KR20230052732A

KR20230052732A - 원산지가 다른 프로폴리스를 혼합사용하여 초임계 추출한 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20230052732A
Application number: KR1020210136117A
Authority: KR
Inventors: 이승완; 김하동; 박경배; 이지헌
Original assignee: 서울프로폴리스 주식회사
Priority date: 2021-10-13
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2023-04-20

Abstract

본 발명 면역기능개선 기능성식품 조성물은 초임계추출법을 활용하여 프로폴리스에서 플라보노이드(Falvnoid) 및 폴리페놀(Polyphenol)성분을 고농도로 추출하고, 이를 활용하여 항염, 면역력 증진 및 항바이러스 효과를 얻을 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 말명은 프로폴리스 원괴 또는 가공괴를 30~60℃의 온도에서 150bar 내지 500bar의 압력에서 용매 CO₂및 보조용매 EtOH를 사용하여 면역기능개선 건강기능식품 조성물인 Terpene, Phenolic Acids 및 Flavonoids를 90%~99%의 수율로 초임계 추출하는 것으로 구성된다.
상기 프로폴리스 가공괴는 프로폴리스 원괴를 일정 양의 주정에 침지 시키고 수 주일 동안 정치시키면서 간헐적으로 교반하여 왁스 성분을 제거하며, 프로폴리스 추출물을 제조하기 위하여 사용되는 상기 프로폴리스 원괴와 주정의 혼합비율은 중량비로 1 : 3.0~15.0의 비율로 혼합하여 프로폴리스 주정 추출물을 제조할 수 있다.

Description

원산지가 다른 프로폴리스를 혼합사용하여 초임계 추출한 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법{Health functional food composition extracted by supercritical extraction method with_mixing propolis of different origins for improving immune function and manufacturing method therefor}

본 발명은 면역기능개선 건강기능식품 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 프로폴리스 초임계추출법을 활용하여 획득한 플라보노이드(Falvnoid) 및 폴리페놀(Polyphenol)성분으로 면역력 증진 및 항바이러스 효과를 얻을 수 있는 프로폴리스 초임계추출법을 활용한 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

프로폴리스는 벌이 자신을 보호하기 위해 나무의 수지를 물어다가 자신의 침과 효소를 섞어 벌집에 바른 물질로서 일반적으로 레진(Resin) 50%, 왁스(Wax) 30%, 에센셜오일(Essential oil) 10%, 기타 10%로 구성되어 있으며 항산화, 항염 및 항균 효능이 탁월하여 예로부터 민간에서 널리 사용되어왔다.

최근 들어 과학적인 연구를 기반으로 프로폴리스의 다양한 효능이 입증되어 나라마다 제도적 차이는 있으나 의약품, 치료보조제 또는 건강기능식품 등으로 사용되고 있으며, 특히, 국내에서는 2000년대 이후 건강기능식품, 일반식품 및 생활용품의 소재로 활용되고 있다.

또한, 최근 코로나 이슈가 부각되고 있으며, 면역력 및 건강에 관한 국민들의 관심이 어느 때보다도 높아진 상황으로, 건강기능식품에 대한 수요가 증가하고 있는 추세이다.

프로폴리스의 주요성분은 300여종의 플라보노이드(Flavonoid) 및 폴리페놀(Polyphenol)등으로 구성되어있고, 최근 연구에서 테르페노이드(Terpenoid)에 대한 기능성이 밝혀지면서 이에 대한 추출 및 활용의 중요성이 부각되고 있는 실정이다.

이러한 점을 활용한 종래기술로써 공개특허 제10-2012-0120515호가 개시된 바 있다.

상기 종래기술은 항균, 항산화, 그리고 면역증진 기능이 우수한 건강 식품의 개발을 위하여 프로폴리스와 식물추출물을 혼합한 조성물과 그 제조 방법을 제공하는 것이며, 상기 혼합 조성물을 포함하는 환제, 정제, 캡슐, 음료 형태의 식품 제조 방법을 제공하는 것이다. 상기 프로폴리스와 식물혼합 추출물을 혼합하여 얻어진 식품 조성물을 각종 질환 예방 및 치료를 위한 건강식품의 원료로 활용하기 위한 발명이다.

그러나 상기 종래기술 및 기존 추출방법에서는 플라보노이드, 폴리페놀 또는 테르페노이드와 같은 성분의 추출은 유기용매에서 추출하는 방법이 대부분이고, 물을 이용한 기능성 성분들의 추출효율이 매우 낮아 산업적으로 활용하기에는 어려움이 많고, 이를 해결하기 위한 다양한 기술이 개발되었음에도 불구하고 용해도 차이로 인해 기능성 성분의 추출률이 낮은 것이 현실이다.

따라서, 초임계추출법을 활용하여 프로폴리스에서 플라보노이드(Flavonoid) 및 폴리페놀(Polyphenol)성분을 고농도로 추출하고, 이를 활용하여 항염, 면역력 증진 및 항바이러스 효과를 얻을 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법의 필요성이 대두되었다.

국내공개특허 제10-2012-0120515호(2012. 11. 02.)

본 발명은 상기한 과제를 해결하기 위한 것으로 그 목적은 초임계추출법을 활용하여 프로폴리스에서 플라보노이드(Falvnoid) 및 폴리페놀(Polyphenol)성분을 고농도로 추출하고, 이를 활용하여 항염, 면역력 증진 및 항바이러스 효과를 얻을 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

또한 , 본 발명은 천연원료를 활용하는 것으로 건강식품 복용자의 알레르기 반응을 최소화 할 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명은 건강기능식품 뿐만 아니라 기능성 소재 또는 기능성 생활용품 등에 다양한 형태로 응용될 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음과 같은 단계를 거치게 된다.

본 발명의 면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조방법은 프로폴리스 원괴 또는 가공괴를 30~60℃의 온도에서 150bar 내지 500bar의 압력에서 용매 CO₂및 보조용매 EtOH를 사용하여 면역기능개선 건강기능식품 조성물인 Terpene, Phenolic Acids 및 Flavonoids를 90%~99%의 수율로 초임계 추출하는 것으로 구성된다.

