ES2312435T3

ES2312435T3 - Antagonistas de lhrh, su preparacion y su uso como medicamentos.

Info

Publication number: ES2312435T3
Application number: ES01933682T
Authority: ES
Inventors: Michael Bernd; Bernhard Kutscher; Eckhard Gunther; Peter Romeis; Thomas Reissmann; Thomas Beckers
Original assignee: Aeterna Zentaris GmbH
Current assignee: Aeterna Zentaris GmbH
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2021-03-12
Also published as: CA2402193A1; ATE408619T1; WO2001068676A3; BG107121A; KR20020083179A; MXPA02008870A; DK1268522T3; CN1443195A; CA2402193C; AU2001260110B2; HRP20020810A2; UA79070C2; ZA200207248B; RU2248982C9; PT1268522E; KR100607396B1; NZ521273A; SK14332002A3; IL151647A0; WO2001068676A2

Abstract

Antagonistas de LHRH, caracterizados por los compuestos de la fórmula: Ac-D-Nal(2) 1 -D-Cpa 2 -D-Pal(3) 3 -Ser 4 -Tyr 5 -D-Xxx 6 -Leu 7 -Arg 8 -Pro 9 -D-Ala 10 -NH2 Ac-D-Nal(2) 1 -D-Cpa 2 -D-Pal(3) 3 -Ser 4 -Tyr 5 -D-Hci 6 -Leu 7 -Lys(iPr) 8 -Pro 9 -D-Ala 10 -NH 2 Ac-D-Nal(2) 1 -D-Cpa 2 -D-Pal(3) 3 -Ser 4 -Tyr 5 -D-hArg(Et)2 6 -Leu 7 -hArg(Et)2 8 -Pro 9 -D-Ala 10 -NH2 Ac-D-Nal(2) 1 -D-Cpa 2 -D-Pal(3) 3 -Ser 4 -Tyr 5 -D-Cit 6 -Leu 7 -Arg 8 -Pro 9 -D-Ala 10 -NH 2, así como sus sales con ácidos farmacéuticamente aceptables.

Description

Antagonistas de LHRH, su preparación y su uso como medicamentos.

La invención se refiere a antagonistas de LHRH con propiedades mejoradas de solubilidad, a procedimientos para la preparación de estos compuestos, a medicamentos en los que están contenidos estos compuestos, así como al uso de los medicamentos para el tratamiento de tumores dependientes de hormonas y enfermedades no malignas, influenciadas por hormonas, tal como hiperplasia benigna de la próstata (BPH - siglas en inglés) y endometriosis.

La nomenclatura utilizada para la definición de los péptidos coincide con la nomenclatura explicada por la Comisión de IUPAC-IUB sobre nomenclatura bioquímica (European J. Biochem. 1984, 138, 9-37), en donde, en coincidencia con la representación habitual, los grupos amino aparecen en el extremo N hacia la izquierda y los grupos carboxilo aparecen en el extremo C hacia la derecha. Los antagonistas de LHRH, al igual que los péptidos de acuerdo con la invención, comprenden aminoácidos que se presentan en la naturaleza y sintéticos, en donde los primeros comprenden Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp y His. Las abreviaturas para los distintos radicales de aminoácidos se basan en los nombre triviales de los aminoácidos y son Ala = alanina, Arg = arginina, Gly = glicina, Leu = leucina, Lys = lisina, Pal(3) = 3-(3-piridil)alanina, Nal(2) = 3-(2-naftil)alanina, Phe = fenilalanina, Cpa = 4-clorofenilalanina, Pro = prolina, Ser = serina, Thr = treonina, Trp = triptófano, Tyr = tirosina y Sar = sarcosina. Todos los aminoácidos aquí descritos proceden de la serie L, si no se menciona de otro modo. Por ejemplo, D-Nal(2) es la abreviatura de 3-(2-naftil)-D-alanina y Ser es la abreviatura de L-serina. Las sustituciones en el grupo \varepsilon-amino en la cadena lateral de lisina se representan por una expresión puesta entre paréntesis detrás de Lys, eventualmente en forma de una abreviatura.

Otras abreviaturas utilizadas son:

Ac: acetilo

B: 4-(4-amidino-fenil)-amino-1,4-dioxo-butilo

Boc: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio

DCC: diciclohexilcarbodiimida

DCM: dioclorometano

Ddz: dimetoxifenil-dimetilmetilenoxi-carbonilo (dimetoxi-dimetil-Z)

DIC: diisopropilcarbodiimida

DIPEA: N,N-diisopropiletilamina

DMF: dimetilformamida

Fmoc: fluorenilmetiloxicarbonilo

HF: ácido fluorhídrico

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

HPLC: cromatografía líquida de alta presión

Me: metilo

TFA: ácido trifluoroacético

Z: benciloxicarbonilo

Los péptidos de acuerdo con la invención representan análogos de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH - siglas en inglés), la cual presenta la siguiente estructura; p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2} [LH-RH, gonadorelina).

