CN114159445B - 筛选抑制新型冠状病毒感染的小分子药物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抑制冠状病毒感染的小分子药物、其筛选方法、及其在抑制新型冠状病毒感染中的应用。该小分子药物是式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药。

Description

筛选抑制新型冠状病毒感染的小分子药物的方法及其应用
技术领域
本发明属于小分子药物领域，具体涉及筛选抑制新型冠状病毒感染的小分 子药物的方法以及小分子药物在抑制新型冠状病毒感染中的应用。
背景技术
SARS-CoV-2与2002年出现的SARS-CoV都属于Sarbecovirus亚属(Betacoronirus,Coronaviridae)这两种病毒都跨越了动物宿主的物种屏障， 并可导致危及生命的呼吸道疾病。SARS-CoV-2感染人体的机制及其靶标蛋白 已经被很好地研究和报道，SARS-CoV-2表面的突刺蛋白(Spike，S蛋白)介 导病毒受体识别和膜融合，促进病毒进入靶细胞。S蛋白S1结构域的N端区 域包含受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)序列，可以直接与 宿主细胞膜上的血管紧张素转换酶2(Angiotensin convertingenzyme 2，ACE2) 受体结合。
因此，抑制S蛋白与ACE2的结合是一种阻断SARS-CoV-2传播途 径行之有效的手段。现有的研究工作大都集中针对S蛋白的单克隆抗体的研制， 但是通常批准一种用来治疗病毒感染的新型抗体的时间周期是很长的。此外， 一些副作用(比如抗体依赖的病毒感染增强)需要被深入研究，以及抗体治疗 高昂的费用均限制了抗体研发的临床应用。因此，利用已知的小分子药物来抑 制S蛋白和ACE2的结合，可以显著加快研发更有效和经济的COVID-19治疗 方法。
因此，筛选抑制S蛋白与ACE2相互作用的化合物是阻遏SARS-CoV-2 感染的有效途径。
发明内容
本发明提供能特异性抑制S蛋白与ACE2相互作用的的头孢类化合物、其 筛选方法及其用途。
本发明的第一方面提供式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构 体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药在制备用于结合冠状病毒S蛋白、或 抑制冠状病毒与ACE2或表达ACE2的细胞、或抑制冠状病毒侵染细胞、或预 防或治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的应用，
其中，R1是任选被1-2个选自C1-C4烷基、羟基、卤素和氨基的取代基 取代的杂芳基，
R2是羧基取代的C1-C4烷基、H、C1-C4烷基、羟基或卤素，或R2不存 在，此时基团-NH-C(O)-C(R1)＝N-O-R2为-NH-C(O)-C(＝R1)-N＝O，
R3是任选被1-2个选自C1-C4烷基、羟基、卤素、氧基、氨基和杂环基 取代的杂环基或杂芳基或S-杂环基，
R4是C1-C4烷基、羟基、O-、氧、卤素或氨基，
是单键或双键。
在一个或多个实施方案中，R1是任选被1-2个选自C1-C4烷基、羟基、 卤素和氨基的取代基取代的噻唑或噻二唑。
在一个或多个实施方案中，R1是5-氨基-1,2,4噻二唑或2-氨基-噻唑。
在一个或多个实施方案中，R2是羧基取代的C1-C4烷基、H或C1-C4烷 基；或R2不存在，此时基团-NH-C(O)-C(R1)＝N-O-R2为-NH-C(O)-C(＝R1)-N＝O。
在一个或多个实施方案中，R2是H、甲基或羧基取代的丁基；或R2不存 在，此时基团-NH-C(O)-C(R1)＝N-O-R2为-NH-C(O)-C(＝R1)-N＝O。
在一个或多个实施方案中，R3是任选被1-2个选自C1-C4烷基、羟基、 卤素、氨基和氮杂环戊烷基的取代基取代的氮杂环戊酮、吡啶或S-不饱和三氮 杂环己二酮。
在一个或多个实施方案中，R3是吡啶、是被C1-C4烷基取代的S-不饱和 三氮杂环己二酮基、或是被氮杂环戊烷基取代的氮杂环戊酮基。
在一个或多个实施方案中，R3是其中R是氮杂环戊烷基。优选 地，R3是
在一个或多个实施方案中，R3是含有阳离子的吡啶，优选为
在一个或多个实施方案中，R3是
在一个或多个实施方案中，R4是羟基或O-。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物是头孢他啶、头孢吡普或头孢 曲松。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物与冠状病毒S蛋白的受体结合 结构域共价结合。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒是真病毒或假病毒。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒选自以下的一个或多个或其假病毒： HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒引起的疾病包括但不限于中东呼吸综 合征、重症急性呼吸综合征、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性呼吸窘 迫综合症(ARDS)、心衰、新型冠状病毒肺炎等。
在一个或多个实施方案中，所述表达ACE2的细胞是人肺泡上皮细胞或者 非洲绿猴肾细胞。
本发明还提供式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、外消 旋物、溶剂合物、水合物或前药在制备用于结合冠状病毒S蛋白、或抑制冠状 病毒与ACE2或表达ACE2的细胞相互作用中的非诊断或治疗应用，其中式(I) 化合物如本文第一方面所述。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物是头孢他啶、头孢吡普或头孢 曲松。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物与冠状病毒S蛋白的受体结合 结构域共价结合。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒是真病毒或假病毒。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒选自以下的一个或多个或其假病毒： HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒引起的疾病包括但不限于中东呼吸综 合征、重症急性呼吸综合征、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性呼吸窘 迫综合症(ARDS)、心衰、新型冠状病毒肺炎等。
在一个或多个实施方案中，所述表达ACE2的细胞是人肺泡上皮细胞或者 非洲绿猴肾细胞。
本发明还提供一种结合冠状病毒S蛋白、抑制冠状病毒与ACE2或表达 ACE2的细胞相互作用、抑制冠状病毒侵染细胞、或预防或治疗冠状病毒引起 的疾病的方法，包括向有需要的对象施用式(I)所示化合物或其药学上可接 受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药，其中式(I)化合物 如本文第一方面所述。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物是头孢他啶、头孢吡普或头孢 曲松。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物与冠状病毒S蛋白的受体结合 结构域共价结合。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒是真病毒或假病毒。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒选自以下的一个或多个或其假病毒： HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒引起的疾病包括但不限于中东呼吸综 合征、重症急性呼吸综合征、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性呼吸窘 迫综合症(ARDS)、心衰、新型冠状病毒肺炎等。