상기 프로폴리스 원괴 또는 가공괴는 브라질 레드 프로폴리스, 브라질 그린 프로폴리스, 호주 프로폴리스, 한국 프로폴리스 또는 중국 프로폴리스 중 2~3가지를 혼합하여 사용한다.

상기 프로폴리스 원괴의 초임계추출박 및 가공괴를 일정 양의 주정에 침지 시키고 수 주일 동안 정치시키면서 간헐적으로 교반하여 왁스 성분을 제거하며, 프로폴리스 추출물을 제조하기 위하여 사용되는 상기 프로폴리스 원괴와 주정의 혼합비율은 중량비로 1 : 3.0~15.0의 비율로 혼합하여 프로폴리스 주정 추출물(EEP)을 제조할 수 있다.

상기 초임계 추출에서 원괴 또는 가공괴를 초임계 추출할 때 온도와 압력을 1단계 및 2단계로 추출하되, 1단계 추출 조건은 40℃의 온도에서 150~200bar의 압력으로 추출하고, 2단계에서 40℃의 온도에서 250~500bar의 압력으로 추출한다.,

총 폴리페놀(TP) 및 총 플라보노이드(TF)의 수율은 60℃의 온도, 400bar의 압력에서 수율이 높고, 총 폴리페놀 수율은 40℃ 및 50℃ 온도에서 높으며, 60℃에서 압력의 증가는 TP 및 TF 추출을 시킨다.

상기 면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조하기 위하여 사용하는 초임계 추출에서 용매 CO₂및 보조용매 EtOH를 사용한다.

본 발명은 초임계추출법을 활용하여 프로폴리스에서 테르펜류(Terepene), 플라보노이드(Flavonoid) 및 폴리페놀(Polyphenol)성분을 고농도로 분리하고 추출하기 위한 것이다. 이와 같이 분리 추출된 프로폴리스조성물을 활용하여 항염, 면역력 증진 및 항바이러스 효과를 제공한다.

또한 , 본 발명은 천연원료를 활용하는 것으로 건강식품 복용자의 알레르기 반응을 최소화 할 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 건강기능식품뿐만 아니라 기능성 소재 또는 기능성 생활용품 등에 다양한 형태로 응용될 수 있는 면역기능개선 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.

도 1 본 발명의 초임계 추출방법으로 제조된 면역기능개선 건강기능식품 조성물 원료
도 2 본 발명의 면역기능개선 건강기능식품 조성물로 제조된 건강기능식품

이하 발명의 바람직한 일실시예를 사용하여 프로폴리스 초임계추출박을 활용한 면역기능개선 건강기능식품 조성물 제조방법에 대해 상세히 설명한다

본 발명의 초임계추출 방법을 활용한 프로폴리스는 레드(Red) 프로폴리스, 그린(Green) 프로폴리스 및 브라운(Brown) 프로폴리스를 사용하며, 본 실시예에서는 브라질 레드 프로폴리스, 브라질 그린 프로폴리스, 호주 프로폴리스, 한국 프로폴리스 및 중국 프로폴리스를 이용하였지만 특정 원산지에 한정하지 않는다.

여기서 사용되는 용어들은 본 문서에 기재된 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 해당 실시예의 다양한 변경, 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 설명에 사용되는 'EEP' 또는 '프로폴리스 주정 추출물'은 프로폴리스 원료를 주정으로 추출한 것으로 동일한 의미이다.

프로폴리스 원료는 2종류로 구분할 수 있는데, 먼저 이물질들이 제거되었으나 왁스 성분이 제거되지 않은 점성이 있는 "원괴"와 왁스 성분을 제거한 다음 재 가공하여 육안으로 보기에 비교적 깨끗한 갈색의 덩어리 즉 "가공괴"로 나눌 수 있다.

프로폴리스 원괴의 경우 왁스를 사전에 제거하지 않아도 프로폴리스 원료를 주정으로 추출하여 프로폴리스 주정 추출물(EEP)를 제조하는 수용화 과정에서 왁스를 분리 제거시킬 수 있다면 공정을 단순화하고 제품의 경쟁력을 높일 수 있다.

프로폴리스 가공괴는 주정에 잘 녹아서 프로폴리스 주정 추출물(EEP)을 별도의 정제과정 없이 수용화 과정에 그대로 사용할 수 있는 편리한 점이 있으나 반면에 정제수와의 혼합 비율, 부 원료의 농도, 온도 등의 여러 조건에 따라서 수용화 정도 및 안정성에 큰 차이가 발생한다.

240 여종 이상의 복합 유기화합물로 구성된 프로폴리스는 그 산지에 따라서 구성 성분 비율은 다소 차이는 있지만 대략 45~55%의 수지, 25~35%의 왁스, 10%의 에센셜 오일과 페놀 방향족 화합물, 5%의 화분 등으로, 생리활성도가 높은 플라보노이드 계열의 유기화합물과 테르펜류들로서, 이들 중에서도 가장 관심을 받고 있는 성분은 페놀성 방향족 유기산과 플라보노이드 계열의 천연물들이다.

<프로폴리스 초임계 추출 및 수율>

본 발명의 프로폴리스 초임계 추출방법은 다음과 같은 방법으로 추출한다.

