WO2015022978A1 - 脂肪蓄積抑制剤、医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法 - Google Patents

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thistle
extract
fat accumulation
accumulation inhibitor
fat
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宏典 屋
泰男 上山
征志 稲福
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株式会社アミノアップ化学
国立大学法人 琉球大学
特定非営利活動法人奄美機能性食品開発研究会
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a fat accumulation inhibitor, a pharmaceutical, a prophylactic or therapeutic agent for fatty liver, a food and drink, and a method for producing a fat accumulation inhibitor.
  • the thistle group in thistle includes the white thistle ( Cirsium brevicale A. Gray), the blue thistle ( C. boninense ), the oil thistle ( C. spinosum ), and the four species of thistle ( C. maritimum ).
  • Japan it is reported that it is distributed from the Pacific coast south of Kanto to the Ryukyu Islands, and also in part of Taiwan (Non-patent Document 1).
  • Patent Document 1 discloses an antibacterial agent and an antioxidant containing an extract of rhizome of striped thistle as an active ingredient.
  • Patent Document 2 discloses a blood glucose increase inhibitory action and Patent Document 3 discloses an antimutagenicity.
  • the Noazami C. japonicum
  • Patent Document 4 it is disclosed that may be used as a ceramide production promoting effect and humectants.
  • Non-patent Document 2 reports on the action of promoting the adipocyte differentiation from mouse fibroblasts (3T3-L1 cells) for Japanese thistle plants.
  • Patent Document 5 thistle plants of the genus (Arechiazami (Cephalonoplos segetum (Bieb.) Kitam .) And Noazami (Cirsium japonicum DC.)) Lipolysis promoting effect is disclosed.
  • JP-A-6-206867 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-212096 JP 2000-256205 A JP 2011-79754 A JP-A-8-301780
  • the fat accumulation inhibitor according to the first aspect of the present invention comprises: Contains thistle plants as active ingredients.
  • the thistle plant may be a striped thistle.
  • the preventive or therapeutic agent for fatty liver according to the third aspect of the present invention, is contained as an active ingredient.
  • the food and drink according to the fourth aspect of the present invention is The fat accumulation inhibitor according to the first aspect of the present invention is contained.
  • the method for producing a fat accumulation inhibitor according to the fifth aspect of the present invention comprises: Including a step of obtaining an extract by performing an extraction operation on a thistle plant using a solvent, It is characterized by that.
  • the fat accumulation inhibitor according to the sixth aspect of the present invention Obtained by the method for producing a fat accumulation inhibitor according to the fifth aspect of the present invention, It is characterized by that.
  • a fat accumulation inhibitor having an excellent effect
  • a pharmaceutical containing the fat accumulation inhibitor a prophylactic or therapeutic agent for fatty liver, a food and drink, and a method for producing a fat accumulation inhibitor.
  • Can do a pharmaceutical containing the fat accumulation inhibitor, a prophylactic or therapeutic agent for fatty liver, a food and drink, and a method for producing a fat accumulation inhibitor.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of freeze-dried powder of thistle leaf according to this example on the expression of lipolysis promotion-related genes and adipose synthesis-related genes in subcutaneous white adipose tissue and renal white adipose tissue of mice fed with a high fat diet. is there.
  • the fat accumulation inhibitor according to the present invention contains a thistle plant as an active ingredient.
  • the thistle genus plant used in the present invention Asteraceae (Asteraceae) Shimaazami belonging to thistle genus (Cirsium) (Cirsium brevicaule A.Gray) , Ogasawara thistle (C. boninense), Oiran'azami (C. spinosum), Hamaazami ( C. maritimum), and the like (provided that Arechiazami (Cephalonoplos segetum (Bieb.) Kitam .) and Noazami (Cirsium japonicum DC.) is excluded).
  • the silver thistle Cirsium brevicale A. Gray
  • Any plant of the genus Thrips that exhibits the effects of the present invention can be selected as appropriate.
  • thistle plants those of any cultivation days can be used.
  • leaves, stems, roots, rhizomes, fruits, seeds, seed coats, flowers and the like of thistle plants can be used, but leaves of thistle plants can be preferably used.
  • thistle plants are raw or dried powders (for example, prepared by freeze-drying thistle plants and pulverizing them in a mortar or the like), juice, and thistle plant extract (described later). It is prepared and used in the form of etc. Commercially available extracts of thistle plants, powders of thistle plants, and the like may also be used. Therefore, in the present specification, the term “thistle plant” contained in the fat accumulation inhibitor according to the present invention refers to a raw thistle plant, a dry powder of thistle plant, a squeezed juice of thistle plant, and a thistle genus. It refers to plant extracts (described later), extracts of thistle plants, and the like.
  • the fat accumulation inhibitor according to the present invention has the effect of suppressing the accumulation of fat in fat cells and reducing the expression of fatty acid synthase (FAS: Fatty acid synthase).
  • the method for producing a fat accumulation inhibitor according to the present invention includes a step of obtaining an extract by performing an extraction operation on a thistle plant using a solvent.
  • Examples of thistle plants used in the above-described process include raw thistle plants, dry powder of thistle plants, and the like.
  • the kind of thistle plant, the number of cultivation days, and the use site are the same as described above.
  • obtaining an extract by performing an extraction operation on a thistle plant using a solvent means, for example, immersing a thistle plant in a solvent (eg, immersing at 37 ° C. for 2 hours).
  • a solvent eg, immersing at 37 ° C. for 2 hours.
  • separating the solvent for example, filtration under reduced pressure
  • washing the residue with a solvent to obtain an extract solution
  • immersing thistle plant in the solvent immersing thistle plant in the solvent
  • the solvent is separated, the residue is washed with a solvent, and further, separation of the solvent and washing of the residue with the solvent are repeated once or twice or more to obtain an extract.
  • the “extraction operation” means immersing a thistle plant in a solvent, separating the solvent, washing the residue with a solvent, and the like.
  • the “extract” is a liquid obtained by immersing thistle plant in a solvent, obtained by separating the solvent after immersing thistle plant in a solvent and washing the residue with a solvent. Represents a liquid or the like.
  • solvent includes, for example, water, hot water (for example, 50 ° C. or higher), alcohols, hexane, chloroform, ethers, esters, and ketones.
  • Alcohols are, for example, lower alcohols such as ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, and polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol, propylene glycol, glycerin;
  • ethers are, for example, Examples include diethyl ether and propyl ether; esters include, for example, butyl acetate and ethyl acetate; and ketones include, for example, acetone and ethyl methyl ketone.
  • an extraction operation may be performed on the obtained residue using chloroform, and different solvents may be combined in order in the extraction operation.
  • water, hot water, ethanol or the like is preferably used as the solvent.
  • hexane extract What is obtained by the step of obtaining the liquid may be referred to as “hexane extract”; what is obtained by the step of obtaining the extract by performing an extraction operation with chloroform as a solvent on the thistle plant is “ “Chloroform extract” may be referred to as “the extract of a thrips plant using ethanol as a solvent to obtain an extract” There is a case that ethanol extract ".
