ES2312185T3 - Anticuerpos recombinantes especificos contra las terminaciones de amiloide beta, adn que codifica y procedimientos de utilizacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo recombinante, específico contra el extremo N terminal libre de un péptido amiloide Beta o contra el extremo C terminal libre de un péptido amiloide Beta ABeta 1-40, en el que el anticuerpo no se une a la proteína precursora del amiloide Beta de la que dicho péptido amiloide Beta puede derivarse proteolíticamente.

Description

Anticuerpos recombinantes específicos contra las terminaciones de amiloide \beta, ADN que codifica y procedimientos de utilización de los mismos.

Antecedentes de la invención Sector de la invención

La presente invención se refiere a compuestos que previenen o inhiben el avance de la enfermedad de Alzheimer. Los compuestos se pueden incorporar en forma de genes a las células del sistema nervioso central. La presente invención también se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene un gen que codifica una molécula de anticuerpo recombinante específico contra la terminación de un péptido amiloide \beta unido de forma funcional a un promotor capaz de expresar un anticuerpo recombinante en las células del sistema nervioso central, así como las composiciones farmacéuticas de la misma.

Descripción del estado de la técnica

Una de las principales características distintivas desde el punto de vista histopatológico de la enfermedad de Alzheimer (EA) es la presencia de depósitos amiloideos con placas neuríticas y difusas en el parénquima del núcleo amigdalino, hipocampo y la neocorteza (Glenner y Wong, 1984; Masters et al., 1985; Sisodia y Price, 1995). Amiloideo es un término genérico que describe a los agregados fibrilares que tienen una estructura común en forma de hojas \beta. Estos agregados muestran propiedades birrefringentes en presencia de rojo Congo y luz polarizada (Glenner and Wong, 1984). Se cree que la placa difusa es relativamente benigna, al contrario que la placa neurítica, que parece estar fuertemente correlacionada con los procesos reactivos y degenerativos (Dickson et al., 1988; Tagliavini et al., 1988; Yamaguchi et al., 1989; Yamaguchi et al., 1992). El componente principal de las placas neuríticas es una proteína amiloide \beta (A\beta) de 42 residuos de aminoácidos (Miller et al., 1993; Roher et al., 1993) que se deriva de la proteína precursora amiloide \beta, PPA\beta (o PPA), de mucho mayor tamaño (Kang et al., 1987). A\beta 1-42 se produce en menor abundancia que el péptido A\beta 1-40 (Haass et al., 1992; Seubert et al., 1992), pero el depósito preferente de A\beta 1-42 es el resultado del hecho de que esta forma extendida en COOH es más insoluble que A\beta 1-40 y más propensa a agregarse y a formar hojas plegadas \beta antiparalelas (Joachim et al., 1989; Halverson et al., 1990; Barrow et al., 1992; Burdick et al., 1992; Fabian et al., 1994). La forma A\beta 1-42 puede promover la agregación de A\beta 1-40 (Jarrett and Lansbury 1993).

Se ha secuenciado el gen PPA, lo que llevó a descubrir que se encuentra codificado en el cromosoma 21 (Kang et al., 1987). La expresión del gen PPA genera varias isoformas que contienen A\beta de 695, 751 y 770 aminoácidos, conteniendo estos dos últimos PPA\beta un dominio que comparte homologías estructurales y funcionales con los inhibidores de serina proteasas de tipo Kunitz (Kang et al., 1987; Kitaguchi et al., 1988; Ponte et al., 1988; Tanzi et al., 1988; Konig et al., 1992). Aún no se han definido las funciones de la PPA\beta en el sistema nervioso central, aunque las pruebas cada vez apuntan con mayor firmeza a que la PAA\beta desempeña una función de mediación en la adherencia y crecimiento de las neuronas (Schubert et al., 1989; Saitoh et al., 1994; Saitoh and Roch, 1995) y posiblemente en la ruta de transmisión de señales ligada a la proteína G (Nishimoto et al., 1993). En las células cultivadas, las PPA\beta maduran a través de la ruta de secreción constitutiva (Weidemann et al., 1989; Haass et al., 1992; Sisodia 1992) y algunas PPA\beta ligadas a la superficie celular son cortadas por el dominio A\beta por acción de una enzima, denominada \alpha-secretasa, (Esch et al., 1990), hecho que impide la amiloidogénesis del A\beta. Varios estudios han descrito dos rutas adicionales de procesamiento de la PPA\beta, ambas amiloidogénicas: en primer lugar, una ruta endosómica/lisosómica genera un conjunto complejo de fragmentos ligados a la membrana relacionados con la PPA\beta, algunos de los cuales contienen la secuencia completa A\beta (Haass et al., 1992; Golde et al., 1992); y en segundo lugar, mediante ciertos mecanismos que no se comprenden en su totalidad, A\beta 1-40 se secreta en el medio acondicionado y está presente en el líquido cefalorraquídeo in vivo (Haass et al., 1992; Seubert et al., 1992; Shoji et al., 1992; Busciglio et al., 1993). En la actualidad, ha dejado de creerse que la degradación lisosómica contribuya de forma significativa a la producción de A\beta (Sisodia and Price, 1995). No se han identificado las enzimas proteolíticas responsables de los cortes en los extremos NH_{2} y COOH de A\beta, denominado respectivamente \beta y \gamma. Hasta hace poco tiempo, la creencia extendida era que A\beta se genera a través de un metabolismo anómalo del precursor. No obstante, la presencia de A\beta en el medio acondicionado de una amplia variedad de células en cultivo y en el líquido cefalorraquídeo humano, indica que A\beta se produce como parte de la función normal de las células.

Si el depósito de amiloide es un factor limitante de la velocidad de desarrollo de la EA, entonces todos los factores vinculados con la enfermedad o bien promoverán el depósito del amiloide o bien potenciarán la patología causada por el amiloide. La probabilidad de que se produzca el depósito de amiloide se ve potenciada por la trisomía 21 (síndrome de Down) (Neve et al., 1988; Rumble et al., 1989), en la que existe una copia adicional del gen PPA, debido a una mayor expresión de la PPAA, y por las mutaciones vinculadas a la enfermedad de Alzheimer familiar (EAF) (Van Broeckhoven et al., 1987; Chartier-Harlin et al., 1991; Goate et al., 1989; Goate et al., 1991; Murrell et al., 1991; Pericak- Vance et al., 1991; Schellenberg et al., 1992; Tanzi et al., 1992; Hendricks et al., 1992; Mullan et al., 1992). Algunas de estas mutaciones están correlacionadas con una mayor producción total de A\beta (Cai et al., 1993; Citron et al., 1992) o con una producción excesiva específica de los péptidos más fibrilogénicos (Wisniewski et al., 1991; Clements et al., 1993; Susuki et al., 1994) o con una mayor expresión de los factores que inducen la formación de las fibrillas (Ma et al., 1994; Wisniewski et al., 1994). En su conjunto, estos descubrimientos favorecen fuertemente la hipótesis de que el depósito de amiloide constituye un elemento crítico en el desarrollo de la EA (Hardy 1992) si bien, por supuesto, no excluyen la posibilidad de que otros cambios relacionados con el envejecimiento estén asociados con la enfermedad, tales como los filamentos helicoidales apareados, que se pueden desarrollar en paralelo más que como resultado del depósito de amiloide y que contribuyen a la demencia de forma independiente.

Los investigadores han centrado sus esfuerzos en la reducción de la cantidad de los depósitos de A\beta en el sistema nervioso central (SNC), lo que también representa el objetivo principal en el desarrollo de fármacos para la EA. Estas actividades se encuentran dentro de dos áreas generales: factores que afectan a la producción de A\beta, y factores que afectan a la formación de fibrillas de A\beta insolubles. Un tercer objetivo terapéutico consiste en reducir las respuestas inflamatorias como consecuencia de la neurotoxicidad del A\beta.

Por cuanto respecta a la primera, se está realizando un gran esfuerzo destinado a comprender con detalle el modo de procesamiento de la PPA\beta de nueva síntesis para su inserción en la membrana plasmática, y a identificar las secretasas amiloidogénicas putativas que se han asignado sobre la base de los sitios de restricción de la proteína madura. Desde una perspectiva farmacológica, la forma más directa de reducir la producción de A\beta consiste en la inhibición directa de la \beta secretasa o de la \gamma secretasa. En la actualidad no existen inhibidores específicos, si bien varios compuestos han mostrado una inhibición indirecta de las actividades. Por ejemplo, bafilomicina inhibe la producción de A\beta con una CE_{50} de aproximadamente 50 nM (Knops et al., 1995; Haass et al., 1995), y lo más probable es que esta inhibición se deba a su actividad como inhibidor de la H^{+} ATPasa vacuolar colocalizada en las vesículas con la A\beta secretasa. Otro compuesto, MDL28170, utilizado a elevadas concentraciones, bloquea la actividad de la \gamma secretasa (Higaki et al., 1995). La opinión extendida confía en que la identificación de las \beta o \gamma secretasas pueda conducir a la síntesis de inhibidores de la proteasa específicos que bloqueen la formación de péptidos amiloidogénicos. Sin embargo, se desconoce si estas enzimas son específicas para la PPA\beta o si quizás presentan otras funciones secretoras importantes. De igual forma, se encontrarán problemas de especificidad de las dianas al realizar cualquier intento de interferir con las rutas de transducción de señales que pueden determinar si el procesamiento de la PPA\beta se dirige a través de rutas amiloidogénicas o no amiloidogénicas. Además, aún es necesario identificar estos mecanismos de transducción de señales. En conclusión, el conocimiento actual de los complejos y diversos mecanismos moleculares subyacentes que conducen a la producción excesiva de A\beta, ofrece pocas esperanzas de descubrimiento de un tratamiento dirigido selectivo mediante agentes farmacológicos.