Durante más de 20 años los investigadores han buscado antagonistas selectivamente potentes del decapéptido LH-RH [M. Kanten y J.E. Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 (1986)]. El gran interés por antagonistas de este tipo está justificado por su utilidad en el campo de la endocrinología, ginecología, contracepción y cáncer. Un gran número de compuestos han sido preparados como potenciales antagonistas de LH-RH. Los compuestos más interesantes que se han encontrado hasta la fecha son aquellos compuestos, cuyas estructuras representan una modificación de la estructura de LH-RH.

La primera serie de potentes antagonistas se obtuvo mediante la introducción de restos aminoácidos aromáticos en las posiciones 1, 2, 3 y 6 ó 2, 3 y 6. La forma habitual de escribir los compuestos se representa como sigue: Primero se indican los aminoácidos que en la cadena peptídica de LH-RH se ponen en lugar de los aminoácidos originalmente presentes, en donde las posiciones en las que tuvo lugar el intercambio, se distinguen por cifras en superíndice. Además, mediante la denominación pospuesta "LH-RH" se expresa que se trata de análogos de LH-RH en los que tuvo lugar el intercambio.

Antagonistas conocidos son:

: [Ac-D-Cpa^{1,2}, D-Trp^{3,6}]LH-RH (D. H et al, en: Gross, E. y Meienhofer, J. (compiladores) Peptides; Proceedings of the 6th American Peptide Symposium, págs. 775-779, Pierce Chem. Co., Rockville II. (1979);

: [Ac-Pro^{1}, D-Cpa^{2},D-Na(2)^{3,6}]LH-RH (patente de EE.UU. nº 4.419.347) y

: [Ac-Pro^{1}, D-Cpa^{2},D-Trp^{3,6}]LH-RH (J.L. Pineda et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983).

Con el fin de mejorar el efecto de antagonistas, se introdujeron más tarde aminoácidos de carácter básico, por ejemplo D-Arg, en la posición 6. Por ejemplo, [Ac-D-Cpa^{1,2}, D-Trp^{3}, D-Arg^{5}, D-Ala^{10}]LH-RH (ORG 30276) (D.H. Coy et al., Endocrinology 100, 1445, 1982); y [Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)^{2}, D-Trp^{3}, D-Arg^{6}]LH-RH (CRF 18260) (J.E. Rivier et al., en: Vickery B.H. Nestor, Jr. J.J., Hafez, E.S.E. (compiladores) LH-RH and its Analogs, págs. 11-22 MTP Press, Lancaster, GB 1984).

Otros potentes antagonistas de LH-RH están descritos en los documentos WO 92/19651, WO 94/19970, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A-5.300.492, US-A-5.140.009, EP 0 413 209 A1 y DE 195 44 212 A1.

Este último da a conocer compuestos con un componente de ornitina o lisina modificado en la posición 6, que corresponden a la siguiente fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Xxx^{6}-Leu^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2},

en donde D-Xxx representa un grupo aminoácido de la fórmula general (VI)

1

Otros antagonistas de LH-RH conocidos son Antarelix, Ganirelix y Cetrorelix.

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Antarelix® (INN: Teverelix);

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Leu^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}.

Ganirelix:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-hArg(Et)_{2}^{6}-Leu^{7}-hArg(Et)_{2}^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}.

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Cetrorelix:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Cit^{6}-Leu^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}.

Otro estado de la técnica más próximo es el documento WO 00/55190 A1. La patente describe péptidos que contienen componentes aminoácidos N-metilados y que presentan una solubilidad en agua mejorada.

Como otro estado de la técnica se menciona también el documento Haviv F. et al., "The Effect of NME Tyr5 Substitution in Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Antagonists", J. Med. Chem. 1993, 36, 928-933. El documento da a conocer antagonistas de LH-RH que en la posición 5 de los decapéptidos contienen un aminoácido N-Me-Tyr. Se describe el efecto de una solubilidad en agua mejorada y una resistencia proteolítica a las enzimas.

El objetivo de la invención es crear nuevos antagonistas de LH-RH que presenten una estabilidad enzimática incrementada y una solubilidad en agua significativamente mejorada.

Este problema se resuelve mediante compuestos, cuyo alcance se caracteriza por los siguientes compuestos:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-Ser^{10}-NH_{2}

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

Conforme a otro aspecto de la invención, los compuestos de acuerdo con la invención se presentan en forma de sal acetato, trifluoroacetato o embonato.

La invención se refiere también a los compuestos de acuerdo con la invención para uso como medicamentos o preparados farmacéuticos.

Conforme a otro aspecto de la invención se proporcionan preparados farmacéuticos que comprenden al menos uno de los compuestos de acuerdo con la invención y soportes y coadyuvantes habituales.