在一个或多个实施方案中，所述表达ACE2的细胞是人肺泡上皮细胞或者 非洲绿猴肾细胞。
本发明还提供一种筛选结合冠状病毒S蛋白，或抑制冠状病毒S蛋白与 ACE2或表达ACE2的细胞相互作用的物质的方法，包括：
(1)将候选物质和任选的对照物质、通过第一标记与第一固相偶联的 ACE2的胞外结构域和通过第二标记与第二固相偶联的冠状病毒S蛋白的受体 结合域混合，其中第一固相和第二固相之一含有光致敏剂，例如酞菁，另一含 有噻唑烯衍生物，和
(2)使用680nm的光照射混合物并检测520-620nm处的信号。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中相对对照物质，所述信号减弱的 候选物质是抑制冠状病毒与ACE2相互作用的物质。
在一个或多个实施方案中，相对对照物质，所述信号减弱至少45％、至少 50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的 候选物质是抑制冠状病毒与ACE2相互作用的物质。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括，(3)将步骤(2)中信号减 弱的候选物质与通过第一标记与第一固相偶联并通过第二标记与第二固相偶 联的ACE2胞外结构域或冠状病毒S蛋白受体结合域混合，和(4)使用680nm 的光照射混合物并检测520-620nm处的信号。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)中相对对照物质，所述信号基本没 有变化(例如减弱)的候选物质是抑制冠状病毒与ACE2相互作用的物质。
在一个或多个实施方案中，所述物质是化合物。
在一个或多个实施方案中，混合物中第一固相和第二固相的距离至多约200nm。
在一个或多个实施方案中，第一标记和第二标记选自生物素和Fc/His标 签，第一固相和第二固相选自链霉亲和素包被的固相和抗-His-偶联的固相。
在一个或多个实施方案中，所述表达ACE2的细胞是人肺泡上皮细胞或者 非洲绿猴肾细胞。
本发明还提供一种筛选结合冠状病毒S蛋白，或抑制冠状病毒S蛋白与 ACE2或表达ACE2的细胞相互作用的物质的试剂盒，包括：通过第一标记与 第一固相偶联的ACE2的胞外结构域、通过第二标记与第二固相偶联的冠状病 毒S蛋白的受体结合域、和任选的对照物质，其中第一固相和第二固相之一含有光致敏剂，例如酞菁，另一含有噻唑烯衍生物。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含通过第一标记与第一固相偶 联并通过第二标记与第二固相偶联的ACE2胞外结构域或冠状病毒S蛋白受体 结合域。
在一个或多个实施方案中，所述物质是化合物。
在一个或多个实施方案中，在将试剂盒组分混合后，第一固相和第二固相 的距离至多约200nm。
在一个或多个实施方案中，第一标记和第二标记选自生物素和Fc/His标 签，第一固相和第二固相选自链霉亲和素包被的固相和抗-His-偶联的固相。
在一个或多个实施方案中，所述表达ACE2的细胞是人肺泡上皮细胞或者 非洲绿猴肾细胞。
本发明还提供一种筛选调节组分A与组分B相互作用的物质的方法，包 括：
(1)将候选物质和任选的对照物质、通过第一标记与第一固相偶联的组 分A和通过第二标记与第二固相偶联的组分B混合，其中第一固相和第二固相之一含有光致敏剂，例如酞菁，另一含有噻唑烯衍生物，和
(2)使用680nm的光照射混合物并检测520-620nm处的信号，
(3)将步骤(2)中信号变化的候选物质与通过第一标记与第一固相偶联 并通过第二标记与第二固相偶联的组分A或组分B混合，和
(4)使用680nm的光照射混合物并检测520-620nm处的信号。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中相对对照物质，所述信号变化至 少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％ 或至少99％。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)中相对对照物质，所述信号基本没 有变化的候选物质是调节组分A与组分B相互作用的物质。
在一个或多个实施方案中，所述调节是上调，所述信号变化是增强。
在一个或多个实施方案中，所述调节是下调，所述信号变化是减弱。
在一个或多个实施方案中，所述物质是化合物。
在一个或多个实施方案中，在将试剂盒组分混合后，第一固相和第二固相 的距离至多约200nm。
在一个或多个实施方案中，第一标记和第二标记选自生物素和Fc/His标 签，第一固相和第二固相选自链霉亲和素包被的固相和抗-His-偶联的固相。
本发明还提供一种筛选调节组分A与组分B相互作用的物质的试剂盒， 包括：通过第一标记与第一固相偶联的组分A、通过第二标记与第二固相偶联 的组分B、通过第一标记与第一固相偶联并通过第二标记与第二固相偶联的组 分A或组分B、和任选的对照物质，其中第一固相和第二固相之一含有光致敏 剂，例如酞菁，另一含有噻唑烯衍生物。
在一个或多个实施方案中，所述物质是化合物。
在一个或多个实施方案中，在将试剂盒组分混合后，第一固相和第二固相 的距离至多约200nm。
在一个或多个实施方案中，第一标记和第二标记选自生物素和Fc/His标 签，第一固相和第二固相选自链霉亲和素包被的固相和抗-His-偶联的固相。
附图说明
图1显示筛选特异性阻断S-RBD与ACE2相互作用的小分子化合物的结 果。a，AlphaScreen系统检测S-RBD与ACE2-ECD相互作用的原理图。供体 珠和受体珠分别包覆链霉亲和素和抗His的单克隆抗体。b，使用AlphaScreen 系统检测S-RBD与ACE2-ECD的相互作用。c，比较ACE2-ECD-生物素分别 与S-RBD-His、MAdCAM-1-His和VCAM-1-His结合的AlphaScreen信号值。 d，通过阳性筛选，从3581个化合物中筛选出75个候选化合物。通过与二甲 基亚砜对照组相比，各化合物的AlphaScreen信号值的下降来计算其抑制率。e，AlphaScreen系统的负筛选原理图。生物素化的S-RBD-His同时连接链霉亲和 素包覆的供体珠和抗His偶联的受体珠，直接产生AlphaScreen信号。f，头孢 他啶在AlphaScreen体系中对S-RBD-ACE2相互作用的相对抑制率。相对抑制 率由阳性筛选抑制率减去负筛选抑制率计算所得。二甲基亚砜为对照组。在b、 c和f中，数据表示平均值±SEM(n≥2)。***p<0.001,ns：没有显著性差 异(学生t检验)。
图2显示头孢他啶特异性结合SARS-CoV-2S-RBD的结果。使用Octet RED96仪器，利用生物层干涉原理测定头孢他啶与S-RBD(a)和ACE2-ECD (b)的结合情况。生物素化的S-RBD或ACE2-ECD被链霉亲和素捕获，并用 生物传感器固定，测试与不同梯度浓度的头孢他啶的结合能力。
图3显示头孢他啶抑制S-RBD结合肺泡上皮细胞(HPAEpiC)的结果。a， 流式细胞术分析S-RBD与肺泡上皮细胞的结合。对照：细胞用带FITC荧光 的山羊抗人IgG抗体孵育；二甲基亚砜：溶剂对照；头孢他啶：100μM溶解 在二甲基亚砜中。图中的数字表示平均荧光强度。b，头孢他啶对S-RBD蛋白 与肺泡上皮细胞结合的抑制作用。使用图中所示不同浓度的头孢他啶处理细胞。 抑制率由各组平均荧光强度与二甲基亚砜对照组的平均荧光强度相比降低的 百分率计算所得。IC50如图所示。三次独立实验中代表性的结果如a所示。数 据表示平均值±SEM(n＝2)。
