JP6467345B2

JP6467345B2 - 脂肪蓄積抑制剤、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び脂肪酸合成酵素抑制剤

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Publication number: JP6467345B2
Application number: JP2015531830A
Authority: JP
Inventors: 宏典屋; 泰男上山; 征志稲福
Original assignee: NPO AMAMI FUNCTIONAL FOODS STUDY GROUP; University of the Ryukyus; Amino UP Co Ltd
Current assignee: NPO AMAMI FUNCTIONAL FOODS STUDY GROUP; University of the Ryukyus; Amino UP Co Ltd
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2019-02-13
Anticipated expiration: 2034-08-13
Also published as: JP6638161B2; US10653740B2; JP2019088297A; US20160184378A1; WO2015022978A1; JPWO2015022978A1; US20180200317A1

Description

本発明は、脂肪蓄積抑制剤、医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法に関する。

アザミは、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）アザミ属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）に属する植物であり、山地から海浜までに至る広い地域に分布している。世界に２５０種以上があり、北半球に広く分布する。地方変異が非常に多く、日本では１００種以上あるとされるが、現在も新種が見つかることがある。さらに種間の雑種もあるので、分類が難しい場合もあるとされる。

アザミの中のシマアザミ群には、シマアザミ（ＣｉｒｓｉｕｍｂｒｅｖｉｃａｕｌｅＡ．Ｇｒａｙ）、オガサワラアザミ（Ｃ．ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）、オイランアザミ（Ｃ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、及びハマアザミ（Ｃ．ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）の４種が認められており、日本では関東以南の太平洋岸から琉球列島に至るまで、また、台湾の一部にも分布することが報告されている（非特許文献１）。

アザミ属植物に関しては、さまざまな薬理作用を有することが報告されている。特許文献１には、シマアザミの根茎の抽出物を有効成分とする抗菌剤及び抗酸化剤が開示されている。また、ハマアザミ（Ｃ．ｍａｒｉｔｉｍｕｍＭａｋｉｎｏ）については、特許文献２に血糖上昇抑制作用が、特許文献３に抗変異原性が開示されている。また、ノアザミ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）については、特許文献４に、セラミド産生促進作用及び保湿剤として用いられ得ることが開示されている。また、日本産のアザミ属植物については、非特許文献２にて、マウス線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞）から脂肪細胞分化を促進する作用が報告されている。また、特許文献５には、アザミ属植物（アレチアザミ（Ｃｅｐｈａｌｏｎｏｐｌｏｓｓｅｇｅｔｕｍ（Ｂｉｅｂ．）Ｋｉｔａｍ．）及びノアザミ（ＣｉｒｓｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤＣ．））の脂肪分解促進作用が開示されている。

特開平６−２０６８６７号公報特開２０００−２１２０９６号公報特開２０００−２５６２０５号公報特開２０１１−７９７５４号公報特開平８−３０１７８０号公報

門田祐一「シマアザミとその近縁種の分類と分布」Ｍｅｍ．Ｎａｔｎ．Ｓｃｉ．Ｍｕｓ．，Ｔｏｋｙｏ（２３），１９９０Ｌｉａｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．，Ｐｈａｒｍ．，Ｂｕｌｌ．３５（６），８５５−８６０，（２０１２）

しかしながら、アザミ属植物に関して、脂肪蓄積抑制作用については、これまで報告がなされていなかった。

本発明者らは、アザミ属植物が、優れた脂肪蓄積抑制作用を有することを新たに見出し、本発明を完成した。本発明は、優れた効果を有する脂肪蓄積抑制剤、並びに該脂肪蓄積抑制剤を含有する医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤は、
アザミ属植物を有効成分として含有する。

アザミ属植物は、シマアザミであってもよい。

本発明の第２の観点に係る医薬品は、
本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する。

本発明の第３の観点に係る脂肪肝の予防剤又は治療剤は、
本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する。

本発明の第４の観点に係る飲食品は、
本発明の第１の観点に係る脂肪蓄積抑制剤を含有する。

本発明の第５の観点に係る脂肪蓄積抑制剤の製造方法は、
アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程を含む、
ことを特徴とする。

本発明の第６の観点に係る脂肪蓄積抑制剤は、
本発明の第５の観点に係る脂肪蓄積抑制剤の製造方法により得られる、
ことを特徴とする。

本発明によれば、優れた効果を有する脂肪蓄積抑制剤、並びに該脂肪蓄積抑制剤を含有する医薬品、脂肪肝の予防剤又は治療剤及び飲食品並びに脂肪蓄積抑制剤の製造方法を提供することができる。

