PT100077B

PT100077B - Antagonistas da hormona de libertacao da hormona luteinizante e seu processo de preparacao

Info

Publication number: PT100077B
Application number: PT100077A
Authority: PT
Inventors: Andrew V Schally; Tamas Janaky; Atilla Juhasz
Original assignee: Univ Tulane
Priority date: 1991-01-30
Filing date: 1992-01-30
Publication date: 1999-06-30
Also published as: HU9202778D0; LV5806A4; PT100077A; MX9200342A; US5171835A; LV5806B4; CA2079461A1; FI924405A; ZA92600B; JPH05505630A; FI924405A0; EP0522152A1; TW304198B; WO1992013883A1; IE920287A1; HUT63635A

Description

Este pedido de patente é uma continuação em parte do pedido copendente n^B de série 07/404667, depositado em 7 de Setembro, 1989.

ANTECEDENTES DO INVENTO presente invento refere-se a novos péptidos possuindo um efeito inibidor sobre a libertação de gonadotropinas pela pituitária em mamíferos, incluindo seres humanos e possuindo uma influência sobre o crescimento de tumores cancerosos nos seres humanos. Mais especificamente, o presente invento refere-se a análogos antagonistas da hormona de libertação da hormona luteinizante (LH-RH), os quais possuem a estrutura:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ e a seus sais, e a composições farmacêuticas e processos de utilização relativos a estes análogos.

DISCUSSÃO DA ARTE ANTERIOR

A hormona de libertação da hormona luteinizante hipotalâmica (LH-RH) controla a síntese pituitária e a secreção de gonadotropinas (LH e FSH) que são essenciais para a regulação da síntese de esteróides sexuais nas gônadas.

Foram registados mais de 2500 novos análogos sintéticos da LH-RH (análogos agonistas e antagonistas) desde a sua descoberta e sua elucidação estrutural (A. V. Schally et al., Fértil. Steril. 22. 703-721, 1971) com vista na suas esperadas

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-4aplicações médicas (M. J. Karten e J.

7_, 44-66, 1986; A. Dutta, Drugs of the Future, 13 761-787,

1988) . Os antagonistas da LH-RH competem com a LH-RH endógena nos receptores da hipófise e inibem directamente a secreção de gonadotropinas. Possuem vantagens terapêuticas significativas sobre os agonistas na medida em que estes inibem quase imediatamente a secreção de gonadotropinas sem induzir um aumento inicial de gonadotropinas, como é característico dos agonistas da LH-RH. Têm-se utilizado antagonistas de LH-RH em endocrinologia e ginecologia para o controla da fertilidade e para o tratamento de puberdade precoce, pois eles bloqueiam a ovulação na fêmea e suprimem a espermatogénese no macho. A utilização de antagonistas em oncologia para o tratamento de tumores sensíveis a hormonas é muito recente, mas muito promissora (A. V. Schally et al., em: GnRH analogs in câncer and in humam reproduction. Basic Aspects, (editado por B. H. Vickery e V. Lunenfeld), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, Vol. 1, pp. 5-31,

1989) .

Os antagonistas mais interessantes até à data têm sido os compostos cuja estrutura é uma modificação da estrutura da LH-RH. A modificação sistemática da molécula mostrou a contribuição dos aminoácidos individuais e das suas cadeias laterais para a actividade biológica. Os primeiros antagonistas mais potentes possuíam frequentemente um agrupamento hidrofóbico de resíduos de aminoácidos D no terminal N e aminoácidos D hidrofílicos, fortemente básicos, na posição 6 e/ou 8 (D. H. Coy et al., Endocrinology, 100 1445-1447, 1982; A. Horvath et al., Peptides 3. 969-971, 1982; J. Rivier et al., J. Med. Chem. 29., 1846-1851,

1986). No entanto, estes potentes antagonistas hidrofílicos causavam edema sistémico transiente da face e das extremidades e inflamação no local da injecção quando injectados por via subcutânea em ratazanas a 1,25 ou 1,5 mg/kg de peso corporal. Estes análogos, os quais são secretagogos de mastócitos libertam histamina e, quando administrados por via intravenosa a ratazanas numa dose de 1,25 mg/kg de peso corporal, podem também causar cianose e depressão respiratória que leva à morte celular (Smith et al., Contraception 29., 283-289, 1984; Morgan et al., Int.

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-5Arch. Allergy Appl. Immunology 80 , 70-75 , 1986). Para ultrapassar estes efeitos secundários, mas manter a elevada potência anti-ovulatória dos antagonistas, dirigiu-se a pesquisa para a mudança da basicidade das cadeias laterais na região dos aminoácidos 5-8. Hocart et al., (J. Med. Chem. 30., 1910-1914,

1987) verificaram que a substituição de derivados de Lys alquilados na posição 6 não produzia alterações significativas na actividade de libertação de histamina dos análogos, ao passo que substituintes similares na posição 8 reduziam a libertação de histamina 10 vezes. Provou-se que o Detirelix (AC-D-Nal(2)¹, D-Phe(4Cl)², D-Trp³, D-hArg(Et)₂ ⁶, D-Ala¹⁰] é um poderoso antagonista (L. A. Adams et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62, 58, 1986) mas possui efeitos secundários hipotensivos e bradicárdicos (C. H. Lee et al., Life Sei., 45. 67, 1989). Os antagonistas chamados Nal-Glu-GnRHant retêm a potência de inibição da ovulação e possuem uma actividade de libertação de histamina in vitro marcadamente inferior (J. E. Rivier et al.,

J. Med. Chem. 29 , 1846-1851, 1986), mas permanece a possibilidade de resposta alérgica local em alguns pacientes humanos. A introdução de N⁵-nicotinoil-lisina nas posições 5,6 e de N⁶-isopropil-lisina na posição 8 leva a um composto com actividade anti-ovulatória elevada e actividade de libertação de histamina desprezável (Ljungqvist et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 8236-8240, 1988). A modificação de Bajusz et al. (Int. J. Pept. Prot. Res., 32., 425-435, 1988) i.e., a incorporação de citrulina e homocitrulina na posição 6, produziu péptidos não possuindo efeitos secundários edematogénicos nem anafilactóides e possuindo elevado efeito inibidor, como exemplificado pelo Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂. Verificou-se que alguns destes compostos possuíam efeito de inibição sobre o crescimento de vários modelos de tumores animais in vivo e que suprimiam o crescimento de diferentes linhas de células cancerosas humanas (A. V. Schally, em General Gynecology, Vol 6, Parthenon Press, Carnforth, England, 1989, pp. 1-20; Szende et al., J. Natl. Câncer Inst. , 82., 513-517, 1990; Szende et al., Câncer Research, 50, 3716-3721, 1990; E. Korkut et al., Proc. Natl. Acad. Sei. US, aceite para publicação) podendo assim ser potenciais agentes terapêuticos no

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tratamento de diferentes cancros (da próstata, da mama, endometrial, do ovário e pancreático).

Muitos tumores humanos são dependentes de hormonas ou sensíveis a hormonas e contêm receptores de hormonas; p. ex. os carcinomas mamários contêm receptores de estrogénio, progesterona, glucocorticóides, LH-RH, EGF, IGF-I, e de somatostatina. Também foram detectados péptidos receptores de hormonas em leucemia aguda, no cancro da próstata, da mama, pancreático, do ovário, do endométrio, no cancro do cólon, e em tumores no cérebro (Μ. N. Pollak, et al., Câncer Lett. 38., 223-230, 1987;

F. Pekonen et al., Câncer Res., 48., 1343-1347, 1988; M. Fekete et al., J. Clin. Lab. Anal. 3. 137-147, 1989; G. Emons et al., Eur. J. Câncer Oncol., 25 215-221, 1989). As nossas recentes pesquisas (M. Fekete et al., Endocrinology, 124 946-955, 1989;

M. Fekete et al., Pancreas £ 521-528, 1989) revelaram que tanto os análgos de agonistas como de antagonistas do LH-RH se ligam às membranas de células cancerígenas da mama humanas, e também às membranas celulares do cancro pancreático embora se pense que este último tumor seja independente de hormonas. Pôs-se em evidência que os péptidos biologicamente activos tais como a melanotropina (MSH), o factor de crescimento epidérmico, a insulina e os análogos agonistas e antagonistas da LH-RH (L. Jennes, et al., Peptides 5. 215-220, 1984) são internalizados pelas células a que se destinam por endocitose.

SUMÁRIO DO INVENTO

O presente invento refere-se a novos decapéptidos antagonistas análogos da LH-RH hipotalâmica os quais possuem elevada actividade anti-ovulatória e antineoplástica, e são isentos de efeitos secundários anafilactóides e se crê que sejam isentos de efeitos endematogénicos.

Os compostos deste invento são representados pela fórmula I na qual

X-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶ (AY₂) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

I

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-7R¹ é D-Phe, D-Phe(4C1), D-Nal(l) ou D-Nal(2),

R² é D-Phe ou D-Phe(4H1),

R³ é D-Trp, D-Phe, D-Phe(4H1), D-Nal(l), D-Nal(2) ou D-Pal(3), rB é Tyr ou Arg,

R⁶ é D-Lys ou D-Orn,

Hl é fluoro, cloro ou bromo,

X é um grupo alcanoílo inferior com 2-5 átomos de carbono,

A é um resíduo diaminoacilo possuindo a fórmula

CH₂-(CH₂)_m-CH-(CH₂)_n-CO- II nh₂ nh₂ na qual m é 0 ou 1, n é 0 ou 1,

Y é hidrogénio ou Y¹ ou Y², em que

Y¹ é um grupo acilo derivado de ácidos carboxílicos alicíclicos ou alifáticos de cadeia linear ou ramificada possuindo entre 3 e 12 átomos de carbono ou de ácidos carboxílicos aromáticos com 6 ou 10 átomos de carbono anel,

Y² é um grupo carbamoílo ou um grupo alquil-C^-Cg-carbamoílo possuindo a fórmula

H-(CH₂)_n-NH-CO- III na qual n é 0-3.