Dada la neurotoxicidad que parece estar asociada con los agregados en forma de hoja plegada \beta de A\beta, una de las estrategias terapéuticas consiste en inhibir o retardar la agregación de A\beta. La ventaja que entraña esta estrategia consiste en que no es necesario comprender perfectamente los mecanismos intracelulares que activan la producción excesiva de A\beta o los efectos inducidos a nivel intracelular por A\beta. Diversos agentes que se unen a A\beta son capaces de inhibir la neurotoxicidad de A\beta in vitro, por ejemplo, el colorante rojo Congo, que se une a A\beta, inhibe completamente la toxicidad inducida por A\beta en neuronas cultivadas (Yankner et al., 1995). Del mismo modo, el antibiótico rifampicina también previene la agregación de A\beta y su subsecuente neurotoxicidad (Tomiyama et al., 1994). Actualmente se están desarrollando otros compuestos como inhibidores de este proceso, bien sea mediante la inhibición directa del A\beta, p.ej., bromuro de hexadecil-N-metilpiperidinio (HMP) (Wood et al., 1996), o impidiendo la interacción de A\beta con otras moléculas que contribuyen a la formación de depósitos de A\beta. Un ejemplo de dicha molécula es el sulfato de heparano o el proteoglucano de sulfato de heparano, perlecano, que ha sido identificado en todos los amiloides y está implicado en la etapa más temprana de la inflamación asociada con la inducción del amiloide.

El sulfato de heparano interacciona con el péptido A\beta y le imparte características estructurales amiloideas secundarias y terciarias. Recientemente, se ha demostrado que los sulfatos aniónicos de molécula pequeña interfieren con esta reacción, impidiendo o deteniendo la amiloidogénesis (Kisilevsky, 1995), aunque no resulta claro si estos compuestos entrarán en el SNC. Un péptido basado en la secuencia del dominio de unión a perlecano parece inhibir la interacción entre A\beta y perlecano, y se está estudiando la capacidad de los péptidos derivados de A\beta para inhibir la autopolimerización como posible vía para el desarrollo de tratamientos para la EA. No obstante, es probable que la eficacia de estos compuestos in vitro sea reducida, debido a varias razones, principalmente la necesidad de penetración crónica de la barrera sanguínea cerebral.

Como otro medio de inhibición o retardo de la agregación de A\beta, la patente WO 96/25435 describe la posibilidad de utilizar un anticuerpo monoclonal, que sea específico para el extremo C terminal libre del péptido A\beta 1-42, pero no para el péptido A\beta 1-43, a fin de evitar la agregación de A\beta 1-42. Si bien se describe que la administración de dicho anticuerpo monoclonal específico contra el extremo de A\beta interaccionan con el residuo C terminal libre de A\beta 1-42, intercediendo este modo e interrumpiendo la agregación que puede resultar patógena en la EA, no se incluye ninguna explicación específica relacionada con la forma de utilización terapéutica de dichos anticuerpos monoclonales específicos contra el extremo C terminal de A\beta. Si bien la manipulación directa o indirecta de la agregación del péptido A\beta parece ser una estrategia terapéutica atractiva, una posible desventaja de esta estrategia general puede ser que los compuestos farmacológicos de esta clase deben administrarse durante un período de tiempo prolongado, pudiendo acumularse y resultar altamente tóxicos a nivel del tejido cerebral.

Como alternativa a un enfoque basado en péptidos, se puede pensar en descubrir el mecanismo celular de la neurotoxicidad de A\beta y desarrollar agentes terapéuticos dirigidos contra dichas dianas celulares. El punto de atención se ha centrado en controlar la disfunción del calcio del daño celular mediado por radicales libres. Se ha planteado que A\beta se une a RAGE (el receptor de productos finales de glucación avanzada) sobre la superficie celular, desencadenando de este modo reacciones que podrían generar estímulos oxidantes citotóxicos (Yan et al., 1996). Si se bloquea el acceso de A\beta a los sitios de unión sobre la superficie celular, se podría retrasar el avance del daño neuronal en la EA. Hasta la fecha, no existe ningún agente farmacológico específico que permita bloquear la neurotoxicidad inducida por A\beta.

Además de las estrategias terapéuticas mediante la administración directa de agentes farmacológicamente activos, la patente WO 89/01975 da a conocer un procedimiento para el trasplante de células gliales (células secretoras activas derivadas del interior del cerebro) que se han transformado a fin de expresar y secretar anticuerpos poliméricos recombinantes de la clase de las IgM contra la acetilcolinesterasa. En la descripción de la patente WO 89/01975, se predice que el anticuerpo secretado por las células transformadas trasplantadas en el cerebro de una persona afectada por la enfermedad de Alzheimer, pueden aliviar o eliminar los síntomas de la enfermedad. Este es una estrategia terapéutica genética originada a partir de la observación de que las células del sistema nervioso central muestran una elevada eficacia en la secreción anticuerpos (Cattaneo and Neuberger, 1987). Más tarde, Piccioli et al., 1991 y 1995, demostraron la expresión neuronal ectópica de anticuerpos recombinantes desde el promotor del gen vgf neuronal de una forma específica para cada tejido y regulada por el desarrollo. Así pues, se descubrió que las células no linfoides y, en particular, las células neuronales, eran capaces de secretar inmunoglobulinas funcionales.

El grupo de Solomon ha descrito un procedimiento para seleccionar una molécula antiagregación, tal como un anticuerpo monoclonal, un fragmento anticuerpo o un péptido, que mimetice el sitio de unión de un anticuerpo (WO9618900 Solomon, B. Prevention of Protein Aggregation [Prevención de la agregación de proteínas]). Posteriormente, este grupo escribió el aislamiento de anticuerpos monoclonales específicos basándose en su capacidad de inhibición de la agregación del péptido amiloide \beta (Int. J. Exp. Clin. Invest. (1996) 3, 130-133; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 452-455). Estos anticuerpos no son específicos contra los extremos, dado que no se unen específicamente al grupo amino libre del extremo N terminal o del extremo C terminal del péptido amiloide \beta.

En la patente EP683234 se describen nuevos anticuerpos útiles, debido a que presentan especificidad de unión por el amiloide \beta o derivados del mismo. Estos derivados presentan una secuencia de aminoácidos que comprende desde el 2º al 42º, desde el 3º al 42º o desde el desde el 4º al 42º aminoácidos del amiloide \beta. Un anticuerpo que reconoce las secuencias de A\beta que comienzan en los residuos 1, 2, 3 ó 4 no es, por definición, específico contra el extremo C terminal del péptido amiloide \beta.

La inclusión de cualquier documento citado en el presente documento no pretende admitir que dicho documento representa la técnica anterior pertinente, ni se considera sustancial con respecto a la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier afirmación relacionada con el contenido o la fecha de cualquier documento se basa en la información disponible para el solicitante en el momento de presentación de estar solicitud, y no constituye la admisión de la corrección de dicha afirmación.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a nuevos compuestos que previenen la aparición de la enfermedad de Alzheimer o que inhiben el avance de la enfermedad de Alzheimer. Los compuestos, a saber, anticuerpos recombinantes específicos contra los extremos de los péptidos amiloides \beta, se expresan de forma estable en el cerebro. Estas moléculas de anticuerpo recombinante expresadas ectópicamente, que son específicas contra el extremo N terminal de los péptidos amiloides \beta o del extremo C terminal libre de un péptido amiloide \beta A\beta 1-40, previenen la acumulación de péptidos amiloides \beta en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el líquido cefalorraquídeo, así como la agregación de dichos péptidos para formar depósitos amiloideos en el cerebro. Dados los numerosos mecanismos posibles que pueden contribuir a la producción del amiloides \beta, además de la tremenda diversidad de interacciones de A\beta con la superficie celular y con las moléculas que se unen a A\beta extracelularmente, capaces de provocar neurotoxicidad crónica, los presentes compuestos previenen la acumulación de péptidos A\beta en el medio extracelular de las neuronas afectadas como punto focal de esta cascada patológica heterogénea. La presente invención también evita los problemas asociados con la repetida administración de agentes farmacológicos, que precisa la penetración crónica de la barrera sanguínea cerebral.

Por consiguiente, representa un objetivo de la presente invención resolver las deficiencias de la técnica anterior, dando a conocer nuevos compuestos para la prevención o inhibición del avance de la enfermedad de Alzheimer.

Otro objetivo de la presente invención consiste en conferir a las células del sistema nervioso la capacidad de expresar ectópicamente moléculas de anticuerpo recombinante en el cerebro, siendo dichas moléculas específicas contra el extremo N terminal de los péptidos amiloides \beta o del extremo C terminal libre de un péptido amiloide \beta A\beta 1-40, a fin de prevenir la acumulación de péptidos amiloides \beta en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el líquido cefalorraquídeo, así como la agregación de dichos péptidos para formar depósitos amiloideos en el
cerebro.

Un objetivo adicional de la presente invención consiste en dar a conocer compuestos para la prevención o inhibición del avance de la enfermedad de Alzheimer, inhibiendo asimismo la interacción de los péptidos amiloides \beta que median en la neurotoxicidad inducida por el amiloide \beta e inhibiendo la activación del complemento inducido por el amiloide \beta, así como la liberación de citocinas implicadas en el proceso inflamatorio asociado con la enfermedad de Alzheimer.

Otro objetivo adicional de la presente invención consiste en dar a conocer una molécula de ADN recombinante que contiene un gen que codifica para una molécula de anticuerpo recombinante específica contra el extremo N terminal de un péptido amiloide \beta o contra el extremo C terminal libre de un péptido amiloide \beta A\beta1-40 y unido de forma funcional a un promotor que se expresa en el sistema nervioso central.

Aún otro objetivo adicional de la presente invención consiste en dar a conocer un vector para introducir la molécula de ADN recombinante en las células del sistema nervioso central.

Aún otro objetivo adicional de la invención consiste en dar a conocer una composición farmacéutica para prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una representación esquemática de la proteína precursora del amiloide \beta (PPA\beta) y de los productos de degradación por acción de la \alpha, \beta y \gamma-secretasa. Se indican las ubicaciones generales de los diversos dominios, junto con los sitios de restricción (\alpha, \beta, \gamma) de las secretasas. En la figura 1 también se muestra esquemáticamente que la expresión y secreción estable de los anticuerpos ectópicos específicos contra los extremos de A\beta en el SNC inhiben (1) la acumulación de los péptidos A\beta y (2) las consecuencias neurotóxicas de los depósitos amiloideos sin afectar a las funciones biológicas de la proteína precursora del amiloide \beta soluble.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:1) de la región de la PPA\beta de la que se derivan los péptidos amiloides \beta (A\beta). Las flechas indican los sitios de restricción de la \alpha-, \beta- o \gamma-secretasa, y los residuos de aminoácidos correspondientes a los péptidos sintéticos que se utilizarán como inmunógenos aparecen indicados bajo la secuencia mediante segmentos lineares.