本実施例によるシマアザミ抽出物の、培養細胞における脂肪蓄積抑制効果を示す図である。（ａ）は脂肪滴の形成、（ｂ）は細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度測定の結果を示す図である。本実施例によるシマアザミ抽出物の、培養細胞の脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの体重、肝臓重量、脾臓重量及び腎臓重量に及ぼす影響を示す図である。本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの精巣周辺脂肪組織重量、腎臓周辺脂肪組織重量、腸間膜脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量に及ぼす影響を示す図である。本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの血中中性脂肪濃度、血中総コレステロール濃度、血中遊離脂肪酸濃度及び血中インスリン濃度に及ぼす影響を示す図である。本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの肝臓中性脂肪濃度、肝臓総コレステロール濃度及び肝障害の血中マーカー（ＡＳＴ及びＡＬＴ）に及ぼす影響を示す図である。本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの皮下白色脂肪組織及び腎臓周辺白色脂肪組織における脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響について示したグラフ図である。本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末の、高脂肪食摂取マウスの肝臓における脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響について示したグラフ図である。シマアザミからヘキサン抽出物及びクロロホルム抽出物を得る工程について説明した図である。ヘキサン抽出物から各画分を得る工程について説明した図である。本実施例によるヘキサン抽出物の各画分について、細胞内中性脂肪濃度測定の結果を示す図である。クロロホルム抽出物から各画分を得る工程について説明した図である。本実施例によるクロロホルム抽出物の各画分について、脂肪酸合成酵素ｍＲＮＡレベル測定の結果を示す図である。本実施例によるクロロホルム抽出物のＣＭ（５０／５０）画分から得られたフラクションを示す図である。各フラクションについて、脂肪酸合成酵素ｍＲＮＡレベル測定の結果を示す図である。フラクション４について、脂肪酸合成酵素ｍＲＮＡレベル測定の結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

まず、本発明よる脂肪蓄積抑制剤について詳述する。本発明による脂肪蓄積抑制剤は、アザミ属植物を有効成分として含有する。

本発明に用いられるアザミ属植物としては、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）アザミ属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）に属するシマアザミ（ＣｉｒｓｉｕｍｂｒｅｖｉｃａｕｌｅＡ．Ｇｒａｙ）、オガサワラアザミ（Ｃ．ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）、オイランアザミ（Ｃ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、ハマアザミ（Ｃ．ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）等が挙げられる（ただし、アレチアザミ（Ｃｅｐｈａｌｏｎｏｐｌｏｓｓｅｇｅｔｕｍ（Ｂｉｅｂ．）Ｋｉｔａｍ．）及びノアザミ（ＣｉｒｓｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤＣ．）は除く）。この中でも、シマアザミ（ＣｉｒｓｉｕｍｂｒｅｖｉｃａｕｌｅＡ．Ｇｒａｙ）が最も好適に用いられる。本発明の効果を奏するアザミ属植物であれば、適宜選択され得る。

本発明において、アザミ属植物としては、任意の栽培日数のものが用いられ得る。また、アザミ属植物の葉、茎、根、根茎、果実、種子、種皮、花等を用いることができるが、アザミ属植物の葉を好適に用いることができる。

本発明において、アザミ属植物は、生のまま、又は乾燥粉末（例えば、アザミ属植物を凍結乾燥させ乳鉢等で粉末化することで調製される）、搾汁、アザミ属植物抽出物（後述）等の形態に調製されて使用される。市販のアザミ属植物のエキス、アザミ属植物の粉末等を用いてもよい。したがって、本明細書において、本発明による脂肪蓄積抑制剤に含有される“アザミ属植物”とは、生の状態のアザミ属植物、アザミ属植物の乾燥粉末、アザミ属植物の搾汁、アザミ属植物抽出物（後述）、アザミ属植物のエキス等を指す。

本発明による脂肪蓄積抑制剤は、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制し、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現を低下させる効果を有する。

次に、本発明による脂肪蓄積抑制剤の製造方法について詳述する。

本発明による脂肪蓄積抑制剤の製造方法は、アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程を含む。

前述の工程で用いられるアザミ属植物としては、生の状態のアザミ属植物、アザミ属植物の乾燥粉末等が例示される。アザミ属植物の種類、栽培日数、使用部位については、前述同様である。

