NO333224B1

NO333224B1 - Anvendelse av lupin-konglutin gamma for behandling av type II diabetes og farmasoytiske eller ernaeringssammensetninger inneholdene lupin-konglutin gamma.

Info

Publication number: NO333224B1
Application number: NO20053788A
Authority: NO
Inventors: Paolo Morazzoni; Marcello Duranti
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2003-02-11
Filing date: 2005-08-10
Publication date: 2013-04-15
Also published as: PT1605957E; EP1605957B1; DK1605957T3; CA2515607C; JP2006517212A; US20060142185A1; CY1108138T1; HK1085927A1; RU2005125411A; EP1605957A1; JP2012153715A; JP5504301B2; US7323441B2; ATE391510T1; CN1747739B; NO20053788L; PL377578A1; KR20110033312A; PL214193B1; ITMI20030237A1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av lupinkonglutin gamma eller av proteiner med homologi høyere enn 50% med lupin-konglutin gamma, for fremstilling av et medikament, mattilsetninger eller mat for behandlingen av type II diabetes, farmasøytiske eller ernæringssammensetninger inneholdende lupin-konglutin gamma og anvendelse av lupin-konglutin gamma som terapeutisk middel, spesielt som hypoglykemiserende middel. Lupinkonglutin gamma kan anvendes i ren form eller i form av ekstrakter, blandinger eller konsentrater.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av lupin-konglutin gamma for behandlingen av type II diabetes samt farmasøytiske eller ernæringssammensetninger inneholdende lupin-konglutin gamma.

Teknisk bakgrunn

Lupin { Lupinus albus), en ettårig plante tilhørende Leguminosae-klassen, har langt tilbake i tid blitt dyrket ved Middelhavet og i Midtøsten for frøene som anvendes både for ernæringsformål (på grunn av deres bemerkelsesverdige proteininnhold) og i tradisjonell medisin som anthelmintiske og antiparasittiske midler.

Lupinfrø inneholder giftige kinolizidinringalkaloider, slik som lupanin, 13-oksy-lupanin, multiflorin og derivater, og metyl-ablin, som er kjent for å utøve deprimerende og paralyserende påvirkninger på sentralnervesystemet. Alkaloidene, som er ansvarlige for lupinfrøs bitre smak og forekommer i store mengder i ville lupinfrø, men i små mengder i såkalt søt lupin { Lupinus albus), kan fjernes ved oppløsning i vann.

Den alminnelige proteinfraksjonen i lupinfrø er globulin, som utgjør 87 % av totalen. Fraksjonen består av vannuoppløselige proteiner, som er oppløselige i fortynnede saltløsninger (Duranti et al. Phytochemistry, 20, 2071-2075, 1981). Konglutin gamma utgjør omkring 6 % av den totale mengden globuliner. Observert proteinmolekylvekt, som bestemt ved gel-filtrering, er omkring 199 000 Da (Duranti et al. i: Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical-Biochemistry-Vol.ll (Van Driesche E, Rougé P, Beeckams S, Bog-Hansen TC eds.) 1997, Textop Publ., Hellerup, Danmark, s. 881-85, 1997). Konglutin gamma består av en monomer av observert molekylvekt på 47 000 Da. Reduksjonen av monomeren viser at den består av to polypeptidkjeder med observert molekylvekt på henholdsvis 30 000 Da og 17 000 Da, bundet ved en disulfidbinding (Restani et al. Phytochemistry, 20, 2077-2083, 1981).

Det har blitt foreslått en tetrametrisk struktur for lupin-konglutin gamma basert på molekylmasseverdiene oppnådd under naturlige og denaturerende betingelser. Konglutin gamma lett subenhet mangler kovalent bundne karbohydrater, mens den tunge subenheten har blitt funnet å være glykosylert. Aminosyresammensetningen atskiller seg signifikant fra de fleste lupin reserveproteiner (Restani et al. 1981, supra). Konglutin gamma inneholder faktisk et antall sulfatiske aminosyrer og en akseptabel mengde lysin, treonin og tryptofan og viser seg å være svært motstandsdyktig mot proteolyse ved både endogene og eksogene proteaser (Duranti, Narhung, 30, 271-274, 1986).