Conforme a otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la preparación de los compuestos de acuerdo con la invención de la fórmula general I

(I)A-Xxx^{1}-Xxx^{2}-Xxx^{3}-Xxx^{4}-Xxx^{5}-Xxx^{6}-Xxx^{7}-Xxx^{8}-Xxx^{9}-Xxx^{10}-NH_{2}

con A con el significado de acetilo,

en el que se constituyen fragmentos a base de componentes provistos de grupos protectores adecuados Xxx^{m}, en los que m significa un número entero de 1 a 10 y Xxx^{1} está acetilado, en una fase sólida o en solución según procedimientos habituales, a continuación los fragmentos se unen a una fase sólida mediante acoplamiento de segmentos, y después de finalizado el acoplamiento los compuestos de la fórmula general I se separan de la fase sólida con procedimientos habituales bajo amidación en el componente Xxx^{10}.

Conforme a otro aspecto de la invención se proporciona el uso de los compuestos de acuerdo con la invención para la preparación de medicamentos para el tratamiento de tumores dependientes de hormonas, en particular carcinoma de próstata o cáncer de mama, así como para indicaciones no malignas, cuyo tratamiento requiere una supresión de hormonas LH-RH.

Conforme a otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la preparación de preparados farmacéuticos, en el que al menos un compuesto conforme a una de las reivindicaciones 1 y 2 se mezcla con los soportes y coadyuvantes habituales y se confecciona como medicamento.

Los compuestos de acuerdo con la invención pueden utilizarse para el tratamiento de tumores dependientes de hormonas, en particular carcinoma de próstata, cáncer de mama o mioma del útero, así como para indicaciones no malignas, cuyo tratamiento requiere una supresión de hormonas LH-RH, tal como endometriosis o hiperplasia benigna de la próstata (BPH). Además, pueden emplearse para el tratamiento de alteraciones en la fecundidad en la mujer o en el hombre, por ejemplo para la superestimulación de los ovarios controlada en el marco de una fecundación artificial (fertilización in vitro). Para ello, habitualmente se mezclan, según procedimientos en sí conocidos, con soportes y coadyuvantes habituales y se confeccionan como medicamento.

La síntesis de compuestos conformes a la fórmula (I) se puede realizar tanto mediante condensación clásica de fragmentos o por síntesis en fase sólida según Merrifield mediante subsiguiente constitución, utilizando D-lisina acilada en la cadena lateral ya con el ácido carboxílico de la fórmula general R^{1}-COOH, como mediante reacción de un componente decapéptido con los correspondientes ácidos carboxílicos mediante enlace amida en la cadena lateral de D-lisina^{6}. Según esto, la introducción del grupo R^{1}-CO puede efectuarse en tres puntos diferentes del procedimiento: antes de la condensación de los distintos componentes para formar el péptido, después de la incorporación de lisina u ornitina en en la cadena peptídica, pero antes de la condensación de los siguientes componentes, o después de la condensación de todos los componentes.

Los compuestos de la fórmula (I) se sintetizan según los métodos conocidos tal como, por ejemplo, mediante una técnica de separación en fase sólida, técnica de separación en fase sólida parcial (la denominada condensación de fragmentos) o mediante los acoplamientos en solución clásicos (véase M. Bodansky, "Principles of Peptide Synthesis", editorial Springer 1984).

Por ejemplo, los métodos de la síntesis en fase sólida se describen en el libro de texto "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M. Stewart y J.D. Young, Pierce Chem Company, Rockford, III., 1984 y en G. Barany y R.B. Merrifield "The Peptides", Cap. 1, págs. 1-285, 1979, Academic Press Inc. Síntesis en solución clásicas están descritas ampliamente en el tratado "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Synthese von Peptiden" E. Wünsch (editor) 1974, editorial Georg Thieme, Stuttgart, RFA.

La constitución escalonada se realiza, por ejemplo, uniendo primero covalentemente los extremos carboxilo de aminoácidos, cuyo grupo amino en posición \alpha está protegido, el grupo protector \alpha-amino separa este aminoácido, une al grupo amino libre, así obtenido, al siguiente aminoácido protegido a través de su grupo carboxi y, de este modo, enlaza paso a paso a los restantes aminoácidos del péptido a sintetizar en la secuencia correcta, y después del enlace de todos los aminoácidos separa al péptido acabado del soporte y eventualmente separa a otros grupos protectores de la función lateral presentes. La condensación escalonada se realiza, de manera habitual, mediante síntesis a partir de los correspondientes aminoácidos portegidos de manera usual.

El enlace de los distintos aminoácidos entre sí se realiza según métodos habituales para ello, en particular entran en consideración:

\bullet: método de los anhídridos simétricos en presencia de dicilohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida (DCC, DIC)

\bullet: método de la carbodiimida en general

\bullet: método de de la carbodiimida-hidroxibenzotriazol

(véase The Peptides, volumen 2, Ed. EJ. Meienhofer).