前述の“アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る”こととは、例えば、アザミ属植物を溶媒に浸漬させる（例えば、３７℃、２時間浸漬させる）ことで抽出液を得ること；アザミ属植物を溶媒に浸漬させた後、溶媒を分離（例えば、減圧濾過）し、残渣を溶媒で洗浄することで抽出液を得ること；アザミ属植物を溶媒に浸漬させた後、溶媒を分離し、残渣を溶媒で洗浄し、さらに溶媒の分離と残渣の溶媒による洗浄とを１回又は２回以上繰り返すことで抽出液を得ることをいう。したがって、本明細書において、“抽出操作”とは、アザミ属植物を溶媒に浸漬させること、溶媒を分離すること、残渣を溶媒で洗浄すること等を表す。また、本明細書において“抽出液”とは、アザミ属植物を溶媒に浸漬させることで得られた液体、アザミ属植物の溶媒への浸漬後に溶媒を分離し残渣を溶媒で洗浄することで得られた液体等を表す。

前述の“溶媒”には、例えば、水、熱水（例えば、５０℃以上）、アルコール類、ヘキサン、クロロホルム、エーテル類、エステル類、ケトン類が含まれる。アルコール類は、例えば、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等の低級アルコール、及び１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコールであり；エーテル類は、例えば、ジエチルエーテル、プロピルエーテル等であり；エステル類は、例えば、酢酸ブチル、酢酸エチル等であり；ケトン類は、例えば、アセトン、エチルメチルケトン等である。これらの溶媒の２又は３以上を組み合わせた混合溶媒を用いてもよい。また、例えば、ヘキサンを用いて抽出操作を行った後に、得られた残渣に対してクロロホルムを用いて抽出操作を行うというように、抽出操作において異なる溶媒を順番に組み合わせて用いてもよい。人体への影響を考慮すると、溶媒としては、水、熱水、エタノール等が好適に用いられる。

なお、本明細書において、アザミ属植物に対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“アザミ属植物抽出物”という場合があり；シマアザミに対して溶媒を用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“シマアザミ抽出物”という場合があり；アザミ属植物に対して溶媒としてヘキサンを用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“ヘキサン抽出物”という場合があり；アザミ属植物に対して溶媒としてクロロホルムを用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“クロロホルム抽出物”という場合があり；アザミ属植物に対して溶媒としてエタノールを用いて抽出操作を行うことで抽出液を得る工程により得られたものを“エタノール抽出物”という場合がある。

また、上記の本明細書による脂肪蓄積抑制剤は、前述の製造方法により得られるものであってもよい。すなわち、前述の“アザミ属植物抽出物”は、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制し、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させる効果を有するため、脂肪蓄積抑制剤として用いることができる。また、例えば、特定の溶媒による抽出物に対してさらに固相抽出等を行って得られた特定の画分を脂肪蓄積抑制剤として用いてもよく、この固相抽出して得られた特定の画分をさらにＨＰＬＣ等に供して得られた特定のフラクションを脂肪蓄積抑制剤として用いてもよい。

次に、本発明による医薬品及び飲食品について詳述する。

本発明による脂肪蓄積抑制剤は、医薬品に用いることができる。本発明による医薬品は、前述の脂肪蓄積抑制剤を有効成分として含有する。

本発明による医薬品の投与方法は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等、適宜選択され得る。この医薬品の剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。

また、本発明による医薬品には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。また、本発明による医薬品には、前述の脂肪蓄積抑制剤以外の他の活性成分（例えば、脂肪肝抑制剤）を適宜含有させることもできる。

本発明による医薬品の有効成分である脂肪蓄積抑制剤の投与量は、患者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができる。また、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。

本発明による医薬品は、有効成分として本発明による脂肪蓄積抑制剤を含有しているため、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制し、特に肝臓における脂質代謝を改善させ、ひいては、脂肪肝の抑制、皮下脂肪の減量、肥満抑制及び防止、肥満体質の改善等の作用を発揮する。特に、肝臓における脂肪蓄積抑制作用に優れるため、本発明は脂肪肝の予防剤又は治療剤を提供することができる。本発明者らは、この脂肪蓄積抑制効果の一つの機序が、脂肪分解促進作用によるものではなく、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現を低下させることによるものであることを見出し（実施例にて後述）、本発明を完成した。特に、近年、脂肪肝については、肝硬変や肝臓がん発症への関連性のみならず、糖尿病の発症リスクの上昇や動脈硬化の促進の可能性が示唆されているため、本発明による医薬品（脂肪肝の予防剤又は治療剤）によって、肝臓における脂肪蓄積を抑制し、脂肪肝を抑制し得ることは殊に重要である。