Las figuras 3A-3D muestran esquemáticamente la estructura de un anticuerpo completo (figura 3A) con el dominio variable de las cadenas pesada (V_{H}) y ligera (V_{L}) y el dominio o dominios constantes de las cadenas ligera (C_{L}) y pesada (C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3), un fragmento Fab (figura 3B), un fragmento Fv (figura 3C), y un fragmento Fv monocatenario (scFv) (figura 3D). El fragmento Fab representado en la figura 3B comprende un dominio variable de cadena pesada V_{H} y ligera V_{L} y el primer dominio constante (C_{H}1 y C_{L}), unidos mediante un puente disulfuro. El fragmento Fv mostrado en la figura 3C representa la parte de unión al antígeno del anticuerpo formada por un complejo de las regiones variables (V_{H}-V_{L}) unidas de forma no covalente, mientras que el fragmento Fv monocatenario mostrado la figura 3D une la cadena variable pesada V_{H} con la cadena variable ligera V_{L} por medio de un péptido enlazador.

La figura 4 muestra esquemáticamente una construcción de un anticuerpo scFv producida clonando la región variable de un anticuerpo monoclonal anti-A\beta específico contra los extremos utilizando la técnica de amplificación por PCR con los cebadores A, B, C y D, y uniendo después entre sí la cadena variable pesada V_{H} y la cadena variable ligera V_{L} con un péptido enlazador intercatenario (ICL). El área sombreada representa las regiones hipervariables del sitio de unión del antígeno mientras que LP designa el péptido líder de las cadenas pesada y ligera.

La figura 5 muestra una representación esquemática del vector AAV ScFv\alphaA\beta, en la que se indican las repeticiones terminales invertidas (ITR), el promotor PPA\beta humano (Hu\betaAPPP), y la señal de poliadenilación SV40 (SV40pA). El plásmido utilizado es pSSV9.

Descripción detallada de la invención

Las moléculas de ADN descritas en la presente memoria contienen un gen que codifica para una molécula de anticuerpo recombinante específica contra el extremo N terminal o contra el extremo C terminal de un péptido A\beta. Dicha molécula de anticuerpo recombinante discrimina entre un péptido A\beta y la proteína precursora del amiloide \beta de la que dicho péptido amiloide \beta se deriva proteolíticamente, que también se denomina a lo largo de la presente memoria descriptiva "antisenilina". Por "antisenilina" se entiende una molécula que se une específicamente a un extremo/terminal de un péptido A\beta para ralentizar o evitar la acumulación de péptidos amiloides \beta en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el líquido cefalorraquídeo, así como su agregación en forma de depósitos o placas amiloideas seniles, y que bloquean la interacción de los péptidos A\beta con otras moléculas que contribuyen a la neurotoxicidad de A\beta.

La prevención o inhibición del avance de la enfermedad de Alzheimer implica la implantación del gen que codifica para la molécula de antisenilina en las células cerebrales, tras lo cual las antisenilinas se expresarán y se secretarán de forma estable en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el liquido cefalorraquídeo. La secreción de antisenilinas en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el liquido cefalorraquídeo, donde están presentes los péptidos A\beta solubles, promueve la formación de complejos antisenilina-A\beta solubles. Estos complejos antisenilina-A\beta solubles se eliminan del sistema nervioso central tras el drenaje del espacio extracelular, del líquido intersticial y del líquido cefalorraquídeo en el torrente sanguíneo general a través de las vellosidades aracnoideas del seno sagital superior. De esta forma, se evita la acumulación de los péptidos A\beta en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el liquido cefalorraquídeo, lo que daría lugar a depósitos amiloideos y/o induciría neurotoxicidad (figura 1). Asimismo, se espera que la eliminación de los péptidos amiloides \beta solubles reduzca el proceso inflamatorio observado en la enfermedad de Alzheimer al inhibir, por ejemplo, la activación del complemento inducido por el amiloide \beta y la liberación de citocinas, y bloquear asimismo la interacción de A\beta con los receptores superficiales celulares tales como el receptor RAGE.

La composición descrita la presente memoria incluye una molécula de ADN recombinante que contiene un gen de antisenilina asociada con un medio de implantación de genes, donde esta composición se puede utilizar como medicamento para prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer.

Según se muestra en la figura 1 (véase Schehr, 1994), y según lo descrito en el apartado Descripción del estado de la técnica, se cree que la proteína precursora del amiloide \beta (PPA\beta) también sirve como precursor de un producto proteolítico, la proteína precursora del amiloide \beta soluble (PPA\betas), que se considera que muestra funciones promotoras del crecimiento y neuroprotectoras. Los expertos en la materia observan fácilmente que la expresión estable de antisenilinas en el sistema nervioso central no interferirá con las funciones biológicas normales de la PPA\beta que no están asociadas con la formación de los péptidos A\beta. En las moléculas de ADN recombinante descritas, el gen que codifica para la molécula de antisenilina contiene, como mínimo, las secuencias de nucleótidos que codifican para el dominio de unión antigénica de una molécula de anticuerpo monoclonal específica contra los extremos. Así pues, la molécula de antisenilina, que es una molécula de anticuerpo recombinante que contiene la parte de unión antigénica de un anticuerpo monoclonal, pretende englobar una molécula de inmunoglobulina quimérica o humanizada, de cualquier isotipo, así como un anticuerpo monocatenario.

Se entiende que los anticuerpos quiméricos son moléculas, de las que distintas partes se derivan de especies animales diferentes, tales como las que presentan una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de ratón y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos y los procedimientos para su producción son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ADN que codifica para la región variable del anticuerpo se puede introducir en un ADN que codifique para otros anticuerpos, o unirlo al mismo, para producir anticuerpos quiméricos (patente U.S.A. 4,816,567; Orlandi et al., 1989).

Asimismo, se pueden producir anticuerpos monocatenarios como antisenilinas. Estos anticuerpos monocatenarios pueden ser polipéptidos compuestos monocatenarios con capacidad de unión a un péptido A\beta y comprender un par de secuencias de aminoácidos homólogas o análogas a las regiones variables de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina (complejo V_{H}-V_{L} unido o Fv monocatenario). Tanto V_{H} como V_{L} pueden copiar a las secuencias de anticuerpos monoclonales naturales, o una o ambas de las cadenas puede comprender una construcción CDR-FR del tipo descrito en la patente U.S.A. 5,091,513. Los polipéptidos separados análogos a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada permanecen unidos entre sí por acción de un péptido enlazador. Los procedimientos para la producción de dichos anticuerpos monocatenarios, p.ej., Fv monocatenario (scFv), en particular en los casos en los que el ADN que codifica para las estructuras polipeptídicas de las cadenas V_{H} y V_{L} está caracterizado o se puede caracterizar fácilmente mediante un análisis de secuencias, pueden basarse en los procedimientos descritos por ejemplo, en la patente U.S.A. 4,946,778, patente U.S.A. 5,091,513, patente U.S.A. 5,096,815, Biocca et al., 1993, Duan et al., 1994, Mhashilkar et al., 1995, Marasco et al., 1993, y Richardson et al., 1995. Las figuras 3A-3D (de Biocca et al., 1995) muestran esquemáticamente un anticuerpo intacto (figura 3A), un fragmento Fab (figura 3B), un fragmento Fv formado por un complejo de las regiones variables (V_{H}-V_{L}) unidas de forma no covalente (figura 3C), y un anticuerpo Fv monocatenario (figura 3D).

En la construcción del gen recombinante que codifica para la molécula de antisenilina, se obtiene en primer lugar un hibridoma que da lugar a un anticuerpo monoclonal, específico contra el extremo N terminal o contra el extremo C terminal de un péptido amiloide \beta, en donde el anticuerpo específico contra el extremo se define como un anticuerpo que reconoce de forma única el extremo N terminal libre o el extremo C terminal libre de un péptido y que es capaz de discriminar entre péptido y la proteína precursora del amiloide \beta de la que dicho péptido amiloide \beta se deriva proteolíticamente. El diseño de péptidos inmunógenos para ser utilizados en la inmunización y la generación de anticuerpos monoclonales para la producción de hibridomas se basa en péptidos similares a los utilizados anteriormente por diversos laboratorios a fin de generar anticuerpos monoclonales que reconozcan de forma única los extremos amino o carboxi terminales libres de A\beta (Harrington et al., 1993; Iwatsubo et al., 1994; Konig et al., 1996; Murphy et al., 1994; Gravina et al., 1995). Si bien en algunos casos se han utilizado péptidos de mayores longitudes para generar anticuerpos específicos contra los extremos de A\beta, Saido y colaboradores (1993; 1994) han determinado que existe una longitud de cinco aminoácidos para un péptido determinado que garantiza que el grupo amino libre específico que se encuentran el extremo N terminal constituye una parte esencial del epítopo reconocido por el nuevo anticuerpo. Así pues, se evalúa un anticuerpo monoclonal generado contra un péptido inmunógeno en cuanto a su selectividad en el reconocimiento de un extremo N o C terminal de un péptido A\beta. La selectividad del anticuerpo monoclonal se puede determinar mediante un ensayo de inhibición competitiva, a través de un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) o inmunoprecipitación con péptidos correspondientes a las distintas regiones de A\beta en la región inmediatamente precedente al sitio de restricción de la \beta secretasa en el dominio extracelular de la PPA\beta. En los casos en los que la eliminación de los péptidos amiloides implicados en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, es decir, A\beta 1-40 (correspondiente a los residuos 5-44 del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:1), A\beta 1-42 correspondiente a los residuos 5-46 del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:1), y A\beta 1-43 (correspondiente a los residuos 5-47 del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:1) constituye el objetivo principal, el anticuerpo monoclonal es preferentemente específico contra el extremo N terminal que es común a estos péptidos A\beta. No obstante, en otros casos, como sucede cuando se utilizan para tratar un paciente tras la aparición de la enfermedad de Alzheimer, puede ser preferible seleccionar un anticuerpo que también interfiera con la capacidad de los péptidos A\beta para promover la agregación o que interaccione con otras moléculas que, o bien contribuyan a promover el depósito de A\beta o bien medien en los efectos citotóxicos inducidos por A\beta. Se sintetizan péptidos inmunógenos de diferentes longitudes, que incorporan o bien del extremo N terminal o bien el extremo C terminal, que permitan generar anticuerpos anti-A\beta específicos contra los extremos y el ADN recombinante que codifique para un anticuerpo recombinante específico contra los extremos de A\beta (antisenilina), que se utilizan en una composición farmacéutica para este tipo de aplicación selectiva destinada a prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer.

