir p53 de tipo silvestre de
una conformación inactiva y no funcional a su conformación activa,
en donde p53 silvestre existe en un estado inactivo aquí definido,
para la preparación de una composición farmacéutica para uso para
tratar trastornos médicos y especialmente el melanoma maligno. La
invención también se refiere a un método para probar compuestos en
cuanto a la habilidad mencionada anteriormente, en donde se
monitoriza la concentración de p53 silvestre inactivo. El método
puede llevarse a cabo tanto in vitro como in vivo.
Aunque la proteína supresora de tumores p53 está
mutada en la mayor parte de los tumores humanos, el tipo p53
silvestre (wt) es dominante en el melanoma maligno (Hollstein et
al., Science, 253:49-53, (1991); Sparrow
et al., Melanoma Res. 1995. 5:93-100
(1995); y Hartmann et al., Int J cancer,
67:313-317, (1996)) Petitclerc et al.,
Cancer Res, 59: 2724-2730 (1999) encontraron
Mab LM609, un anticuerpo monoclonal bloqueador de función dirigido
a la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, para bloquear el
crecimiento del melanoma M21 por medio de la inducción de la
apoptosis
tumoral.
tumoral.
Los melanomas malignos típicamente son
refractarios a la inducción de apoptosis con fármacos químicos o
radioactividad.
Los inventores actuales han descubierto ciertos
compuestos que son capaces de inducir apoptosis en células de
melanomas malignos, dichos compuestos se definen en la
reivindicación 1 como que tienen una estructura según la fórmula
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
n es 0, 1 o 2;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y se
seleccionan de -H, -CH_{2}-R^{5},
-CH_{2}-O-R^{5},
-CH_{2}-S-R^{5},
-CH_{2}-NH-R^{5},
-CO-O-R^{5},
-CO-NH-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-R^{5},
-CH_{2}-O-CO-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-NHR^{5},
CH_{2}-NH-CO-OR^{5},
-CH_{2}-NH-CS-NHR^{5}
y
-CH_{2}-O-CO-NHR^{5};
o R^{1} y R^{2} son juntos =CH_{2};
R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y se
seleccionan de H, -OH, -SH, -NH_{2}, -NHR^{5} y
-O-CO-C_{6}H_{5}; o R^{3} y
R^{4} son juntos =O, =S, =NH o =NR^{5};
R^{5} representa grupos iguales o diferentes
seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido,
alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no
sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos
arilo o anillo(s) heteroaromático(s) mono-, bi-,
tricíclicos sustituidos o no sustituidos con uno o más heteroátomos
y heterociclos no aromáticos en donde
los sustituyentes de los grupos sustituidos se
seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a
C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no
aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino
C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR^{6}, CONR^{6} y
COOR^{6};
R^{6} se selecciona de H, alquilo C1 a C10
sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más
heteroátomos y heterociclos no aromáticos;
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2}; o
R^{7} y R^{8} son ambos hidrógeno; así como
las sales farmacéuticamente aceptables o profármacos de los
compuestos de fórmula (I).
Cuando es cíclico, el grupo alquilo es
preferiblemente C5 a C10, más preferiblemente C5-C7.
Cuando es acíclico, el grupo alquilo es preferiblemente C1 a C6,
más preferiblemente metilo, etilo, propilo
(n-propilo, isopropilo), butilo (lineal o
ramificado) o pentilo, y lo más preferido metilo.
Como se usa aquí, el término "arilo"
significa un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo, o un grupo
heteroaromático mono-, bi-, o tricíclico que contiene uno o más
heteroátomo(s) preferiblemente seleccionados de N, O y S,
tales como piridilo, pirrolilo, quinolinilo, furanilo, tienilo,
oxadiazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazolilo,
triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, imidazolilo,
pirimidinilo, indolilo, pirazinilo, indazolilo, pirimidinilo,
tiofenetilo, piranilo, carbazolilo, acridinilo, quinolinilo,
bencimidazolilo, benzoimidazolilo, benzotiazolilo, purinilo,
azapurinilo, cinnolinilo, pteridinilo.
Como se usa aquí, el término "grupos
funcionales" significa en el caso de grupos no protegidos:
hidroxi-, tiol-, función amina, ácido carboxílico y en el caso de
grupos protegidos: alcoxi inferior, N-, O-,
S-acetilo, éster de ácido carboxílico.
Como se usa aquí, el término "heteroarilo"
significa un grupo aromático que contiene uno o más
heteroátomo(s) preferiblemente seleccionados de N, O y S,
tales como piridilo, pirrolilo, quinolinilo, furanilo, tienilo,
oxadiazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazolilo,
triazolilo, imidazolilo, pirimidinilo, indolilo, pirazinilo o
indazolilo.
Como se usa aquí, el término "heterociclo no
aromático" significa un grupo cíclico no aromático que contiene
uno o más heteroátomo(s) preferiblemente seleccionados de N,
O y S, tales como un grupo amino cíclico tales como pirrolidinilo,
piperidilo, piperazinilo, morfolinilo o un éter cíclico tales como
tetrahidrofuranilo, monosacári-
do.
do.
Como se usa aquí, el término "halógeno"
significa flúor, cloro, bromo o yodo, de los que el cloro
generalmente es el preferido.
Como se usa aquí, y a menos que se especifique
de otra forma, el término "sustituido" significa que los grupos
en cuestión están sustituidos con grupos funcionales tales como
hidroxilo, amina, sulfuro, sililo, ácido carboxílico, halógeno,
arilo, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
Un grupo de compuestos actualmente preferidos
son los representados por la fórmula II
en
donde:
R_{1} y R_{2} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, un grupo hidroximetilo, o un grupo
metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido
con un grupo amino, un grupo metileno unido a un átomo de nitrógeno
contenido en la estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol, o R_{1} y R_{2}
pueden representar juntos un grupo metileno de doble enlace, y;
R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, hidroxilo, y benzoiloxi, o R_{3}
y R_{4} pueden representar juntos un átomo de oxígeno que está
unido con un doble enlace, con la condición que cuando cualquiera
de R_{3} y R_{4} es un grupo benzoiloxi, ambos R_{1} y R_{2}
son hidrógeno.
\newpage
En los compuestos de fórmula II anteriores, el
grupo fenilo o la estructura de anillo que contiene nitrógeno de
R_{1}, y el grupo benzoiloxi de R_{3} o R_{4} pueden
opcionalmente estar sustituidos, tal como por ejemplo con un
halógeno, metilo, metoxi, amino y/o halometilo que contiene de
1-3 átomos de halógeno.
Un compuesto de la invención puede estar en
forma libre, por ejemplo en forma anfotérica, o en forma de sal,
por ejemplo de adición de ácido o una sal aniónica. Un compuesto en
su forma libre puede ser convertido en una sal de manera conocida
en la técnica y viceversa.
También se cree que dichos compuestos son
capaces de inducir apoptosis en células vasculares angiogénicas
durante la angiogénesis, induciendo por lo tanto la regresión de los
vasos sanguíneos angiogénicos y bloqueando varios estados de la
enfermedad dependientes de la formación de vasos sanguíneos y/o
supervivencia de las células vasculares, incluyendo el crecimiento
y metástasis de varios tumores humanos; ceguera de los adultos, por
ejemplo causada por la retinopatía diabética o la degeneración
macular; soriasis; estados de inflamación crónica, por ejemplo la
artritis reumatoide; hemangioma; y obesidad.
En un aspecto la presente invención proporciona
un método para tratar el melanoma maligno y/o inhibir la
angiogénesis no deseada, que comprende administrar a un mamífero
con necesidad del mismo una cantidad farmacéuticamente eficiente de
un compuesto seleccionado de los compuestos que tienen una
estructura según la fórmula I.
Los inventores actuales han descubierto también
un estado conformacional de la proteína wt p53 en las células
tumorales hasta ahora desconocido y de lo más inesperado. La
conformación inactiva de wt p53 se ha encontrado ahora en células
malignas de melanoma. Más importante, dicha conformación inactiva de
wt p53 puede revertir a una conformación funcional activa, capaz de
inducir apoptosis. Basada en estos descubrimientos, la presente
invención, en otro aspecto, proporciona un método para probar
sustancias en cuanto a su habilidad para transformar la
conformación inactiva de wt p53 en una conformación activa de wt
p53, y así para descubrir sustancias adecuadas para tratar el
melanoma maligno. El método se define en la reivindicación 6. Puesto
que se cree que la misma conformación inactiva de wt p53 está
presente en las células vasculares angiogénicas durante la
angiogénesis, se cree también que las mismas sustancias son útiles
para inhibir la angiogénesis en trastornos patológicos que se sabe
envuelven angiogénesis.
La Figura 1A muestra el porcentaje de células
apoptóticas en función del tiempo en células M21 de melanoma humano
que expresan la integrina \alpha_{v}\beta_{3} y células M21L
que carecen de la integrina \alpha_{v}\beta_{3}.
La Figura 1B muestra el porcentaje de células
apoptóticas en función del tiempo en células M0 de melanoma humano,
que carecen de la integrina \alpha_{v}\beta_{3};
M0-2baV, células M0 que sobre expresan una quimera
del dominio extracelular de la subunidad de la integrina IIb con la
cola citoplasmática de la subunidad \alphaV; y células
M0-\alphaV que expresan concentraciones altas de
la subunidad \alphaV de la integrina.
