ES2301864T3 - Derivados cationicos de la porfirina como agentes antibacterianos. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula I (Ver fórmula) en el cual: X1, X2, X3 y X4 representan de forma independiente un átomo de hidrógeno, un resto lipofílico, un grupo fenilo, un grupo inferior alquilo, alcarilo o aralquilo, o un grupo catiónico con la fórmula siguiente: - L - R1 - N + (R2)(R3)R4 en el cual: L está ausente o es un resto lipofílico seleccionado de un grupo consistente en fenoxi, fenileno, sulfonilamido, aminosulfonilo, sulfonilimino, fenilsulfonilamido, fenilaminosulfonilo, urea, uretano y restos de enlace de carbamato; R1 representa un alquileno inferior, un alquenileno inferior o un alquinileno inferior, el cual es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrumpido con oxígeno), flúor, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8R9, NR10R11 y N + R12R13R14; y R2, R3 y R4 representan independientemente H, arilo, alquilo inferior, alquenilos inferior o alquinilo inferior, de los cuales los últimos tres son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrumpido con oxígeno), arilo, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8R9, NR10R11 y N + R12R13R14. R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 y R14 representan independientemente H o un alquilo inferior y en el cual: el resto lipofílico es un grupo alquilo saturado de cadena lineal de fórmula -(CH2)pCH3 donde ¿p¿ es un entero entre 1 y 22; los grupos alquilos inferiores son seleccionados independientemente de un grupo consistente en grupos C1-C20 alquilos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno; los grupos alquilenos inferiores son seleccionados independientemente del grupo consistente en grupos C1-C20 alquilenos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno; los grupos alquenilos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C2-C20 alquenilos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno; los grupos alquenilenos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C2-C20 alquenileno, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno; los grupos alquinilos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C2-C20 alquinilo, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno; los grupos alquinilenos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C2-C20 alquinilenos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno; los grupos arilos son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos aromáticos carbocíclicos de seis a diez miembros, los cuales son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de flúor, ciano, nitro, alquilo inferior (según se define anteriormente; es decir, alcarilo), OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8R9 y NR10R11; y los grupos aralquilos son seleccionados independientemente del grupo consistente en grupos arilos (según se define anteriormente) enlazados al anillo de porfirina a través de un grupo alquilo inferior (según se define anteriormente) siempre que al menos uno de X1, X2, X3 y X4 sea un grupo catiónico según se define anteriormente, compensado con un anión de compensación, y al menos uno de X1, X2, X3 y X4 sea un átomo de hidrógeno.

Description

Derivados catiónicos de la porfirina como agentes antibacterianos.

Campo de la invención

La presente invención trata sobre los compuestos y usos de los mismos en el tratamiento de un trastorno médico para el cual se indica un compuesto fotodinámico y en particular, en el tratamiento curativo o profiláctico de la colonización e infección microbianas.

Antecedentes

La resistencia a los antibióticos desarrollada por un número creciente de microorganismos está reconocida como un problema de salud mundial (Tunger et al., 2000, Int. J. Microb. Agents 15:131-135; Jorgensen et al., 2000, Clin. Infect. Dis. 30:799-808). Es por ello que se necesita con urgencia el desarrollo de enfoques no-antibióticos para eliminar microorganismos con el fin de controlar infecciones que no pueden tratarse con antibióticos y para limitar el desarrollo de cepas adicionales resistentes a los antibióticos.

El tratamiento de infecciones microbianas con terapias fotodinámicas (PDT, por su expresión inglesa, Photodynamic Therapy) representa un valioso método alternativo para erradicar bacterias ya que éste comprende un mecanismo que es marcadamente diferente al mecanismo típico de la mayoría de los antibióticos. Así, la PDT está basada en el uso de una molécula fotosensibilizadora que, una vez activada por la luz, genera especies que reaccionan con el oxígeno que son tóxicas para una gran variedad de células procariotas y eucariotas que incluyen bacterias, micoplasmas y levaduras (Malik et al., 1990, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 5:281-293; Bertoloni et al., 1992, Microbios 71:33-46). Es importante destacar que la actividad fotosensibilizadora de muchos agentes fotodinámicos contra las bacterias no es disminuida por la resistencia a los antibióticos, sino que en lugar de ello, depende fundamentalmente de su estructura química (Malik et al., 1992, J. Photochem. Photobiol. B Biol 14:262-266).

Varios tipos de agentes fotosensibilizadores neutrales y aniónicos muestran una pronunciada actividad fototóxica contra las bacterias Gram positivas. Sin embargo, tales agentes fotosensibilizadores no ejercen una actividad citotóxica apreciable contra las bacterias Gram negativas a menos que la permeabilidad de la membrana externa sea alterada por el tratamiento con ácido etilendiaminotetraacético EDTA (por su expresión inglesa Ethylene diamine tetra-acetic acid) o policationes (Bertoloni et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett. 71:149-156; Nitzan et al., 1992, Photochem. Photobiol. 55:89-97). Se cree que la envoltura celular de las bacterias Gram negativas, la cual es más compleja y más gruesa que la de las bacterias Gram positivas, impide un enlace efectivo del agente sensibilizador o intercepta y desactiva las especies que reaccionan a los citotóxicos fotogeneradas por el agente fotosensibilizador (Ehrenberg et al., 1985, Photochem. Photobiol. 41:429-435; Valduga et al., 1993, J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
21:81-86).

Por el contrario, los agentes fotosensibilizadores cargados positivamente (catiónicos), incluyendo las porfirinas y ftalocianinas, promueven la desactivación eficiente de las bacterias Gram negativas sin necesidad de modificar la estructura natural de la membrana celular (Merchat et al., 1996, J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 32:153-157; Minnock et al., 1996, J. Photochem. Photbiol. B. Biol. 32:159-164). Parece que la carga positiva favorece el enlace del agente fotosensibilizador en los sitios celulares críticos que una vez dañados por la exposición a la luz, causan la pérdida de la viabilidad de la célula (Merchat et al., 1996, J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 35:149-157).

De esta forma se ha reportado que la Escherichia Coli es desactivada eficientemente por una luz visible después de la incubación con el catiónico 5, 10. 15, 20-tetrakis-(4-N-metilpiridil)-porfina (T_{4}MPyP) (Valduga et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 256:84-88). La actividad fototóxica de esta porfirina está mediada fundamentalmente, más que por el enlace con el ADN, por el deterioro de las funciones enzimáticas y de transporte, tanto de la membrana externa como de la citoplasmática.

Sin embargo, la utilidad de los agentes terapéuticos fotodinámicos con base de porfirinas conocidos está limitada debido a su toxicidad contra el tejido celular del hospedero mamífero, o sea, los compuestos no son capaces de diferenciar entre las células microbianas sobre las que deben actuar y las células hospederas. Además, la utilidad de los agentes terapéuticos fotodinámicos con base de porfirinas conocidas está también limitada por su potencia relativamente baja ante las células microbianas dianas.

Por ello, existe la necesidad de compuestos con base de porfirinas con perfiles de toxicidad mejorados y de alta potencia que puedan ser usados en la terapia PDT para eliminar preferentemente las células microbianas.

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Sumario

Según un primer aspecto de la invención, se ha proporcionado un compuesto de fórmula I.

1

en la cual:

X_{1}, X_{2}, X_{3}, y X_{4} representan independientemente (es decir, son similares o diferentes a) un átomo de hidrógeno, un resto lipofílico, un grupo fenilo, un grupo alquilo, alcarilo o aralquilo inferiores, o un grupo catiónico de la siguiente fórmula;

-L-R_{1}-N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4}

en la cual:

L es un resto de enlace, según se define a continuación, o está ausente;

R_{1} representa un alquileno inferior, un alcenileno inferior o un alquinileno inferior, el cual es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes de un alquilo inferior, un alquileno inferior (opcionalmente interrumpido por oxígeno), flúor, OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8},R_{9}, NR_{10}R_{11} y N^{+}R_{12}R_{13}R_{14}; y

R_{2}, R_{3} y R_{4} representan independientemente (es decir, son similares o diferentes a) H, arilo, alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior, los últimos tres de los cuales son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados a partir del alquilo inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrumpido por oxígeno), arilo, OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8}R_{9},NR_{10}R_{11} y N^{+}R_{12}R_{13}R_{14}

R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} representan independientemente H o un alquilo inferior

siempre que al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4}, sea un grupo catiónico, según la definición antes mencionada y al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4}, sea un átomo de hidrógeno.

El término "alquilo inferior" significa alquilo C_{1}-C_{20} lineal o ramificado, cíclico o acíclico, el cual puede ser interrumpido por oxígeno (preferiblemente no más de cinco átomos de oxígeno están presentes en cada cadena de alquilo). Los grupos alquilos inferiores que pueden representarse con R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4 },R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} incluyen alquilos C_{1}-C_{18}, alquilos C_{1}-C_{16}, alquilos C_{1}-C_{14}, alquilos C_{1}-C_{12}, alquilos C_{1}-C_{10}, alquilos C_{1}-C_{9}, alquilos C_{1}-C_{8}, alquilos C_{1}-C_{7}, alquilos C_{1}-C_{6}, alquilos C_{1}-C_{5}, alquilos C_{1}-C_{4}, alquilos C_{1}-C_{3} y alquilos C_{1}-C_{2}. Los grupos alquilos inferiores preferidos que pueden representarse con R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4 }, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} incluyen alquilos C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5},C_{6}, C_{7}, C_{8}, C_{9}, C_{10}, C_{11}, C_{12}, C_{13}, C_{14}, C_{15} y C_{16}.

El término "alquileno inferior" debe ser interpretado de acuerdo con esto.

Los términos "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" indican C_{2}-C_{20} alquenilos y alquinilos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, respectivamente, cada uno de los cuales puede ser interrumpido por oxígeno (preferiblemente no más de cinco átomos de oxígeno están presentes en cada cadena de alquenilo o alquinilo).

El término "alquenilo inferior" también incluye los isómeros geométricos cis y trans. Los grupos alquenilos inferiores que pueden estar representados con R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} incluyen alquenilo C_{2}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{17}, alquenilo C_{2}-C_{16}, alquenilo C_{2}-C_{14}, alquenilo C_{2}-C_{12}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{8}, alquenilo C_{2}-C_{7}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{3} y alquenilo C_{3}-C_{4}. Los grupos alquenilos preferentes que pueden estar representados con R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} incluyen alquenilos C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5},C_{6}, C_{7}, C_{7}, C_{8}, C_{9}, C_{10}, C_{11}, C_{12}, C_{13}, C_{14}.

El término "alquenileno inferior" debe ser interpretado de acuerdo con esto.

Los grupos "alquinilos inferiores" que pueden estar representados con R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} incluyen alquinilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{16}, alquinilo C_{2}-C_{14}, alquinilo C_{2}-C_{12}, alquinilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{9}, alquinilo C_{2}-C_{8}, alquinilo C_{2}-C_{7}, alquinilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{3} y alquinilo C_{3}-C_{4}. Los grupos alquinilos preferentes que pueden estar representados con R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10}, R_{11} incluyen alquinilos C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7}, C_{7}, C_{8}, C_{9}, C_{10}, C_{11}, C_{12}, C_{13} y C_{14}.

El término "alquinileno inferior" debe ser interpretado de acuerdo con esto.

El término "arilo" significa grupos aromáticos carbocíclicos de seis a diez miembros, tales como fenilo y naftilo, cuyos grupos son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados del flúor, ciano, nitro, alquilos inferiores (es decir, alcarilos), OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8},R_{9},NR_{10}R_{11}.

El término "aralquilo" incluye grupos arilos unidos al anillo de porfirinas mediante un grupo alquilo inferior.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un compuesto de fórmula II:

2

donde M es un elemento metálico diamagnético o un elemento metaloide y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son los que se definieron anteriormente.

El término "elemento metálico" pretende incluir un elemento metálico divalente o trivalente. Preferiblemente, el elemento metálico es diamagnético. Con mayor preferencia, el elemento metálico es seleccionado de Zn (II), La (III), Lu (III), Y (III), In (III) Cd (II), Mg (II), Al (III) y Pd (II). Más preferentemente, el elemento metálico es Ni (II), Mn (III), Fe (III) o Pd (II).

El término "metaloide" pretende incluir un elemento que posea propiedades físicas y químicas tales como la habilidad de conducir electricidad, que son intermedias tanto de los metales como de los no metales. El término elemento metaloide incluye átomos de silicio (Si) y de germanio (Ge) que son opcionalmente sustituidos por uno o más ligandos.

Se apreciará que los términos elemento metálico y elemento metaloide incluyen un elemento metal o un elemento metaloide que posee un estado de oxidación positivo, los cuales pueden sustituirse por uno o más ligandos seleccionados del flúor, OH, OR_{15}, donde R_{15} es un alquilo inferior, un alquenilo inferior, un alquinilo inferior, un aralquilo, un arilo o alcarilo según la definición anterior (en la cual el arilo y alcarilo son monosustituidos).

Los compuestos de las fórmulas I y II contienen al menos un grupo catiónico. De esta forma, los compuestos de la invención pueden poseer una carga positiva neta, por ejemplo, una carga de +1, +2, +3, +4, +5, +6 o más. En una realización preferente, los compuestos poseen una carga neta de menos de +4, por ejemplo, +1, +2 ó +3. En una realización particularmente preferida, los compuestos poseen una carga neta de +2.

Se apreciará por los expertos en la técnica que los compuestos de las fórmulas I y II pueden ser balanceados por aniones de compensación. Los aniones de compensación ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los haluros (por ejemplo: fluoruro, cloruro y bromuro), sulfatos (por ejemplo, decilsulfato), nitratos, percloratos, sulfonatos (por ejemplo, el sulfonato de metano) y trifluoroacetato. Otros aniones de compensación serán bien conocidos por los expertos en la técnica. De esta forma, farmacéutica y/o veterinariamente, derivados aceptables de los compuestos de las fórmulas I y II, tales como las sales y los solvatos, también están incluidos dentro del campo de la invención. Las sales que pueden ser mencionadas incluyen: sales a las que se les puede adicionar ácidos, por ejemplo, sales formadas con ácidos inorgánicos como el ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico con ácidos carboxílicos o con ácidos organosulfónicos; sales a las que se les puede adicionar una base; sales metálicas formadas con bases, por ejemplo, las sales de sodio o de potasio.

Los expertos en la técnica también podrán apreciar que los compuestos de la fórmula I pueden mostrar tautomería. Todas las formas tautoméricas y las mezclas de las mismas están incluidas en el campo de la invención.

Los compuestos de las fórmulas I y II también pueden contener uno o más átomos asimétricos de carbón y pueden por lo tanto mostrar isomería óptica y/o diastereoisomería. Los diastereoisómeros pueden ser separados usando técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía o cristalización fraccional. Los distintos estereoisómeros pueden ser aislados mediante la separación de una mezcla racémica u otra mezcla de los compuestos usando técnicas convencionales, por ejemplo, cristalización fraccional o HPLC (por su expresión inglesa, High Power Liquid Chromatography). Alternativamente, los isómeros ópticos deseados pueden ser obtenidos por reacción de los productos iniciales ópticamente activos apropiados en condiciones que no causarán racemización o epimerización, o por derivación, por ejemplo con el ácido homoquiral, seguido por la separación de los ésteres diastereoisómeros por medios convencionales (por ejemplo, HPLC, cromatografía de Silicio). Todos los estereoisómeros están incluidos en el campo de la
invención.

Una característica distintiva de los compuestos de los aspectos primero y segundo de la invención es que al menos uno de los grupos sustituyentes X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es un grupo catiónico amonio cuaternario de la fórmula -L-R_{1}-N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4}, según lo definido anteriormente. Preferiblemente, ninguno de los X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es un grupo catiónico anilino o piridino.

En una realización preferente, R_{1} es un grupo alquileno inferior no sustituido, alquenileno inferior o alquinileno inferior.

Ventajosamente, R_{1} es un grupo alquileno inferior de cadena lineal de la fórmula:

-(CH_{2})_{m}-.

Preferiblemente, "m" es un entero entre 1 y 20. Más preferiblemente, "m" es un entero entre 1 y 10, por ejemplo entre 1 y 6, entre 1 y 5, entre 1 y 4 ó entre 1 y 3. Los grupos alquilenos inferiores de cadenas lineales preferentes que pueden ser representados por R_{1} incluyen grupos de la fórmula anterior en la cual "m" es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Más preferiblemente "m" es 2 ó 3.

Los tres grupos sustituyentes restantes del resto cuaternario de amonio, es decir R_{2}, R_{3} y R_{4} pueden ser los mismos o diferentes y son seleccionados a partir de H, un alquilo inferior, un alquenilo inferior o un alquinilo inferior, los tres últimos de los cuales son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de un alquilo inferior, OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8}R_{9}, NR_{10}R_{11} y N^{+}R_{12}R_{13}R_{14}.

En una realización preferente, R_{2}, R_{3} y/o R_{4} son un grupo alquilo inferior, alquenilo inferior o un grupo alquinilo inferior.

Preferiblemente, R_{2}, R_{3} y/o R_{4} son grupos alquilos inferiores no sustituidos.

Opcionalmente, al menos uno de R_{2}, R_{3} y R_{4} es un grupo alquilo que es sustituido por un grupo amino primario, secundario o terciario o un grupo cuaternario amonio.

En una realización preferente de los compuestos de los aspectos primero y segundo de la invención, R_{1} es -(CH_{2})_{3}-,
R_{2} y R_{3} son CH_{3} y R_{4} es -(CH_{2})_{3}-N (CH_{3})_{2}.

En una realización preferente alternativa de los compuestos de los aspectos primero y segundo de la invención R_{1} es -(CH_{2})_{3}-, y R_{2}, R_{3} y R_{4} son CH_{3} cada uno.

En una realización preferente alternativa adicional de los compuestos de los aspectos primero y segundo de la invención, R_{1} es -(CH_{2})_{3}-, y R_{2}, R_{3} y R_{4} son C_{2}H_{5} cada uno.

Ventajosamente, al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es un grupo catiónico como se definió anteriormente y al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es un átomo de hidrógeno.

Preferiblemente, cada uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es un átomo de hidrógeno o un grupo catiónico como se definió anteriormente.

Convenientemente, los valores pK de cualquier grupo amino primario, secundario o terciario, si están presentes en los compuestos de la invención, es mayor que 8 para asegurar que el grupo esté protonado en un ambiente fisioló-
gico.

El grupo catiónico amonio cuaternario está opcionalmente enlazado al anillo de porfirina a través de un resto de enlace, L, seleccionada de un grupo consistente en:

fenoxi, fenileno, sulfonilamido, aminosulfonilo, sulfonilimino, fenilsulfonilamido, fenilo-aminosulfonilo, urea, uretano y restos de enlace de carbamato.

En una realización preferente, el grupo catiónico cuaternario está enlazado al anillo de porfirina mediante un enlace fenoxi.

De ahí que, X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} pueden tener la siguiente fórmula:

3

en la cual R es R_{1} -N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4}, según se define anteriormente, y "n" es un entero entre 1 y 3.

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En una realización alternativa preferente, el grupo catiónico amonio cuaternario está enlazado al anillo de porfirina por un enlace fenileno.

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De esta forma, X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} puede tener la siguiente fórmula:

4

en la cual R es R_{1} - N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4}, según se define anteriormente, y "m" es un entero entre 1 y 3.

Preferiblemente, "m" es 2, y más preferiblemente 1.