また、本発明による脂肪蓄積抑制剤は、飲食品に用いることができる。本発明による飲食品は、前述の脂肪蓄積抑制剤を含有する。

本発明による飲食品は、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、液体状等に調製することができる。また、飲食品中に含有させることが認められている賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。また、脂肪肝抑制等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品等に応用することができる。また、本発明による脂肪蓄積抑制剤は、飲食品と同様に、哺乳類等の飼料、ペットフード、ペット用サプリメント等に用いることもできる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
シマアザミ葉からシマアザミ抽出物を調製し、培養細胞実験を行った。

（シマアザミ抽出物の調製）
シマアザミの葉を水で洗った後、次亜塩素酸で殺菌した。その後、水切りを十分行い、予備凍結させた。その後、真空乾燥装置（株式会社マルイ）を用いてシマアザミの葉を凍結乾燥させた。凍結乾燥させた葉を粉砕機で粉砕し、ふるいにかけることで非粉末物を除去して、シマアザミの葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１ｇに１０ｍＬのヘキサンを加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬのヘキサンで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、ヘキサン抽出物とした。

先のヘキサンによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するヘキサンを除去した。ヘキサン除去後の残渣に１０ｍＬのクロロホルムを加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬのクロロホルムで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、クロロホルム抽出物とした。

先のクロロホルムによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するクロロホルムを除去した。クロロホルム除去後の残渣に１０ｍＬのエタノールを加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬのエタノールで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、エタノール抽出物とした。

先のエタノールによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するエタノールを除去した。エタノール除去後の残渣に１０ｍＬの蒸留水を加え、３７℃で２時間浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を１０ｍＬの蒸留水で２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、水抽出物とした。

以上の調製方法により得られたヘキサン抽出物、クロロホルム抽出物及びエタノール抽出物を減圧乾固し、水抽出物を凍結乾燥した。各抽出物をジメチルスルホキシドに溶解して、各々２５ｍｇ／ｍＬの溶解液を得た。

（マウス線維芽細胞（３Ｔ３―Ｌ１細胞）の培養）
１０％のウシ血清を加えたダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて、マウス線維芽細胞（３Ｔ３―Ｌ１細胞）を、５×１０^３細胞／ｍＬ／ウェルとなるように２４ウェルプレートに播種した。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で、１日おきに培地交換を行いながら、コンフルエントに達するまで培養した。コンフルエントに達した後、さらに２日間の培養を行い、その後、分化誘導を開始させた。

（３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導）
３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０ｎＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタソン（ＤＥＸ）及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭにて、２日間培養することで行った。分化誘導開始後２日目に、培地を１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭに交換し、その後２日目に同培地の交換を行い、その後４日目まで培養を行った。なお、前述の通り得られたシマアザミの各抽出物を、終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように、３Ｔ３―Ｌ１細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで培地に添加した。

（脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞のオイルレッドＯ染色及び細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度測定）
培養終了後の、脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞（以下、“培養脂肪細胞”という）内に形成される脂肪滴の数及び細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度を評価することによって、シマアザミ葉の各抽出物の脂質蓄積抑制効果を評価した。

培養脂肪細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、ホルマリンで固定した。固定した細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、その後、６０％イソプロパノールに１分間浸した。その後、６０％イソプロパノールに溶解したオイルレッドＯ（和光純薬工業株式会社）にて、１０分間、脂肪滴を染色した（オイルレッドＯを用いた実験手法については、食品機能研究法（林琳）ｐ１３３−１３６を参照した）。その後、細胞を、６０％イソプロパノールにて１回洗浄し、ＰＢＳにて２回洗浄して、光学顕微鏡下で細胞内の脂肪滴の形成を目視により評価した。

また、ヘキサン抽出物を添加して培養した後の培養脂肪細胞をＰＢＳにて洗浄して、０．１％ラウリル硫酸ナトリウムにて細胞を溶解し、細胞溶解液から脂質を抽出した。この抽出には、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒの方法（ＢｌｉｇｈＥＧａｎｄＤｙｅｒＷＪ，Ａｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｏｆｔｏｔａｌｌｉｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１９５９；３７（８）：９１１−９１７）を利用した。抽出した脂質を１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだイソプロパノールに溶解して、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度を測定した。このＴＧ濃度の値を、細胞溶解液のタンパク質濃度（ＱｕｂｉｔＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（インビトロジェン）を用いて測定）で補正して、細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度とした。なお、検定方法として、２群間の有意差を検出するためにスチューデントのｔ検定を用いた。

