KR20210102543A - 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금은화, 위령선 및 천마 복합 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물은 마우스 모델에서 운동능력향상 및 신경세포주의 보호효과를 나타내므로, 신경세포의 사멸에 의해 발생하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease}
본 발명은 금은화, 위령선 및 천마 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환은 일반적으로 60세 이상의 노령 인구에서 발병하며, 최근 전세계적으로 노령화가 급속히 진행되고 있어, 신경퇴행성 질환에 대한 중요성이 점차 증가하고 있다. 그 중 파킨슨병은 중간 뇌에 존재하는 흑색질(Substantia nigra)이라는 세포가 소실되어 나타나는 만성 진행성 중추신경계 질환이다. 흑색질 세포는 도파민(Dopamine)을 생산하는데, 도파민은 두뇌의 중요한 화학 전달 물질로 뇌신경 세포의 흥분 전달에 중요한 역할을 한다. 따라서 도파민이 부족하게 되면 자신의 움직임을 조절하는 능력을 잃어버리게 된다. 이와 같은 파킨슨병의 증상은 나이가 들면서 나타나는 노화 현상과 구분하기 어려워 진단을 내리기가 쉽지가 않다. 그러나 이러한 노화 현상과 비슷해 보이는 증상들 외에도 특징적인 운동장애 증상이 나타난다. 파킨슨병을 가진 개인의 증상 완화에 가장 많이 사용되는 약제는 레보도파(Levodopa: L-Dopa)이다. 레보도파는 뇌에 흡수되어 도파민으로 변환되고, 대부분의 환자들에게 증상이 개선되어 정상적인 삶을 누릴 수 있도록 해준다. 그러나, 일부의 환자에서는 레보도파 섭취시 운동이상증과 같은 부작용이 보고된 바 있다.
현재까지 천연물질에서 추출된 생약성분을 포함하는 파킨슨병 치료제는 시판된 바 없으며, 부작용이 없으면서도 증상의 치료 및 개선 효과가 우수한 의약품 및 기능성 식품에 대한 미충족 수요가 점점 더 증가하고 있는 추세이다.
대한민국 등록특허 제10-1704918호
본 발명자들은 신경퇴행성 질환을 예방하고 치료 또는 개선할 수 있는 천연물질 유래의 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하여, 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약추출물을 제조하고 이의 신경세포 보호효과를 검증하였다. 그 결과 상기 복합 생약추출물이 신경퇴행성 질환의 마우스 동물모델에서 운동능력을 향상시키고, 신경세포주를 보호하는 효과가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 금은화, 위령선 및 천마 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 금은화, 위령선 및 천마 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "금은화(Lonicerae Flos)"는 인동과(Caprifoliaceae) 인동덩굴(Lonicera japonica Thunberg)의 꽃봉오리 또는 막 피기 시작한 꽃을 의미한다.
본 발명에서, 상기 "위령선(Clematidis Radix)"은 미나리아재비과(Ranunculaceae)의 으아리(Clematis manshurica Ruprecht) 및 대체가능한 동속 근연식물인 가는잎사위질빵(Clematis hexapetala Pallas), 위령선(Clematis chinensis Osbeck), 할미밀망(Clematis trichotoma Nakai), 클레마티스 아르만디(Clematis armandii)의 뿌리 및 뿌리줄기를 의미한다.
본 발명에서, 상기 "천마(Gastrodiae Rhizoma)"는 난초과(Orchidaceae)의 천마(Gastrodia elata BLUME)의 덩이줄기를 쪄서 건조한 것을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 상기 생약의 추출물은 구입하거나 또는 생약으로부터 직접 추출하여 얻을 수 있다. 상기 추출은 각각의 생약을 적절한 크기로 절단 또는 분쇄한 후 수행될 수 있다.