  • the fat accumulation inhibitor according to the present specification may be obtained by the above-described production method. That is, since the above-mentioned “thistle plant extract” has the effect of suppressing fat accumulation in adipocytes and reducing the expression of fatty acid synthase (FAS), it can be used as a fat accumulation inhibitor. Further, for example, a specific fraction obtained by further performing solid phase extraction or the like on an extract with a specific solvent may be used as a fat accumulation inhibitor, and a specific fraction obtained by this solid phase extraction may be used. A specific fraction obtained by further subjecting the fraction to HPLC or the like may be used as a fat accumulation inhibitor.
  • a specific fraction obtained by further subjecting the fraction to HPLC or the like may be used as a fat accumulation inhibitor.
  • the fat accumulation inhibitor according to the present invention can be used for pharmaceuticals.
  • the pharmaceutical product according to the present invention contains the aforementioned fat accumulation inhibitor as an active ingredient.
  • the administration method of the pharmaceutical product according to the present invention can be appropriately selected from oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, intradermal administration, sublingual administration and the like.
  • the pharmaceutical dosage form may also be arbitrary, for example, oral solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, oral liquid preparations such as internal liquids and syrups, and parenteral liquids such as injections. It can be appropriately prepared for preparations and the like.
  • the pharmaceuticals according to the present invention include commonly used excipients, binders, disintegrants, thickeners, dispersants, reabsorption accelerators, taste-masking agents, buffers, surfactants, solubilizers, preservatives. , Emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, pH adjusters, and the like can be appropriately contained.
  • the pharmaceutical agent according to the present invention may appropriately contain other active ingredients (for example, fatty liver inhibitor) other than the aforementioned fat accumulation inhibitor.
  • the dose of the fat accumulation inhibitor which is an active ingredient of the pharmaceutical product according to the present invention, can be appropriately set depending on the age, weight, indication symptoms, etc. of the patient.
  • administration during meals, administration after meals, administration before meals, administration between meals, administration before going to bed, etc. are possible.
  • the pharmaceutical product according to the present invention contains the fat accumulation inhibitor according to the present invention as an active ingredient, it suppresses fat accumulation in adipocytes, particularly improves lipid metabolism in the liver. It exerts actions such as fat reduction, obesity suppression and prevention, and improvement of obesity.
  • the present invention can provide a preventive or therapeutic agent for fatty liver because it is excellent in the action of inhibiting the accumulation of fat in the liver.
  • the present inventors have found that one mechanism of the effect of inhibiting fat accumulation is not due to the action of promoting lipolysis, but due to a decrease in the expression of fatty acid synthase (FAS).
  • FAS fatty acid synthase
  • fatty liver has not only been associated with the development of cirrhosis and liver cancer, but also has been suggested to increase the risk of developing diabetes and promote arteriosclerosis. It is particularly important that the accumulation of fat in the liver can be suppressed and the fatty liver can be suppressed by a preventive or therapeutic agent for the liver.
  • the fat accumulation inhibitor according to the present invention can be used in foods and drinks.
  • the food-drinks by this invention contain the above-mentioned fat accumulation inhibitor.
  • the food and drink according to the present invention can be prepared in the form of granules, granules, pastes, gels, solids, liquids, and the like.
  • excipients, binders, disintegrants, thickeners, dispersants, reabsorption accelerators, taste-masking agents, buffering agents, surfactants, solubilizers, which are permitted to be contained in food and drink, Preservatives, emulsifiers, isotonic agents, stabilizers, pH adjusters, and the like can be appropriately contained.
  • it can be applied to foods and drinks, functional foods, foods for sick people, foods for specified health use, etc., which are based on the concept of fatty liver suppression and the like as necessary.
  • the fat accumulation inhibitor by this invention can also be used for feeds, such as mammals, pet food, a supplement for pets similarly to food-drinks.
  • Example 1 A striped thistle extract was prepared from striped thistle leaves and cultured cell experiments were conducted.
  • Residual hexane was removed by placing the residue after washing with hexane under reduced pressure. Extraction processing was performed by adding 10 mL of chloroform to the residue after removing hexane and immersing at 37 ° C. for 2 hours. After extraction, the extract was separated by filtration under reduced pressure, and the residue was washed twice with 10 mL of chloroform. The liquid produced by this washing was combined with the previously obtained extract to obtain a chloroform extract.
  • Residual chloroform was removed by placing the residue after the previous washing with chloroform under reduced pressure.
  • An extraction treatment was performed by adding 10 mL of ethanol to the residue after removal of chloroform and immersing it at 37 ° C. for 2 hours. After extraction, the extract was separated by filtration under reduced pressure, and the residue was washed twice with 10 mL of ethanol. The liquid produced by this washing was combined with the previously obtained extract to obtain an ethanol extract.
  • the remaining ethanol was removed by placing the residue after washing with ethanol under reduced pressure. Extraction processing was performed by adding 10 mL of distilled water to the residue after removing ethanol and immersing it at 37 ° C. for 2 hours. After extraction, the extract was separated by filtration under reduced pressure, and the residue was washed twice with 10 mL of distilled water. The liquid produced by this washing was combined with the previously obtained extract to obtain a water extract.
  • the hexane extract, chloroform extract and ethanol extract obtained by the above preparation method were dried under reduced pressure, and the water extract was lyophilized. Each extract was dissolved in dimethyl sulfoxide to obtain a 25 mg / mL solution.
  • DMEM Dulbecco's Vogt modified Eagle's minimum essential medium
  • adipocytes were washed with phosphate buffered saline (PBS) and fixed with formalin. Fixed cells were washed again with PBS and then soaked in 60% isopropanol for 1 minute. Thereafter, lipid droplets were stained with oil red O (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 60% isopropanol for 10 minutes (for the experimental method using oil red O, Food Function Research Method (Apple) p133 -136). Thereafter, the cells were washed once with 60% isopropanol and twice with PBS, and the formation of lipid droplets in the cells was visually evaluated under an optical microscope.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cultured adipocytes after culturing with the addition of the hexane extract were washed with PBS, the cells were lysed with 0.1% sodium lauryl sulfate, and lipids were extracted from the cell lysate.
  • the method of Bligh & Dyer (Bright EG and Dyer WJ, A rapid method of total lipid extraction and purification, Canadian Journal of Biochemistry 9-19: 19 and 19: 19) is used.
  • the extracted lipid was dissolved in isopropanol containing 10% Triton X-100, and neutral fat (triglyceride: TG) concentration was measured using triglyceride E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The value of this TG concentration was corrected by the protein concentration of the cell lysate (measured using Qubit Fluorometer (Invitrogen)) to obtain an intracellular triglyceride (triglyceride: TG) concentration. As a test method, Student's t-test was used to detect a significant difference between the two groups.
  • FIG. 1 (a) The results of oil red O staining are shown in FIG. 1 (a), and the results of intracellular neutral fat (triglyceride: TG) concentration measurement are shown in FIG. 1 (b).
  • ND indicates 3T3-L1 cells (Non-Differencement, ND) that have not undergone differentiation induction treatment
  • Control has undergone differentiation induction treatment and added with dimethyl sulfoxide.