（結果）
オイルレッドＯ染色の結果を図１（ａ）に、細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度測定の結果を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）及び（ｂ）において、「ＮＤ」は分化誘導処理を行なっていない３Ｔ３−Ｌ１細胞（Ｎｏｎ−Ｄｉｆｆｅｎｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＮＤ）を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は分化誘導処理を行ってジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。シマアザミ葉のヘキサン抽出物を添加して培養した細胞では、クロロホルム抽出物、エタノール抽出物及び水抽出物のそれに比して、形成された脂肪滴の数が明らかに少ないことが示された（図１（ａ））。また、シマアザミ葉のヘキサン抽出物を添加して培養した細胞では、コントロールに比して有意に細胞内中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）濃度が低いことが示された（図１（ｂ））。

以上より、本実施例によるシマアザミ葉の抽出物は、培養脂肪細胞の脂質蓄積を抑制することが示された。

（脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響）
シマアザミ葉のヘキサン抽出物を用いて、培養脂肪細胞の脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表１）の発現に及ぼす影響について検討した。

３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導を、１０％ＦＢＳ、５０ｎＭＩＢＭＸ、１μＭＤＥＸ及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭにて、２日間培養することで行った。分化誘導開始後２日目に、培地を１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍＬインスリンを混合したＤＭＥＭに交換し、その後２日目に同培地の交換を行い、その後４日目まで培養を行った。なお、前述の通り得られたシマアザミの各抽出物を、終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように、３Ｔ３―Ｌ１細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで培地に添加した。

培養脂肪細胞をＰＢＳで洗浄して、８００μＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を加えて細胞溶解液を得た。細胞溶解液に２００μＬのクロロホルムを混合して室温にて５分間静置し、その後１２，０００×ｇ、１５分間の遠心分離により細胞溶解液を二層に分離した。回収した上層（水層）に等量の７０％エタノールを混合して、ＰｕｒｅＬｉｎｋＲＮＡＭｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＴｏｔａｌＲＮＡを精製した。ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２μｇのＴｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。

合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び目的の遺伝子発現を検出するプライマー（表１）を加えて、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて遺伝子発現解析を行った。内部標準であるハウスキーピング遺伝子（β―アクチン、ＡＣＴＢ）の発現量により各遺伝子発現データを補正して、シマアザミ各抽出物による脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表１）の変動を解析した。

（結果）
結果を図２に示す。図２において、「ＮＤ」及び「Ｃｏｎｔｒｏｌ」については図１と同様である。シマアザミ葉のヘキサン抽出物を添加して培養した細胞では、コントロールに比して有意に脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が低下していた。

以上より、本実施例によるシマアザミ抽出物は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させることにより、脂肪細胞内の脂肪蓄積を抑制させることが示唆された。

（実施例２）
シマアザミ葉の凍結乾燥粉末を用いて、動物実験を行った。

５７ＢＬ／６マウス（♂）を購入し、新しい環境に慣らすために１週間の予備飼育を行った。その後、マウスを６匹ずつの３群に分けて、各群のマウスに、高脂肪食（米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が１９７７年に発表したげっ歯類を用いた栄養研究のための標準精製飼料（ＡＩＮ−７６）の基本組成に１５％のコーン油を配合したもの）に、シマアザミ葉の凍結乾燥粉末（実施例１と同様）を０％、５％又は１０％配合した飼料（表２参照）を与えて、４週間飼育した。飼育期間中、各群マウスの摂取エネルギーが同等になるように食餌摂取量を調整した。なお、図３−６において、「Ｃｎｔｌ（＝ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、シマアザミ葉の凍結乾燥粉末が含まれていない飼料を与えた群（つまり、表２の「０％」の群）を表す。

飼育終了後、マウスの各組織と血液を採取し、各群のマウスの体重及び臓器重量（図３）、組織重量（図４）、血中パラメーター（図５）及び肝臓の各種パラメーター（図６）を測定した。検定方法としては、対照群と実験群の有意差を検出するために多重検定法であるダネットの方法を用いた。