Kjennskapen til aminosyresekvensen i protein (Scarafoni et al., Biochim. Biophys. Acta 1519, 147-151, 2001) gjør det mulig å ekskludere enhver sekvens homolog

med reserveproteiner, katalytiske eller strukturelle proteiner, også fra andre kilder. Konglutin gamma viser homologier eller likheter med andre proteiner, slik som soya BG7S (70 % homologi) (Kagawa et al., Febs Letters, 226, 145-149, 1987, Komatsu et al., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1705-1706, 1994) og med EDGP, et glykoprotein fra gulrotfrø (58 % homologi) (Satoh et al., Planta, 188, 432-438, 1992), hvis funksjon må klarlegges ytterligere.

Anvendelsen av lupin total ekstrakt som hypoglykemi ble beskrevet av Horvath (J. Pharmacol. (Amer.), 38, 303, 1930), som foreslo det som et substitutt for insulin i mild til medium diabetes mellitus. Deretter identifiserte dementi og Torrisi { Boll. Soc. It. Biol. Sper., 9, 1004, 1935 e Arch. Fisiol. 34, 290, 1935) den hypoglykemiserende aktive ingrediensen i alkaloid lupanin, hvis effekt imidlertid var umiddelbar.

Den hypoglykemiserende effekten til lupinmel ble også nylig beskrevet i Mario Villaroel et al, Archivos Latinoamericanos de Nutricion, Vol. 46, N. 3, 1996, s 234-237) som foreslår anvendelse av plommesyltetøy inneholdende lupinmel for anvendelse som dietetisk mat for diabetikere.

Når det gjelder konglutin gamma, beskrev Duranti et al., (Phytochem. 56(6), 529-533, 2001) dens evnet til å interagere med forskjellige metaller. Ved nøytral pH, har konglutin gamma den høyeste affinitet for Zn<2+->ion. Videre er konglutin gamma bundet i en affinitetskromatografikolonne sammensatt med Zn<2+>og Ni<2+>, det bundne proteinet kan elueres ved anvendelse av buffermidler ved pH under 6 eller inneholdende EDTA eller imidazol. Konglutin gamma retensjonskurver i metallaffinitetskolonne er kongruente med titreringskurven for histidinsidegruppen (pKa = 6).

Anvendelse av konglutin gamma for behandlingen av type II diabetes har imidlertid ikke tidligere blitt beskrevet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse har det blitt funnnet at lupin-konglutin gamma så vel som proteiner med homologi høyere enn 50 % med lupin-konglutin gamma, utviser bemerkelsesverdig hypoglykemiserende virkning.

Eksempler på kjente proteiner med homologi høyere enn 50 % med lupin-konglutin gamma inkluderer soya BG7S (70 % homologi) (Kagawa et al., Febs Letters, 226, 145-149, 1987; Komatsu et al., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1705-1706, 1994) og EDGP (58 % homologi) (Satoh et al., Planta, 188, 432-438, 1992).

Konglutin gamma og homologe proteiner viste seg også svært effektive i å redusere plasmakurver etter glukoseadministrasjon i rotte.

Som teknikkens stand skal også kort nevnes FREDERICO C. PEREIRA ET AL., "Insulinotropic action of white lupine seeds (Lupinus albus L.): effects on ion fluxes and insulin secretion from isolated pancreatic islets", Biomedical Research, vol. 22, no. 2, 2001, s. 103-109 hvor det gjøres kjent en farmasøytisk sammensetning bestående av et vandig ekstrakt av hvite lupinfrø, samt GIRMA M. WOLDEMICHEL ET AL., "Triterpene glycosides of Lupinus angustifolius", Phytochemistry, vol. 60, 2002, s. 323-327 hvor sammensetningen i hele frø av Lupinus angustifolius L.