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En una realización preferente alternativa, X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} pueden tener la siguiente fórmula:

5

en la cual R es R_{1}-N^{+} (R_{2})(R_{3}) R_{4}, "n" y "m" son como se definen anteriormente y "n+m" está entre 1 y 3.

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Ventajosamente, L contiene un anillo de benceno (por ejemplo, fenoxi, fenileno, fenilsulfonilamido o fenilaminosulfonilo) mono-sustituido en la posición para. Alternativamente, L puede ser mono o di-sustituido en las posiciones meta u orto. L también puede ser ambos, para- y orto-sustituido.

En una realización preferente alternativa, el grupo catiónico amonio cuaternario está directamente enlazado al anillo de porfirina, o sea, L está ausente.

En una realización preferente de los aspectos primero y segundo de la invención, el compuesto contiene dos grupos catiónicos, según se definen anteriormente, en los lados opuestos del anillo de porfirina, o sea, en las posiciones 5 y 15 del anillo o en las posiciones 10 y 20 del anillo. Por ejemplo, X_{1} y X_{3} pueden ser un átomo de hidrógeno, un resto lipofílico, un grupo fenilo, un grupo alquilo inferior, un grupo alcarilo o aralquilo, y X_{2} y X_{4} pueden ser grupos catiónicos, o viceversa. Preferiblemente, tanto X_{1} como X_{3} son átomos de hidrógeno y tanto X_{2} como X_{4} son un grupo catiónico, o viceversa.

Alternativamente, el compuesto de la invención puede incluir dos grupos catiónicos, según se define anteriormente, en posiciones vecinas del anillo de porfirina, o sea, en las posiciones 5 y 10 del anillo, o en las posiciones 10 y 15 del anillo, o en las posiciones 15 y 20 del anillo, o en las posiciones 20 y 5 Por ejemplo, X_{1} y X_{2} pueden ser hidrógeno y X_{3} y X_{4} pueden ser grupos catiónicos, o X_{2} y X_{3} pueden ser hidrógenos y X_{4} y X_{1} pueden ser grupos catiónicos,
etc.

En una realización preferente adicional de los compuestos de los aspectos primero y segundo de la invención, al menos X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es o contienen un resto lipofílico.

En "resto lipofílico" incluimos restos que tienen un coeficiente de partición entre 1-n-octanol y agua expresado como log P mayor que 1,0 de pH fisiológico y 25ºC.

El resto lipofílico es un grupo alquilo saturado de cadena lineal de fórmula -CH_{2})_{p}CH_{3}, en la cual "p" es un entero entre 1 y 22, por ejemplo entre 1 y 18. Preferiblemente, "p" está entre 1 y 18, más preferiblemente entre 2 y 16, entre 4 y 16, entre 6 y 18, entre 8 y 16 ó entre 4 y 12. Más preferiblemente, "p" está entre 10 y 12.

Se apreciará que X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} puede ser un grupo catiónico, según se define anteriormente, el cual también contiene un resto lipofílico.

En una realización preferente alternativa de los aspectos primero y segundo de la invención, ninguno de X_{1}, X_{2}, X_{3} ó X_{4} son un resto lipofílico.

Ventajosamente, los compuestos de la invención son solubles en agua. Preferiblemente, los compuestos pueden disolverse en agua hasta obtener una concentración de al menos 5 \mug/l, por ejemplo, al menos 10 \mug/l, 15 \mug/l, ó 20 \mug/l. Más preferiblemente, los compuestos pueden disolverse en agua hasta obtener una concentración de al menos 100 \mug/l, por ejemplo 200 \mug/l, 300 \mug/l, 400 \mug/l, 500 \mug/l, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 50 mg/ml ó
100 mg/ml.

Convenientemente, los compuestos de la invención muestran mayor toxicidad ante el microorganismo diana (por ejemplo, una bacteria) al recibir iluminación/irradiación que en ausencia de iluminación/irradiación activadoras, es decir, muestran mayor actividad fotodinámica ("toxicidad en la luz") que toxicidad en la oscuridad (véase más abajo). Se apreciará que tal toxicidad puede determinarse usando cultivos de células. Preferiblemente, la actividad fotodinámica de un compuesto es al menos dos veces mayor que la toxicidad en la oscuridad de ese compuesto, más preferiblemente al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos ocho veces, al menos diez veces, al menos quince veces o al menos veinte veces. Más preferiblemente, el compuesto de la invención es sustancialmente no-tóxico en ausencia de iluminación/irradiación.

En una realización preferente, el compuesto de la invención es tóxico para el microorganismo diana (por ejemplo, las células bacterianas) en dosis bajas. Preferiblemente, el compuesto es tóxico para el microorganismo diana en una concentración menor que 10 \muM, por ejemplo menor que 1 \muM, menor que 0,1 \muM, menor que 0,01 \muM, menor que 0,005 \muM o menor que 0,001 \muM (véase Ejemplo B).

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Los compuestos preferentes de la invención incluyen los siguientes:

(a) Dicloruro de 5,15-bis-(4-(3-[(3-dimetilamino-propil)-dimetil-amonio]-propiloxi)-fenil)-porfirina ("Compuesto 8").

6

Preferiblemente, este compuesto se suministra como sal diclorada o tetraclorada.

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(b) Dicloruro de 5,15-bis-[4-(3-trietilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina ("Compuesto 9").

7

Preferiblemente este compuesto se suministra como una sal diclorada.

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(c) Dicloruro de 5,15-bis-[3-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina ("Compuesto 12").

8

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de sal diclorada.

\vskip1.000000\baselineskip

(d) Dicloruro de 5,15-bis-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina ("Compuesto 10");

9

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de una sal diclorada.

\newpage

(e) Dicloruro de 5-[3,5-bis-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15-undecil-porfirina ("Compuesto 6");

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10

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de sal diclorada.

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(f) Cloruro de 5-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio-propiloxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina ("Compuesto 23");

11

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de una sal clorada o diclorada.

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(g) Tricloruro de 3-[({3-[(3-{4-[15-(4-Dodeciloxi-fenil)-porfirina-5-il]-fenoxi}-propil)-dimetil-amonio]-propil}-dimetil-amonio)-propil]-trimetil-amonio ("Compuesto 25");

12

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de una sal triclorada.

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(h) Dicloruro de 5,15-bis-[3-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-10-undecil-porfirina ("Compuesto 28");

13

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de una sal diclorada.

\newpage

(i) Dicloruro de 5-{4-[3-Dimetil-(3-trimetilamonio-propil)-amonio-propiloxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina ("Compuesto 31"); y

14

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de una sal diclorada.

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(j) Dicloruro de 5-[4-(3-Dimetildecil-amoniopropiloxi)-fenil]-15-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio-
propiloxi]-fenil}-porfirina. ("Compuesto 32").

15

Preferiblemente, este compuesto se suministra en forma de una sal diclorada.

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Se apreciará que los compuestos anteriores pueden estar alternativamente en una forma metalada es decir, pueden incluir un elemento metálico en quelato o un elemento metaloide dentro del anillo de porfirina.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un compuesto para usarse como agente terapéutico fotodinámico selectivo, es decir, para destruir microorganismos selectivamente, en los cuales el compuesto es un compuesto según el primer o segundo aspectos de la invención.

Por "selectivo" queremos decir que el agente terapéutico fotodinámico es tóxico con preferencia para uno o más microorganismos (tales como bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos y/o virus) comparado con las células hospederas de mamíferos, por ejemplo, humanos. Preferiblemente, la toxicidad del compuesto para el microorganismo diana es al menos dos veces superior que la toxicidad del compuesto para las células de mamíferos (tales como las células de la piel humana), más preferiblemente al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos ocho veces, al menos diez veces, al menos quince veces o al menos veinte veces. Más preferiblemente aún, el compuesto de la invención es sustancialmente no-tóxico para las células de
mamíferos.

De esta forma, cuando los compuestos de la invención son usados para tratar infecciones bacterianas, por ejemplo, los regímenes de dosificación pueden ser seleccionados de tal forma que las células bacterianas sean destruidas con el mínimo daño al tejido hospedero saludable (por ejemplo, las células de la piel). De esta forma, los agentes terapéuticos fotodinámicos exhiben preferiblemente una "ventana terapéutica".

Un cuarto aspecto de la invención proporciona una formulación farmacéutica que contiene un compuesto según el primer y segundo aspectos de la invención en una mezcla con un adyuvante, diluente o portador farmacéutica y veterinariamente aceptable.

Los compuestos de la invención pueden ser formulados en varias concentraciones, en dependencia de la eficacia/toxicidad del compuesto que se está usando y la indicación para la cual está siendo usado. Preferiblemente, la formulación contiene un compuesto de la invención en una concentración entre 0,1 \muM y 1 mM, más preferiblemente entre 1 \muM y 100 \muM, entre 5 \muM y 50 \muM, entre 10 \muM y 50 \muM, entre 20 \muM y 40 \muM y más preferiblemente alrededor de 30 \muM. Para las aplicaciones in vitro, las formulaciones pueden comprender una concentración inferior de un compuesto de la invención, por ejemplo entre 0,0025 \muM y 1 \muM.

Se apreciará por los expertos en la técnica que los compuestos de la invención se administrarán generalmente en mezclas con un diluente excipiente o un portador farmacéutico adecuado seleccionado teniendo en cuenta la vía de administración proyectada y la práctica farmacéutica estándar (por ejemplo, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennysylvania, USA).

Por ejemplo, para la aplicación tópica, o sea, en la piel o el área de una herida, los compuestos de la invención pueden ser administrados en forma de loción, solución, crema, gel, ungüento o polvo (por ejemplo, véase Remington, supra, páginas 1586 a la 1597). De esta forma, los compuestos de la invención pueden ser formulados como un ungüento apropiado que contenga el compuesto activo en suspensión o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o más de lo siguiente: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, mezcla de polioxietileno con polioxipropileno, cera emulsiva y agua. Alternativamente, pueden ser formulados como una loción o crema adecuada, en suspensión o disuelta en, por ejemplo, una mezcla de uno o más de lo siguiente: aceite mineral, monoestearato de sorbitano, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, sulfato de e-laurilo, un alcohol (por ejemplo, etanol, alcohol cetearilo, 2-octildodecanol, alcohol bencílico) y agua.

En una realización preferente, la formulación en forma de polvo (por ejemplo, loción, solución, crema, gel o ungüento) tiene base acuosa.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca también incluyen pastillas que contienen el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que contienen el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina o glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que contienen el ingrediente activo en un portador líquido adecuado.

Los compuestos de la invención también pueden ser administrados intranasalmente o por inhalación y son convenientemente suministrados en forma de inhalador de polvo seco o con una presentación de spray para aerosol desde un contenedor presurizado, una bomba, spray o nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A^{3} ó 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA227EA^{3}), dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede determinarse mediante una válvula que suministre la cantidad medida. El contenedor presurizado, bomba, spray o nebulizador puede contener una solución o suspensión del compuesto activo, por ejemplo, usar una mezcla de etanol y el propulsor como solvente, el cual puede adicionalmente contener un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitano. Las cápsulas y los cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para ser usados en un inhalador o insuflador pueden ser formulados para contener una mezcla en polvo de un compuesto de la invención y una base polvo adecuada tal como la lactosa o almidón.

Las formulaciones de aerosol o polvo seco son preferiblemente dispuestas de manera que cada dosis medida o "bocanada" contenga al menos 1 mg de un compuesto de la invención para administrarlo al paciente. Se apreciará que la dosis total con un aerosol variará de un paciente a otro y en dependencia de la indicación de cada paciente, y puede administrarse en una dosis única o, más comúnmente, en dosis divididas durante el día.

Alternativamente, otras vías de administración convencionales conocidas en la técnica también pueden ser empleadas; por ejemplo, los compuestos de la invención pueden ser suministrados oralmente, bucalmente o sublingualmente en forma de tabletas, cápsulas, óvulos, elixires, soluciones o suspensiones, las cuales pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, demorada o controlada. Los compuestos de la invención también pueden administrarse intra-ocularmente (véase más adelante), intra-auditivamente o mediante inyección intracavernosa.

Los compuestos de la invención también pueden administrarse parenteralmente, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutáneamente (incluyendo vía un juego de agujas finas o el uso de la tecnología sin aguja Powderject®), o pueden ser administrados por técnicas de infusión. La mejor manera de usarlos es en forma de solución acuosa estéril, la cual puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para que la solución se convierta en isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben estar en un buffer adecuado (preferiblemente un pH de 3 a 9), de ser necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas en condiciones estériles se alcanza rápidamente mediante técnicas farmacéuticas estándares bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones estériles para inyección, acuosas y no-acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, buffers, bacteriostáticos y solutos los cuales convierten la formulación en isotónica con la sangre del receptor tratado; y suspensiones estériles acuosas y no-acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitarias o de multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden ser almacenados en un clima de congelación en seco (liofilizado) requiriendo sólo la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de usarse. Las soluciones de inyección ocasionales y las suspensiones pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito anteriormente.

Los compuestos de la invención pueden también administrarse por vía ocular, particularmente para tratar enfermedades oculares. Para uso oftálmico, los compuestos de la invención también pueden formularse como suspensiones micronizadas en soluciones salinas isotónicas estériles de pH ajustado, o preferiblemente, como soluciones en salinas isotónicas estériles de pH ajustado, opcionalmente en combinación con un preservante tal como el cloruro de bencilalconio. Alternativamente, estas pueden formularse en un ungüento tal como el petrolato.

Para el uso veterinario, un compuesto de la invención es administrado en una formulación aceptable según la práctica veterinaria normal y el cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración más apropiada para el animal en particular.

Los compuestos y/o formulaciones de la invención pueden almacenarse en un contenedor o vasija apropiada conocida en la técnica. Se apreciará por los expertos en la técnica, que el contenedor o vasija debe preferiblemente estar hermético y/o esterilizado. Ventajosamente, el contenedor o vasija está hecho de material plástico, tal como el polietileno.

Un quinto aspecto de la invención proporciona un compuesto según el primer y segundo aspectos de la invención para usarse en la medicina y, en particular, en el tratamiento curativo y/o profiláctico de las infecciones microbianas.

Los compuestos de la invención son fotosensibles (fotodinámicos) ya que emiten especies que reaccionan al oxígeno, tales como oxígeno singlete o radicales libres de oxígeno, posterior a la iluminación/irradiación en presencia de oxígeno con luz o la longitud de onda apropiada (típicamente de 400 nm a 800 nm; véase más abajo). Por consiguiente, los compuestos de la invención son adecuados para ser usados como agentes terapéuticos fotodinámicos en el tratamiento curativo y/o profiláctico de un problema médico para el que se prescriba un agente fotodinámico (por ejemplo, véase Smith, 2002, Curr Probl Cancer. 26(2):67-108; Hopper, 2000, Lancet Oncol. 1:212-9;Dougherty, 2002, J Clin Laser Med Surg. 20(1):3-7; Ceburkov & Gollnick, 2000, Eur J Dermatol. 10(7):568-75).

Preferiblemente, los compuestos de la invención están propuestos para usarse en el tratamiento curativo y/o profiláctico de infecciones bacterianas tales como los cocos Gram positivos (por ejemplo, Estreptococo), los cocos Gram negativos (por ejemplo Neiseria), los bacilos Gram positivos (por ejemplo, la especie Corynebacteria), los bacilos Gram negativos (por ejemplo la Escherichia coli), los bacilos de pruebas de ácido (por ejemplo, la Micobacteria típica) e incluyen infecciones causantes de abcesos, quistes, infecciones dermatológicas, infecciones de heridas, artritis, infecciones del tracto urinario, pancreatitis, enfermedades inflamatorias pélvicas, peritonitis, prostatitis, infecciones de la vagina, de la cavidad oral (incluyendo las infecciones dentales), ojos y/o oídos, úlceras y otras infecciones localizadas; infecciones causadas por actinomices, infecciones causadas por hongos tales como la Candida albicans, Aspergillus and Blastomices; infecciones virales tales como el VIH, encefalitis, gastroenteritis, fiebre hemorrágica, hantavirus, hepatitis viral, herpes virus (por ejemplo, citomegalovirus, Epstein-Barr, herpes virus simiae, herpes simples y varicela-zoster); infecciones protozoarias tales como la amebiasis, babesiosis, coccidiosis, criptosporidiosis, giardiasis, Leishmaniasis, Trichomoniasis, toxoplasmosis y malaria, helmintiasis tales como las causadas por nemátodos, céstodos y tremátodos, por ejemplo, ascariasis, necator, filariasis linfáticas, oncocerciasis, esquistosomiasis y toxocariasis; y enfermedades inflamatorias tales como el reumatismo del tejido blando, osteoartritis, artritis reumatoidea y espondiloartropatías.

Más preferiblemente, los compuestos de la invención son para usarse en el tratamiento curativo y/o profiláctico de infecciones causadas por bacterias Gram positivas y/o bacterias Gram negativas. Más preferiblemente, los compuestos de la invención son para usarse en el tratamiento curativo y/o profiláctico de infecciones causadas por bacterias Gram positivas.

Los compuestos de la invención son preferiblemente usados para destruir microorganismos, por ejemplo: bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos y virus. Los compuestos de la invención son particularmente adecuados para destruir bacterias que han desarrollado resistencia a los tratamientos antibióticos convencionales, tales como el Staphilococcus áureo resistente a la meticilina (MRSA, por su expresión inglesa Methicillin-resistant Staphilococcus aureus).

Se apreciará por los expertos en la técnica que los compuestos de la invención son adecuados para tratar todas las infecciones en las cuales los microorganismos diana pueden encontrarse en una superficie fotoaccesible o en un área fotoaccesible (por ejemplo, la epidermis, cavidad oral, cavidad nasal, los senos, oídos, ojos, pulmones, tracto urogenital y tracto gastrointestinal). Además, los compuestos de la invención son apropiados para tratar infecciones en superficies o áreas que se hayan convertido en fotoaccesibles de manera temporal, tales como los huesos infectados expuestos temporalmente durante procedimientos quirúrgicos. Las infecciones de la cavidad peritoneal, tales como aquellas que resultan de la apendicitis perforada, son vías fotosensibles al menos para los dispositivos laparoscópicos.

Las dosis del compuesto de la invención dependerán de varios factores que incluyen el compuesto en particular utilizado, la formulación, vía de administración y el uso para el que se prescribe el compuesto. Por lo general, sin embargo, las dosis fluctuarán entre 0,01 y 20 mg del compuesto por kilogramo de peso corporal, preferiblemente desde 0,1 hasta 15 mg/kg, por ejemplo de 1 a 10 mg/kg de peso corporal.