Los expertos en la materia apreciarán que es posible añadir un residuo de cisteína al extremo de los péptidos inmunógenos anteriores, opuesto al extremo correspondiente al extremo N terminal libre o al extremo C terminal libre de los péptidos A\beta, a fin de facilitar la unión a una proteína portadora. La hemocianina extraída de la lapa californiana (HLC), la ovoalbúmina y la seroalbúmina bovina (SAB) constituyen ejemplos no limitantes de proteínas que pueden utilizarse como portadoras de los inmunógenos. La presencia de un residuo de cisteína N terminal o C terminal en los péptidos inmunógenos sintéticos aporta un grupo sulfhidrilo libre, que permite realizar un enlace covalente con una proteína activada mediante maleimida. Se utiliza un reactivo heterobifuncional, tal como un éster N-maleimido-6-aminocaproílico o un éster m-maleimidobenzoil- N-hidroxisuccinimídico (MBS) para enlazar de forma covalente el péptido inmunógeno sintético con la proteína portadora (Véase, por ejemplo, la publicación Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual [Anticuerpos: un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988). Asimismo, se encuentran disponibles estuches comerciales que pueden utilizarse para enlazar antígenos peptídicos con proteínas portadoras de grandes dimensiones activadas por
maleimida.

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, las publicaciones Kohler and Milstein, 1975; Patente U.S.A.. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); y Harlow et al., supra; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology [Protocolos Actuales en Inmunología], Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992-1997), cuyos contenidos se incorporan completamente en la presente memoria a modo de referencia.

Una vez generados los anticuerpos monoclonales, es posible evaluar la selectividad y afinidad de unión (Kd) mediante un análisis ELISA, y se pueden realizar bioensayos in vitro con los anticuerpos a fin de evaluar la eficacia de los anticuerpos monoclonales específicos contra los extremos de A\beta a la hora de de bloquear la agregación de A\beta y la citotoxicidad inducida por A\beta, según se describe más adelante en el ejemplo 1. Preferentemente, estos anticuerpos monoclonales no sólo presentan selectividad específica contra los extremos de péptidos A\beta específicos, sino que también presentan una elevada afinidad de unión. Se pretende que el ADN que codifica para cualquier anticuerpo que sea específico contra los extremos N terminal o C terminal de los péptidos A\beta y que presenta eficacia en el bloqueo de la agregación de A\beta y de la citotoxicidad inducida por A\beta, según se describe en el ejemplo 1, pueda utilizarse en la generación de moléculas de ADN que codifiquen para antisenilina. Por ejemplo, se pueden utilizar los anticuerpos monoclonales específicos contra los extremos C terminales, descritos en la patente WO 96/25435, para obtener las moléculas de ADN recombinante que codifican para antisenilina, según la presente invención.

A continuación, se puede aislar ARN mensajero (ARNm) de los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales específicos del extremo de A\beta determinados para ser selectivos por el extremo N terminal libre o por el extremo C terminal libre de los péptidos A\beta. A partir del ARNm del hibridoma aislado, se sintetiza ADNc y, continuación, se puede clonar la secuencia de nucleótidos que codifica para los dominios variables del anticuerpo monoclonal específico del extremo de A\beta mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores basados en las secuencias conservadas en cada extremo de las secuencias de nucleótidos que codifican para los dominios V de la cadena pesada (V_{H}) y de la cadena ligera (V_{L}) de la inmunoglobulina. La presencia de sitios de restricción incorporados en la secuencia de los cebadores PCR facilita la clonación de productos amplificados por PCR que codifican para la región variable de la cadena pertinente.

Un gen recombinante que codifique para una molécula de anticuerpo Fv monocatenario recombinante se construye, por ejemplo, uniendo secuencias de nucleótidos que codifican para los dominios V_{H} y V_{L} con una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido enlazador intercatenario (Biocca et al., 1993; Duan et al., 1994; Mhashilkar et al., 1995; Marasco et al., 1993; Richardson et al., 1995; patente U.S.A. 4,946,778; patente U.S.A. 5,091,513, patente U.S.A. 5,096,815) o insertando las secuencias de nucleótidos que codifican para el dominio variable, de forma que reemplacen a las secuencias correspondientes que codifiquen para el dominio variable en un gen de inmunoglobulina humana, que pasará entonces a codificar para un anticuerpo quimérico recombinante (Orlandi et al., 1989; Patente U.S.A. 4,816,567).

Entre las publicaciones de referencia estándar que explican los principios generales de la tecnología del ADN recombinante se pueden citar Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], Green Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y. (1987-1997), Watson et al., Molecular Biology of the Gene [Biología molecular del gen], Volúmenes I y II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., editorial, Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology [Biología celular molecular], Scientific American Books, Inc., editorial, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, editores, New York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering [Principios de manipulación genética: introducción a la ingeniería genética], 2ª edición, University of California Press, editorial, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); y Berger et al., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods of Enzymology [Guía sobre las técnicas de clonación molecular, métodos de enzimología] vo. 152, 1987, Academic Press, Inc. San Diego, CA

La molécula de ADN recombinante según la presente invención, que contiene un gen que codifica para un anticuerpo recombinante (antisenilina), también contiene, preferentemente, un promotor unido de forma funcional al gen de la antisenilina recombinante y capaz de expresar una molécula de antisenilina en las células cerebrales. Como podrá apreciarse, a fin de facilitar la secreción de la molécula de antisenilina desde las células transformadas que expresan antisenilina, también se incorpora un péptido líder o de señal en el extremo N terminal.

Se dice que una molécula de ADN es «capaz de expresar» un polipéptido, tal como una molécula de antisenilina, siempre que contenga secuencias de nucleótidos que incluyan información de regulación transcripcional y traslacional, y dichas secuencias están "unidas de forma funcional" a las secuencias de nucleótidos que codifican para el polipéptido. Un enlace funcional es un enlace en el que las secuencias de ADN reguladoras y la secuencia de ADN que se desea expresar están conectadas de tal forma que permiten la expresión genética. Las regiones reguladoras necesarias para expresión genética incluyen, en general, una región promotora, así como secuencias de ADN que, una vez transcritas a ARN, señalarán el inicio de la síntesis de proteínas. Dichas regiones incluirán normalmente las secuencias 5'-no codificadoras implicadas en el inicio de la transcripción y la traslación.

Una región promotora estará unida de forma funcional a una secuencia de ADN si el promotor es capaz de efectuar la transcripción de dicha secuencia de ADN. Según se utiliza en el presente documento, una "secuencia promotora" es la secuencia del promotor que se encuentra en el ADN y se transcribe por acción de la ARN polimerasa. Así pues, para expresar las antisenilinas, son necesarias señales transcripcionales y traslacionales reconocidas por la célula huésped.

Se puede administrar una composición que comprende una molécula de ADN recombinante, asociada con un medio de implantación de genes en las células del sistema nervioso central, a un paciente que la necesite para prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer. La molécula de ADN recombinante incluye un gen que codifica para una molécula de antisenilina enlazado de forma funcional con un promotor, donde este enlace funcional permite la expresión de las moléculas de antisenilina en el cerebro. El promotor es, preferentemente, un promotor que seguirá el patrón de expresión de la PPA\beta alcanzando el mayor nivel de expresión en el hipocampo y la corteza cerebral, donde el depósito de amiloide es más prevalente en los casos de enfermedad de Alzheimer. Como ejemplo no limitante de un promotor preferente enlazado de forma funcional al gen del antisenilina, el promotor de timidina cinasa (Thyl) ha demostrado regular la expresión de PPA\beta de una forma específica de cada región que mimetiza la expresión natural de la PPA\beta en el cerebro (Andra et al., 1996). Se han utilizado transgenes quiméricos basados en el promotor sinapsina I para dirigir la expresión de la PPA\beta en los subcampos CA del hipocampo y la corteza piriforme del cerebro de ratones transgénicos (Howland et al., 1995). Se ha conseguido un elevado nivel de expresión de PPA\beta en la corteza cerebral de ratones transgénicos mediante un promotor de proteína priónica (Hsiao et al., 1996). La utilización del promotor del gen de la PPA\beta en la expresión del gen del antisenilina aportará varias ventajas. En particular, el gen de antisenilina bajo el control del promotor de la PPA\beta presentará unos patrones de expresión anatómicos y fisiológicos idénticos a los del gen de la PPA\beta. Varios grupos han caracterizado el promotor humano de la PPA\beta (e.g. Salbaum et al., 1988; La Fauci et al., 1989; Wirak et al., 1991; Lahiri y Nall, 1995). El promotor presenta diversos dominios de regulación, incluyendo un elemento de choque térmico y secuencias consenso para la unión de los factores de transcripción. Así pues, es posible potenciar la expresión de antisenilinas bajo el control del gen de la PPA\beta en regiones específicas del cerebro, según resulte necesario, mediante la aplicación de cualquier número de agentes inductores, por ejemplo, factores de crecimiento, ácido retinoico e interleucina-1. De igual forma, también se ha documentado que un promotor de preproencefalina consigue una expresión específica de cada región y a largo plazo en el cerebro de ratas adultas, tras una transferencia genética directa in vivo (Kaplitt et al., 1994).

A fin de facilitar la introducción de la molécula de ADN recombinante, que incluye un gen de antisenilina unido de forma funcional a un promotor, en las células del sistema nervioso central, se puede utilizar una serie de medios distintos de implantación de genes en asociación con la molécula de ADN recombinante. El término "medios para la implantación de genes" incluye cualquier técnica adecuada para la implantación de una molécula de ADN a través de la barrera sanguínea cerebral y/o para la implantación transmembranal a través de las membranas celulares. Como ejemplos no limitantes de los medios para la implantación de genes se incluyen los vectores víricos (p.ej., vectores víricos adenoasociados), lípidos/liposomas, ligandos para los receptores superficiales celulares, etc.

La molécula de ADN recombinante, que incluye el gen de antisenilina, está asociada con el medio para la implantación de genes, y esta asociación pretende abarcar, por ejemplo, la situación en la que el medio para la implantación de genes es un liposoma y el gen de antisenilina se encuentra formando un complejo con el mismo; la situación en la que el medio para la implantación de genes es un ligando para un receptor superficial celular y el gen de antisenilina se encuentra conjugado o unido de otra forma al mismo; etc. Así pues, "asociado con" incluye la incorporación o empaquetamiento, formación de complejos, conjugación o enlace, así como cualquier otra forma de asociación, entre el gen de antisenilina y el medio para la implantación de genes. Como podrá apreciarse, la molécula de ADN recombinante puede estar asociada con más de un medio para la implantación de genes, en particular en los casos en los que la molécula de ADN recombinante se ha de implantar a través tanto de la barrera sanguínea cerebral como de la membrana celular de las células cerebrales.