(Leguminosae) har blitt studert.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor anvendelse av lupin-konglutin gamma for fremstilling av et medikament, mattilsetning eller mat for behandlingen av type II diabetes.

Foreliggende oppfinnelse vedrører ytterligere farmasøytiske eller ernæringssammensetninger inneholdende lupin-konglutin gamma som aktiv ingrediens.

Lupin-konglutin gamma er foretrukket, enten som vesentlig rent protein eller som en lupin-proteinblanding eller ekstrakt inneholdende konglutin gammaen. Vesentlig ren betyr en konsentrasjon typisk høyere enn 80 vekt%, foretrukket høyere enn 90 %<.>

Konglutin gamma kan oppnås i henhold til fremgangsmåten skjematisert på figur 3.

Ifølge fremgangsmåten knuses lupiner, kjerner avskalles og skives, deretter fjernes olje ved ekstrahering med løsemidler. Etter dette utsettes oljefrie flak for en ekstraheringsprosess A under sure betingelser for å oppnå raffinat A og sur ekstrakt A, som igjen utsettes for ytterligere behandlinger.

Med utgangspunkt i raffinat A utføres følgende trinn:

B) to påfølgende ekstraheringer av raffinat A under ubetydelige alkaliske betingelser for å oppnå raffinat B, som forkastes, og ekstrakt B,

C) utfelling av proteinene fra ekstrakt B ved syrebehandling,

D) fraksjonering av proteinene, eliminering av de faste proteinene og klaring av supernatanten (SP) som anvendes i et senere trinn.

Samtidig, med utgangspunkt i acidisk ekstrakt A resulterende fra syreekstraheringsprosessen A, utføres følgende trinn:

E) klaring av ekstrakt A for å oppnå klaret ekstrakt (AEP),

Fl) ultrafiltrering av AEP for å oppnå Fl-retenat,

F2) diafiltrering av blandingen oppnådd ved å kombinere SP og Fl-retenat, for å oppnå retenat DFP og F2-permeat (som forkastes), G) pasteurisering og spraytørking av DFP for å oppnå NCGP (naturlig konglutin gamma).

Resultatene av de farmakologiske forsøkene utført med konglutin gamma rapporteres i det følgende.

Den hypoglykemiserende aktiviteten til lupin-konglutin gamma ble testet i rotter sammenlignet med metformin (standard referanse).

Eksempel 1

Hann CD-raserotter, med utgangsvekten 275-300 g ble anvendt. Dyrene ble huset i makrolonbur i omgivelser med automatisk kontroll av lys (12 timer lys/12 mørke-sykluser), temperatur (21 ± 1°C) og fuktighet (60 ± 5 %).

Lupin-konglutin gamma fremstilt som beskrevet i eksempel 2 ble anvendt. 100 rotter (delt i 5 grupper på 30 dyr hver) ble forbehandlet (tid - 30 minutter) med:

Gruppe 1: bærer (1 % karboksymetylcellulose [CMC}, 2 ml/kg os)

Gruppe 2: lupin-konglutin gamma (50 mg/kg os i 1 % CMC)

Gruppe 3: lupin-konglutin gamma (100 mg/kg os i 1 % CMC)

Gruppe 4: lupin-konglutin gamma (200 mg/kg os i 1 % CMC)

Gruppe 5: metformin (50 mg/kg os i 1 % CMC)

Alle rottene ble deretter behandlet (tid 0 minutter) oralt med glukose (2 g/kg) for å øke glukoseplasmanivåer.