En una realización preferente, los compuestos de la invención son usados en combinación con los agentes antimicrobianos convencionales. Por ejemplo, los compuestos pueden ser usados en combinación con uno o más de los antibióticos convencionales siguientes: agentes antibacterianos, por ejemplo las penicilinas naturales y sintéticas y las cefalosporinas, sulfonamidas, eritromicina, kanamicina, tetraciclina, cloramfenicol, rifampicina e incluso la gentamicina, ampicilina, benzipenicilina, benetaminpenicilina, penicilina benzatínica, feneticilina, fenoximetil penicilina, procainpenicilina, cloxacilina, flucoxacilina, meticilina sódica, amoxicilina, hidrocloruro de bacampicilina, ciclacilina, mexlocilina, pivampicilina, hidrocloruro de talampicilina, cafecilina sódica, piperacilina, ticarcilina, mecilina, pirmecilina, cefaclor, cefadroxil, cefotaxima, cefotaxime, cefoxitina, cefsulodina sódica, ceftazidime, ceftizoxime, cefuroxime, cefalexina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefradina, latamoxef disódico, aztreonam, hidrocloruro de clorotetraciclina, clomociclina sódica, hidrocloruro de demeclocidina, doxiciclina, limeciclina, minociclina, oxitetraciclina, amikacina, sulfato de framicetina, sulfato de neomicina, netilmicina, tobramicina, colistina, fusidato sódico, sulfato de polimixina B, espectinomicina, vancomicina, sulfaloxato de calcio, sulfametopirazina, sulfadiazina, sulfadimidina, sulfaguanidina, sulfúrea, capreomicina, metronidazol, tinidazol, ácido nalidíxico, trimetoprimsufametoxaxol, clindamicina, lincomicina, cicloserina, isoniazida, etambutol, etionamida, pirazinamida y otros similares; los agentes antifungales, por ejemplo: miconazol, quetoconazol, itraconazol, fluconazol, anfotericina, flucitosina, griseofulvina, namaticina, nistatina y sus similares; y agentes antivirales tales como: aciclovirus, AZT, ddl, hidrocloruro de amantadina, inosinpranobex, vidarabina y otros similares.

En otra realización preferente, los compuestos de la invención son coadministrados con agentes que aceleran la penetración tales como poli-(etilenimina) o agentes antibióticos que muestran tal capacidad de acelerar la penetración (por ejemplo, polimixina o colistina).

Los compuestos de la invención son particularmente adecuados para usarse en el tratamiento curativo o profiláctico de una o más de las siguientes indicaciones:

Impétigo

El impétigo es una infección altamente transmisible. Es la infección más común en los niños.

El impétigo tiene dos formas clásicas: no bulosa y bulosa. El impétigo no buloso, también llamado impétigo contagioso, es responsable de aproximadamente el 70% de los casos. Las lesiones normalmente se curan en 2 ó 3 semanas sin tratamiento. El impétigo también puede complicarse con otras enfermedades de la piel tales como escabiosis, varicela, dermatitis atópica y la enfermedad de Darier.

(a) Impétigo no buloso Tipos de bacterias

La no bulosa es una infección causada principalmente por los Estreptococos del Grupo A beta-hemolítico (Estreptococo Piógenes), Estafilococo áureo, o una combinación de estos dos organismos (véase Andrews' diseases of the skin: clinical dermatology 9th ed. (2000) edited by Odom RB editor Saunders p. 312-4). Los estreptococos que no son del Grupo A (Grupo B, C y G) pueden ser responsables de casos raros de impétigo, y los estreptococos del Grupo B están asociados al impétigo en el recién nacido.

Tipos de heridas

La no bulosa es una infección superficial, intradermal, vesiculopustular unilocular.

Las lesiones del impétigo no buloso comúnmente comienzan en la piel de la cara o las extremidades después de un trauma. Por regla general, la piel intacta es resistente a la impetiginazación.

La presentación clínica del impétigo evoluciona de forma ordenada desde una pequeña vesícula o pústula, que progresa hasta convertirse en una placa en forma de postilla de color melado. Las lesiones usualmente son inferiores a los 2 cm de diámetro. Las lesiones tienden a secar, dejando pequeñas costillas sin cicatrización. Las lesiones son usualmente mínimamente sintomáticas. Raramente, puede estar presente el eritema asociado con dolor ligero o prurito ligero. La infección se extiende hasta las áreas contiguas y distales mediante la inoculación de otra herida provocada por el rascado.

Sitios de localización de las bacterias

El impétigo no buloso es una infección superficial estreptocócica o estafilocócica que se localiza en la capa subcorneal de la piel (justo debajo del estrato córneo) (véase Figura 1). Más particularmente, la infección en el impétigo está limitada histopatológicamente a queratinocitos epidermales superiores altamente diferenciados. Una vez que las bacterias invaden alguna ruptura en la piel, comienzan a multiplicarse.

La histopatología consiste en una inflamación extremadamente superficial alrededor del resto superior cónica de los folículos pilosebáceos. Se forma una vesicopústula subcorneal que contiene unos cuantos cocos aislados conjuntamente con piezas de leucocitos polimorfonucleares y células epidermales. En la dermis, se produce una reacción inflamatoria ligera - dilatación vascular, edema e infiltración de leucocitos polimorfonucleares (Andrews' diseases of the skin, supra., p.312-4).

(b) Impétigo buloso Tipos de bacterias

El impétigo buloso está causado por cepas de Estafilococos áureos que producen toxinas exfoliativas (Sadick et al., 1997, Dermatologic Clinics 15_ (2): 341-9).

Tipos de heridas

El impétigo buloso está histológicamente caracterizado por hendiduras subcorneales e infiltraciones con leucocitos polimofonucleares que migran a través de la epidermis y se acumulan entre la capa de la piel granular y la del estrato córneo. Frágiles bulas superficiales, pequeñas o grandes, están presentes en el tronco y las extremidades.

Bulas flácidas y lesiones húmedas con eritema a su alrededor son características de esta infección subcorneal. A menudo, solo las piezas de las bulas rotas se ven en el momento de la presentación. La separación de la epidermis se debe a una exotoxina producida por el Estafilococo áureo.

Sitios de las bacterias

El impétigo buloso es una infección estafilocócica superficial que ocurre en y justo debajo del estrato córneo (véase figura 1). Se considera impétigo buloso debido a la toxina exfoliativa producida por algún Estafilococo áureo adherido a las células del estrato córneo.

Dermatitis atópica (DA)

La dermatitis atópica, también llamada eczema atópico, es una inflamación crónica de la piel que trae como consecuencia el salpullido y prurito, especialmente en las flexuras, por ejemplo, detrás de las rodillas, en la parte de alante de los codos, muñecas, cuello y párpados. La infección del salpullido es común y causa aún más inflamación y picazón.

El eczema se manifiesta típicamente en las edades de 1-6 meses. Aproximadamente el 60% de los pacientes debuta alrededor de 1 año y el 90% alrededor de los 5 años. La presentación de la dermatitis atópica en la adolescencia o posteriormente no es común y debe requerir otro diagnóstico. Las manifestaciones de la enfermedad varían con la edad.

Tipos de bacterias

Las bacterias y sus superantígenos contribuyen a la patogénesis de la DA.

El Estafilococo áureo forma colonias en la piel del 90% de los pacientes de DA (lesiones eczematosas crónicas) y sólo en la del 5% de los pacientes no atópicos. La densidad de la colonización del Estafilococo áureo puede alcanzar hasta 10^{7} unidades formadoras de colonias por cm^{-2} sin signos clínicos de infección en pacientes con DA. Además, la piel no lesionada aparentemente normal de pacientes atópicos contiene números elevados de Estafilococos áureos.

La razón para el crecimiento excesivo del Estafilococo áureo en la dermatitis atópica, aunque mucho menos severamente o incluso no severo en lo absoluto en enfermedades como la soriasis, no es conocida. La proteína A facilita una respuesta mucho menos vigorosa en las atópicas que en las normales o psoriacéas, pero esto tiene más posibilidades de ser más el resultado que la causa de la colonización. Recientemente la atención se ha girado a los lípidos de la piel y existe cierta evidencia de que los ácidos grasos, los cuales pueden controlar la colonización estafilocócica, son deficientes en las atópicas.

Los superantígenos son un grupo único de proteínas producidas por bacterias y virus que pasan por alto ciertos elementos de la secuencia convencional inmune mediada por antígenos. Mientras que los antígenos convencionales activan aproximadamente desde 0,01% hasta 0,1% de las células corporales T, un superantígeno tiene la habilidad de estimular desde el 5% hasta el 30% de la población de las células T. El Estafilococo áureo puede exacerbar o mantener la inflamación de la piel en las DA al secretar un grupo de exotoxinas que actúan como superantígenos. Los pacientes con DA poseen una barrera cutánea alterada secundaria a una insuficiencia de cerámidas dentro del estrato córneo. Se ha sugerido que la penetración de la piel por estas exotoxinas puede causar activación de las células T, macrófagas, las células L y mastocitos, originando de esta forma una liberación de citoquinas y mediadores de mastocitos. Se concibe que estos eventos pueden proporcionar la base para la inflamación en la DA crónica. Persiste la especulación acerca de que si la colonización del Estafilococo áureo y la secreción local de superantígenos es un fenómeno primario o secundario en la DA (Andrews' diseases of skin, Chap. 5, Atopic Dermatitis, Eczema, and non-infectious immunodeficiency disorders p.69-76).

Las infecciones cutáneas virales, micóticas y bacterianas ocurren más comúnmente en pacientes con DA. Las infecciones virales son consistentes con un defecto de las células T e incluyen herpes simples (local o generalizado, por ejemplo, eczema herpético), molusco contagioso y el virus del papiloma humano. Las infecciones micóticas superficiales causadas por Tricofito rubrum y la Pitirosporina oval también ocurren con frecuencia. Las infecciones bacterianas, específicamente aquellas causadas por Estafilococo áureo, son extremadamente comunes. La superinfección trae como consecuencia costras de color melado, supuración serosa extensiva o foliculitis.

Tipos de heridas

Las lesiones agudas se presentan en forma de pápulas eritematosas, vesículas y erosiones; la enfermedad crónica consiste en pápulas fibróticas y piel engrosada y liquenificada.

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Un hallazgo de un número creciente de estafilococos patogénicos está frecuentemente asociado con secreciones, formación de costras, foliculitis y adenopatías. La infección estafilocócica secundaria es frecuente y el edema local y la adenopatía regional ocurren comúnmente durante la dermatitis atópica. El impétigo puede ser un tipo de infección secundaria de la dermatitis atópica.

La histología de la dermatitis atópica fluctúa desde la dermatitis esponjosa aguda hasta el liquen simple crónico, en dependencia de la morfología de la lesión cutánea biopsiada.

Sitios de las bacterias

Las paredes celulares del Estafilococo áureo exhiben receptores, las llamadas adhesinas, para la fibronectina y el fibrinógeno epidérmico y dérmico. Se ha demostrado que el enlace del Estafilococo áureo estaba mediado por fibrinógeno y fibronectina en pacientes con AD. Como la piel de los pacientes con AD carece de un estrato córneo intacto, la fibronectina dérmica podría estar descubierta e incrementar la adherencia del Estafilococo áureo. Estructuras fibrilares y amorfas han sido detectadas entre las células del Estafilococo áureo y los corneocitos y pueden provocar una biopelícula bacteriana. Se ha observado que el Estafilococo áureo penetra en los espacios intracelulares lo que sugiere que los lípidos de la superficie de la piel están deteriorados en los pacientes de AD (véase Breuer K et al., 2002, British Journal of Dermatology 147: 55-61).

Úlceras

Las úlceras de la piel, tales como las úlceras de pies diabéticos, las úlceras por presión y las ulcerosas venosas crónicas, son llagas o lesiones abiertas de la piel caracterizadas porque el tejido mengua y a veces están acompañadas de pus. Las úlceras de la piel pueden tener diferentes causas y afectan diferentes poblaciones, pero todas ellas tienden a sanar muy despacio, si es que sanan, y pueden ser bastante difíciles y costosas de tratar.

Tipos de bacterias

Las úlceras por presión no están asociadas a problemas de infecciones más serias. Los microorganismos aeróbios a bajos niveles contaminarán las úlceras causadas por presión, pero no impedirán la sanción con el tiempo. Sin embargo, las úlceras causadas por presión que atraviesan todas las capas de la piel pueden infectarse de manera secundaria, y se puede producir una osteomielitis. Esas úlceras provocadas por presión que presentan tejido necrótico contienen altos niveles de microorganismos aerobios y anaerobios al compararse con las úlceras no necróticas; generalmente presentan un olor desagradable cuando los anaerobios invaden los tejidos. De ahí que una conducta a seguir para tratar las mismas es limpiar el tejido necrótico de la herida, produciendo una disminución de presencia anaerobia.

Las infecciones de las úlceras por presión son típicamente polimicrobianas y pueden contener Estreptococos piógenes, enterococos, estreptococos anaerobios, Enterobactereace, Pseudomonas auriginosas, Bacteroides fragilis y Estafilococos áureos.

Tipos de heridas

Etapa I de la úlcera por presión: El eritema permanente de la piel intacta, se considera como una lesión que anuncia la ulceración de la piel.

Etapa II de la úlcera por presión: Pérdida parcial del espesor de la piel que implican la epidermis y/o la dermis. La úlcera es superficial y se presenta clínicamente en forma de una quemadura, ampolla o cráter poco profundo. Como la epidermis puede estar interrumpida por una quemadura, ampolla o cráter poco profundo, la úlcera debe ser evaluada basada en signos de infecciones secundarias.

Etapa III: Pérdida completa del espesor de la piel que comprende daño o necrosis del tejido subcutáneo que puede extenderse hasta la capa que está por debajo pero no atraviesa el estrato. La úlcera se presenta clínicamente como un cráter profundo con o sin compromiso del tejido adyacente.

Etapa IV: Pérdida del espesor total de la piel con destrucción extensa, necrosis del tejido o daño al músculo, hueso o estructuras de soporte, tales como los tendones o cápsulas articulares.

Sitios de las bacterias

Existen tres estados microbiológicos posibles en una herida: contaminación, colonización e infección. La contaminación está caracterizada por la simple presencia de microorganismos en la herida pero sin proliferación. Se ha aceptado de forma general que todas las heridas, independientemente de su etiología, están contaminadas. La colonización está caracterizada como la presencia y proliferación de microorganismos en la herida sin reacción del hospedero. La colonización es un trastorno común en las heridas crónicas tales como úlceras venosas y úlceras por presión y no retrasan necesariamente el proceso de curación. Cuando las bacterias invaden los tejidos sanos y continúan proliferándose hasta el punto en que su presencia facilita o invade masivamente la respuesta inmune del hospedero, a este estado microbiano se le conoce como infección. Los signos y síntomas clásicos de infección incluyen enrojecimiento, dolor e inflamación local, fiebre y cambios en la cantidad y carácter de los exudados de la herida.

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Infecciones pulmonares

Los compuestos de la invención también son apropiados para tratar a pacientes que tienen enfermedades infecciosas pulmonares mediante la administración al sujeto de un compuesto de la invención e irradiando (o sea, iluminando) el pulmón con luz que tenga un ancho de onda que cause que el compuesto produzca un efecto antimicrobiano. La infección pulmonar puede ocurrir con una variedad de géneros y especies de bacterias, la cuales incluyen la Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis), Pseudomonas (causa primaria de muerte de los pacientes de fibrosis quística), el Estreptococo, el Staphilococcus pneumoniae, la Klebsiella, el Toxoplasma, etc. La infección pulmonar puede ocurrir con una variedad de cepas de virus y agentes patógenos oportunistas (hongos, parásitos). Como los agentes patógenos pulmonares son cada vez más resistentes a las terapias clásicas con antibióticos, la terapia fotodinámica ofrece un método alternativo para eliminar a estos dañinos organismos.

El compuesto de la invención puede ser suministrado al pulmón en una variedad de formas. Por ejemplo, el compuesto puede ser suministrado a través del tracto respiratorio (o sea, intratraquealmente, intrabronquialmente o intraalveolarmente) o a través de la pared toráxica. La fuente de luz puede aplicarse a través de estas vías, así como con la ayuda de fibras ópticas flexibles, por ejemplo. La iluminación/irradiación puede ser dirigida a la base del pulmón, al ápice del pulmón o a ambos.

Indicaciones adicionales

Los compuestos de la invención son también adecuados para el tratamiento curativo y/o profiláctico de lo siguiente:

Infecciones de los sitios de quemaduras e injertos de piel; otitis (infección del oído), conjuntivitis bacteriana y otras infecciones oculares, periodontitis y otras infecciones dentarias y huesos infectados expuestos durante procedimientos quirúrgicos.

De esta forma, otros aspectos adicionales de la invención proporcionan lo siguiente:

(i)

Uso de un compuesto de la invención en la preparación de un medicamento para usarse en la terapia fotodinámica;

(ii)

Uso de un compuesto de la invención en la preparación de un medicamento para destruir y/o prevenir el crecimiento de microorganismos, tales como bacterias, levaduras, hongos y virus (por ejemplo, el medicamento puede ser usado para prevenir o reducir la proliferación o transferencia de ese elemento patógeno a otros sujetos, por ejemplo, pacientes, trabajadores de la salud, etc.);

(iii)

El uso de un compuesto de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento curativo y/o profiláctico en una infección dermatológica;

(iv)

El uso de un compuesto de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento curativo y/o profiláctico de una infección pulmonar; y

(v)

El uso de un compuesto de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento curativo y/o profiláctico de una herida infectada y/o una úlcera,

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También están descritos en la presente solicitud:

(i)

Un método para tratar a un paciente que necesita un tratamiento de un agente terapéutico fotodinámico que incluye la administración al paciente de un compuesto de la invención y la iluminación/irradiación del compuesto; y

(ii)

Un método para prevenir la infección de una herida que incluye el contacto de la herida con un compuesto de la invención y la iluminación/irradiación del compuesto (de tal manera que se generen especies reactivas al oxígeno).

Al usarse, los compuestos fotosensibles de la invención son iluminados/irradiados, o sea, activados, usando técnicas convencionales conocidas en el campo de la terapia fotodinámica. Preferiblemente, los compuestos son iluminados/irradiados a una longitud de onda entre 400 nm y 800 nm. Más preferiblemente, los compuestos son iluminados/irradiados a una longitud de onda en correspondencia con uno o más portales de absorción de la porfirina, que se encuentra alrededor de los 417 nm (Banda de Soret), 485 nm, 515 nm, 550 nm, 590 nm y 650 nm. Más preferiblemente, los compuestos son iluminados/irradiados a una longitud de onda de aproximadamente 417 nm.

La longitud de onda óptima dependerá del compuesto en particular y la indicación para la cual es utilizado. Por ejemplo, para el impétigo, una longitud de onda de 510 a 560 nm es preferible debido al color de la lesión. Para las heridas abiertas, una longitud de onda de 560 a 700 es preferible, con preferencia por las longitudes de onda más altas, con el fin de minimizar la activación de la hemoglobina (mínimo de 690 nm).

Los expertos en la técnica apreciarán que la iluminación/irradiación puede tener lugar en varios momentos diferentes después de la aplicación del compuesto de la invención. Típicamente, el compuesto es iluminado/irradiado entre 5 minutos y 24 horas después de su aplicación, por ejemplo, entre 5 minutos y 2 horas o entre 10 minutos y 1 hora. Los tiempos de iluminación óptima pueden determinarse mediante la experimentación.

En los casos en que el compuesto de la invención es aplicado a la piel, la longitud de onda de luz puede ser seleccionada de manera que controle la profundidad de penetración. Por ejemplo, para una penetración profunda se prefieren longitudes de onda más largas. La intensidad de la luz y la dosis de luz total pueden también variarse para controlar la profundidad de la penetración.

Preferiblemente, el agente terapéutico fotodinámico solo penetra el estrato corneal.

De la misma forma, la duración óptima de la exposición del compuesto a la iluminación/irradiación dependerá del compuesto en particular y de para qué se haya indicado. Típicamente, sin embargo, el tiempo de iluminación está entre 1 y 30 minutos, más preferiblemente entre 5 y 20 minutos, por ejemplo, 10 minutos.

La cantidad total de iluminación/radiación variará según el tratamiento y la localización de los tejidos a tratar. Generalmente, la cantidad de iluminación/radiación está entre 10 a 1000 J/cm^{2}, preferiblemente entre 10 y 350 J/cm^{2}.