본 발명에서, "신경퇴행성 질환"은 신경세포의 기능 감소 또는 신경세포 사멸에 의해 나타나는 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 및 자율신경의 기능 이상을 의미하며, '퇴행성 뇌질환'과 동일한 의미이다. 상기 신경퇴행성 질환은 임상적 특징으로 분류할 수 있다. 주요 증상으로 진행성 인지기능 장애를 나타내는 질환에는, 알츠하이머병, 치매(전두측두치매, 루이치매), 피질기저퇴행증(corticobasal degeneration) 등이 있고, 진행성 운동실조를 나타내는 질환에는 파킨슨병, 다계통위축증(multiple system atrophy), 헌팅턴병, 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy) 등이 있다. 근력저하 및 근위축 증상을 나타내는 신경퇴행성 질환으로는 루게릭병, 원발성측삭경화증, 척수근위축병 등이 있다.
본 명세서에서 용어 "신경세포 사멸"은 다양한 원인(예: 대사성 원인, 독성 원인, 신경 독성 원인 및 화학적 원인, 등)에 의해 초래되는 신경 세포 또는 신경 조직의 손상 내지 사멸을 의미한다.
상술한 본 발명의 조성물의 예방, 개선, 또는 치료의 대상이 되는 질환인 "신경퇴행성 질환"은 신경세포의 사멸을 동반한다. 이러한 신경 세포의 사멸은 신경 세포의 괴사(necrosis) 및 아폽토시스(apoptosis)를 포함한다. 본 발명의 조성물에 의한 신경 세포의 사멸 억제는 활성산소종의 발생 억제, 또는 미토콘드리아의 기능 보호를 통하여 달성된다.
본 발명의 조성물은 운동기능의 향상, 두뇌 또는 인지 기능을 증진하는 데 매우 효과적이다. 바람직하게는, 상기 두뇌 또는 인지 기능은 학습 능력, 기억 능력 또는 집중력이다. 또한, 본 발명의 조성물은 신경퇴행성 질환에 수반되는 운동기능, 두뇌 또는 인지 기능의 악화를 개선하는 데 매우 유효하다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 복합 생약 추출물은 (i) 상기 3종 생약의 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단일 추출공정을 통해 제조되거나, (ii) 각 단일 성분의 추출물을 각각 제조한 후 각 성분의 추출물을 혼합하는 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 상기 추출물을 각 생약으로부터 직접 추출하여 얻는 경우에는, 극성 용매 또는 비극성 용매와 같은 다양한 추출용매가 이용될 수 있다.
극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) C1 내지 C6의 저급 알코올(구체적으로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethylsulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 추출물은 극성 유기 용매 추출물이다. 본 명세서 상의 용어 '극성 유기 용매'는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 아세트산, 또는 상기 극성 유기 용매들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 극성 유기 용매는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세트산 또는 상술한 성분들 중에서 선택되는 둘 이상의 성분들의 혼합물이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 유기용매의 농도는 1 내지 100%(v/v), 구체적으로는 10 내지 100%(v/v), 20 내지 100%(v/v), 30 내지 100%(v/v)), 40 내지 100%(v/v), 50 내지 100%(v/v), 60 내지 100%(v/v), 70 내지 100%(v/v),
10 내지 90%(v/v), 20 내지 90%(v/v), 30 내지 90%(v/v)), 40 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 60 내지 90%(v/v), 70 내지 90%(v/v),
10 내지 80%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 30 내지 80%(v/v)), 40 내지 80%(v/v), 50 내지 80%(v/v), 60 내지 80%(v/v), 70 내지 80%(v/v)일 수 있고, 보다 구체적으로는 25%(v/v), 30%(v/v), 40%(v/v), 50%(v/v), 60%(v/v), 70%(v/v), 75%(v/v), 80%(v/v), 85%(v/v), 90%(v/v)또는 95%(v/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 추출물을 제조하기 위해, 추출에 사용되는 용매의 양은 사용되는 생약 성분들의 