マウスの各種パラメーターは、以下の市販のキットを用いて測定した。
・中性脂肪（図５）：トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）
・総コレステロール（図５）：コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）
・遊離脂肪酸（図５）：ＮＥＦＡＣ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）
・インスリン（図５）：マウスインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所）
・肝障害マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）（図６）：トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）

マウスの肝臓中性脂肪濃度及び肝臓総コレステロール濃度（図６）は、以下の通り測定した。飼育終了後のマウスから肝臓を摘出し、Ｆｏｌｃｈ氏らの方法（ＦｏｌｃｈＪ，ＬｅｅｓＭａｎｄＳｌｏａｎｅＳｔａｎｌｅｙＧＨ，Ａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｌｉｐｉｄｅｓｆｒｏｍａｎｉｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ；ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９５７；２２６（１）：４９７−５０９）を用いて肝臓の脂質を抽出した。抽出した肝臓の脂質を、１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだイソプロパノールに溶解し、脂質抽出液とした。この脂質抽出液中の中性脂肪濃度を、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ氏の方法（ＦｌｅｔｃｈｅｒＭＪ，Ａｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｓｅｒｕｍｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ；ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ１９６８；２２（３）：３９３−３９７）を用いて測定した。また、この脂質抽出液中の総コレステロール濃度を、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。

（結果）
図３に体重、肝臓重量、脾臓重量及び腎臓重量の測定結果を示す。体重、脾臓重量及び腎臓重量には変化が見られなかった一方で、肝臓重量は、飼料中のシマアザミ葉の含量が多くなるほど有意に低下していた。

図４に精巣周辺脂肪組織重量、腎臓周辺脂肪組織重量、腸間膜脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量の測定結果を示す。精巣周辺脂肪組織重量、腎臓周辺脂肪組織重量及び腸間膜脂肪組織重量には変化が見られなかった一方で、皮下脂肪組織重量は、飼料中のシマアザミ葉の含量が多くなるほど有意に低下していた。

図５に血中中性脂肪濃度、血中総コレステロール濃度、血中遊離脂肪酸濃度及び血中インスリン濃度の測定結果を示す。血中中性脂肪濃度、血中総コレステロール濃度及び血中インスリン濃度には変化が見られなかった一方で、血中遊離脂肪酸濃度は、飼料中のシマアザミ葉の含量が多くなるほど有意に低下していた。

図６に肝臓中性脂肪濃度、肝臓総コレステロール濃度及び肝障害の血中マーカー（ＡＳＴ及びＡＬＴ）の測定結果を示す。肝臓中性脂肪濃度及び肝臓総コレステロール濃度のみならず、肝障害の血中マーカー（ＡＳＴ及びＡＬＴ）についても、有意な低下がみられた。

（脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響）
シマアザミ葉の摂取が、高脂肪食摂取マウスの脂肪細胞及び肝臓における脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表３）の発現にどのような影響を及ぼすかについて検討した。

前述の飼育終了後のマウスから採取した脂肪組織０．１ｇ及び肝臓０．１ｇに、８００μＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を加え、ホモジナイザーにより組織を溶解した。組織溶解液に２００μＬのクロロホルムを混合して室温にて５分間静置し、その後、１２，０００×ｇ、１５分間の遠心分離により細胞溶解液を二層に分離した。回収した上層（水層）に等量の７０％エタノールを混合して、ＰｕｒｅＬｉｎｋＲＮＡＭｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＴｏｔａｌＲＮＡを精製した。ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２μｇのＴｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。

合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び目的の遺伝子発現を検出するプライマー（表３）を加えて、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて遺伝子発現解析を行った。肝臓の内部標準として１８ＳｒＲＮＡ量を用いて、及び脂肪組織の内部標準としてＡＣＴＢ発現量を用いて、各遺伝子発現データを補正して、シマアザミ摂取による各組織の脂肪分解促進関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子（表３）の発現を解析した。

（結果）
図７に皮下白色脂肪組織及び腎臓周辺白色脂肪組織での結果を、図８に肝臓での結果を示す。なお、図３−６と同様に、図７及び図８の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、シマアザミ葉の凍結乾燥粉末が含まれていない飼料を与えた群（つまり、表２の「０％」の群）を表す。シマアザミ葉を摂取した高脂肪食摂取マウスでは、皮下白色脂肪組織及び腎臓周辺白色脂肪組織の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現が用量依存的に低下しており（図７）、また、肝臓においても、ＦＡＳ発現が用量依存的に低下していた（図８）。