Las fuentes de energía apropiadas incluyen lámparas PDT 450L, PDT 650L y PDT 1200 de Waldmann AG, Alemania. Alternativamente, se puede usar luz blanca para la activación del compuesto.

Los compuestos de la invención pueden también utilizarse para destruir microorganismos in Vitro. De esta forma, otro aspecto de la invención proporciona una solución esterilizante que contiene un compuesto según el primer y/o segundo aspectos de la invención. La solución también puede tomar la forma de un enjuague bucal o un concentrado que debe ser diluido antes de usarse.

Preferiblemente, el compuesto de la invención está presente en la solución en una concentración de 1 a 100 \mug/ml.

Preferiblemente, la solución contiene además un agente tensoactivo o surfactante. Los surfactantes apropiados incluyen los surfactantes aniónicos (por ejemplo, un sulfonato alifático), surfactantes anfotéricos y/o zwiteriones (por ejemplo, derivados de compuestos alifáticos cuaternarios amónicos, fosfónicos y sulfónicos) y surfactantes noniónicos (por ejemplo, alcoholes alifáticos, ácidos, amidas o alquilfenoles con óxidos alquilenos).

Convenientemente, el agente tensoactivo está presente en una concentración de 0,5 hasta 5 por ciento de peso ponderal.

Las soluciones esterilizantes de la invención son particularmente apropiadas para usarse en el medio hospitalario. Por ejemplo, las soluciones esterilizantes pueden usarse para esterilizar instrumentos quirúrgicos y superficies del salón de operaciones, así como las manos y guantes del personal del quirófano. Además, las soluciones esterilizantes pueden usarse durante la cirugía, por ejemplo para esterilizar los huesos expuestos. En todos los casos, la solución es aplicable a la superficie que se va a esterilizar y posteriormente iluminar/irradiar de manera que produzca especies reactivas al oxígeno (véase más abajo).

De ahí que, otro aspecto de la invención proporciona un método para destruir microorganismos in Vitro que incluye poner en contacto a los microorganismos que se van a destruir con el compuesto de la invención e iluminar/irradiar el compuesto.

Realizaciones preferidas de la invención, no limitantes, serán descritas a continuación a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos que las acompañan, en los cuales:

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la estructura de la piel.

La Figura 2 muestra la inhibición del crecimiento (%) de (A) las células del Estafilococo áureo BAA-44 y (B) las células de la E. coli ATCC 25922 iluminadas con luz blanca (150 mW/cm^{2}) durante 0 a 30 minutos posterior a la preincubación durante 5 minutos con un compuesto de prueba en una concentración de 3 \muM.

La Figura 3 muestra la supervivencia bacteriana (número de células) de (A) las células del Estafilococo áureo BAA-44 y (B) la E. coli ATCC 25922 después de la incubación con un compuesto de prueba en una concentración de 0,1 \muM e iluminación con luz ("toxicidad en la luz", o sea, actividad fotodinámica) o no iluminación ("toxicidad en la oscuridad").

La Figura 4 muestra la actividad fotodinámica (barras abiertas) y toxicidad en la oscuridad (barras sombreadas) de (A) "el Compuesto 8" y (B) "el Compuesto 10" contra el Estafilococo áureo BAA-44 en dosis variables.

La Figura 5 muestra los efectos de la azida sódica (50 mM) y el D_{2}O en las células de los fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) incubadas con el Compuesto 10, con o sin iluminación, usando una fuente de luz (236, Waldmann). Triángulos/línea continua: Compuesto 10 + buffer PBS + luz; Cuadrados/línea continua: Compuesto 10 + D_{2}O + luz;
Círculos/línea continua: Compuesto 10 + azida sódica + luz; los triángulos/línea de puntos: Compuesto 10 + buffer PBS con/sin luz; los cuadrados/línea de puntos: compuesto 10 + D_{2}O con/sin luz; los círculos/línea de puntos: Compuesto 10 + azida sódica con/sin luz. (n=3, media \pm Desv. estándar).

La Figura 6 muestra la ausencia de resistencia creada por el Estafilococo áureo BAA-44 posterior a tratamientos repetidos con el Compuesto 10. Los datos medios muestran con barras límites de confianza del 95% con respecto al margen de error.

La Figura 7 muestra una comparación de supervivencia de clones expuestos nueve veces a tratamientos PDT con el Compuesto 10 y clones vírgenes, sin tratar.

La Figura 8 muestra la toxicidad del "Compuesto 8" contra los fibroblastos humanos (barras sombreadas) y el Estafilococo áureo BAA-44 (barras abiertas) en dosis variadas.

La Figura 9 muestra un dibujo dimensional de una fuente de luz 236 (Waldmann).

La Figura 10 muestra un foto decoloración de 10 \muM del Compuesto 10 iluminado durante tiempos variados con una luz azul a (A) 15 mW/cm^{2} y (B) 150 mW/cm^{2}.

La Figura 11 muestra la estabilidad química del Compuesto 10 formulado (A) como un sólido, (B) en agua y (C) en PBS.

La Figura 12 muestra una representación gráfica en 3D de la estabilidad (medida por HPLC) del Compuesto 10 después de 21 días en un buffer PBS.

La Figura 13 muestra la estabilidad durante 8 semanas de varias formulaciones (A) del Compuesto 1, (B) del Compuesto 8, (C) del Compuesto 12 y (D) del Compuesto 10.

La Figura 14 muestra la estabilidad extendida durante 17 semanas de varias formulaciones (A) del Compuesto 10 y (B) del Compuesto 8.

La Figura 15 muestra la distribución fluorescente intracelular de las células NHDF incubadas después de la cotinción (A) con el tinte específico para lisosomas Lyso Tracker Green (verde) y (B) Rodamina G6 específica para mitocondrias (rojo).

La Figura 16 muestra la distribución fluorescente intracelular de las células NHDF incubadas con 1 \muM del Compuesto 10 durante 1 hora posterior a la cotinción con (A) Rodamina G6 específica para mitocondrias y (B) el tinte específico para lisosomas Lyso Tracker Green. La fluorescencia del Compuesto 10 es localizada extra-nuclearmente y la cotinción con Rodamina G6 específica para mitocondrias trajo como resultado una colocalización del Compuesto 10 y la fluorescencia de la mitocondria. La colocalización es absorbida en la fluorescencia amarilla. La cotinción con el tinte específico para lisosomas Lyso Tracker Green trajo como resultado una localización diferente del Compuesto 10 (rojo) y fluorescencia de lisosomas (verde) (Figura 16B). La colocalización está representada por la fluorescencia amarilla.

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Ejemplos Ejemplo A Síntesis de compuestos a modo de ejemplo Materiales y métodos Mediciones - NMR

Los espectros del protón de NMR fueron registrados en un instrumento Broker B-ACS60 (300 MHz) usando TMS como estándar interno. Los cambios químicos se dan en ppm y las constantes de acoplamiento en Hz en el solvente indicado. Algunas abreviaturas para NMR: singlete (s), singlete amplio (bs), doblete (d), triplete (t), cuarteto (q), quinteto, multiplete (m).

Productos químicos

Todos los solventes y reactivos fueron comprados a Aldrich, Fluka, Merck y Lancaster y usados sin ninguna purificación adicional.

El dipirrolmetano fue preparado según lo descrito por C. Broker et al., J. Porphyrins Phthalocyanines, 2 455 (1998).

Cromatografía

La cromatografía en columna fue llevada a cabo usando gel de sílice (Merck Silicagel 60, Fluka 60; 0,040-0,063 mm) y Sephadex LH-20 (Pharmacia). Todos los solventes (Synopharm) para la cromatografía se encontraban en grado técnico puro.

Abreviaturas

DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona

DMF: N,N-dimetilformamida

TFA: Acido trifluoroacético

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Vías de síntesis para la prueba de los compuestos

Fueron sintetizados los siguientes compuestos de prueba:

Compuestos de la invención a modo de ejemplo

Compuestos 6, 8 hasta el 10, 12, 23, 25, 28, 31 y 32.

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Compuestos de referencia (para usarse como controles comparativos)

Compuestos 1, 3, 16, 19, 26, 29, 33, 36, 37, 39, 41 y 46 hasta el 51.

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Compuestos químicos intermedios

Compuestos 2, 4, 5, 7, 11, 13 hasta el 15, 17, 18, 20 hasta 22, 24, 27, 30, 34, 35, 38, 40 y 42 hasta el 45.

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Compuesto 1

Tetracloruro de 5,10,15,20-tetrakis-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

16

A una suspensión agitada vigorosamente de 5,10,15,20-tetrakis-(4-hidroxifenil)-porfirina (50 mg, 0,07 mmol) y K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) en DMF (20 ml), se le adiciona una solución de (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (0,27 g; 1,05 mmol) en DMF (5 ml) gota a gota a 50ºC durante 30 minutos. La mezcla es agitada a 50ºC durante 15 horas. Después de extraer el DMF a presión reducida, se disuelve el residuo obtenido en metanol (5 ml) y se filtra a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita de acero (diámetro 3,5 cm). Después de lavar con metanol (1 l), la capa es eluída con ácido acético. Después de la evaporación del solvente del eluato, el residuo obtenido es purificado mediante cromatografía en una columna (2,5 X 40 cm) de Sephadex LH20 eluyéndolo con n-butano:agua:ácido acético (4:5:1, por vol, de fase superior). El material recuperado es disuelto en un volumen mínimo de metanol y la solución es pasada por una columna corta (3,5 X 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). La sal de tetracloruro recuperada es secada a alto vacío y obtenida en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 2,35-2,50 (bs, 8 H), 3,25-3,35 (bs, 36 H), 3,65-3,75 (bs, 8 H), 4,35 (m, 8 H), 7,30, 8,10 (2 x d, ^{3}J 8,5 Hz, 16 H), 8,80-9,00 (bs, 8 H).

Compuesto 2

5, 10, 15-tris-(4-hidroxi-fenil)-20-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

17

A una suspensión agitada vigorosamente de 5,10,15,20-tetrakis-(4-hidroxifenil)-porfirina (400 mg, 0,59 mmol) y K_{2}CO_{3} (1,0 g, 7,1 mmol) en DMF (75 ml), se le adiciona una solución de 1-bromoundecano (0,1 ml, 0,45 mmol) en DMF (10 ml) gota a gota a 50ºC durante 30 minutos y la mezcla es agitada a la misma temperatura durante 1,5 horas. Después de extraer por filtrado el K_{2}CO_{3} y extraer a presión reducida el DMF, el residuo obtenido es disuelto en diclorometano (200 ml), lavado con agua (3x150 ml) y la solución es secada (Na_{2}SO_{4}). El solvente es evaporado a presión reducida y el residuo obtenido es disuelto en tolueno: etanol (5:1 en vol., ca. 10 ml) y purificado por cromatografía usando una columna (5x50 cm) de gel de sílice (Merck 60). La columna es eluída con tolueno seguido por tolueno:acetato de etilo (2:1 en vol.) y el material deseado recuperado por evaporación del solvente de las fracciones apropiadas es secado a alto vacío. El producto es obtenido en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, d6-acetona): 0,95 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,25-1,55 (m, 14 H), 1,58 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,85 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,16 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,20 (d, ^{3}J 8,1 Hz, 2 H), 7,25 (d, ^{3}J 8,2 Hz, 6 H), 8,00-8,15 (m, 8 H), 8,80-9,10 (m, 8 H).

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Compuesto 3

Tricloruro de 5,10,15-tris-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-20-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

18

A una suspensión agitada vigorosamente del Compuesto 2 (100 mg, 0,12 mmol) y K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) en DMF (30 ml), se le adiciona una solución de (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (0,3 g, 16,6 mmol) en DMF (10 ml) a 50ºC y la mezcla es agitada a esta temperatura durante 12 horas. Después de extraer el DMF a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y filtrado a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita de acero (de 3,5 cm de diámetro). Después de lavado con metanol (ca. 1 l), la capa es eluída con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente del eluato a presión reducida, se purifica el residuo obtenido por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluyéndolo con n-butanol: agua: ácido acético (5:4:1, en vol., fase superior). Después de extraer el solvente de las fracciones adecuadas del eluato a presión reducida, se disuelve el residuo obtenido en metanol (5 ml) y se pasa la solución por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, en forma de cloruro). El producto final es obtenido en forma de sal de tricloruro, después de la extracción del solvente y el secado a alto vacío, en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,80 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,15-1,45 (m, 16 H), 1,50-1,60 (bs, 2 H), 2,25-2,45 (bs, 6 H), 3,25-3,35 (bs, 27 H), 3,75-3,85 (bs, 6 H), 4,18 (t, ^{3}J 7.5 Hz, 2 H), 4,40-4,45 (bs, 6 H), 7,20-7,40, 7,95-8,15 (2 x m, 16 H), 8,60-9,00 (bs, 8 H).

Compuesto 4

5-(3, 5-Dimetoxi-fenil)-15-undecil-porfirina

19

A una solución de dipirrolmetano (0,62 g, 4,2 mmol) agitada en diclorometano (5 ml) se le añade 3,5-dimetil-oxibenzaldehído (0,35 g, 2,1 mmol) y se añade dodecanal (0,464 g, 2,52 mmol) en diclorometano desgasificado
(1 l). Se adiciona TFA (0,07 mL, 3,0 mmol) gota a gota. La solución es agitada a temperatura ambiente en la oscuridad durante 17 horas en argón. Después de adicionar el DDQ (2,7 g, 12 mmol), la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante otra hora. Al efectuar la purificación del material recuperado después de la extracción del solvente a presión reducida por cromatografía en una columna (400 g) de gel de sílice (Merck 60) con tolueno para la elución se obtiene el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\deltaH (300 Mz, CDCl_{3}): 0,80 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,10-1,25 (m, 12 H), 1,40 (m, 2H), 1,75 (quint,, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 2,45 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 3,90 (s, 6H), 4,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 6,80 (m, 1H), 7,35 (m, 2 H), 9,00, 9,25, 9,30, 9,50 (4 x d,, ^{3}J 4,7 Hz, 4 x 2 H), 10,15 (s, 2H).

Compuesto 5

5-(15-Undecil-porfirin-5-il)-benceno-1,3-diol

20

A una solución del Compuesto 4 (80 mg, 0,133 mmol) en diclorometano anhidro (80 ml) en una atmósfera de argón, se le añade BBr_{3} (5 ml, 1M en diclorometano) gota a gota a -70ºC y la mezcla es agitada durante 1 hora a esta temperatura y después entibiada hasta alcanzar la temperatura ambiente y agitada durante la noche. La mezcla es enfriada hasta -10ºC e hidrolizada mediante la adición de agua (2 ml) y agitada durante 1 h. Se añade NaHCO_{3} (3 g) directamente para neutralizar. La mezcla es agitada durante otras 12 h y después de la filtración del NaHCO_{3} y de extraer el diclorometano al vacío, el residuo obtenido es purificado por una cromatografía de columna usando gel de sílice con diclorometano. Después de evaporar el solvente de las fracciones apropiadas combinadas y de secar el residuo obtenido a alto vacío, el producto es obtenido en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, d6-acetona): 0,75 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,05-1,25 (m, 12 H), 1,30-1,40 (m, 2H), 1,45-1,50 (m, 2 H), 2,40 (quint, ^{3}J 7.5 Hz, 2 H), 4,90 (t, ^{3}J 7.5 Hz, 2 H), 6,65 (m, 1 H), 7,18 (m, 2 H), 8,60-8,65, 9,00-9,05, 9,35-9,40, 9,55-9,60 (4 x m, 8 H), 10,25 (s, 2H).

Compuesto 6

Dicloruro de 5-[3,5-bis-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15-undecil-porfirina

21

A una suspensión agitada vigorosamente del Compuesto 5 (80 mg, 0,14 mmol) y K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) en DMF (30 ml) se adiciona (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (0,3 g, 16,6 mmol) a 50ºC. La mezcla se agita a esta temperatura durante 18 h. Después de extraer el DMF a presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 ml) y se filtra a través de una capa de gel de sílice (2 cm de profundidad) soportada en una frita (de 3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 1 l), el producto crudo es eluído con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Se recogen las fracciones apropiadas y, después de la evaporación del solvente a baja presión, se purifica el residuo obtenido por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluyéndolo con n-butanol: agua: ácido acético (5:4:1, en vol., fase superior). Después de extraer el solvente de las fracciones apropiadas a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y la solución es pasada por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Después de recoger el eluato, se extrae el solvente a presión reducida y el residuo obtenido se seca a alto vacío hasta obtener la sal de dicloruro en forma de cristales violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CD_{3}OD): 0,75 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,05-1,20 (m, 14 H), 1,45-1,50 (m, 2 H), 2,05-2,15 (m, 4 H), 2,15-2,20 (m, 2H), 2,95 (s, 18 H), 3,35-3,45 (m, 4 H), 3,95 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 4,55 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 6,85 (m, 1 H), 7,35 (m, 2 H), 8,85-8,90, 9,15-9,20, (3 x m, 8 H), 10,10 (s, 2 H).

Compuesto 7

5,15-bis-[4-(3-Bromo-propiloxi)-fenil]-porfirina

22

A una solución agitada de dipirrolmetano (0,61 g, 4,1 mmol) y 4-(3-bromopropiloxi)-benzaldehído (1,03 g, 4,2 mmol) en diclorometano desgasificado (1 l), se le añade TFA (0,07 ml, 1,5 mmol) gota a gota. Se agita la solución a temperatura ambiente en la oscuridad en argón durante 17 h. Después de agregarle el DDQ (2,76 g, 0,012 mol), la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante otra hora. Al realizar el filtrado a través de gel de sílice (Fluka 60, 100 g) usando diclorometano para la elución, se obtiene un producto crudo, a partir del cual, después de la recristalización a partir del diclorometano:n-hexano, se obtiene el producto puro en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, C_{6}D_{6}): -3,15 (2 H, s), 2,00 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 3,30 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 3,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 7,15-7,18, 7,95-8,15 (2 x m, 2 x 4 H), 9,15-9,20,(m, 8 H), 10,05 (s, 2H).

Compuesto 8

Dicloruro de 5,15-bis-(4-{3-[(3-Dimetilamino-propil)-dimetil-amonio]-propiloxi}-fenil)-porfirina

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23

El Compuesto 7 (200 mg, 0,27 mmol) es disuelto en DMF absoluto (40 ml) con N, N, N', N'-tetrametil-1,3-propanodiamina (5 ml, 13,9 mmol) y la solución es agitada a 50ºC en argón durante la noche. Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y la solución es filtrada a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). La capa es eluída con metanol (ca. 1 l) seguido por ácido acético:metanol:agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente de las fracciones apropiadas, el producto crudo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y posteriormente purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 usando n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1, en vol., fase superior) como fase en desarrollo. La primera fracción eluída es el producto deseado. Después de extraer el solvente a baja presión, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y pasado por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Después de extraer el solvente del eluato a presión reducida, el residuo es cristalizado a partir del dietil-éter y secado a alto vacío para obtener el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 2,20-2,35 (m, 4 H), 2,40-2,50 (m, 4 H), 2,80 (s, 12 H), 3,05 (4 H, t, ^{3}J 7,8, 2 H), 3,25 (s, 12 H), 3,45-3,55 (bs, 4 H), 3,65-3,75 (m, 4 H), 4,30 (t, ^{3}J 4,2 Hz, 4 H), 7,40, 8,10 (2 x d, ^{3}J 7,5 Hz, 2 x 4 H), 8,95, 9,45 (2x d, ^{3}J 4,2 Hz, 8 H), 10,40 (s, 2 H).