양에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 추출물 제조에 이용되는 생약의 중량의 1배 내지 20배의 부피, 더욱 구체적으로 2배 내지 20배의 부피, 5배 내지 15배의 부피, 7배 내지 12배 부피일 수 있으나, 또는 10배의 부피일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추출물의 추출온도는 특별히 제한되지 아니하고, 예를 들어 0℃℃내지 120℃일 수 있으며, 구체적으로는 15℃내지 95℃, 15℃내지 90℃, 15℃내지 80℃, 15℃내지 70℃, 15℃내지 60℃, 15℃내지 50℃, 15℃내지 45℃, 15℃내지 40℃, 15℃내지 35℃, 15℃내지 30℃, 15℃내지 25℃, 15℃내지 20℃, 20℃내지 95℃, 20℃내지 90℃, 20℃내지 80℃, 20℃내지 70℃, 20℃내지 60℃, 20℃내지 50℃, 20℃내지 45℃, 20℃내지 40℃, 20℃내지 35℃, 20℃내지 30℃, 또는 20℃내지 25℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추출물의 추출시간은 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 1시간 내지 10일, 1시간 내지 120시간일수 있으며, 구체적으로는 1시간 내지 120시간, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 3시간 내지 120시간, 3시간 내지 96시간, 3시간 내지 72시간, 6시간 내지 120시간, 6시간 내지 96시간, 6시간 내지 72시간, 12시간 내지 120시간, 12시간 내지 96시간, 12시간 내지 72시간, 24시간 내지 120시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 72시간, 36시간 내지 120시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 72시간, 48시간 내지 120시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 72시간, 60시간 내지 120시간, 60시간 내지 96시간, 60시간 내지 72시간, 72시간 내지 120시간, 72시간 내지 96시간, 72시간 내지 84시간일 수 있고, 보다 구체적으로는 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 또는 84시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 이용되는 추출물은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 또는 당업계에 알려진 통상적인 추출방법을 통해 추출될 수 있다. 본 발명의 구체예에서 본 발명의 추출물은 열수 추출 또는 저급 알코올을 이용한 냉침 추출 방법을 통해 제조될 수 있으며, 1회 내지 10회 반복 추출할 수 있다.
본 발명에서 금은화, 위령선 및 천마의 추출물은 용매에 의해 추출된 조(crude)추출물 형태를 이용할 수 있으며, 고순도로 정제하여 사용할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 금은화, 위령선 및 천마의 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명의 금은화, 위령선 및 천마 복합 생약 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 유효성분인 금은화, 위령선 및 천마의 배합 중량비(w/w)는 1-10:1-10:1-10, 1-5:1-10:1-10, 1-3:1-10:1-10, 1:1-10:1-10, 1-5:1-5:1-5, 1-3:1-5:1-5, 1:1-5:1-5, 1-3:1-3:1-3, 1-2:1-3:1-3, 1:1-3:1-3, 1:2-3:2-3 일 수 있고, 가장 구체적으로는 1:3:3 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 '배합 중량비(w/w)'는 추출 공정을 거치기 전 각각의 성분들의 중량비를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 복합 추출물이 금은화, 위령선 및 천마의 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단일 추출공정을 통해 제조되는 경우, 상기 혼합물에 포함된 각 생약의 중량비를 나타낸다. 또한, 본 발명의 복합 추출물이 단일 성분의 생약추출물을 각각 제조한 후 각 성분의 추출물을 혼합하는 방식으로 제조되는 경우, 다음 계산식에 의해 계산되는 '단일 성분 기준 중량'들 간의 중량비를 나타낸다:
[계산식]
단일 성분 기준 중량 = 단일 추출물 제조에 이용된 단일 성분의 중량 Х (최종 복합 추출물 제조를 위해 사용된 단일 추출물의 중량/제조한 단일 추출물의 중량).