1. 초임계 추출물 및 추출박의 성분분석

			초임계
			원괴- 추출물	원괴- 추출박	원괴- 추출물+주정	원괴- 추출박+주정	잔사-추출물	잔사-추출박	잔사- 추출물+주정	잔사- 추출박+주정
	phenolic	Artepillin C	5293.0	10130.0	27140.0	794.0	2963.0		8163.0
	phenolic	Caffeic acid		140.0		111.0
	phenolic	Cinnamic acid		5.0		4.0
	phenolic	ρ-Coumaric acid	23.4	1830.0	1360.0	870.0	76.3		1200.0
	phenolic	Ferulic acid		8.6		3.3
	flavonoid	Chrysin		97.1		42.8
	flavonoid	Kaempferol	N.D	894.2	94.5	826.9	3.8		47.8
	flavonoid	Pinocembrin		2.9		0.2
	flavonoid	Quercetin	N.D	460.4	7.7	342.3	1.7		8.7
	flavonoid	Rutin		20.9		33.9
mono	terpene	Vanillin	1.4	3.9	5.6	2.8		2.8		0.4
sesqui	terpene	Nerolidol	136.0	80.0	122.0	6.8		16.5		6.8
tri	terpene	β-amyrin	356.9	2255.0	8552.0	204.7		305.7		101.5

초임계추출조건 : 40℃, 400bar, 270min(보조용매 EtOH : 3ml/min, 120min)본 발명의 초임계 추출조건 40℃, 400bar에서는 Artepillin C가 추출물에 1/3이 추출되고, 그 외 Phenolic Acids 및 Flavonoids는 추출박에 대다수가 포함되어 있음을 상기 표로부터 알수 있다. 그러나 분자량이 적은 Terpene인 Nerolidol은 62%가 추출물에 추출되고, 38%는 추출박에 남아 있으며, 분자량이 큰 Terpene인 β-Amyrin의 14%는 추출물에 추출되고, 86%는 추출박에 남아 있다.

초임계 추출조건에서 온도와 압력을 40~50℃ 및 200~300bar로 낮추어 추출물의 Polarity 낮추게 되면 추출박에 Artepillin C 및 Terpene이 대다수가 남아있게 되며, 이렇게 되면 Terpenes을 Phenolic Acids 및 Flavonoids와 분리할 수 없게 된다.

초임계 추출 온도(60℃, 50℃. 40℃, 30℃)와 압력(150bar, 200bar, 250bar, 300bar, 350bar, 400bar, 450bar, 500bar)을 변경하면서 추출물과 추출박의 Terpenes, Phenolic Acids 및 Flavonoids의 함량에 대한 성분분석에 의해 상기 표에서 최적의 초임계 추출조건을 찾아낼 수 있다.

2. 초임계 추출물 및 추출박의 TF값과 수율

시료	추출방법 및 용매	분류	상태	중량(g)	TF/0.1g	총 TF	수율(%)
브라질원괴 (TF 3.68)	초임계 추출 (CO₂)	추출물	고상	21.9	3.68	806	9.6%
	초임계 추출 (CO₂)	추출박	고상	160.7	4.71	7,569	90.4%
	초임계 추출 (CO₂₊ETOH))	추출물	액상	273.4	0.64	1,750	25.7%
	초임계 추출 (CO₂₊ETOH))	추출박	고상	136.4	3.7	5,047	74.3%

상기 표를 보면 40℃, 400bar 초임계 추출조건에서는 총 TF값의 9.6%가 추출물로 추출되고, 90.4%가 추출박에 남아있음을 알 수 있다. 보조용매로 주정(유속 3ml/min)을 사용하면 총 TF값의 25.7%가 추출물로 추출되고, 74.3%가 추출박에 남아 주정 즉, 에탄올(etOH)를 사용하는 경우 수율이 크게 향상되는 것을 알 수 있다.총 플라보노이드류(TF) 값의 90% 이상을 회수할 수 있는 초임계추출조건(40℃, 400bar)에서 Artepillin C의 1/3이 추출물로 추출되고 있어 성분별로 세분화된 추출조건이 설정될 필요가 있다.

<초임계 추출방법>

1. 프로폴리스 원괴 초임계 CO₂ 및 EtOH 추출

(초임계 추출조건)

- 압력 : 150 bar, 200 bar, 250 bar

- 온도 : 20℃, 35℃, 50℃

- 보조용매 : Ethanol 5%, 10%, 15%(w/w)

(설명)

초임계 추출시 추출수율에 대한 온도와 압력의 영향은, 일정한 온도에서 압력이 증가하면 CO₂밀도를 증가시켜 CO₂초임계추출에서 용질의 용해도를 증가시키고, 일정한 압력에서 온도가 높아지면 용질의 증기압을 크게하여 용질의 용해도를 증가시킨다. 온도와 압력의 영향은 용매의 물리적 성질인 극성과 밀도의 변동에 영향을 주고 그에 따라 다른 용질들에 대해 초임계추출의 선택성에 변화를 준다.

※ 아래 table 2에서 같은 온도에서 압력을 높이면 CO₂밀도가 증가되고, 용질의 용해도 증가로 추출수율(X₀)이 증가하는 것을 알 수 있다.

분획(Fractionation)은 비극성 분자를 추출하기 좋아하는 CO₂분자의 극성도에 의존하며, 압력이 증가함에 따라 CO₂밀도가 증가하고, CO₂극성이 증가하여 극성성분 추출이 증가한다.

프로폴리스는 CO₂보다 CO₂+ 에탄올에 훨씬 더 잘 용해되며, 보조용매로 에탄올을 사용한 초임계추출의 추출수율은 보조용매로 에탄올을 사용하지 않은 초임계추출의 추출수율보다 훨씬 높은 추출수율을 보여준다. 아래 table 3에서 보는 바와 같이 보조용매로 15% 에탄올을 사용한 추출수율은 EEP 추출수율보다 비슷하거나 더 크며, 바람직하게는 15~20% 에탄올을 사용한다.

추출수율(X₀)이 높다는 것은 Wax 및 Essential Oil 등이 분리되지 않고 Terpenes, Phenolic Acids 및 Flavonoids가 추출물에 함께 추출되기 때문이다.

Global Yield(추출수율, X₀)는 100g 프로폴리스 원괴에서 얻는 추출물 건조량(g)으로 왁스 및 레진, 폴리페놀, 플라보노이드 등 모든 성분이 포함되므로, 고온 및 고압에서 보조용매 에탄올을 사용한 초임계추출법이 높은 추출수율을 보이는 이유는 프로폴리스에 함유된 전성분(왁스 및 레진, 폴리페놀, 플라보노이드 등)이 분리되지 않고 추출되기 때문이다.