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Compuesto 9

Dicloruro de 5,15-bis-[4-(3-Trietilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

24

A una solución del Compuesto 7 (50 mg, 0,068 mmol) en DMF absoluto (20 ml) se adiciona trietilamina (4,7 ml, 0,034 mol, 500 eq,). La mezcla es agitada a 60ºC durante 24 h. El solvente es extraído a presión reducida y el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y filtrado a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita (de 3,5 cm de diámetro). Después de lavar con metanol (ca. 1 L), la capa es eluída con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente de la fracción eluída, el producto crudo es disuelto en metanol (5 ml) y purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, eluyéndolo con n-butano: agua: ácido acético (4:5:1, en vol., fase superior). Los solventes son extraídos a baja presión de las fracciones apropiadas, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y la solución es pasada por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro), para obtener el producto en forma de un sólido violeta después de la evaporación del solvente.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CD_{3}OD): 1,25 (m, 18H), 2,13 (m, 4H), las señales para - CH_{2}NCH_{2} (16H) se encuentran en el área de 3,00-3,40 como parte de un multiplete cubierto por las señales de los solventes, 4,15 (t, 4H, 3J = 7,5 Hz), 7,36 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz ), 8,15 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz), 9,05 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz), 9,54 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz), 10,45 (s, 2H)

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Compuesto 10

Dicloruro de 5,15-bis-[4-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

25

Se transfiere una solución del Compuesto 7 (300 mg, 0,41 mmol) en DMF absoluto (50 ml) a una autoclave de 100 ml. Después de adicionar trimetilamina (4,5 g), la mezcla es agitada a 50ºC durante 16 h. Después de la evaporación del solvente, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y la solución es filtrada a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita (de 3,5 cm de diámetro). Después del lavado con metanol (ca. 1 L) se eluye la capa con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente de las fracciones apropiadas, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, eluyéndolo con n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1, en vol., fase superior). Se obtienen dos fracciones, la primera elución de estas fracciones es el producto deseado. El solvente es extraído a presión reducida y el residuo obtenido se vuelve a disolver en metanol (5 ml) y la solución es pasada por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo es cristalizado a partir del metanol: dietil-éter y secado a un gran vacío para producir el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CD_{3}OD): 2,40-2,60 (m, 4 H), 3,30-3,25 (bs, 18 H), 3,75-3,80 (m, 4 H), 4,40 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 7,40, 8,20 (2 x d, ^{3}J 8,5 Hz, 8 H), 9,05, 9,50 (2 x d, ^{3}J 4,5 Hz, 8 H), 10,45 (s, 2 H).

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Compuesto 11

5,15-bis-[3-(3-tromo-propiloxi)-fenil]-porfirina

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26

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A una solución agitada de dipirrolmetano (1,22 g, 8,2 mmol) y 3-(3-bromo-propiloxi)-benzaldehído (2,06 g, 8,2 mmol) en diclorometano desgasificado (2 l), se le adiciona TFA (0,14 ml, 3 mmol) gota a gota. La solución es agitada a temperatura ambiente en la oscuridad en argón durante 17 h. Después de añadir DDQ (5,4 g, 0,024 mol), la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante otra hora. Después de extraer los solventes a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en diclorometano (5 ml) y pasado por una columna (300 g) de silicio (Fluka 60) usando diclorometano como eluente para producir el producto crudo que es cristalizado a partir del diclorometano: metanol para producir el material puro en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}): -3,20 (2 H, s), 2,40 (quint, ^{3}J 7.5 Hz, 4 H), 3,65 (t, ^{3}J 7.5 Hz, 4H), 4,25 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 7,20-7,25, 7,60-7,65, 7,75-7,80 (3 x m, 8 H), 9,05, 9,25, (2 x d, ^{3}J 4,2 Hz, 8 H), 10,25 (s, 2 H).

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Compuesto 12

Dicloruro de 5,15-bis-[3-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

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27

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Una solución del Compuesto 11 (400 mg, 0,543 mmol) en DMF (50 ml) es transferida a una autoclave de 100 ml. Después de la adición de trimetilamina (6,3 g), la mezcla es agitada a 50ºC durante 8 h. Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y la solución es filtrada a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita (de 3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 1 L), el eluato con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, por vol) proporciona fracciones que, después de la evaporación del solvente a presión reducida, producen un residuo sólido. Este es disuelto en metanol (5 ml) y purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, eluyéndolo con n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1, en vol., fase superior). Se eluyen dos fracciones de la columna, la primera de las cuales es el producto deseado. Después de extraer el solvente a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol
(5 ml).

La solución es pasada por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro), el solvente es extraído a presión reducida y el producto crudo es cristalizado a partir del metanol: dietil-éter para producir cristales violetas los cuales son secados a alto vacío.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CD_{3}OD): 2,30-2.35 (m, 4 H), 3,15 (s, 18 H), 3,95-4,05 (m, 4 H), 4,20-4,25 (m, 4 H), 7,40-7.45, 7,65-7,70, 7,80-7,85 (3 x m, 8 H), 9,00-9,05, 9,40-9,45, (2 x m, 8 H), 10,40 (m, 2 H).

\newpage

Compuesto 13

5,15-bis-(4-Hidroxi-fenil)-10,20-bis-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

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28

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La tercera fracción eluída de la columna durante la separación cromatográfica descrita para la síntesis del Compuesto 2 está caracterizada como 5,15-bis-(4-hidroxi-fenil)-10,20-bis-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CDCl_{3}): -2,88 (2 H, s), 0,85 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 6 H), 1,20-1,40 (m, 28 H), 1,55 (br m, 4 H), 1,80 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 4,15 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 6,65, 7,15 (d, ^{3}J 8,1 Hz, 8 H), 7,80, 8,00 (d, ^{3}J 8,1 Hz, 8 H), 8,75-8,80 (m, 8 H). La geometría del trans-Regioisómero es asignada por ^{1}H-^{13}C-2D-NMR en d-ácido acético.

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Compuesto 14

5, 10-bis-(4-Hidroxi-fenil)-15,20-bis-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

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29

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La cuarta fracción eluída de la columna durante la separación cromatográfica descrita para la síntesis del Compuesto 2 está caracterizada por 5,10-bis-(4-hidroxifenil)-15,20-bis-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CDCl_{3}): -2,80 (2 H, s), 0,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 6 H), 1,20-1,60 (m, 28 H), 1,65 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 2,00 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 4,22 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 4 H), 7,15 (d, ^{3}J 8,1 Hz, 4 H), 7,25 (d, ^{3}J 8,2 Hz, 4 H), 8,10 (d, ^{3}J 8,2 Hz, 4 H ), 8,15 (d, ^{3}J 8,2 Hz, 4 H), 8,80-8,90 (m, 8 H).

La geometría del cis-Regioisómero es asignada por 1H-^{13}C-2D-NMR en ácido d-acético.

\newpage

Compuesto 15

5,10,15-tris-[4-(3-Bromo-propiloxi)-fenil]-20-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

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30

En una atmósfera de argón, el Compuesto 2 (200 mg, 0,24 mmol) es disuelto en DMF absoluto (40 ml) en presencia de K_{2}CO_{3} (500 mg) y 1,3-dibromopropano (1,02 ml, 10 mmol). La mezcla es calentada durante toda la noche a 80ºC. El procedimiento es igual al procedimiento dado para el Compuesto 2 descrito anteriormente. El producto es purificado por cromatografía de columna en gel de sílice (Merck 60) eluyendo con hexano: acetato de etilo (5:1, en vol.).

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CDCl_{3}): -2,75 (2 H, s), 0,85 (t, 3J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,45 (m, 14 H), 1,50 (quint, 3J 7,5 Hz, 2 H), 1.90 (quint, 3J 7,5 Hz, 2 H), 2,40 (quint, 3J 7,4 Hz, 6 H), 3,65 (t, 3J 7,4 Hz, 6 H), 4,16 (t, 3J 7,5 Hz, 2 H), 4,25 (t, 3J 7,5 Hz, 6 H), 7,18-7,20 (m, 8 H), 8,00-8,05 (m, 8 H), 8,75-8,85 (m, 8 H).

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Compuesto 16

Tricloruro de 5,10,15-bris-[4-(3-Trietilamonio-propiloxi)-fenil]-20-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

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31

El Compuesto 15 (200 mg, 0,17 mmol) es disuelto en DMF absoluto (40 ml) con trietilamina (5 ml, 34,5 mmol, 208 eq.). La mezcla es calentada hasta los 50ºC durante 48 h. Después de extraer el DMF al vacío, el residuo obtenido es disuelto en metanol y purificado por cromatografía de columna usando gel de sílice (Merck, 60) eluyendo con metanol: agua: ácido acético (2:1:3, en vol.) y entonces ácido acético: piridina (1:1, en vol.). Al efectuarse la extracción del solvente de las fracciones apropiadas al vacío se obtiene un producto crudo el cual es disuelto en metanol: NaCl acuoso (1M) (5 ml. 1:1, en vol.). La mezcla es agitada durante 30 minutos y filtrada a través de una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita (de 3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (200 ml), éste es eluído con metanol: agua: ácido acético (2:1:3, por vol). Después de la evaporación del solvente de las fracciones combinadas apropiadas, el residuo obtenido es disuelto en metanol (2 ml) y se añade diclorometano (5 ml) gota a gota. El gel blanco precipitado se recoge mediante el filtrado y el solvente se extrae a alto vacío.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,45 (m, 43H), 1,45-1,65 (bs, 2 H), 2,25-2,40 (bs, 6 H), 3,35-3,45 (bs, 24 H), 3,50-3,60 (bs,, 6 H), 4,25 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,40-4,45 (bs, 6 H), 7,25-7,40, 8,10-8,20 (m, 16 H), 8,80-9,10 (bs, 8 H).

\newpage

Compuesto 17

5-[4-(3-Hidroxi-fenil)]-15-(3-undeciloxi-fenil)-porfirina

32

Se disuelve 5-15-bis-(3-Hidroxi-fenil)-porfirina (Wiehe, A., Simonenko, E. J., Senge, M. O. and Roeder, B. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines 5, 758-761 (2001)) (86 mg, 0,17 mmol) y se realiza la suspensión de K_{2}CO_{3} (250 mg, 7,1 mmol) en DMF (40 ml). A la mezcla agitada vigorosamente se le añade una solución de 1-bromoundecano (0,04 ml, 0,17 mmol) en DMF (5 ml) gota a gota a 50ºC durante 30 minutos y la mezcla es calentada a esa temperatura durante 1 h. Después de extraer el K_{2}CO_{3} por filtración, se extrae el DMF a alto vacío. El residuo obtenido es purificado por cromatografía de columna usando gel de sílice (Merck 60) eluyéndolo con n-hexano: acetato de etilo (10:1, por vol). La 2da fracción es recogida y secada a alto vacío para obtener el producto.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3)}: -3,15 (2 H, s), 0,75 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,10-1,30 (m, 14 H), 1,35 (m, 2 H), 1,80 (quint, 3J7,5 Hz, 2 H), 4,05 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 6,85-6,90, 7,20-7,25, 7,35-7,45, 7,50-7,65, 7,75-7,80 (5 x m, 8 H), 8,85, 8,95, 9,10, 9,20 (4 x d, ^{3}J 4,9 Hz, 4 x 2 H), 10,15 (s, 2 H).

Compuesto 18

5, 10,15-tris-(3-Hidroxi-fenil)-20-(3-dodeciloxi-fenil)-porfirina

Se disuelve 3-Hidroxibenzaldehído (1,8 g, -14,8 mmol, 3 eq.) y 3-dodeciloxibenzaldehído (1,35 g, 4,9 mmol, 1 eq.) en una mezcla de ácido acético (145 ml) y nitrobenceno (98 ml, 960 mmol) y se calienta hasta 120ºC. Se añade pirrol (1,35 ml, 19,6 mmol, 4 eq.) en un resto y se agita la mezcla a 120ºC durante 1 h. Después de enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente, los solventes se extraen al vacío a 50ºC. El producto es aislado por cromatografía en una columna de sílica (500 g) usando tolueno como eluente. El producto deseado es obtenido como la quinta fracción de la columna y es recromatografiado usando una columna de sílica más pequeña (200 g) eluída con tolueno. El producto es obtenido como un sólido violeta después de la evaporación del solvente.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CDCl_{3}): 0,64 (t, 3 H, ^{3}J 6,8 Hz), 0,94-1,15 (m, 16 H), 1,25 (bs, 2 H), 1,62 (bs, 2 H), 3,90 (bs, 2 H), 6,33-6,95 (m, 8 H), 7,08-7,60 (m, 8 H), 8,20-8,47 (m, 4 H), 8,51-8,70 (m, 4 H)

Compuesto 19

5-{3-[bis-(2-Dietilamino-etil)-aminopropiloxi]-Fenil}-15-(3-undeciloxi-fenil)-porfirina

33

El Compuesto 17 (50 mg, 0,065 mmol) es disuelto con N,N,N',N'-tetraetildietilentriamina (1 ml, 39 mmol) en THF(10 ml) y la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 4 días. Después de la evaporación del solvente, el residuo es disuelto en éter dietílico (20 ml) y la solución es lavada con agua (5 x 30 ml). La fase orgánica es secada (Na_{2}SO_{4}) y concentrada a alto vacío. La mezcla es purificada por cromatografía de columna (gel de sílice, Merck 60) eluyéndola con n-hexano: acetato de etilo (5:1, en vol.) seguido por n-hexano: acetato de etilo: trietil amino (10:10:1, en vol.). Después de recoger las fracciones apropiadas y de extraer el solvente a presión reducida, se obtiene el producto puro por cristalización del residuo a partir de éter dietílico: metanol.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}): 0,80 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 0,9 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 12 H), 1,20-1,40 (m, 14 H), 1,45 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H),1,80 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,95 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H),2,40-2,60 (m, 16 H), 2,65 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,10 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,20 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,30-7,40, 7,55-7,65, 7,75-7,80 (3 x m, 8 H), 9,10-9,15, 9,20-9,25 (2 x m, 2 x 4 H), 10,15 (s, 2 H).

\newpage

Compuesto 20

5-[4-(3-Bromo-propiloxi)-fenil]-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina

34

A una solución agitada de dipirrolmetano (0,31 g, 2,1 mmol), 4-(3-bromo-propiloxi)-benzaldehído (0,27 g, 1,1 mmol) y 4-dodeciloxibenzaldehído (0,32 g, 1,1 mmol) en diclorometano desgasificado (500 ml) se añade TFA (0,035 ml, 1,5 mmol) gota a gota. La solución es agitada a temperatura ambiente en la oscuridad durante 17 h en argón. Después de adicionar DDQ (1,38 g, 6 mmol), la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante otra hora. La purificación por cromatografía de columna usando gel de sílice (Merck 60, 400 g) con tolueno como eluente proporciona el producto (2ª fracción) conjuntamente con el Compuesto 7 (3ª fracción).

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}): -3,15 (2 H, s), 0,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,40 (m, 16 H), 1,55 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,90 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 2,40 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2H), 3,75 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,20 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,35 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,20-7,30, 8,10-8,15 (2 x m, 8 H), 9,10-9,15, 9,25-9,30 (2 x m, 2 x 4 H), 10,20 (s, 2 H).

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Compuesto 21

5, 10, 15,20-tetrakis-(3-Hidroxi-fenil)-porfirina

Se disuelve 3-Hidroxibenzaldehído (0.910 g, 7,45 mmol) en ácido propiónico (50 ml) y se calienta hasta 140ºC. Se añade Pirrol (0,52 ml, 7,45 mmol) a un resto y la mezcla se calienta a reflujo durante 2 h. Se continúa agitando durante otras 12 h a temperatura ambiente. Se extrae el ácido propiónico al vacío y el residuo se disuelve en acetona y se purifica por cromatografía en una columna de sílica (250 g) la cual es eluída con tolueno conteniendo una proporción en continuo incremento de acetato de etilo. El producto es eluído con tolueno: acetato de etilo (6:1 en vol.). Se extrae el solvente al vacío para obtener el producto en forma de un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, d6-acetona): 7,18 (d, 4H, ^{3}J = 8,25 Hz), 7,49 (t, 4H, ^{3}J = 8,25 Hz), 7,56-7,62 (m, 8H), 8,81 (m, 8 H).

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Compuesto 22

5, 10,15-tris-[4-(3-Bromo-propiloxi)-fenil]-20-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina

35

A una solución agitada de pirrol (0,7 ml, 10 mmol), 4-(3-bromopropiloxi)-benzaldehído (1,8 g, 7,5 mmol) y 4-(n-dodeciloxi)-benzaldehído (0,725 g, 2,5 mmol) en diclorometano desgasificado (1 L) se añade TFA (0,085 ml, 10 mmol) gota a gota. La solución de reacción es agitada en argón a temperatura ambiente en la oscuridad durante 17 h. Después de adicionar DDQ (6,9 g, 30 mmol), la mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante una hora más. Los solventes son extraídos a presión reducida y el residuo es vuelto a disolver en tolueno. La purificación cromatográfica en una columna (3,5 x 30 cm) de gel de sílice (Merck 60) usando tolueno:n-hexano (1:4 en vol.) como eluente proporciona el producto crudo el cual es purificado por recristalización a partir del metanol: diclorometano, produciendo cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CDCl_{3}): 0,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,45 (m, 16 H), 1,60 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,90 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 2,50 (quint, ^{3}J 7,4 Hz, 6 H), 3,75 (t, ^{3}J 7,4 Hz, 6 H), 4,20 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,35 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 6 H), 7,25-7.30 (m, 8 H), 8,15-8,30 (m, 8 H), 8,80-8,85 (m, 8 H).

Compuesto 23

Cloruro de 5-{4-[3-Dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio-propiloxi]fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina

36

El Compuesto 20 (30 mg, 0,038 mmol) es disuelto con N,N,N',N'-tetrametil-1,3-propanodiamina (156 mg, 1,2 mmol) en THF: DMF(1:1 by vol., 20 ml) y agitado a 50ºC durante18 h. Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo es disuelto en diclorometano y purificado por cromatografía de columna (gel de sílice Merck 60) y se eluye con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de combinar las fracciones apropiadas y extraer el solvente a presión reducida, el residuo es cristalizado a partir del diclorometano: hexano para obtener el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}+1% ácido acético): 0,85 (m, 3 H), 1,20-1,40 (m, 18 H), 1,55-1,60 (m, 2 H), 1,60-1,65 (m, 4H), 2,10-2,20 (bs, 8 H), 3,15-3,25 (m, 8 H), 3,75 (bs, 2 H), 4,20 (bs, 2 H), 4,35 (bs, 2 H), 7,15-7,20, 8,10-8,15 (2 x m, 8 H), 8,95-9,00, 9,10-9,15, 9,25-9,30 (3 x bs, 8 H), 10,20 (s, 2H).

Compuesto 24

5, 15-bis-(3-Metoxi-fenil)-10-undecil-porfirina

37

A un matraz de 50 ml que contenga litio (500 mg, 71 mmol) se le añade éter dietílico recién destilado (15 ml) en una atmósfera de argón. Se realiza el reflujo de la suspensión durante 1 hora, se enfría a 15ºC y se trata con una solución de n-undecil-bromuro (6,58 g, 71 mmol) en éter (6 ml) añadido gota a gota con una jeringuilla. La mezcla es enfriada hasta 7-10ºC y, 5 minutos después, cuando la suspensión se torne ligeramente turbia y aparezcan puntos brillantes en el metal de litio, el residuo de la solución de bromuro de n-undecilo es añadido a un ritmo estable durante un período de 30 minutos, manteniéndose la temperatura interna a menos de 10ºC. Al completar la adición, la mezcla es agitada durante 1 h más a 10ºC. La suspensión es filtrada en argón para extraer el exceso de litio y de bromuro de litio.