  • the cultured cells are shown. It was shown that the number of lipid droplets formed in the cells cultured with the addition of hexane extract of striped thistle was clearly smaller than that of chloroform extract, ethanol extract and water extract (Fig. 1 (a)).
  • 3T3-L1 cells were induced to differentiate into adipocytes by culturing for 2 days in DMEM mixed with 10% FBS, 50 nM IBMX, 1 ⁇ M DEX and 10 ⁇ g / mL insulin.
  • the medium was replaced with DMEM mixed with 10% FBS and 10 ⁇ g / mL insulin, then the medium was replaced on the second day, and then cultured until the fourth day.
  • each extract of the striped thistle obtained as described above was added to the medium from the start of differentiation induction of 3T3-L1 cells to the end of the experiment so that the final concentration was 50 ⁇ g / mL.
  • Example 2 Animal experiments were performed using freeze-dried powder of thistle leaves.
  • each tissue and blood of the mouse was collected, and the body weight and organ weight (FIG. 3), tissue weight (FIG. 4), blood parameters (FIG. 5) and various parameters of the liver (FIG. 6) of each group of mice. ) was measured.
  • Dunnett's method which is a multiple test method, was used to detect a significant difference between the control group and the experimental group.
  • Mouse liver neutral fat concentration and liver total cholesterol concentration were measured as follows. The liver was removed from the mice after the breeding, and the method of Folch et al. (1): 497-509) was used to extract liver lipids. The extracted liver lipid was dissolved in isopropanol containing 10% Triton X-100 to obtain a lipid extract. The neutral fat concentration in this lipid extract was measured using the method of Fletcher (Fletcher MJ, A colorimetric method for Estimating serum triglycerides; Clinica Chimica Acta 1968; 22 (3)): 393-397. The total cholesterol concentration in this lipid extract was measured using Cholesterol E-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • FIG. 3 shows the measurement results of body weight, liver weight, spleen weight, and kidney weight. While no changes were seen in body weight, spleen weight and kidney weight, liver weight was significantly reduced as the content of striped thrips in the diet increased.
  • FIG. 4 shows the measurement results of testicular peripheral adipose tissue weight, renal peripheral adipose tissue weight, mesenteric adipose tissue weight, and subcutaneous adipose tissue weight. While there was no change in the weight of testicular adipose tissue, peripheral kidney adipose tissue, and mesenteric adipose tissue, the subcutaneous adipose tissue weight decreased significantly as the content of striped thistle leaves increased in the diet. It was.
  • FIG. 5 shows the measurement results of blood neutral fat concentration, blood total cholesterol concentration, blood free fatty acid concentration, and blood insulin concentration. While blood triglyceride concentration, blood total cholesterol concentration, and blood insulin concentration did not change, blood free fatty acid concentration decreased significantly as the content of striped thistle leaves increased. It was.
  • FIG. 6 shows the measurement results of liver neutral fat concentration, liver total cholesterol concentration, and blood markers (AST and ALT) of liver damage. Significant decreases were observed not only in the liver triglyceride concentration and liver total cholesterol concentration, but also in the blood markers for liver damage (AST and ALT).
  • FIG. 7 shows the results for the subcutaneous white adipose tissue and white kidney adipose tissue
  • FIG. 8 shows the results for the liver.
  • “Control” in FIGS. 7 and 8 is a group to which feed containing no freeze-dried powder of thistle leaf was given (that is, the group of “0%” in Table 2).
  • fatty acid synthase (FAS) expression in subcutaneous white adipose tissue and peripheral white adipose tissue decreased in a dose-dependent manner (FIG. 7), and also in the liver, FAS expression was reduced in a dose-dependent manner (FIG. 8).
  • Example 3 The fat accumulation inhibitory effect of the hexane extract and chloroform extract obtained from the leaves of thistle was examined in detail.
  • the above-mentioned hexane extract solution was subjected to solid phase extraction using a Presep-C silica gel column (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to obtain each fraction. More specifically, as shown in FIG. 10, 1 mL of the above hexane extract solution was applied to a Presep-C silica gel column, and the resulting eluate was designated as “FT1 fraction”. Subsequently, 5 mL of hexane was passed through and the obtained eluate was designated as “FT2 fraction”. Subsequently, 5 mL of hexane: chloroform (50:50) was passed through, and the obtained eluate was designated as “HC (50/50) fraction”.
  • NC indicates 3T3-L1 cells not subjected to differentiation induction treatment
  • PC indicates cells cultured after differentiation induction treatment and addition of dimethyl sulfoxide.
  • the intracellular triglyceride concentration was significantly lower than that of “PC” (FIG. 11).
  • the hexane extract of striped thistle leaves according to this example suppresses lipid accumulation.
  • the HC (50/50) fraction in the hexane extract is excellent in lipid accumulation inhibitory effect.
  • a fat synthesis related gene was evaluated using HepG2 cell which is a human liver cancer cell.
  • Cell culture and induction of differentiation into adipocytes were performed in the same manner as in Example 1 except that HepG2 cells were used instead of 3T3-L1 cells. From the start of induction of differentiation of HepG2 cells to the end of the experiment, a medium in which each fraction dissolved in 1 mL of dimethyl sulfoxide was added to 0.5% (v / v) was used.
  • purification of total RNA from cells, cDNA synthesis, and real-time PCR were performed in the same manner as in Example 1, but the following primers were used for detecting FAS expression.
  • FAS-sense TCGTGGGCTACAGCATGGGT (SEQ ID NO: 33)
  • FAS-anti-sense GCCCTCTGAAGTCGAAGAAG (SEQ ID NO: 34)
  • ACTB-sense TCACCGAGCGCGCT (SEQ ID NO: 35)
  • ACTB-anti-sense TAATGTCACGCACGATTTCCC (SEQ ID NO: 36)
  • Each gene expression data was corrected by the expression level of the housekeeping gene ( ⁇ -actin, ACTB), which is an internal standard, and the mRNA level of the fat synthesis-related gene (FAS) was evaluated for the cells treated with each fraction.
  • ACTB housekeeping gene
  • FAS fat synthesis-related gene
  • CM (50/50) fraction in which the decrease in fatty acid synthase (FAS) expression was observed, the CM (50/50) fraction was subjected to HPLC (described later), and fractions 1 to 10 (Fr .01 to 10) (FIG. 14).
  • the HPLC method will be specifically described.
  • An Shimadzu Corporation instrument was used as the HPLC instrument, and an evaporative light scattering detector (ELSD-LT, Shimadzu Corporation) was used as the detector.
  • the column used was a silica gel column Develosil packed column (60-3 8.0 / 250 (NM), Nomura Chemical), and gradient analysis (flow rate 0.5 mL / min) using chloroform and methanol was performed.
  • results are shown in FIG. In FIG. 16, “solvent” indicates cells cultured with addition of dimethyl sulfoxide, and “CM (50/50) fraction” indicates cells cultured with addition of the aforementioned CM (50/50) fraction. Show. In “Fr.04”, the expression of fatty acid synthase (FAS) is significantly reduced compared to “solvent”, and the degree of decrease in fatty acid synthase (FAS) expression in “Fr.04” is “CM (50/50) fraction "was stronger than that.