La Figura 1C ilustra la expresión en la
superficie celular de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} y la
subunidad de la integrina \beta_{3} en distintas líneas
celulares de melanoma humano.
La Figura 1D muestra los resultados de un
análisis por ruptura de caspasa-8 y
caspasa-9.
Figura 2A: el panel superior muestra la
actividad de unión específica al ADN de p53 en células M21 y M21L
recogidas de colágeno de 3 dimensiones usando un ensayo de
desplazamiento de gel de electroforesis (EMSA) con un
superdesplazamiento de p53 usando Pab 421; el panel inferior
presenta las concentraciones de proteína de p53 comparadas con
actina como control de carga.
La Figura 2B, es lo mismo que el panel superior
de la figura 2A, pero con células M0 y M0\alphav.
La Figura 2C muestra la acetilación de p53 en la
lisina 382 y las concentraciones de proteína de PUMA, Apaf1, Bax y
Bcl- en células M21 (\alphav+) y M21L (\alphav-) después del
cultivo en colágeno de 3 dimensiones hasta 7 días en colágeno de 3
dimensiones se detectaron por medio de Western blotting.
Los datos mostrados en la Figura 2D representan
la reactividad de Pab 1620 y Pab 240 como porcentaje de reactividad
de D01 (p53 total) en células M21 (\alpha_{v}\beta_{3}+) y
M21L (\alpha_{v}\beta_{3}-).
El panel superior de la Figura 3A muestra el
porcentaje de células apoptóticas en células M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+), células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-) y un número de clones de células en
células M21L (\alpha_{v}\beta_{3}-) transfectadas de forma
estable con un p53-His
175 dominante negativo, incluyendo M21Lp53His175-0, M21Lp53His175-1, M21Lp53His175-8 y M21Lp53His175-32. El panel inferior muestra la actividad de unión de ADN de p53 en estos clones después de 5 días en colágeno de 3 dimensiones.
175 dominante negativo, incluyendo M21Lp53His175-0, M21Lp53His175-1, M21Lp53His175-8 y M21Lp53His175-32. El panel inferior muestra la actividad de unión de ADN de p53 en estos clones después de 5 días en colágeno de 3 dimensiones.
La Figura 3B ilustra el crecimiento del tumor
in vivo de las células usadas en la Figura 3A.
En la Figura 3C el gráfico muestra los valores
medios de los volúmenes tumorales con el tiempo en de
5-7 animales para cada tipo celular de tumor
mostrado en la Figura.
La Figura 3D muestra un gráfico de barras que
muestra los pesos húmedos de los tumores de M21, M21L,
M21Lp53His175-0 y M21Lp53His175-8
después de 25 días de crecimiento tumoral en ratones.
En la Figura 3E M21 (\alphav+), M21L
(\alphav-) y seis clones individuales m21Lp53siARN (Lp53siARN) de
células de melanoma se cultivaron en colágeno de 3 dimensiones
durante los tiempos indicados. Se detectó apoptosis por teñido con
Annexina-V. Los blots de las concentraciones de p53
y la proteína actina se muestran en la parte vertical de las
células indicadas inmediatamente a la izquierda de cada carril. Los
resultados mostrados son representativos de tres experimentos
independientes.
La Figura 4A muestra los resultados del examen
de la conformación de p53 con Pab1620 y Pab 240 en células de
melanoma M21 y M21L incubadas con o sin PRIMA-1 100
\muM durante 5 días.
El panel superior de la Figura 4B muestra los
resultados del examen de la conformación de p53 con Pab1620 y Pab
240 en células de melanoma AA en condiciones de cultivo de 2
dimensiones (día 0) y después de 5 días en colágeno de 3
dimensiones. El panel inferior muestra el examen de la conformación
de p53 después de 5 días en colágeno de 3 dimensiones con o sin
PRIMA-1 100 \muM.
El panel superior de la Figura 4C muestra la
cuantificación de apoptosis por medio del teñido con Annexina V en
células de melanoma M21 después de 16, 24, 36, y 48 horas en
colágeno de 3 dimensiones con o sin tratamiento con
PRIMA-1 100 \muM. El panel inferior muestra los
resultados del mismo tratamiento en condiciones de cultivo de 2
dimensiones.
La Figura 4D muestra tumores humanos de melanoma
crecidos subcutáneamente en ratones sin pelo tratados con una
inyección única de PRIMA-1, lisados y analizados en
cuanto a la acetilación de p53 en la lisina 382, fosforilización de
p53 en la Ser 15 y las concentraciones de proteína de PUMA, Apaf1 y
por Western blotting 24 y 36 horas después de inyección de
PRIMA-1.
La Figura 4E muestra que la caspasa 9, pero no
la caspasa 8, se activa con PRIMA-1 en tumores de
melanoma M21 tratados como se describió en la figura 4D.
La Figura 4F muestra que la apoptosis inducida
por PRIMA-1 es bloqueada por el inhibidor de la
caspasa 9 Z-LEHD-FMK x TFA (C1355)
en colágeno de 3 dimensiones.
La parte superior de la Figura 4G muestra los
volúmenes medios de los tumores con el tiempo de células de
melanoma humano M21 cultivadas en ratones sin pelo C57/BL tratados
con o sin PRIMA-1 (100 mg/kg) durante 6 días. La
parte inferior muestra los volúmenes medios de los tumores con el
tiempo de células de melanoma humano C8161 cultivadas en ratones
sin pelo C57/BL tratados con o sin PRIMA-1 (100
mg/kg) durante 6 días.
En la Figura 4H, se muestran los pesos húmedos
de los tumores después de 25 días de formación de tumores de
melanoma M21 con o sin tratamiento con PRIMA-1 como
se describe en la figura 4G.
En la mayor parte de los tumores humanos p53
está mutada, pero la poca frecuencia de mutación de p53 en el
melanoma maligno es misteriosa. Sin embargo, el melanoma maligno
expresa concentraciones altas de integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, una integrina que promueve la
supervivencia de las células de melanoma (Montgomery et al.,
PNAS 91:8856-8860 (1994); Petitclerc et
al; Hsu et al., Am J Pathol.
153:1435-1442 (1998)) y suprime la actividad de p53
en las células endoteliales (Strömblad et al., J. Clin.
Invest. 98:426-433 (1996); Strömblad et
al., J, Biol. Chem. 277: 13371-13374
(2002)). Los inventores actuales sugieren ahora que la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} suprime la actividad de la p53 de
melanoma por medio de la inducción de una conformación inactiva, no
plegada, previamente desconocida de p53. En las células tumorales,
se ha encontrado que dicha actividad de p53 regulada por la
integrina \alpha_{v}\beta_{3} gobierna la supervivencia de
las células de melanoma y el crecimiento tumoral. Se encontró que la
p53 dominante negativa (His175) así como p53siARN restauraban la
supervivencia de las células y el crecimiento tumoral de células de
melanoma que carecían de la integrina \alpha_{v}\beta_{3},
sugiriendo que la inactivación de p53 mediada por la integrina
controla la supervivencia de las células de melanoma. El compuesto
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona,
también llamado PRIMA-1, que se sabe anteriormente
por el documento de patente internacional WO0224692 que tiene la
habilidad de revertir la conformación de p53 mutada a un estado
activo, sorprendentemente restauró la conformación activa de wt p53
en células de melanoma, indujo apoptosis y bloqueó el crecimiento
tumoral del melanoma en una forma dependiente de wt p53. Estos
resultados pueden explicar que la mutación de p53 en el melanoma
maligno no sea necesaria, e indica un principio de acción nuevo en
la terapia del melanoma.
Strömblad et al., en J. Clin.
Invest. 98:426-433 (1996), citado anteriormente,
indicaron que las células endoteliales proliferativas se convierten
en apoptóticas como respuesta a antagonistas de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, conduciendo a la regresión de vasos
sanguíneos angiogénicos, y por lo tanto bloqueando el crecimiento de
varios tumores humanos, y que el bloqueo de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} lleva a la activación de p53.
Basados en los descubrimientos mostrados en la
publicación anterior, y los descubrimientos descritos en la
presente solicitud, los inventores creen también que los compuestos
actuales son capaces de inducir apoptosis en células endoteliales
proliferativas durante la angiogénesis, induciendo por lo tanto la
regresión de los vasos sanguíneos angiogénicos y bloqueando varias
enfermedades que dependen de la formación de vasos sanguíneos y/o
supervivencia de las células vasculares, incluyendo el crecimiento y
metástasis de varios tumores humanos; ceguera de los adultos, por
ejemplo causada por la retinopatía diabética o la degeneración
macular; soriasis; estados de inflamación crónica, por ejemplo la
artritis reumatoide; hemangioma; y obesidad. Consecuentemente, se
cree que la misma conformación inactiva de wt p53 que se describe
aquí está presente en dichas células endoteliales proliferativas
durante la angiogénesis.
Mientras que se cree que la conformación
inactiva de wt p53 en células de melanoma está inducida por la
integrina \alpha_{v}\beta_{3}, el mecanismo subyacente para
la inducción de cualquier estado inactivo similar de p53 en otros
tejidos podría ser diferente. Sin embargo, puesto que el mecanismo
actual de acción de los compuestos actuales no se entiende bien, es
también concebible que los mismos compuestos pudieran ser útiles
para tratar otros trastornos patológicos en donde esté presente la
wt p53 inactiva.