Se disuelve 5,15-bis-(3-Metoxi-fenil)-porfirina (100 mg, 0,19 mmol) en THF (30 ml) anhidro a -50ºC en una atmósfera de argón. El reactivo organo-litio descrito anteriormente (5 ml) es añadido gota a gota a la mezcla. Después de 5 minutos, el baño de enfriamiento es extraído y la mezcla es calentada hasta alcanzar la temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 15 minutos, la reacción es templada por la adición lenta de agua (2 ml). Después de 15 min la mezcla es oxidada por la adición de DDQ (4 mL, 0,4 mmol, 0,1 M en THF) y agitada durante 15 minutos más. La mezcla es filtrada por una alúmina (neutral, grado + Brockman) y purificada por cromatografía de columna sobre gel de sílice y se eluye con hexano:diclorometano (4:1 en vol.). La primera fracción es recogida y cristalizada a partir del metanol: diclorometano.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}): -3,05 (bs, 2 H, s), 0,80 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,10-1,20 (m, 12 H), 1,25 (m, 2 H), 1,70 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 2,40 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 3,85 (s, 6H), 4,95 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,20-7,23, 7,50-7,60, 7,65-7,75 (3x m, 8 H), 8,85-8,90, 9,10-9,15, 9,35-9,40 (3 x m, 8 H), 9,95 (s, 1H).

Compuesto 25

Tricloruro de 3-[({3-[(3-{4-[15-(4-Dodeciloxi-fenil)-porfirina-5-il]-fenoxi}-propil)-dimetil-amonio]-propil}-di- metil-amonio)-propil]-trimetil-amonio

38

El Compuesto 23 (20 mg, 0,022 mmol) y bromuro de (1-bromopropil)-trimetil-amonio (26 mg, 0,1 mmol) son disueltos en DMF (15 ml) y agitados durante la noche a 50ºC. Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo es disuelto en metanol (5 ml) y aplicado a una capa (3 cm de profundidad) de gel de sílice el cual es lavado con metanol (500 ml) seguido por ácido acético:metanol:agua (3:2:1 por vol). Después de la evaporación del solvente el residuo es purificado por cromatografía de columna (gel de sílice, Merck 60) usando primero ácido acético: metanol: agua (3:2:1 en vol.) y después piridina: ácido acético (1:1 en vol.). Se recoge la segunda fracción eluída y se seca al vacío. Se disuelve el residuo en metanol (2 ml) y se purifica por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 la cual es eluída con n-butanol: ácido acético: agua (5:1:4 en vol., fase superior). Después de extraer el solvente a presión reducida, el residuo es secado al vacío a 80ºC. La espectroscopía de NMR indica que el producto está contaminado con una pequeña proporción de productos de eliminación.

Compuesto 26

5, 10,15-tris-[4-(3-Dietilamino-propiloxi)-fenil]-20-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina

39

Se disuelve el Compuesto 22 (50 mg, 0,06 mmol) y dietilamina (5 ml) recién destilada en DMF absoluto (30 ml), en argón. La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 20 h y vertida en acetato de etilo (50 ml). La mezcla es lavada con agua (4 x 50 ml) y, después de secar las fases orgánicas combinadas (Na_{2}SO_{4}), la evaporación del solvente produce un residuo el cual es purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 30 cm) de silicio (Merck 60) y se eluye con acetato de etilo: n-hexano: trietil amino (10:10:1, en vol.). Las fracciones son combinadas según convenga, el solvente es evaporado a presión reducida y el residuo es secado a alto vacío. La recristalización a partir del diclorometano: n-hexano produce el producto puro.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CDCl_{3}): 0,85 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,05 (m, 18 H), 1,20-1,45 (m, 18 H), 1,55 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 2,15 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 6 H), 2,75 (quint,, ^{3}J 7,4 Hz, 6 H), 3,15-3,25 (m, 12 H), 4,15 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,25 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 6 H), 7,15-7,20 (m, 8 H), 8,00-8,05 (m, 8 H), 7,95-8,05 (m, 8 H).

Compuesto 27

5,15-bis-(3-Hidroxi-fenil)-10-undecil-porfirina

40

A una solución del Compuesto 24 (95 mg, 0,14 mmol) en diclorometano anhidro (80 ml) en una atmósfera de argón, se añade gota a gota BBr_{3}, (6 ml, 1M en diclorometano) a -70ºC y la mezcla es agitada durante 1 hora. La mezcla es calentada hasta alcanzar la temperatura ambiente y agitada durante la noche y posteriormente enfriada hasta -10ºC e hidrolizada mediante la adición de 2 ml de agua durante 1 hora. Se añade NaHCO_{3} (3 g) directamente a la neutralización. La mezcla es agitada durante 12 horas más. Después de extraer el NaHCO_{3} por filtración y el diclorometano por vacío, el residuo obtenido es purificado por cromatografía de columna usando gel de sílice y se eluye con diclorometano. Después de la extracción del solvente de fracciones combinadas adecuadas y del secado a alto vacío se obtiene el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}): -3,05 (bs, 2 H, s), 0_{},85 (t, ^{3}J 7_{},5 Hz, 3H), 1_{},20-1_{},40 (m, 12 H), 1_{},50 (m, 2 H), 1_{},80 (quint, ^{3}J 7_{},5 Hz, 2 H), 2_{},55 (quint, ^{3}J 7_{},5 Hz, 2 H), 5_{},00 (t, ^{3}J 7_{},5 Hz, 2 H), 7,15-7,25, 7,50-7,60, 7,80-7,90 (3x m, 8 H), 8,95-9,00, 9,20-9,25, 9,50-9,60 (3 x m, 8 H), 10,15 (s, 1H).

Compuesto 28

5,15-bis-[3-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-10-undecil-dicloruro de porfirina

41

A una solución del Compuesto 27 (50 mg, 0,08 mmol) en DMF (20 ml), en una atmósfera de argón, se añade K_{2}CO_{3} (100 mg, 0,72 mmol) y (3-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (300 mg, 1,2 mmol) y la mezcla se agita a 50ºC durante 18 h. Después de extraer el solvente a alto vacío, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y filtrado por una capa de gel de sílice (de 2 cm de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (500 ml), se eluye con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, v:v). Después de secar las fracciones combinadas adecuadas a alto vacío, el residuo es disuelto en metanol y purificado por cromatografía de columna en Sephadex LH-20, se eluye con n-butanol: ácido acético: agua (5:1:4, en vol., fase superior). Después de la evaporación del solvente, el residuo obtenido de la primera fracción eluída es disuelto en metanol y pasado por una columna corta de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro, para obtener, después de la evaporación del solvente, el producto puro.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CD_{3}OD): 0,85 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,40 (m, 12 H), 1,50 (m, 2 H), 1,80 (m, 2 H), 2,40 (bs, 4 H), 2,55 (m, 2 H), 3,20 (bs, 18 H), 3,65 (bs, 4 H), 4,35 (bs, 4 H), 5,10 (m, 2 H), 7,50-7,55, 7,70-7,85 (2 x m, 8 H), 8,95-9,00, 9,25-9,24, 9,50-9,70 (3 x bs, 8 H), 10,15 (bs, 1H)

Compuesto 29

Dicloruro de 5,10-bis-[4-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15,20-bis-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

42

Se disuelve el Compuesto 14 (50 mg, 0,05 mmol) y se realiza la suspensión de K_{2}CO_{3} (150 mg, 1,1 mmol) en DMF (30 ml). A una mezcla agitada vigorosamente se le añade gota a gota una solución de (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (0,3 g, 16,6 mmol) en DMF (10 ml) a 50ºC y se calienta la mezcla durante 18 h. Después de extraer el DMF a alto vacío, el residuo obtenido es disuelto en metanol (5 ml) y filtrado por una capa de gel de sílice (2 cm. de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 500 ml) se eluye con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente de las fracciones combinadas adecuadas, el residuo obtenido es purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 y se eluye con n-butanol: agua: ácido acético (5:4:1, en vol., fase superior) para la posterior separación de la sal de amonio en exceso y de otros subproductos. Después de extraer el solvente a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol y pasado por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el producto es secado a alto vacío.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,80 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 6 H), 1,15-1,35 (m, 28 H), 1,35-1,45 (bs, 4 H), 1,70-1,80 (bs, 4 H), 2,30-2,40 (bs, 4 H), 3,15-3,30 (bs, 18 H), 3,65-3,75 (bs, 4 H), 4,00-4,05 (m, 4 H), 4,30-4,40 (bs, 4 H), 7,00-7,15, 7,20-7,30, 7,80-95, 7,95-8,15 (4 x m, 4 x 4 H), 8,60-9,00 (bs, 8 H).

\vskip1.000000\baselineskip

Compuesto 30

5,10,15-tris-(3-Hidroxi-fenil)-20-(3-undeciloxi-fenil)-porfirina

43

Se añade pirrol (1,31 g, 19,6 mmol) a un resto de una mezcla de 3-hidroxibenzaldehído (1,8 g, 14,8 mmol) y 3-undeciloxibenzaldehído (1,36 g, 4,9 mmol) en ácido acético (145 ml) y nitrobenceno (118 g, 960 mmol) precalentado hasta 130ºC y la mezcla es agitada durante 1 hora a 120ºC. La mezcla es enfriada y el solvente extraído a alto vacío. El residuo es disuelto en diclorometano (5 ml) y purificado por cromatografía de columna usando gel de sílice (Merck 60) eluyendo con hexano: tolueno (4:1, en vol.). El producto es obtenido después de extraer el solvente del eluato a presión reducida y de secar el residuo obtenido al vacío.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, CDCl_{3}): 0,75-0,80 (m, 3 H), 1,05-1,35 (m, 14 H), 1,40-1,50 (m, 2 H), 1,75-1,85 (m, 2 H), 3,90-4,10 (m, 2 H), 6,90-7,70 (m, 16 H), 8,45-8,80 (m, 8 H).

\vskip1.000000\baselineskip

Compuesto 31

Dicloruro de 5-{4-[3-dimetil-(3-trimetilamonio-propil)-amonio-propiloxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina

44

El Compuesto 23 (50 mg, 0,055 mmol) es disuelto con yoduro de metilo (5 ml, 80 mmol) en DMF absoluto (30 ml) y la mezcla es agitada a 40ºC durante 3 h. Después de la evaporación del solvente, se disuelve el residuo obtenido en metanol (5 ml) y se filtra por una capa de gel de sílice (2 cm de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 1 L), se eluye con diclorometano: metanol (2:3 en vol., 500 ml) y posteriormente con ácido acético: agua: metanol (3:1:2, en vol.). Después de extraer el solvente de las fracciones reunidas, el residuo obtenido es disuelto en ácido acético y purificado por cromatografía de columna en Sephadex LH-20, y se eluye con ácido acético. Después de la evaporación del solvente de las fracciones reunidas apropiadas y de secar el residuo obtenido a alto vacío, el residuo es disuelto en metanol y pasado por una columna pequeña (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Después de la evaporación del solvente del eluato, el producto es secado a alto vacío.

\newpage

Compuesto 32

Dicloruro de 5-[4-(3-Dimetildecil-amoniopropiloxi)-fenil]-15-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amoniopropiloxi]-fenil}-porfirina

45

Se disuelve el Compuesto 23 (50 mg, 0,068 mmol) con N,N,N',N'-tetrametil-1,3-propanodiamina (354 mg, 1,36 mmol) y N,N-dimetildecilamina (1 g, 2,72 mmol) en DMF:THF(30 ml, 1:1, en vol.) y la mezcla es agitada a 50ºC durante la noche. Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol (10 ml) y filtrado a través de una capa de gel de sílice (2 cm de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 500 ml), este es eluído con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Las dos primeras fracciones eluídas son combinadas y después de la evaporación del solvente a presión reducida, el residuo obtenido es disuelto en metanol y purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, se eluye con n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1, en vol.). Después de extraer el solvente a presión reducida de la segunda fracción eluída, el residuo es disuelto en metanol (5 ml) y pasado por una columna corta (3,5 x 20 cm.) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). El eluato es evaporado hasta secarse y el residuo obtenido es secado a alto vacío para obtener el producto.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,80 (m, 3 H), 1,05-1,25 (m, 10 H), 1,25-1,40 (bs, 2 H), 1,80-1,90 (bs, 4 H), 2,15-2,30 (bs, 2 H), 2,80-3,60 (m, 20 H), 3,80-3,95 (bs, 4 H), 7,05-7,15, 7,85-8,00 (2 x m, 2 x 4 H), 8,75-8,90, 9,20-9,35 (2bs, 24H), 10,15 (bs, 2 H).

Compuesto 33

Tricloruro de 5,10,15-tris[3-(3-Trimetil-amoniopropiloxi)-fenil]-20-(3-undeciloxi-fenil)-porfirina

46

Se disuelve el Compuesto 30 (100 mg, 0,12 mmol), y se realiza la suspensión del K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) en DMF (30 ml). A la mezcla agitada vigorosamente, se le añade una solución de (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (0,3 g, 16,6 mmol) en DMF (10 ml) a 50ºC gota a gota durante 30 minutos y se calienta la mezcla durante 18 horas. Después de extraer el DMF a presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 ml) y se filtra por una capa de gel de sílice (2 cm de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 500 ml) se eluye con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente de las fracciones combinadas apropiadas a presión reducida, se purifica el residuo por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, y se eluye con n-butanol: agua: ácido acético (5:4:1, en vol., fase superior). Después de extraer el solvente del eluato a presión reducida, se disuelve el residuo obtenido en metanol y la solución se pasa por una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Mediante la evaporación del solvente del eluato se obtiene el producto, el cual es secado a alto vacío.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,75-0,80 (m, 3 H), 1,00-1,40 (m, 18 H), 1,60-1,80 (bs, 2 H), 2,25-2,40 (bs, 6 H), 3,29 (bs, 27 H), 3,40-3,60 (m, 6 H), 3,90-4,00 (m, 2 H), 4,05-4,25 (m, 6 H), 7,10-7,20, 7,25-7,40, 7,60-7,80, 7,80-7,90 (4 x m, 16H), 8,70-9,00 (bs, 8 H).

Compuesto 34

5, 15-bis-(3-Hidroxi-fenil)-porfirina

47

Esta se prepara según lo descrito por Wiehe, A., Simonenko, E. J., Senge, M. O. and Roeder, B. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines 5, 758-761 (2001).

Compuesto 35

5,10,15-tris-(4-Hidroxi-fenil)-20-(4-tetradeciloxi-fenil)-porfirina

48

Se disuelve 5,10,15,20-tetrakis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina (170 mg, 0,25 mmol) y se dispersa K_{2}CO_{3} (0,65 g, mmol) en DMF (30 ml). A una mezcla de reacción agitada vigorosamente se le adiciona gota a gota una solución de 1-bromotetradecano (0,1 ml, 0,45 mmol) en DMF (10 ml) a 50ºC durante 30 minutos y la mezcla es calentada durante 1,5 horas. Después de la evaporación del solvente, el residuo se disuelve en tolueno: etanol (1:1 en vol., ca. 5 ml) y se purifica por cromatografía usando una columna (5 x 25 cm.) de gel de sílice (Merck 60) la cual se lava con tolueno. Después del eluato de las 3 primeras fracciones, se continúa la elución usando tolueno: acetato etílico (2:1 en vol.). El quinto compuesto eluído es recogido, el solvente es evaporado y el residuo es secado a alto vacío para obtener el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, d6-acetona): 0,85 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,15-1,55 (m, 20 H), 1,45 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,75 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,10 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,20 (d, ^{3}J 8,5 Hz, 2 H), 7,25 (d, ^{3}J 8,5 Hz, 6 H), 8,00-8,15 (m, 8 H), 8,80-9,10 (m, 8 H).

Compuesto 36

Tricloruro de 5,10,15-tris-[4-(3-Trimetil-amoniopropiloxi)-fenil]-20-(4-tetradeciloxi-fenil)-porfirina

49

Se disuelve el n-tetradeciloxi análogo al Compuesto 2, preparado similarmente a lo descrito anteriormente para el Compuesto 2 pero usando 1-bromotetradecano en lugar de 1-bromoundecano, (50 mg, 0,057 mmol) y (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (210 mg, 0,8 mmol) y se realiza la suspensión de K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) en DMF (20 ml). La mezcla agitada vigorosamente es agitada a esta temperatura durante 18 horas. Después de extraer el DMF a presión reducida, se disuelve el residuo obtenido en metanol (5 ml) y se filtra por una capa de gel de sílice (2 cm de profundidad) soportada en una frita (3,5 cm de diámetro). Después de lavar la capa con metanol (ca. 500 ml), se eluye con ácido acético: metanol: agua (3:2:1, en vol.). Después de la evaporación del solvente de las fracciones combinadas apropiadas, el residuo obtenido es purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluyéndolo con n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1, en vol., fase superior) para separarlo del exceso de sal de amonio y de otros materiales contaminantes. Después de eluir y extraer el solvente de las fracciones apropiadas, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 ml) y se pasa por una columna corta (3,5 x 20 cm.) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro). Se extrae el solvente a presión reducida y se seca el residuo obtenido a alto vacío para obtener el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,75 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 0,95-1,25 (m, 22 H), 1,50-1,65 (bs, 2 H), 2,20-2,40 (bs, 6 H), 3,05-3,15 (bs, 27 H), 3,45-3,60 (bs, 6 H), 3,60-3,80 (bs, 2 H), 4,05-4,25 (bs, 6 H), 6,80-7,25, 7,65-8,05, (2 x m, 16 H), 8,45-8,95 (bs, 8 H).

Compuesto 37

5-(4-{3-[2,4,6-tris-(Dimetilaminometil)-feniloxi]-propiloxi}-fenil)-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina

50

El Compuesto 20 (50 mg, 0,063 mmol) se disuelve en DMF (20 ml) en presencia de 2,4,6-tris-(dimetilaminometil)-fenol (1 ml, 3,7 mmol) y se agita a 50ºC durante la noche. Después de la evaporación del solvente, el residuo es cristalizado a partir de diclorometano: metanol para extraer el exceso de amina. Después de la filtración, las porfirinas se vuelven a disolver en diclorometano y se purifican por cromatografía en una columna de gel de sílice (Merck 60) la cual es lavada con diclorometano. La evaporación del solvente a presión reducida y la recristalización del residuo del diclorometano: metanol, permite la obtención del producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H}(300 Mz, CDCl_{3}): -3,15 (2 H, s), 0,85 (t, 3J 4,5 Hz, 3 H), 1,20-1,40 (m, 18 H), 1,55 (quint, 3J 4,5 Hz, 2 H), 1,90 (quint, 3J 4,5 Hz, 2 H), 2,20 (s, 18 H), 2,55 (t, 3J 5,2 Hz, 2 H), 3,45 (s, 6 H), 4,15 (t, 3J 5,5 Hz, 2 H), 4,20 (t, 3J 5,5 Hz, 2 H), 4,35 (t, 3J 7,5 Hz, 2 H), 6,85 (2 x s, 2 H), 7,20-7,30, 8,10-8,15 (2 x m, 8 H), 9,00-9,05, 9,25-9,30 (2 x m,
2 x 4 H), 10,20 (s, 2 H).