  • the chloroform extract of striped thistle leaves according to this example reduced the expression of fatty acid synthase (FAS).
  • the CM (50/50) fraction in the chloroform extract, and further, fraction 4 (Fr. 04) in the CM (50/50) fraction may be excellent in the fatty acid synthase (FAS) expression reduction effect. Indicated.
  • the thistle extract according to this example has the effect of suppressing lipid accumulation and reducing the expression of fatty acid synthase (FAS).

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Abstract

　脂肪蓄積抑制剤は、アザミ属植物を有効成分として含有する。

Description

脂肪蓄積抑制剤、医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法
　本発明は、脂肪蓄積抑制剤、医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法に関する。
　アザミは、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）アザミ属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）に属する植物であり、山地から海浜までに至る広い地域に分布している。世界に２５０種以上があり、北半球に広く分布する。地方変異が非常に多く、日本では１００種以上あるとされるが、現在も新種が見つかることがある。さらに種間の雑種もあるので、分類が難しい場合もあるとされる。
　アザミの中のシマアザミ群には、シマアザミ（Ｃｉｒｓｉｕｍ　ｂｒｅｖｉｃａｕｌｅ　Ａ．Ｇｒａｙ）、オガサワラアザミ（Ｃ．　ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）、オイランアザミ（Ｃ．　ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、及びハマアザミ（Ｃ．　ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）の４種が認められており、日本では関東以南の太平洋岸から琉球列島に至るまで、また、台湾の一部にも分布することが報告されている（非特許文献１）。
　アザミ属植物に関しては、さまざまな薬理作用を有することが報告されている。特許文献１には、シマアザミの根茎の抽出物を有効成分とする抗菌剤及び抗酸化剤が開示されている。また、ハマアザミ（Ｃ．　ｍａｒｉｔｉｍｕｍ　Ｍａｋｉｎｏ）については、特許文献２に血糖上昇抑制作用が、特許文献３に抗変異原性が開示されている。また、ノアザミ（Ｃ．　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）については、特許文献４に、セラミド産生促進作用及び保湿剤として用いられ得ることが開示されている。また、日本産のアザミ属植物については、非特許文献２にて、マウス線維芽細胞（３Ｔ３－Ｌ１細胞）から脂肪細胞分化を促進する作用が報告されている。また、特許文献５には、アザミ属植物（アレチアザミ（Ｃｅｐｈａｌｏｎｏｐｌｏｓ　ｓｅｇｅｔｕｍ（Ｂｉｅｂ．）Ｋｉｔａｍ．）及びノアザミ（Ｃｉｒｓｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　ＤＣ．））の脂肪分解促進作用が開示されている。
特開平６－２０６８６７号公報 特開２０００－２１２０９６号公報 特開２０００－２５６２０５号公報 特開２０１１－７９７５４号公報 特開平８－３０１７８０号公報
門田祐一「シマアザミとその近縁種の分類と分布」Ｍｅｍ．Ｎａｔｎ．Ｓｃｉ．Ｍｕｓ．，Ｔｏｋｙｏ（２３），１９９０ Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ．，Ｐｈａｒｍ．，Ｂｕｌｌ．３５（６），８５５－８６０，（２０１２）
　しかしながら、アザミ属植物に関して、脂肪蓄積抑制作用については、これまで報告がなされていなかった。
　本発明者らは、アザミ属植物が、優れた脂肪蓄積抑制作用を有することを新たに見出し、本発明を完成した。本発明は、優れた効果を有する脂肪蓄積抑制剤、並びに該脂肪蓄積抑制剤を含有する医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤は、
　アザミ属植物を有効成分として含有する。
　アザミ属植物は、シマアザミであってもよい。
　本発明の第２の観点に係る医薬品は、
　本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する。
　本発明の第３の観点に係る脂肪肝の予防剤又は治療剤は、
　本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する。
　本発明の第４の観点に係る飲食品は、
　本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤を含有する。
　本発明の第５の観点に係る脂肪蓄積抑制剤の製造方法は、
　アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程を含む、
　ことを特徴とする。
　本発明の第６の観点に係る脂肪蓄積抑制剤は、
　本発明の第５の観点に係る脂肪蓄積抑制剤の製造方法により得られる、
　ことを特徴とする。
　本発明によれば、優れた効果を有する脂肪蓄積抑制剤、並びに該脂肪蓄積抑制剤を含有する医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法を提供することができる。
本実施例によるシマアザミ抽出物の、培養細胞における脂肪蓄積抑制効果を示す図である。（ａ）は脂肪滴の形成、（ｂ）は細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度測定の結果を示す図である。 本実施例によるシマアザミ抽出物の、培養細胞の脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。 本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの体重、肝臓重量、脾臓重量及び腎臓重量に及ぼす影響を示す図である。 本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの精巣周辺脂肪組織重量、腎臓周辺脂肪組織重量、腸間膜脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量に及ぼす影響を示す図である。 本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの血中中性脂肪濃度、血中総コレステロール濃度、血中遊離脂肪酸濃度及び血中インスリン濃度に及ぼす影響を示す図である。 本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの肝臓中性脂肪濃度、肝臓総コレステロール濃度及び肝障害の血中マーカー（ＡＳＴ及びＡＬＴ）に及ぼす影響を示す図である。 本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの皮下白色脂肪組織及び腎臓周辺白色脂肪組織における脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響について示したグラフ図である。 本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの肝臓における脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響について示したグラフ図である。 シマアザミからヘキサン抽出物及びクロロホルム抽出物を得る工程について説明した図である。 ヘキサン抽出物から各画分を得る工程について説明した図である。 本実施例によるヘキサン抽出物の各画分について、細胞内中性脂肪濃度測定の結果を示す図である。 クロロホルム抽出物から各画分を得る工程について説明した図である。 本実施例によるクロロホルム抽出物の各画分について、脂肪酸合成酵素ｍＲＮＡレベル測定の結果を示す図である。 本実施例によるクロロホルム抽出物のＣＭ（５０／５０）画分から得られたフラクションを示す図である。 各フラクションについて、脂肪酸合成酵素ｍＲＮＡレベル測定の結果を示す図である。 フラクション４について、脂肪酸合成酵素ｍＲＮＡレベル測定の結果を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
　まず、本発明よる脂肪蓄積抑制剤について詳述する。本発明による脂肪蓄積抑制剤は、アザミ属植物を有効成分として含有する。
　本発明に用いられるアザミ属植物としては、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）アザミ属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）に属するシマアザミ（Ｃｉｒｓｉｕｍ　ｂｒｅｖｉｃａｕｌｅ　Ａ．Ｇｒａｙ）、オガサワラアザミ（Ｃ．　ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）、オイランアザミ（Ｃ．　ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、ハマアザミ（Ｃ．　ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）等が挙げられる（ただし、アレチアザミ（Ｃｅｐｈａｌｏｎｏｐｌｏｓ　ｓｅｇｅｔｕｍ（Ｂｉｅｂ．）Ｋｉｔａｍ．）及びノアザミ（Ｃｉｒｓｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　ＤＣ．）は除く）。この中でも、シマアザミ（Ｃｉｒｓｉｕｍ　ｂｒｅｖｉｃａｕｌｅ　Ａ．Ｇｒａｙ）が最も好適に用いられる。本発明の効果を奏するアザミ属植物であれば、適宜選択され得る。
　本発明において、アザミ属植物としては、任意の栽培日数のものが用いられ得る。また、アザミ属植物の葉、茎、根、根茎、果実、種子、種皮、花等を用いることができるが、アザミ属植物の葉を好適に用いることができる。