Os sais terapeuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula I estão incluídos dentro do âmbito deste invento.

Os péptidos de fórmula I podem ser sintetizados por síntese peptídica em solução, clássica, ou preferivelmente , pela técnica em fase sólida utilizando resina de metilbenzil-hidrilamina (MBHA), de benzidrilamina (BAH) ou resina de álcool

2-metoxi-4-alcoxibenzílico (Sasrin) com um ligante amido adequado.

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Este processo proporciona péptidos intermediários e/ou péptidos intermediários-resinas de fórmula IV:

X¹-R¹-R²-R³-Ser-(X⁴)-R⁵-(X⁵)-R⁶(X⁶)-Leu-Arg(X⁸)-Pro-D-Ala-NH-X¹⁰ IV na qual

R¹, R², R³, R⁸, e R⁸ são definidos como anteriormente, X¹ é um grupo alcanoílo inferior com 2-5 átomos de carbono,

X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hidroxilo de Ser,

X⁵ é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hidroxilo fenólico de Tyr, ou um grupo protector para o grupo guanidino de Arg,

X⁶ é hidrogénio ou um grupo protector para Lys, Orn,

X⁸ é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo guanidino de Arg,

X¹⁰ é hidrogénio ou grupo de ligação (espaçador) incorporado numa resina.

Para assegurar as reacções selectivas na cadeia lateral diaminoalcanoílo de R⁸ para se obter péptidos de fórmula I, preparam-se péptidos intermediários de fórmula V por processos em fase sólida, como péptidos de fórmula I com a excepção de que é incorporado R⁸[A(X^8/)₂] adequadamente protegido em vez de R⁸(X⁸) na posição 6:

X¹-R¹-R²-R³-Ser(X⁴)-R⁵-(X⁵)-R⁸[A(X⁸')₂]-Leu-Arg(X⁸)-Pro-D-Ala-NH-X¹⁰ V na qual

X¹, R¹, R², R³, R⁸, R⁸ e A são definidos como anteriormente, X¹,

X⁴, X⁵ e X⁸ são definidos como anteriormente mas não são hidrogénio,

X⁸' é hidrogénio ou um grupo protector da cadeia lateral diamino, X¹⁰ é um grupo de ligação incorporado numa resina.

Para preparar os compostos de fórmula I nos quais Q é

A(Y¹)2 ou A(Y²)2 têm-se utilizado quatro esquemas reaccionais

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diferentes:

a) Fazem-se reagir péptidos intermediários de fórmula IV (na qual R¹, R², R³, R⁵, R⁶ e X¹ são definidos como anteriormente, X⁴, X⁵, X⁶, Χθ, e X¹® são hidrogénio) com A(Y¹)2 ou A(Y²)₂ pré-formados em que A, Y¹ e Y² são definidos como anteriormente.

b) Alternativamente, utilizam-se compostos de fórmula V (na qual R¹, R², R³, R⁵, R⁶ e X¹ são definidos como anteriormente, X⁴, X⁵ são grupos protectores de cadeias laterais, X⁶' é hidrogénio e X¹⁰ é um grupo de ligação da resina) como péptidos intermediários. Os compostos de fórmula I, em que Y é Y·*· são produzidos por acilação directa do péptido intermediário de fórmula V com um halogeneto de acilo ou anidrido de acilo, seguida por separação dos péptidos da resina e remoção dos grupos protectores num só passo.

c) De acordo com outro processo, prepara-se o R⁶[A(Y2)] antecipadamente fazendo reagir um grupo R⁶ protegido adequadamente com A e depois com Y, ou com A(Y2) pré-formado e seguido por incorporação no péptido durante a síntese peptídica em fase sólida.

d) Os dois grupos amino livres de A dos péptidos intermediários de fórmula V (na qual R¹, R², R³, R⁵, R®, A e X¹ são definidos como anteriormente, X⁴, x⁵, x⁶', X⁸ e X¹⁰ são hidrogénio) são acilados com acil-imidazolo.

O invento proporciona também processos para separar um ou mais grupos protectores e/ou clivar os péptidos da resina suporte, para a purificação de um péptido sintetizado e sua conversão num sal não tóxico, farmaceuticamente aceitável, quando os sais retêm a actividade biológica desejada do composto progenitor.

Os péptidos deste invento inibem a ovulação de ratazanas fêmeas em dosagens inferiores a 0,15-1,0 jtg/kg de peso corporal, quando administrados s.c. a cerca do meio-dia no dia do proestro. Estes péptidos possuem um longo efeito de actuação sobre

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a supressão dos níveis de LH, FSH e testosterona quando são injectados em ratazanas macho castradas em doses de 0,5-2,0 microgramas/kg de peso corporal. Os péptidos 7 e 8 induzem uma diminuição significativa nos níveis de LH durante mais de 24 horas (p<0,01). Quarenta e oito horas após a injecção, ambos os antagonistas mostraram inibição significativa (p<0,05) numa dose de Sjug. Nessa altura, o péptido 8 foi activo mesmo numa dose de

1,25 p>g (p<0,05). A maioria dos compostos de fórmula I mostram uma alta afinidade para os receptores de membrana de pituitárias de ratazanas e cancros da mama humanos. Em testes de citotoxicidade, em culturas de linhas de células de cancro da mama e da próstata humanos, alguns análogos inibem poderosamente a incorporação de ³H-timidina.

A inibição do crescimento do cancro da próstata Dunning R3327H foi posta em evidência após o tratamento de ratazanas com o péptido 8. 0 tempo de duplicação do tumor aumentou para 42 dias em comparação com os 12 dias do grupo de controlo. 0 peso corporal não variou durante o tratamento, no entanto os pesos dos testículos, das vesículas seminais e da próstata ventral reduziram-se grandemente no grupo que recebeu o péptido 8. Os resultados indicaram que o péptido 8, libertado a partir de sistemas de libertação sustida, podem suprimir eficazmente o crescimento dos cancros da próstata.

Proporciona-se uma composição farmacêutica por mistura do composto de fórmula I com transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluindo microcápsulas (micro-esferas) ou microgrânulos (micropartícuias) formuladas a partir de poli-(DLlactido-co-glicólido) para distribuição sustida.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Para conveniência na descrição deste invento, utilizam-se as abreviaturas convencionais para os aminoácidos, péptidos e seus derivados, como são geralmente aceites na arte dos péptidos e como recomendado pela IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature [European J. Biochem., 13 8, 9-37 (1984)].

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As abreviaturas para os resíduos de aminoácido individuais são baseadas no nome trivial do aminoácido, p. ex., pGlu é ácido piroglutâmico, His é histidina, Trp é triptofano, Ser é serina, Tyr é tirosina, Lys é lisina, Orn é ornitina, Leu é leucina, Arg é arginina, Pro é prolina, Gly é glicina, Ala é alanina e Phe é fenilalanina. Quando o resíduo de aminoácido possui formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que se representa a menos que indicado em contrário.

As abreviaturas dos aminoácidos incomuns empregues no presente invento são as seguintes: A₂pr é ácido 2,3-diaminopropiónico, A₂bu é ácido 2,4-diaminobutírico, Nal(2) é

3- (2-naftil)alanina, D-Pal(3) é 3-(3-piridil)alanina, Phe(4Cl) é

4- clorofenilalanina.

As sequências peptídicas são escritas de acordo com a convenção segundo a qual o aminoácido N terminal está à esquerda e o aminoácido C terminal está à direita.

Outras abreviaturas utilizadas são:

AcOH	ácido acético
Ac₂O Boc	anidrido acético terc-butoxicarbonilo
Bz	benzoílo
Bzl	benzilo
car	carbamoílo
CHC	ciclo-hexanoílo
DCB	2,6-diclorobenzilo
DCC	N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida
DCM	diclorometano
DIC	N,N'-di-isopropilcarbodiimida
DMF	dimetilformamida
EtCar	etilcarbamoílo
FMOC	fluorenilmetiloxicarbonilo
HOBt	1-hidroxibenzotriazolo
HOPCP	pentaclorofenol
HPLC	cromatografia líquida de elevado rendimento

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-12iPrOH álcool isopropílico

LAU laurilo

MeCN acetonitrilo

MeOH álcool metílico

OSu éster N-hidroxi-succinamida

PRL propionilo

TEA trietilamina

TFA ácido trifluoroacético

Tos 4-toluenossulfonilo

Z(2-C1) 2-clorobenziloxicarbonilo

Z benziloxicarbonilo

Os compostos que são concretizações especialmente preferidas do presente invento possuem a estrutura:

X-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶-(AY₂) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ I na qual

R¹ é D-Nal(2)_z

R² é D-Phe(4C1),

R³ é D-Trp, ou D-Pal(3), r5 θ _Ty_{r ou} ^_Cg_/

R⁶ é D-Lys ou D-Orn,

X é acetilo,

A é A₂pr ou DL-A₂bu,

Y é γϊ ou Y², em que

Y¹ é formilo, acetilo, propionilo, butirilo, i-butirilo, ciclo-hexanoílo ou benzoílo,

Y² é carbamoilo, N-metilcarbamoílo ou N-etilcarbamoílo.