2. 브라질 그린 프로폴리스 초임계 추출

(추출조건)

- 에탄올추출 : 프로폴리스 원괴 3g + 에탄올 10ml, 상온에서 1일 교반 ⇒ 여과액을 -10℃ O/N, 여과(왁스제거), 농축(에탄올 제거), EEP 무게측정(수율)

- 초임계추출 : 40℃ / 60℃, 400 bar

5g EEP 사용, 30min(CO₂유속 : 1.0g/min) ⇒ 추출물 회수, 추출수율(X₀) 계산

- TP : total polyphenol content(gallic acid)

TF : total Flavonoid content(catechin)

(설명)

일정한 온도에서 압력이 증가하면 추출수율이 증가하며, 일정 압력에서 온도가 증가하면 추출수율이 증가한다. 최고 추출수율 값은 60℃ 온도와 300bar 압력에서 12.86% , 60℃ 및 400bar에서는 추출수율이 12.26%이다.

※ TP 및 TF

가장 높은 TP 및 TF 값은 60℃, 400bar에서 얻어진다.(Wax 및 Essential Oil도 포함)

TP 값은 40℃ 및 50℃에서 수율이 높다. 60℃에서 압력의 증가는 TP 및 TF 추출을 증가시키고, TF 추출은 400bar에서 온도를 증가시키면 TF 값이 증가한다.

TP 추출은 초임계추출법 보다는 EEP 추출법이 더 효율적이고, TF 추출은 초임계추출법이 EEP 추출법보다는 효율적이다.

3. 저압법 및 초임계 유체 추출법에 의한 프로폴리스 추출

(추출조건)

- 극성 : n-Hexane(0.0), Chloroform(CHCl₃)(4.1), Ethyl Acetate(4.4), Ethanol(5.2), 증류수(9.0)

- 초임계추출 OS-SFE : 압력 및 온도, 용매유속 중 한가지 조건만 사용(변화)

30, 40, 50℃ / 100, 150, 200bar / 3.0, 5.0g CO₂/min

초임계추출 TSS-SFE : 일정한 온도 및 용매유속에서 2가지 압력조건 적용

1단계 : 40℃, 5.0g CO₂/min에서 100bar, 150bar(2시간 추출)

2단계 : 40℃, 5.0g CO₂/min에서 250bar, 300bar(3시간 추출)

- 보조용매 : 에탄올 2, 5, 7%(w/w)

(설명)

※ OS-SFE : one step supercritical fluid extraction

TSS-SFE : two sequential step supercritical fluid extraction

※ TSS-SFE : 1단계(100~150bar) - wax, essential oil 등이 추출

2단계(250~300 bar) - phenolic acids, flavonoids with important biological activities

※ 추출수율은 압력이 증가함에 따라 증가하고, 100 및 150bar에서 온도가 증가함에 따라 감소한다.

※ OS-SFE 200bar에서 온도가 30, 40, 50℃가 변해도 수율이 일정함(온도 증가함에 따라 ① 수율을 상쇄할 정도로 용매력 감소, ② 수율증대분 만큼 용질의 증기압 증가)

※ OS-SFE 250bar, 40℃에서 최고수율 12% / Sox-CHCl₃(73%)보다 낮고, Sox-Hex(17%)와 비슷함

낮은 수율은 높은 선택성을 나타낸다. 그러므로 수율과 선택성의 조합은 생리활성물질의 최적 추출조건을 결정한다.

※ 원료의 높은 Wax 함량(16.1%)은 플라보노이드류 같은 high aggregate-value 물질 추출에 영향을 준다. 그러므로 1단계에서 Wax를 분리하는 TSS-SFE 방법이 바람직하다. 즉 1단계 낮은 밀도에서 Wax 성분과 Essential Oil이 쉽게 용해되고, 2단계 높은 밀도에서 목표로 하는 Phenolic Acids 및 Flavonoids 같은 Resin 성분이 선택된다. 1단계 추출물은 Waxy with whitish aspect, 2단계 추출물은 Resinous with yellowish characteristics

※ TSS-SFE 1단계 40℃, 100bar에서 3.7%~4.1%인 것이 150bar에서 8.4%로 증가.

1단계에서 추출율이 높으면 2단계에서 추출율이 감소함(40℃, 150bar에서 8.4%인 것이 250bar에서 5.1%로 감소). 총 수율 측면에서 가장 좋은 조건은 1단계 40℃ 온도에서 150bar의 압력이고, 2단계 250bar의 압력이다.

※ 브라질 프로폴리스의 총 추출수율은 압력을 276bar에서 345bar로 증가함에 따라 증가하고, 최고값 10.5%는 345bar의 압력과 45℃에서 얻어진다.. 플라보노이드의 추출수율은 45℃에서 276bar일 때 최대 700 ㎍/g이고 345bar에 도달할수록 감소한다.

<면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조>

본 발명의 프로폴리스 초임계추출박을 활용한 면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조방법은 다음과 같다.

1. 프로폴리스 초임계추출박의 제조

프로폴리스 초임계추출박은 프로폴리스 원괴 또는 가공괴 일정량을 초임계추출기에 채우고 30~60℃의 온도에서 150bar 내지 500bar의 압력에서 용매 CO₂및 보조용매 ETOH를 분당 10 내지 50 mL 유속으로 5시간 이상 흘려보내어서 초임계 추출하여 포집되는 추출물 및 추출박을 회수하여 추출박을 활용한다.

본 발명의 프로폴리스 초임계추출 원료는 레드 프로폴리스, 그린 프로폴리스 및 브라운 프로폴리스를 혼합 사용하며, 혼합비율은 0.1~1.0 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5의 중량비 혼합하는 것이 바람직하다.

2. 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물의 제조

본 발명의 또다른 실시예로 아래와 같이 초임계추출박의 주정 추출물을 사용할 수 있다.