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 유효성분인 금은화, 위령선 및 천마의 배합중량비율(중량%)은 금은화 5-30 중량%, 위령선 10-90중량%, 및 천마 10-90 중량%일 수 있고, 보다 구체적으로는 금은화 10-20 중량%, 위령선 40-80중량%, 및 천마 40-80중량%; 금은화 10-25중량%, 위령선 30-75중량%, 및 천마 30-75중량%; 금은화 10-20 중량%, 위령선 40-70 중량%, 및 천마 40-70 중량%; 또는 금은화 10-20 중량%, 위령선 30-60 중량%, 및 천마 30-60 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 유효성분인 금은화, 위령선 및 천마의 배합중량비율(중량%)은 금은화 5-25 중량%, 위령선 30-60중량%, 및 천마 30-60 중량%일 수 있고, 보다 구체적으로는 금은화 10-20 중량%, 위령선 35-55중량%, 및 천마 35-55중량%; 금은화 10-25중량%, 위령선 35-50중량%, 및 천마 35-50중량%; 금은화 10-20 중량%, 위령선 35-50 중량%, 및 천마 35-50 중량%; 또는 금은화 10-20 중량%, 위령선 35-45 중량%, 및 천마 35-45 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어 '예방'이란 본 발명에 따른 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 신경퇴행성 질환의 발병을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 '치료'란 본 발명에 따른 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 신경퇴행성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 복합 추출물을 포함한다. 상기 '약제학적 유효량'은 상술한 복합 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미하며, 본 발명의 목적을 달성하는 한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remignton's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 mg/kg 범위 내이다. 또한 인체 내 투여량은 동물실험을 근거로 환산할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 로테논으로 유도된 운동능력이 저하된 마우스 모델에서 운동능력의 향상 효과를 나타낸다.
또한 본 발명의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium)에 의한 신경세포독성, 미토콘드리아 특이적 활성산소종의 생성, 미토콘드리아의 기능 손실, 신경세포 사멸(caspase3/7 활성화), 및 ATP의 생성 능력 손실을 억제 또는 감소시킨다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '개선'이란 본 발명에 따른 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 신경퇴행성 질환의 정도를 감소시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 경우, 상술한 본 발명의 일 양태인 약제학적 조성물에 포함된 복합 생약 추출물을 유효성분으로 그대로 이용이 가능하다. 따라서 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적, 또는 예방적 유효량을 상기 대상 질환을 겪거나, 겪을 가능성이 있는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
상기 조성물의 "치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체(개체)"는 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 및 붉은털 원숭이 등을 포함하는 포유류이다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 상기 신경퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료방법은, 본 발명의 일 양태인 약제학적 조성물, 또는 식품조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 복합 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
(c) 본 발명의 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물은 마우스 모델에서 운동능력향상 및 신경세포주의 보호효과를 나타내므로, 신경세포의 사멸에 의해 발생하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 파킨슨병 동물 모델에서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 운동능력 개선 효능을 나타낸 도이다.
도 2는 MPP+가 처리된 도파민성 신경세포주에서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 세포독성 감소 효능을 나타낸 도이다.
도 3은 MPP+가 처리된 도파민성 신경세포주에서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 미토콘드리아 특이적 활성산소종의 생성을 억제하는 효능을 나타낸 도이다.
도 4는 MPP+가 처리된 도파민성 신경세포주에서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 미토콘드리아 기능 손상 개선 효능을 나타낸 도이다.
도 5는 MPP+가 처리된 도파민성 신경세포주에서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 세포사멸 감소 효능을 나타낸 도이다.
도 6은 MPP+가 처리된 도파민성 신경세포주에서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 ATP 생성 손상 개선 효능을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
제조예 : 복합 생약 추출물 제조
세척 및 건조된 금은화(Lonicerae Flos), 위령선(Clematidis Radix), 천마(Gastrodiae Rhizoma) 생약을 1:3:3의 중량비로 총 70 g이 되도록 혼합한 뒤 10배의 70%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 72시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 그 후, 상기 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 복합 생약 추출물(혼합 추출물)을 수득하였다. 수율은 13-14% 였다.
실시예 1: Rotenone-유도 파킨슨병 동물모델에 대한 복합 생약 추출물의 운동 능력 개선 효능
Rotenone은 살충제로 사용되는 물질로서 미토콘드리아의 전자전달계를 저해하는 것으로 알려져 있다. Rotenone은 미토콘드리아의 활성을 억제시키고, 이로 인해 뇌세포를 사멸시킴으로써 투여된 동물의 운동 기능을 저하시켜 파킨슨병과 유사한 증상을 일으킨다. 본 발명자들은 본 발명의 복합 생약 추출물의 뇌세포 사멸 감소 및 운동 능력의 향상 효과를 검증하기 위하여 Rotenone으로 유도된 파킨슨병 동물 모델을 이용하여 운동 기능성 확인 시험을 수행하였다.