As concretizações mais particularmente preferidas são:

1. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Car) ₂ ] -

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

2. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys-[A₂pr(Ac)2^^-

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

3. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[ A₂pr(For)21~

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-13-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

4. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(EtCar)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

5. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(CHC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

6. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Bz)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

7. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(Car)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

8. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(Ac)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

9. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[ A₂pr(EtCar)₂ J-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

10. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(For) ₂ ] -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

11. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(PRL)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

12. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(CHC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

13. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(Bz)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

14. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(Ac)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

15. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(For)₂]-

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

16. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(Car) ₂ ] -

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

17. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu-(EtCar) ₂ ] -

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

18. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(PRL)₂]-

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

19. Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4C1) -D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-Lys [DL-A₂bu(LAU) ₂ ] -

-Leu-Arg—Pro-D-Ala-NH₂,

20. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(Bz)3]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

21. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(CHC) ₂ ] -

-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

22. Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4C1) -D-Trp-Ser-Arg-D-Lys [ A₂pr (Car) ₂ ] -Leu-

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-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

23. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Ac)₂]-Leu-

-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

24. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[ A₂pr(For)₂]-Leu-

-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

25. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

26. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂,

As propriedades antagonistas de CHRH dos compostos deste invento tornam os compostos úteis na medicina humana e veterinária. Por exemplo, os compostos de fórmula I encontram uso como agentes para a revelação de complicações da disponibilidade fisiológica indesejável de gonadotropinas pituitárias num mamífero. Estas complicações incluem puberdade precoce; tumores dependentes de hormonas tais como tumores da próstata malignos e benignos, p.ex., amenorreia secundária; endometriose e doenças císticas mamárias e ovárias tanto nos animais como nos seres humanos. Os compostos de fórmula I são também úteis para a regulação da ovulação, tornando-os, assim, agentes úteis para o controlo da fertilidade, p. ex., como contraceptivos pré-coito ou pós-coito, para a sincronização do estro em gado e para melhorar o método do ritmo. Os compostos são também úteis para a regulação da gonadotropina da menopausa humana, da hormona de estimulação do folículo (FSH) e da hormona luteinizante (LH) durante períodos perimenopausicos e pós-menopausicos na mulher. Uma vez que suprimem a espermatogénese e o nível de testosterona no macho, podem ser potenciais para uso na contracepção masculina.

Os péptidos do invento são por vezes administrados na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis, não tóxicos, tais como sais de adição de ácido. São exemplos destes sais de adição de ácido o hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartarato e similares.

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-15As microcápsulas ou micropartículas dos péptidos formulados a partir de poli(DL-lactido-co-glicólido) podem ser os sistemas de distribuição sustida preferidos. Pode-se também utilizar a administração intravenosa em solução salina isotónica, soluções de tampão fosfato ou similares.

As composições farmacêuticas conterão usualmente o péptido em conjunto com um transportador convencional, farmaceuticamente aceitável. Usualmente a dosagem estará entre cerca de 1 e 100 microgramas do péptido por quilograma de peso corporal do hospedeiro quando administrada por via intravenosa. Globalmente, o tratamento de pacientes com estes péptidos efectua-se geralmente da mesma maneira que o tratamento clínico utilizando outros agonistas e antagonistas da LHRH.

Estes péptidos podem ser administrados a mamíferos por via intravenosa, sub-cutânea, intramuscular, intranasal, para se conseguir o efeito antagonista da LHRH e antitumoral. As dosagens eficazes variarão com a forma de administração e com a espécie particular do mamífero em tratamento. Um exemplo de uma forma de dosagem típica é uma solução salina fisiológica contendo o péptido, solução esta que é administrada para proporcionar uma dose diária na gama de cerca de 0,01 a 0,05 mg/kg de peso corporal.

Embora o invento tenha sido descrito em relação às suas concretizações preferidas, deve-se entender que poderão ser feitas variações e modificações óbvias para os peritos na arte sem afastamento do âmbito do invento, o qual se apresenta nas reivindicações em anexo. Podem ser empregues no invento substituições conhecidas na arte que não diminuam significativamente a sua eficácia.

PROCEDIMENTOS DE ENSAIOS

Os compostos deste invento exibem um poderoso efeito sobre a libertação de gonadotropina pela pituitária, ligam-se a membranas de células tumorais e inibem a incorporação de [³H]timidina no ADN em culturas celulares.

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SHAL3.0.011ΡΤ (a) actividades de inibição da LH-RH

Ensaiou-se a capacidade dos compostos para influenciar a libertação de LH in vitro utilizando um sistema de células de pituitária de ratazana superfundido [S. Vigh e A. V. Schally, Peptides, 5 Suppl.X, 241-247 (1984); V. Csernus e A. V. Schally, em Neuroendocrine Research Methods, Ed. B. Greenstein, Harwood Academic Publishers, London, (1990)].

Ensaiou-se o efeito inibidor dos péptidos sobre LH-RH como se segue: Cada péptido é perfundido através das células durante 9 min. (3 ml de perfundido) a 1 nM. Imediatamente a seguir a isto, administra-se uma mistura contendo a mesma concentração de péptido e LH-RH 3 nM durante 3 min. Isto é seguido por quatro infusões consecutivas de LH-RH 3 nM durante 3 min. (1 ml de perfundido) com intervalos de 30 min. (30, 60, 90, 120 min.). Determina-se o teor em LH das fracções de 1 ml recolhidas por radio-imunoensaio (RIA).

(b) Determina-se a actividade anti-ovulatória in vivo em ratazanas de ciclos de quatro dias como descrito em [A. Corbin e C. W. Beattie, Endocr. Res. Commun., 2, 1-23 (1975)].

(c) Ligação ao receptor.

Determina-se a afinidade dos péptidos para as membranas de células de cancro da mama humano e de pituitária de ratazana utilizando LHRH e [D-Trp⁶]LHRH marcados. 0 ensaio é realizado de modo semelhante ao descrito por T. Kadar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. Usa, 85, 890-894 (1988) e M. Fekete et al., Endocrinology, 124, 946-955 (1989).

(d) Mediu-se o efeito in vivo sobre os níveis de LH e FSH como descrito por L. Bokser et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. US, aceite para publicação). Ratazanas macho castradas, pesando 350-410 gramas, anestesiadas com uretano, foram injectadas por via subcutânea com péptido 7 e 8 em doses de 1,25 /xg e 5,0 Mg. Recolheram-se amostras de sangue da veia jugular antes da injecção el, 2, 3, 4, 6, 24 e 48 horas após a administração dos péptidos. Os animais de controlo foram injectados apenas com

622

SHAL3. Ο.011ΡΤ

-17solução salina. Determinaram-se os níveis de LH e FSH por RIA específicos.

(e) Teste de citotoxicidade

Ensaia-se a capacidade dos péptidos de fórmula I para inibirem a incorporação de [³H]timidina no ADN de culturas em monocamada da linha de células de tumor mamário humano MCF-7, como descrito [V. K. Sondak et al., Câncer Research, 44, 1725-1728 (1984); F. Holzel et al., J. Câncer Res.Clin. Oncol. 109. 217-226 (1985); M. Albert et al., J. Câncer Res. Clin. Oncol. 109. 210-216 (1985)].

(f) Efeito antitumoral in vivo

Testou-se a inibição do crescimento de tumores cancerosos em ratazanas com compostos de fórmula I como descrito por Szende et al., (J. Natl. Câncer Inst., 82., 513-517, 1990), Szende et al., Câncer Research, 50., 3716-3721, 1990), por A. V. Schally e

T. Redding (Proc. Natl. Acad. Sei. US, 84., 7279-7282, 1987), e por E. Korkut et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. US, aceite para publicação). Dissolveu-se o péptido 8 em propilenoglicol aquoso a 45% e administrou-se numa dose de 25 ^g/dia a partir de uma minibomba ALZET a ratazanas macho possuindo o adenocarcinoma da próstata de ratazanas bem diferenciado Dunning R3327, dependente de androgénio. Mediram-se os tumores semanalmente com microcalibradores e calcularam-se os volumes dos tumores. A duração do tratamento foi de 8 semanas, mudando as minibombas no final da 4‘ semana.

SÍNTESE DOS PÉPTIDOS

Podem-se preparar os péptidos do presente invento por quaisquer técnicas que sejam conhecidas pelos peritos na arte dos péptidos.

Pode-se encontrar um sumário das técnicas assim disponíveis em M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Heildelberg, 1984. A síntese clássica em solução está descrita em detalhe no tratado Methoden der Organishe Chemie

622

SHAL3.0.011ΡΤ *β

18(Houben-Weyl), Vol. 15, Synthese von Peptiden, Partes I e II, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. As técnicas de síntese exclusivamente em fase sólida estão apresentadas no livro de texto de J. M. Stewart e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2^a ed.) e na revisão de G. Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 705-739, 1987.