　本発明において、アザミ属植物は、生のまま、又は乾燥粉末（例えば、アザミ属植物を凍結乾燥させ乳鉢等で粉末化することで調製される）、搾汁、アザミ属植物抽出物（後述）等の形態に調製されて使用される。市販のアザミ属植物のエキス、アザミ属植物の粉末等を用いてもよい。したがって、本明細書において、本発明による脂肪蓄積抑制剤に含有される“アザミ属植物”とは、生の状態のアザミ属植物、アザミ属植物の乾燥粉末、アザミ属植物の搾汁、アザミ属植物抽出物（後述）、アザミ属植物のエキス等を指す。
　本発明による脂肪蓄積抑制剤は、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制し、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現を低下させる効果を有する。
　次に、本発明による脂肪蓄積抑制剤の製造方法について詳述する。
　本発明による脂肪蓄積抑制剤の製造方法は、アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程を含む。
　前述の工程で用いられるアザミ属植物としては、生の状態のアザミ属植物、アザミ属植物の乾燥粉末等が例示される。アザミ属植物の種類、栽培日数、使用部位については、前述同様である。
　前述の“アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る”こととは、例えば、アザミ属植物を溶媒に浸漬させる（例えば、３７℃、２時間浸漬させる）ことで抽出液を得ること；アザミ属植物を溶媒に浸漬させた後、溶媒を分離（例えば、減圧濾過）し、残渣を溶媒で洗浄することで抽出液を得ること；アザミ属植物を溶媒に浸漬させた後、溶媒を分離し、残渣を溶媒で洗浄し、さらに溶媒の分離と残渣の溶媒による洗浄とを１回又は２回以上繰り返すことで抽出液を得ることをいう。したがって、本明細書において、“抽出操作”とは、アザミ属植物を溶媒に浸漬させること、溶媒を分離すること、残渣を溶媒で洗浄すること等を表す。また、本明細書において“抽出液”とは、アザミ属植物を溶媒に浸漬させることで得られた液体、アザミ属植物の溶媒への浸漬後に溶媒を分離し残渣を溶媒で洗浄することで得られた液体等を表す。
　前述の“溶媒”には、例えば、水、熱水（例えば、５０℃以上）、アルコール類、ヘキサン、クロロホルム、エーテル類、エステル類、ケトン類が含まれる。アルコール類は、例えば、エタノール、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール等の低級アルコール、及び１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコールであり；エーテル類は、例えば、ジエチルエーテル、プロピルエーテル等であり；エステル類は、例えば、酢酸ブチル、酢酸エチル等であり；ケトン類は、例えば、アセトン、エチルメチルケトン等である。これらの溶媒の２又は３以上を組み合わせた混合溶媒を用いてもよい。また、例えば、ヘキサンを用いて抽出操作を行った後に、得られた残渣に対してクロロホルムを用いて抽出操作を行うというように、抽出操作において異なる溶媒を順番に組み合わせて用いてもよい。人体への影響を考慮すると、溶媒としては、水、熱水、エタノール等が好適に用いられる。
　なお、本明細書において、アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“アザミ属植物抽出物”という場合があり；シマアザミに対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“シマアザミ抽出物”という場合があり；アザミ属植物に対して溶媒としてヘキサンを用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“ヘキサン抽出物”という場合があり；アザミ属植物に対して溶媒としてクロロホルムを用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“クロロホルム抽出物”という場合があり；アザミ属植物に対して溶媒としてエタノールを用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“エタノール抽出物”という場合がある。
　また、上記の本明細書による脂肪蓄積抑制剤は、前述の製造方法により得られるものであってもよい。すなわち、前述の“アザミ属植物抽出物”は、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制し、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させる効果を有するため、脂肪蓄積抑制剤として用いることができる。また、例えば、特定の溶媒による抽出物に対してさらに固相抽出等を行って得られた特定の画分を脂肪蓄積抑制剤として用いてもよく、この固相抽出して得られた特定の画分をさらにＨＰＬＣ等に供して得られた特定のフラクションを脂肪蓄積抑制剤として用いてもよい。
　次に、本発明による医薬品及び飲食品について詳述する。
　本発明による脂肪蓄積抑制剤は、医薬品に用いることができる。本発明による医薬品は、前述の脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する。
　本発明による医薬品の投与方法は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等、適宜選択され得る。この医薬品の剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。
　また、本発明による医薬品には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。また、本発明による医薬品には、前述の脂肪蓄積抑制剤以外の他の活性成分（例えば、脂肪肝抑制剤）を適宜含有させることもできる。
　本発明による医薬品の有効成分である脂肪蓄積抑制剤の投与量は、患者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができる。また、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。
　本発明による医薬品は、有効成分として本発明による脂肪蓄積抑制剤を含有しているため、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制し、特に肝臓における脂質代謝を改善させ、ひいては、脂肪肝の抑制、皮下脂肪の減量、肥満抑制及び防止、肥満体質の改善等の作用を発揮する。特に、肝臓における脂肪蓄積抑制作用に優れるため、本発明は脂肪肝の予防剤又は治療剤を提供することができる。本発明者らは、この脂肪蓄積抑制効果の一つの機序が、脂肪分解促進作用によるものではなく、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現を低下させることによるものであることを見出し（実施例にて後述）、本発明を完成した。特に、近年、脂肪肝については、肝硬変や肝臓がん発症への関連性のみならず、糖尿病の発症リスクの上昇や動脈硬化の促進の可能性が示唆されているため、本発明による医薬品（脂肪肝の予防剤又は治療剤）によって、肝臓における脂肪蓄積を抑制し、脂肪肝を抑制し得ることは殊に重要である。
　また、本発明による脂肪蓄積抑制剤は、飲食品に用いることができる。本発明による飲食品は、前述の脂肪蓄積抑制剤を含有する。
　本発明による飲食品は、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、液体状等に調製することができる。また、飲食品中に含有させることが認められている賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。また、脂肪肝抑制等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品等に応用することができる。また、本発明による脂肪蓄積抑制剤は、飲食品と同様に、哺乳類等の飼料、ペットフード、ペット用サプリメント等に用いることもできる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　シマアザミ葉からシマアザミ抽出物を調製し、培養細胞実験を行った。
（シマアザミ抽出物の調製）
　シマアザミの葉を水で洗った後、次亜塩素酸で殺菌した。その後、水切りを十分行い、予備凍結させた。その後、真空乾燥装置（株式会社マルイ）を用いてシマアザミの葉を凍結乾燥させた。凍結乾燥させた葉を粉砕機で粉砕し、ふるいにかけることで非粉末物を除去して、シマアザミの葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１ｇに１０ｍＬのヘキサンを加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬのヘキサンで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、ヘキサン抽出物とした。
　先のヘキサンによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するヘキサンを除去した。ヘキサン除去後の残渣に１０ｍＬのクロロホルムを加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬのクロロホルムで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、クロロホルム抽出物とした。
　先のクロロホルムによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するクロロホルムを除去した。クロロホルム除去後の残渣に１０ｍＬのエタノールを加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬのエタノールで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、エタノール抽出物とした。
　先のエタノールによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するエタノールを除去した。エタノール除去後の残渣に１０ｍＬの蒸留水を加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬの蒸留水で２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、水抽出物とした。
　以上の調製方法により得られたヘキサン抽出物、クロロホルム抽出物及びエタノール抽出物を減圧乾固し、水抽出物を凍結乾燥した。各抽出物をジメチルスルホキシドに溶解して、各々２５ｍｇ／ｍＬの溶解液を得た。