Pueden descubrirse sustancias útiles para tratar
otros trastornos patológicos en donde esté presente la wt p53
inactiva por medio del método genérico de la presente invención.
Como se usa aquí el término "conformación
inactiva de wt p53" se usa de forma intercambiable con el término
"conformación inactiva, no plegada de wt p53" para designar
una conformación de wt p53 que es reactiva al anticuerpo
monoclónico Pab 240, pero no reacciona con el anticuerpo monoclónico
Pab 1620. Además, la conformación inactiva tiene también la
habilidad de ser transformada en una conformación activa de wt p53
por medio del compuesto químico anterior llamado
PRIMA-1. La conformación inactiva de wt p53 se
caracteriza además por ser incapaz de unirse al ADN, e incapaz de
mediar apoptosis.
Anteriormente se sabía que el Pab 240 solamente
era reactivo al p53 mutante en condiciones de no desnaturalización,
mientras que era igualmente reactivo con la p53 mutante y wt p53 en
condiciones de desnaturalización. Sin embargo, los inventores
actuales han descubierto ahora que el Pab 240 es también reactivo al
estado inactivo de wt p53, definido aquí, en condiciones de no
desnaturalización.
La integrina \alpha_{v}\beta_{3} juega
un papel crítico en la progresión del melanoma cutáneo mostrando
una mayor expresión en las lesiones de melanoma de la fase de
crecimiento vertical comparado con las lesiones de la fase más
benigna de crecimiento radial (Albeda et al., Cancer
Res. 50:6757-6764 (1990)). En modelos
experimentales, la expresión de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} promociona la supervivencia de las
células de melanoma, el crecimiento tumoral y la conversión de la
fase de crecimiento radial a la vertical mientras que el bloqueo de
la integrina \alpha_{v}\beta_{3} inhibe el crecimiento
tumoral del melanoma induciendo apoptosis
(Felding-Habermann, J Clin Invest.
89:2018-22 (1992); Petitclerc et al., 1999;
Hsu et al., 1998), implicando que la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} regula funcionalmente la supervivencia
de las células de melanoma. Efectivamente, se ha encontrado también
que la integrina \alpha_{v}\beta_{3} promueve la
supervivencia de las células de melanoma en un entorno de 3
dimensiones in vitro (Montgomery et al., 1994). Pero,
no está claro todavía como la integrina \alpha_{v}\beta_{3}
puede controlar la supervivencia de las células de melanoma.
La proteína supresora de tumores p53 induce
funcionalmente la muerte celular apoptótica como respuesta a varios
tipos de estrés (Oren, Cancer Biol. 5:221-227
(1994); Ko y Prives, Genes Dev. 10: 1054-1072
(1996); Levine, Cell 88:323-331 (1997)). La
p53 activada puede ocasionar apoptosis por medio de dos caminos
(Vousden, Cell. 103: 691-694 (2000)). Uno de
ellos está asociado con receptores de la muerte y la activación de
la caspasa-8 (Ashkenazi y Dixit, Science 281:
1305-8 (1998)), mientras que el otro camino
apoptótico es mediado a través de la liberación del citocromo c de
la mitocondria y la activación subsecuente de Apaf1 y
caspasa-9 (Green y Reed, Science 281:
1309-12 (1998)). Además, p53 actúa como una proteína
de unión específica a ADN para activar o reprimir la expresión de
una variedad de genes, incluyendo la activación por transcripción
de bax (Miyashita et al., Cell 80:293 (1995)), PIG3
(gen 3 inducible por p53, Venot et al., EMBO J.
17: 4668-79 (1998)), PUMA (modulador de apoptosis
de p53 regulado en aumento, Nakano y Vousden, Mol Cell.
7:683-694 (2001)), y Apaf-1 (factor
1 activador de proteasa apoptótico; (Vouden y Lu, 2002)) y
reprimiendo por transcripción bcl-2 (Zhan et
al., Oncogene 9: 3743-51 (1994)). Estas
dianas de corriente abajo están involucradas funcionalmente en
ciertos procesos apoptóticos mediados por p53.
Recientemente se ha descrito un nuevo mecanismo
para la apoptosis inducida por p53 que actúa directamente en la
membrana de la mitocondria por Mihara, A. et al., en "p53
has a direct apoptogenic role at the mitochondria", Molecular
Cell, publicado el 27 de Enero de 2003. Según esto, p53, por
medio de un rápido movimiento a la mitocondria, efectivamente
"empieza rápido" y amplifica su efecto de apoptosis dependiente
de la transcripción, de arranque más lento. Además, un antagonista
de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} induce la apoptosis de
las células endoteliales proliferativas, que está asociada con la
activación de p53 (Strömblad et al., 1996; Strömblad et
al., 2002). Aunque p53 está mutado en la mayor parte de los
tumores humanos, wt p53 es dominante en el melanoma maligno
(Hollstein et al., 1991; Sparow et al., 1995; Hartmann
et al., 1996). Además, los melanomas malignos son
típicamente refractarios a la inducción de apoptosis con fármacos
químicos o radioactividad.
Para demostrar que la regulación de p53 mediada
por la integrina \alpha_{v}\beta_{3} regula la supervivencia
de las células de melanoma, se realizaron los siguientes
experimentos, que se describirán aquí en más detalle a
continuación. Primero, se analizaron células M21 de melanoma humano
que expresan la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, y la
subpoblación M21L que carece de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, en un modelo tridimensional de
colágeno que mimetiza el entorno dérmico patofisiológico. Se
encontró que la integrina \alpha_{v}\beta_{3} inhibió la
actividad de p53 induciendo una conformación inactiva de wt p53.
Además, la sobreexpresión de un mutante dominante negativo de p53
(His175) o p53 siARN restauró la supervivencia de las células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-) y el crecimiento tumoral, sugiriendo
que p53 es una diana clave para la supervivencia de las células de
melanoma promovida por la integrina \alpha_{v}\beta_{3}. Es
importante que PRIMA-1 pudiera restaurar la
conformación activa de wt p53 en células M21 y por lo tanto
conducir a la apoptosis de células de melanoma y suprimir el
crecimiento tumoral del melanoma. Estos resultados revelan un
principio novedoso para el tratamiento del melanoma por
reactivación de wt p53.
En relación a la figura 1A, las células madre de
melanoma humano M21, que expresan la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, y una subpoblación, M21L, que carece
de la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, se cultivaron en un gel
de colágeno de 3 dimensiones (colágeno 3D). En los tiempos
indicados, se detectó apoptosis por teñido con
FITC-Annexina-V. El análisis de FACS
mostró que las células M21L que carecían de
\alpha_{v}\beta_{3} fueron apoptóticas en un grado mucho
más alto que las células M21 (\alpha_{v}\beta_{3}+),
sugiriendo que la expresión de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} es crítica para la supervivencia de las
células de melanoma.
Las células madres de melanoma humano M0, que
carecen de la integrina \alpha_{v}\beta_{3};
M0-2baV, células M0 que sobre expresan una quimera
del dominio extracelular de la subunidad IIb de la integrina con la
cola citoplasmática de la subunidad de la integrina \alphaV; y
células M0-\alphaV que expresan concentraciones
altas de la subunidad de la integrina \alphaV, se cultivaron en
colágeno 3D. En los tiempos indicados, se detectó apoptosis por
teñido con FITC-Annexina-V. Como se
muestra en la figura 1B, el análisis de FACS mostró que las células
M0\alphaV (que expresaban \alpha_{v}\beta_{3}),
sobrevivieron bien mientras que tanto las células M0 como M02baV
sufrieron apoptosis en mayor grado en todos los tiempos observados.
Esto indica que la parte de la unión al ligando extracelular de la
subunidad \alphaV de la integrina es importante en la
supervivencia de las células de melanoma.
Se analizó la expresión de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} y de la subunidad de la integrina
\beta_{3} en la superficie celular en las líneas celulares de
melanoma humano M21, M21L, M0, M0-\alphaV y
M0-2baV teñidas con
anti-\alpha_{v}\beta_{3} Mab LM609 y
anti-\beta_{3} Mab AP3, respectivamente. Como
puede verse en la figura 1C, el análisis de FACS mostró que tanto
\alpha_{v}\beta_{3} como la subunidad \beta_{3} se
expresaron en todas las células M21 y M0\alphaV pero raramente se
expresaron en células M21L y M0. Mientras que la integrina
\beta_{3} se expresó en prácticamente todas las células
M0-2baV, la integrina \alpha_{v}\beta_{3}
no estaba presente.
Se ha sugerido que la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} no unida pueda causar apoptosis por
inducción directa la rotura de la caspasa-8
(Stupack et al, J. Cell Biol. 155:
459-470 (2001)). Por lo tanto, se analizaron los
lisados del colágeno 3D preparados con células M21 y M21L después de
3, 5 y 7 días por western blotting en cuanto a la ruptura de la
caspasa-8 y la caspasa-9. En
relación a la figura 1D, no se observó rotura de la
caspasa-8 en estas células de melanoma, mientras que
un control de células de Jurkate tratadas con cicloheximida mostró
rotura de la caspasa-8. Sin embargo, la
caspasa-9 se rompió más en las células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-) comparadas con las M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+), indicando que la falta de integrina
\alpha_{v}\beta_{3} causó apoptosis en las células M21L y
que esta apoptosis puede estar mediada por un camino apoptótico
mitocondrial que envuelve a la caspasa-9 pero que no
envuelve ninguna activación detectable de la
caspasa-8.