以上より、本実施例によるシマアザミ葉の凍結乾燥粉末を摂取すると、ＦＡＳの発現が低下することにより、脂肪細胞及び肝臓における脂肪蓄積を抑制することが示唆された。

（実施例３）
シマアザミ葉から得られたヘキサン抽出物及びクロロホルム抽出物の脂肪蓄積抑制効果について、詳細に検証した。

（ヘキサン抽出物の調製）
実施例１と同様にシマアザミの葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に１０倍量のヘキサンを加え、３７℃で２時間振盪浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を凍結乾燥粉末の１０倍量のヘキサンで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、ヘキサン抽出物とした（図９）。

（クロロホルム抽出物の調製）
先のヘキサンによる洗浄後の残渣を減圧下に置くことで、残存するヘキサンを除去した。ヘキサン除去後の残渣に凍結乾燥粉末の１０倍量のクロロホルムを加え、３７℃で２時間振盪浸漬させることで、抽出処理を行った。抽出後、減圧濾過により抽出液を分離し、残渣を凍結乾燥粉末の１０倍量のクロロホルムで２回洗浄した。この洗浄により生じた液を、先に得た抽出液と合わせ、クロロホルム抽出物とした（図９）。

（ヘキサン抽出物の脂肪蓄積抑制効果の検証）
以上の調製方法により得られたヘキサン抽出物を減圧乾固し、ヘキサンに溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのヘキサン抽出物溶解液を得た（図１０）。

前述のヘキサン抽出物溶解液について、プレセップ−Ｃシリカゲルカラム（和光純薬工業株式会社）を用いた固相抽出を行うことによって、各画分を得た。より具体的には、図１０に示すように、前述のヘキサン抽出物溶解液１ｍＬをプレセップ−Ｃシリカゲルカラムにアプライし、得られた溶出液を“ＦＴ１画分”とした。次いで、ヘキサン５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＦＴ２画分”とした。次いで、ヘキサン：クロロホルム（５０：５０）５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＨＣ（５０／５０）画分”とした。次いで、クロロホルム５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＨＣ（０／１００）画分”とした。次いで、クロロホルム：メタノール（５０：５０）５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（５０／５０）画分”とした。次いで、メタノール５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（０／１００）画分”とした。各画分を、乾固後、１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した。

各画分について、３Ｔ３―Ｌ１細胞の中性脂肪蓄積に与える影響について評価を行った。３Ｔ３―Ｌ１細胞の培養、３Ｔ３―Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導については、実施例１と同様に行った。なお、３Ｔ３―Ｌ１細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで、前述の１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した各画分を０．５％（ｖ／ｖ）となるように加えた培地を用いた。各画分を添加して培養した後の培養脂肪細胞を溶解し、細胞溶解液から脂質を抽出して、細胞内中性脂肪濃度を測定した。培養脂肪細胞の溶解、脂質の抽出、細胞内中性脂肪濃度の測定については、実施例１と同様に行った。

（結果）
細胞内中性脂肪濃度測定の結果を図１１に示す。図１１において、「ＮＣ」は分化誘導処理を行なっていない３Ｔ３−Ｌ１細胞を示し、「ＰＣ」は分化誘導処理を行ってジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。ＨＣ（５０／５０）画分を添加して培養した細胞では、「ＰＣ」に比して有意に細胞内中性脂肪濃度が低いことが示された（図１１）。

以上より、本実施例によるシマアザミ葉のヘキサン抽出物は、脂質蓄積を抑制することが示された。特に、ヘキサン抽出物中のＨＣ（５０／５０）画分は、脂質蓄積抑制効果に優れることが示された。

（クロロホルム抽出物の脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響の検証）
上記の調製方法により得られたクロロホルム抽出物を減圧乾固し、クロロホルムに溶解して、１００ｍｇ／ｍＬのクロロホルム抽出物溶解液を得た（図１２）。

前述のクロロホルム抽出物溶解液について、プレセップ−Ｃシリカゲルカラム（和光純薬工業株式会社）を用いた固相抽出を行うことによって、各画分を得た。より具体的には、図１２に示すように、前述のヘキサン抽出物溶解液１ｍＬをプレセップ−Ｃシリカゲルカラムにアプライして得られた溶出液と、次いでクロロホルム５ｍＬを通液して得られた溶出液と、を合わせて“ＣＭ（１００／０）画分”とした。次いで、クロロホルム：メタノール（５０：５０）５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（５０／５０）画分”とした。次いで、メタノール５ｍＬを通液し、得られた溶出液を“ＣＭ（０／１００）画分”とした。各画分については、乾固後、１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した。