실험동물로는 20~22 g의 무게를 갖는 5주령 수컷 C57BL/6 마우스(Orient Bio Inc., Republic of Korea)를 이용하였다. 구입한 마우스들을 NIH (NIH publication No.85-23, revised 1985)의 가이드라인을 따라 12시간의 낮, 12시간의 밤의 사이클을 갖는 23 ± 1℃의 실내 온도에서 유지하였다. 순치된 마우스들을 무작위적으로 아래와 같이 5개의 그룹으로 나누어 생체 내 실험을 수행하였다.
(1) 정상군 (n=10)
(2) Rotenone 처리군 (음성대조군; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (n=10; 복강내 1 mg/kg/일 농도로 Rotenone 주사)
(3) 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 (1:3:3 비율) 1, 3, 10, 30, 100 mg/kg (n=10; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(4) L-DOPA 25 mg/kg (양성대조군; Sigma-Aldrich, USA) (n=10; L-DOPA 복강내 주사, 복강내 Rotenone 주사)
(5) Rasagiline 0.05 mg/kg (양성대조군; Sigma-Aldrich, USA) (n=10; Rasagiline 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
3일간의 하우징(housing)후, 28일 동안 생쥐에게 농도별 추출물을 경구투여하였다. 양성대조군인 L-DOPA 및 Rasagiline의 경우에도 28일 동안 각각 복강내 투여(i.p.) 및 경구 투여를 진행하였다. 정상군을 제외한 그룹에는 식염수에 녹인 1 mg/kg/일 Rotenone를 추출물 투여 시작시점 7일 후부터 21일 동안 복강내 투여(i.p.)하였다.
운동 기능성을 확인하기 위하여 Rotarod test를 수행하였다. Rotarod test는 돌아가는 원통 위에서 달리는 시간을 측정하는 검사로서, ROTA-ROD TREADMILL DJ345 (㈜대종기기산업, 대한민국)을 사용하였다. 본 실험을 진행하기에 앞서, 마우스들이 해당 기구에 익숙해지도록 2일 및 1일 전에 5, 15 rpm 속도로 돌아가는 원통 위에서 5분간 달리도록 3회 트레이닝을 진행하였다.
마우스가 20 rpm으로 돌아가는 원통 위에서 달리다가 바닥으로 떨어지는 시간을 측정하였으며, 측정시간은 기기에 부착된 자동타이머를 이용하였고, 최대 측정 시간은 300초로 고정하였다. 그 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었다.
실험군 운동측정시간 (초) 정상군 대비 운동능력 (%)
정상군 279 -
Rotenone 유도군 (음성대조군) 132 47.3
복합 생약 추출물 1 mg/kg 211 75.8
복합 생약 추출물 3 mg/kg 200 71.8
복합 생약 추출물 10 mg/kg 253 90.7
복합 생약 추출물 30 mg/kg 288 103.0
복합 생약 추출물 100 mg/kg 274 98.0
L-DOPA 25 mg/kg (양성대조군) 267 95.7
Rasagiline 0.05 mg/kg (양성대조군) 247 88.5
C57BL/6 마우스에 Rotenone만을 주입한 음성대조군의 경우, 행동 능력이 Rotenone을 투여하지 않은 정상군 대비 47.3% 밖에 미치지 못하였다(52.7% 감소). 또한, 상기 제조예에서 제조한 복합 생약 추출물을 1, 3, 10, 30, 100 mg/kg 농도로 투여한 군에서는 행동 능력이 각각 정상군 대비 75.8%, 71.8%, 90.7%, 103.0%, 98.0% 수준으로 향상되었다. 따라서, 본 발명의 복합 생약 추출물의 Rotenone 처리에 따른 운동 능력 감소에 대한 억제효과를 확인하였다. L-DOPA 25 mg/kg을 투여한 양성대조군에서 나타난 운동 능력 향상 정도는 정상군과 유사하였고, 또한 Rasagiline 0.05 mg/kg을 투여한 양성대조군에서 나타난 운동 능력 향상 정도는 정상군과 유사하였다. 복합 생약 추출물 30, 100 mg/kg를 투여한 군은 정상군과 유사하였으며, L-DOPA, Rasagiline을 투여한 양성대조군과 운동 능력의 향상 정도가 유사하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 복합 생약 추출물은 파킨슨병 모델의 운동능력을 향상시키는 바, 신경퇴행성 질환 중 하나인 파킨슨 병의 치료제로 개발될 수 있음을 보여준다.