Se examinó la actividad específica de unión de
p53 a ADN en células M21 y M21L recogidas de colágeno 3D usando un
ensayo de desplazamiento de gel electroforético (EMSA) con un súper
desplazamiento de p53 usando Pab 421. La actividad de p53 fue
similar en las células M21 y M21L en el día 0. Sin embargo, como se
muestra en el panel superior de la figura 2A, las células M21L que
carecían de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} mostraron una
mayor actividad de p53 después de su cultivo en colágeno 3D mientras
que las células M21 (\alpha_{v}\beta_{3}+) no lo
hicieron.
Se analizaron las concentraciones de proteína de
p53 por Western blotting usando Pab anti-p53. En
relación al panel inferior de la figura 2A, las concentraciones de
proteína de p53 en células M21 y M21L no mostraron ninguna
diferencia en 7 días en el colágeno 3D (examen realizados en los
días 0, 3, 5 y 7). Se examinaron las concentraciones de actina como
control de carga. Esto indica que la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} regula la actividad de p53 sin
influenciar las concentraciones de proteína de p53.
Se examinó la actividad específica de unión de
p53 a ADN en células M0 y M0\alphaV después de incubación en
colágeno 3D durante 5 y 7 días, respectivamente. El ensayo de EMSA
mostró que la actividad de p53 fue mayor en las células M0 que
carecían de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} que en las
células M0\alphaV (\alpha_{v}\beta_{3}+) (véase la figura
2B). Esto verifica el papel de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} en la regulación del estado de
activación de p53 en células de melanoma en un segundo sistema
celular.
Se examinó la acetilación de p53 en la lisina
382, un lugar de acetilación para la activación de p53 conocido por
Western blotting usando pab anti acetilación
p53-L382. Como puede verse en la figura 2C, las
concentraciones de p53 acetilado se redujeron en células M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+) comparadas con células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-), mientras que las concentraciones
totales de p53 permanecieron sin alterarse. Además PUMA fue regulada
en aumento en células M21L (\alpha_{v}\beta_{3}-) en
paralelo con la activación de p53, pero no en células M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+), indicando que la actividad de p53
podría activar PUMA de forma transcripcional.
En relación a la figura 2D, se analizó la
conformación de p53 por ELISA usando Pab 1620 para reconocer la
conformación activa, plegada, de p53; Pab 240 que reconocía la
conformación inactiva, no plegada de p53 y; DO1 que reconocía tanto
la conformación plegada como la no plegada de p53. Los datos
mostrados en la figura 2D representan la reactividad de Pab 1620 y
Pab 240 como porcentaje de la reactividad de D01 (total de p53). Se
encontró que tanto las células M21 (\alpha_{v}\beta_{3}+)
como las células M21L (\alpha_{v}\beta_{3}-) mostraban una
conformación de p53 activa en cultivo regular de dos dimensiones
(día 0). Sin embargo, p53 cambió a una conformación inactiva no
plegada después de incubación en colágeno 3D de las células M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+), mientras que células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-) mantenían una conformación de p53
activa. Esto sugiere que la integrina \alpha_{v}\beta_{3}
regula la conformación de wt p53 en células de melanoma en un
entorno patofisiológico de 3 dimensiones y que la falta de actividad
de p53 en células que expresan la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} está causada por una conformación de p53
no plegada, inactiva.
Células
M21L(\alpha_{v}\beta_{3}-) fueron transfectadas de
forma estable con p53-His175 dominante negativo y
se identificaron un número de clones incluyendo
M21Lp53His175-0, M21Lp53His175-1,
M21Lp53His175-8 y M21Lp53His175-32,
examinando la actividad de p53 usando EMSA después de incubación en
colágeno 3D durante 5 días. La actividad de p53 en estos clones se
redujo a un nivel similar a las células M21 que expresaban
\alpha_{v}\beta_{3} (panel inferior en la figura 3A). Los
clones M21Lp53His175 y las células M21L y M21 se incubaron en
colágeno 3D y se examinó la apoptosis por teñido con
FITC-Annexina V en los tiempos indicados en la
figura 3A. El análisis de FACS mostró que el número de células
apoptóticas fue más bajo en las células M21L que llevaban clones dn
p53 comparado con las células M21L, y que la velocidad de apoptosis
en los clones M21L-dnp53 fue similar a la de las
células M21 que expresaban la integrina \alpha_{v}\beta_{3},
indicando que la sobreexpresión del p53 dominante negativo podía
rescatar las células M21L de apoptosis en un grado similar a la
expresión de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} misma.
Se investigó el papel de la p53 regulada por la
integrina en el crecimiento tumoral del melanoma in vivo.
Los resultados se muestran en la figura 3B. Las células de melanoma
(1 x 10^{6}), incluyendo los clones de M21L, M21 y
M21L-dn p53, M21Lp53His175-0 y
M21Lp53His175-8, se inyectaron por vía subcutánea en
la espalda de ratones sin pelo C57/BL de 6 semanas. Cada tipo de
célula inyectada incluía 7 ratones. Se permitió que los ratones
crecieran durante 25 días. Se encontró que los tumores se formaron
con células M21Lp53His175-0,
M21Lp53His175-8, y
M21(\alpha_{v}\beta_{3}+), mientras que las células
M21L que carecían de la integrina \alpha_{v}\beta_{3}
típicamente no formaron tumores durante este tiempo.
Se monitorizaron los volúmenes de los tumores en
cuanto al crecimiento del melanoma, como se describió en el párrafo
anterior. Se determinó el volumen del tumor en el tiempo por la
fórmula: anchura^{2} x longitud x 0,52. En relación a la figura
3C, los valores mostrados son la media del volumen de los tumores de
5-7 animales para cada tipo de célula tumoral. En
la figura, \blacklozenge represente M21; \Box M21L;
\blacktriangle Lp53His175-0; y \Box;
Lp53His175-8. M21Lp53His175-0 y
Lp53His175-8 formaron tumores grandes similares en
tamaño a los tumores de M21. Sin embargo, las células M21L que
carecían de integrina \alpha_{v}\beta_{3} típicamente
desarrollaron solo tumores mínimos o no desarrollaron ningún
tumor.
En la figura 3D se muestra el gráfico de barras
de los valores medios, más menos la desviación estándar, de los
pesos húmedos de los tumores de las células M21, M21L,
M21Lp53His175-0 y M21Lp53His175-8.
Las células se cultivaron por vía subcutánea en ratones sin pelo
durante 25 días como se describe en la figura 3B.
Se transfectaron de forma estable células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-) con p53-siARN y se
identificaron un número de clones incluyendo M21Lp53siARN16,
M21Lp53siARN17, M21Lp53siARN18, M21Lp53siARN19, M21Lp53siARN21, y
M21Lp53siARN22, examinando las concentraciones de proteína de p53
usando Western blot (panel vertical de la figura 3E). Los clones
M21Lp53siARN y las células M21L y M21 se incubaron en colágeno 3D y
se examinó la apoptosis por teñido con
FITC-Annexina V en los tiempos indicados en la
figura 3E. El análisis de FACS mostró que el número de células
apoptóticas fue más bajo en las células M21L que llevaban clones dn
p53 comparado con las células M21L, y que la velocidad de apoptosis
en los clones M21L-p53siARN era similar a la de las
células M21 que expresaban la integrina \alpha_{v}\beta_{3},
indicando que la sobreexpresión de p53siARN podía rescatar las
células M21L de la apoptosis en un grado similar al de la expresión
de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} misma.
Ejemplo
En este ejemplo se demostrará que
PRIMA-1 induce una conformación de p53 activa en
células de melanoma positivas para la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, induce las dianas transcripcionales de
p53, promueve la apoptosis de la célula de melanoma, incluyendo la
activación de caspasa específica, y suprime el crecimiento del tumor
de melanoma in vivo.
PRIMA-1 es una substancia
conocida por el documento de patente internacional WO0224692 que
puede reactivar la función de inducción de apoptosis de las
proteínas p53 mutantes. Para probar si PRIMA-1
podría afectar también la conformación inactiva no plegada de wt
p53 en las células de melanoma obligada por la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, las células M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+) y las células M21L
(\alpha_{v}\beta_{3}-) se incubaron con o sin 100 \muM de
PRIMA-1 en colágeno 3D durante 7 días. La
conformación de p53 se examinó como se describió anteriormente. Los
resultados se presentan en la figura 4A. Como puede verse,
PRIMA-1 pudo restaurar la conformación activa de
p53 desde un estado inactivo no plegado en células M21
(\alpha_{v}\beta_{3}+), mientras que la conformación de p53
en células M21L de control (\alpha_{v}\beta_{3}-) no fue
influenciada por PRIMA-1. Esto demuestra de forma
independiente que wt p53 en las células de melanoma pueden sufrir
cambios conformacionales entre los estados plegados y no plegados.
Más importante, estos resultados sorprendentemente indican que la
conformación no plegada de wt p53 en las células de melanoma puede
ser revertida a la conformación activa por PRIMA-1.