Sintetizaram-se os péptidos básicos deste invento pelo processo em fase sólida, mas em alguns casos construiu-se a cadeia lateral na posição 6 pelo procedimento clássico. Na síntese em fase sólida, adicionam-se por passos os aminoácidos adequados protegidos (por vezes péptidos protegidos) na direcção C->N desde que o aminoácido do terminal C tenha sido apropriadamente ligado (ancorado) a um suporte sólido inerte (resina). Após a conclusão do passo de acoplamento, remove-se o grupo protector do terminal N deste resíduo de aminoácido recentemente adicionado e então adiciona-se o aminoácido seguinte (adequadamente protegido), e assim por diante. Após se terem ligado os aminoácidos desejados na sequência adequada, separa-se o péptido do suporte e liberta-se do(s) restante(s) grupo(s) protectore(s) sob condições que sejam destrutivas no mínimo possível para os resíduos na sequência. Isto tem que ser seguido por uma purificação prudente e uma caracterização escrupulosa do produto sintético, de modo a assegurar que a estrutura desejada foi, de facto, a que se obteve.

Concretizações preferidas da síntese

Um processo particularmente preferido para a preparação dos compostos de fórmula I no presente invento é a síntese em fase sólida, mas estes compostos podem também ser sintetizados combinando os processos de fase sólida e clássico (em solução). Neste processo particularmente preferido, protege-se a função α-amino dos aminoácidos por um grupo sensível a ácidos ou bases. Estes grupos protectores devem possuir as propriedades de serem estáveis às condições de formação da ligação peptídica, sendo ao mesmo tempo facilmente removíveis sem destruição da cadeia peptídica em crescimento ou racemização de qualquer um dos

622

SHAL3.0.011ΡΤ —19— çentros quirais nele contidos.

Os péptidos de fórmula I são preferivelmente preparados a partir de péptidos intermediários de fórmula IV:

X¹-R¹-D-Phe(4H1)-R³-Ser(X⁴)-R⁵(X⁵)-R⁶(X⁶)-Leu-Arg(X⁸)-Pro-D-Ala-NH-X¹⁰ IV na qual

R¹, R³, R⁵, R⁶, Hl e X¹ são definidos como anteriormente,

X⁴ é um grupo protector para o grupo hidroxilo da serina, tal como benzilo (Bzl) ou 2,6-diclorobenzilo (DCB). O grupo protector preferido é o Bzl.

X⁵ é benzilo, 2-Br-benziloxicarbonilo ou DCB (preferido) para proteger o hidroxilo fenólico do R⁶Tyr;

é Tos (preferido), nitro ou metil-(t-butilbenzeno)sulfonilo para proteger o grupo guanidino se R⁶ for Arg, χ6 é um grupo protector para o grupo amino da cadeia lateral de Lys ou Orn, tal como Z, Z(2-C1) (preferido) ou FMOC,

X⁸ é um grupo protector para a Arg e pode ser nitro, metil-(t-butilbenzeno)sulfonilo ou Tos (preferido),

X¹⁰ é uma amida para proteger o grupo benzidrilo ou metilbenzidrilo incorporado na resina suporte; para a síntese de amidas de péptidos, é preferido o copolímero comercialmente disponível benzidrilamino-poliestireno-divinilbenzeno 2%.

Inicia-se a síntese de péptidos de fórmula IV em fase sólida pela ligação de D-Ala protegido com Boc a uma resina de benzidrilamina em CH₂C1₂. Realiza-se o acoplamento utilizando DIC ou DIC/HOBt à temperatura ambiente. Após a remoção do grupo Boc, realiza-se o acoplamento de sucessivos aminoácidos protegidos (aplica-se cada um num excesso molar de 3) em CH₂C1₂ou em misturas de DMF/CH₂C1₂ dependendo da solubilidade dos Boc-aminoácidos. Preferivelmente, segue-se o sucesso da reacção de acoplamento em cada etapa da síntese pelo teste da ninidrina como descrito por Kaiser et al., [Anal. Biochem. 3.4, 595 (1970)]. Em casos onde ocorre o acoplamento incompleto,

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-20repete-se o procedimento de acoplamento antes da remoção do grupo protector do alfa-aminoácido antes da reacção com o aminoácido seguinte.

Após se ter completado a sequência de aminoácidos desejada dos péptidos intermediários de fórmula IV, realiza-se a acetilação do terminal N utilizando Ac₂O/TEA, e trata-se então o péptido-resina com HF líquido na presença de anisolo para se obterem os péptidos de fórmula IV nos quais X⁴, X^, Χθ, X⁸ e X·*·⁰são hidrogénio.

Estes péptidos são convertidos nos péptidos de fórmula I (na qual Y é Y¹) pelo processo de acoplamento de carbodiimida com ácido 2,3-bis-benzoildiaminopropiónico, ácido 2,3-bis-ciclo-hexanoildiaminopropiónico, ácido 2,3-bis-lauroildiaminopropiónico, ácido 2,4-bis-benzoildiaminobutírico, ácido 2,4-bis-ciclo-hexanoildiaminobutírico, ácido 2,4-bis-lauroildiaminobutírico, pré-formados.

Para produzir compostos de fórmula I, na qual Y¹ é alcanoílo inferior e Y² é carbamoílo inferior, é preferido o segundo processo sintético devido à elevada hidrofilicidade dos substituintes na cadeia lateral da lisina⁶ , i.e. por exemplo, do ácido 2,3-bis-formildiaminopropiónico. Estes tipos de péptidos são preparados a partir de compostos de fórmula V:

χΙ-Rl-D-Phe(4H1)-R³-Ser(X⁴)-R⁵(X⁵)-R⁶[A(X⁶')₂]-Leu-Arg(X⁸)-Pro-D-Ala-NH-X¹⁰ VI na qual

R¹, R³, R⁵, R⁶, Hl e X¹ são definidos como anteriormente,

X⁵ é benzilo, 2-Br-benziloxicarbonilo ou DCB (preferido) para proteger o hidroxilo fenólico do R^ Tyr; ou é Tos (preferido), nitro ou metil-(t-butilbenzeno)sulfonilo para proteger o grupo guanidino se R⁵ for Arg,

622

SHAL3.0.011ΡΤ

X⁶' é um grupo protector de amino para a cadeia lateral diaminoacilo da Lys, tal como Z, Z(2-C1) ou FMOC,

X⁸ é adequado para proteger o grupo Arg; tal como nitro, metil-(t-butilbenzeno)sulfonilo ou Tos (preferido),

X¹⁰ é um grupo benzidrilo ou metilbenzidrilo protector de amida incorporado na resina suporte; para a síntese de amidas de péptidos, é preferido o copolímero disponível comercialmente benzidrilamino-poliestireno-divinilbenzeno 2%.

A preparação de todos os péptidos intermediários protegidos de fórmula V é realizada por síntese peptidica em fase sólida, como descrito para os péptidos que possuem a fórmula IV, mas incorpora-se um resíduo R⁶(A) adequadamente protegido, preferivelmente Boc-R⁶[A(FMOC)₂], na posição 6 em vez de Boc-R⁶X⁶. 0 grupo protector em A é escolhido de modo a ser selectivamente removível, ao passo que outros grupos protectores permanecem intactos durante a remoção dos dois X⁶*. Este passo pode ser resolvido por exemplo clivando os grupos bloqueadores FMOC com piperidina proporcionando péptidos de fórmula Va na resina:

X¹-R¹-R²-R³-Ser(X⁴)-R⁵(X⁵)-R⁶(A)-Leu-Arg(X⁸)-Pro-D-Ala-NH-X¹⁰ Va na qual

X¹, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ e A são definidos como anteriormente , e X⁴, Χ^, x⁶ e X^⁰ não são hidrogénio.

Acilam-se, então, os grupos amino livres na posição 6 com uma mistura ácido fórmico-Ac₂0 ou com halogenetos ou anidrido de ácido acético, de ácido propiónico ou de ácido piválico para se obterem os compostos de fórmula I, na qual Y é Y¹ após desprotecção.

A separação dos grupos protectores e a clivagem dos péptidos da resina ocorre após a formação da cadeia lateral em

Numa síntese alternativa, obtêm-se péptidos de fórmula Vb

622

SHAL3.0.011ΡΤ

completamente desprotegidos por desprotecção dos péptidos intermediários de fórmula V nos quais é preferivelmente incorporado Boc-R⁶ [ A( Z) 2 ] na posição 6 em vez do Boc-R⁶[A-(FMOC)₂]:

X¹-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶ (A) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

Vb na qual

X¹, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ a A são definidos como anteriormante.

o processo de produção de péptidos de fórmula I com a cadeia lateral A(Y²)₂ compreende fazer reagir um péptido de fórmula Vb com uma fonte adequada de cianato, adequadamente cianatos metálicos, p. ex. cianato de potássio ou um isocianato de N-alquilo, p. ex. isocianato de N-etilo.

Uma maneira fácil de produzir compostos de fórmula I em que Y é Y¹ é a acilação directa do resíduo diamino na posição 6 de péptidos de fórmula Vb com uma quantidade equivalente de halogeneto de acilo, com uma mistura AcO₂/HCOOH, com acetil- ou propionil-imidazilo. As reacções são simples originando compostos únicos apesar da presença do grupo OH livre na serina^.

Um processo sintético alternativo para a preparação de péptidos de fórmula I é a incorporação do diaminoacil-R⁶ bis-substituído protegido, adequado, em vez do grupo R⁶ protegido. A síntese é realizada exactamente como mencionado anteriormente com a excepção de se incorporar Boc-R⁶(AY₂) no péptido em vez de Boc-R⁶(X⁶) no quinto passo da síntese.