실시예 2: 도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 세포 독성 보호 효능
본 실시예에서는 본 발명의 복합 생약 추출물의 도파민성 신경세포주에서의 세포 보호 활성을 평가하였다. 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물이 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium)에 의해 유도한 신경세포 손상을 보호하는 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해, SH-SY5Y 세포주를 이용하여 MTT assay를 진행하였다.
구체적으로, 인간 신경아세포종 SH-SY5Y cell을 10％ 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS, GibcoTM USA) 및 항생제 (1% Penicillin, Streptomycin [P/S], Gibco-BRL, USA)가 함유된 RPMI 1640 medium (Gibco??, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기는 37℃로 온도를 유지했고, 95％ 공기 및 5％ CO2 대기 조건에서 세포를 배양하였다. 96-웰 플레이트에 1X 농도조건으로 PDL (Poly-D-lysine, Sigma-Aldrich, USA)을 코팅한 뒤, PBS로 세척 및 건조한 후 세포를 배양하였다. 세포는 5x104 cell/well의 개수로 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하여 24시간 동안 추가적으로 배양하여 세포를 분화시켰다.
SH-SY5Y 세포주가 배양되어 있는 96-웰 플레이트에 제조예에서 제조한 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 3, 10, 30 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리한 후, 2 mM의 MPP+을 처리하였다. MPP+ 처리 48시간 후 96-웰 플레이트에 0.5 mg/ml 농도로 MTT 용액을 배지에 희석하여 웰당 100 μl씩 첨가하였다. 37℃배양기에서 30분 동안 반응시키고 590 nm 파장 값에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 2 및 표 2에 나타내었다.
실험군 세포생존률 (%)
정상군 100.0
MPP+ 유도군 (음성대조군) 35.8
복합 생약 추출물 1 μg/ml 32.5
복합 생약 추출물 3 μg/ml 34.7
복합 생약 추출물 10 μg/ml 46.1
복합 생약 추출물 30 μg/ml 81.2
MPP+를 처리한 결과, 음성대조군(MPP+만 처리한 군)에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 세포 생존률이 35.8% 수준으로, 세포 사멸이 높게 유발됨을 확인하였다. 복합 생약 추출물을 1, 3, 10, 30 μg/ml 농도로 처리하였을 때에는 10, 30 μg/ml 농도에서 MPP+에 의한 세포 사멸이 농도의존적으로 억제되었다(정상군 대비 46.1%, 81.2% 수준의 세포 생존률 확인). 따라서, 상기 결과로부터, 본 발명의 복합 생약 추출물은 도파민성 신경세포주에서 세포독성에 대한 보호 활성이 매우 우수함을 확인하였다.
실시예 3: 복합 생약 추출물의 도파민성 신경세포주에서 MPP+에 의해 유도된 미토콘드리아 특이 활성산소종의 생성 감소 효능
본 실시예에서는 MitoSoxTM indicator (Thermo Scientific, USA)를 이용하여, 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y 세포에 신경독소 물질인 MPP+을 처리하였을 경우, 미토콘드리아 특이 활성산소종(ROS) 생성에 대한 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 효과를 확인하였다. MitoSoxTM indicator를 이용하면 미토콘드리아 특이 활성산소종에 의해 미토콘드리아 기질 내에서 활성산소종에 의한 산화물이 핵산과 서로 결합하면 붉은색 형광을 나타낸다. 이를 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 분화시킨 SH-SY5Y 세포에서의 미토콘드리아 특이 활성산소종 수준을 측정하였다.
구체적으로, SH-SY5Y 세포에 상기 제조예에서 제조한 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 3, 10, 30 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리한 후 2 mM의 MPP+을 처리하였다. MPP+ 처리 48시간 후 96-웰 플레이트에 MitoSox 시약을 5 μM 농도로 10분간 처리하였다. PBS로 1회 세척한 후 510, 580 nm 파장영역에서 형광을 측정하였다. 그 결과를 도 3 및 표 3에 나타내었다.