Por esta razón, la conformación de p53 fue también analizada en
células de melanoma humanas AA que expresan integrina
\alpha_{v}\beta_{3} y wt p53 antes y después de la
incubación con colágeno 3D (figura 4B). Los resultados en el panel
superior muestran que p53 en las células AA tenían una conformación
activa en las condiciones de cultivo 2D (día 0) y que la incubación
en colágeno 3D indujo una conformación inactiva. Sin embargo, muy
importante, el panel inferior muestra que el tratamiento de las
células de melanoma AA con PRIMA-1 obliga a p53 a
la conformación activa en colágeno 3D. Esto muestra que
PRIMA-1 puede usarse para convertir wt p53 de
conformación inactiva a conformación activa en diferentes células de
melanoma.
La apoptosis se analizó en células M21 crecidas
en condiciones de cultivo 2D o en colágeno 3D con o sin tratamiento
de PRIMA-1 durante 16, 24, 36 y 48 horas. Los
resultados se muestran en la figura 4C. PRIMA-1
promovió la apoptosis en células M21 (\alpha_{v}\beta_{3}+)
en colágeno 3D en un grado mucho más alto que en cultivo 2D,
sugiriendo que la regulación del estado de activación de p53
controla la supervivencia de la célula de melanoma selectivamente
en ambientes 3D. Esto verifica también de forma independiente los
resultados usando dn p53 y p53-siARN (figura
3).
La figura 4D muestra la acetilación de
p53-Lis382, la fosforilación de
p-53-ser15, y las concentraciones de
proteína de Apaf-1, PUMA y Bax en tumores de célula
de melanoma humana M21 crecidos en ratones sin pelo 24 y 36 horas
después de una única inyección de PRIMA-1, todo
detectado por Western blot. Los resultados muestran que
PRIMA-1 induce la acetilación de p53 así como las
concentraciones de proteína de Apaf-1 y PUMA en
tumores de melanoma in vivo. Así, la acetilación de
p53-lis382 está potencialmente envuelta en la
activación de p53 por PRIMA-1, mientras que
Apaf-1 y PUMA son mediadores potenciales corriente
abajo de PRIMA-1 y de la apoptosis de la célula de
melanoma inducida por p53 in vivo.
La figura 4E muestra la activación de caspasa 9,
pero no de caspasa 8, en tumores de células de melanoma humanas M21
crecidos en ratones sin pelo 24 y 36 horas después de una única
inyección de PRIMA-1, detectada por Western blot.
Los resultados muestran que PRIMA-1 induce. La
caspasa 9 es por tanto un efector potencial corriente abajo de
PRIMA-1 y de la apoptosis inducida por p53 en
células de melanoma in vivo.
La figura 4F muestra la detección de la
apoptosis por el teñido de las células de melanoma de M21 por
Annexina-V después de 36 horas en colágeno 3D con o
sin 80 \muM de Prima-1 con o sin el inhibidor de
caspasa 9 Z-LEHD-FMK x TFA (C1355).
Los resultados muestran que PRIMA-1 induce la
apoptosis de la célula de melanoma en colágeno 3D que puede ser
dependiente de la caspasa 9 activa como un mediador de corriente
abajo.
Para probar si la restauración de una
conformación de wt p53 activa por PRIMA-1 pudiera
también inducir la apoptosis de la célula de melanoma in
vivo y por tanto bloquear el crecimiento del tumor de melanoma,
células de melanoma M212 y células de melanoma C8161 (1,5 x
10^{6}) fueron inyectadas por vía subcutánea en el lomo de
ratones sin pelo C57/BL de 6 semanas de edad. Los ratones fueron
tratados con o sin PRIMA-1 (100 mg/kg) durante 6
días comenzando 6 días después de la inoculación del tumor. El
gráfico de la figura 4G muestra los volúmenes medios de los tumores
calculados como se describió anteriormente para cuatro ratones en
cada grupo. PRIMA-1 inhibió, significativamente, el
crecimiento del melanoma M21 comparado con el control de PBS
mientras que no tuvo efecto en el crecimiento del melanoma C8161.
Dado que las células C8161 tiene un p53 truncado, no funcional
mientras que las células M21 llevan wt p53, los resultados muestran
que el efecto de PRIMA-1 sobre el crecimiento del
melanoma es dependiente del p53 funcional.
En la figura 4H, se muestran la media de los
pesos húmedos del tumor más/menos la desviación estándar después de
25 días de la formación del tumor del melanoma con o sin tratamiento
con PRIMA-1 como se describió en la figura 4G. El
descubrimiento de que PRIMA-1 puede suprimir el
crecimiento del tumor de células de melanoma que llevan wt p53
apunta a un nuevo principio para el tratamiento del melanoma maligno
mediante la reactivación de una conformación inactiva de wt p53,
que se mantuvo inactiva por la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}.
Basados en estos descubrimientos inesperados los
inventores actuales esperan también que análogos estructurales de
PRIMA-1, tales como PRIMA-2 y
PRIMA-3, que se han descrito en el documento de
patente internacional WO0224692, así como análogos posteriores de
PRIMA-1 descritos en las solicitudes de patente
internacional Nº. PCT/SE03/00206 (no publicadas) exhiban actividad
similar a PRIMA-1.
Los ejemplos de sales de adición
farmacéuticamente aceptables para usar en composiciones
farmacéuticas de la presente invención incluyen aquellas derivadas
de ácidos minerales, tales como ácido clorhídrico, bromhídrico,
fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos,
tales como tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico,
benzoico, glicólico, glucónico, succínico, y arilsulfónico. Los
excipientes farmacéuticamente aceptables descritos aquí, por
ejemplo, vehículos, adyuvantes, transportadores o diluyentes, son
bien conocidos para aquellos con conocimientos de la técnica y
están fácilmente disponibles. Los transportadores farmacéuticamente
aceptables pueden ser aquellos que son químicamente inertes para los
compuestos activos y que no tienen efectos secundarios negativos o
toxicidad en las condiciones de uso. Las formulaciones farmacéuticas
se encuentran por ejemplo en Remington: The Science and Practice of
Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania
(1995).
La composición según la invención puede
prepararse para cualquier ruta de administración, por ejemplo, oral,
intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, o
intraperitoneal. La naturaleza precisa del vehículo u otro material
dependerá de la ruta de administración. Para la administración
parenteral, se emplea una solución acuosa aceptable
parenteralmente, que esté libre de pirógenos y tenga el pH,
isotonicidad y estabilidad requeridos. Aquellos con conocimiento de
la técnica son capaces de preparar soluciones adecuadas y numerosos
métodos están descritos en la bibliografía. Una breve revisión de
los métodos para la administración de fármacos se puede encontrar
también en por ejemplo Langer, Science 249:
1527-1533 (1990).
La dosis administrada a un mamífero,
particularmente a un ser humano, en el contexto de la presente
invención debería ser `suficiente para efectuar una respuesta
terapéutica en el mamífero en un marco de tiempo razonable. Una
persona con conocimiento de la técnica reconocerá que la dosis
dependerá de una variedad de factores que incluyen la potencia del
compuesto específico, la edad, la condición y el peso corporal del
paciente, así como el estado/severidad de la enfermedad. La dosis
será también determinada por la ruta (forma de administración)
ritmo y frecuencia de la administración. En el caso de la
administración oral la dosis puede variar desde alrededor de 0,01
mg a alrededor de 1000 mg por día del compuesto de la fórmula (I) o
la cantidad correspondiente de una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo.
Los ejemplos específicos preferidos de los
compuestos que pueden usarse según la presente invención son
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona
(también referido como PRIMA-1),
9-(azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona)-6-cloro-9H-purina
(también referido como PRIMA-2),
2-(hidroximetil)quinuclidina-3,3-diol
(también referido como PRIMA-3),
2-(adenina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
2-metileno-3-quinuclidinona,
2-(-2-amino-3-cloro-5-trifluorometil-1-metilanilina)-3-quinuclidinona,
2-(6-trifluorometil-4-clorobencimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(6-metoxipurina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
1-azabiciclo[2,2,2]oct-3-il
benzoato,
2-(5,6-dimetil-becimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-7-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(ácido
7-metileno-1,3-dimetilúrico)-3-quinuclidinona,
o
2-(2,6-dicloro-9-metilenopurina)-3-quinuclidinona,
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Según la presente invención, un grupo más
preferido de compuestos son aquellos que tienen una estructura como
se define por la siguiente fórmula III
en
donde
uno de R1 y R2 es hidrógeno y el otro es un
grupo metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo
substituido con un grupo amino, a un átomo de nitrógeno contenido en
la estructura de anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol, y, más preferiblemente
el grupo metileno está unido a un átomo de nitrógeno contenido en
la estructura de anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol.
Más preferiblemente, uno de R_{1} y R_{2} en
la fórmula II y III es hidrógeno, o ambos R_{1} y R_{2} son
grupos hidroximetilo.
Los compuestos siguientes se cree que exhiben
una actividad similar o mayor que la de PRIMA-1:
2-(5,6-dimetil-bencimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-7-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(ácido
7-metileno-1,3-dimetilúrico)-3-quinuclidinona,
2-(2,6-dicloro-9-metilenpurina)-3-quinuclidinona
y
2-(6-metoxipurina-9-metileno)-3-quinuclidinona.
Los métodos de la invención para probar
substancias están basados en la detección del p53 tipo silvestre en
la conformación inactiva, tanto en una forma directa como en una
forma indirecta, como se explicará a continuación.