El virus adenoasociado (VAA) se aisló inicialmente como cultivo tisular concomitante y, posteriormente, se descubrió como agente de coinfección no patógeno durante un brote de adenovirus en niños (Blacklow et al., 1968). Se trata de un virus de ADN monocatenario del grupo de los parvovirus con un genoma de 4,7 kb. Como uno de los virus de ADN humanos más pequeños, el VAA precisa de la coinfección con un virus auxiliar, por lo general un adenovirus o un virus del herpes, para conseguir una multiplicación eficaz (Carter, 1990). En ausencia de infección por el virus auxiliar, el VAA permanece latente y se integra de forma estable con alta frecuencia, habitualmente en un lugar específico del cromosoma 19 (Kotin et al., 1990; 1991; 1992; Samulski et al., 1991). Se ha secuenciado el genoma del VAA, tras lo que se descubrió que la única secuencia necesaria para la integración de un vector de VAA es la repetición terminal invertida (ITR) formada por los 145 nucleótidos terminales, lo que significa que la capacidad de clonación es cercana a 4,7 kb (Muzyczka, 1992). Debido a la naturaleza no patógena del virus, a su amplia gama de células huésped y a su capacidad de sacar partido del mecanismo natural para conseguir la integración con alta frecuencia, el VAA resulta particularmente adecuado como vector para la implantación/transferencia de genes a las células. Además, mientras que los retrovirus convencionales precisan la síntesis de ADN genómico, los vectores de VAA presentan la capacidad exclusiva de introducir genes extraños en células latentes o sin división. Estas características han venido explotándose cada vez más en la expresión genética en el cerebro de los mamíferos, y se han expresado en el cerebro varios genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer a través de vectores de VAA (Makimura et al., 1996). Los recientes estudios realizados por Du et al., 1996, indican que los vectores de VAA consiguen transducir de forma eficaz y expresar de forma estable un gen extraño, p.ej., lacZ, en neuronas humanas posmitóticas. También se ha documentado la expresión de genes extraños en células neuronales mediante la transfección mediada por liposomas con plásmidos derivados del VAA (Meyer et al., 1995; Wu et al., 1994, 1995).

Low et al., patente U.S.A. 5,108,921, han revisado los procedimientos disponibles para la implantación transmembranal de moléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos mediante el mecanismo de la actividad endocítica mediada por receptores. Estos sistemas de receptores incluyen aquellos que reconocen galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, transferrina, asialoglucoproteína, transcobalamina (vitamina B12), \alpha-2 macroglobulinas, insulina y otros factores de crecimiento de los péptidos tales como el factor de crecimiento epidérmico (FCE). Low et al. también describen que los receptores de nutrientes, tales como los receptores de biotina y folato, se pueden utilizar de forma ventajosa para promover el transporte a través de la membrana celular, debido a la ubicación y multiplicidad de los receptores de biotina y folato sobre las superficies membranosas de la mayoría de las células y a los procesos de transporte transmembranal asociados mediados por los receptores. Así pues, se pone en contacto un complejo formado entre un compuesto que se administrará en el citoplasma y un ligando, tal como biotina o folato, con una membrana celular que contiene receptores de biotina o folato al objeto de iniciar el mecanismo de transporte transmembranal mediado por los receptores, consiguiendo este modo la entrada en la célula del compuesto deseado.

Es posible unir un ligando de biotina a una molécula de ADN, por ejemplo, incorporando desoxinucleótidos trifosfatos biotinilados disponibles comercialmente, p.ej., biotina-14-dATP o biotina-14-dCTP de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, mediante desoxinucleotidil transferasa terminal (Karger, B.D., 1989). Biotina-14-dATP es un análogo de dATP que presenta biotina unida a la posición 6 de la base purina mediante un enlazador de 14 átomos, mientras que biotina-14-dCTP es un análogo de dCTP que presenta biotina unida a la posición N^{4} de la base pirimidina, también mediante un enlazador de 14 átomos.

La molécula de ADN recombinante que codifica para el gen de antisenilina unido de forma funcional a un promotor, que puede estar incorporada en un vector vírico o plasmídico para su empaquetamiento en un virus, acoplada a una molécula de ligando que se une a un receptor neuronal, formando complejos con lípidos catiónicos o liposomas catiónicos, o asociada con otro medio adecuado para la implantación de genes, se administra un individuo mediante inyección. La microinyección estereotáctica en diferentes regiones del cerebro siguiendo coordenadas establecidas se puede utilizar para administrar la molécula de ADN recombinante empaquetada en un virus o unida a un ligando directamente en el entorno extracelular, es decir, en el líquido cefalorraquídeo que rodea a las células cerebrales, para su posterior implantación transmembranal en las propias células. Dado que la inyección directa en el cerebro es un procedimiento agresivo, es preferible administrar la molécula de ADN recombinante empaquetada en un virus o unida a un ligando mediante inyección por vía intravenosa o intraarterial. La molécula de ADN recombinante empaquetada en un virus o unida a un ligando se puede asociar además con otros medios de implantación de genes, de forma que la administración de genes se realiza a través de barrera sanguínea cerebral hasta alcanzar el sistema nervioso central. Zhu et al., 1993, demostraron que los complejos de lípido catiónicos-ADN plasmídico se pueden administrar de forma sistemática en todos los tejidos, incluido el cerebro. Recientemente, también se ha demostrado que los liposomas catiónicos administrados por vía intraarterial, que contienen el gen de la timidina cinasa, tuvieron éxito en un modelo de rata de tumor cerebral, en el que se consiguió la remisión sin aparente toxicidad o daño histológico (Laine et al., 1995). La implantación de genes mediante liposomas ha sido ampliamente cubierta en la literatura científica y en las publicaciones de patentes, y revisada de forma extensa por Lasic, D.D., en: Liposomes in Gene Delivery [Liposomas en la implantación de genes], CRC Press, Boca Raton, Florida, 1997, que se incorpora aquí en su totalidad a modo de referencia. Una vez administrada al cerebro, la molécula de ADN recombinante empaquetada en un virus, que puede estar acoplada a una molécula de ligando o asociada con otro medio adecuado para la implantación de genes, transforma las células cerebrales, que posteriormente expresan moléculas de antisenilina (moléculas de anticuerpos recombinante específicas contra los extremos de los péptidos A\beta) y secretan las antisenilinas expresadas en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el liquido cefalorraquídeo. Posteriormente, las antisenilinas secretadas forman un complejo soluble con el péptido A\beta, para cuyos extremos son específicas, en el espacio extracelular, en el líquido intersticial y en el liquido cefalorraquídeo. Estos complejos antisenilina-péptido A\beta previenen la agregación de los péptidos A\beta formando depósitos amiloideos y previenen la neurotoxicidad inducida por A\beta al eliminar los péptidos A\beta del sistema nervioso central mediante el drenaje del espacio extracelular, del líquido intersticial y del líquido cefalorraquídeo en el torrente sanguíneo general, de donde se eliminan mediante digestión por las proteasas. Por consiguiente, se previene la acumulación de péptidos A\beta solubles de nueva secreción responsables del depósito de amiloide, así como la neurotoxicidad inducida por A\beta.

Si bien la prevención o inhibición del avance de la enfermedad de Alzheimer está destinada principalmente a pacientes con una disposición genética clara al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, también se puede utilizar con fines profilácticos para "inmunizar" a la población en general frente a la aparición de dicha enfermedad prevalente y debilitante. La ruta de administración preferente es por vía intravenosa o intraarterial. No obstante, a pesar de la agresividad de una microinyección directa en regiones del cerebro, esta vía de administración pretende entrar dentro del alcance de la invención. En particular, los pacientes afectados por el síndrome de Down o por mutaciones vinculadas con la enfermedad de Alzheimer familiar, que se espera que puedan desarrollar la enfermedad de Alzheimer debido a su predisposición, o los pacientes que ya sufren la enfermedad de Alzheimer, pueden recibir tratamiento mediante microinyección directa en el cerebro. Se espera que los beneficios de este tratamiento supere con creces a los riesgos que entraña una técnica agresiva tal como una inyección en el cerebro.

La molécula de ADN recombinante que contiene un gen de antisenilina asociada con un medio de implantación de genes se puede utilizar en la preparación o fabricación de un medicamento/composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas contienen una cantidad de la molécula de ADN recombinante que resulta eficaz para lograr su fin previsto. Por ejemplo, cuando el medio para la implantación de genes es un vector vírico, tal como el vector VAA, una dosis adecuada de partículas víricas en una composición farmacéutica, que se microinyectará de forma estereotáctica en distintos lugares del cerebro, se encuentra comprendida entre aproximadamente 5x10^{4} y 1x10^{11} partículas. Cuando se utiliza un ligando, tal como biotina, como medio para la implantación de genes mediante su administración directa en el cerebro, las dosis adecuadas de las moléculas de ADN unidas al ligando se encuentran comprendidas en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 100 \mug. Preferentemente, en el caso de dichas moléculas de ADN unidas a un ligando, las moléculas de ADN se condensan previamente, a fin de proteger dichas moléculas frente al medio extracelular de las células del sistema nervioso central. Las composiciones farmacéuticas y las dosis de las moléculas de ADN formando complejos con lípidos catiónicos o liposomas catiónicos se abordan en la publicación Lasic, 1997, supra. Además, las composiciones farmacéuticas pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como los que son bien conocidos en la técnica.

La invención se entenderá más fácilmente haciendo referencia al siguiente ejemplo predictivo.

Ejemplo 1

A continuación se describen la estrategia y los protocolos utilizados en el desarrollo de moléculas de ADN recombinante que contienen un gen que codifica para una molécula de anticuerpo de antisenilina específica contra los extremos de un péptido amiloide \beta.

Producción de un anticuerpo monoclonal específico de los extremos de A\beta Síntesis de péptidos inmunógenos

Se preparan varios péptidos de diferentes longitudes que incorporan o bien el extremo N terminal libre o bien el extremo C terminal libre mediante un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (430A). Los péptidos sintéticos se purifican mediante HPLC y se caracterizan utilizando análisis de composición de aminoácidos y de microsecuenciación del extremo NH_{2} terminal.