图4显示头孢他啶对SARS-CoV-2病毒感染的抑制作用。a：头孢他啶对 表达荧光素酶的SARS-CoV-2假病毒感染293T过表达ACE2的细胞过程的抑 制作用。使用图中所示不同浓度的头孢他啶处理细胞。IC50如图所示。采用 CCK-8法测定头孢他啶对293T细胞的细胞毒性。数据表示平均值±SEM(n≥ 2)。b：头孢他啶对SARS-CoV-2真病毒感染Vero E6细胞过程的抑制作用。 使用图中所示不同浓度的头孢他啶处理细胞。IC50如图所示。采用CCK-8法 测定头孢他啶对Vero E6细胞的细胞毒性。数据表示平均值±SEM(n≥2)。
图5显示头孢他啶及头孢菌素衍生物对S-RBD-ACE2相互作用的影响。利 用AlphaScreen系统检测头孢他啶与不同类型头孢类衍生物对S-RBD-ACE2 相互作用的抑制作用。数据表示平均值±SEM(n＝2)。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数 含义，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。术语“包括”及其变化形式不具有限制意 义，其中这些术语出现在本说明书和权利要求中。因此，术语“包括”、“包含”、 和“含有”可互换使用。
本发明旨在提供抑制冠状病毒与ACE2相互作用的化合物，从而抑制冠状 病毒引起的感染。冠状病毒表面的突刺蛋白(Spike，S蛋白)介导膜融合和病 毒受体识别，其S1结构域的N端区域负责病毒的附着并包含受体结合域(RBD) 序列，直接与宿主细胞上的ACE2受体的胞外结构域(ECD)结合。
本发明人通过设计一种筛选抑制冠状病毒S蛋白与ACE2相互作用的物质 的方法，鉴定得到式(I)所示的化合物可以抑制冠状病毒S蛋白与ACE2的 相互作用。
本发明包含上述式(I)化合物或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋 物、溶剂合物、水合物或前药，只要它们也具有与式(I)化合物具有相同或 基本相同的功能。发明人发现，式(I)化合物与冠状病毒S蛋白的受体结合 结构域共价结合。进一步地，发明人发现式(I)化合物抑制冠状病毒S蛋白 与ACE2或表达ACE2的细胞的相互作用。表达ACE2的细胞可以是本身表达 ACE2的细胞或经工程改造后表达ACE2或其表达量变化的细胞，例如人肺泡上皮细胞或者非洲绿猴肾细胞(Vero E6)等不同类型细胞。本领域技术人员 知晓常见的本身表达ACE2的细胞和可用于工程改造以实现或改变ACE2表达 的细胞以及相应的工程改造的方法。
式(I)中，R1是任选被1-2个选自C1-C4烷基、羟基、卤素和氨基的取 代基取代的杂芳基；R2是羧基取代的C1-C4烷基、H、C1-C4烷基、羟基或卤 素，或R2不存在，此时基团-NH-C(O)-C(R1)＝N-O-R2为-NH-C(O)-C(＝R1)-N＝O； R3是任选被1-2个选自C1-C4烷基、羟基、卤素、氧基、氨基和杂环基取代的杂环基或杂芳基或S-杂环基；R4是C1-C4烷基、羟基、O-、卤素或氨基；是单键或双键。
式(I)中的可以是单键或双键，这可根据R3基团的键价状态进行确 定。例如，若R3是/>则/>为双键；若R3是含有阳离子的吡啶或/>则/>为单键。
在一个或多个实施方案中，式(I)化合物是如下所示的头孢他啶、头孢 吡普或头孢曲松。
如本文所用，术语“烷基”单独或与其它术语组合使用，是指饱和脂肪族烷 基，包括1-20个碳原子的直链或支链烷基以及环状基团。优选地，烷基是指 含有1-10个碳原子的中等烷基，如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异 丁基、叔丁基、戊基及类似烷基。更优选地，是指含有1-4个碳原子的低级烷 基，例如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基及类似烷基。环状基团可以是单环或多环，并且优选具有3-10个环碳原子。示例性的环状 基团包括环丙基、环丙基甲基、环戊基、环己基、金刚烷基、以及取代的和未 取代的冰片基、降冰片基和降冰片烯基。烷基可以被取代也可不被取代。当被 取代时，取代基个数为1个或多个，优选1-3个，更优选1个或2个，取代基团独立地选自包括卤素、羧基、羟基、低级烷氧基、芳基。羧基取代的C1-C4 烷基包括羧基取代的甲基、羧基取代的乙基、羧基取代的丙基、羧基取代的正丁基、羧基取代的异丁基。
本文所用的“烯基”是指其中具有一个或多个双键且具有2至12个碳原子 的直链或支链烃基。示例性烯基包括但不限于乙烯基，乙烯基，烯丙基，丁烯 基，戊烯基，己烯基，丁二烯基，戊二烯基，己二烯基，2-乙基己烯基，2-丙基-2-丁烯基，4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。术语“Cx-y烯基”，其中x和y是整 数，是指具有x-y个碳原子的烯基。
术语“亚烷基”或“亚烷”是指二价烷基。术语“亚烯基”或“亚烯”是指二价烯 基。
除非另有说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合是指稳定的直链或支 链或其组合，包括至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si和S的杂原 子，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵 化。杂原子O、N、P、S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置或烷基连接到 分子剩余部分的位置。
除非另有说明，单独或与其它术语一起使用的术语“环烷基”和“杂环烷基” 分别指环状的“烷基”和“杂烷基”形式。此外，在杂环烷基中，杂原子可占据杂 环与分子其余部分连接的位置。“环烷基”和“杂环烷基”可以是饱和或不饱和的。 因此，环烷基的示例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，1-环己 烯基，环己烯基，环庚基等。杂环烷基的例子包括但不限于，1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、 四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、氮杂环 戊烷基、三氮杂环己二酮基等。单独或作为另一取代基一部分的“环亚烷基”和 “杂环亚烷基”分别指由环烷基和杂环烷基衍生的二价基团。本文中，环烷基或 杂环烷基还包含C原子上含有＝O的环酮基或杂环酮基。杂环基可被选自任选被取代的C1-C4烷基、羟基、卤素、氨基、杂环基或杂芳基的取代基取代。
除非另有说明，术语“芳基”指多不饱和、芳族的烃取代基，它可以是单环 或者稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接的多环(优选为1-3个环)。稠环芳 基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环是芳环。术语“杂芳基”是指含 有至少一个杂原子如N、O或S的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化， 并且氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即，稠合在 一起的多环，其中所述稠环中的至少一个是杂芳环)。5,6-稠环亚杂芳基是指 稠合在一起的两个环，其中一个环为5元，另一个环为6元，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样，6.6-稠环杂亚芳基指稠合在一起的两个环，其中一个环是6元的，另一个环是6元的，且其中至少一个环是杂芳环。并且6,5-稠合 环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为6元，另一个环为5元， 并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基基团可通过碳或杂原子连接到分子的 其余部分上。