En el caso del acoplamiento de fragmentos se utiliza, preferiblemente, el acoplamiento de azida, que discurre sin racemización, o el método de DCC-1-hidroxibenzotriazol o bien de DCC-3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina. También se pueden emplear los ésteres activados de fragmentos.

Para la condensación escalonada de aminoácidos se adecuan, de manera particularmente buena, éstres activados de aminoácidos N-protegidos tales como, por ejemplo, ésteres de N-hidroxisuccinimida o ésteres de 2,4,5-triclorofenilo. La aminolisis se puede catalizar muy bien mediante compuestos N-hidroxi que poseen aproximadamente la acidez del ácido acético tal como, por ejemplo, 1-hidroxibenzotriazol.

Como grupos protectores de amino intermedios se ofrecen grupos dehidratantes tales como, por ejemplo, el radical benciloxicarbonilo (= radical Z) o grupos débilmente ácidos, separables. Como grupo protector para los grupos amino en posición \alpha entran en consideración, por ejemplo:

: grupos butiloxicarbonilo terciarios, grupos fluorenilmetiloxicarbonilo, grupos carbobenzoxi o grupos carbobenztio (eventualmente en cada caso con radical p-bromo- o p-nitro-bencilo), el grupo trifluoroacetilo, el grupo ftalilo, el grupo o-nitrofenoxiacetilo, el grupo tritilo, el grupo p-toluenosulfonilo, el grupo bencilo, radicales bencilo sustituidos en el núcleo benzo (radical p-bromo- o p-nitro-bencilo) y el radical \alpha-fenil-etilo. Para ello, se remite también a Jesse P. Greenstein y Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, Nueva York 1961, Jphn Wiley and Sons, Inc., volumen 2, por ejemplo página 883 y siguientes, "Principles of Peptide Synthesis", editorial Springer 1984, "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M: Stewart y J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III., 1984, G. Barany y R.B. Merrifield "The Peptides", Cap. 1, Págs. 1-285, 1979, Academic Press Inc., así como The Peptides, volumen 2, comp. E. Gross y J. Meienhofer, Academic Press, Nueva York. Estos grupos protectores entran en consideración, básicamente también para la protección de otros grupos laterales funcionales (grupos OH, grupos NH_{2}) de los correspondientes aminoácidos.

Grupos hidroxi presentes (serina, treonina) son protegido, preferiblemente, por grupos bencilos y grupos similares. Otros grupos amino no en posición \alpha (por ejemplo grupos amino en posición \omega, grupos guanidino de la arginina) son protegidos, preferiblemente, de forma ortogonal.

Los distintos componentes aminoácidos son adquiribles en el comercio, exceptuando lisina modificada por el grupo R^{1}-CO.

Un posible transcurso del procedimiento para la preparación de lisina modificada por el grupo R^{1}-CO es como sigue:

1.: El grupo \alpha-carboxi es protegido de manera adecuada, por ejemplo mediante esterficación.

2.: El grupo \varepsilon-amino es protegido, por ejemplo con el grupo Z.

3.: El grupo \alpha-carboxi es protegido de tal manera (por ejemplo, el grupo Boc), que resulta una selectividad en relación con la posterior separación de los grupos protectores de amino.

4.: Se separa el grupo Z en el grupo \varepsilon-amino.

5.: En el grupo \varepsilon-amino se introduce el grupo R^{1}-CO deseado.

6.: Se separa el grupo protector en el grupo \alpha-amino.

7.: El grupo \alpha-amino se derivatiza eventualmente de forma reversible, por ejemplo con el grupo Z.

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Para la introducción de los grupos R^{1}-CO mediante reacción del grupo amino de la lisina con el correspondiente ácido carboxílico o derivado de ácido carboxílico entran en consideración, básicamente, los mismos procedimientos que antes para el enlace de los aminoácidos descritos. Sin embargo, es particularmente preferida la condensación utilizando carbodiimida, por ejemplo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol.

La reacción para el enlace de aminoácidos tienen lugar en un disolvente o agente de suspensión indiferente habitual para ello (por ejemplo diclorometano), pudiendo añadirse dimetilformamida eventualmente para mejorar la solubilidad.