En el método de la presente invención es
esencial que únicamente el tipo silvestre y no el p53 mutante esté
presente. De acuerdo con lo anterior, en cualesquiera células usadas
en el método, solamente el tipo silvestre p53 debería expresarse, o
sea el gen p53 no debe estar mutado. La expresión de wt p53 puede
determinarse fácilmente por una persona con conocimiento de la
técnica usando cualquier método convencional adecuado, tal como
secuenciación, espectroscopia de masas, pruebas de unión a ADN
etc.
Naturalmente, es también esencial que la forma
inactiva de wt p53 esté presente durante la prueba. La presencia de
la forma inactiva de wt p53 puede después adecuadamente establecerse
en una forma directa usando Pab240.
Más particularmente, los inventores actuales han
encontrado que wt p53 es inactivado en las condiciones siguientes:
en las células de melanoma cultivadas in vitro en un entorno
de tres dimensiones, tal como colágeno 3D; en células de melanoma
en cultivo de tejido después de irradiación con UV o radiación
gamma, y, en células de melanoma crecidas in vivo en
ratones. Los inventores también predicen que wt p53 tomará una
conformación inactiva en células vasculares angiogénicas durante la
angiogénesis y que la conformación inactiva de wt p53 está también
presente en tipos adicionales de células y tejidos y en otros casos
pueden ser inducida por otros medios de tratamiento.
El método de monitorizar cualesquiera cambios en
la concentración de wt p53 inactiva durante la prueba no es crítico
según la invención, siempre que el método permita la detección de
cualquier reducción sustancial en la concentración de wt p53
inactiva y una consecuente inducción de las concentraciones de p53
activa.
Basada en la definición anterior del nuevo
estado de wt p53 inactiva, y la presente descripción detallada, la
persona con conocimiento podrá encontrar métodos adecuados para
detectar y/o monitorizar la concentración de wt p53 inactiva usando
conocimientos generales comunes. Tales métodos estarán generalmente
basados en medidas de conformación de wt p53 y/o estado de
actividad, como será explicado a continuación con más detalle.
Durante la prueba, la concentración de wt p53
inactiva puede establecerse por ejemplo usando un anticuerpo
específico conformacional adecuado, que reconozca solamente la forma
inactiva, tal como el mencionado anteriormente Pab240. Ya que la
concentración celular total de wt p53 está formada por las
concentraciones combinadas de p53 inactiva y activa,
respectivamente, la medida de la conformación de p53 activa puede
usarse también como una medida indirecta de p53 inactiva, por
ejemplo una ausencia de p53 activa indica que p53 es en lugar de
ello inactiva. La medida de la conformación de p53 activa puede
también llevarse a cabo usando un anticuerpo específico
conformacional adecuado, tal como Pab 1620. Si se desea, la
concentración total de wt p53 puede medirse por medio de un
anticuerpo adecuado, que no discrimina entre las formas inactivas y
activas de wt p53, tal como DO1.
Desde luego, otros parámetros directos o
indirectos que reflejen el estado de actividad de wt p53 podrían
también usarse. Según lo cual, el estado de actividad de wt p53
puede por ejemplo detectarse por la medida de la unión de p53 a
ADN, por medio de la ausencia de expresión de las construcciones del
reportero, por ejemplo usando GFP o luciferasa como reporteros, por
medio de la medida de los genes de la diana de p53, como se indica
en las figuras 2C y 4D, por ejemplo PUMA-1,
Apaf-1, PIG-3, GADD45, Mdm2,
p21-CIP1, bax, bcl-2, y/o caspasa
3, por medio de usar técnicas de micromatriz relacionadas para
analizar los genes específicos de la diana de p53 o los patrones de
expresión de los genes que indican la actividad de p53 y/o midiendo
la capacidad de wt p53 para inducir la apoptosis y/o el frenado del
crecimiento y/o la actividad de las moléculas envueltas en estos
caminos corriente arriba o corriente abajo de p53, por ejemplo la
activación de la caspasa 9 y la caspasa 3 como se indica en la
figura 4E.
También, como se indicó en la figura 2C y 4D, la
acetilación específica de p53 podría también usarse como una
indicación de la actividad de p53. Igualmente, la fosforilación de
p53 es también concebible como una indicación de la actividad de
p53.
El uso de anticuerpos es sin embargo actualmente
preferido por ser un método práctico y más directo de detectar y
monitorizar la wt p53 inactiva, especialmente cuando se usa
Pab240.
El método general de probar substancias en
cuanto a la habilidad de transferir wt p53 desde una conformación
inactiva a una conformación activa según la presente invención
incluirá así las siguientes etapas generales:
- A.
- Proporcionar células que lleven wt p53 en donde la conformación inactiva de wt p53 está presente;
- B.
- Exponer las células a una substancia que se va a probar; y
- C.
- Medir la concentración celular de la conformación de wt p53 inactiva, por ejemplo por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El método general anterior puede adaptarse a
pruebas in vitro o in vivo exponiendo las células en
la etapa B tanto in vivo como in vitro a la sustancia
que se va a probar, como será fácilmente comprendido de ahora en
adelante.
La etapa C se lleva a cabo típicamente tanto
antes como después de la exposición de la célula en la etapa B a la
substancia que se va a probar.
En el caso de una prueba in vitro para
las substancias capaces de revertir una conformación de p53 inactiva
a una conformación activa, las células que llevan wt p53 pueden
cultivarse en un ambiente tridimensional y la conformación y/o
estado de actividad de p53 medirse, por ejemplo por cualquiera de
los métodos mencionados anteriormente, con o sin, respectivamente,
la adición de una sustancia de prueba. Una sustancia se considera
funcional si se encuentra que es capaz de cambiar la conformación
y/o la actividad de wt p53 inactiva. Alternativamente, las células
con wt p53 podrían irradiarse para inducir la conformación de wt p53
inactiva, exponerlas a una sustancia que se va a probar, y después
de esto analizarlas para la conformación y/o actividad de p53.
Alternativamente, podría utilizarse una célula que naturalmente
muestra una conformación de wt p53 inactiva o una conformación de
wt p53 inactiva podría ser inducida por otros medios, la célula
después de esto se expondría a una sustancia para ser probada, y
analizada en cuanto al estado inactivo de p53.
Un tejido, un órgano, o una parte de los mismos,
de un ser humano o de un animal podría cultivarse, tratarse y
usarse para la prueba de la invención como se describió para las
células in vitro anteriormente. Aunque tales modelos algunas
veces son referidos como modelos ex-vivo,
cuando se usan en el método de la invención de prueba de sustancias
aquí, tales métodos se consideran un método de prueba
in-vitro.
Alternativamente, la prueba
in-vitro de sustancias podría llevarse a cabo
en modelos de angiogénesis. Ejemplos in vitro incluyen, pero
no están limitados a, ensayos de células endoteliales que forman
tubos, crecimiento hacía el exterior de vasos sanguíneos a partir
de células madre, crecimiento hacia el exterior de vasos sanguíneos
a partir de un vaso aislado de origen animal o humano, o análisis de
células endoteliales en cultivo de tejido.
Un procedimiento de prueba in vitro
podría así por ejemplo incluir las siguientes etapas generales:
- A.
- Proporcionar células que lleven wt p53 in vitro, e inducir la conformación wt p53 inactiva si no está ya presente;
- B.
- Exponer las células a una substancia para ser probada; y
- C.
- Medir la concentración celular de la conformación inactiva de wt p53, directamente o indirectamente por ejemplo por cualquiera de los métodos anteriormente mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa C se lleva a cabo típicamente de ambas
formas antes o después de exponer la célula en la etapa B a una
sustancia que se va a probar.
Igualmente, la conformación de wt p53 y/o
actividad podría evaluarse in vivo. Por ejemplo, trasplantes
de células de melanoma podrían usarse in vivo para probar
sustancias en cuanto a su capacidad de revertir una conformación de
p53 inactiva a p53 activa. En este caso, un animal que lleva dicho
trasplante de tumor sería tratado con una sustancia que se va a
probar, y el efecto de esta sustancia sobre la conformación de wt
p53 y la actividad medidos como se describió anteriormente.
Alternativamente, el probado de sustancias podría ser llevado a
cabo en modelos de melanoma animal, donde el melanoma está
ocurriendo naturalmente o es provocado dentro del animal por
tratamiento, por ejemplo, con radiación UV y/o con sustancias
químicas carcinogénicas y/o con modificaciones genéticas. La
administración de una sustancia de prueba a un animal puede
llevarse a cabo por vía intravenosa, vía intraperitoneal, vía
subcutánea, vía intratumoral, o de manera diferente.
Alternativamente, la prueba de sustancias in
vivo podría llevarse a cabo en modelos de angiogénesis. Ejemplos
de modelos in vivo incluyen, pero no están limitados a,
estimulación de la angiogénesis en la membrana corioalantoica del
embrión de pollo, estimulación de la angiogénesis por un trasplante
de la matriz extracelular o sustancias comparables en ratones o en
otro animal, estimulación de la angiogénesis en la córnea por un
compuesto angiogénico, estimulación de la angiogénesis en la retina
por hipoxia, análisis de la angiogénesis de desarrollo en la retina
o en otro lugar, e inducción de la angiogénesis por un trasplante de
tumor u otro tipo de trasplante. La medida de la angiogénesis se
lleva a cabo por una cuantificación del número de vasos sanguíneos
dentro del tejido y/o por cuantificación de los marcadores celulares
vasculares y/o por medida de la apoptosis celular vascular y/o
proliferación celular vascular y/o por medios similares.
Un procedimiento de prueba in vivo podría
por ejemplo comprender las etapas generales siguientes:
- A.