芳基和杂芳基基团的非限制示例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4- 联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡 嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶 唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2- 噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5- 苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、 2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每个芳基和杂芳基环系 统的取代基选自下述可接受的取代基。单独或作为另一取代基一部分的“亚芳 基”和“杂亚芳基”分别指由芳基和杂芳基衍生的二价基团。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基，嘧啶基，噻吩基，呋喃基，吲哚基，苯并噁二唑基，苯并二 噁唑基，苯并二噁烷基，噻吩基，吡咯并吡啶基，吲唑基，喹啉基，喹喔啉基， 吡啶并吡嗪基，喹唑啉酮基，苯并异噁唑基，咪唑并吡啶基，苯并呋喃基，苯 并噻吩基，苯基，萘基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，异喹啉基，噻二唑基，噁 二唑基，吡咯基，二唑基，三唑基，四唑基，苯并噻二唑基，异噻唑基，吡唑 并嘧啶基，吡咯并嘧啶基，吡唑并咪唑基，吡唑基，苯并三唑基，苯并噁唑基或喹啉基。上述示例可以是取代或未取代的，并且上述各杂芳基示例的二价基 团是杂亚芳基的非限制性示例。本文中的噻二唑基包含所示的变体。本文 中的吡啶基可以包含阳离子的吡啶基，即缺失1个或多个电子的吡啶基，例如/>上述芳基或杂芳基可被选自任选被取代的C1-C4烷基、羟基、卤素、氨 基、杂环基或杂芳基的取代基取代。
本文所用术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。术语“卤代烷基”包括被一个或多 个卤原子取代的基团，包括全氟基团。这对于包含前缀“卤-”的其他基团也是一 样的。合适的卤代烷基基团的示例是二氟甲基、三氟甲基等。
术语“羟基”表示-OH基团。
术语“氧代”或基团“氧”表示＝O基团。
术语“氨基”指-NH2基团。
本文所用术语“杂环基”是任选被取代的含选自N、S和O的杂原子的5元 或6元环或稠环，优选含有N和/或S。示例性杂环基包括但不限于：呋喃、 吡格、噻吩、吡唑、咪唑、恶唑、噻唑、噻二唑、吡啶、吡喃、吡嗪、哌嗪、 三嗪。杂环基的取代基选自任选被取代的C1-C4烷基、羟基、氧、卤素、氨基、 杂环基或S-杂环基。
本文所用术语“羧基”是指-COOH。
作为简化讨论和限制本申请通篇使用的特定术语的方式，使用术语“基团” 和“部分(moiety)”以区分允许取代或可被取代的化学物质与本发明的具体实 施方式中不允许如此取代或可不被如此取代的那些化学物质。由此，使用术语 “基团”来描述化学取代基，所述的化学物质包括例如在链中未取代的基团和含 非过氧化的O、N、S、Si或F原子的基团，以及羰基或其他常规取代基。在 使用术语“部分”来描述化学化合物或取代基的情况中，旨在仅包括未取代的化 学物质。例如，术语“烷基基团”应不仅包括纯开链饱和烃类烷基取代基，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，还包括携带本领域已知的其它取代基如羟基、烷 氧基、烷基磺酰基、卤原子、氰基、硝基、氨基、羧基等的烷基取代基。因此， “烷基基团”包括醚基基团、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、磺烷 基等。另一方面，短语“烷基部分”仅限于包括纯开链饱和烃类烷基取代基，如 甲基、乙基、丙基、叔丁基等。
如本文所用，术语“取代”，是指一个化合物具有取代基，该取代基至少包 含一个带有一个或多个氢原子的碳原子、氮原子、氧原子或硫原子。如果一个 取代基被描述为被“取代”，是指一个非氢取代基占据了一个碳、氮、氧、或硫上的一个氢的位置。本发明中，所述的烷基、链烯基、链炔基可被取代；例如， 取代或未取代的烷基，取代或未取代的链烯基，取代或未取代的链炔基。除非 另有定义，否则经取代的基团在一个或多个适当位置具有取代基，且当超过一 个位置经取代时，每一取代位置的取代基可为相同或不同。本文的取代基包括 C1-C4烷基、羟基、氧、卤素、氨基、杂环基或S-杂环基。
本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体 (如顺反异构体，构象异构体)。本发明公开的化合物或其盐可以包括一个或多 个非对称中心，因此会存在对映异构体、非对映异构体以及其它可以被定义的 立体异构体形式，根据立体化学可分为(R)-或(S)-、用于氨基酸的(D)- 或(L)-。本发明意为包括所有这些可能的异构体，以及外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以通过手性合成子或手性试剂制备，或用通常的技术如使用手性柱的高效液相 来分离制备。当本发明所述的化合物含有烯族双键或其它几何不对称中心时， 除非另有说明，则其意为该化合物包括E和Z几何异构体。同样地，所有的互变异构体也包括在内。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副 反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。本文所述“药 学上可接受的盐”包括酸式盐和碱式盐。
“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类 盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例 如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机 酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨 酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、 辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷 磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fumaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、 羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、 丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮 酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对 甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。