Rett før administrasjon av glukose (tid 0 minutter) og 30, 60 og 90 minutter etter administrasjon av glukose ble alle dyrene (n=5rotter hver gang) bedøvd med natriumtiopental (50 mg/kg i.p.) og 5 ml blod ble tappet fra hulvenen. Blodprøver ble samlet i sprøyter inneholdende EDTA (7,5 mm) som antikoagulant, og straks utsatt for sentrifugering (2 000 g x 10 minutter ved 4°C) for å oppnå plasmaen nødvendig for den enzymatiske kvantifiseringen av glukose.

Kvantifiseringen av glukose i rotteplasma ble utført i triplikat ved enzymatisk assay (absorbering ved 505 nm) og glukosekonsentrasjonen ble beregnet i mg/dl.

Mer nøyaktig ble et enzymatisk kit (Glucose-Trinder fra Sigma Aldrich, kat. 315-500) inneholdende alle reagensene nødvendige for Trinder-reaksjonen (glukose-oksidasemetode) anvendt.

Videre ble både spektrofotometerkalibreringen og lesekvaliteten av ulike plasmatyper gjort gyldig ved standard reagenser fra Sigma-Aldrich (Calibrator, kat. A-2539, ACCUTROL Normal, kat. A-2034, ACCUTROL Abnormal, kat. A-3034). Lupin-konglutin gamma ifølge eksempel 2 ble anvendt. Metformin, karboksymetylcellulose og forskjellige kit for glukosekvantifisering, for kvalitetskontroll og for kalibrering av apparatet ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (Milano, Italia).

Alle verdiene rapportert i tabellene er uttrykt som gjennomsnittlig gjennomsnittlig standard avvik (M.S.E). Statistiske analyser mellom gruppe 1 (bærer-behandlede rotter) og gruppe 2, 3, 4 og 5 (dyr behandlet med lupin-konglutin gamma i ulike konsentrasjoner eller med metformin) ble utført i områdene under kurveverdiene (figur 2), først ved variansanalyse (en vei) og deretter ved Dunnetts test (to haler) med flere sammenligninger. Forskjeller ble vurdert som signifikante når P<0,05.

Resultater

Figur 1 og 2 oppsummerer forsøksresultatene.

Den orale administrasjonen av 2 g/kg glukose økte glukoseplasmanivåer 2,7 ganger (85 ± 6 ved 232 ± 18 mg/dl, P<0,001) i kontrollrotter (bærer). Økningen nådde sitt toppunkt 30 minutter etter glukoseadministrasjon, deretter ble den gradvis redusert i løpet av 90 minutter (figur 1).

Forbehandling av rotter med lupin-konglutin gamma, administrert 30 minutter før glukosen i doser på 50, 100 og 200 mg/kg os, induserte en signifikant, doseavhengig reduksjon av økningen i glukoseplasmanivåer (figur 1 og 2).

Mer spesielt, i betraktning av området under kurve(AUC)verdiene rapportert i figur 2, ble effekten oppnådd med 200 mg/kg os lupin-konglutin gamma (AUC = 2090 238) sammenlignet med og signifikant forskjellig fra den observert for gruppe 5 (dyr forbehandlet med 50 mg/kg os metformin) (AUC = 1565 ± 201).

De oppnådde resultatene viser klart at forbehandling av rotter med lupin-konglutin gamma signifikant reduserer økningen av glukoseplasmanivåer resulterende fra oral administrasjon av glukose 2 g/kg.

Eksempel 2

Fremstilling av lupinskiver

Omkring 4 500 kg lupiner ble knust og skall ble separert fra kjerner, således ble det oppnådd 3 440 kg kjerner og 1 060 kg skall. Knuste kjerner ble skivet i en valsemølle, dennes valser ble holdt på en temperatur under 40°C for å hindre proteindenaturering. Gule skiveformede skall ble oppnådd med en romvekt på 300 til 330 kg/m<3>.