PURIFICAÇÃO DE PÉPTIDOS

Purificaram-se produtos sintéticos brutos (>500 mg) num sistema de HPLC preparativa BECKMAN Prep-350 equipado com uma coluna DYNAMAX MACRO (41,4 x 250 mm) com enchimento de sílica gel C18 esférica (tamanho dos poros: 300 Ã, tamanho das partículas: 12 gm) (RAININ Inc., Co., Woburn, MA) (Coluna A). A

622

SHAL3.0.011ΡΤ

purificação de quantidades mais pequenas de péptidos (<250 mg) foram realizadas num sistema de HPLC BECKMAN (Modelo 142) utilizando uma coluna DYNAMAX MACRO (21,2 x 250 mm) com enchimento do mesmo meio, como anteriormente (Coluna B). Para purificar péptidos pesando <50 mg, utilizaram-se uma coluna de fase inversa, VYDAC Protein & Peptide c^s de 10 x 250 mm (tamanho dos poros: 300 Á, tamanho das partículas: 5 /xm) (ALTECH, Deerfield, IL) (Coluna C) ou uma coluna W-POREX C·^ de 10 x 250 mm (tamanho dos poros: 300 Â, tamanho das partículas: Mm) (Phenomenex, Rancho Paios Verdes, CA) (Coluna D). As colunas foram eluidas com o sistema de solventes i que consiste em (A) TFA aquoso a 0,1% e (B) TFA a 0,1% em acetonitrilo aquoso a 70%, usualmente na forma de um gradiente. Monitorizou-se o eluente da coluna com detectores UV operando a 230 ou 280 nm. Realizou-se a cromatografia à temperatura ambiente.

HPLC ANALÍTICA

Realizou-se a análise dos péptidos brutos e purificados com um cromatógrafo de fase líquida Hewlett-Packard Modelo 1090 equipado com um detector de série de díodos operando a 220 e 280 nm e uma coluna de fase inversa W-POREX C^S de 4,6 x 250 mm (tamanho dos poros: 300 Â, tamanho, das partículas: 5 M“) (Coluna E). Manteve-se um caudal de 1,2 ml/min do sistema de solventes i. ou do sistema de solventes ii que consiste de (A) acetato de amónio 0,05 M pH=7,0 e (B) acetato de amónio 0,05 M em acetonitrilo aquoso a 65% e realizaram-se as separações à temperatura ambiente.

ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS

Hidrolizam-se amostras de péptidos a 110’C durante 20 h em tubos selados, sob vácuo, contendo ácido metanossulfónico 4 M. Realizam-se as análises com um analisador de aminoácidos Beckman 6300.

622 β

SHAL3.Ο.011ΡΤ r^'

-24PREPARAÇÃO I ácido bis-benzoíl-2,4-diaminopropiónico Ia ácido bis-benzoíl-2,4-DL-diaminobutírico Ib

Adicionou-se, gota a gota, à solução de 140 mg (1 mmol) de DL-A₂pr em 2 ml de NaOH a 10%, a 4°C, 1,5 ml de cloreto de benzoílo a 25% em dioxano. Agitou-se a mistura reaccional durante 24 horas, a 4°C, e depois extractou-se o composto do título com acetato de etilo e purificou-se por recristalização em clorofórmio-hexano. Preparou-se (Bz)₂-DL-A₂bu de maneira semelhante mas utilizando DL-A₂bu em vez de A₂pr. Os factores de retenção são 0,60 e 0,69, respectivamente, em placas de TLC de sílica gel com o sistema de solventes acetato de etilo-piridina-ácido acético-água 60-20-6-11.

PREPARAÇÃO II ácido bis-ciclo-hexanoíl-2,3-diaminopropiónico lia ácido bis-ciclo-hexanoíl-2,3-DL-diaminobutírico Ilb

Agitou-se 140 mg (1 mmol) de DL-A₂pr.HCl em 2 ml de NaOH a 10% durante 24 horas à temperatura ambiente com 1,6 ml (3 mmol) de cloreto de ciclo-hexanocarbonilo a 25% em dioxano adicionado gota a gota. Purificou-se o composto do título por extracção com solventes e recristalizou-se em benzeno-hexano.

Realizou-se a preparação Ilb de uma maneira similar com a excepção de se ter utilizado 191 mg (1 mmol) de ácido DL-2,4-diaminobutírico·2HC1 em vez do ácido 2,3-diaminopropiónico. Os factores de retenção são 0,69 e 0,79, quando cromatografados sobre sílica gel de TLC num sistema de solventes como se descreveu na preparação I.

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-25PREPARAÇÃO III

BOC-d-Lys(A₂pr)-OH Illa

Boc-D-Lys(DL-A₂bu)-OH Illb

A uma solução em DMF (4 ml) de um anidrido misto, preparado a partir de Z₂-A₂pr (0,72 g) e cloroformato de etilo (0,2 ml) na presença de TEA (0,28 ml), adicionaram-se 4 ml de DMF contendo 0,5 g de N^a-Boc-D-Lys e 0,3 ml de TEA, com agitação a 0°C. Após duas horas, concentrou-se a mistura reaccional até um óleo sob pressão reduzida, dissolveu-se em água e acetato de etilo e acidificou-se com KHSO₄ 1 M. Lavou-se a fase orgânica com água, secou-se sobre Na₂SO₄ e evaporou-se sob vácuo. Dissolveu-se 0,5 g deste dipéptido protegido em 25 ml de ácido acético aquoso a 50% e hidrogenou-se à temperatura ambiente durante 2 horas na presença de 0,1 g de Pd/C (10%). Filtrou-se a mistura reaccional e evaporou-se até à secura. Limpou-se o produto branco resultante com éter dietílico, filtrou-se e secou-se.

Preparou-se o produto Illb de uma maneira similar mas acilando com Z₂-DL-A₂bu em vez de Z₂-A₂pr.

PREPARAÇÃO IV (FMOC)₂A₂pr-OH

Dissolveu-se 0,5 g (3,55 mmol) de ácido 2,3-diaminopropiónico em 7,1 ml de NaOH N e adicionou-se gota a gota 2,75 g (excesso de 15%) de FMOC-OSu em 25 ml de acetona enquanto se agitava a mistura reaccional à temperatura ambiente. Após 4 horas de agitação, adicionou-se 3,55 ml de H₂SO₄ N, filtrou-se a mistura reaccional, lavou-se com 3 x 10 ml de água e secou-se ao ar no funil. Recristalizou-se o produto em acetato de etilo-éter de petróleo. Verificou-se a pureza do precipitado branco (pesando 1,9 g) por TLC em sílica-gel com o seguinte sistema de solventes: acetato de etilo-piridina-ácido acético-água = = 120:20:6:11 (R_f=0,62-0,66).

622

SHAL3.0.011ΡΤ —26—

PREPARAÇÃO V

Boc-D-Lys[(FMOC)₂A₂pr]-OH

Suspenderam-se 0,73 g (3 mmol) de N^a-Boc-D-Lys-OH com 0,42 ml (3 mmol) de TEA em 3 ml de DMF aquoso a 50%. Então dissolveram-se 1,8 g (3,2 mmol) de (FMOC)₂A₂pr (Preparação VIII) e 0,37 g de HOBt em 3 ml de DMF e misturou-se com 0,5 ml de DIC a 0°C. Após 10 min adicionou-se esta solução à suspensão de Boc-D-Lys-OH. Com a agitação à temperatura ambiente a mistura tornou-se límpida em 1 hora. Vertendo a mistura para 30 ml de água, obteve-se um precipitado volumoso amarelado que cristalizou por limpeza com éter dietílico e recristalizou-se em solução de MeOH-DCM-hexano (1,2 g). O composto do título provou ser homogéneo por TLC em silica-gel (R_f=0,68-0,72 ) , desenvolvida com o sistema de solventes acetato de etilo-piridina-ácido acético-água 960:20:6:11.

PREPARAÇÃO VI

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂VIa

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂VIb

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂VIc

Ligou-se Boc-D-Ala a lg (cerca de 1 mmol) de resina de benzidrilamina neutralizada, contendo 1 meq de NH₂ (Advanced Chemtech, Louisville, KY) por meio de acoplamento mediado por Ν,Ν'-diisopropilcarbodiimida (DIC)/1-hidroxibenzotriazolo (HOBt) durante 2 horas à temperatura ambiente, em diclorometano ou DMF. Realizou-se o acoplamento sucessivo dos aminoácidos protegidos num vaso reaccional para síntese manual em fase sólida utilizando um excesso molar de 2,5-3,0 dos aminoácidos protegidos de acordo com o esquema que se segue:

622

SHAL3. Ο.011ΡΤ

PASSO

REAGENTES E OPERAÇÕES TEMPOS DE

MISTURA (min)

Acoplamento: Boc-aminoácido em DCM ou

DMF dependendo da solubilidade do ami-60-90 noácido protegido particular, mais DIC

Lavagem com iPrOH (ou DMF e depois iPrOH).2

Lavagem com DCM2

Lavagem com iPrOH2

Lavagem com DCM (três vezes) Desprotecção: TFA a 50% em DCM (duas vezes)

Lavagem com DCM

Lavagem com iPrOH

Neutralização: TEA a 10% em DCM

Lavagem com iPrOH

Neutralização: TEA a 10% em DCM

Lavagem com iPrOH

Lavagem com DCM (três vezes) e 25

Após ligação de Boc-Ala à resina, acoplaram-se então sucessivamente os seguintes aminoácidos pelo mesmo ciclo de passos: Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-D-Lys[Z(2-Cl)] , Boc-Tyr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe(4Cl), e Boc-D-Nal(2).