“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类 盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入 无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、 铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐 为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂， 例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨 酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、N,N'-双苄基乙撑二 胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌 嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、 二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶 剂化物”是指一种包含了一种或多种本专利公开的化合物分子与一种或多种溶 剂分子的聚合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂 还可能是有机溶剂。因此，本专利公开的化合物可以作为水合物存在，包括单 水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物， 而在其它情况下，本发明公开的化合物也可以是仅保有一部分水，或者是保有 水与一些溶剂的混合物。
所述的“化合物的前药”指当用适当的方法服用后，该化合物的前药在病人 体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式 (I)的一个化合物所组成的盐或溶液。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合 物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
制备方法
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领 域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从 生物(如微生物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。
组合物
本发明还提供一种组合物，包含本文所述的式(I)化合物或其药学上可 接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药，和药学上中可接受 的辅料。
本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的式(I)化合物或其 药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药传送给动物 或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学 上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包 括本领域周知的治疗中常用于递送康生物的各种类型的载体或赋形剂。示例性 的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化 合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、 甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、 溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩 空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具 体而言，合适的辅料可以是本领域常用于抗生素给药的辅料。辅料的示例包括 各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PBS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。
其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递 送配制物中包含式(I)化合物的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递 方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领 域技术人员所知。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤 膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法 进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组 合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的 静脉内溶液带或小瓶。
通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述试剂。治疗有效量是指可在受 试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、 性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。 治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给 药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合 物含有按照重量比例为例如0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的 式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、 水合物或前药。
本文所述组合物可与其他抑制冠状病毒与ACE2相互作用的试剂、抑制冠 状病毒引起的感染的试剂和/或治疗冠状病毒引起的疾病的试剂联用。本领域技 术人员可确定其他试剂的给药剂量。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成 分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的，可以被制成单位剂型的形式。 剂型比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、 悬浮液、注射剂、散剂、丸剂、控速释剂、输液剂、混悬剂等等。根据本发明 的化合物所预防和治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。从易于制备和储存的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填 充或液体填充的胶囊。本发明的化合物或其组合物也可储存在适宜于注射或滴 注的消毒器具中。本发明的化合物或其组合物也可储存在适当的容器，并置于 试剂盒或药盒中。
方法和用途
本发明人在研究中发现，式(I)所示的化合物可以高效抑制冠状病毒与 ACE2相互作用，因此其是良好的冠状病毒引起的感染的抑制剂。作为冠状病 毒感染抑制剂，该化合物可以预防或治疗冠状病毒引起的疾病。
本文所述的冠状病毒是有包膜的含单股正链RNA的冠状病毒属 (Coronavirus)病毒，包括但不限于HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV、SARS-CoV-2。本文所述冠状病毒 还包括假病毒。本文所述“假病毒”是非病毒DNA和与病毒外型相同的蛋白质 外壳包裹成的病毒颗粒，其具有与真病毒相似的进入细胞的过程但是不具备致 病性。例如，SARS-CoV-2的假病毒是非病毒DNA和与SARS-CoV-2病毒的 外型相同的蛋白质外壳包裹成的病毒颗粒。本领域知晓常用于制备假病毒的非病毒DNA，例如艾滋病病毒的有缺陷的基因组。本发明的化合物可以预防或 治疗冠状病毒引起的疾病。这些疾病包括但不限于中东呼吸综合征、重症急性 呼吸综合征、急性呼吸窘迫综合症、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性 呼吸窘迫、心衰、新型冠状病毒肺炎等。
