ES2303937T3

ES2303937T3 - Uso de conglutina de altramuz para el tratamiento de diabetes tipo ii.

Info

Publication number: ES2303937T3
Application number: ES04708771T
Authority: ES
Inventors: Paolo Morazzoni; Marcello Duranti
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 2003-02-11
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2008-09-01
Anticipated expiration: 2024-02-06
Also published as: AU2004212297B2; IL170200A; CA2515607C; NO20053788L; DK1605957T3; JP5504301B2; KR20110033312A; RU2005125411A; PL377578A1; DE602004012984T2; CA2515607A1; NO20053788D0; RU2339393C2; JP2006517212A; KR20050106415A; DE602004012984D1; US20060142185A1; CY1108138T1; CN1747739A; ATE391510T1

Abstract

El uso de gamma conglutina de altramuz para la preparación de un medicamento, para el tratamiento de la diabetes de tipo II.

Description

Uso de conglutina de altramuz para el tratamiento de diabetes tipo II.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de gamma conglutina de altramuz para el tratamiento de la diabetes de tipo II.

Antecedentes técnicos

El altramuz (Lupinus albus), una planta anual que pertenece a la clase de las Leguminosas, ya se cultiva desde hace mucho tiempo en el área del Mediterráneo y en el Oriente Medio a causa de sus semillas, que se usan con objetivos alimentarios (debido a sus contenidos remarcables de proteínas) y en medicina tradicional como agentes antihelmínticos y antiparasitarios.

Las semillas de altramuz contienen alcaloides tóxicos de anillo de quinolizidina, tales como la lupanina, 13-oxi-lupanina, multiflorina y derivados, y metilalbina, que se sabe que ejercen acciones depresoras y paralizantes sobre el Sistema Nervioso Central. Dichos alcaloides, que son responsables del sabor amargo de las semillas de altramuz, y se producen en grandes cantidades en las semillas de altramuz salvaje, pero en pequeñas cantidades en las semillas del denominado altramuz dulce (Lupinus albus), pueden eliminarse mediante maceración en agua.

El resto dominante de proteína en las semillas de altramuz es la globulina uno, que representa el 87% del total. Dicho resto está constituido por proteínas insolubles en agua, que son solubles en soluciones salinas diluidas (Duranti y col. Phytochemistry, 20, 2071-2075, 1981). La gamma conglutina representa aproximadamente el 6% de las globulinas totales. El peso molecular aparente de la proteína, tal como se determina mediante filtración en gel, es aproximadamente de 199.000 Da (Duranti y col. en: Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical-Biochemistry-Vol. 11 (Van Driesche E, Rougè P, Beeckams S, Bog-Hansen TC eds.) 1997, Textop Publ., Hellerup, Dinamarca, pp. 881-85, 1997). La gamma conglutina está constituida por un monómero de peso molecular aparente de 47.000 Da. La reducción del monómero muestra que éste está constituido por dos cadenas de polipéptidos, con pesos moleculares aparentes de 30.000 Da y 17.000 Da, respectivamente, unidas mediante un puente disulfuro (Restani y col. Phytochemistry, 20, 2077-2083, 1981).

Se ha sugerido una estructura tetramérica para la gamma conglutina de altramuz basándose en los valores de las masas moleculares obtenidas en condiciones nativas y desnaturalizantes. La subunidad ligera de la gamma conglutina carece de carbohidratos unidos covalentemente, mientras que se ha encontrado que la subunidad pesada se glicosila.

La composición de aminoácidos difiere significativamente de la mayor parte de las proteínas de reserva del altramuz (Restani y col. 1981, más arriba). La gamma conglutina contiene, de hecho, un número de aminoácidos sulfatados y una cantidad representativa de lisina, treonina y triptófano, y demuestra ser muy resistente a la proteolísis mediante las proteasas endógenas y exógenas (Duranti, Narhung, 30, 271-274, 1986).

El conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína (Scarafoni y col., Biochim, Biophys. Acta 1519, 147-151, 2001) permite excluir cualquier homología de secuencias con las proteínas de reserva, las proteínas catalíticas o estructurales, y también de otras fuentes. La gamma conglutina muestra homologías o similitudes con otras proteínas, tales como la BG7S de soja (homología del 70%) (Kagawa y col., Febs Letters, 226, 145-149, 1987; Komatsu y col., Biosci. Biotec. Biochem. 58, 1705-1706, 1994) y con EDGP, una glicoproteína de la semilla de zanahoria (homología del 58%) (Satoh y col., Planta, 188, 432-438, 1992), cuya función tiene todavía que aclararse.