Utilizando Boc-Arg(Tos) em vez de Boc-Tyr(Bzl) leva ao péptido resina possuindo a estrutura de Boc-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys[Zl-(2-C1)]-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-RESINA. Da mesma maneira, mudando o Boc-D-Pal(3) para D-Trp na posição 3 resultou no péptido-resina Boc-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys[Zl-(2-C1)]-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-RESINA.

Testou-se o decapéptido-resina (3-3,5 g) contendo o grupo amino N-terminal livre com um excesso de 50 vezes de anidrido

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SHAL3. Ο.011ΡΤ

-28acético e TEA em 30 ml de DMF durante 30 min. Lavou-se então o péptido acetilado-resina com DMF (3 vezes), iPrOH (3 vezes) e DCM (3 vezes) e secou-se no vácuo. A remoção dos grupos protectores e a clivagem do decapéptido da resina foram realizados por tratamento de 1,5-2 g de material com HF líquido (30 ml), anisolo (3 ml) a 0°C durante 45 min. Eliminou-se o fluoreto de hidrogénio sob uma corrente de azoto e precipitou-se o péptido por adição de éter dietílico. Extractou-se então o péptido com ácido acético aquoso a 50% (3 vezes), separou-se da resina por filtração, diluiu-se com água e liofilizou-se.

Purificaram-se os péptidos brutos numa Coluna A com o sistema de solventes i. utilizando um gradiente linear de 40-70% de B durante 60 min para a preparação Via e 20-60% de B durante 80 min para as preparações VIb e VIc. Os tempos de retenção em HPLC para as preparações Via (837 mg), VIb (540 mg) e VIc (521 mg) são 25,5 min, 11,4 min e 18,8 min, respectivamente , quando se utiliza o sistema de solventes í na forma de gradiente linear (30-60% de B durante 30 min). A análise de aminoácidos deu os resultados esperados.

PREPARAÇÃO VII

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bz1)-Tyr(Bz1)-D-Lys(A₂pr) -Leu-Arg( Tos) -Pro-D-Ala-NH-resinaVila

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys(A₂pr) -Leu-Arg(Tos) -Pro-D-Ala-NH-resinavilb

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys (A₂pr) -Leu-Arg (Tos) -Pro-D-Ala-NH-resinaVIIc

Realiza-se a preparação do composto Vila por síntese peptídica em fase sólida de acordo com os procedimentos apresentados no esquema da preparação VI. Constrói-se o decapéptido em dez passos sucessivos acoplando primeiro Boc-D-Ala a 1 g de resina de benzidrilamina, seguido por Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-D-Lys[A₂pr(FMOC)], Boc-Tyr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe(4Cl) e Boc-D-Nal(2). Realiza-se a acetilação N-terminal com um excesso

622

SHAL3.0.011ΡΤ

de 50 vezes de anidrido acético em DMF durante 30 min. Removeram-se os grupos protectores FMOC em A₂pr por tratamento do péptido-resina com 20 ml de piperidina a 50% em DMF durante 18 h e depois lavou-se com DMF (3 vezes), iPrOH (3 vezes) e DCM(3 vezes) ô manteve-se num excicador até à reacção seguinte.

Procedendo de uma maneira similar mas incorporando BocArg(Tos) em vez de Boc-Tyr(Bzl) na posição 5, prepara-se o Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-resina (preparação Vllb). Utilizando Boc-D-Trp em vez de Boc-D-Pal(3) na posição 3 e Boc-Arg(Tos) em vez de Boc-Tyr(Bzl) na posição 5 resulta o Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys-(A₂pr)-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-resina (preparação VIIc).

PREPARAÇÃO VIII

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂VlIIa

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂Vllb

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(A₂pr)— -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂VIIc

Prepararam-se os péptidos VlIIa, VlIIb e VIIIc pela técnica de fase sólida sobre resina de benzidrilamina*HCl de acordo com os procedimentos apresentados no esquema da preparação VI.

Assim, trata-se a resina (0,5 g contendo cerca de 0,5 mmol de NH₂) durante os dez ciclos de acoplamento sucessivos com Boc-D-Ala, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Lys[A₂pr(Z)₂], Boc-Tyr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe(4Cl), Boc-D-Nal(2) e finalmente com Ac₂0/imidazolo para dar um péptido-resina que é depois tratado com HF e anisolo para dar o péptido VlIIa livre contendo D-Lys(A₂pr).

Procedendo de uma maneira similar mas incorporando Boc-D-Trp em vez de Boc-D-Pal(3) na posição 3, preparou-se o péptido VIIIc

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-30livre contendo D-Lys(A₂pr) (500 mg).

Alternativamente, as preparações VlIIa, VlIIb e VIIIc são obtidas a partir das preparações Via, VIB e VIc por acilação com Boc₂”A2P^{r em} carbodiimida, reacção em presença de HOBt. Removem-se então os grupos Boc por tratamento com TFA a 50% em DCM, precipita-se o péptido com éter dietílico, filtra-se e seca-se em vácuo.

Purificaram-se os péptidos brutos numa Coluna A com um gradiente do sistema de solventes i (20-60% de B durante 80 min).

Os tempos de retenção em HPLC de VlIIa, VlIIb e VIIIc são

15,1 min, 10,1 min e 17,5 min, respectivamente, quando se utiliza o sistema de solventes i. na forma de gradiente linear (30-50% de B durante min).

PREPARAÇÃO IX

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys(DL-A₂bu)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

Realiza-se a preparação IX por síntese peptídica em fase sólida como descrito para a preparação VlIIa com a excepção de que se constroi Boc-D-Lys[DL-A₂bu(Z)₂] na cadeia peptídica na posição 6 em vez de Boc-D-Lys[A₂pr(Z)₂]. 0 tempo de retenção em HPLC da preparação IX é 10,4 min quando se utiliza o sistema de solventes i na forma de gradiente linear (35-50% de B durante 15 min).

EXEMPLO 1

Preparou-se o péptido Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-SerTyr-D-Lys-[A₂pr(Ac)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (8) em fase sólida por acetilação dos grupos amino livres da cadeia lateral de Lys substituída com A₂pr da preparação VII (0,3 g) com 470 μΐ de acetilimidazolo na presença de 700 μΐ de TEA. Desprotegeu-se

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-31então o péptido e separou-se da resina num só passo utilizando HF líquido como descrito para a preparação VI. Purificou-se o péptido bruto por HPLC na Coluna B eluida com o sistema de solventes i. utilizando um gradiente linear (25-50% de B durante 45 min).

EXEMPLO 2

Realizaram-se as sínteses de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys-[A₂pr(Bz)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (13) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys-[A₂pr(Bz)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (6) através do acoplamento da preparação VIb e ácido 2,3-bis-benzoildiaminopropiónico (preparação Ia) com carbodiimida. Arrefeceu-se uma solução (200 μΐ de DMF) de 7 mg de preparação la e 3,1 mg de HOBt, a 0°c e depois fez-se reagir com 3,5 μΐ de DIC durante 15 min. Dissolveu-se 36,3 mg de preparação VIb em 200 μΐ de DMF, neutralizou-se com TEA e misturou-se com a solução de éster activo anteriormente preparada e manteve-se a 0°C durante 18 horas. Injectou-se a mistura reaccional directamente na Coluna C e purificou-se por eluição com o sistema de solventes i para dar os compostos 13. (17,6 mg) e 6. (18 mg), respectivamente.

Seguindo o mesmo procedimento, mas acilando as preparações VIb e VIc com A₂pr(Ac)₂, prepararam-se Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Ac)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (2) (19,1 mg) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Ac)₂]Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (23) (17,2 mg).

A acilação das preparações VIb e Via com ácido

2,3-bis-ciclo-hexanoildiaminopropiónico (preparação lia) deu 14,8 mg de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(CHC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (5) e 15,3 mg de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[ A₂pr(CHC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (12), respectivamente.

A reacção da preparação Via com ácido 2,4-bis-benzoildiaminobutírico (preparação Ib) com ácido 2,4-bis-ciclo-

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-32-hexanoildiaminobutírico (preparação Ilb) ou

2,4-bis-lauroildiaminobutírico resultam, respectivamente, nos péptidos Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(Bz)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (20) (16,6 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(CHC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (21).(14,7 mg) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys(DL-A₂bu-(LAU)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (19) (8 mg), respectivamente.

EXEMPLO 3

Realizou-se a síntese de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys-[DL-A₂bu(Car)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (16) por carbamilação dos dois grupos amino livres contidos no péptido intermediário (preparação IX). Dissolveu-se 37 mg da preparação IX em 100 μΐ de DMF e tamponou-se a solução por adição de 15 μΐ de TEA e 30 μΐ de ácido acético. A esta mistura adicionou-se uma solução de 48 mg de cianato de potássio em 100 μΐ de água e manteve-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 48 horas. Isolou-se o péptido do título (15,8 mg) por purificação em Coluna C utilizando o sistema de solventes i..

Procedendo de uma maneira similar mas utilizando as preparações VHIa, Vlllb e VHIc como precursores, prepararam-se os péptidos seguintes: Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(Car)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (7) (12,2 mg),

Ac-D-Nal-(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Car)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (1) (14,7 mg) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(Car)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (22) (11,2 mg).