（マウス線維芽細胞（３Ｔ３―Ｌ１細胞）の培養）
　１０％のウシ血清を加えたダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて、マウス線維芽細胞（３Ｔ３―Ｌ１細胞）を、５×１０３細胞／ｍＬ／ウェルとなるように２４ウェルプレートに播種した。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で、１日おきに培地交換を行いながら、コンフルエントに達するまで培養した。コンフルエントに達した後、さらに２日間の培養を行い、その後、分化誘導を開始させた。
（３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導）
　３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０ｎＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタソン（ＤＥＸ）及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭにて、２日間培養することで行った。分化誘導開始後２日目に、培地を１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭに交換し、その後２日目に同培地の交換を行い、その後４日目まで培養を行った。なお、前述の通り得られたシマアザミの各抽出物を、終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように、３Ｔ３―Ｌ１細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで培地に添加した。
（脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３－Ｌ１細胞のオイルレッドＯ染色及び細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度測定）
　培養終了後の、脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３－Ｌ１細胞（以下、“培養脂肪細胞”という）内に形成される脂肪滴の数及び細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度を評価することによって、シマアザミ葉の各抽出物の脂質蓄積抑制効果を評価した。
　培養脂肪細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、ホルマリンで固定した。固定した細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、その後、６０％イソプロパノールに１分間浸した。その後、６０％イソプロパノールに溶解したオイルレッドＯ（和光純薬工業株式会社）にて、１０分間、脂肪滴を染色した（オイルレッドＯを用いた実験手法については、食品機能研究法（林琳）ｐ１３３－１３６を参照した）。その後、細胞を、６０％イソプロパノールにて１回洗浄し、ＰＢＳにて２回洗浄して、光学顕微鏡下で細胞内の脂肪滴の形成を目視により評価した。
　また、ヘキサン抽出物を添加して培養した後の培養脂肪細胞をＰＢＳにて洗浄して、０．１％ラウリル硫酸ナトリウムにて細胞を溶解し、細胞溶解液から脂質を抽出した。この抽出には、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ　ＥＧ　ａｎｄ　Ｄｙｅｒ　ＷＪ，Ａ　ｒａｐｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｐｉｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１９５９；３７（８）：９１１－９１７）を利用した。抽出した脂質を１０％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含んだイソプロパノールに溶解して、トリグリセライド　Ｅ－テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度を測定した。このＴＧ濃度の値を、細胞溶解液のタンパク質濃度（Ｑｕｂｉｔ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（インビトロジェン）を用いて測定）で補正して、細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度とした。なお、検定方法として、２群間の有意差を検出するためにスチューデントのｔ検定を用いた。
（結果）
　オイルレッドＯ染色の結果を図１（ａ）に、細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度測定の結果を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）及び（ｂ）において、「ＮＤ」は分化誘導処理を行なっていない３Ｔ３－Ｌ１細胞（Ｎｏｎ－Ｄｉｆｆｅｎｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＮＤ）を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は分化誘導処理を行ってジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。シマアザミ葉のヘキサン抽出物を添加して培養した細胞では、クロロホルム抽出物、エタノール抽出物及び水抽出物のそれに比して、形成された脂肪滴の数が明らかに少ないことが示された（図１（ａ））。また、シマアザミ葉のヘキサン抽出物を添加して培養した細胞では、コントロールに比して有意に細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度が低いことが示された（図１（ｂ））。
　以上より、本実施例によるシマアザミ葉の抽出物は、培養脂肪細胞の脂質蓄積を抑制することが示された。
（脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響）
　シマアザミ葉のヘキサン抽出物を用いて、培養脂肪細胞の脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表１）の発現に及ぼす影響について検討した。
　３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導を、１０％ＦＢＳ、５０ｎＭ　ＩＢＭＸ、１μＭ　ＤＥＸ及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭにて、２日間培養することで行った。分化誘導開始後２日目に、培地を１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭに交換し、その後２日目に同培地の交換を行い、その後４日目まで培養を行った。なお、前述の通り得られたシマアザミの各抽出物を、終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように、３Ｔ３―Ｌ１細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで培地に添加した。
　培養脂肪細胞をＰＢＳで洗浄して、８００μＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を加えて細胞溶解液を得た。細胞溶解液に２００μＬのクロロホルムを混合して室温にて５分間静置し、その後１２，０００×ｇ、１５分間の遠心分離により細胞溶解液を二層に分離した。回収した上層（水層）に等量の７０％エタノールを混合して、Ｐｕｒｅ　Ｌｉｎｋ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した。Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２μｇのＴｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
　合成したｃＤＮＡを鋳型として、Ｆａｓｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び目的の遺伝子発現を検出するプライマー（表１）を加えて、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて遺伝子発現解析を行った。内部標準であるハウスキーピング遺伝子（β―アクチン、ＡＣＴＢ）の発現量により各遺伝子発現データを補正して、シマアザミ各抽出物による脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表１）の変動を解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（結果）
　結果を図２に示す。図２において、「ＮＤ」及び「Ｃｏｎｔｒｏｌ」については図１と同様である。シマアザミ葉のヘキサン抽出物を添加して培養した細胞では、コントロールに比して有意に脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が低下していた。
　以上より、本実施例によるシマアザミ抽出物は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させることにより、脂肪細胞内の脂肪蓄積を抑制させることが示唆された。
（実施例２）
　シマアザミ葉の凍結乾燥粉末を用いて、動物実験を行った。
　５７ＢＬ／６マウス（♂）を購入し、新しい環境に慣らすために１週間の予備飼育を行った。その後、マウスを６匹ずつの３群に分けて、各群のマウスに、高脂肪食（米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が１９７７年に発表したげっ歯類を用いた栄養研究のための標準精製飼料（ＡＩＮ－７６）の基本組成に１５％のコーン油を配合したもの）に、シマアザミ葉の凍結乾燥粉末（実施例１と同様）を０％、５％又は１０％配合した飼料（表２参照）を与えて、４週間飼育した。飼育期間中、各群マウスの摂取エネルギーが同等になるように食餌摂取量を調整した。なお、図３－６において、「Ｃｎｔｌ（＝ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、シマアザミ葉の凍結乾燥粉末が含まれていない飼料を与えた群（つまり、表２の「０％」の群）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　飼育終了後、マウスの各組織と血液を採取し、各群のマウスの体重及び臓器重量（図３）、組織重量（図４）、血中パラメーター（図５）及び肝臓の各種パラメーター（図６）を測定した。検定方法としては、対照群と実験群の有意差を検出するために多重検定法であるダネットの方法を用いた。