因此，本发明提供还一种抑制冠状病毒引起的感染、预防或治疗冠状病毒 引起的疾病的方法，包括：给予有需要的对象有效量的本文所述式(I)所示 化合物或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药。 本文中，“个体”、“对象”或“患者”指哺乳动物，尤其指人。
具体而言，“有效量”指的是对人或者动物能够产生治疗功能的，并且能够 被动物和人所接受的注射量。例如，在液体的组合药物中，多肽的浓度可以是 20ng/mL以上、50ng/mL、100ng/mL以上等。该有效量可随给药的模式和待 治疗的疾病的严重程度而变化。可调节剂量方案以提供最佳治疗应答。例如， 由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减 少。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年 龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变 施用途径来获得最佳的治疗效果。
本发明中化合物的给药方式可以包括但是并不限制于皮下注射、经皮注射、 植入、局部给药、肌肉注射、缓释给药和口服等。本领域技术人员知晓在不同 给药方式、剂量、给药部位等情况下将药物给予对象所需的其他试剂。例如敷 料、溶剂(如水)等。
本文所用术语“给予”或“给药”是指向患有待治疗或预防的疾病或病症或 具有其风险的对象提供本发明的化合物或药物组合物。
本文所用术语“全身性递送”是指任何合适的给药方法，其可全身递送本发 明的化合物。在一个实施方式中，全身性递送可选自口服给药、胃肠外给药、 鼻内给药、吸入给药、舌下给药、直肠给药和透皮给药。
药理学和毒理学中，给药途径是使药物、流体、毒剂或其它物质被摄入身 体的途径。给药途径一般可根据施用物质的位置分类。常用的示例可包括口服 给药和静脉内给药。也可基于作用靶标的位置对途径进行分类。作用可以是局 部的(局部)、肠道(系统范围作用，但通过胃肠道递送)或胃肠外(全身作 用，但通过胃肠道以外的途径递送)、通过吸入肺。
局部给药强化了局部效果，并且将物质直接施用于希望发挥其作用的地方。 然而，有时，术语局部可定义为施用于身体的局部区域或身体部分的表面，而 不必涉及物质的目标作用，使得该分类相当于基于施用位置的分类的变化形式。 在肠道给药中，所需的效果的全身的(非局部)，通过消化道给予物质。在胃 肠道外给药中，所需的效果的全身的，并且通过除了消化道以外的途径给予物 质。
局部给药的示例可包括经表皮(施用于皮肤上)，例如过敏测试或一般局 部麻醉，吸入，例如哮喘药物，灌肠，例如用于对肠道成像的造影剂，滴眼剂 (至结膜上)，例如用于结膜炎的抗生素，滴耳剂如用于外耳炎的皮质类固醇 和抗生素，以及通过体内的粘膜的那些。
肠道给药可以是涉及胃肠道的任何部分的给药，并且具有全身性效果。该 示例可包括经口(口服)的那些，许多药物是片剂、胶囊或滴剂，通过胃饲管、 十二指肠饲管或腹孔的那些，许多药物和肠道营养，以及直肠给予的那些，栓 剂中的各种药物。
胃肠外给药的示例可包括静脉内(进入静脉)，例如，许多药物，总肠胃 外营养动脉内(进入动脉)，例如，用于治疗血管痉挛的血管扩张药物和用于 治疗栓塞的血栓溶解药物，骨内输注(进入骨髓)，肌肉内，大脑内(进入脑 实质)，脑室内(进入脑室系统)，鞘内(注射到脊柱管内)和皮下(在皮肤 下)。其中，骨内输注在间接静脉渠道中是有效的，因为骨髓直接排入静脉系统中。当静脉途径困难时，骨内输注可偶尔用于急救医疗和儿科中的药物和流 体。
任何给药途径都适用于本发明。在一个实施方式中，可通过静脉注射向对 象给予本发明的化合物。在另一个实施方式中，本发明的化合物可通过任何其 他合适的全身性递送，如口服、胃肠道外、鼻内、舌下、直肠或经皮给药给予 对象。在另一个实施方式中，本发明的化合物可通过例如吸入，经鼻腔系统或 嘴给予对象。
可通过腹膜内注射或IP注射向对象给予本发明的化合物。本文所用的术 语“腹膜内注射”或“IP注射”是指将物质注射到腹膜内(体腔)。与人相比，IP 注射更经常应用于动物。通常，当需要大量的血液替代流体时，或者由于低血压或其他问题而不能使用用于静脉内注射的合适血管时，优选IP注射。在动 物中，由于与其他胃肠外方法相比易于给药，在兽医领域和测试给予全身性药 物和流体的动物中主要使用IP注射。
实施上述方法的药盒包含本文所述式(I)所示化合物或其药学上可接受 的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药，或本文所述的组合物， 和任选的施用它们所需的其他物品，和任选的说明书。所述其他物品例如使用 或施用各种剂型的组合物所需的量具、容器例如注射器等。所述说明书用于指导所述使用或施用过程。因此，本发明还提供本文所述式(I)化合物或其药 学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前药在制备抑制冠 状病毒与ACE2相互作用或预防或治疗冠状病毒引起的疾病的产品中的用途。 所述产品可以是药物组合物或药盒。
筛选方法和试剂盒
本发明还提供筛选抑制冠状病毒S蛋白与ACE2相互作用的物质的方法， 包括：(1)将对照物质(比如二甲基亚砜)或候选物质、通过第一标记与第 一固相偶联的ACE2的胞外结构域和通过第二标记与第二固相偶联的冠状病毒 S蛋白的受体结合域混合，其中第一固相和第二固相之一含有光致敏剂，另一 含有噻唑烯衍生物，和(2)使用680nm的光照射混合物并检测520-620nm处 的信号。一个固相的光致敏剂例如酞菁在680nm的光照射下将环境氧转化为激发态氧(例如单线态氧)。单线态氧在回到基态之前有一个有限的生命周期。 在其4μs秒的半衰期内，单线态氧在溶液中扩散约200nm。
由于ACE2的胞外结构域和冠状病毒S蛋白的受体结合域的相互作用，使 第一固相和第二固相的距离至多约200nm，从而单线态氧的能量转移到另一固 相的噻唑烯衍生物中，最终在520-620纳米处产生发射光。在没有另一固相或 第一固相和第二固相的距离大于200nm的情况下，单线态氧降至基态，则不 产生信号。所述第一标记和第二标记是将结构域与固相偶联的标记物。本领域 熟知可用于所述偶联的标记物，例如通过生物素和链霉亲和素之间的结合，或通过Fc/His标签和抗-His之间的结合。在用所述方法筛选物质例如化合物时， 所述信号下降至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少 80％、至少90％或至少99％的候选物质是抑制冠状病毒与ACE2相互作用的物 质。例如，对照物质所在的混合物产生明显的信号，而候选物质所在的混合物 则产生较低的信号，其抑制所述信号下降至少45％。本文中“第一”和“第二”仅 是为了区分所涉的内容，而并非旨在对该内容进行顺序或主次等的限定。
为了筛选抑制冠状病毒S蛋白与ACE2相互作用的物质，本发明还提供进 行上述筛选的试剂盒，包括：通过第一标记与第一固相偶联的ACE2的胞外结 构域、通过第二标记与第二固相偶联的冠状病毒S蛋白的受体结合域、和任选 的对照物质，其中第一固相和第二固相之一含有光致敏剂，例如酞菁，另一含 有噻唑烯衍生物。在将试剂盒组分混合后，第一固相和第二固相的距离至多约 200nm。示例性地，第一标记是生物素，第一固相是链霉亲和素包被的固相； 第二标记是Fc/His标签，第二固相是抗-His-偶联的固相。