EXEMPLO 4

Preparou-se o Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(PRL)₂]^_Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (18) por propionilação dos dois grupos amino livres da cadeia lateral da Lys substituída da preparação IX. Dissolveu-se 37 mg do péptido intermadiário em 100 μΐ de DMF, neutralizou-se com 7 μΐ de TEA e

622

SHAL3.0.011ΡΤ

fez-se reagir com 50 μΐ de reagente propionilimidazolo pré-formado durante 24 horas à temperatura ambiente. Submeteu-se a mistura reaccional a HPLC em Coluna C eluida com o sistema de solventes χ. As fracções liofilizadas contendo o péptido puro renderam 13 mg do péptido do título.

Prepararam-se os compostos Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(Ac)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (8) (14,1 mg) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(Ac)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (14) (12,8 mg) pelo processo descrito neste exemplo mas utilizando a preparação VlIIa e a preparação IXa como compostos de partida, respectivamente, e acetilimidazolo como agente acilante.

EXEMPLO 5

Sintetizou-se o péptido Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(PRL)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (11) por síntese peptídica em fase sólida em resina de benzidrilamina (1 g ~ 1 mmol), como descrito para a preparação VI. Construiu-se o decapéptido por acoplamento sucessivo dos seguintes aminoácidos protegidos (ou derivados): Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-D-Lys[A₂pr(PRL)₂], Boc-Tyr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe((4C1) e Boc-D-Nal(2). Após acetilação do grupo amino N-terminal, realizaram-se a remoção dos grupos protectores e a clivagem do decapéptido da resina como se descreveu para a preparação VI. Purificou-se o péptido liofilizado, bruto na Coluna c.

EXEMPLO 6

Realizou-se a síntese de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal-(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(For)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (3) por formilação dos grupos amino livres de um péptido intermediário (VlIIa) com anidrido misto pré-formado a partir de ácido fórmico e anidrido acético. Para preparar este anidrido, deixaram-se reagir 960 μΐ (10 mmol) de anidrido acético com 390 μΐ (10 mmol) de ácido fórmico a 0°C durante 30 min. Dissolveu-se 37 mg de

622

SHAL3. Ο.011ΡΤ

preparação VlIIa em

100 μΐ de DMF, 7 μΐ de TEA e 6,7 μΐ (50 μπιΐηοΐ) do reagente preparado anteriormente e manteve-se a mistura a 0°C durante 1 hora. Conseguiu-se a purificação do péptido 3 por HPLC na Coluna C eluida com o sistema de solventes i e o rendimento foi de 22,8 mg.

Sintetizaram-se da mesma maneira os péptidos Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl) -D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys [A₂pr(For)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂(10 ) , Ac-D-Nal-(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(For)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (15) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe-(4C1)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[ A₂pr(For)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂(24), com a excepção de que se utilizaram como compostos de partida o Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)Ser-Tyr-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (preparação VlIIa), o Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys(DL-A₂bu)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂(preparação IX) e o Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (preparação VIIIc) como compostos de partida.

EXEMPLO 7

Realizou-se a síntese do péptido Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[ A₂pr(EtCar)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ fazendo reagir o péptido intermediário Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (preparação VlIIb) com isocianato de N-etilo. Dissolveu-se 36 mg (20 /ímol) de péptido intermediário em 100 μΐ de DMF, ajustou-se o pH com 14 μΐ (100 μπιοί) de TEA e fez-se reagir o péptido com 3,5 μΐ de isocianato de N-etilo a 0°C durante 10 horas. Injectou-se a mistura reaccional na Coluna C e eluiu-se com o sistema de solventes i para dar o péptido desejado (21,8 mg).

Realizaram-se as sínteses de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(EtCar)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (9) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu(EtCar)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (17), da mesma maneira mas utilizando Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (preparação VlIIa) e Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)73 622

SHAL3.0.011ΡΤ

-35-Ser-Tyr-D-Lys[DL-A₂bu]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

respectivamente.

Tabela 1

Processos de preparação e purificação por HPLC
N^B do péptido	para antagonistas de LH-RH	Tempo de retenção (min)
Processo sintético	Gradiente (% de B/min) para
purificação	análise
1.	3	25 - 50/40	30 - 45/15	12,5
2.	2	30 - 45/45	35 - 50/15	10,0
3.	6	20 - 50/50	35 - 50/15	8,7
4.	7	25 - 45/50	35 - 50/15	11,0
5.	2	30 - 55/50	45 - 60/15	12,0
6.	2	35 - 55/60	45 - 60/15	9/5
7.	3	30 - 60/60	35 - 50/15	8,2
8.	1 & 4	25 - 50/50	35 - 50/15	12,5
9.	7	25 - 45/50	40 - 55/15	10,6
10.	6	30 - 45/45	35 - 50/15	10,3
11.	4	30 - 55/50	35 - 50/15	14,8
12.	2	25 - 45/50	55 - 70/15	11,9
13.	2	25 - 45/50	35 - 50/15	12,3
14.	4	25 - 45/50	35 - 50/15	12,8
15.	6	25 - 40/45	35 - 50/15	12,3
16.	3	35 - 50/45	35 - 50/15	11,8
17.	7	25 - 50/50	35 - 50/15	13,9
18.	4	30 - 50/40	35 - 65/15	14,7
19.	2	50 - 90/60	80 - 95/15	12,0
20.	2	35 - 50/45	45 - 60/15	8,0
21.	2	50 - 80/60	50 - 65/15	10,9
22.	3	30 - 50/40	45 - 60/15	8,0
23.	2	35 - 55/40	45 - 60/15	9/3
24.	6	35 - 55/40	40 - 55/15	12,0
25.	Prep.VIIIa	20 - 50/60	35 - 50/15	9,3
26.	Prep.IX	20 - 50/60	35 - 50/15	9/1

Λ-*

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-36Tabela 2.

Actividade anti-ovulatória e afinidade de péptidos Ac-D-Nal ( 2) -D-Phe ( 4C1) -R³-Ser-Arg-D-Lys [À₂pr ( Y) ₂ ] -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ para receptores de membranas de células do cancro humano da mama.

N⁸ do Péptido péptido	% Bloqueio da da ovulação	Constante de afinidade
K_al	^Ka²
	R³	Y	0,75 Mg 1,5 MU	nM^-1	UM”¹
1	D-Pal(3)	Car		7,07	3,15
2	D-Pal(3)	Ac		16,35	0,32
3	D-Pal(3)	For		SL
4	D-Pal(3)	EtCar		9,71	0,05
5	D-Pal(3)	CHC	40	SL
6	D-Pal(3)	BZ	10 20	SL
22	D-Trp	Car		4,09	2,67
23	D-Trp	Ac		6,87	0,14
24	D-Trp	For	50	SL

*¹²⁵I-[D-Trp]⁶LH-RH utilizado como ligando marcado SL, sem ligação

622

SHAL3. Ο.011ΡΤ

Tabela 3.

Actividade anti-ovulatória e afinidade de péptidos Ac-D-Nal(2)-D-Phe ( 4C1) -D-Pal (3) -Ser-Arg-D-Lys [ A( Y) ₂ ] -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂para receptores de membranas de células de cancro humano da mama.

N^a do Péptido péptido	% de bloqueio da ovulação	Constante de afinidade
^Ka^xnM¹	K_a2 uM“^X
A	Y	0,75Mg	1,5/xg
7	A₂pr	Car			6,27	5,72
8	A₂pr	Ac			1,57	6,16
9	A₂pr	EtCar	20	50	30,92	8,57
10	A₂pr	For	67	100	48,29	2,11
12	A₂pr	CHC			1,68	3,57
14	DL-A₂bu	Ac		20	4,83	0,26
15	DL-A₂bu	For	(25* **)	100	SL
16	DL-A₂bU	Car		33	SL
18	DL-A₂bu	PRL	75		21,18	6,17
19	DL-A₂bu	LAU			0	0
21	DL-A₂bu	CHC			SL
25	A₂pr-				3,49	1,29
26	DL-A₂bU-				SL

*¹²⁵i-[D-Trp]⁶lh-rh utilizado como ligando marcado **a dose é de 0,375 Mg

SL, sem ligação

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-38Tabela 4.

Actividades inibidoras de IB-RH dos antagonistas Ac-D-Nal(2)-D-Phe (4C1) -R³ -Ser-Arg-D-Lys [ A₂pr (Y) ₂ ] -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ em sistemas de células de pituitária de ratazanas perfundidas a várias razões molares de antagonista para LHRH.

% de inibição da resposta de LH a diferentes antagonistas a uma razão para LHRH de

1:1

3:1

N» do	0	30	60	90	0	30	60	90
péptido	min	min	min	min	min	min	min	min

1	80	46	31	95	59	55	52
2	26	27	29	25	88	41	13
3					93	43	26	24
4					91	50	42	41
5					95	60	60	60
6	50	40	35	30	82	63	60	55
22					64	22	24
23					52	22	21	22
24	36	11	0	9	58	5	18	27

622

SHAL3.0.011ΡΤ

-39Tabela 5.