- Proporcionar un animal que exprese wt p53 en un tejido del mismo, en donde la conformación wt p53 inactiva esté presente;
- B.
- Exponer células del tejido del animal in vivo a una sustancia para ser probada; y
- C.
- Medir la concentración celular de la conformación de wt p53 inactiva, directa o indirectamente, por ejemplo por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa C se lleva a cabo típicamente de ambas
formas antes y después de exponer las células en la etapa B a una
substancia que se va a probar
Alternativamente, y como se ilustra en la figura
4G la prueba positiva de un compuesto puede también establecerse
por comparación del efecto de la sustancia probada en células o
tejidos que llevan p53 funcional para el efecto en células o
tejidos que no tienen p53 o no tiene p53 funcional. Obviamente, el
efecto observable puede por ejemplo relacionarse con un volumen de
tumor reducido o peso reducido, o número de células de tumor o
inducción de apoptosis o indicaciones de las mismas, por ejemplo
como se describe en la figura 4. Según esto, en los método
anteriores in vivo e in vitro, en lugar de la etapa C,
una etapa alternativa C' puede usarse que comprende comparar el
efecto de la sustancia probada sobre las células o tejidos (que
llevan p53 funcional) en la etapa B con el efecto sobre las células
o tejidos sin p53 o con p53 no funcional.
Alternativamente, la prueba de un compuesto
puede también probarse comparando el efecto de la sustancia probada
en otros mecanismos fisiológicos o patológicos en donde la
conformación wt p53 pudiera jugar un papel activo para la
regulación, por ejemplo, en la angiogénesis como se indicó
anteriormente. En tales casos, los efectos observables podrían ser
los efectos de la sustancia probada sobre acontecimientos
particulares fisiológicos o patológicos, por ejemplo la cantidad de
vasos sanguíneos formados nuevamente por angiogénesis y/o la
cantidad de apoptosis o indicaciones de la misma en células
vasculares.
Los animales son típicamente sacrificados
después de la prueba in vivo de las sustancias descrita
anteriormente.
Claims (20)
1. El uso de un compuesto capaz de transferir
p53 de tipo silvestre de una conformación inactiva de la misma,
dicha conformación es reactiva a Pab 240 y no a Pab 1620, a una
conformación activa capaz de inducir apoptosis, dicho compuesto se
selecciona de compuestos que tienen una estructura según la fórmula
(I)
en
donde
n es 0, 1 o 2;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y se
seleccionan de -H, -CH_{2}-R^{5},
-CH_{2}-O-R^{5},
-CH_{2}-S-R^{5},
-CH_{2}-NH-R^{5},
-CO-O-R^{5},
-CO-NH-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-R^{5},
-CH_{2}-O-CO-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-NHR^{5},
CH_{2}-NH-CO-OR^{5},
-CH_{2}-NH-CS-NHR^{5}
y
-CH_{2}-O-CO-NHR^{5};
o R^{1} y R^{2} son juntos =CH_{2};
R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y se
seleccionan de H, -OH, -SH, -NH_{2}, -NHR^{5} y
-O-CO-C_{6}H_{5}; o R^{3} y
R^{4} son juntos =O, =S, =NH o =NR^{5};
R^{5} representa grupos iguales o diferentes
seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido,
alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no
sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos
arilo sustituidos o no sustituidos o anillo(s)
heteroaromático(s) mono-, bi-, tricíclicos sustituidos o no
sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos
en donde
los sustituyentes de los grupos sustituidos se
seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a
C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no
aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino
C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR^{6}, CONR^{6} y
COOR^{6};
R^{6} se selecciona de H, alquilo C1 a C10
sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más
heteroátomos y heterociclos no aromáticos;
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2}; o R^{7} y R^{8} son
ambos hidrógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable o
profármaco de los mismos,
para la preparación de un medicamento para uso
en el tratamiento del melanoma maligno.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el
compuesto se selecciona de los compuestos que tienen la siguiente
fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en donde:
R_{1} y R_{2} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, un grupo hidroximetilo, o un grupo
metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido
con un grupo amino, un grupo metileno unido a un átomo de nitrógeno
contenido en la estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol, o R_{1} y R_{2}
pueden representar juntos un grupo metileno de doble enlace, y;
R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, hidroxilo, y benzoiloxi, o R_{3}
y R_{4} pueden representar juntos un átomo de oxígeno que está
unido con un doble enlace, con la condición que cuando cualquiera
de R_{3} y R_{4} es un grupo benzoiloxi, ambos R_{1} y R_{2}
son hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco
del mismo.
3. El uso de la reivindicación 2, en donde el
compuesto se selecciona de
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona,
9-(azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona)-6-cloro-9H-purina,
2-(hidroximetil)quinuclidina-3,3-diol,
2-(adenina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
2-metileno-3-quinuclidinona,
2-(-2-amino-3-cloro-5-trifluorometil-1-metilanilina)-3-quinuclidinona,
2-(6-trifluorometil-4-clorobencimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(6-metoxipurina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
1-azabiciclo[2,2,2]oct-3-il
benzoato,
2-(5,6-dimetil-becimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-7-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(ácido
7-metileno-1,3-dimetilúrico)-3-quinuclidinona,
o
2-(2,6-dicloro-9-metilenopurina)-3-quinuclidinona,
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
4. El uso de un compuesto capaz de transferir
p53 de tipo silvestre de una conformación inactiva de la misma,
dicha conformación es reactiva a Pab 240 y no a Pab 1620, a una
conformación activa capaz de inducir apoptosis, dicho compuesto se
selecciona de compuestos que tienen una estructura según la fórmula
I
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
n es 0, 1 o 2;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y se
seleccionan de -H, -CH_{2}-R^{5},
-CH_{2}-O-R^{5},
-CH_{2}-S-R^{5},
-CH_{2}-NH-R^{5},
-CO-O-R^{5},
-CO-NH-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-R^{5},
-CH_{2}-O-CO-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-NHR^{5},
CH_{2}-NH-CO-OR^{5},
-CH_{2}-NH-CS-NHR^{5}
y
-CH_{2}-O-CO-NHR^{5};
o R^{1} y R^{2} son juntos =CH_{2};
R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y se
seleccionan de H, -OH, -SH, -NH_{2}, -NHR^{5} y
-O-CO-C_{6}H_{5}; o R^{3} y
R^{4} son juntos =O, =S, =NH o =NR^{5};
R^{5} representa grupos iguales o diferentes
seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido,
alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no
sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos
arilo sustituidos o no sustituidos o anillo(s)
heteroaromático(s) mono-, bi-, tricíclicos sustituidos o no
sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos
en donde
los sustituyentes de los grupos sustituidos se
seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a
C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no
aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino
C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR^{6}, CONR^{6} y
COOR^{6};
R^{6} se selecciona de H, alquilo C1 a C10
sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más
heteroátomos y heterociclos no aromáticos;
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2}; o R^{7} y R^{8} son
ambos hidrógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable o
profármaco del mismo,
con la condición que cuando
n es 1;
R^{3} y R^{4} se seleccionan de
-O-CO-C_{6}H_{5} y =O; y
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2};
R^{1} y R^{2} no son ambos -H y no forman
juntos un grupo metileno de doble enlace =CH_{2} o un grupo
metileno de enlace sencillo unido al átomo de nitrógeno de un grupo
fenilo sustituido con un grupo amino, o a un átomo de nitrógeno
contenido en la estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol;
para la preparación de un medicamento para uso
en el tratamiento del melanoma maligno y/o una condición patológica
que envuelve la angiogénesis no deseada.
5. El uso de la reivindicación 4, en donde el
compuesto se selecciona de los compuestos que tienen la siguiente
fórmula (II)
en
donde:
R_{1} y R_{2} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, un grupo hidroximetilo, o un grupo
metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido
con un grupo amino, un grupo metileno unido a un átomo de nitrógeno
contenido en la estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol, o R_{1} y R_{2}
pueden representar juntos un grupo metileno de doble enlace, y;
R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, hidroxilo, y benzoiloxi, o R_{3}
y R_{4} pueden representar juntos un átomo de oxígeno que está
unido con un doble enlace, con la condición que cuando cualquiera
de R_{3} y R_{4} es un grupo benzoiloxi, ambos R_{1} y R_{2}
son hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco
del mismo.
6. El uso de la reivindicación 5, en donde el
compuesto se selecciona de
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona,
9-(azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona)-6-cloro-9H-purina,
2-(hidroximetil)quinuclidina-3,3-diol,
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1-6 junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, diluyente y/o excipiente.