Se describió por Horvath (J. Pharmacol. (Amer), 38, 303, 1930) el uso de extracto total de altramuz como hipoglicemiante, que propuso éste como sustituto de la insulina en diabetes mellitus de tipo leve a media. Posteriormente, Clementi y Torrisi (Boll. Soc. It. Biol, Sper., 9, 1004, 1935 y Arch. Fisiol., 34, 290, 1935) identificaron el ingrediente activo hipoglicemiante en el alcaloide lupanina, cuyos efectos era sin embargo transitorios.

Se describió también por Pereira y col. (Biomedical research 22 (2) 103-109, 2001) el efecto hipoglicemiante in vitro de los extractos de semillas de altramuz blanco; sin embargo, se prepararon los extractos mediante la ebullición de las semillas de altramuz durante dos horas, lo que produce la desnaturalización de la proteína, en concreto de la gamma conglutina.

Se describió también recientemente el efecto hipoglicemiante de la ingesta de altramuz en Mario Villaroel y col, Archivos Latinoamericanos de Nutrición, Vol. 46, N. 3, 1996, pp. 234-237), lo que sugiere el uso de mermeladas de ciruela que contengan harina de altramuz para uso como alimento dietético para diabéticos.

En cuanto a lo que se refiere a la gamma conglutina, Duranti y col., (Phytochem. 56(6), 529-533, 2001) describieron su capacidad para interactuar con diferentes metales. A pH neutro, la gamma conglutina tiene una afinidad más elevada por el ión Zn^{2+}. Además, la gamma conglutina complejada con Zn^{2+} y Ni^{2+} se une a una columna de cromatografía por afinidad, la proteína unida se puede eluir usando agentes tamponantes a pH por debajo de 6 o que contengan EDTA o imidazol. Las curvas de retención de la gamma conglutina en la columna de afinidad por metales son congruentes con la curva de valoración del grupo secundario de la histidina (pKa = 6).

Sin embargo, no se ha descrito hasta la fecha el uso de la gamma conglutina para el tratamiento de la diabetes de tipo II.

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que la gamma conglutina de altramuz así como las proteínas que muestran una homología mayor del 50% con la gamma conglutina de altramuz, ejercen una acción hipoglicemiante remarcable.

Los ejemplos de proteínas conocidas que muestran una homología mayor del 50% con la gamma conglutina de altramuz son la BG7S de soja (homología del 70%) (Kagawa y col., Febs Letters, 226, 145-149, 1987; Komatsu y col., Biosci. Biotec. Biochem. 58, 1705-1706,1994) y la EDGP (homología del 58%) (Satoh y col., Planta, 188, 432-438, 1992).

La gamma conglutina y las proteínas homólogas demostraron también ser muy potentes en la reducción de las curvas en plasma tras la administración de glucosa en rata.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de la gamma conglutina de altramuz para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo II.

La presente invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas o nutricionales que comprenden gamma conglutina de altramuz.

La gamma conglutina de altramuz es una proteína tanto sustancialmente pura o tal como una mezcla o extracto de proteína de altramuz que contiene dicha gamma conglutina. Sustancialmente pura significa una concentración normalmente mayor de un 80% en peso, preferiblemente mayor de un 90%.

Se puede obtener la gamma conglutina de acuerdo al procedimiento esquematizado en la figura 3.

De acuerdo con dicho procedimiento, se trituran los altramuces, se descascaran las pepitas y se convierten en copos, que se desaceitan a continuación mediante extracción con solventes. Tras esto, los copos desaceitados se someten a un procedimiento A de extracción bajo condiciones ácidas para obtener rafinato A y extracto A ácido, que se vuelven a someter a la vez a tratamientos adicionales.

Comenzando desde el rafinato A, se llevan a cabo las siguientes etapas:

B): dos extracciones posteriores de rafinato A bajo condiciones ligeramente alcalinas, para obtener rafinato B, que se descarta y extracto B;

C): precipitación de las proteínas procedentes del extracto B mediante tratamiento con ácidos;

D): fraccionamiento de las proteínas, eliminación de las proteínas sólidas y clarificación del sobrenadante (SP) que se usa en una etapa posterior.

Al mismo tiempo, comenzando a partir del extracto A ácido resultante del procedimiento A de extracción ácida, se llevan a cabo las siguientes etapas:

E): clarificación del extracto A para obtener el extracto clarificado (AEP);

F1): ultrafiltración de AEP para obtener F1-retentato;

F2): diafiltración de la mezcla resultante de la combinación de SP y F1-retentato, para obtener retentato DFP y F2-permeato (que se descarta);

G): pasteurización y secado mediante pulverización de DFP para obtener NCGP (gamma conglutina nativa).

Se informa a continuación de los resultados de la experimentación farmacológica llevada a cabo con la gamma conglutina.

Se ensayó en ratas la actividad hipoglicemiante de la gamma conglutina de altramuz en comparación con la metformina (patrón de referencia).

Ejemplo 1

Se usaron ratas macho de linaje CD, con un peso inicial de 275-300 g. Se alojaron los animales en jaulas de makrolon en un ambiente con control automático de la luz (ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad), temperatura (21 \pm 1ºC) y humedad del 60 \pm 5%).

Se preparó la gamma conglutina de altramuz tal como en el Ejemplo 2. Se pretrataron (tiempo - 30 min) 100 ratas (divididas en 5 grupos de 30 animales cada uno) con:

Grupo: 1: vehículo (carboximetilcelulosa [CMC] al 1%; 2 ml/kg por vía oral)

Grupo: 2: gamma conglutina de altramuz (50 mg/kg por vía oral en CMC al 1%)

Grupo: 3: gamma conglutina de altramuz (100 mg/kg por vía oral en CMC al 1%)

Grupo: 4: gamma conglutina de altramuz (200 mg/kg por vía oral en CMC al 1%)

Grupo: 5: metformina (50 mg/kg por vía oral en CMC al 1%).

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Se trataron todas las ratas posteriormente (tiempo 0 min) oralmente con glucosa (2 g/kg) para aumentar los niveles de glucosa en plasma.

Inmediatamente antes de la administración de la glucosa (tiempo 0 min) y 30, 60 y 90 min después de la administración de la glucosa, se anestesiaron todos los animales (n = 5 ratas durante cada tiempo) con tiopental de sodio (50 mg/kg intraperitoneal) y se retiraron 5 ml de sangre de la vena cava. Se recogieron las muestras de sangre en jeringas que contenían EDTA (7,5 mM) como anticoagulante, y se sometieron inmediatamente a centrifugación (2000 g x 10 min a 4ºC) para obtener el plasma necesario para la cuantificación enzimática de la glucosa.

Se llevó a cabo la cuantificación de la glucosa en plasma de rata por triplicado mediante ensayo enzimático (absorbancia a 505 nm) y se expresó la concentración de glucosa en mg/dl.

De manera más precisa, se usó un kit enzimático (Glucosa-Trinder de Sigma Aldrich, con nº de catálogo 315-500) que contenía todos los reactivos necesarios para la reacción de Trinder (procedimiento glucosa-oxidasa).

Además, se validaron tanto la calibración con el espectrofotómetro como la calidad de la lectura en diferentes muestras de plasma mediante los reactivos patrón de Sigma-Aldrich (Calibrator, con nº de catálogo A-2539; ACCUTROL Normal, con nº de catálogo A-2034; ACCUTROL Anormal, con nº de catálogo A-3034). Se usó la gamma conglutina de altramuz del Ejemplo 2. La metformina, carboximetilcelulosa y diversos kits para la cuantificación de la glucosa, para el control de calidad y para la calibración del equipo se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Milán,
Italia).

Todos los valores informados en las tablas se expresaron como promedio \pm desviación estándar promedio (M. S. E.). Se llevaron a cabo los análisis estadísticos entre el Grupo 1 (ratas tratadas con vehículo) y los Grupos 2, 3, 4 y 5 (animales tratados con gamma conglutina de altramuz a diferentes concentraciones o con metformina) mediante las áreas bajo los valores de la curva (Fig. 2), en primer lugar mediante el análisis de la varianza (una ruta) y posteriormente mediante el ensayo de Dunnett (dos colas) con comparación múltiple. Se consideraron significativas las diferencias cuando P < 0,05.

Resultados

Las Figuras 1 y 2 resumen los resultados del experimento.

La administración por vía oral de 2 g/kg de glucosa aumentó los niveles de glucosa en plasma hasta 2,7 veces (85 \pm 6 a 232 \pm 18 mg/dl; P < 0,001) en las ratas control (vehículo). Dicho aumento alcanzó su pico 30 min después de la administración de la glucosa, a continuación, éste disminuyó gradualmente en un tiempo de 90 min (Fig. 1).

El pretratamiento de las ratas con la gamma conglutina de altramuz, administrada 30 min antes de la glucosa a dosis de 50, 100 y 200 mg/kg por vía oral, indujo una reducción significativa dependiente de la dosis en el aumento de los niveles de glucosa en plasma (Fig. 1 y 2).

De manera más concreta, considerando los valores del área bajo la curva (AUC), informados en la Fig. 2, el efecto obtenido con 200 mg/kg por vía oral de la gamma conglutina de altramuz (AUC = 2090 \pm 238) fue comparable a y no significativamente diferente del observado en el Grupo 5 (animales pretratados con 50 mg/kg por vía oral de metformina) (AUC = 1565 \pm 201).

Los resultados obtenidos muestran claramente que el pretratamiento de las ratas con gamma conglutina de altramuz reduce significativamente el aumento de los niveles de glucosa en plasma resultantes de la administración por vía oral de 2 g/kg de glucosa.

Ejemplo 2 Preparación de los copos de altramuz

Se trituraron aproximadamente 4,500 kg de altramuces y se separaron las cáscaras de las semillas, obteniendo de esta manera 3,440 kg de semillas y 1,060 kg de cáscaras. Las semillas trituradas se convirtieron en copos en un molino de rodillos, cuyos rodillos se mantuvieron a una temperatura por debajo de 40ºC para evitar la desnaturalización de la proteína. Se obtuvieron copos amarillos con forma de disco, que tenían una densidad a granel de 300 a 330 kg/m^{3}.

Extracción del aceite

Se llenaron lotes de 500 kg de copos procedentes de la etapa a) hasta 2 m de altura en una tubería vertical de 900 mm de diámetro y se desaceitaron mediante percolación con hexano. El procedimiento de extracción se repitió 4 veces y consistió en:

1): percolación con hexano blanco hasta que se hubieron recuperado 500 l de mezcla en el tanque,

2): recirculación de la mezcla durante 15 min,

3): escurrido de la porción líquida durante 15 min en las etapas 1 a 3 y durante 30 min en la etapa final de extracción.

Se eliminó bajo vacío (250 mbar, 25000 N/m^{2}) el hexano todavía presente en los copos desaceitados, con agitación durante 150 min, hasta que el contenido final de hexano fue de 250 ppm, que se redujo posteriormente a 50 ppm mediante soplado de aire. Se obtuvieron aproximadamente 430 kg de copos blancos.

A) Extracción de las proteínas bajo condiciones ácidas

Se suspendieron 185 kg de copos blancos en 1800 ml de agua ácida fría a pH 4,5-4,8 y a una temperatura entre 13,5 y 15,2ºC, con agitación mecánica ajustada a 55 rpm, y se extrajeron durante 1 hora. Se usaron aproximadamente 23,6 l de HCl 3 M para mantener el pH ácido a lo largo de la extracción. Se obtuvieron 385 kg de rafinato A y 1,600 l de extracto A ácido mediante centrifugación.

B) Separación del extracto de proteínas procedente del rafinato bajo condiciones ligeramente alcalinas

En una primera etapa, se extrajeron 385 kg de rafinato A con 900 l de agua a pH 7,2-7,4 y a 28,2 a 31,5ºC, con agitación mecánica a 60 rpm, durante 1 hora. Se añadió la solución con 50 ml de agente antiespumante Struktol SB 2010. Se usaron aproximadamente 19,6 l de NaOH 3 M para mantener el pH alcalino a lo largo de la extracción.

Se separaron aproximadamente 945 l de extracto de proteínas procedente del rafinato mediante centrifugación.

En una segunda etapa, se extrajo el rafinato obtenido mediante centrifugación con 540 l de agua a pH 7,3-7,4 y a una temperatura de 29,0 a 32,0ºC durante 15 min. Se usaron 0,3 l de NaOH 3 M para mantener el pH alcalino a lo largo de la extracción. Se obtuvieron aproximadamente 595 l de extracto II de proteínas y 242 kg de rafinato B.

Se combinaron los extractos I y II de proteínas para obtener 1,450 l de extracto B de proteínas.

C) Precipitación de las proteínas procedentes del extracto de proteínas bajo condiciones ácidas

Se añadió el extracto B de proteínas (1,540 l) con 16 l de HCl 3 m para ajustar el pH a 4,6-4,5 y con 50 ml del agente antiespumante anterior, con agitación mecánica a 85 rpm. Las proteínas precipitaron en el punto isoeléctrico (pH 4,5).

D) Separación de las proteínas precipitadas procedentes del sobrenadante

Se separó la dispersión de proteínas procedente de la etapa C) (aproximadamente 1,550 l) que tenía un contenido en sólidos que oscilaba entre 11,0 y 11,5% en volumen con un separador de tipo disco a 6.830 rpm. El contenido en sólidos en el extracto clarificado resultante fue de 0,0 a 0,1% en volumen. Se separaron aproximadamente 1,330 l de sobrenadante clarificado (SP) y 213 l de suspensión. El contenido de materia seca del sobrenadante clarificado fue de 0,4-0,5% y la materia seca contuvo un 70% de las proteínas totales.

E) Clarificación del extracto A ácido

Se clarificó el extracto A ácido (1,600 l) procedente de la extracción A ácida, que tenía un contenido de materia seca que oscilaba entre 2 y 2,5% en volumen, usando un separador de tipo disco a 7.500 rpm. El contenido en sólidos en el extracto clarificado resultante fue de entre un 0,1 a un 0,15% en volumen. Se separaron aproximadamente 1,500 l de extracto clarificado (AEP) y 100 l de suspensión. El contenido en sólidos en el extracto clarificado (AEP) fue de 2,2-2,5%, y la materia seca contenida fue el 25% de las proteínas totales.

F1) Ultrafiltración del extracto clarificado (AEP)

Se ajustaron 700 l de AEP desde pH 4,5 a pH 6,0-7,0 y se concentraron a través de la membrana de ultrafiltración a 3 bares (3 x 10^{5} N/m^{2}) de presión y 40ºC hasta que se hubo reducido el volumen final por un factor de 10 en comparación con el volumen de partida.

El contenido en materia seca del F1-retentato fue aproximadamente del 7%, y la materia seca contenida fue el 50% de las proteínas totales. Se descartó el F1-permeato.

F2) Diafiltración de SP y AEP

Se añadieron por etapas 233 l del sobrenadante clarificado (SP) procedente de la etapa D) al F1-retentato, y se recirculó la mezcla en la membrana hasta que se hubo reducido su volumen al del retentato de partida. Tras la etapa final de dilución, se continuó la recirculación hasta que el contenido en materia seca en el retentato diafiltrado (DFP) hubo alcanzado un nivel máximo, que osciló entre un 14,5 a un 15,0%, y la materia seca contenida fue aproximadamente el 84% de las proteínas totales. Se descartó el F2-permeato.

G) Pasteurización y secado mediante pulverización para obtener NCGP

Se ajustó el retentato diafiltrado (DFP) desde pH 6,5 a aproximadamente pH 5,2, se calentó a 40-65ºC en un intercambiador de calor constituido por una tubería con camisa con un diámetro interno de 6 mm y alimentada en un secador mediante pulverización. Se ajusto la temperatura de entrada del aire a 195ºC y la velocidad de alimentación del DFP fue de 8 a 10 l por hora. Se separó el polvo seco procedente de la corriente de aire usando un separador de tipo ciclón. El contenido en materia seca osciló entre un 94,0 y un 95,2%. Se obtuvieron aproximadamente 4,5 kg de gamma conglutina nativa (NCGP) a partir de 40 l de DFP.

La gamma conglutina preparada de acuerdo con este procedimiento contiene un 84,7% de proteínas, 0,6% de aceite y 6,4% de materia seca. La materia seca contiene una cantidad calculada de un 8,3% de sustancias libres de nitrógeno (NFE). El índice de solubilidad del nitrógeno del NCGP a pH 7 en solución acuosa al 1% es del 72,5%.

De acuerdo con la presente invención, se administrará la gamma conglutina por vía oral, bien sola o en combinación con otras sustancias con actividad útil o complementaria, formuladas como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes y similares. Se pueden preparar las formulaciones farmacéuticas con procedimientos convencionales, usando ingredientes conocidos en la técnica, tales como excipientes, ligandos, desintegrantes, lubricantes, agentes estabilizantes, y similares. La dosificación puede variar de acuerdo con los síntomas, el peso del paciente, la gravedad de la enfermedad y similar. En el caso de un paciente humano adulto, la dosificación diaria total de gamma conglutina de altramuz oscilará entre 150 y 750 mg, preferiblemente entre 50 y 250, en una dosis única o en dosis múltiples, por ejemplo, una a tres veces al día.

Claims

1. El uso de gamma conglutina de altramuz para la preparación de un medicamento, para el tratamiento de la diabetes de tipo II.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 de una mezcla o extracto de proteínas de altramuz que contiene dicha gamma conglutina.

3. Las composiciones farmacéuticas o nutricionales que contienen gamma conglutina de altramuz como ingrediente activo.

4. Las composiciones farmacéuticas o nutricionales de acuerdo con la reivindicación 3 que comprenden una mezcla o extracto de proteínas de altramuz que contiene la gamma conglutina de altramuz.

5. La gamma conglutina de altramuz como agente terapéutico.

6. La gamma conglutina de altramuz como agente hipoglicemiante.