본 발명의 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물 제조하기 위하여 프로폴리스 초임계 추출박을 일정량의 주정(EtOH)에 침지 시키고 수 주일 동안 정치시키면서 간헐적으로 교반하여 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물을 제조한다. 상기 프로폴리스 추출박은 잘게 파쇄하여 사용할 수 있다. 상기 프로폴리스 초임계추출박 주정 침지액을 여과하여 액상의 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)을 제조한다. 상기 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물을 제조하기 위하여 사용되는 프로폴리스 초임계추출박과 주정의 혼합비율은 추출률과 사용 목적에 따라서 중량비로 1 : 3.0~15.0 사이에서 선택할 수 있으며 필요시 추출 후 농축하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 주정은 전분 원료 또는 당분 원료를 발효시켜 알코올 성분이 85도 이상 100도로 증류한 것을 사용한다.

프로폴리스 가공괴를 사용하는 경우도 상기 프로폴리스 원괴를 처리하는 방법과 유사하나 주정에 잘 녹기 때문에 주정을 적게 사용하여도 짧은 시간에 프로폴리스의 추출 농도가 높다. 즉, 비교적 높은 플라보노이드 값(T/F)을 가지는 프로폴리스 주정 추출물(EEP)을 얻을 수 있다.

본 발명의 프로폴리스 원료는 레드 프로폴리스, 그린 프로폴리스 및 브라운 프로폴리스를 혼합 사용하며, 혼합비율은 0.1~1.0 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5의 중량비 혼합하는 것이 바람직하다.

3. 프로폴리스 주정 추출물의 제조

본 발명의 또 다른 실시예로 아래와 같이 주정 추출물을 사용할 수 있다.

본 발명의 프로폴리스 주정 추출물 제조하기 위하여 프로폴리스 원괴를 일정 양의 주정(EtOH)에 침지 시키고 수 주일 동안 정치시키면서 간헐적으로 교반하여 프로폴리스 주정 추출물을 제조한다. 상기 프로폴리스 원괴는 잘게 파쇄하여 사용할 수 있다. 상기 프로폴리스 주정 침지액을 여과하여 액상의 프로폴리스 주정 추출물(EEP)을 제조한다. 상기 프로폴리스 주정 추출물을 제조하기 위하여 사용되는 프로폴리스 원괴와 주정의 혼합비율은 추출률과 사용 목적에 따라서 중량비로 1 : 3.0~15.0 사이에서 선택할 수 있으며 필요시 추출 후 농축하여 사용할 수 있다.

본 발명의 프로폴리스 원료는 브라질 레드 프로폴리스, 브라질 그린 프로폴리스 및 호주 브라운 프로폴리스를 사용하며, 혼합비율은 0.1~1.0 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5의 중량비 혼합하는 것이 바람직하다.

4. 치커리 뿌리에서 추출한 이눌린 성분을 이용하여 저분자 개방형 사슬 다당류의 제조

본 발명에서 사용하는 아르기닌은 상용의 제품을 구입하여 사용하였다.

또한, 개방형사슬 다당류는 천연의 치커리 뿌리에서 추출한 이눌린(inulin)을 사용하였으며, 상기 이눌린은 식이섬유 및 프리바이오틱스로서 널리 사용되고 있으며 주로 물에 잘 녹지 않는 포도당 한 분자에 여러 개의 과당으로 구성된 다당류[G(F)n]의 일종이다. 보통 n=25~30의 범위이다.

상기 이눌린의 수용성을 높이기 위하여 이눌린을 효소 또는 유기산 등 산으로 가수분해시켜 분자량이 작은 다당류로 전환 시켜야 하며, 분자량이 작은 다당류로 전환되면 당도도 높아지게 된다. 이렇게 이눌린을 가수분해하면 포도당(G) 한 분자에 과당(F) 여러 분자(n) 즉, G(F)n 구조의 다당류가 되며, 보통은 n=2~5인 Fructooligosaccharide(FOS)와 Sucrose로 전환된다.

본 발명에서 상기 이눌린을 유기산 등 산으로 가수분해하면 n=25~30 정도의 과당이 한 분자의 포도당과 결합된 다당류 및 과당만으로 구성된 수용성 Polyfructosaccharide(PFS)가 함께 생성된다.

이눌린을 누룩곰팡이나 산으로 가수분해하여 얻어지는 과당은 당뇨병 등에 좋은 효과가 있는 감미료이다.

5. 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물의 수용화 단계

정제수에 일정량의 아르기닌과 PFS를 반응기에 먼저 넣은 다음 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)을 추가한 후 45~60℃ 온도에서 4~6 시간 동안 교반하여 주정에 용해된 프로폴리스 성분들이 수상(water phase)으로 이동하면서 가용화 된다. 이때 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)와 정제수의 중량비는 0.5~4.0 : 1로서 제품의 사용목적에 따라서 조정하여 선택할 수 있다. 또한 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR) 대비 아르기닌 중량비는 1 : 0.02~0.10, PFS 중량비는 1 : 0.02~0.08 범위 내에서 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)의 종류 및 농도에 따라서 탄력적으로 적용할 수 있다.

6. 농축 단계

상기 정제수에 일정 량의 아르기닌과 PFS를 반응기에 먼저 넣은 다음 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)을 추가한 혼합물을 실온에서 일정시간(수 시간~2일)정치하면 수 불용성의 미 반응 프로폴리스 성분 및 왁스 성분들이 용기 바닥으로 침전된다. 상층의 맑은 액상은 바로 감압 농축기로 이송한 후 통상의 방법대로 주정을 제거하면 안정한 프로폴리스 초임계추출박의 수용성 프로폴리스 조성물이 생성된다.

7. 제품의 안정제 추가

최종 제품의 안정성 향상을 위하여 분산제 또는 보조제로서 소량의 아미노산 및 비타민 C를 가용화 단계 직전 또는 농축 단계 후에 첨가할 수 있다

본 발명의 안정한 프로폴리스 초임계추출박의 수용성 프로폴리스 조성물을 이용하여 면역조절 및 활성 효과를 검사한 결과 다음과 같은 효과가 있었다.