Olieekstrahering

Båtener på 500 kg skall fra trinn a) ble fylt opp til 2 meters høyde i et vertikalt rør med en diameter på 900 mm og olje ble fjernet ved perkolering med heksan. Ekstraheringsfremgangsmåten ble repetert 4 ganger og består av:

1) perkolering av hvit heksan til 500 I blanding hadde blitt gjenvunnet i tanken,

2) resirkulering av blandingen i 15 minutter,

3) uttapping av væskeandelen i 15 minutter i trinn 1 til 3 og i 30 minutter i det endelige ekstraheringstrinnet.

Heksan fremdeles tilstede i skall uten olje ble fjernet under vakuum (250 mbar) med omrøring i 150 minutter til det endelige heksaninnholdet var 250 ppm, som deretter ble redusert til 50 ppm gjennom luftblåsing. Omkring 430 kg hvite skall ble oppnådd.

A) Proteinekstraherinq under sure betingelser

185 kg hvite skall ble suspendert i 1 800 ml kaldt surt vann med pH 4,5-4,8 og ved en temperatur fra 13,5 til 15,2°C, under mekanisk omrøring justert til 55 rpm, og ekstrahert i 1 time. Omkring 23,6 I 3M HCI ble anvendt for å holde pH sur under hele ekstra heri ngen. 385 kg raffinat A og 1 600 I surt ekstrakt A ble oppnådd ved sentrifugen ng.

B) Separering av proteinekstraktet fra raffinatet under svakt alkaliske betingelser

I et første trinn ble 385 kg raffinat A ekstrahert med 900 I vann med pH 7,2-7,4 og ved 28,2 til 31,5°C, med mekanisk omrøring ved 60 rpm i 1 time. Løsningen ble tilsatt med 50 ml antiskummiddel Struktol SB 2010. Omkring 19,6 I 3M NaOH ble anvendt for å holde pH alkalisk under hele ekstraheringen.

Omkring 945 I proteinekstrakt ble separert fra raffinatet ved sentrifugen ng.

I et andre trinn ble raffinatet oppnådd ved sentrifugen ng ekstrahert med 540 I vann ved pH 7,3-7,4 og en temperatur på 29,0 til 32,0oC i 15 minutter. 0,3 I 3M NaOH ble anvendt for å holde pH alkalisk under hele ekstraheringen. Omkring 595 I proteinekstrakt II og 242 kg raffinat B ble oppnådd.

Proteinekstrakter I og II ble kombinert for å oppnå 1 450 I proteinekstrakt B.

C) Utfelling av proteiner fra proteinekstraktet under acidiske betingelser

Proteinekstrakt B (1 540 I) ble tilsatt med 16 I 3M HCI for å justere pH til 4,6-4,5 og 50 ml av det ovennevnte antiskummiddelet under mekanisk omrøring ved 85 rpm. Proteiner utfelte ved det isoelektriske punktet (pH 4,5).

D) Separering av utfelte proteiner fra supernatanten

Proteindispersjonen fra trinn C) (omkring 1 550 I) med faststoffinnhold i området fra 11,0 til 11,5 volum% ble separert med en platetypeseparator ved 6 830 rpm. Faststoffinhhold i det resulterende klarede ekstraktet var 0,0 til 0,1 volum%. Omkring 1 330 I klaret supernatant (SP) og 213 I slam ble separert. Tørrstoffinnholdet i den klarede supernatanten var 0,4-0,5 % og tørrstoffet inneholdt totalt 70 % proteiner.

E) Klaring av surt ekstrakt A

Surt ekstrakt A (1 600 I) fra den sure ekstraksjonen A med tørrstoffinnhold i området fra 2 til 2,5 volum% ble klaret ved anvendelse av en platetypeseparator ved 7 500 rpm. Faststoffinnholdet i det resulterende klarede ekstraktet var fra 0,1 til 0,15 volum%. Omkring 1 500 I klaret ekstrakt (AEP) og 100 I slam ble separert. Faststoffinnholdet i det klarede ekstraktet (AEP) var 2,2-2,5 % og tørrstoffet inneholdt totalt 25 % proteiner.