各画分について、ヒト肝臓がん細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いて脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）の発現に及ぼす影響について評価を行った。３Ｔ３―Ｌ１細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞を用いたことを除いて、細胞の培養、脂肪細胞への分化誘導については、実施例１と同様に行った。なお、ＨｅｐＧ２細胞の分化誘導開始時から実験終了時まで、前述の１ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した各画分を０．５％（ｖ／ｖ）となるように加えた培地を用いた。また、細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡの精製、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲの方法については、実施例１と同様に行ったが、ＦＡＳ発現を検出するプライマーについては、以下のものを用いた。
ＦＡＳ−ｓｅｎｓｅ：ＴＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＧＴ（配列番号３３）
ＦＡＳ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ：ＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号３４）
ＡＣＴＢ−ｓｅｎｓｅ：ＴＣＡＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴ（配列番号３５）
ＡＣＴＢ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ：ＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号３６）

内部標準であるハウスキーピング遺伝子（β―アクチン、ＡＣＴＢ）の発現量により各遺伝子発現データを補正して、各画分で処理した細胞について、脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）のｍＲＮＡレベルを評価した。

結果を図１３に示す。図１３において、「未処理」はジメチルスルホキシドを加えていない細胞を示し、「溶媒」はジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。クロロホルム抽出物及びＣＭ（５０／５０）画分を添加して培養した細胞では、「未処理」及び「溶媒」に比して有意に脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が低下していた。

脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現減少がみられたＣＭ（５０／５０）画分についてさらに詳細に調べるために、ＣＭ（５０／５０）画分をＨＰＬＣ（後述）に供し、フラクション１〜１０（Ｆｒ．０１〜１０）に分画した（図１４）。

ＨＰＬＣの手法について具体的に説明する。ＨＰＬＣ機器として株式会社島津製作所製の機器を用い、検出器として蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、株式会社島津製作所）を用いた。使用したカラムはシリカゲルカラムＤｅｖｅｌｏｓｉｌｐａｃｋｅｄｃｏｌｕｍｎ（６０−３８．０／２５０（ＮＭ）、野村化学）であり、クロロホルム及びメタノールを用いたグラジエント分析（流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）を行った。グラジエント条件は以下の通りである。
・０：００Ｓｔａｒｔ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１００：０）
・６０：００（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝７５：１５）
・７０：００（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：５０）
・９０：００ｓｔｏｐ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：０）

ＨＰＬＣにより得られたフラクション１〜１０（Ｆｒ．０１〜１０）について、前述同様にＨｅｐＧ２を用いて脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）の発現に及ぼす影響について評価を行った。

結果を図１５に示す。図１５において、「溶媒」はジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示す。フラクション４（Ｆｒ．０４）を添加して培養した細胞では、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が最も低下していた。

脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現が最も減少したフラクション４（Ｆｒ．０４）についてさらに詳細に調べるために、前述同様にＨｅｐＧ２を用いて、脂肪合成関連遺伝子（ＦＡＳ）のｍＲＮＡレベルを評価した。

結果を図１６に示す。図１６において、「溶媒」はジメチルスルホキシドを添加して培養した細胞を示し、「ＣＭ（５０／５０）画分」は、前述のＣＭ（５０／５０）画分を添加して培養した細胞を示す。「Ｆｒ．０４」では「溶媒」に比して有意に脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現が低下しており、「Ｆｒ．０４」での脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現減少の度合いは、「ＣＭ（５０／５０）画分」でのそれよりも強かった。

以上より、本実施例によるシマアザミ葉のクロロホルム抽出物は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させることが示唆された。特に、クロロホルム抽出物中のＣＭ（５０／５０）画分、さらにはＣＭ（５０／５０）画分中のフラクション４（Ｆｒ．０４）は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現減少効果に優れることが示された。

以上より、本実施例によるシマアザミ抽出物は、脂質蓄積を抑制し、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を低下させる効果を有することが示された。

なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、２０１３年８月１３日に出願された日本国特許出願２０１３−１６８４０４号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１３−１６８４０４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

Claims

シマアザミを有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤。
シマアザミを有効成分として含有する脂肪肝の予防剤又は治療剤。
シマアザミを有効成分として含有する脂肪酸合成酵素抑制剤。