Péptido N1/5 A\beta_{1-40/42} (Acm: "Antisenilina N1/5")

Se sintetiza un péptido correspondiente a los primeros cinco residuos de aminoácidos de A\beta (1-40 y 1-42), según se representa de forma esquemática mediante segmentos lineares en la figura 2. El péptido contiene un residuo de cisteína en el extremo C terminal y presenta la secuencia del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:2 (véase la figura 1).

Péptido N1/7A\beta_{1-40/42} (Acm: "Antisenilina N1/7")

Se sintetiza un péptido correspondiente a los primeros siete residuos de aminoácidos de A\beta (1-40 y 1-42), según se representa de forma esquemática mediante segmentos lineares en la figura 2. El péptido contiene un residuo de cisteína en el extremo C terminal y presenta la secuencia del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:3.

Péptido C34/40A\beta_{1-40} (Acm: "Antisenilina C34/40")

Se sintetiza un péptido correspondiente a los últimos siete residuos de aminoácidos de A\beta (1-40), según se representa de forma esquemática mediante segmentos lineares en la figura 2. El péptido contiene un residuo de cisteína en el extremo N terminal y presenta la secuencia del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:4.

Péptido C36/42A\beta_{1-42} (Acm: "Antisenilina C36/42") (no forma parte de la presente invención)

Se sintetiza un péptido correspondiente a los últimos siete residuos de aminoácidos de A\beta (1-42), según se representa de forma esquemática mediante segmentos lineares en la figura 2. El péptido contiene un residuo de cisteína en el extremo N terminal y presenta la secuencia del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:5.

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Conjugación de los péptidos

Los péptidos purificados se conjugan con seroalbúmina bovina (SAB) utilizando el éster N-maleimido-6-aminocaproílico del ácido 1-hidroxil-2-nitro-4-bencenosulfónico.

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Inmunización y producción de un anticuerpo monoclonal hibridoma

Fase 1: cuatro grupos de 10 ratones Balb/c fueron inmunizados con los péptidos purificados conjugados con SAB descritos anteriormente, siguiendo protocolos de inmunización estándar (Taggert y Samloff, 1983).

Fase 2: una vez finalizado el protocolo de inmunización, se lleva a cabo un procedimiento de fusión utilizando los esplenocitos de los ratones hiperinmunizados y una estirpe celular de mieloma apropiada, SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581), NS-1 (ATCC TIB18), o equivalente. Este procedimiento se realiza utilizando polietilenglicol y se logra seleccionar los productos de fusión adecuados empleando medio HAT. Se cultivan las colonias viables de hibridoma en placas de 96 pocillos.

Fase 3: se lleva a cabo un análisis de detección en todos los pocillos que contienen los productos de fusión adecuados mediante un ensayo ELISA descrito en el siguiente apartado, con los antígenos peptídicos. Asimismo, se someten a detección los sobrenadantes de varios pocillos mediante los bioensayos in vitro que son descritos más adelante.

Fase 4: sobre la base de los resultados de los ensayos ELISA y de las evaluaciones basadas en los resultados de los bioensayos, se lleva a cabo una subclonación mediante diluciones limitantes sobre las colonias seleccionadas.

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Detección mediante ELISA y determinaciones de la afinidad

Las afinidades de especificidad y de unión (Kd) de los anticuerpos monoclonales fueron evaluadas mediante ensayos ELISA (Engvall y Perlmann, 1971) utilizando un conjunto de péptidos sintéticos correspondientes a A\beta 1-42, A\beta 1-40 y de los residuos 1-52, 1-11, -2[KM]-11, -1[M]-11, 1-28, 35-40, 35-42 y 35-44 que se encuentran en los péptidos A\beta y en la PPA\beta de la que se derivan. Además, las secuencias de péptidos inmunógenos, correspondientes al extremo N terminal libre o al extremo C terminal de los péptidos A\beta, y conjugadas con una proteína portadora diferente, tal como la hemocianina extraída de la lapa californiana (HLC) y la ovoalbúmina, fueron utilizadas para determinar si los anticuerpos monoclonales resultantes son específicos contra los extremos de los péptidos A\beta y no específicos contra proteína portadora o el puente de cisteína.

Para evaluar el protocolo que se utilizará posteriormente en la generación de anticuerpos monoclonales, se prepararon anticuerpos policlonales de alta afinidad específicos contra al extremo N terminal libre de los péptidos A\beta, donde los anticuerpos se sintetizaron utilizando el péptido restringido: H_{2}N - IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:6 - aminohexanoato-C-amida. Los péptidos se sintetizaron utilizando una estrategia bioquímica Fmoc de fase sólida. Posteriormente, los péptidos se cortaron y se analizaron mediante espectrometría de masas y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La purificación mediante HPLC se realizó utilizando una columna C-18 YMC (relleno de 10 \mu, tamaño del poro de 120 \ring{A}, 10 X 250 mm) en un sistema tampón de A: H_{2}O/TFA 0,1% y B:CH_{3}CN/TFA al 0,08%. Las fracciones pertinentes se mezclaron, se liofilizaron y se analizaron de nuevo mediante espectrometría de masas y HPLC. El péptido se unió a HLC para su inmunización y a SAB para la detección por ELISA, con el agente reticulante MBS. Se procedió a inmunizar conejos en intervalos de 3 semanas y se evaluó el título mediante ELISA utilizando acetal-IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:7-aminohexanoato-C-amida: Este péptido corresponde a una secuencia de residuos de aminoácidos que se extiende desde el sitio de empalme 0 a 1 que da lugar al extremo N terminal libre de los péptidos A\beta. El mismo péptido interno se unió a un gel de unión a tiol a través de su residuo de cisteína y se utilizó para preabsorber todos los anticuerpos que no dependen de la presencia de amino-Asp libre. A continuación, los anticuerpos se purificaron y se recogieron utilizando el péptido N terminal. Mientras que el suero sin procesar presenta una actividad sustancial frente al péptido interno, una vez purificado por afinidad, no se observa reactividad del anticuerpo resultante con el péptido interno, sólo con el péptido N-terminal. Para generar anticuerpos monoclonales específicos contra el extremo N terminal de los péptidos A\beta, se procede a inmunizar ratones en intervalos de 3 semanas utilizando: H_{2}N-IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:6-aminohexanoato-C-amida conjugada con SAB, según lo descrito para la preparación del anticuerpo policlonal. El título en cada ratón también se evaluó mediante ELISA, según lo descrito anteriormente. Tras la fusión de los esplenocitos de los ratones que presentaban el título más elevado, fueron aislados varios clones que se sometieron a análisis de detección mediante el método de detección ELISA del péptido intermedio.

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Bioensayos in vitro a fin de evaluar la eficacia de los anticuerpos monoclonales específicos contra los extremos de A\beta a la hora de de bloquear la agregación de A\beta y la citotoxicidad inducida por A\beta

A) Efectos sobre la formación de fibrillas de A\beta: Según han demostrado Jarrett et al. (1993), el extremo carboxi terminal de A\beta tiene una importancia crítica a la hora de promover la formación del amiloide, que probablemente es el responsable de la velocidad de formación altamente acelerada de placas amiloideas que se observa en la enfermedad de Alzheimer (Yankner y Mesulam, 1991). La formación del amiloide mediante los péptidos cinéticamente solubles, tales como A\beta 1-40, pueden tener como núcleos o "semillas" a los péptidos A\beta 1-42 que incluyen los residuos C terminales críticos 41(Ile) y 42(Ala). Después del 9 de abril de 1997, fecha de presentación de la solicitud provisional de U.S.A., sobre la que la presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad, los resúmenes de Solomon et al. (1997) y Frenkel et al. (1997) documentaron que sus estudios muestran que los anticuerpos dirigidos contra la región N terminal de las posiciones 1-16 de los péptidos A\beta se unen con las fibrillas formadas y conducen a la desagregación. Se ha descrito que el epítopo antiagregación de dicho anticuerpo se encuentra localizado exclusivamente en los cuatro aminoácidos Glu Phe Arg His (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:8) de las posiciones de los residuos 3-6. Estos cuatro residuos de aminoácidos del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:8 están todos presentes en los péptidos inmunizantes del extremo N terminal de A\beta. La capacidad de los anticuerpos específicos contra los extremos C terminal y N terminal de A\beta para bloquear la nucleación por parte de A\beta 1-42 o para evitar la agregación de los péptidos amiloides se evalúa mediante ensayos de agregación estándar (Wood et al., 1996).

El promotor humano de la PPA\beta ha sido caracterizado por Quitschke et al. 1996 (J. Biol. Chem. 271: 22231-39). El péptido A\beta 1-40 se disuelve hasta 5 mg/mL en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. El péptido se concentra hasta sequedad y se redisuelve en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, hasta una concentración final de 230 \muM. Se agita una disolución de A\beta 1-42 (20 \muM) durante 3 días y se homogeniza con ultrasonidos durante 30 minutos para producir fibrillas de amiloide. Se añade A\beta 1-42 a una concentración de 2 nM a la incubación supersaturada a pH 7,4 para promover la agregación de A\beta 1-40. Se determinó la formación de agregados en ausencia y en presencia de cada uno de los anticuerpos monoclonales específicos del extremo de A\beta mediante la monitorización de la turbidez de las muestras preparadas en microplacas con un lector de microplacas a 405 nm. Asimismo, también se monitorizó la reacción mediante fluorescencia con tioflavina-T, según lo descrito por Wood et al. (1996). Se evaluó la capacidad de los anticuerpos específicos contra el extremo N terminal para promover la disgregación de las fibrillas del péptido amiloide analizando el desplazamiento de péptidos amiloides agregados marcados con [^{125}I] de una matriz de colágeno que contiene péptidos no agregados dispuestos sobre microplacas de 96 pocillos recubiertas de plástico. Asimismo, se evalúa la capacidad de los anticuerpos específicos contra el extremo N terminal para proteger las neuronas frente a los daños inducidos por A\beta, utilizando el procedimiento de exclusión con azul de tripano, mediciones del calcio intracelular, microscopia electrónica de barrido y de transmisión, y microscopia confocal.