Como material de soporte sintético entran en consideración polímeros insolubles, por ejemplo resina de poliestireno en forma de perlas, expandible en disolventes orgánicos (por ejemplo un copolímero a base de poliestireno y 1% de divinilbenceno). La constitución de una decapéptido-amida protegida en una resina de metil-benzhidrilamina (resina MBHA, es decir resina de poliestireno provista de grupos metil-benzhidrilamina) que proporciona la función amida C-terminal deseada del péptido después de la separación HF del soporte puede llevarse a cabo conforme al siguiente diagrama de flujo:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Diagrama de flujo

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Protocolo de síntesis de péptidos utilizando aminoácidos

2

Los aminoácidos protegidos con N\alpha-Boc se acoplan habitualmente en un exceso triple molar, en presencia de diisopropilcarbodiimida (DIC) y 1-hidroxibenzotraizol (HOBt) en CH_{2}Cl_{2}/DMF en el espacio de 90 min y el grupo protector de Boc se separa mediante la acción durante media hora de ácido trifluoroacético al 50% (TFA) en CH_{2}Cl_{2}. Para el control de la conversión completa puede servir el test de la cloroanilina según Christensen y el test de la ninhidrina de Kaiser. Restos de funciones amino libres se bloquean mediante acetilación en un exceso quíntuple en acetilimidazol en CH_{2}Cl_{2}. La secuencia de las etapas de reacción de la constitución del péptido en la resina resulta del diagrama de flujo. Para la separación de los péptidos unidos a la resina se seca el respectivo producto final de la síntesis en fase sólida en vacío a través de P_{2}O_{5} y se trata en un exceso de 500 veces en HF/anisol 10:1/V:V durante 60 min a 0ºC.

Después de separar por destilación el HF y el anisol en vacío, los péptidos, mediante separación con agitación con etiléter anhidro, precipitan en forma de sólidos blancos y la separación de soportes polímeros que precipitan conjuntamente se realiza mediante lavado con ácido acético acuoso al 50%. Mediante concentración moderada de las soluciones en ácido acético en vacío pueden obtenerse los péptidos respectivos en forma de aceites muy viscosos los cuales, tras la adición de éter abs. en frío, se transforman en sólidos blancos.

La purificación ulterior se realiza por métodos rutinarios de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) preparativa.

La transformación de los péptidos en sus sales por adición de ácidos puede llevarse a cabo, de manera en sí conocida, mediante reacción de los mismos con ácidos. A la inversa, pueden obtenerse péptidos libres mediante reacción de sus sales por adición de ácidos con bases. Embonatos de péptidos pueden prepararse mediante reacción de sales del ácido trifluoroacético (sales de TFA) del péptido con ácido embónico (ácido pamoico) libre o la correspondiente sal disódica del ácido embónico. Para ello, la sal del TFA del péptido se mezcla, en solución acuosa, con la solución de embonato disódico en un medio polar-aprótico, preferiblemente dimetilacetamida y se aísla el precipitado amarillo pálido que se forma.

Los Ejemplos siguientes sirven para explicar la invención.

Ejemplo 1

(D-68968)

Ac-D-Na(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2}

La síntesis del decapéptido se realizó en el soporte polímero con una densidad de carga de 0,55 mmol/g (resina sustituida con aminometilo, protección con Fmoc, tipo D-1675, firma Bachem). La lisina se acopló en forma de Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, y los grupos protectores de Fmoc se separaron con piperidina al 20%/DMF. Después de la separación simultánea de todos los grupos protectores de las cadenas laterales y de la separación por disolución del soporte polímero, el péptido bruto aislado se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvo el decapéptido al 98,5%.

La sustitución en el nítrógeno \varepsilon de D-lisina con ácido 4-(4-aminofenil)-amino-1,4-dioxo-butírico se consiguió con PyBop en DMF bajo la adición de DIPEA. La purificación del péptido bruto aislado se efectuó mediante HPLC preparativa. La liofilización subsiguiente proporcionó producto aprox. al 99% (trifluoroacetato) de la fórmula molecular C_{82}H_{106}ClN_{19}O_{15} con FAB-MS correcto 1633 (M+H) (calc. 1631,78096).

Ejemplo 2

(D-68968)

Ac-D-Na(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

La síntesis del decapéptido se realizó en el soporte polímero con una densidad de carga de 0,55 mmol/g (resina sustituida con aminometilo, protección con Fmoc, tipo D-1675, firma Bachem). La lisina se acopló en forma de Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, y los grupos protectores de Fmoc se separaron con piperidina al 20%/DMF. Después de la separación simultánea de todos los grupos protectores de las cadenas laterales y de la separación por disolución del soporte polímero, el péptido bruto aislado (contenido, aprox. 59%, HPLC) se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvo el decapéptido al 95%.

La sustitución en las cadenas laterales de D-lisina con ácido 4-(4-aminofenil)-amino-1,4-dioxo-butírico se consiguió con PyBop en DMF bajo la adición de DIPEA. El péptido bruto aislado se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización subsiguiente se obtuvo un péptido al 96,8% (trifluoroacetato) de la fórmula molecular C_{85}H_{112}ClN_{17}O_{15} con FAB-MS correcto 1648 (M+H) (calc. 1645,8218).