　マウスの各種パラメーターは、以下の市販のキットを用いて測定した。
・中性脂肪（図５）：トリグリセライド　Ｅ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）
・総コレステロール（図５）：コレステロールＥ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）
・遊離脂肪酸（図５）：ＮＥＦＡ　Ｃ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）
・インスリン（図５）：マウスインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所）
・肝障害マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）（図６）：トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）
　マウスの肝臓中性脂肪濃度及び肝臓総コレステロール濃度（図６）は、以下の通り測定した。飼育終了後のマウスから肝臓を摘出し、Ｆｏｌｃｈ氏らの方法（Ｆｏｌｃｈ　Ｊ，Ｌｅｅｓ　Ｍ　ａｎｄ　Ｓｌｏａｎｅ　Ｓｔａｎｌｅｙ　ＧＨ，Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｐｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ；Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９５７；２２６（１）：４９７－５０９）を用いて肝臓の脂質を抽出した。抽出した肝臓の脂質を、１０％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含んだイソプロパノールに溶解し、脂質抽出液とした。この脂質抽出液中の中性脂肪濃度を、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ氏の方法（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ　ＭＪ，Ａ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ；Ｃｌｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　１９６８；２２（３）：３９３－３９７）を用いて測定した。また、この脂質抽出液中の総コレステロール濃度を、コレステロールＥ－テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。
（結果）
　図３に体重、肝臓重量、脾臓重量及び腎臓重量の測定結果を示す。体重、脾臓重量及び腎臓重量には変化が見られなかった一方で、肝臓重量は、飼料中のシマアザミ葉の含量が多くなるほど有意に低下していた。
　図４に精巣周辺脂肪組織重量、腎臓周辺脂肪組織重量、腸間膜脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量の測定結果を示す。精巣周辺脂肪組織重量、腎臓周辺脂肪組織重量及び腸間膜脂肪組織重量には変化が見られなかった一方で、皮下脂肪組織重量は、飼料中のシマアザミ葉の含量が多くなるほど有意に低下していた。
　図５に血中中性脂肪濃度、血中総コレステロール濃度、血中遊離脂肪酸濃度及び血中インスリン濃度の測定結果を示す。血中中性脂肪濃度、血中総コレステロール濃度及び血中インスリン濃度には変化が見られなかった一方で、血中遊離脂肪酸濃度は、飼料中のシマアザミ葉の含量が多くなるほど有意に低下していた。
　図６に肝臓中性脂肪濃度、肝臓総コレステロール濃度及び肝障害の血中マーカー（ＡＳＴ及びＡＬＴ）の測定結果を示す。肝臓中性脂肪濃度及び肝臓総コレステロール濃度のみならず、肝障害の血中マーカー（ＡＳＴ及びＡＬＴ）についても、有意な低下がみられた。
（脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響）
　シマアザミ葉の摂取が、高脂肪食摂取マウスの脂肪細胞及び肝臓における脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表３）の発現にどのような影響を及ぼすかについて検討した。
　前述の飼育終了後のマウスから採取した脂肪組織０．１ｇ及び肝臓０．１ｇに、８００μＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を加え、ホモジナイザーにより組織を溶解した。組織溶解液に２００μＬのクロロホルムを混合して室温にて５分間静置し、その後、１２，０００×ｇ、１５分間の遠心分離により細胞溶解液を二層に分離した。回収した上層（水層）に等量の７０％エタノールを混合して、Ｐｕｒｅ　Ｌｉｎｋ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した。Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２μｇのＴｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
　合成したｃＤＮＡを鋳型として、Ｆａｓｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び目的の遺伝子発現を検出するプライマー（表３）を加えて、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて遺伝子発現解析を行った。肝臓の内部標準として１８Ｓ　ｒＲＮＡ量を用いて、及び脂肪組織の内部標準としてＡＣＴＢ発現量を用いて、各遺伝子発現データを補正して、シマアザミ摂取による各組織の脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表３）の発現を解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（結果）
　図７に皮下白色脂肪組織及び腎臓周辺白色脂肪組織での結果を、図８に肝臓での結果を示す。なお、図３－６と同様に、図７及び図８の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、シマアザミ葉の凍結乾燥粉末が含まれていない飼料を与えた群（つまり、表２の「０％」の群）を表す。シマアザミ葉を摂取した高脂肪食摂取マウスでは、皮下白色脂肪組織及び腎臓周辺白色脂肪組織の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現が用量依存的に低下しており（図７）、また、肝臓においても、ＦＡＳ発現が用量依存的に低下していた（図８）。
　以上より、本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末を摂取すると、ＦＡＳの発現が低下することにより、脂肪細胞及び肝臓における脂肪蓄積を抑制することが示唆された。
（実施例３）
　シマアザミ葉から得られたヘキサン抽出物及びクロロホルム抽出物の脂肪蓄積抑制効果について、詳細に検証した。
（ヘキサン抽出物の調製）
　実施例１と同様にシマアザミの葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に１０倍量のヘキサンを加え、３７℃で２時間振盪浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を凍結乾燥粉末の１０倍量のヘキサンで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、ヘキサン抽出物とした（図９）。
（クロロホルム抽出物の調製）
　先のヘキサンによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するヘキサンを除去した。ヘキサン除去後の残渣に凍結乾燥粉末の１０倍量のクロロホルムを加え、３７℃で２時間振盪浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を凍結乾燥粉末の１０倍量のクロロホルムで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、クロロホルム抽出物とした（図９）。
（ヘキサン抽出物の脂肪蓄積抑制効果の検証）
　以上の調製方法により得られたヘキサン抽出物を減圧乾固し、ヘキサンに溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのヘキサン抽出物溶解液を得た（図１０）。
　前述のヘキサン抽出物溶解液について、プレセップ－Ｃシリカゲルカラム（和光純薬工業株式会社）を用いた固相抽出を行うことによって、各画分を得た。より具体的には、図１０に示すように、前述のヘキサン抽出物溶解液１ｍＬをプレセップ－Ｃシリカゲルカラムにアプライし、得られた溶出液を“ＦＴ１画分”とした。次いで、ヘキサン５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＦＴ２画分”とした。次いで、ヘキサン：クロロホルム（５０：５０）５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＨＣ（５０／５０）画分”とした。次いで、クロロホルム５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＨＣ（０／１００）画分”とした。次いで、クロロホルム：メタノール（５０：５０）５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（５０／５０）画分”とした。次いで、メタノール５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（０／１００）画分”とした。各画分を、乾固後、１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した。
　各画分について、３Ｔ３―Ｌ１細胞の中性脂肪蓄積に与える影響について評価を行った。３Ｔ３―Ｌ１細胞の培養、３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導については、実施例１と同様に行った。なお、３Ｔ３―Ｌ１細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで、前述の１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した各画分を０．５％（ｖ／ｖ）となるように加えた培地を用いた。各画分を添加して培養した後の培養脂肪細胞を溶解し、細胞溶解液から脂質を抽出して、細胞内中性脂肪濃度を測定した。培養脂肪細胞の溶解、脂質の抽出、細胞内中性脂肪濃度の測定については、実施例１と同様に行った。