Actividades inibidoras de LH-RH dos antagonistas Ac-D-Nal(2)-D-Phe ( 4C1) -D-Pal ( 3 ) -Ser-Arg-D-Lys [ A( Y ) ₂ ] -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ em sistemas de células de pituitária de ratazanas perfundidas a várias razões molares de antagonista de LHRH % de inibição da resposta de LH a diferentes antagonistas a uma razão para LHRH de

1:1

3:1

N⁸ do	0	30	60	90	0	30	60	90
péptido	min	min	min	min	min	min	min	min
7	57	51	45	41	96	78	70	58
8	64	39	27	22	99	66	47	37
9					90	72
14					80	63	51	53
15	44	41	22	23	99	60	34	21
16	52	33	24	28
18					90	71	58	54
19	20	20	0	0
25	57	49	43		85	69	62	57
26	70	52	37		90	75	62	57

622

SHAL3.0.011ΡΤ —40—

Tabela 6

Efeito de uma dose de 25 /xg/dia do péptido 8 sobre o crescimento do cancro da próstata Dunning R3327 em ratazanas

Tempo	Tamanho do tumor	(mm³)
(semana)	Grupo de controlo	Grupo tratado
0	4326 ± 1891*	4001 ± 1617
1	6901 ± 2968	5459 ± 1863
2	9174 ± 4507	5892 + 1938
3	9465 ± 4349	6357 ± 2327
4	12582 ± 6659	6237 ± 2974**
5	12230 ± 4848	7447 ± 3481**
6	14732 ± 6597	8038 ± 4374**
7	17796 ± 8602	8129 ± 3525***

**p<0,05

Claims

REIVINDICACÕES

1 - Composto de fórmula:

X-R¹-R²“R^{3 *}-Ser-R⁵-R⁶ ( AY 2) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por

R¹ ser D-Phe, D-Phe(4C1),D-Nal(l) ou D-Nal(2),

R² ser D-Phe oh D-Phe(4H1),

R³ ser D-Trp, D-Phe, D-Phe(4H1), D-Nal(l) ou D-Nal(2) ou D-Pal(3),

R⁵ ser Tyr ou Arg,

R⁶ ser D-Lys ou D-Orn,

Hl ser fluoro, cloro ou bromo,

X ser um grupo alcanoílo inferior de 2-5 átomos de carbono, A ser um resíduo diaminoacilo com a fórmula

CH₂-(CH2)_m-CH-(CH₂)_n-CO- II nh₂ nh₂ onde m é 0 ou 1, n é 0 ou 1,

Y é hidrogénio ou Y¹ ou Y², onde

Y¹ é um grupo acilo derivado de ácidos carboxílicos alicíclicos ou alifáticos de cadeia linear ou ramificada, com 3 a 12 átomos de carbono ou ácidos carboxílicos aromáticos de 6 ou 10 átomos de carbono no anel,

Y² é um grupo alquilo alicíclico ou alifático de cadeia linear ou ramificada,

Y³ é um grupo carbamoílo ou carbamoílo substituído com alquilo com a fórmula

H-(CH₂)_n-NH-CO- III onde n é 0-3.
2 - Péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y ser Y¹ onde Y¹ é formilo, acetilo, propionilo, butirilo, i-butirilo, ciclo-hexanoílo ou benzoílo.

73 622

SHAL3.0.011PT
3 - Péptido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por R^ ser D-Nal(2), R₂ ser D-Phe(4C1), R₃ ser D-Pal(3), R₅ ser Tyr, Rg ser D-Lys, X ser acetilo e A ser ácido 2,3-diaminopropiónico.
4 - Péptido de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por Y¹ ser formilo.
5 - Péptido de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por Y¹ ser acetilo.
6 - péptido de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por Y¹ ser propionilo.
7 - Péptido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por R_x ser D-Nal(2), R₂ ser D-Phe(4C1), R₃ ser D-Pal(3), R₅ ser Tyr, Rg ser D-Lys, X ser acetilo e A ser ácido 2,4-diaminobutírico.

por

Y¹

- Péptido de ser formilo.

acordo com reivindicação

7, caracterizado por

9 γΐ

- Péptido de ser acetilo.

acordo com reivindicação

7, caracteri z ado por
10 - Péptido de acordo Y¹ ser propionilo.

com reivindicação

7, caracterizado
11 - Péptido de R-l ser D-Nal (2), por

Arg, Rg ser D-Lys, propiónico.

a

D-Phe(4C1), R₃ ser D-Pal(3) com acordo

R₂ ser

X ser acetilo e A ser ácido reivindicação

2, caracterizado , R₅ ser 2,3-diamino
12 - Péptido de do por Y¹ ser formilo.

acordo com a reivindicação 11, caracteriza
13 - Péptido de acordo com a reivindicação 11, do por Y¹ ser acetilo.

caracteriza-

Ac

W*'

73 622

SHAL3.0.011PT
14 - Péptido de acordo com a reivindicação 11, do por Y¹ ser propionilo.
15 - Péptido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser D-Nal(2), R₂ ser D-Phe(4Cl), R₃ ser D-Trp, R₅ ser Arg, R₆ ser D-Lys, X ser acetilo e A ser ácido 2,3-diaminopropiónico.
16 - Péptido de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por Y¹ ser formilo.
17 - Péptido de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por Y³· ser acetilo.
18 - Péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y ser Y² onde Y² é carbamoílo, N-metil-carbamoílo ou N-etil-carbamoílo.
19 - Péptido de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por R_x ser D-Nal(2), R₂ ser D-Phe(4Cl), R₃ ser D-Pal(3), R₅ser Tyr ou Arg, Rg ser D-Lys, X ser acetilo e A ser ácido 2,3-diaminopropiónico ou ácido 2,4-diaminobutírico.
20 - Péptido de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por Y² ser Car.
21 - Péptido de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por Y² ser EtCar.
22 - Processo de produção de porções peptídicas de fórmula: X-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶ (AY₂) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde

R¹ é D-Phe, D-Phe(4C1),D-Nal(l) ou D-Nal(2),

R² é D-Phe ou D-Phe(4H1),

R³ é D-Trp, D-Phe, D-Phe(4H1), D-Nal(l) ou D-Nal(2) ou D-Pal(3),

R⁵ é Tyr ou Arg,

73 622

SHAL3.0.011PT

-44R⁶ é D-Lys ou D-Orn,

Hl é fluoro, cloro ou bromo,

X é um grupo alcanoílo inferior de 2-5 átomos de carbono A é um resíduo diaminoacilo com a fórmula onde m é 0 ou 1, n é 0 ou 1,

Y é hidrogénio ou Y³· ou Y², onde

Y¹ é um grupo acilo derivado de ácidos carboxílicos alicíclicos ou alifáticos de cadeia linear ou ramificada, com 3 a 12 átomos de carbono ou ácidos carboxílicos aromáticos de 6 ou 10 átomos de carbono no anel,

Y² é um grupo alquilo alicíclico ou alifático de cadeia linear ou ramificada,

Y³ é um grupo carbamoílo ou carbamoílo substituído com alquilo com a fórmula

H-(CH₂)_n-NH-COIII onde n é 0-3, caracterizado por se efectuar uma condensação de fragmentos dos fragmentos peptídicos correspondentes ou uma síntese passo a passo e, quando necessário, se acilarem os péptidos assim obtidos e/ou se converterem em sais farmaceuticamente aceitáveis.
23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a síntese passo a passo ser efectuada protegendo o grupo amino na posição a e ligando covalentemente o terminal carboxi a um suporte sintético usado para este fim, em seguida separando o grupo α-protector, reduzindo o grupo carboxi, do aminoácido imediatamente seguinte, ao grupo HC=o, o qual é então ligado ao grupo α-amino desprotegido anteriormente mencionado, em seguida desprotegendo o grupo α-amino protector deste segundo aminoácido e ligando, então, o grupo carboxi do aminoácido imediatamente seguinte ao segundo grupo α-amino desprotegido anteriormente mencionado, sendo depois os outros aminoácidos do

73 622

SHAL3.0.011ΡΤ péptido a sintetizar ligados passo a passo na sequência correcta e após ligação de todos os aminoácidos do péptido completo da reivindicação 22, sendo o referido péptido separado do suporte e, quando necessário, sendo ainda separados os grupos protectores de funções laterais, quando presentes.

Por THE ADMINISTRATORS OF THE TULANE

EDUCATIONAL FUND =0 AGENTE 0FICIAL=

73 622

SHAL3.0.011ΡΤ

PATENTE N^fi 100 077

Antagonistas da hormona de libertação da hormona luteinizante (LHRH) possuindo um esqueleto de LHRH substituído nas posições

1,2,3,5,6 e 10 e seu processo de preparação

RESUMO

0 presente invento refere-se a análogos da hormona de libertação da hormona luteinizante (LH-RH), os quais são antagonistas potentes de LH-RH. Estes péptidos inibem a libertação de gonadotropinas de pituitárias em mamíferos, incluindo seres humanos, e possuem actividade antitumoral.

A fómula I representa os péptidos do invento:

X-R^—R^R^Ser-RS-R⁶ (AY ₂) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde

R¹ é D-Phe, D-Phe(4C1),D-Nal(l) ou D-Nal(2),

R² é D-Phe ou D-Phe(4H1),

R³ é D-Trp, D-Phe, D-Phe(4H1), D-Nal(l) ou D-Nal(2) ou D-Pal(3), r5 Tyr _ou Arg,

R⁶ é D-Lys ou D-Orn,

Hl é fluoro, cloro ou bromo,

X é um grupo alcanoílo inferior de 2-5 átomos de carbono, A é um resíduo diaminoacilo com a fórmula

CH₂-(CH₂)_m-CH-(CH₂)_n-CO- II nh₂ nh₂ onde m é 0 ou 1, n é 0 ou 1,

Y é hidrogénio ou Y^· ou Y², onde

Y¹ é um grupo acilo derivado de ácidos carboxílicos alicíclicos ou alifáticos de cadeia linear ou ramificada, com 3 a 12 átomos de carbono ou ácidos carboxílicos aromáticos de 6 ou 10 átomos de carbono no anel,