Compuesto 38

5, 10,15-tris-(4-Hidroxi-fenil)-20-(4-deciloxi-fenil)-porfirina

51

\newpage

Se disuelve 5,10,15,20-tetrakis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina (100 mg, 0,15 mmol) y se dispersa K_{2}CO_{3} (230 mg) en DMF (30 ml). A una mezcla de reacción agitada vigorosamente se le añade una solución de 1-bromodecano (0,016 ml, 0,11 mmol) en DMF (10 ml), gota a gota, a 70ºC durante 30 minutos y la mezcla es agitada durante 1,5 horas. Después de la evaporación del solvente, el residuo se disuelve en tolueno: etanol (1:1 en vol., ca. 3 ml) y se purifica por cromatografía en una columna (150 g) de gel de sílice (Merck 60) usando tolueno como eluente. Después del eluato de las 3 primeras fracciones, la columna es eluída con tolueno: acetato de etilo (2:1 en vol.) y se recoge la 5ª fracción eluída, se extrae el solvente y se seca el resido a alto vacío para obtener el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, d6-acetona): 0,95 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,25-1,55 (m, 12 H), 1,55 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,85 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,15 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,20 (d, ^{3}J 8,5 Hz, 2 H), 7,25 (d, ^{3}J 8,5 Hz, 6 H), 8,00-8,15 (m, 8 H), 8,80-9,10 (m, 8 H).

Compuesto 39

Tricloruro de 5,10,15-tris-[4-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-20-(4-deciloxi-fenil)-porfirina

52

Se disuelven el Compuesto 38 (50 mg, 0,061 mmol) y (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (210 mg, 0,8 mmol) y se realiza la suspensión de K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) en DMF (20 ml). La mezcla de reacción agitada vigorosamente se calienta a 50ºC durante 18 h. Después de la evaporación del solvente, el producto crudo es disuelto en metanol y purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex, y se eluye con n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1, en vol., fase superior). Después de extraer el solvente, el residuo es disuelto en metanol y pasado a través de una columna (3,5 x 20 cm) de Amberlita IRA-400 (en forma de cloruro). Después de la evaporación del solvente, el producto se seca a alto vacío y produce cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0.90 (t, ^{3}J 7,5 Hz,03 H), 1,20-1,40 (m, 12 H), 1,45-1,60 (bs, 2 H), 1,80-1,90 (bs, 2 H), 2,45-2,55 (bs, 6 H), 3,25-3,35 (bs, 27 H), 3,75-3,85 (bs, 6 H), 4,05-4,25 (m, 2 H), 4,35-4,40 (bs, 6 H), 7,10-7,40, 7,95-8,15 (2 x m, 16 H), 8,60-9,00 (bs, 8 H).

Compuesto 40

5,10,15-tris-(4-Hidroxi-fenil)-20-(4-trideciloxi-fenil)-porfirina

53

Se disuelve 5,10,15,20-tetrakis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina (400 mg, 0,59 mmol) y se realiza la suspensión de K_{2}CO_{3} (1,0 g, 7,1 mmol) en DMF (75 ml). A la mezcla de reacción agitada vigorosamente se añade una solución de 1-bromotridecano, (0,1 ml, 0,45 mmol) en DMF (10 ml), gota a gota, a 50ºC, durante 30 min y se calienta la mezcla durante 1,5 h. La mezcla de reacción se enfría hasta alcanzar la temperatura ambiente y se vierte en agua (150 ml). Se extraen las porfirinas con acetato de etilo (100 ml) y se lava el extracto en una solución salina (3 x 50 ml) y se seca (Na_{2}SO_{4}). Después de la evaporación del solvente, el residuo es disuelto en tolueno: etanol (1:1, en vol., ca. 10 ml) y purificado por cromatografía usando una columna (200 g) de gel de sílice (Merck 60) con tolueno como eluente. Después del eluato de los tres primeros compuestos, el eluente se cambia por tolueno: acetato de etilo (2:1, en vol.). El quinto compuesto eluído se recoge y se seca a alto vacío para producir el producto en forma de cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 Mz, d6-acetona): 0,85 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,60 (m, 18 H), 1,50 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 1,80 (quint, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 4,14 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 2 H), 7,20 (d, ^{3}J 8,5 Hz, 2 H), 7,25 (d, ^{3}J 8,5 Hz, 6 H), 8,00-8,15 (m, 8 H), 8,80-9,10 (m, 8 H).

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Compuesto 41

Tricloruro de 5-(4-Trideciloxi-fenil)-10,15,20-tris-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

54

Se disuelve el compuesto 40 (50 mg, 0,057 mmol) y (1-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (210 mg, 0,8 mmol) se disuelven y K_{2}CO_{3} (230 mg, 1,7 mmol) se realiza la suspensión en DMF (20 ml). La mezcla de reacción agitada vigorosamente se calienta a 50ºC durante 18 h. Después de extraer el DMF, el residuo se disuelve en metanol (5 ml) se aplica a una capa (2cm de espesor) de gel de sílice el cual es lavado en metanol (ca.1000 ml) y después es eluído con ácido acético: metanol: agua (3:2:1 en vol.). Después de la evaporación del solvente, el residuo es disuelto en metanol y posteriormente purificado por cromatografía en una columna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 el cual es eluído con n-butanol: agua: ácido acético (4:5:1 en vol., fase superior). Después de retirar el solvente, el residuo es disuelto en metanol y pasado a través de una columna corta (3,5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRC 400, forma de cloruro). Después de la evaporación del solvente, el producto se seca a alto vacío para obtener cristales violetas.

^{1}H-NMR:

\deltaH (300 MHz, CD_{3}OD): 0,90 (t, ^{3}J 7,5 Hz, 3 H), 1,20-1,40 (m, 18 H), 1,45-1,60 (m, 2 H), 1,80-1,90 (bs, 2 H), 2,40-2,55 (bs, 6 H), 3,25-3,35 (bs, 27 H), 3,75-3,85 (bs, 6 H), 4,05-4,25 (m, 2 H), 4,35-4,40 (bs, 6 H), 7,10-7,40, 7,90-8,15 (2 x m, 16 H), 8,60-9,00 (bs, 8 H).

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Compuesto 42

5,15-bis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina

55

Ésta es preparada según lo descrito por Mehta, Goverdhan; Muthusamy, Sengodagounder; Maiya, Bhaskar G.; Arounaguiri, S., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1; 2177 - 2182 (1999).

\newpage

Compuesto 43

5,10,15-tris-(4-Hidroxi-Fenil)-20-(4-octiloxi-fenil)-porfirina

56

Se disuelve 5,10,15,20-tetrakis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina (200 mg, 0,294 mmol) y se realiza la suspensión carbonato de potasio (487 mg, 3,53 mmol, 12 eq.) en argón en DMF absoluto (50 ml) y la mezcla se calienta a 55ºC. Se agrega gota a gota una solución de bromuro de octilo (35,8 \mul, 0,206 mmol, 0,7 eq.) en DMF absoluto (10 ml) durante 30 min. y la mezcla se agita a 55ºC durante 2 h. Se retira el solvente al vacío a 50ºC, se agrega agua (80 ml) y se extrae la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml). Se seca la fracción orgánica combinada (Na_{2}SO_{4}) y se evapora el solvente. El residuo es purificado por cromatografía en una columna (300 g) de gel de sílice. Los compuestos tetralquilados y trialquilados son eluídos con tolueno:acetato de etilo (30:1 en vol.). La tercera fracción (compuesto di-sustituido, el trans-isómero) es eluída con tolueno:etilacetato (15:1 en vol.). La cuarta fracción (compuesto di-sustituido, el cis-isómero) es eluída con tolueno:etilacetato (10:1 en vol.) y el producto deseado (compuesto mono-alquilado) es eluído con tolueno:etilacetato (5:1 en vol.). El solvente se extrae a presión reducida y el residuo es secado a alto vacío para obtener el producto en forma de sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, d6-acetona): 0,75 (t, 3H, ^{3}J = 6,8 Hz), 1,13-1,25 (m, 8H), 1,43 (quint, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 1,73 (quint, 2 H, ^{3}J = 7,5 Hz), 3,50 (t, 2H, ^{3}J = 8 Hz), 7,11 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,16 (d, 6 H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,90-7,94 (m, 8H), 8,80-8,90 (m, 8 H)

Compuesto 44

5-(4-Dodeciloxi-fenil)-10,15,20-tris-(4-hidroxi-fenil)-porfirina

57

Se disuelve 5,10,15,20-tetrakis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina (200 mg, 0,294 mmol) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (487 mg, 3,53 mmol, 12 eq.) en argón en DMF absoluto (50 ml) y se calienta la mezcla a 55ºC. Se agrega gota a gota una solución de bromuro de dodecilo (49,4 \mul, 0,206 mmol, 0,7 eq.) en DMF absoluto (10 ml) durante 30 min. La mezcla es agitada a 55ºC durante 2 h. Se extrae el solvente al vacío a 50ºC, se agrega agua (80 ml) y se extrae la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml) Las fracciones orgánicas combinadas se secan (Na_{2}SO_{4}) y se evapora el solvente. Se aísla el producto por cromatografía en una columna (300 g) de silicio. Los compuestos tetra-alquilados y tri-alquilados son eluídos con tolueno: acetato de etilo (30:1 en vol.), los compuestos di-sustituidos (trans-isómero) con tolueno: etilacetato (15:1 en vol.), los compuestos di-sustituidos (cis-isómero) con tolueno: acetato de etilo (10:1 en vol.) y el producto deseado (compuesto mono-alquilado) con tolueno: acetato de etilo (5:1 en vol.). El solvente se extrae al vacío y el residuo es secado a alto vacío para obtener un producto en forma de sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, d6-acetona): 0,75 (t, 3H, ^{3}J = 6,8 Hz), 1,13-1,25 (m, 16H), 1,41 (quint, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 1,63 (quint, 2 H, ^{3}J = 7,5 Hz), 3,89 (t, 2H, ^{3}J = 6 Hz), 7,11 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,16 (d, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,9-7,94 (m, 8H), 8,78-8,83 (m, 8 H)

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Compuesto 45

5, 10,15-tris-(4-Hidroxi-fenil)-20-(4-noniloxi-fenil)-porfirina

58

Se disuelve 5,10,15,20-tetrakis-(4-Hidroxi-fenil)-porfirina (200 mg, 0,294 mmol) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (487 mg, 3,53 mmol, 12 eq.) en argón en DMF absoluto (50 ml) y se calienta la mezcla hasta los 55ºC. Se adiciona gota a gota una solución de bromuro de nonilo (49,4 \mul, 0,206 mmol, 0,7 eq.) en DMF absoluto (10 ml) durante 30 minutos. La mezcla es agitada a 55ºC durante 2 h. Se extrae el solvente al vacío a 50ºC, agua (80 ml) y se extrae la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml). Se secan los extractos orgánicos combinados (Na_{2}SO_{4}) y se extrae el solvente a presión reducida. Se aísla el producto por cromatografía en una columna de sílica (300 g). Los compuestos tetra-alquilados y tri-alquilados son eluídos con tolueno: acetato de etilo (30:1 en vol.), compuesto di-sustituido (el trans-isómero) con tolueno: acetato de etilo (15:1 en vol.), compuesto di-sustituido (el cis-isómero) con tolueno: acetato de etilo (10:1 en vol.) y el producto deseado (compuesto mono-alquilado) es eluído con tolueno: acetato de etilo (5,1 por vol). El solvente es extraído a presión reducida y el residuo es secado a alto vacío para obtener el producto en forma de un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, d6-acetona): 0,87 (t, 3H, ^{3}J = 7,5 Hz), 1,14-1,26 (m, 10H), 1,41 (quint, 2H), 1,70 (quint, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 3,92 (t, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,02 (d, 2H, ^{3}J = 8,25 Hz,), 7,15 (d, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz,), 7,85 (d, 2H, ^{3}J = 8,25 Hz), 7,91 (d, ^{3}J = 7,5 Hz), 8,76-8,84 (m, 8 H).

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Compuesto 46

Tricloruro de 5-(4-Octiloxi-fenil)-10,15,20-tris-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

59

Se disuelve el Compuesto 43 (50 mg, 0,063 mmol) y 3-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (164 mg, 0,63 mmol, 10 eq.) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (130 mg, 0,95 mmol, 15 eq.) en argón en DMF absoluto (30 ml) y la mezcla es agitada a 55ºC durante 12 horas. Se extrae el solvente al vacío a 50ºC y se aplica el residuo a una capa de sílica (2 cm profundidad). Las sales de amonio que no reaccionaron son eliminadas mediante el lavado con metanol (1000 ml) y el producto es eluído con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 en vol.). Se extrae el solvente a presión reducida y el residuo es posteriormente purificado por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (100 g) usando como eluente n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 en vol., fase superior). Los solventes son extraídos a presión reducida y el residuo es disuelto en metanol y pasado por una columna pequeña de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRA 400, en forma de cloruro) usando metanol como eluente. Después de la evaporación del solvente, el producto crudo es disuelto en la cantidad mínima de metanol y se adiciona dietil-éter (50 ml). Se centrifuga la solución durante 15 minutos. El líquido sobrenadante es evaporado hasta secarse y el residuo secado a alto vacío para producir el producto como un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\deltaH (300 MHz, CD_{3}OD): 0,90 (t, 3H, ^{3}J = 7,5 Hz), 1,25-1,41 (m, 8H), 1,45 (bs, 2H), 1,87 (bs, 2H), 2,38 (bs, 6H); 3,29 (bs, 27H), 3,67 (t, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 4,01 (t, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 4,30 (t, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,11 (d, 2H, ^{3}J = 7:5 Hz), 7,38 (d, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,95 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 8,11 (d, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 8,93 (bs, 8H)

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Compuesto 47

Tricloruro de 5-(4-Dodeciloxi-fenil)-10, 15,20-tris-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

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60

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Se disuelve el Compuesto 44 (50 mg, 0,059 mmol) y (3-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (154 mg, 0,59 mmol, 10 eq.) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (122 mg, 0,885 mmol, 15 eq.) en argón en DMF absoluto (30 ml) y la mezcla es agitada a 55ºC durante 12 horas. El solvente es extraído al vacío a 50ºC y el residuo vuelto a disolver en un poco de metanol y aplicado a una capa de sílica (2 cm de profundidad). Las sales de amonio que no reaccionaron son eliminadas mediante el lavado con metanol (1000 ml). El producto es eluído con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 en vol.). Los solventes son extraídos a presión reducida, y el producto crudo posteriormente purificado por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (100 g) usando como eluente n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 en vol., fase superior). Los solventes son extraídos a presión reducida, el residuo se vuelve a disolver en un poco de metanol y se pasa la solución por una columna corta de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRC 400, en forma de cloruro) usando metanol como eluente. Después de extraer el solvente, se vuelve a disolver el producto crudo en una cantidad mínima de metanol y se adiciona éter dietílico (50 ml). Se centrifuga la solución durante 15 minutos. El líquido sobrenadante es evaporado hasta secarse y el producto secado a alto vacío para obtener un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,88 (t, 3H, ^{3}J = 7,5 Hz), 1,25-1,37 (m, 16H), 1,48 (bs, 2H), 1,93 (bs, 2H), 2,42 (bs, 6H), 3,28 (bs, 27H), 3,68-3,75 (m, 6H), 4,05 (t, 2H), 4,33 (t, 6H), 7,17 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,33 (d, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,99 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 8,08 (d, 6H, ^{3}J = 7,5 Hz), 8,85 (bs, 8H).

\newpage

Compuesto 48

Tricloruro de 5-(4-Noniloxi-fenil)-10,15,20-tris-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina

61

Se disuelve el Compuesto 45 (50 mg, 0,062 mmol) y (3-bromopropil)-bromuro de trimetilamonio (162 mg, 0,62 mmol, 10 eq.) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (128 mg, 0,93 mmol, 15 eq.) en argón en DMF absoluto (30 ml) y la mezcla es agitada a 55ºC durante 12 horas. Se extrae el solvente al vacío a 50ºC y el residuo se vuelve a disolver en un poco de metanol y se aplica a una capa de sílica (2 cm de profundidad). Las sales de amonio que no reaccionaron son eliminadas por el lavado con metanol (1000 ml). El producto es eluído con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 en vol.). Se extraen los solventes a presión reducida y el producto es posteriormente purificado por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (100 g) y se eluye con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 en vol., fase superior). Los solventes son extraídos a presión reducida, el residuo vuelto a disolver en un poco de metanol y la solución es pasada por una columna corta de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRC 400, en forma de cloruro) usando como eluente metanol. Después de extraer el solvente, el producto es secado a alto vacío para obtener un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\deltaH (300 MHz, CD_{3}OD) 0,89 (t, 3H, ^{3}J = 7,5 Hz), 1,18-1,34 (m, 10H), 1,41 (bs, 2H), 1,73 (quint, 2H, ^{3}J= 7,5 Hz), 2,30-2,44 (m, 6H), 3,31 (bs, 27H), 3,65-3,73 (m, 6H), 3,93 (t, 2H, ^{3}J= 7,5 Hz), 4,25-4.42 (m, 6H), 7.08 (d, 2H, ^{3}J= 7,5 Hz), 7,30 (d, 6H, ^{3}J= 7,5 Hz), 7,93 (d, 2H, ^{3}J= 7,5 Hz), 8,05 (d, 6H, ^{3}J= 7,5 Hz), 8,94 (bs, 8H).

Compuesto 49

Tricloruro de 5-(4-Octiloxi-fenil)-10,15,20-tris-[4-(5-trimetilamonio-pentiloxi)-fenil]-porfirina

62

Se disuelve el Compuesto 43 (23 mg, 0,03 mmol) y (5-bromopentil)-bromuro de trimetilamonio (84 mg, 0,3 mmol, 10 eq.) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (62 mg, 0,45 mmol, 15 eq.) en argón en DMF absoluto (15 ml) y se agita la mezcla a 55ºC durante 12 horas. Se extrae el solvente al vacío a 50ºC y el residuo se vuelve a disolver en un poco de metanol y se aplica a una capa de sílica (2 cm de profundidad). Las sales de amonio que no reaccionaron son eliminadas mediante el lavado con metanol (1000 ml). El producto es eluído con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 en vol.). Los solventes son extraídos a presión reducida y el producto es posteriormente purificado por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (100 g) usando como eluente n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 en vol., fase superior). Los solventes son extraídos a presión reducida, el residuo es vuelto a disolver en un poco de metanol y la solución es pasada por una columna corta de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRC 400, en forma de cloruro) usando metanol como eluente. El proceso completo de purificación es repetido si quedan impurezas en el producto. Después de extraer el solvente, el residuo es secado a alto vacío para obtener el producto en forma de un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD): 0,78 (bs, 3H), 1,08-1,35 (m, 10H), 1,45-1,59 (m, 6H), 1,63-1,93 (m, 14H), 3,17-3,32 (m, 6H), 3,31 (bs, 33H), 3,84 (bs, 2H), 4,07 (bs, 6H), 6,93 (bs, 2H), 7,09 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,74 (bs, 2H), 7,88 (d, 2H, ^{3}J = 7,5 Hz), 8,71 (bs, 8H).