（結果）
　細胞内中性脂肪濃度測定の結果を図１１に示す。図１１において、「ＮＣ」は分化誘導処理を行なっていない３Ｔ３－Ｌ１細胞を示し、「ＰＣ」は分化誘導処理を行ってジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。ＨＣ（５０／５０）画分を添加して培養した細胞では、「ＰＣ」に比して有意に細胞内中性脂肪濃度が低いことが示された（図１１）。
　以上より、本実施例によるシマアザミ葉のヘキサン抽出物は、脂質蓄積を抑制することが示された。特に、ヘキサン抽出物中のＨＣ（５０／５０）画分は、脂質蓄積抑制効果に優れることが示された。
（クロロホルム抽出物の脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響の検証）
　上記の調製方法により得られたクロロホルム抽出物を減圧乾固し、クロロホルムに溶解して、１００ｍｇ／ｍＬのクロロホルム抽出物溶解液を得た（図１２）。
　前述のクロロホルム抽出物溶解液について、プレセップ－Ｃシリカゲルカラム（和光純薬工業株式会社）を用いた固相抽出を行うことによって、各画分を得た。より具体的には、図１２に示すように、前述のヘキサン抽出物溶解液１ｍＬをプレセップ－Ｃシリカゲルカラムにアプライして得られた溶出液と、次いでクロロホルム５ｍＬを通液して得られた溶出液と、を合わせて“ＣＭ（１００／０）画分”とした。次いで、クロロホルム：メタノール（５０：５０）５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（５０／５０）画分”とした。次いで、メタノール５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（０／１００）画分”とした。各画分については、乾固後、１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した。
　各画分について、ヒト肝臓がん細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いて脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）の発現に及ぼす影響について評価を行った。３Ｔ３―Ｌ１細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞を用いたことを除いて、細胞の培養、脂肪細胞への分化誘導については、実施例１と同様に行った。なお、ＨｅｐＧ２細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで、前述の１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した各画分を０．５％（ｖ／ｖ）となるように加えた培地を用いた。また、細胞からのＴｏｔａｌ　ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲの方法については、実施例１と同様に行ったが、ＦＡＳ発現を検出するプライマーについては、以下のものを用いた。
　ＦＡＳ－ｓｅｎｓｅ：ＴＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＧＴ（配列番号３３）
　ＦＡＳ－ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ：ＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号３４）
　ＡＣＴＢ－ｓｅｎｓｅ：ＴＣＡＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴ（配列番号３５）
　ＡＣＴＢ－ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ：ＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号３６）
　内部標準であるハウスキーピング遺伝子（β―アクチン、ＡＣＴＢ）の発現量により各遺伝子発現データを補正して、各画分で処理した細胞について、脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）のｍＲＮＡレベルを評価した。
　結果を図１３に示す。図１３において、「未処理」はジメチルスルホキシドを加えていない細胞を示し、「溶媒」はジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。クロロホルム抽出物及びＣＭ（５０／５０）画分を添加して培養した細胞では、「未処理」及び「溶媒」に比して有意に脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が低下していた。
　脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現減少がみられたＣＭ（５０／５０）画分についてさらに詳細に調べるために、ＣＭ（５０／５０）画分をＨＰＬＣ（後述）に供し、フラクション１～１０（Ｆｒ．０１～１０）に分画した（図１４）。
　ＨＰＬＣの手法について具体的に説明する。ＨＰＬＣ機器として株式会社島津製作所製の機器を用い、検出器として蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ－ＬＴ、株式会社島津製作所）を用いた。使用したカラムはシリカゲルカラムＤｅｖｅｌｏｓｉｌ　ｐａｃｋｅｄ　ｃｏｌｕｍｎ（６０－３　８．０／２５０（ＮＭ）、野村化学）であり、クロロホルム及びメタノールを用いたグラジエント分析（流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）を行った。グラジエント条件は以下の通りである。
・０：００　Ｓｔａｒｔ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１００：０）
・６０：００　（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝７５：１５）
・７０：００（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：５０）
・９０：００　ｓｔｏｐ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：０）
　ＨＰＬＣにより得られたフラクション１～１０（Ｆｒ．０１～１０）について、前述同様にＨｅｐＧ２を用いて脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）の発現に及ぼす影響について評価を行った。
　結果を図１５に示す。図１５において、「溶媒」はジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。フラクション４（Ｆｒ．０４）を添加して培養した細胞では、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が最も低下していた。
　脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現が最も減少したフラクション４（Ｆｒ．０４）についてさらに詳細に調べるために、前述同様にＨｅｐＧ２を用いて、脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）のｍＲＮＡレベルを評価した。
　結果を図１６に示す。図１６において、「溶媒」はジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示し、「ＣＭ（５０／５０）画分」は、前述のＣＭ（５０／５０）画分を添加して培養した細胞を示す。「Ｆｒ．０４」では「溶媒」に比して有意に脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が低下しており、「Ｆｒ．０４」での脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現減少の度合いは、「ＣＭ（５０／５０）画分」でのそれよりも強かった。
　以上より、本実施例によるシマアザミ葉のクロロホルム抽出物は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させることが示唆された。特に、クロロホルム抽出物中のＣＭ（５０／５０）画分、さらにはＣＭ（５０／５０）画分中のフラクション４（Ｆｒ．０４）は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現減少効果に優れることが示された。
　以上より、本実施例によるシマアザミ抽出物は、脂質蓄積を抑制し、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させる効果を有することが示された。
　なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本発明は、２０１３年８月１３日に出願された日本国特許出願２０１３－１６８４０４号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１３－１６８４０４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

Claims (7)

  1. 　アザミ属植物を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤。
  2. 　アザミ属植物は、シマアザミである、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤。
  3. 　請求項１又は２に記載の脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する、
    　ことを特徴とする医薬品。
  4. 　請求項１又は２に記載の脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する、
    　ことを特徴とする脂肪肝の予防剤又は治療剤。
  5. 　請求項１又は２に記載の脂肪蓄積抑制剤を含有する、
    　ことを特徴とする飲食品。
  6. 　アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程を含む、
    　ことを特徴とする脂肪蓄積抑制剤の製造方法。
  7. 　請求項６に記載の製造方法により得られる、
    　ことを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
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