<실험방법>

1 항염증 활성

Raw 264.7 cell을 96well plate에는 well당 1x10⁴cell의 농도로 80 μ씩, 48 well plate에는 5x10⁴cell로 400 μ씩 seeding하였다. 37℃에서 6시간 안정화 시켜준 뒤 배지에 농도별로 희석한 시료를 96 well plate에는 10 μ씩, 48 well plate에는 50 μ씩 넣고 37℃에서 12시간 전처리하였다.

시료의 전처리 후, 1 mg/ml의 LPS stock을 1 μg/ml의 농도로 세포 배양배지를 이용하여 희석하여 최종농도가 100 ng/ml이 되도록 96 well plate에는 10 μ씩, 48 well plate에는 50 μ씩 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다.

24시간 배양 후, 세포독성을 측정하기 위하여 Light Off 상태에서 MTT시약을 96 well에 10 μ씩 분주하고 2시간 37℃에서 incubation하였다. 세포배양 plate를 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 세포배양 상등액을 suction하여 제거하였다. 각 well에 남은 세포에 DMSO를 100 μ씩 넣은 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

NO 측정을 위해 48 well plate는 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 50 μ씩 96 well plate에 옮기고 NO standard 100 mM부터 DW로 8단계 희석하였다. Griess regent (40 mg/ml in DW)를 50μ씩 분주하여 540 nm에서 흡광도 측정하였다.

한편 TNF-α와 IL-6는 ELISA kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정량하였다.

2. 세포증식반응 측정

정상 면역세포 활성화 : ICR mouse의 비장세포를 분리하여 Homogenizer로 으깨서 single cell로 만든 후, 96well plate에는 5x10^5 80ul씩, 48well plate에는 1x10^6으로 400ul씩 seeding하였다. seeding후 바로 농도별로 RPMI 배지에 희석하여 시료를 처리하였다. 5-6시간 안정화 시켜준 뒤, 유사분열유도인자인 LPS 혹은 ConA를 각각 1 μg/ml 또는 5 μg/ml 농도로 처리하고, 37도에서 over night 배양시켰다. 세포독성 여부를 측정하기 위한 96 well plate에 MTT 시약 5 mg/ml농도로 10 μl씩 분주하고 2시간 뒤 centrifuge 시키고 상등액 suction하였다. DMSO를 100 μl씩 분주하고 540 nm에서 흡광도 측정하였다. 48 well plate는 상등액을 회수하여 원심분리 시키고 다시 상등액을 모았다. 또한 림프구 활성화 측정은 세포배양액을 회수하여 IL-2, TNF-a, IFN-γ 및 IL-4를 정량하여 평가하였다.

3. Cyclophosohamide(CY)에 의한 면역억제 in vitro실험법

상기 세포증식반응과 동일한 방법으로 mouse의 비장세포를 seeding한 후에 시료를 알맞은 농도로 희석하여 처리하였다. Cyclophosphamide를 1.6 mg/ml의 농도가 되도록 희석하여 세포에 처리 후 37도에서 over night으로 배양시켰다. 배양 후 증식밥응 실험은 24시간 추가배양을, 사이토카인 분비능 측정을 위한 실험은 ConA를 5 μg/ml 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 각 시료는 일정한 농도로 CY와 동시처리하였다. 동일한 방법으로 96 well plate에 MTT 시약을 처리하고 2시간 뒤 원심분리시키고 상등액을 suction한 후 DMSO 분주한 뒤 540 nm 흡광도에서 세포활성을 측정하였다. 48 well plate는 상등액을 회수하여 원심분리 시키고 다시 상등액을 회수하여 IL-2 측정에 사용하였다.

4. In vivo 면역억제 개선효과 실험

Cyclophosphamide 투여에 의한 면역억제에 대한 각 시료의 면역력 조절효과를 측정하기 위하여, cylophosphamide를 200 mg/kg으로 복강주사하기 전 혹은 후에 각각 5일 동안 적절한 농도의 시료를 경구하였다. 이 후 CY 투여 6일 후에 비장을 회수하여 ex vivo 조건에서 면역세포의 증식반응 및 사이토카인을 측정하였다. 또한 시료를 200 mg(200 ul)/mouse로 5회 경구투여한 마우스의 혈청을 이용하여 간독성(GPT/GOT)과 신독성(CRE/BUN)을 CriChem 3500i를 통해 측정하였다.

5. CY투여 면역억제 마우스에서 항체유도에 미치는 영향

Cyclophosphamide를 투여한 면역억제 마우스의 항체유도 저하에 대한 각 시료의 영향을 측정하기 위하여, 시료를 5일 동안 경구하고 다음 날 CY를 200 mg/kg으로 복강주사하였다. CY투여 1일 후에 항원인 KLH단백질을 20 ug씩 복강면역하였다. KLH항원 주사 1주일 후에 다시 동량의 KLH를 복강면역하고, 1주일 후에 채혈하여 혈청을 이용하여 ELISA법에 의해 KLH항원에 대한 IgG+A+M 항체가를 측정하였다.

<실험결과>

1. 항염증 활성

RAW 264.7 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과, 시료 A와 B는 2,000배 희석까지는 세포독성을 보이며 4,000배 이상의 희석부터 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.

염증매개인자인 NO생성에 대한 영향을 측정한 결과 시료 A와 B 모두가 강한 염증억제 활성을 나타냈다. 전염증성 사이토카인인 TNF-a와 IL-6의 분비는 세포독성을 나타내지 않는 조건에서 측정하였다. 그 결과, NO, TNF-a, IL-6 생성 억제활성을 종합해 보았을 때 시료 B가 시료 A에 비해 보다 안정적인 항염증 활성을 가지는 것으로 판단되었다.

<그림 1> 각 시료의 RAW 264.7 세포에 대한 세포독성

<그림 2> RAW 264.7 세포 염증반응에서 각 시료의 NO 생성 억제활성

<그림 3> RAW 264.7 세포 염증반응에서 각 시료의 TNF-α 생성 억제활성

<그림 4> RAW 264.7 세포 염증반응에서 각 시료의 IL-6 생성 억제활성

2. 비장세포에 대한 면역조절 활성

림프구와 대식세포 등 많은 종류의 면역세포를 포함하는 비장세포를 이용하여 각 시료의 면역조절활성을 측정하였다.