8. Un compuesto capaz de transferir p53 de tipo
silvestre de una conformación inactiva de la misma, dicha
conformación es reactiva a Pab 240 y no a Pab 1620, a una
conformación activa capaz de inducir apoptosis, dicho compuesto se
selecciona de compuestos que tienen una estructura según la fórmula
I
en
donde
n es 0, 1 o 2;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y se
seleccionan de -H, -CH_{2}-R^{5},
-CH_{2}-O-R^{5},
-CH_{2}-S-R^{5},
-CH_{2}-NH-R^{5},
-CO-O-R^{5},
-CO-NH-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-R^{5},
-CH_{2}-O-CO-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-NHR^{5},
CH_{2}-NH-CO-OR^{5},
-CH_{2}-NH-CS-NHR^{5}
y
-CH_{2}-O-CO-NHR^{5};
o R^{1} y R^{2} son juntos =CH_{2};
R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y se
seleccionan de H, -OH, -SH, -NH_{2}, -NHR^{5} y
-O-CO-C_{6}H_{5}; o R^{3} y
R^{4} son juntos =O, =S, =NH o =NR^{5};
R^{5} representa grupos iguales o diferentes
seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido,
alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no
sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos
arilo sustituidos o no sustituidos o anillo(s)
heteroaromático(s) mono-, bi-, tricíclicos sustituidos o no
sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos
en donde
los sustituyentes de los grupos sustituidos se
seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a
C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no
aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino
C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR^{6}, CONR^{6} y
COOR^{6};
R^{6} se selecciona de H, alquilo C1 a C10
sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más
heteroátomos y heterociclos no aromáticos;
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2}; o R^{7} y R^{8} son
ambos hidrógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable o
profármaco del mismo,
para uso en el tratamiento del melanoma
maligno.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El compuesto de la reivindicación 8, en donde
el compuesto se selecciona de los compuestos que tienen la
siguiente fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde:
R_{1} y R_{2} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, un grupo hidroximetilo, o un grupo
metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido
con un grupo amino, un grupo metileno unido a un átomo de nitrógeno
contenido en la estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol, o R_{1} y R_{2}
pueden representar juntos un grupo metileno de doble enlace, y;
R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, hidroxilo, y benzoiloxi, o R_{3}
y R_{4} pueden representar juntos un átomo de oxígeno que está
unido con un doble enlace, con la condición que cuando cualquiera
de R_{3} y R_{4} es un grupo benzoiloxi, ambos R_{1} y R_{2}
son hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco
del
mismo.
mismo.
10. El compuesto de la reivindicación 9, en
donde el compuesto se selecciona de
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona,
9-(azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona)-6-cloro-9H-purina,
2-(hidroximetil)quinuclidina-3,3-diol,
2-(adenina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
2-metileno-3-quinuclidinona,
2-(-2-amino-3-cloro-5-trifluorometil-1-metilanilina)-3-quinuclidinona,
2-(6-trifluorometil-4-clorobencimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(6-metoxipurina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-9-metileno)-3-quinuclidinona,
1-azabiciclo[2,2,2]oct-3-il
benzoato,
2-(5,6-dimetil-becimidazol-1-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(8-azaadenina-7-metileno)-3-quinuclidinona,
2-(ácido
7-metileno-1,3-dimetilúrico)-3-quinuclidinona,
o
2-(2,6-dicloro-9-metilenopurina)-3-quinuclidinona,
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
\newpage
11. Un compuesto capaz de transferir p53 de tipo
silvestre de una conformación inactiva de la misma, dicha
conformación es reactiva a Pab 240 y no a Pab 1620, a una
conformación activa capaz de inducir apoptosis, dicho compuesto se
selecciona de compuestos que tienen una estructura según la fórmula
I
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
n es 0, 1 o 2;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y se
seleccionan de -H, -CH_{2}-R^{5},
-CH_{2}-O-R^{5},
-CH_{2}-S-R^{5},
-CH_{2}-NH-R^{5},
-CO-O-R^{5},
-CO-NH-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-R^{5},
-CH_{2}-O-CO-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-NHR^{5},
CH_{2}-NH-CO-OR^{5},
-CH_{2}-NH-CS-NHR^{5}
y
-CH_{2}-O-CO-NHR^{5};
o R^{1} y R^{2} son juntos =CH_{2};
R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y se
seleccionan de H, -OH, -SH, -NH_{2}, -NHR^{5} y
-O-CO-C_{6}H_{5}; o R^{3} y
R^{4} son juntos =O, =S, =NH o =NR^{5};
R^{5} representa grupos iguales o diferentes
seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido,
alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no
sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos
arilo sustituidos o no sustituidos o anillo(s)
heteroaromático(s) mono-, bi-, tricíclicos sustituidos o no
sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos
en donde
los sustituyentes de los grupos sustituidos se
seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a
C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no
aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino
C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR^{6}, CONR^{6} y
COOR^{6};
R^{6} se selecciona de H, alquilo C1 a C10
sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más
heteroátomos y heterociclos no aromáticos;
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2}; o R^{7} y R^{8} son
ambos hidrógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable o
profármacos del mismo,
\vskip1.000000\baselineskip
con la condición que cuando
n es 1;
R^{3} y R^{4} se seleccionan de
-O-CO-C_{6}H_{5} y =O; y
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2};
R^{1} y R^{2} no son ambos -H y no forman
juntos un grupo metileno de doble enlace =CH_{2} o un grupo
metileno de enlace sencillo unido al átomo de nitrógeno de un grupo
fenilo sustituido con un grupo amino, o a un átomo de nitrógeno
contenido en la estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol;
para uso en el tratamiento del melanoma maligno
y/o una condición patológica que envuelve la angiogénesis no
deseada.
\newpage
12. El compuesto de la reivindicación 11, en
donde el compuesto se selecciona de los compuestos que tienen la
siguiente fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde:
R_{1} y R_{2} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, un grupo hidroximetilo, o un grupo
metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido
con un grupo amino, a un átomo de nitrógeno contenido en la
estructura del anillo de un resto de purina,
8-azapurina, o bencimidazol, o R_{1} y R_{2}
pueden representar juntos un grupo metileno de doble enlace, y;
R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente de hidrógeno, hidroxilo, y benzoiloxi, o R_{3}
y R_{4} pueden representar juntos un átomo de oxígeno que está
unido con un doble enlace, con la condición que cuando cualquiera
de R_{3} y R_{4} es un grupo benzoiloxi, ambos R_{1} y R_{2}
son hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco
del mismo.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en
donde el compuesto se selecciona de
2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona,
9-(azabiciclo[2,2,2]octan-3-ona)-6-cloro-9H-purina,
2-(hidroximetil)quinuclidina-3,3-diol,
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
14. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, diluyente y/o excipiente.
15. Un método para probar compuestos en cuanto a
su habilidad para transferir p53 de tipo silvestre desde una
conformación inactiva a una conformación activa que comprende las
etapas de:
A. Proporcionar células que lleven solo wt y no
p53 mutante, en cuyas células la conformación inactiva de wt p53
está presente;
B. Exponer las células in vitro a una
sustancia que se va a probar; y
C. Medir la conformación de wt p53 celular
inactiva.
16. El método de la reivindicación 15, en donde
se usa en lugar de la etapa C una etapa alternativa C' que
comprende comparar el efecto de la sustancia de prueba en las
células (que llevan p53 funcional) en la etapa B al efecto en
células o tejidos sin p53 o con p53 no funcional.
17. El método de la reivindicación 15 o 16, en
donde la integrina \alpha_{v}\beta_{3} está presente en las
células.
18. El método de las reivindicaciones
15-17, en donde el Pab 240 se usa para detectar wt
p53 en su conformación inactiva.
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 15-18, en donde un compuesto que
tienen una estructura según la fórmula I
\newpage
en donde
n es 0, 1 o 2;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y se
seleccionan de -H, -CH_{2}-R^{5},
-CH_{2}-O-R^{5},
-CH_{2}-S-R^{5},
-CH_{2}-NH-R^{5},
-CO-O-R^{5},
-CO-NH-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-R^{5},
-CH_{2}-O-CO-R^{5},
-CH_{2}-NH-CO-NHR^{5},
CH_{2}-NH-CO-OR^{5},
-CH_{2}-NH-CS-NHR^{5}
y
-CH_{2}-O-CO-NHR^{5};
o R^{1} y R^{2} son juntos =CH_{2};
R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y se
seleccionan de H, -OH, -SH, -NH_{2}, -NHR^{5} y
-O-CO-C_{6}H_{5}; o R^{3} y
R^{4} son juntos =O, =S, =NH o =NR^{5};
R^{5} representa grupos iguales o diferentes
seleccionados de H, alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido,
alquenilo C2 a C10 sustituido o no sustituido, alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3 a C12 sustituido o no
sustituido, grupos bencilo sustituidos o no sustituidos, anillos
arilo sustituidos o no sustituidos o anillo(s)
heteroaromático(s) mono-, bi-, tricíclicos sustituidos o no
sustituidos con uno o más heteroátomos y heterociclos no aromáticos
en donde
los sustituyentes de los grupos sustituidos se
seleccionan de alquilo C1 a C10, alquenilo C2 a C10, alquinilo C2 a
C10, halógeno, arilo sustituido o no sustituido, compuestos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos, heterociclos no
aromáticos, alquiloxi C1 a C10, alquilamino C1 a C10, alquenilamino
C2 a C10, alquinilamino C2 a C10, COR^{6}, CONR^{6} y
COOR^{6};
R^{6} se selecciona de H, alquilo C1 a C10
sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo C2 a C10
sustituido o no sustituido, bencilo, arilo, anillos
heteroaromáticos sustituidos o no sustituidos con uno o más
heteroátomos y heterociclos no aromáticos;
R^{7} y R^{8} forman juntos un resto de
puente CH_{2}-CH_{2}; o R^{7} y R^{8} son
ambos hidrógeno;
o se prueba una sal farmacéuticamente aceptable
o profármaco del mismo.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 15-19, en donde las células en la
etapa B están expuestas in vivo en un animal a la sustancia
que se prueba, y el animal se sacrifica después.
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