Ejemplo 3

(D-68971)

Ac-D-Na(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2}

La síntesis del decapéptido se realizó en el soporte polímero con una densidad de carga de 0,55 mmol/g (resina sustituida con aminometilo, protección con Fmoc, tipo D-1675, firma Bachem). La lisina se acopló en forma de Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, y los grupos protectores de Fmoc se separaron con piperidina al 20%/DMF. Después de la separación simultánea de todos los grupos protectores de las cadenas laterales y de la separación por disolución del soporte polímero, el péptido bruto aislado con un contenido de aprox. 71% (HPLC) se continuó haciendo reaccionar sin purificación.

La sustitución en las cadenas laterales de D-lisina con ácido 4-(4-aminofenil)-amino-1,4-dioxo-butírico se consiguió con PyBop en DMF bajo la adición de DIPEA. El péptido bruto aislado se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización subsiguiente se obtuvo un péptido al 98,8% (trifluoroacetato) de la fórmula molecular C_{82}H_{106}ClN_{19}O_{15} con FAB-MS correcto 1633 (M+H) (calc. 1631,78096).

Ejemplo 4

(D-68987)

Ac-D-Na(2)^{1}-D-Phe(4-Cl)^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Lys(B)^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

La síntesis del decapéptido D-Lys-6-no sustituido se realizó en 9,09 g de soporte polímero con una densidad de carga de 0,55 mmol/g. La lisina se acopló en forma de Fmoc-D-Lys(Boc)-OH.

Después de la separación de la resina, se aislaron 8,15 g de péptido bruto. La purificación del péptido se efectuó mediante HPLC preparativa.

La sustitución en las cadenas laterales de D-lisina con ácido 4-(4-aminofenil)-amino-1,4-dioxo-butírico se consiguió con PyBop en DMF bajo la adición de DIPEA. El péptido bruto aislado se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización subsiguiente se obtuvo un producto al 94,6% (trifluoroacetato) de la fórmula molecular C_{85}H_{112}ClN_{17}O_{15} con FAB-MS correspondiente: 1646,8 (M+H); calculado 1645,82.

Investigaciones sobre el efecto biológico

Los compuestos de acuerdo con la invención se investigaron en cuanto a su unión al receptor. El procedimiento se basa estrechamente en el procedimiento descrito en Beckers et al., Eur. J. Biochem, 231, 535-543 (1995). Según la síntesis dada a conocer arriba, Cetrorelix obtenido se yoda con [^{125}I] (Amersham; actividad específica 80,5 Bq/fmol), utilizando el reactivo IodoGen (Pierce). La mezcla de reacción se purifica mediante cromatografía de líquido de alta eficiencia de fases inversas, obteniéndose Cetrorelix monoyodado sin péptido no marcado. En cada caso aproximadamente 80% del [^{125}I]-Cetrorelix y del compuesto de acuerdo con la invención, no marcado, es adecuado para la asociación específica al receptor.

Los compuestos de acuerdo con la invención se pueden testar en cuanto a su efecto in-vitro con los siguientes métodos 1 y 2, determinándose las afinidades de unión en el ensayo de unión con [^{125}I]-Cetrorelix (método 1) y las actividades funcionales con triptorelina en calidad de estímulo agonista (método 2).

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Método 1

Determinación de K_{D} en el ejemplo de Cetrorelix

Ensayo de unión al receptor según Beckers, T., Marheineke, K., Hilgard, P. (1995) "Selection and characterization of cell lines with stable overexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin (Gn-RH)" Eur. J. Biochem, 231, 535-543.

Para la investigación de la unión al receptor se yoda Cetrorelix utilizando el reactivo IodoGen (Pierce) con [^{125}I] (Amersham; actividad específica 80,5 Bq/fmol). La mezcla de reacción se purifica mediante cromatografía de líquido de alta eficiencia, obteniéndose Cetrorelix monoyodado sin péptido no marcado. Aproximadamente 80% del [^{125}I]-Cetrorelix estaba capacitado para la asociación específica al receptor.

El ensayo de unión al receptor se lleva a cabo con células intactas en condiciones fisiológicas, tal como se describe (Beckers et al. 1995). Cultivos subconfluentes de células LTK establemente transfectadas, las cuales expresan el receptor humano de LHRH, se separan mediante incubación en NaCl/P_{i} (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4})/EDTA 1 mM y se recolectan mediante centrifugación. El sedimento de células se resuspende en tampón de unión (DMEM sin H_{2}CO_{3}, con 4,5 g/l de glucosa, Hepes 10 mM pH 7,5, BSA al 0,5% (masa/volumen), 1 g/l de bacitracina, 0,1 g/l de SBTI. NaN_{3} al 0,1% (masa/volumen)). Para ensayos de desplazamiento se incuban 0,25x10^{6} células/100 \mul con aproximadamente 225 pM del [^{125}I]-Cetrorelix (actividad específica 5-10 x 10^{5} dpm/pmol) y distintas concentraciones de compuesto de acuerdo con la invención, no marcado, en calidad de competidor. La suspensión de células en 100 \mul de medio de unión se estratifica en tubitos de ensayo de 400 \mul sobre 200 \mul de aceite de silicona al 84% en vol. (Merck tipo 550)/aceite de parafina al 16% en vol. Tras la incubación durante 1 h a 37ºC con sacudimiento lento y continuo, las células se separan del medio de incubación mediante centrifugación durante 2 min a 9000 rpm (tipo de rotor HTA13.8; Heraeus Sepatec, Osterode/Alemania). Las puntas de los tubitos, que contenían el sedimento de células, se cortan. A continuación, el sedimento de células y el sobrenadante se analizan mediante recuento de la irradiación \gamma. La cantidad de material unido cortado se determina bajo la inclusión de Cetrorelix no marcado a una concentración final de 1 \muM y, típicamente, asciende a \leq 10% del material unido total. El análisis de los datos de unión se lleva a cabo con el programa de análisis EBDA/ligando (Biosoft V3.0).