먼저 비장세포에 대해 안전한 농도를 산출하기 위하여, MTT법에 의해 세포독성을 조사한 결과 모든 시료가 2,000배 이상의 희석액에 대해 안전한 것으로 나타났다. 한편 시료 단독 혹은 T세포 활성화를 유도하는 ConA나 B세포와 대식세포 활성화를 유도하는 LPS와 같은 mitogen에 의한 자극에 대해서 각 시료는 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 사료되었다.

즉 이 결과는 이들 시료는 림프구 증식반응을 일으키는 mitogen과의 시너지 효과나 증식억제 작용 등을 하지 않는다는 것을 의미한다.

<그림 5> 비장세포에 대한 각 시료의 세포독성

비장세포에 ConA를 처리할 경우, T림프구가 ConA에 의해 활성화되어 사이토카인을 분비하게 된다. 이러한 이론을 토대로 비장세포 내의 T림프구를 ConA로 자극하는 모델에서 각 시료가 T세포로부터의 분비되는 사이토카인 에 대해 어떠한 영향을 미치는 가를 측정하였다.

세포독성에 의한 시험결과의 오류를 막기 위하여 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 실험을 진행하였다. T세포로부터 분비되는 사이토카인은 mitogen자극에 대해 모든 T세포가 분비하는 대표적인 사이토카인인 IL-2, Th1 type의 세포가 분비하는 IFN-r, 그리고 Th2 type의 T세포가 분비하는 IL-4, 그리고 활성화된 T세포로부터 분비되는 TNF-a를 대상으로 정량하였다

그 결과 두 시료 모두 T세포의 mitogen에 의해 분비되는 모든 종류의 사이토카인의 분비를 억제하는 활성을 지니는 것으로 나타났으며, 특히 시료 B가 활성화 T세포에 의한 사이토카인 분비에 대해 보다 높은 억제효과를 가지는 것으로 판단되었다.

이러한 결과는 A와 B 두 시료는 T세포의 증식반응에 대해서는 별다른 영향을 미치지 않으나, mitogen처리에 의해 T세포로부터 분비되는 사이토카인에 대해서는 Th1 type은 물론 Th2 type의 사이토카인에 대해 억제하는 활성을 지니는 것으로 판단되었다.

<그림 6> ConA 자극 비장세포에 대한 각 시료의 IL-2 생성 억제효과

<그림 7> ConA 자극 비장세포에 대한 각 시료의 IFN-r 생성 억제효과

<그림 8> ConA 자극 비장세포에 대한 각 시료의 IL-4 생성 억제효과

<그림 9> ConA 자극 비장세포에 대한 각 시료의 TNF-a 생성 억제효과

3. In vitro 면역억제 모델에서 면역조절효과

CY는 T세포의 NF-kB와 NF-AT 활성화를 억제하는 면역억제제로서, 사람에 있어서도 장기이식이나 조직이식 시, T세포의 활성화를 차단하여 거부반응을 억제하기 위한 목적으로 사용된다.

면역억제 반응에 대한 각 시료의 조절작용을 조사하기 위하여, 비장세포에 CY를 처리하여 면역억제를 유도하는 in vitro 모델에서 각 시료에 의한 면역력 증가활성을 조사하였다.

면역력 강화는 각 시료의 안전한 농도인 2,000배 이상의 희석비에서, 세포증식반응과 ConA 자극에 의한 T세포로부터 IL-2 사이토카인 생성에 미치는 영향을 중심으로 측정하였다.

CY를 처리는 대조군에 비해 약 17% 정도 세포증식반응이 억제되는 것으로 나타났다. 한편 CY를 처리한 면역세포에 각 시료를 처리함으로서 세포증식반응이 대체로 상승하는 것으로 나타나, 모든 시료가 거의 동등한 수준으로 CY에 의한 면역억제를 다소 개선하는 효과가 있는 것으로 관찰되었다.

<그림 10> CY처리 비장세포의 증식반응에 대한 각 시료의 효과

한편 IL-2 생성에 있어서는 모든 시료가 CY처리에 의한 IL-2분비 억제에 대해 시너지 효과를 보이는 것으로 나타났다. 세포증식반응에서는 CY에 의한 증식억제에 대해 개선효과를 보였으나, IL-2 분비에 있어서는 면역억제를 더 강력하게 유도하여 IL-2의 분비를 더욱 억제하는 것으로 보아, 이들 시료는 사이토카인 분비에 대해서 세포를 죽이는 세포독성에 의한 것이 아닌 다른 기능적인 양식에 의해 억제하는 것으로 추정되었다.

<그림 11> CY처리 비장세포에 대한 각 시료의 IL-2 생성억제 시너지 효과

4. In vivo 면역억제 모델에서 면역조절효과

CY를 세포에 직적 처리하는 방식이 아닌 동물체내에 투여하여 유도되는 면역억제에 대해 각 시료의 체내 투여가 CY에 의해 유도된 면역세포의 기능저하에 대해 어떠한 기능을 하는 가를 조사하였다.

마우스에 CY를 투여하여 면역억제를 유도하는 모델을 이용하여, CY투여 전 혹은 후에 각 시료를 1일 1회 총 5일간 5회 경구투여하고 CY투여 6일 후에 마우스로부터 비장세포를 회수하여 세포증식반응과 사이토카인(IL-2) 생성능을 측정하였다.

그 결과, 시료의 전처리에 있어서는 두 시료 모두 CY 처리 전(예방효과) 혹은 후(개선효과)에 투여한 경우 면역세포 증식반응 억제를 개선하는 활성은 관찰되지 않았다.

이 결과는 시료 A와 B는 CY 투여에 의해 유도된 면역세포 증식반응 저하에 대해서는 별다른 효과가 없다는 것을 의미한다.