本发明筛选方法和试剂盒中，标记或固相并不限于上述示例的那些，而包 含本领域通常用于偶联多肽或蛋白的任何标记或固相。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明 所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或 等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本 文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括 描述和公开所述出版物报道的可与本发明关联使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。 本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开 内容。
本发明的优点
本发明筛选出能够抑制SARS-CoV-2S蛋白与其配体ACE2相结合的小分 子药物，其副作用很小或者可以被身体所允许，能更快地应用到临床治疗当中， 替换部分已有的药物或者制备低剂量药物来有效预防病毒的感染。
本发明筛选的小分子头孢类式(I)化合物可以通过特异性结合S-RBD蛋 白来阻断其与ACE2-ECD的结合。这些化合物已经被广泛用于细菌性感染类 疾病的治疗，相比于其他类型的药物，是一类广泛使用且毒副作用较小的抗生 素类药物，除了具有头孢类药物过敏史的患者外，其他病人均可根据病情使用 相应的剂量，并且病人对头孢的安全性和耐受性普遍良好。其中，头孢他啶在 2018年已被FDA正式批准为治疗细菌性肺炎的临床药物(血药浓度可达到300 μM以上)，其在治疗病毒性肺炎的临床效果却少有报道。发明人经过多轮筛选和验证后，发现头孢他啶可以抑制肺泡上皮细胞结合S-RBD蛋白，并且有 效地抑制SARS-CoV-2假病毒感染293T-ACE2细胞(IC50浓度为113.24μM)， 头孢他啶还显著抑制SARS-CoV-2真病毒感染Vero E6细胞(IC50值为27.57 μM)。
这提示式(I)化合物(例如头孢他啶)在用于治疗新冠病毒导致的肺炎 上可能会起到有效的治疗效果。
头孢类药物有多种衍生物，但是除式(I)化合物外，很多头孢类药物并 没有抑制S-ACE2结合的效果，说明式(I)化合物的某些特殊结构对结合S-RBD 蛋白有重要作用，例如2-氨基噻唑、吡啶阳离子及末端为异丁酸保护的肟结构片段。而且，深入探究式(I)化合物(例如头孢他啶)与S-RBD的结合模式 及药代动力学将有助于开发效果更好的的新冠肺炎先导药物。
在临床治疗当中，利用式(I)化合物替代其他相似功能的抗生素可能发 挥更大的抗病毒效果。比如，在SARS-CoV-2感染病人的临床治疗当中使用该 药物抑制病毒在体内的进一步扩散和感染；健康人群或者高危人群提前服用该药物，预防SARS-CoV-2感染。针对式(I)化合物分子结构的深入优化则可 能进一步提高其抑制SARS-CoV-2感染的效果。
本发明首先真核表达纯化了S-RBD结构域蛋白及其配体ACE2-ECD胞外 结构域蛋白，然后用AlphaScreen系统研究了二者的相互作用，然后从3581种 FDA已批准上市的药物库和天然小分子化合物库中鉴定出小分子式(I)化合 物(例如头孢他啶)可以通过特异性结合S-RBD蛋白来阻断其与ACE2-ECD 的结合，从而抑制了肺泡上皮细胞结合S-RBD蛋白。在假病毒感染实验中验 证了式(I)化合物可以有效地抑制SARS-CoV-2假病毒感染293T-ACE2细胞。 同样，在真病毒感染实验中验证了式(I)化合物可以有效地抑制SARS-CoV-2 真病毒对Vero E6细胞的感染。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出 于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决 不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得 显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明， 否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实施例1，材料和方法
蛋白表达与纯化
融合Fc/His标签的重组SARS-COV-2Spike-RBD蛋白于293T真核细胞中 表达，并使用蛋白A免疫吸附柱(Thermo Fisher Scientific)进行纯化。融合 Flag/His标签的重组人ACE2-ECD蛋白于293T细胞中表达，使用 anti-DYKDDDDK G1亲和树脂按照说明书(GenScript)进行纯化。
AlphaScreen系统
AlphaScreen测定在Costar 384孔板中进行，最终反应体积为20μl。使用 链霉亲和素包被的供体珠或抗His偶联的受体珠(PerkinElmer)，最终使用浓 度为10μg/mL每孔。实验在PBS缓冲液(155mM NaCl,1.06mM KH2PO4,2.97 mM Na2HPO4,pH 7.4)包含0.1％BSA中进行。5μl体积的S-RBD-His(终浓 度0.1μM)和5μl体积的ACE2-ECD-Biotin(终浓度0.2μM)与化合物(终 浓度10μM)在4℃下预孵育0.5h。然后将供体珠和受体珠加入到反应体系中，室温下避光孵育2h。检测激发光在680nm处，读值在520到620nm范围间， 使用EnVision(PerkinElmer)读板器进行信号读取。
流式细胞术
0.1μM的Spike-RBD-Fc/His与5μg/mL FITC标记的山羊抗人IgG抗体 在50μl体系的PBS中室温孵育30分钟，之后与肺泡上皮细胞在室温下孵育 30min。细胞洗涤2次后进行流式细胞术分析。细胞只与FITC标记的山羊抗 人IgG抗体孵育组作为阴性对照。
SARS-CoV-2假病毒感染试验
SARS-CoV-2假病毒由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦课 题组提供。假病毒用DMEM完全培养基等体积(50μl)稀释后，与二甲基亚 砜或不同浓度梯度的头孢他啶混合，在37℃孵育1h。之后加入到表达人ACE2 的293T稳转株细胞中，细胞在37℃孵育48小时后，用Bio-Lite荧光素酶检测缓冲液裂解细胞并检测荧光素酶的活性(Vazyme)。通过比较头孢他啶处理 组与二甲基亚砜对照组的荧光素酶活性值，计算假病毒感染效率。
SARS-CoV-2真病毒感染试验
为了评估头孢他啶抗真病毒感染的效果，在感染前1天将Vero E6细胞接 种于96孔板。将DMSO或梯度稀释的头孢他啶与SARS-CoV-2(GenBank: MT121215.1)以100TCID50/孔混合，37℃孵育1小时。然后将Vero E6细胞 与DMSO/头孢他啶-病毒混合物在37℃孵育1h。完成后用PBS洗涤细胞，去除未结合的SARS-CoV-2病毒粒子，然后用含相应浓度头孢他啶的新鲜培养基 培养。感染后48小时，收集培养上清，检测病毒RNA。使用TRIzol LS试剂(Invitrogen)按照说明书提取病毒RNA。基于病毒核衣壳基因的定量检测使 用Verso 1步RT-qPCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和CFX96TMReal-Time PCR系统(Bio-Rad)。针对SARS-CoV-2N端基因(nt608-706)的PCR引物 为:5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3/5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCT G-3’(正向/反向)。最后计算病毒抑制率。感染实验均在复旦大学生物安全三 级(BSL-3)实验室进行。
生物膜干涉实验(Bio-layer Interferometry,BLI)