Fl) Ultrafiltrering av klaret ekstrakt ( AEP)

700 I AEP ble justert fra pH 4,5 til pH 6,0-7,0 og konsentrert gjennom membran ultrafiltrering ved 3 bar trykk og 40°C til det endelige volumet hadde blitt redusert med en faktor på 10 sammenlignet med utgangsvolumet.

Tørrstoffinnholdet i Fl-retenat var omkring 7 % og tørrstoffet inneholdt totalt 50 % proteiner. Fl-permeat ble forkastet.

F21 Diafiltrerina av SP oa AEP

233 I klaret supernatant (SP) fra trinn D) ble tilsatt trinn-for-trinn til Fl-retenat og blandingen ble resirkulert i membranen til dens volum hadde blitt redusert til det samme som for utgangsretentatet. Etter det endelige fortynningstrinnet fortsatte resirkulering til tørrstoffinnholdet i det diafiltrerte retentatet (DFP) hadde nådd et maksimumsnivå som var i området fra 14,5 til 15,0 % og tørrstoffet inneholdt totalt omkring 84 % proteiner. F2-permeat ble forkastet.

G) Pasteuriserinq og sprav- tørkinq for å oppnå NCGP

Det diafiltrerte retenatet (DFP) ble justert fra pH 6,5 til omkring pH 5,2, varmet til 40-65°C i en varmeveksler bestående av et dobbeltvegget rør med 6 mm indre diameter og matet i en spraytørker. Luftåpningstemperaturen ble justert til 195°C og DFP materaten var 8 til 10 I per time. Det tørre pulveret ble separert fra luftstrømmen ved anvendelse av en syklonseparator. Tørrstoffinnholdet var i området fra 94,0 til 95,2 %. Omkring 4,5 kg opprinnelig konglutin gamma (NCGP) ble oppnådd fra 40 I DFP.

Konglutin gamma fremstilt ifølge denne fremgangsmåten inneholder 84,7 % proteiner, 0,6 % olje og 6,4 % tørrstoff. Tørrstoff inneholder en beregnet mengde på 8,3 % nitrogenfrie substanser (NFE). Nitrogenløselighetsindeks av NCGP med pH 7 i 1 % vandig løsning er 72,5 %.

Ifølge foreliggende oppfinnelse administreres konglutin gamma oralt, enten alene eller i kombinasjon med andre substanser med nyttig eller supplerende aktivitet, formulert som tabletter, kapsler, granuler, pulver, siruper og lignende. De farmasøytiske formuleringene kan fremstilles med konvensjonelle fremgangsmåter ved anvendelse av ingredienser kjent i teknikken, slik som eksipienser, ligander, desintegrerende midler, smøremidler, stabiliserende midler og lignende. Doseringer kan variere i henhold til type symptomer, pasientens vekt, lidelsens alvorlighet og lignende. For en voksen human pasient er den totale doseringen av lupin-konglutin gamma i området fra 150 til 750 mg, foretrukket fra 50 til 250, i en enkel dosering eller i flere doseringer, for eksempel en til tre ganger daglig.

Claims

1. Anvendelse av lupin-konglutin gamma for fremstilling av et medikament, mattilsetninger eller mat for behandlingen av type II diabetes.

2. Anvendelse ifølge krav 1 hvor lupin-konglutin gamma foreligger som en lupin-proteinblanding eller -ekstrakt inneholdende konglutin gamma.

3. Farmasøytisk eller ernæringssammensetning, karakterisert vedat den inneholder lupin-konglutin gamma som aktiv ingrediens.

4. Farmasøytisk eller ernæringssammensetning ifølge krav 3,karakterisert vedat den omfatter en lupin-proteinblanding eller - ekstrakt inneholdende lupin-konglutin gamma.

5. Lupin-konglutin gamma som terapeutisk middel.

6. Lupin-konglutin gamma som hypoglykemiserende middel.