B) Neurotoxicidad inducida por A\beta: El receptor de productos finales de glucación avanzada (RAGE) media en algunos de los efectos neurotóxicos de sobre las neuronas y las células microgliales (Yan et al., 1996). Se evaluó la capacidad de los anticuerpos específicos contra los extremos para inhibir la neurotoxicidad mediada por el receptor mediante un proceso de inhibición competitiva. Los anticuerpos se evaluaron tanto con preparaciones del receptor RAGE purificado y mediante la medición de su efecto sobre la agresión oxidativa celular inducida por A\beta. El receptor RAGE se purificó a partir de un extracto de pulmón bovino disuelto en una solución salina con tampón tris que contiene octil-\beta-glucósido (1%) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (2 nm) y se aplicó a una columna heparinizada hyperD (Biosepra). La columna se eluyó con un gradiente de NaCl y se identificaron las fracciones que presentaron una unión máxima de A\beta marcado con ^{125}I. Las fracciones se mezclaron y se cargaron en un ultragel de hidroxiapatita (Biosepra) y se eluyeron con concentraciones crecientes de fosfato. Las fracciones que presentaron una unión máxima de A\beta marcado con ^{125}I se aplicaron sobre geles de preparación SDS de poliacrilamida (10%) no reducidos. La proteína del receptor RAGE con M_{r} 50.000 se identificó mediante tinción con azul Coomassie y las regiones de las calles adyacentes se cortaron y se eluyeron. La inhibición competitiva, por acción de los anticuerpos específicos de los extremos, de la unión entre el A\beta(1-40/1-42) marcado con ^{125}I y el receptor RAGE, se determinó de varias formas: (1) se inmovilizaron distintas cantidades (0-150 \mug) de proteína purificada sobre microplacas, y se incubaron con A\beta(1-40/1-42) marcado con ^{125}I 100 nM; (2) se incubaron distintas cantidades (0-250 nM) de A\beta(1-40/1-42) marcado con ^{125}I en microplacas previamente recubiertas con 5 \mug de receptor RAGE purificado; y (3) se inmovilizaron distintas cantidades (0-500 ug/mL) de A\beta(1-40/1-42) sobre microplacas, y se incubaron con receptor RAGE marcado con ^{125}I 50 nM. En cada uno de los ensayos, se determinó la cantidad de ligando que se une al pocillo en presencia de distintas cantidades del anticuerpo, cuantificando la radioactividad de los pocillos mediante un contador de centelleo para radiaciones gamma.

Para evaluar la eficacia de los distintos anticuerpos monoclonales específicos contra los extremos de A\beta como inhibidores de la agresión oxidativa celular inducida por A\beta, se incubaron células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón (Breitner et al., 1994) con 0,25 \muM de A\beta en presencia de distintas cantidades de los anticuerpos, y se evaluó la agresión oxidativa celular midiendo la generación dependiente de la dosis de especies reactivas con el ácido tiobarbitúrico, utilizando el ensayo TBARS, descrito anteriormente (Dennery et al., 1990; Yan et al., 1996). En un sistema analítico paralelo (desarrollado por Khoury et al., 1996), se analizaron los efectos inhibitorios de los anticuerpos sobre la producción de especies reactivas del oxígeno inducida por A\beta en células microgliales N9 de ratón. Se incubaron las células N9 (5 x 10^{4}) a 37ºC, en presencia de distintas cantidades de los anticuerpos, en 50 \muL de PD-BSA (solución salina con tampón fosfato sin catión divalente, con 1 mg/mL de SAB) que contiene 1 \muM de H_{2}DCF (diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína), un colorante que muestra reacción fluorescente al oxidarse (Wan et al., 1993), sobre portaobjetos de tipo "multispot" recubiertos con los péptidos A\beta. En distintos momentos, se tomaron alícuotas del medio de cultivo y se midió su fluorescencia mediante un lector de placas de fluorescencia
(Cytofluor II).

C) Efecto sobre las interacciones con proteoglucanos: El proteoglucano de sulfato de heparano, perlecano, derivado de las células vasculares, ha sido identificado en todos los depósitos amiloideos y está implicado en la etapa más temprana de la inflamación asociada con la inducción del amiloide a través de interacciones de unión de alta afinidad con A\beta (Snow et al. 1989; 1995). La unión de perlecano a A\beta imparte características estructurales amiloideas secundarias y terciarias que sugieren que las moléculas que interfieren con interacción pueden evitar o detener la amiloidogénesis.

Los anticuerpos monoclonales específicos contra los extremos de A\beta, preparados a partir de péptidos de diferentes longitudes que corresponden con el extremo N terminal, se evalúan con respecto a su capacidad de bloquear la unión de perlecano al sitio de unión de perlecano en la región del extremo N terminal de A\beta (Snow et al., 1995). Estas evaluaciones se basan en un ensayo de unión en fase sólida, que utiliza perlecano aislado de células endoteliales cultivadas preparadas a partir de aortas torácicas bovinas, según se describe en detalle en (Snow et al. 1995). Se recubren microplacas de polivinilo con 100 \muL de solución de nitrocelulosa y se dejan secar. A continuación, los pocillos se recubren toda la noche a temperatura ambiente con perlecano sin marcar, para dar lugar a 0,28 ug de perlecano unido por pocillo, y se bloquean durante toda la noche a temperatura ambiente con 200 \muL de leche en polvo desnatada al 5%. Se añadieron diversas cantidades de A\beta ^{125}I (7000 cpm/pM) diluido en 100 \muL de TBS/Tween 20 al 0,05% (TBST) por triplicado a los pocillos, que se incubaron durante 2,5 h a temperatura ambiente en un agitador orbital. Transcurrido el periodo de incubación, se retiró el A\beta ^{125}I libre mediante seis lavados con TBST. El ^{125}I unido se extrajo en 100 \muL de hidróxido de sodio 1N y se cuantificó la radiactividad en estado "unido" frente a "libre" mediante recuento de centelleo en fase líquida. Tras la incubación de A\beta ^{125}I en presencia de cantidades crecientes del anticuerpo monoclonal, se realizó un análisis de Scatchard.

Clonación y ensamblaje de los genes recombinantes Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc a partir de hibridomas

Se prepara ARN mensajero (ARNm) a partir de 5 x 10^{8} células de hibridoma, según lo descrito por Griffiths y Milstein (1985). La síntesis de la primera cadena del ADNc se realizó según procedimientos estándar (Maniatis et al., 1989).

Amplificación por PCR, clonación de la región variable de unión al antígeno y construcción de anticuerpos monocatenarios

Se han desarrollado técnicas para la clonación de los dominios variables de inmunoglobulina a partir de ADN genómico y ADNc utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (Orlandi et al., 1989; Ward et al., 1989; Richardson et al., 1995). Los cebadores basados en las secuencias conservadas en cada extremo de las secuencias de nucleótidos que codifican para los dominios V de la cadena pesada (V_{H}) y de la cadena ligera kappa (V_{K}) de la inmunoglobulina de ratón también incorporan sitios de restricción que permiten realizar la clonación forzada del producto amplificado que contiene la región variable de cada cadena. Estos cebadores son capaces de amplificar la mayor parte del ARNm de inmunoglobulina del repertorio de ratón.

Según se muestra en la figura 4, la PCR realizada sobre el ADNc de las células hibridoma se realizó utilizando los cebadores descritos por Richardson et al., 1995. El gen ScFv de antisenilina se ensambló a partir del ADN amplificado correspondiente a las regiones V_{H} y V_{L} y un enlazador intercatenario, expresado por E. coli, y reamplificado mediante PCR empleando cebadores que incorporan un codón de parada en el extremo 3' V_{L}, según lo descrito por Richardson et al. 1995. Para preparar la construcción de un vector VAA recombinante, se incorporaron sitios de restricción XbaI en los cebadores directo e inverso para reamplificar el gen scFv recombinante, de forma que se facilite su introducción en el vector plasmídico de VAA pSSV, explicado inmediatamente a continuación.

Construcción de vectores víricos adenoasociados recombinantes para la expresión regional de genes scFv\alphaA\beta en el cerebro

Los genes ScFv\alphaA\beta ensamblados se ligaron en un plásmido VAA pSSV9 (psub201) bajo el control del promotor de la PAA\beta humana (hu\betaAPPP). El plásmido pSSV9 es un clon genómico modificado de VAA de tipo 2 de longitud completa. De forma alternativa, según lo comentado anteriormente, se pueden utilizar otros promotores adecuados, tales como Thy-1, sinapsina I, prión, etc., si bien se prefiere la utilización de hu\betaAPPP.

Según se muestra en la figura 5, se escindieron todas las secuencias que codifican para VAA, dejando únicamente las repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas, cortando por los dos sitios XbaI situados a los lados. Estas ITR contienen las señales de reconocimiento necesarias para la duplicación y empaquetamiento en un vector VAA. Las secuencias de codificación para VAA son reemplazadas por las secuencias de codificación para hu\betaAPPP_{H/K}A\beta. Las nuevas secuencias que codifican para VAA/hu\betaAPPP_{H/K}A\beta están seguidas por una señal de poliadenilación de la región temprana SV40.

Preparación de los vectores hu\betaAPPP_{H/K}A\betaAAV empaquetados

Los vectores VAA hu\betaAPPP_{H/K}A\beta se empaquetaron mediante co-complementación, según lo descrito por Samulski et al., 1989, utilizando una estirpe celular de riñón embrionario humano transformada mediante adenovirus, 293 (ATCC CRL-1573). Las células se cultivaron en medio mínimo esencial de Eagle (MEM) enriquecido con glutamina y sales de Earle en suero bovino fetal al 10% inactivado térmicamente a 37ºC en una incubadora humidificada con 5% de CO_{2}. Se cultivaron soluciones madre de adenovirus de tipo 5 (Ad5) por infección durante 1 h de 293 células subconfluentes con 10 \muL de cultivo de Ad5 en 1 mL de DMEM sin suero por 100 mm de placa. Transcurridas entre 48 y 72 h, cuando se observaron unos intensos efectos citopáticos, las células se recogieron y se precipitaron mediante centrifugación. Posteriormente, las células se lisaron mediante ciclos de congelación y descongelación a fin de liberar los virus intracelulares, y se eliminaron los residuos mediante centrifugación a bajar velocidad. Los sobrenadantes con virus se dividieron en alícuotas que se almacenaron a -70ºC. La co-complementación se realizó de la siguiente forma: se extendieron 293 células semiconfluentes en placas con una densidad de 0,5 x 10^{6} células por 100 mm de placa, y se infectaron con Ad5 con una multiplicidad de infección de 10. Tras 1 h, las células se co-transfectaron con 20 \mug de plásmidos VAA hu\betaAPPP_{H/K}\alphaA\beta y 10 \mug de pAd8 que contiene los genes de VAA 2 que codifican para las funciones de multiplicación y encapsulación de VAA, pero flanqueadas por repeticiones terminales derivadas del adenovirus 2, en vez del VAA (Samulski et al., 1987, 1989). La transfección se realizó utilizando un procedimiento de precipitación con fosfato de calcio estándar (Wigler et al., 1979) con la adición de difosfato de cloroquina para potenciar la eficacia de la transfección (Luthman et al., 1983). Tras una incubación durante toda la noche, la solución de transfección se reemplazó por medio nuevo que contenía suero bovino fetal al 15%. Tres días después de la infección, se recogieron las células, se precipitaron mediante centrifugación a 1000 x g durante 10 min, y posteriormente se sometieron a ciclos de congelación y descongelación a fin de liberar los viriones asociados a las células. El Ad5 contaminante se desactivó mediante calentamiento de los lisados a 56ºC. Posteriormente, los lisados se clarificaron mediante centrifugación y se trataron con 25 unidades/mL de ADNasa libre de ARNasa 37ºC durante 30 min para eliminar cualquier resto de ADN plasmídico.