<그림 12> CY처리 마우스 비장세포의 증식반응에 대한 각 시료의 영향

한편 CY처리에 의해 면역억제가 유도된 마우스의 비장세포에 ConA를 자극하여 T세포로부터 IL-2를 유도하는 모델에서, 각 시료의 투여가 T세포로부터 IL-2 유도에 어떠한 영향을 미치는 가를 조사하였다. 먼저 CY를 처리한 마우스 비장세포는 ConA 자극에 의한 IL-2의 분비가 억제되었다, 하지만 CY처리 마우스에 각 시료를 CY처리 전 혹은 후에 투여한 결과, CY에 의한 IL-2 생성 억제를 더욱 심화시키는 결과가 관찰되었다. 즉 in vitro에서의 실험결과와 동일하게 각 시료는 CY처리 면역억제 T세포에 대해 기능적으로 IL-2 생성 억제를 더욱 가속화하는 것으로 사료되었다

<그림 13> CY처리 마우스 T세포의 IL-2 분비에 대한 각 시료의 영향

5. In vivo 투여에 의한 독성 테스트

CY처리에 의한 in vivo 동물실험모델에서 각 시료를 1일 1회 200 mg(200 ul)씩 5일간 연속투여한 후 6일째에 혈청을 채취하여 간독성(GOT/GPT)과 신독성(CRE/BUN)을 측정하였다.

그 결과, 모든 시료가 간 혹은 신장에 대해서는 독성을 나타내지 않고 안전한 것으로 확인되었다.

<그림 14> 각 시료의 5회 경구투여에 의한 간 및 신 독성 테스트

6. CY처리 마우스에서 항체유도에 미치는 영향

시료 A와 B가 CY처리 면역억제 마우스에서 특정 항원에 대한 항체유도에 미치는 영향을 조사하였다.

항원인 KLH(keyhole limpet hemocyanine)는 1주 간격으로 2회 20 ug/mouse의 양으로 복강주사하였다. CY는 KLH항원을 1차 면역 1일 전에 200 mg/kg으로 투여하여 면역억제를 유도하였으며, 각 시료는 1차 항원을 면역하기 5일 전부터 1일 1회 총 5일간 2 mg/mouse의 양으로 경구투여하였다. 항원에 대한 면역반응은 KLH에 대한 항체유도 활성을 통해 측정하였다.

그 결과, CY 처리를 처리한 마우스는 KLH항원에 대한 항체 유도가 KLH만을 단독투여한 그룹에 비해 억제되는 것으로 나타났으나, 각 시료를 투여한 마우스에서 1차 면역 후 3주째부터 항체가의 회복이 관찰되었다.

이 결과로부터 두 시료 모두 CY 투여에 의해 면역억제를 유도하기 전에 투여함으로서 CY에 의해 유도되는 항원에 대한 항체유도 억제에 대해 예방적인 효과를 갖는 것으로 판단되었다.

<그림 15> 면역억제 마우스에서 항체유도에 대한 각 시료의 영향

<결론>

- 이상의 결과를 요약하면 다음과 같다.

Claims

원산지가 다른 프로폴리스를 혼합사용하여 초임계 추출한 면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조방법에 있어서,
상기 면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조방법은 프로폴리스 원괴 또는 가공괴를 30~60℃의 온도 및 150bar 내지 500bar의 압력에서 용매 및 보조용매를 분당 10 내지 50mL 유속으로 흘려보내 초임계 추출하여 포집되는 추출박을 회수 사용하여 면역기능개선 건강기능식품 조성물인 Terpene, Phenolic Acids 및 Flavonoids를 90%~99%의 수율로 초임계 추출하는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선 건강기능식품 조성물의 제조방법
제1항에 있어서,
상기 프로폴리스 원괴 또는 가공괴는 브라질 레드 프로폴리스, 브라질 그린 프로폴리스, 호주 프로폴리스, 한국 프로폴리스 또는 중국 프로폴리스 중 2~3가지를 혼합 사용하며, 혼합비율은 0.1~1.0 : 0.5~1.5 또는 0.1~1.0 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5의 중량비 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선 건강기능식품 조성물의 제조방법
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 프로폴리스 초임계추출박의 주정 추출물 제조하기 위하여 프로폴리스 초임계추출박을 주정(EtOH)에 침지 시킨 후 간헐적으로 교반하고 여과하여 액상의 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)을 제조하되, 상기 프로폴리스 추출박은 파쇄하여 사용하며,
상기 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물을 제조하기 위하여 사용되는 프로폴리스 초임계추출박과 주정의 혼합비율은 1.0 : 3.0~15.0 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선 건강기능식품 조성물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 프로폴리스 초임계추출박의 수용성 조성물은 반응기에 정제수를 아르기닌, PFS와 함께 넣은 다음, 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)을 추가한 후 45~60℃ 온도에서 4~6 시간 동안 교반하여 주정에 프로폴리스 성분들을 용해시키고, 상기 용해된 프로폴리스 성분을 수상(water phase)으로 이동하면서 가용화시키돼,
이때 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR)과 정제수의 중량비는 0.5~4.0 : 1 비율 중에서 선택하고, 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR) 대비 아르기닌 중량비는 1 : 0.02~0.10 비율로 선택하며, 프로폴리스 초임계추출박 주정 추출물(EEPR) 대비 PFS 중량비는 1 : 0.02~0.08 범위로 선택하는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선 건강기능식품 조성물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 초임계 추출에서 원괴 또는 가공괴를 초임계 추출할 때 온도와 압력을 1단계 및 2단계로 추출하되, 1단계 추출 조건은 40℃의 온도에서 150~200bar의 압력으로 추출하고, 2단계에서 40℃의 온도에서 250~500bar의 압력으로 추출하는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선 건강기능식품 조성물의 제조방법
제1항에 있어서,
상기 면역기능개선 건강기능식품 조성물의 제조하기 위하여 사용하는 초임계 추출에서 용매는 CO₂ 이고 보조용매는 EtOH인 것을 특징으로 하는 면역기능 개선 건강기능식품 조성물의 제조방법