Cetrorelix presenta un valor de K_{D} de 170 picomol por litro (pM) (número de ensayos llevados a cabo de manera independiente: 21).

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Método 2

Ensayo funcional para la determinación de la actividad antagonista (valor CI_{50})

: El ensayo, provisto de las modificaciones mencionadas seguidamente, se lleva a cabo como se describe en Beckers, T., Reiländer, H., Hilgard, P. (1997) "Characterization of gonadotropin-releasing hormone analogs based on a sensitive cellular luciferase reproter gene assay", Analyt. Biochem. 251, 17-23 (Beckers et al., 1997). 10.000 células por pocillo, que expresan el receptor LHRH humano y un gen informador de luciferasa, se cultivan durante 24 h en placas de microtitulación utilizando DMEM con aditivos y FCS al 1% (v:v). Las células se estimulan, a continuación, durante 6 h con 1 nM de [D-Trp^{8}] LHRH. Compuestos de acuerdo con la invención antagonistas se añaden antes de la estimulación, y las células se lisan al final para la cuantificación de la actividad de Luc celular. El cálculo de los valores CI_{50} a partir de curvas de dosis-efecto se lleva a cabo mediante el análisis de regresión no lineal utilizando el modelo de Hill (programa EDX 2.0 de C. Grunwald, Arzneimittelwerk Dresden).

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La cuantificación de la actividad de Luc se lleva a cabo esencialmente como se describe (Promega Technical Bulletins nº 101/161), utilizando el respectivo sistema de ensayo de luciferasa (Promega E4030) por duplicado. Mediante la adición de coenzima A (CoA) tiene lugar una oxidación de luciferil-CoA con cinética ventajosa. Después de retirar el medio de cultivo de la placa de microtitulación, las células se lisan mediante la adición de 100 \mul de tampón de lisis (tris-fosfatos 25 mM pH 7,8, ditiotreitol 2 mM, ácido 1,2-diaminociclohexan-N,N,N',N'-tetra-acético (CDTA) 2 mM, glicerol al 10% (v:v), Triton X-100 al 1% (v:v). Después de incubación durante 15 min a la temperatura ambiente, se transfieren 10 \mul de lisado de células a una placa de microtitulación blanca, adecuada para una detección luminométrica (Dynatech).

La reacción enzimática se inicia mediante la adición de 50 \mul de tampón de análisis (tricina 20 mM pH 7,8, (MgCO_{3})_{4}Mg(OH)_{2} 1,07 mM, MgSO_{4} 2,67 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mM, ditiotreitol 33,3 mM, 270 \muM de coenzima A, 470 \muM de luciferina de la luciérnaga (Photinus pyralis), 530 \muM de rATPNa_{2}). Al cabo de un minuto se determina, durante un tiempo total de un segundo, la luminiscencia con un tiempo de semivida de la señal de cinco minutos utilizando el Berthold MicroLumat LB 96 P de EG&G.

En la Tabla 2 se recopilan datos físico-químicos e in-vitro de los compuestos de acuerdo con la invención. CI_{50} representa la actividad funcional y pM significa picomol por litro. La solubilidad en agua se determinó según el procedimiento descrito en la nota 2).

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TABLA 2

3

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Solubilidad según el método del Boletín Oficial en solución de Ringer

Para la determinación de la solubilidad según el método del Boletín Oficial, la sustancia de ensayo se mezcla en exceso con un material de soporte inerte tal como, p. ej., arena y se carga en una columna de vidrio (tamaño del volumen, aprox. 10 ml). En el fondo de la columna se incorporó previamente un tamiz de algodón y filtro de fibras de vidrio. La mezcla de sustancia-arena se deja expandir durante 1 hora en 1,0 ml de disolvente en el cual se debe determinar la solubilidad. A continuación, se cargan en la columna de vidrio 10 ml del disolvente. Por medio de una bomba de manguera se bombea la solución en el ciclo. Esta determinación se lleva a cabo a la temperatura ambiente (aprox. 20ºC).