Transducción de neuronas humanas para analizar la expresión de los vectores de VAA/hu\betaAPPP_{H/K}A\beta

La utilidad de VAA como posible vector ha sido determinada de forma inequívoca por Du et al., 1996, en neuronas NT humanas (Pleasure et al., 1993). El precursor de estas neuronas es una subestirpe de células de teratocarcinoma humanas, NT2, que se transforma por diferenciación terminal en neuronas tras la exposición al ácido retinoico (Lee et al., 1994; Pleasure et al., 1993). Cuatro semanas de tratamiento con ácido retinoico, acompañadas de un nuevo cultivo en placas selectivo, puede dar lugar a poblaciones de neuronas prácticamente puras (>95%). Estas neuronas maduras siguen siendo viables en cultivo durante varias semanas. Además de mostrar un aspecto morfológico característico y de expresar numerosos marcadores neuronales, las neuronas NT humanas presentan patrones similares de proteínas precursoras de amiloides que las neuronas nativas del SNC y producen péptidos A\beta (Wertkin et al., 1993).

Stratagene, La Jolla, CA suministra las células precursoras NT2 no diferenciadas, que se cultivan en Opti-MEM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) con 5% de suero bovino fetal (SBF) inactivado térmicamente, 100 unidades/mL de penicilina y 100 \mug/mL de estreptomicina (PS) a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se trataron 2 x 10^{6} células NT2 por matraz T75 con ácido retinoico 10 \muM durante cuatro semanas, tras lo cual se volvieron a cultivar en placas en baja densidad en seis matraces T75. Las capas superiores, que contienen las células diferenciadas, se separaron de forma mecánica y se volvieron a cultivar en placas con una densidad de 1 x 10^{6} células por pocillo en placas de 24 pocillos. Los pocillos y los cubreobjetos de vidrio se recubrieron con 0,01% de poli-D-lisina, seguido de 1:20 de MATRIGEL (Collaborative Research, Bedford, MA). Las células se cultivaron durante tres semanas en DMEM con alto contenido en glucosa/10% de SBF con L-glutamina, PS e inhibidores mitóticos. Las neuronas enriquecidas se mantuvieron en DMEM/10% SBF/PS a 37ºC, 5% de CO_{2}.

Las neuronas NT (aproximadamente 10^{5} por pocillo) se transducen con vectores VAA/hu\betaAPPP_{H/K}A\beta retirando el medio de crecimiento, lavando una vez con medio libre de suero y añadiendo solución madre de vector diluida en DMEM libre de suero. Tras incubar durante 90 min a 37ºC, se añadió a cada pocillo 1 mL de DMEM con 10% de SBF. Se realizó un cambio del medio de cultivo tras 2 días, y cada dos semanas a partir de entonces.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad de las células se evaluó sobre la base de la función mitocondrial de las células transducidas con el vector VAA hu\betaAPPPV_{H/K}A\beta y de las células de control. Se compararon los niveles de actividad deshidrogenasa mitocondrial utilizando bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-3-il)-2,5-difeiltetrazolio como sustrato. Su degradación a un producto de formazán de color púrpura por acción de la deshidrogenasa se cuantificó espectrofotométricamente a 570 nm.

Detección determinación de las constantes de afinidad de unión

A fin de verificar que los anticuerpos recombinantes secretados (antisenilinas) conserven las propiedades de unión de los anticuerpos hibridoma secretados originalmente, se realizaron ensayos ELISA, según lo descrito anteriormente en este ejemplo, con el medio de cultivo de las células transducidas NT2.

Bioensayos para evaluar la inhibición de las funciones de A\beta

Los anticuerpos secretados se aislaron del medio de cultivo en el que se incubaron las células transducidas NT2. Los anticuerpos purificados y el propio medio de cultivo se analizaron como inhibidores de la agregación de A\beta o de la citotoxicidad inducida por A\beta, según lo descrito anteriormente en los bioensayos in vitro.

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Generación de ratones transgénicos que expresan los anticuerpos antisenilina monocatenarios en el cerebro

El gen ScFv de antisenilina se introdujo en un vector de tipo cósmido de proteína priónica de hámster (PrP) en el que la pauta de lectura abierta (ORF) PrP es sustituida por la ORF del gen de antisenilina. Los transgenes se utilizaron para generar ratones transgénicos mediante microinyección de óvulos fertilizados de ratones C57B6SJL, según uno de los procedimientos ampliamente utilizados, tal como los descritos por Brinster et al. (1981), Harbers et al. (1981), Wagner et al. (1981), Gordon et al. (1976), Stewart et al., Palmiter et al. (1983), y la patente U.S.A. nº 4,870,009. La progenie resultante (TGScFvA) se sometió a un análisis mediante genotipado empleando procedimientos de amplificación por PCR estándar.

Modelos animales para determinar el potencial terapéutico de los anticuerpos \alpha\beta como antisenilinas

Se necesitaron modelos animales para evaluar la expresión de los anticuerpos anti-A\beta in vivo y determinar si presentan potencial de reducción de la acumulación de placas amiloideas y de prevención del desarrollo de patologías de tipo EA en el cerebro. Aunque la EA es una enfermedad exclusiva de los humanos, la observación de varios ratones transgénicos que sobreexpresan la PPA\beta humana parece prometedora.

Efectos de la eliminación crónica de A\beta sobre la carga de placas y la patología de la EA relacionada en ratones transgénicos

Se evaluó la función antisenilina de los anticuerpos recombinantes específicos contra los extremo de A\beta en un modelo animal de ratón transgénico que sobreexpresa la isoforma de 695 aminoácidos de la PPA\beta de Alzheimer que contiene una mutación de Lys670 a Asn, y de Met671 a Leu (Hsiao, K., WO 97/48792). La evaluación correlativa de las anomalías conductuales, bioquímicas y patológicas reminiscentes de la enfermedad de Alzheimer en estos ratones transgénicos (TG2576) brinda una oportunidad de explorar la utilidad de los agentes en la ralentización o prevención de la patofisiología inducida por A\beta de la enfermedad.

Se cruzaron ratones transgénicos hembra (TGScFvA) homocigóticos para el gen de la antisenilina con machos de cría TG2576. Las crías que expresan tanto el gen de antisenilina como el gen de la PPA variante se compararon con los ratones TG2576 en relación con las anomalías conductuales, bioquímicas y patológicas.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: CHAIN, Daniel G.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MOLÉCULAS DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES CON CODIFICACIÓN MEDIANTE ADN ESPECÍFICAS PARA TERMINACIONES AMILOIDES BETA, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE LAS MISMAS Y PROCEDIMIENTOS PARA PREVENIR O INHIBIR EL AVANCE DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK, P.L.L.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 419 Seventh Street N.W., Suite 300

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: D.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20004

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn edición nº 1.0, versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: YUN, Allen C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 37,971

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: CHAIN=1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (202) 628-5197

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (202) 737-3528

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 59 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

Claims (21)

1. Anticuerpo recombinante, específico contra el extremo N terminal libre de un péptido amiloide \beta o contra el extremo C terminal libre de un péptido amiloide \beta A\beta 1-40, en el que el anticuerpo no se une a la proteína precursora del amiloide \beta de la que dicho péptido amiloide \beta puede derivarse proteolíticamente.

2. Anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es específico contra el extremo N terminal libre de un péptido amiloide \beta.

3. Anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es específico contra el extremo C terminal de un péptido amiloide \beta A\beta 1-40.

4. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

6. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

7. Molécula de ADN recombinante, que comprende un gen que codifica para el anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un promotor unido de forma funcional a dicho gen, en la que dicho promotor es capaz de expresar dichas moléculas anticuerpo en las células cerebrales.

8. Molécula de ADN recombinante, según la reivindicación 7, en la que dicho promotor es un promotor PPA\beta.

9. Vector, que comprende la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 7 u 8.

10. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 9.

11. Composición farmacéutica para prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer, que comprende la molécula de ADN recombinante, según la reivindicación 7 u 8 asociada con un medio para la implantación de genes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Composición farmacéutica, según la reivindicación 11, en la que el medio de implantación de genes se selecciona entre el grupo compuesto por vectores víricos, lípidos catiónicos, liposomas catiónicos, ligandos capaces de unirse a un receptor superficial celular, y combinaciones de los anteriores.

13. Utilización de una molécula de ADN recombinante, según la reivindicación 7 u 8, para la preparación de una composición para prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer.

14. Utilización, según la reivindicación 13, en la que la composición se administra mediante inyecciones por vía intravenosa, intraarterial, intracraneal o intraencefálica.

15. Utilización, según la reivindicación 13 ó 14, en la que el medio de implantación de genes comprende un vector vírico.

16. Utilización, según la reivindicación 15, en la que el vector vírico es un vector adenoasociado (VAA).

17. Utilización, según la reivindicación 15 ó 16, en la que el medio de implantación de genes comprende además lípidos catiónicos o liposomas catiónicos.

18. Utilización, según la reivindicación 13 ó 14, en la que el medio de implantación de genes comprende lípidos catiónicos o liposomas catiónicos.

19. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en la que el medio de implantación de genes comprende un ligando capaz de unirse a un receptor superficial celular.

20. Utilización, según la reivindicación 19, en la que el ligando es biotina.

21. Utilización del anticuerpo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de una composición destinada a prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer.