RU2339393C2

RU2339393C2 - Применение конглютина для лечения диабета ii типа

Info

Publication number: RU2339393C2
Application number: RU2005125411/15A
Authority: RU
Inventors: Паоло МОРАЦЦОНИ (IT); Паоло МОРАЦЦОНИ; Марчелло ДУРАНТИ (IT); Марчелло ДУРАНТИ
Original assignee: Индена С.П.А.
Priority date: 2003-02-11
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2008-11-27
Also published as: HK1085927A1; JP2012153715A; CY1108138T1; NO333224B1; PT1605957E; NO20053788D0; DE602004012984D1; PL214193B1; EP1605957A1; CN1747739B; RU2005125411A; EP1605957B1; AU2004212297B2; ES2303937T3; AU2004212297A1; CA2515607A1; PL377578A1; CA2515607C; ITMI20030237A1; IL170200A

Abstract

Изобретение относится к области биохимии и медицины. Заявлено применение гамма-конглютина люпина или белков, обладающих более чем 50% гомологией с гамма-конглютином люпина, выбранных из BG7S сои или EDGP моркови, для приготовления лекарственного препарата, пищевых добавок или продуктов питания для лечения диабета II типа, а также для приготовления фармацевтических или пищевых композиций, содержащих гамма-конглютин люпина, смеси белков люпина или экстракт, содержащий гамма-конглютин люпина, и применение гамма-конглютина люпина в качестве сахаропонижающего средства. Гамма-конглютин люпина может быть использован как в чистом виде, так и в виде экстрактов, смесей и концентратов. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к применению конглютина люпина для лечения диабета II типа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Люпин (Lupinus albus), однолетнее растение, принадлежащее к классу бобовых, с древних времен выращивалось в Средиземноморском регионе и в Средней Азии на семена, которые применялись как для питания (благодаря значительному содержанию белков), так в традиционной медицине в качестве антигельминтного и антипаразитарного средства.

Семена люпина содержат токсичные хинолизидиновые циклические алкалоиды, такие как лупанин, 13-оксилупанин, мультифлорин и его производные, и метилальбин, которые обладают угнетающим и парализующим действием на центральную нервную систему. Указанные алкалоиды, ответственные за горький вкус семян люпина, содержатся в больших количествах в семенах дикого люпина, но их малые количества в так называемом сладком люпине (Lupinus albus) могут быть удалены вымачиванием в воде.

Преобладающей белковой фракцией в семенах люпина является глобулин, который составляет 87% от общего количества. Данная фракция состоит из нерастворимых в воде белков, которые растворимы в разбавленном растворе соли (Duranti et al., Phytochemistry, 20, 2071-2075, 1981). Гамма-конглютин составляет около 6% от всех глобулинов. Кажущаяся молекулярная масса белка, определенная способом гель-фильтрации, составляет около 199000 Да (Duranti at al., in: Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical-Biochemistry-Vol., 11 (Van Driesche E., Rougè P., Beeckams S., Bog-Hansen TC eds.), 1997, Textop Publ., Hellerup, Denmark, pp. 881-85, 1997). Гамма-конглютин состоит из мономера кажущейся молекулярной массы 47000 Да. Восстановление мономера показывает, что он состоит из двух полипептидных цепей кажущейся молекулярной массы 30000 Да и 17000 Да, соответственно соединенных дисульфидным мостиком (Restani at al., Phytochemistry, 20, 2077-2083, 1981).

Тетрамерная структура была предложена для гамма-конглютина люпина на основании значений молекулярной массы, полученных в нативных и денатурирующих условиях. В легкой субъединице гамма-конглютина отсутствуют ковалентно связанные углеводы, в то время как тяжелая субъединица является гликозилированной.

Аминокислотный состав значительно отличается от большинства запасаемых белков люпина (Restani et al., 1981, supra). Действительно, гамма-конглютин содержит ряд сульфатированных аминокислот, а также значительное количество лизина, треонина и триптофана, и проявляет весьма большую устойчивость к протеолизу как эндогенными, так и экзогенными протеазами (Duranti, Narhung, 30, 271-274, 1986).

Знание аминокислотной последовательности белка (Scarafoni et al., Biochim. Biophys. Acta, 1519, 147-151, 2001) позволяет исключить какую-либо гомологию в последовательностях с запасаемыми, каталитическими или структурными белками, в т.ч. полученными из других источников. Гамма-конглютин проявляет гомологию или сходство с другими белками, такими как соевый BG7S (70% гомологии) (Kagawa et al., Febs Letters, 226, 145-149, 1987; Komatsu et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1705-1706, 1994) и с EDGP, гликопротеидом из семян моркови (58% гомологии) (Satoh et al., Planta, 188, 432-438, 1992), функция которых пока неясна.

Применение общего экстракта люпина как сахаропонижающего средства описано Horvath (J. Pharmacol. (Amer.) 38, 303, 1930), который предложил его как заменитель инсулина при легком и среднем сахарном диабете. Вслед за этим Clementi и Torrisi (Boll. Soc. It. Biol. Sper., 9, 1004, 1935 и Arch. Fisiol., 34, 290, 1935) идентифицировали сахаропонижающий активный ингредиент алкалоида лупанина, чье действие было тем не менее кратковременным.

Сахаропонижающий эффект люпиновой муки недавно описан в Mario Villaroel et al., Archivos Lationoamericanos de Nitrición, vol. 46, N. 3, 1996, pp. 234-237), где предложено применение сливового джема, содержащего люпиновую муку в качестве диетического питания для диабетиков.

Что касается гамма-конглютина, Duranti et al. (Phytochem. 56(6), 529-533, 2001), описана его способность взаимодействовать с различными металлами. При нейтральном значении рН гамма-конглютин имеет высочайшее сродство к иону Zn²⁺. Кроме того, гамма-конглютин связывается в аффинной хроматографической колонке, образуя комплексы с Zn²⁺ и Ni²⁺; связанный белок может быть элюирован с помощью буферных агентов при значении pH ниже 6 или содержащих ЭДТА или имидазол. Кривые удерживания гамма-конглютина в аффинной колонке с металлами конгруэнтны с кривыми титрования боковой группы гистидина (pKa=6).

Тем не менее, применение гамма-конглютина для лечения диабета II типа на сегодняшний день не было обнаружено.

В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что гамма-конглютин люпина так же, как белки, обладающие более чем 50%-й гомологией с гамма-конглютином люпина, оказывают заметное сахаропонижающее действие.

Примеры известных белков, обладающих более чем 50%-й гомологией с гамма-конглютином люпина, включают в себя соевый BG7S (70% гомологии) (Kagawa et al., Febs Letters, 226, 145-149, 1987; Komatsu et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1705-1706, 1994) и EDGP (58% гомологии) (Satoh et al., Planta, 188, 432-438, 1992).

Гамма-конглютин и гомологичные белки также вызывают весьма сильное снижение сахарных кривых после введения глюкозы у крыс.

Следовательно, настоящее изобретение относится к применению гамма-конглютина люпина и белков, проявляющих более чем 50%-ю гомологию с гамма-конглютином люпина, для приготовления лекарственного препарата, пищевых добавок или продуктов питания для лечения диабета II типа.

Гамма-конглютин люпина предпочтителен либо в виде по существу чистого белка, либо в виде смеси белков люпина, либо в виде экстракта, содержащего указанный гамма-конглютин. "По существу чистый" означает обычно концентрацию выше 80%, предпочтительно выше 90%.

Гамма-конглютин может быть получен в результате процесса, схематично изображенного на фиг.3.

В соответствии с данным процессом семена люпина дробят, ядра освобождают от оболочек и измельчают, а затем обезжиривают путем экстракции растворителями. После этого обезжиренные хлопья подвергаются процессу экстракции А в кислых условиях, чтобы получить рафинат А и кислый экстракт А, которые, в свою очередь, подвергаются дальнейшей обработке.

Над рафинатом А выполняются следующие действия:

В) две последовательных экстракции рафината А в слабощелочных условиях для получения рафината В, который отбрасывается, и экстракта В;

С) осаждение белков из экстракта В обработкой кислотами;

D) фракционирование белков, удаление твердых белков и осветление супернатанта (SP), который используется в следующей стадии.

Одновременно над кислым экстрактом А, полученным в процессе кислотной экстракции на стадии А, выполняются следующие стадии:

Е) осветление экстракта А для получения осветленного экстракта А (AEP);

F1) ультрафильтрация AEP для получения F1-ретентата;

F2) диафильтрация смеси, получаемой при комбинировании SP и F1-ретентата для получения DFP и F2-пермеата (который отбрасывается);

G) пастеризация и сушка распылением DFP для получения NCGP (нативного гамма-конглютина).

Результаты фармакологических экспериментов, выполненных с гамма-конглютином, приведены ниже.

Сахаропонижающая активность гамма-конглютина люпина была изучена на крысах в сравнении с метформином (стандартное сравнение).

Пример 1

Использовались самцы крыс линии CD с начальной массой 275-300 г. Животные содержались в клетках из макролона в условиях при автоматическом контроле освещенности (12 часов света/12 часов темноты), температуре (21±1°С) и влажности (60±5%).

Применялся гамма-конглютин люпина, приготовленный, как описано в примере 2. 100 крысам (разделенным на 5 групп по 30 животных в каждой) были предварительно введены (время - 30 мин):

группа 1: носитель (1% карбоксиметилцеллюлоза [CMC]; 2 мл/кг живого веса)

группа 2: гамма-конглютин люпина (50 мг/кг живого веса в 1% СМС)

группа 3: гамма-конглютин люпина (100 мг/кг живого веса в 1% СМС)

группа 4: гамма-конглютин люпина (200 мг/кг живого веса в 1% СМС)

группа 5: метформин (50 мг/кг живого веса в 1% СМС)

Все крысы позже (время 0 мин) получили перорально глюкозу (2 г/кг) для поднятия содержания глюкозы в плазме.

Непосредственно перед введением глюкозы (время 0 мин), а также через 30, 60 и 90 минут после введения глюкозы всех животных (n=5 крыс для каждого интервала времени) анестезировали тиопенталом натрия (50 мг/кг, в/б) и из полой вены взяты 5 мл крови. Образцы крови отбирались в шприцы, содержащие ЭДТА (7,5 мМ) в качестве антикоагулянта, и немедленно подвергались центрифугированию (2000g × 10 минут при 4°С) с получением плазмы, необходимой для ферментного количественного определения глюкозы.

Количественное определение глюкозы в плазме крови крыс выполняли с помощью ферментного анализа в трех повторах (поглощение при 505 нм) и концентрацию глюкозы выражали в мг/дл.

Более точно, применяли ферментный набор (Glucose-Trinder от Sigma Aldrich, кат. 315-500), содержащий все необходимые реагенты для реакции Триндера (глюкозооксидазный метод).

Кроме того, для калибровки спектрофотометра и качества считывания различных образцов плазмы использовали стандартные реагенты от Sigma Aldrich (Calibrator, кат. А-2539; ACCUTROL Normal, кат. А-2034, ACCUTROL Abnormal, кат. А-3034). Применяли гамма-конглютин люпина из примера 2. Метформин, карбоксиметилцеллюлоза и различные наборы для количественного определения глюкозы, контроля качества и калибровки прибора приобретали на Sigma Aldrich (Милан, Италия).

Все значения выражали как среднее ± среднеквадратическая ошибка (M.S.E.). Статистический анализ между группой 1 (крысы, получавшие носитель) и группами 2, 3, 4 и 5 (животные, получавшие гамма-конглютин люпина в различных концентациях или метформин) проводили на значениях областей под кривыми (фиг.2) сначала с помощью вероятностного анализа (одностороннего), а затем с помощью теста Dunnett (два "хвоста") с множественным сравнением. Различия считали значимыми при Р<0,05.

Результаты

На фиг.1 и 2 сведены результаты эксперимента.

Пероральное введение 2 г/кг глюкозы повышало содержание глюкозы в плазме в 2,7 раза (от 85±6 до 232±18 мг/дл; Р<0,001) в контрольной группе крыс (носитель). Данное повышение достигало своего пика через 30 минут после введения глюкозы, потом оно постепенно снижалось к 90 минуте (фиг.1).

Предварительное введение крысам гамма-конглютина люпина за 30 минут до глюкозы в дозах 50, 100 и 200 мг/кг живого веса индуцировало значительное дозозависимое снижение подъема содержания глюкозы в плазме (фиг.1 и 2).

Более конкретно, рассматривая значения области под кривой (AUC), представленных на фиг.2, эффект, полученный при применении 200 мг/кг гамма-конглютина люпина (AUC=2090±238), был сравним и незначительно отличался от того, который наблюдался в группе 5 (животные, предварительно получавшие 50 мг/кг метформина) (AUC=1565±201).

Полученные результаты ясно показывают, что предварительное введение крысам гамма-конглютина люпина значительно уменьшает повышение содержания глюкозы в плазме, вызванное пероральным введением 2 г/кг глюкозы.

Пример 2

Приготовление хлопьев люпина

Около 4500 кг семян люпина были раздроблены, оболочки отделены от ядрышек, таким образом получено 3440 кг ядрышек и 1060 кг шелухи. Раздробленные ядрышки превращены в хлопья на шаровой мельнице, температура вальцов которой поддерживалась ниже 40°С, для предупреждения денатурации белков. Получены желтые дисковидные хлопья, имеющие плотность от 300 до 330 кг/м³.

Экстракция масел

Загрузка из 500 кг хлопьев, полученных на стадии а), помещена в вертикальную трубку высотой 2 м и 900 мм в диаметре и обезжирена перколяцией гексаном. Процесс экстракции был повторен четырежды и состоял из

1) перколяции белым гексаном до тех пор, пока 500 л смеси не будут выделены в емкости,

2) рециркуляции смеси в течение 15 минут,

3) сливания жидкой фракции в течение 15 минут на стадиях 1-3 и в течение 30 минут на заключительной стадии экстракции.

Гексан, все еще остающийся в обезжиренных хлопьях, удаляли под вакуумом (250 мбар) при перемешивании в течение 150 мин до конечного содержания гексана 250 м.д., которое впоследствии снижали до 50 м.д. продуванием воздухом. Получали около 430 кг белых хлопьев.

А) Экстракция белка в кислых условиях

185 кг белых хлопьев суспендировали в 1800 мл холодной подкисленной воды при рН 4,5-4,8 и при температуре от 13,5 до 15,2°С при механическом перемешивании при 55 об/мин и экстрагировали в течение 1 часа. Для поддержания кислого значения рН во время экстракции использовали около 23,6 л 3М HCl. Центрифугированием получали 385 кг рафината А и 1600 л кислого экстракта А.

В) Разделение экстракта белка и рафината в слабощелочных условиях

На первой стадии 385 кг рафината А экстрагировали 900 л воды при рН 7,2-7,4 и 28,2-31,5°С при механическом перемешивании при 60 об/мин в течение 1 часа. К раствору был добавлен пеногаситель Struktol SB 2010. Для поддержания щелочной рН во время экстракции использовали около 19,6 л 3М NaOH.

Около 945 л экстракта белка отделяли от рафината центрифугированием.

На второй стадии рафинат, полученный центрифугированием, экстрагировали 540 л воды при рН 7,3-7,4 и при температуре от 29,0 до 32,0°С в течение 15 минут. 0,3 л 3М NaOH использовали для поддержания щелочной рН в ходе экстракции. Получали около 595 л экстракта белка II и 242 кг рафината В.

Экстракты белка I и II объединяли и получали 1540 л экстракта белка В.

С) Осаждение белков из экстракта белка в кислых условиях

К экстракту белка В (1540 л) прибавили 16 л 3М HCl для доведения рН до 4,6-4,5 и 50 мл указанного пеногасителя при механическом перемешивании при 85 об/мин. Белки осаждались в изоэлектрической точке (рН 4,5).

D) Разделение осажденных белков и супернатанта

Дисперсию белков, полученную на стадии С (около 1550 л), содержащую твердые частицы в количестве от 11,0 до 11,5 об.%, разделяли на дисковом сепараторе при 6830 об/мин. Содержание твердых частиц в полученном осветленном супернатанте составляло 0,0-0,1 об.%. Получено около 1330 л осветленного супернатанта (SP) и отделено 213 л отстоя. Содержание сухого вещества в полученном осветленном супернатанте было от 0,4 до 0,5%, а сухой остаток содержал 70% общего белка.

Е) Осветление кислого экстракта А

Кислый экстракт А (1600 л), полученный при кислотной экстракции А, содержащий от 2 до 2,5 об.% сухого вещества, осветляли при дисковом сепараторе при 7500 об/мин. Содержание твердых частиц в полученном осветленном экстракте составляло от 0,1 до 0,15 об.%. Разделяли около 1500 л осветленного экстракта (AEP) и 100 л отстоя. Содержание твердых частиц в осветленном экстракте (AEP) составляло 2,2-2,5%, а сухое вещество содержало 25% общего белка.

F1) Ультрафильтрация осветленного экстракта (AEP)

700 л AEP доводили от рН 4,5 до рН 6,0-7,0 и концентрировали мембранной ультрафильтрацией под давлением в 3 бар при температуре 40°С до конечного объема, меньшего в 10 раз по сравнению с исходным.

Содержание сухого вещества в F1 ретентате составляло около 7%, и сухое вещество содержало 50% общего белка. F1 пермеат отбрасывали.

F2) Диафильтрация SP и AEP

233 л осветленного супернатанта SP, полученного в стадии D), были постепенно добавлены в F1 ретентат, и полученную смесь пропускали через мембрану до тех пор, пока объем ее не уменьшился до исходного объема ретентата. После последней стадии разбавления рециркуляцию продолжали до тех пор, пока содержание сухого вещества в диафильтрационном ретентате (DFP) не достигало максимального уровня, который составлял от 14,5 до 15,0%, а сухое вещество содержало около 84% общего белка. F2 пермеат отбрасывали.

G) Пастеризация и сушка распылением с получением NCGP

Диафильтрационный ретентат (DFP) доводили от рН 6,5, примерно до рН 5,2, нагревали до 40-65°С в теплообменнике, с внутренним диаметром 6 мм, состоящем из трубки с рубашкой, и помещали в распылительную сушилку. Температура входящего воздуха была установлена 195°С, а скорость подачи DFP от 8 до 10 л в час. Сухой порошок выделялся из воздушного потока при помощи циклонного пылеуловителя. Содержание сухого вещества колебалось от 94,0 до 95,2%. Из 40 л DFP получали примерно 4,5 кг нативного гамма-конглютина (NCGP).

Гамма-конглютин, приготовленный в соответствии с этим процессом, содержит 84,7% белков, 0,6% масел и 6,4% сухого вещества. Сухое вещество содержит рассчитанное количество 8,3% веществ, не содержащих азота (NFE). Азотный индекс растворимости NCGP при рН 7 в 1% водном растворе составляет 72,5%.

В соответствии с данным изобретением гамма-конглютин будет вводиться перорально, либо отдельно, либо в сочетании с другими веществами с полезной или комплементарной активностью в виде таблеток, капсул, гранул, порошков, сиропов и т.п. Фармацевтические формы могут быть приготовлены по общепринятым процедурам с использованием известных в технике ингредиентов, таких как наполнители, лиганды, разрыхлители, лубриканты, стабилизаторы и т.п. Дозировка может варьироваться в зависимости от симптомов, массы пациента, тяжести заболевания и т.п. Для взрослого пациента общая дневная доза гамма-конглютина люпина может колебаться от 150 до 750 мг, предпочтительно от 50 до 250 мг, однократно или многократно, например от одного до трех раз в сутки.

Claims

1. Применение гамма-конглютина люпина или белков, обладающих более чем 50%-ной гомологией с гамма-конглютином люпина, выбранных из BG7S сои или EDGP моркови, для приготовления лекарственного препарата, пищевых добавок или продуктов питания для лечения диабета II типа.

2. Применение по п.1 гамма-конглютина люпина.

3. Применение по п.1 или 2 смеси белков люпина или экстракта, содержащего указанный гамма-конглютин.

4. Фармацевтическая или пищевая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента гамма-конглютин люпина или белки, обладающие более чем 50%-ной гомологией с гамма-конглютином люпина, выбранные из BG7S сои или EDGP моркови.

5. Фармацевтическая или пищевая композиция по п.4, содержащая смесь белков люпина или экстракт, содержащий гамма-конглютин люпина.

6. Гамма-конглютин люпина в качестве сахаропонижающего средства.