실험군 활성산소종 생성량 (%)
정상군 100.0
MPP+ 유도군 (음성대조군) 131.2
복합 생약 추출물 1 μg/ml 110.8
복합 생약 추출물 3 μg/ml 107.4
복합 생약 추출물 10 μg/ml 102.1
복합 생약 추출물 30 μg/ml 97.3
MPP+를 처리한 결과, MPP+만을 처리한 음성대조군(MPP)에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 미토콘드리아 특이 활성산소종이 약 31% 증가하였다. 복합 생약 추출물을 농도별로 처리하였을 때 음성대조군(MPP) 대비 활성산소종 생성이 감소하였고, 특히 10, 30 μg/ml 농도 처리군의 경우 MPP+ 무처리군(정상군; NC)과 유사한 수준으로 활성산소종이 감소되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 복합 생약 추출물은 신경세포주에서 미토콘드리아 특이 활성산소종의 생성을 억제하는 능력이 우수함을 확인하였다.
실시예 4: 도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 미토콘드리아 기능 손상 개선 효능
본 실시예에서는 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y 신경세포에 신경독소 물질인 MPP+을 처리하였을 경우 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물이 미토콘드리아의 기능을 보호하는지 분석하였다. 정상 미토콘드리아의 세포 내로 흡수되어 형광을 발현하는 TMRE (Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate, Sigma-Aldrich, 87917)를 이용하여 미토콘드리아 막전위를 측정하여, 미토콘드리아의 기능 변화를 분석하였다.
상기 실시예 2와 같이 분화시킨 SH-SY5Y 세포에 상기 제조예에서 제조한 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 10, 30 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리한 후 2 mM MPP+를 48시간 동안 처리하였다. 그 후, TMRE를 0.5 μM의 농도로 30분간 처리해 주었다. PBS로 1회 세척한 후 각 well에 100 μl 씩 PBS를 첨가하였다. 549, 575 nm 파장영역에서 형광을 측정하여 그 결과를 도 4 및 표 4에 나타내었다.
실험군 (n=10) TMRE (%)
정상군 100.0
MPP+ 유도군 (음성대조군) 89.5
복합 생약 추출물 10 μg/ml 101.2
복합 생약 추출물 30 μg/ml 103.1
MPP+를 처리한 결과, MPP+만 처리한 음성대조군(MPP)에서는 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 미토콘드리아 기능 손실이 확인되었다. 반면 복합 생약 추출물을 처리한 군에서는, MPP+ 무처리군(정상군; NC)과 유사한 수준으로 미토콘드리아 기능 손실이 억제되어 본 발명의 복합 생약 추출물은 미토콘드리아 기능 손실 억제효력이 매우 우수함을 확인하였다.
실시예 5: 도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 세포사멸 감소 효능
본 실시예에서는 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y 세포에 신경독소 물질인 MPP+을 처리하였을 경우 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 세포 내 아폽토시스(apoptosis) 감소능 효과를 분석하였다.
Caspase는 시스테인 프로테아제의 한 종류로, 세포자살이라는 프로그램된 아폽토시스에 필수적인 단백질이다. Caspase에 의해 활성화된 아폽토시스는 세포자살을 유도하여 관련된 세포의 사멸을 유도한다. 파킨슨병에서도 뇌세포의 아폽토시스는 질환을 악화시킨다. DEVD-루시페린이 함유되어 있는 Caspase-GloTM 시약과 caspase-3/7가 반응하면 DEVD 서열이 떨어져나오면서 아미노루시페린(aminoluciferin)이 루시페라아제 및 ATP와 반응하여 빛을 발산한다.