La solubilidad se determina cuando es constante la concentración en masa de fracciones tomadas consecutivamente.

La determinación de la concentración en masa se calcula mediante el método HPLC descrito en lo que sigue.

Método HPLC Equipo Sistema de HPLC: Hewlet Packard 1100; Detector: Hewlet Packard DAD Series 1100

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55% de fase móvil A: Se mezclan 970 ml de Milli-Q-H_{2}O, 30 ml de acetonitrilo y 1 ml de ácido trifluoroacético. El pH resultante es aprox. 1,9.

45% de fase móvil B: Se mezclan 300 ml de Milli-Q-H_{2}O, 700 ml de acetonitrilo y 1 ml de ácido trifluoroacético. El pH resultante es aprox. 1,8.

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La administración de los compuestos de acuerdo con la invención puede realizarse de forma diferente, adecuada para principios activos peptídicos. Administraciones adecuadas son bien conocidas por el experto en la materia. La administración puede realizarse mediante inyección. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, por vía parenteral. En este caso, se prefiere la administración por vía subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), bucal (p. ej. sublingual) o rectal. Se prefieren particularmente la adminitración i.s. e i.m.

Los compuestos de acuerdo con la invención son adecuados para la preparación de diferentes formas de administración, por ejemplo para liofilizados, soluciones o suspensiones. Formas de administración adecuadas y su preparación son conocidas por el experto en la materia. Como coadyuvantes y sustancias estructurales son adecuadas, por ejemplo, hexitas, tales como manita, en particular D-manita, L-manita o D,L-manita, sorbita, tal como D-sorbita, D- o L-altrita, idita, glucita y dulcita. La preparación se realiza según modos de proceder en sí conocidos, por ejemplo por mezcladura, suspensión o liofilización.

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Ejemplo A

Liofilizado para la preparación de una solución de inyección s.c. 1 mg de compuesto según el Ejemplo 1 (correspondiente a 0,26-0,27 mg de sal acetato); 0-16,9 partes en peso de D-manitol, de preferencia 0,1-7 partes en peso, en cada caso referidas al Ejemplo 1, y agua para fines de inyección (para la preparación de la solución de inyección a partir del liofilizado).

Preparación: Disolver 1,62 g del Ejemplo 1 en ácido acético al 30% (aprox. 1,5 litros de agua para fines de inyección y 91,17 g de ácido acético). Diluir la solución con 1,5 litros de agua, añadir 82,2 g de manitol, filtrar en condiciones estériles, envasar en viales de inyección de 2 ml estériles en condiciones asépticas y liofilizar. Se obtiene 1 mg de liofilizado del compuesto conforme al Ejemplo 1.

Los compuestos de acuerdo con la invención son adecuados, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades dependientes de hormonas, malignas o no malignas, tal como, por ejemplo, para el tratamiento del carcinoma de mama, el carcinoma de próstata, la endometriosis, el mioma del útero, hiperplasia benigna de la próstata (BPH - siglas en inglés), así como en el tratamiento de trastornos de fecundidad masculinos o femeninos, por ejemplo para evitar una ovulación prematura en pacientes que se someten a una estimulación controlada de los ovarios, seguida de una retirada de los óvulos y técnicas de la reproducción asistida. Los citados tratamientos pueden llevarse a cabo en mamíferos, en particular en seres humanos.

Claims

1. Antagonistas de LHRH, caracterizados por los compuestos de la fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Xxx^{6}-Leu^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Leu^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-hArg(Et)_{2}^{6}-Leu^{7}-hArg(Et)_{2}^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Cit^{6}-Leu^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2},

así como sus sales con ácidos farmacéuticamente aceptables.

2. Compuestos según la reivindicación 1, en donde la sal es un acetato, trifluoroacetato o embonato.

3. Compuestos según las reivindicaciones 1 y 2, para uso como medicamentos.

4. Preparado farmacéutico que comprende al menos un compuesto según una de las reivindicaciones 1 y 2, así como sustancias de soporte y coadyuvantes habituales.

5. Procedimiento para la preparación de los compuestos según la reivindicación 1 de la fórmula general I

con A con el significado de acetilo,

6. Uso de los compuestos según las reivindicaciones 1 y 2 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de tumores dependientes de hormonas, en particular carcinoma de próstata, cáncer de mama, así como para indicaciones no malignas, cuyo tratamiento requiere una supresión de hormonas LH-RH, tales como endometriosis, hiperplasia benigna de la próstata (BPH) o para el tratamiento de trastornos de la fecundidad en la mujer o en el hombre, en mamíferos, en particular en seres humanos.

7. Procedimiento para la producción de preparados farmacéuticos según la reivindicación 4, en el que al menos un compuesto conforme a las reivindicaciones 1 y 2 se mezcla con las sustancias de soporte y coadyuvantes habituales y se confecciona como medicamento.