BLI实验利用Octet Red 96仪器(ForteBio)进行。原理为通过使生物素 化的Spike-RBD或ACE2-ECD(50μg/ml)蛋白固定在链霉亲和素(streptavidin， SA)生物传感器上，并且与不同浓度梯度的头孢他啶于动力学缓冲液(PBS+ 0.02％Tween-20)中孵育，观察两者的动态结合与解离情况，结合和解离时间 设置为360秒与600秒。根据结合曲线整体拟合1:1的Langmuir结合模型， R2≥0.95，计算出头孢他啶与S-RBD结合亲和常数KD值。动力学导出的亲和 力计算公式为KD＝koff/kon。结合实验在25℃进行。数据分析采用Octet DataAnalysis Software 9.0(ForteBio)。
细胞毒性检测
使用Cell Counting Kit-8(CCK-8,Beyotime)试剂盒评估细胞活力，反映 不同浓度的药物对细胞的毒性。将293T或者Vero E6细胞分别铺到96孔板中 (每孔100μl培养液中含有5.0×104个细胞和不同浓度的头孢他啶)培养48 小时。在37℃条件下，将每孔10μlCCK-8试剂加入96孔板中孵育1小时， 然后用酶标仪(Thermo Fisher Scientific)测定450nm处的吸光度。
实施例2，利用AlphaScreen实验系统研究S蛋白-ACE2相互作用
为了筛选抑制S蛋白与ACE2结合的小分子，我们首先建立了基于 AlphaScreen的高通量筛选系统来检测S-RBD与ACE2-ECD的相互作用(图1， a)。S-RBD和ACE2-ECD在293T细胞中表达纯化。生物素标记的ACE2-ECD (ACE2-ECD-biotin)与链霉亲和素包被的供体珠结合，His标记的S-RBD (S-RBD-His)与抗His偶联的受体珠结合。当S-RBD与ACE2-ECD相互结合时，两个微珠距离靠近，在680nm的光照下供体微珠产生单线态氧分子， 这些氧分子扩散到受体微珠上，并将能量转移到受体微珠中的噻唑衍生物上， 导致系统在520-620nm处发光。结果表明，ACE2-ECD-Biotin与S-RBD-His 结合产生非常强的AlphaScreen信号，当两种蛋白都不存在时，信号进而下降 到背景水平(图1，b)。为了证实信号的特异性，我们另外表达了带Fc/His 标签的其他膜蛋白的胞外段，分别是MAdCAM-1和VCAM-1。结果显示，MAdCAM-1-Fc/His或者VCAM-1-Fc/His与ACE2-ECD-Biotin的共孵育均不能 产生有效的Alpha信号，从而证实AlphaScreen实验系统可以特异性地研究 Spike-ACE2相互作用(图1，c)。
实施例3，高通量筛选阻断S-RBD-ACE2相互作用的小分子
接下来，我们使用基于AlphaScreen的高通量筛选系统筛选抑制 S-RBD-ACE2相互作用的小分子。我们筛选了数个小分子化合物库，包括：FDA 批准药物库、The SpectrumCollection和TargetMol-天然化合物库，总共3581 种已知分子结构的小分子化合物(图1，d)。本实验在最终化合物浓度为10μM 的条件下进行，分析S-RBD-His(0.1μM)和ACE2-ECD-Biotin(0.2μM)之 间的相互作用。经过第一轮筛选，共筛选出75个候选化合物，对S-RBD-ACE2 相互作用具有抑制作用(图1，d)。根据AlphaScreen信号的变化，这些化合 物的抑制率均在45％以上。为了排除化合物对AlphaScreen系统本身的干扰，我们新设计了负筛选系统，其中生物素化的S-RBD-His连接链霉亲和素包被的 供体珠和抗His偶联的受体珠，直接产生AlphaScreen信号(图1，e)。在负 筛选系统中降低信号的化合物可能是干扰AlphaScreen系统本身的化合物。最 终通过负筛选，从75个候选化合物中筛选出10个化合物能有效抑制 S-RBD-ACE2的相互作用。在10个化合物中，头孢他啶是最有效的抑制剂， 相对抑制率为80.7％(图1，f)。因此，头孢他啶对S-RBD-ACE2相互作用的 抑制效果最好，且具有抗炎作用，毒副作用最小，因此选择头孢他啶进行进一 步研究。
实施例4，头孢他啶特异性结合S-RBD蛋白
为了研究S-RBD或ACE2中哪个是头孢他啶的结合靶蛋白，采用生物层 干涉(BLI)实验检测头孢他啶与S-RBD或ACE2-ECD的结合亲和性。随着 头孢他啶浓度的升高，该化合物与S-RBD蛋白的结合增强，其KD值为5.97± 0.06μM(图2，a)。值得注意的是，头孢他啶与S-RBD几乎没有解离，说明 头孢他啶与S-RBD之间存在强而稳定的相互作用。相比之下，头孢他啶与ACE2-ECD无特异性结合信号(图2，b)。因此，头孢他啶特异性地与S-RBD 结合。
实施例5，头孢他啶抑制S-RBD与人肺泡上皮细胞的结合
SARS-COV-2感染人体的主要部位是肺脏，可引发严重急性呼吸综合征。 因此，我们检测了头孢他啶对S-RBD蛋白与表达ACE2的人肺泡上皮细胞 (HPAEpiC)结合的抑制作用。在可溶性S-RBD结合实验系统中加入100μM 的头孢他啶可显著降低S-RBD的结合(图3，a)，表明头孢他啶可有效抑制 S-RBD与HPAEpiC细胞的结合。进一步分析显示，IC50为39.90±1.11μM(图 3，b)。
实施例6，头孢他啶抑制SARS-CoV-2假病毒和真病毒对细胞的感染
假病毒具有与真病毒相似的传染性，因此被广泛应用于高传染性和致病性 病毒入侵机制的研究。为了评估头孢他啶对SARS-CoV-2假病毒侵入过表达人 ACE2的293T细胞的抑制作用，我们将一系列浓度梯度的头孢他啶添加在 SARS-CoV-2假病毒感染的检测系统中。结果显示，在体外头孢他啶有效地抑 制了SARS-CoV-2假病毒进入细胞，IC50为113.24±1.23μM(图4，a)。
接下来，我们检测了头孢他啶抑制真病毒SARS-CoV-2感染Vero E6细胞 的能力。将真病毒SARS-CoV-2与DMSO或一系列浓度梯度的头孢他啶在37℃ 条件下孵育1h，然后加入到Vero E6细胞中，在37℃条件下共培养1h。孵育 结束用PBS洗涤细胞，去除未结合的SARS-CoV-2病毒粒子，然后用含有相 同浓度头孢他啶的新鲜培养基进行培养。感染48小时后，用qRT-PCR定量检 测培养液上清中的病毒RNA水平，计算抑制率。结果显示，头孢他啶显著抑 制了SARS-CoV-2真病毒对Vero E6细胞的感染，其IC50值为27.57±1.06μM (图4，b)。
值得注意的是，即使在高浓度下，头孢他啶的细胞毒性也可以忽略不计， 这表明其在临床使用中的安全性(图4，a和b)。因此，头孢他啶除具有传统 的抗菌作用外，还具有较强的抗SARS-CoV-2的作用，可作为治疗COVID-19 的一线抗生素。
实施例7，头孢他啶分子结构中的特定元件介导与S-RBD蛋白结合
头孢菌素有许多具有相似核心结构但有不同侧链修饰的衍生物。比较了头 孢他啶、头孢拉啶、头孢唑林、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢羟唑、头孢呋辛酯、 头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢噻利、头孢吡肟、头孢吡普、头孢洛林 等14种头孢菌素的抑菌效果。在所有头孢菌素中，只有头孢他啶对 S-RBD-ACE2相互作用表现出较强的抑制作用。头孢吡普和头孢曲松有一定的 抑制效果，而其他头孢菌素很少或没有抑制S-RBD-ACE2结合的作用(图5)。这些结果结合初步构效关系(preliminary Structure Activity Relationship，SAR)分析表明，头孢他啶分子结构中独特的元件，包括2-氨基噻唑、吡啶阳离子及 末端为异丁酸保护的肟结构片段可能参与介导与S-RBD蛋白结合并最终阻断S-RBD与ACE2的相互作用。此外，我们的数据显示，头孢他啶很难与S-RBD 蛋白分离(图2)，这可能是由于头孢他啶与S-RBD存在共价结合。

Claims (1)

1.头孢他啶或其药学上可接受的盐在制备用于抑制新型冠状病毒侵染细胞、或抑制新型冠状病毒感染的药物中的应用。
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