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 분화시킨 SH-SY5Y 세포에 상기 제조예에서 제조한 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 3, 10, 30 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리하고 2 mM MPP+를 48시간 동안 처리하였다. 그 후, Caspase-GloTM buffer와 DEVD-루시페린 기질 (Promega, USA)을 혼합하여 각 well당 50 μl를 첨가하고 빛이 없는 조건에서 30분 동안 상온 처리해 주었다. 그 후, 490, 570 nm 파장영역에서 값을 측정하고, 파장 보정을 위하여 Hoechst 33342 (ThermoFisher, USA)를 10 mg/ml의 농도로 3차 증류수에 녹인 후 1:2000 비율로 추가하여 350, 461nm 파장영역에서 값을 측정하였다. 그 결과를 도 5 및 표 5에 나타내었다.
실험군 Cleaved caspase3/7 (%) 유도군 대비 억제수준(%)
정상군 100 -
MPP+ 유도군 (음성대조군) 543 0
복합 생약 추출물 1 μg/ml 541 0.4
복합 생약 추출물 3 μg/ml 508 6.5
복합 생약 추출물 10 μg/ml 468 13.7
복합 생약 추출물 30 μg/ml 296 45.4
MPP+를 처리한 결과, MPP+만을 처리한 음성대조군(MPP)에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 543%의 caspase-3/7 활성이 측정되어 아폽토시스 현상이 높은 수준으로 유발되었음을 확인하였다. 복합 생약 추출물을 10, 30 μg/ml 농도로 처리하였을 경우, MPP+ 처리에 의해 증가된 caspase-3/7의 활성 정도가 음성대조군 대비 각각 13.7%, 45.4% 정도 감소되었고, 이로부터 MPP+ 처리에 따른 아폽토시스 현상이 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 복합 생약 추출물은 도파민성 신경세포주의 아폽토시스를 억제하는 효과가 우수함을 확인하였다.
실시예 6: 도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 ATP 생성 손상 개선 효능
본 실시예에서는 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y 신경세포에 독소물질인 MPP+을 처리하였을 경우 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물이 세포 내 ATP 생성 손상 개선 효과가 있는지 분석하였다.
ATP는 생명체의 중요한 에너지이며, 에너지를 필요로 하는 모든 과정은 ATP 인산화에 의해 저장된 화학에너지를 이용한다. 본 실시예에 사용된 EZ-ATP assay kit (DoGenBio, Korea)는 glycerol의 인산화 반응을 유도하여, ATP의 농도에 비례하여 생성되는 glycerol-6-phosphate를 형광 방법으로 검출함으로써, ATP의 농도를 측정한다.
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 분화시킨 SH-SY5Y 세포에 상기 제조예에서 제조한 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 3, 10, 30 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리하고 2 mM MPP+를 48시간 동안 처리하였다. 그 후, EZ-ATP assay kit에 명시된 protocol에 따라 ATP assay buffer, ATP Enzyme mix, ATP Converter, ATP probe 등을 혼합하여 각 well당 50 μl를 첨가하고 빛이 없는 조건에서 상온에서 30분 동안 처리하였다. 그 후, 535, 595 nm 파장영역에서 값을 측정하였다. 그 결과를 도 6 및 표 6에 나타내었다.
실험군 ATP농도 (%)
정상군 100.0
MPP+ 유도군 (음성대조군) 38.9
복합 생약 추출물 1 μg/ml 40.8
복합 생약 추출물 3 μg/ml 48.9
복합 생약 추출물 10 μg/ml 54.4
복합 생약 추출물 30 μg/ml 66.0
MPP+를 처리한 결과, MPP+만을 처리한 음성대조군(MPP)에서는 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 ATP 농도가 38.9% 수준으로 감소하였다. 복합 생약 추출물을 30 μg/ml 농도로 처리하였을 때 정상군 대비 ATP 농도가 66.0% 수준으로 회복하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 복합 생약 추출물은 도파민성 신경세포주에서 ATP 생성 손상에 대한 개선능이 우수함을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합 생약 추출물의 금은화, 위령선 및 천마의 배합중량비는 1-10:1-10:1-10인 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세트산 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출된 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium)에 의한 도파민성 신경세포 사멸을 억제하는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 도파민성 신경세포는 SH-SY5Y 세포주인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포내 활성산소종의 생성을 억제하는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 caspase3/7의 활성을 억제하는 것인, 약제학적 조성물.
  8. 금은화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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