Compuesto 50

Tricloruro de 5,10,15-tris-[4-(5-Trimetilamonio-pentiloxi)-fenil]-20-(4-undeciloxi-fenil)-porfirina

63

Se disuelve el Compuesto 2 (50 mg, 0,06 mmol) y (5-bromopentil)-bromuro de trimetilamonio (174 mg, 0,6 mmol, 10 eq.) y se realiza la suspensión de carbonato de potasio (124 mg, 0,9 mmol, 15 eq.) en argón en DMF absoluto (30 ml) y la mezcla es agitada a 55ºC durante 12 h. El solvente es extraído al vacío a 50ºC y se vuelve a disolver el residuo en un poco de metanol y aplicado a una capa de sílica (2 cm de profundidad). Las sales de amonio que no reaccionaron son eliminadas mediante el lavado con metanol (1000 ml). El producto es eluído con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 por vol). Los solventes son extraídos a presión reducida y el producto posteriormente purificado por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (100 g) y se eluye con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 por vol, fase superior). Se extraen los solventes a presión reducida, el residuo se vuelve a disolver en una cantidad mínima de metanol y la solución es pasada por una columna corta de resina de intercambio aniónico (Amberlita IRC 400) con metanol como eluente. El proceso completo de purificación es repetido si aún quedan impurezas en el producto. Después de extraer el solvente, el residuo es secado a alto vacío para producir el producto como un sólido violeta.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, MeOD): 0,71-0,88 (m, 13H), 0,91-1,38 (m, 14H), 1,48-1,81 (m, 12H), las señales para -CH_{2}NCH_{2} y una cadena larga de alquilo OCH_{2}- son parte del multiplete con las señales para los solventes en el área 2,8 - 3,3, 3,91 (bs, 6H), 6,33 (bs, 2H), 6,86 (bs, 6H), 7,35 (bs, 2H), 7,70 (bs, 6H), 8,65 (bs, 8H).

Compuesto 51

5,10,15,20-tetrakis-(3-Dodeciloxi-fenil)-porfirina

64

Se disuelven pirrol (0,7 ml, 10 mmol) y 3-dodeciloxibenzaldehído (2,91 g, 10 mmol) en diclorometano (1000 ml) desgasificado y se adiciona TFA (0,77 ml, 10 mmol) gota a gota. La mezcla es agitada durante 17 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Se adiciona DDQ (6,81 g, 30 mmol) en un resto y se agita la mezcla durante 1 hora más a temperatura ambiente. Se filtra la mezcla por una columna (400 g) de silicio usando diclorometano como eluente seguido por diclorometano al cual se le adiciona trietilamina para ajustar el valor del pH a 8. Este proceso de purificación es repetido si quedan impurezas en el producto hasta que se obtiene el producto bruto.

^{1}H-NMR:

\delta_{H} (300 MHz, d6-acetona): 0,80 (bs, 12H), 1,03-1.45 (m, 80H), 1,78 (quint., 8H, ^{3}J = 7,5 Hz), 4,05 (t, 8H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,24 (d, 4H, ^{3}J = 7,5 Hz), 7,49-7,55 (m, 4H), 7,68-7,71 (m, 8H), 8,80 (m, 8 H)

Ejemplo B Perfiles no especificos (toxicidad en la oscuridad) y perfiles de actividad fotodinámica (toxicidad en la luz) de compuestos ejemplares en células bacterianas Metodología

Los efectos tóxicos de compuestos ejemplares de la invención en dos cepas de bacterias, la bacteria Gram negativa Escherichia coli (cepa ATCC 25922) y la bacteria Gram positiva Estafilococo áureo (cepa resistente a la meticilina ATCC BAA-44) fueron evaluadas midiendo el grado de inhibición del crecimiento (efecto bacteriostático) y la inhibición del crecimiento (efecto citocidal) en la oscuridad y al ser expuestos a la luz. Se realizó un monitoreo del compuesto inicial usando luz blanca [390-740 nm] (150 mW/cm^{2}) para varios momentos diferentes a una concentración de 3 \muM (véase Tabla 1). Se realizaron otros experimentos en los compuestos identificados en este monitoreo inicial usando una fuente de luz que emitía luz en longitudes de onda entre 417-420 nm a 15,2 mW/cm^{2}, 13,68 J/cm^{2} (Waldmann Eclairage SA, Francia) (véase Tabla 2).

El siguiente protocolo se empleó para el monitoreo inicial de los compuestos ejemplares (Tabla 1) (véase Reddi et al., 2002, Photochem. Photobiol. 75(5):462-470):

(i)

Células de E. coli y S. aureus fueron cultivadas durante una noche en una infusión agar de cerebro corazón, se volvió a realizar la suspensión de estas en una infusión caldo de cerebro corazón, colectadas por centrifugación (3000 g durante 15 min) y lavadas una vez con una solución buffer fosfato salina (PBS) a pH 7,4 que contiene 2,7 mM KCl y 0,14 M NaCl.

(ii)

Se volvió a realizar la suspensión de las células en PBS a una densidad óptica de 650 nM de 0,7, lo que corresponde a una densidad de 10^{8} a 10^{9} células/ml.

(iii)

Después, las células fueron incubadas en PBS en la oscuridad durante 5 minutos con 3,0 \muM del compuesto que iba a ser probado.

(iv)

Después de la incubación en la oscuridad, las células fueron iluminadas con luz blanca (longitud de onda: 390 a 740 nm) (150 mW/cm^{2}) durante un tiempo de hasta 30 minutos. Durante la iluminación, las células fueron mantenidas a 37ºC y agitadas magnéticamente.

(v)

Finalmente, las células tratadas y no tratadas (control) fueron diluidas en un caldo infusión de cerebro corazón y mantenidas a 37ºC mientras que la absorbancia de la suspensión a 650 nm fue monitoreada en momentos predeterminados para determinar las curvas de crecimiento.

El porcentaje de inhibición del crecimiento en las células tratadas fue calculado mediante la siguiente ecuación:

[1-(A_{x}-A_{0}) \ / \ (A_{c}-A_{0})] \ x \ 100

en la cual A_{x} y A_{c} son las absorbancias medidas después de 3 horas de incubación, para las suspensiones de células tratadas y de control, respectivamente, y A_{0} representa la absorbancia inicial.

Para la investigación siguiente de los compuestos ejemplares (Tabla 2), se adoptó el protocolo siguiente:

(i)

Se cultivaron bacterias (S. aureus BAA-44 y E. coli 25922) en una infusión caldo de cerebro corazón (BHI) hasta que alcanzaron la fase estacionaria de crecimiento.

(ii)

Las células fueron colectadas por centrifugación (3000 g durante 15 min.) con una centrífuga de mesa, lavadas con 10 mM PBS a pH 7,4 que contiene 2,7 mM KCl y 0,14 M NaCl y suspendidas en PBS a una densidad óptica de 0,7 a 650 nM correspondiente a 10^{8}-10^{9} células/ml.

(iii)

Las bacterias, a la densidad celular deseada (\sim10^{8} células/ml) fueron incubadas durante 5 min en la oscuridad con varias concentraciones de los compuestos ejemplares.

(iv)

Al final del período de incubación las células fueron lavadas tres veces con PBS, suspendidas en PBS, transferidas a un plato contenedor de microtitulación 96 (200 \mul/pocillo) e iluminadas durante 15 min con la fuente de luz Waldmann (15,2 mW/cm^{2}; 13,7 J/cm^{2}). Las células fueron iluminadas desde la parte inferior del plato colocándolo en la cubierta de cristal de la lámpara.

(v)

Después de la iluminación, se determina la supervivencia de las células colocando alícuotas diluidas en serie de las células tratadas y no tratadas (es decir, no están presentes compuestos ejemplares o luz) en un agar de cerebro corazón (BHA) y contando el número de colonias después de 18-24 h de incubación a 37ºC.

TABLA 1 Inhibición del crecimiento (%) de células E. coli y S. aureus irradiadas con luz blanca después de 5 min. de incubación con los compuestos seleccionados a una concentración de 3 \muM

65

Resultados

Los resultados de los estudios de toxicidad en E. coli y S. aureus se muestran en las Tablas 1 y 2, junto con las Figuras 2 y 3 (véase Ejemplo A para compuesto, "Cpd", estructuras)

TABLA 2 Supervivencia de las células de E. coli y S. aureus después de incubación con los compuestos seleccionados para prueba y una iluminación con luz blanca ("actividad fotodinámica" o toxicidad en la luz) o sin Iluminación ("toxicidad en la oscuridad")

66

67

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

Conclusiones

Los resultados demuestran que los compuestos de la invención, cuando son iluminados con luz, son capaces de eliminar tanto las células bacterianas Gram positivas como las Gram negativas en las bajas concentraciones investigadas.

Actividad del Compuesto 10 en dosis bajas

El protocolo de unidades formadoras de colonias (CFU, por su expresión inglesa Colony Forming Units) anteriormente expuesto también se empleó para investigar la actividad fotodinámica en concentraciones muy bajas de los compuestos de la invención. Por ejemplo, la figura 4 demuestra los resultados obtenidos usando (A) el Compuesto 8 y (B) el Compuesto 10 en presencia (propiedades fotodinámicas) y en ausencia (propiedades de toxicidad inherente) de luz.

Resultados

(i) Tanto el Compuesto 8 como el 10 exhibieron una toxicidad insignificante en la oscuridad frente a BAA-44 a las concentraciones probadas.

(ii) El Compuesto 8 exhibió un potente efecto antibacteriano a concentraciones tan bajas como 0,01 \muM, donde se alcanzó una reducción logarítmica de 3 en BAA-44.

(iii) El Compuesto 10 exhibió un efecto antibacteriano aún más potente, causando una reducción logarítmica de 3 en BAA-44 a una concentración de 0,005 \muM y fue capaz de eliminar el 90% de las bacterias a una concentración de 0,0025 \muM.

Conclusiones

Los Compuestos 8 y 10 exhiben una toxicidad ante células bacterianas dependiente de la dosis y de la luz, aún en dosis muy bajas.

Gama de actividad antimicrobiana

La actividad antibacteriana del Compuesto 10 fue probada nuevamente ante una gama de cepas bacterianas:

-

S. aureus ATCC BAA-44 (un S. aureus resistente a la meticilina)

-

Ps. aeruginosa ATCC 25668

-

E. epidermidis ATCC 700565

-

Estreptococo piógeno ATCC 49117

-

E. coli ATCC 25922

TABLA 3

68

Conclusiones

El Compuesto 10 exhibe una actividad fotodinámica (es decir, toxicidad en la luz) ante una amplia gama de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Actividad fotodinámica del Compuesto 10 contra MRSA en piel porcina ex vivo

Se cortó piel porcina extirpada quirúrgicamente en piezas de 3(4) x 3(4) cm^{2} en condiciones estériles y se incubaron en etanol al 70% durante 5 minutos para reducir antecedentes de bacterias colonizadas. Después de tres pasos de lavado con solución salina buffer de fosfato (PBS, por sus siglas en inglés Phospate Saline Buffer), las piezas de piel se fijaron en placas petri con Hepes-Agar. A la epidermis (estrato córneo) se le inoculó S. aureus ATCC BAA-44 (\sim10^{8}, Volumen: 100 \mul) y la superficie de la piel fue secada en un gabinete de flujo laminar hasta que estuvo visiblemente seca. Las regiones de interés fueron determinadas usando una pluma ("pap" pen) (1 cm^{2} de diámetro). Una solución estéril del Compuesto 10 (10 \muM) fue aplicada a la piel durante 10 minutos. Tras la aplicación, la piel porcina ex vivo fue colocada bajo una fuente de luz Waldman 236 e iluminada durante 15 min. (15,2 mW/cm^{2}, 13,7 J/cm^{2}). Se efectuó un estudio de unidades de formación de colonias para determinar el número viable de bacterias inmediatamente después de la irradiación usando un aplicador de algodón estéril para extraer las bacterias del sustrato córneo. El aplicador de algodón esterilizado fue humedecido en una solución de muestreo (0,1% Tween 80 en 0,0075 M de fosfato, buffer con pH 7,9) antes de tomar la muestra de la superficie de la piel (3 veces) y sumergido en solución de muestreo antes de realizar diluciones en serie para determinar la recuperación bacteriana.

La incubación con el Compuesto 10 (10 \muM) seguida de 15 minutos de irradiación trajo como resultado una reducción del crecimiento de 3,2 log_{10} (valor medio de tres áreas diana). En contraste, los experimentos de control (irradiación de las bacterias aplicadas sin incubación del Compuesto 10) no mostraron una disminución del número de células bacterianas.

De esta forma, estos datos demuestran actividad fotodinámica del Compuesto 10 contra MRSA en la superficie de piel porcina, incluso en presencia de lípidos y enzimas de la piel.

Confirmación de las propiedades fotodinámicas usando azidas sódicas y D_{2}O

Se realizaron estudios de enfriamiento rápido usando D_{2}O y azida con el Compuesto 10 y con luz contra queratinocitos in vitro. Con el fin de investigar si la fototoxicidad del compuesto probado contra NHDF, NHEK y bacterias pertenece a la fotoxidación de tipo II, se usó azida sódica, un enfriador físico con oxígeno simple así como D_{2}O y un potenciador de especies reactivas al oxígeno (Lin et al., 1991, Cancer Res. 51:1109-1116; Moan et al.,1979, Brit. J. Cancer 39:398-407).

La figura 5 muestra el efecto de incubación con el Compuesto 10 y el enfriador súbito, o el Compuesto 10 y D_{2}O después de la iluminación. La eliminación de las células por el Compuesto 10 se redujo en presencia de la azida sódica, según lo indicado por el aumento de la viabilidad celular, mientras que la adición de D_{2}O mostró una reducción dramática de la viabilidad celular.

En conclusión, la eliminación de NHDF por el Compuesto 10 con iluminación parece estar mediada fundamentalmente por el oxígeno singlete y no por el compuesto en sí mismo.

Prueba de toxicidad extrema del Compuesto 10

El Compuesto 10 fue usado en una dosis antibacteriana de un millón de veces (3,2 mM) en una formulación tópica en una prueba de toxicidad extrema estándar para determinar si era posible detectar cualquier toxicidad clínica o histológica del compuesto. El compuesto se aplicó a piel de rata, tanto intacta como dañada, durante 24 horas.

El protocolo de toxicidad extrema se basó en la Guía para pruebas de productos químicos OECD/ Sección 4 - Prueba de efectos en la salud número 402: Toxicidad dérmica extrema.

Resultados y Conclusiones

Después de observación clínica, macroscópica y microscópica, no se observó toxicología clínica. No se observó toxicología histológica en ninguno de los órganos fundamentales (incluyendo la piel). No se notaron infiltraciones celulares, incluyendo los mastocitos, ni irritación.

En conclusión, el Compuesto 10 no produjo ningún efecto tóxico o alérgico agudo: de hecho, no se observaron signos clínicos o patológicos significativos relacionados con la sustancia y su vehículo de aplicación.

Prueba de fototoxicidad del Compuesto 10

El protocolo de fototoxicidad se basó en la Guía para pruebas de productos químicos OECD/Sección 4 Prueba de efectos en la salud número de ensayo, 406: Sensibilización dérmica.

Los experimentos preliminares determinaron que la exposición a la luz durante 30 minutos no produjo ningún daño en la superficie de la piel, causado por la fuente de luz. De igual forma, los experimentos control demostraron que el Compuesto 10 al ser aplicado a una concentración de 32 \muM en ausencia de luz no produjo ningún daño en la superficie de la piel. Se estudió la fototoxicidad del Compuesto 10 en la formulación tópica al aplicarse a la piel de 14 conejillos de Indias (intacta o dañada) durante 24 horas, seguido por 30 minutos de exposición a la luz. Se probó el Compuesto 10 en dos concentraciones diferentes 32 \muM y 0,32 \muM. El examen clínico e histológico de los sitios de prueba de la piel fue llevado a cabo a las 24 y 72 h después de la iluminación en la forma clásica de la prueba de fototoxicicidad. No se realizaron biopsias de sitios contiguos para prevenir cualquier interacción en caso de sutura. Los hallazgos macroscópicos fueron evaluados en el momento de la biopsia. Antes de asignar un índice a cada punto objeto de estudio (eritema, edema e inflamación), los datos para cada sujeto fueron comparados con los datos de otros animales y con los datos de control. Se asignó un índice de 0 a 4 para cada sitio y para cada punto objeto de estudio según la escala Draize (para la inflamación, se creó una escala similar a la escala Draize después de observar microscópicamente todas las secciones de la piel comparando con la piel normal y con los hallazgos del paso 1). Se calculó un índice medio para cada animal y para cada punto de muestreo.

Al analizar los resultados y comparar los datos experimentales con los datos de los animales de control, se llegó a la conclusión de que no había signos o síntomas clínicos o hallazgos histológicos que sugirieran ningún potencial fototóxico del Compuesto 10.

Ejemplo C Enlace de los compuestos ejemplares de la invención con las células bacterianas Enlaces de los Compuestos 8, 10 y 12 con la E. coli

Se incubaron células de E. coli durante 5 min. con los Compuestos 8, 10 ó 12 a varias concentraciones (1-7,5 \muM). Al finalizar el período de incubación, se realizó la sedimentación de las células por centrifugado para extraer la fracción del compuesto de prueba no enlazado y el pellet celular fue resuspendido en 2 ml de SDS 2% para obtener células lisadas. Después de la incubación durante la noche con SDS, la cantidad de compuesto de prueba enlazado se estimó mediante análisis espectrofluorimétrico de las células lisadas. La concentración de los compuestos en las células lisadas se calculó mediante la medición de las intensidades al máximo de emisión del espectro de fluorescencia y mediante la interpolación de datos en un gráfico de calibración. La cantidad de compuesto de prueba enlazado se expresó en nmoles del compuesto por mg de proteína celular. La concentración de proteína se determinó mediante el método de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193:265-275).

Todos los experimentos se efectuaron por triplicado y los resultados representan un promedio de las 3 determinaciones con las desviaciones estándar.

La cantidad de porfirina recuperada de las células se muestra en la Tabla 4.

TABLA 4

69

Los resultados expuestos en la tabla 4 muestran que los tres compuestos de prueba se enlazan a la E. coli con una eficiencia similar y que aproximadamente el 50% del compuesto que se asocia a las células al final del período de incubación (5 min.) se extrae mediante 3 lavados con PBS.

Ejemplo D Prueba de los compuestos ejemplares en caso de que surja resistencia de la bacteria al PDT

La creación potencial de resistencia de las células bacterianas a los compuestos ejemplares de la invención fue probada en la bacteria Gram positiva con resistencia a múltiples medicamentos (incluyendo la meticilina), Estafilococo áureo BAA-44, usando el compuesto 10 como agente fotodinámico. La supervivencia del S. aureus BAA-44 después del segundo tratamiento se comparó nuevamente con la supervivencia de células de S. aureus que no habían sido tratadas con PDT. El mismo tratamiento se repitió un total de 10 veces con el fin de valorar si la sensibilidad de las células del S. aureus BAA-44 al PDT se mantenía constante o si se observaba el desarrollo de cierta resistencia después de tratamientos repetidos. En un experimento adicional, clones que habían sido expuestos nueve veces a tratamiento con PDT por medio de la metodología anteriormente expuesta fueron tratados una décima vez y los resultados fueron similares a la eliminación de las células observada en un experimento paralelo donde cultivos vírgenes (es decir, que no habían sido expuestos al PDT) fueron sometidos a tratamiento con PDT en exactamente las mismas condiciones. Los resultados obtenidos después de 10 tratamientos consecutivos con PDT se muestran en la Figura 6.

Los resultados obtenidos a partir de la comparación de la eliminación de las células obtenidos de cultivos que habían sido expuestos a 10 tratamientos consecutivos con PDT con cultivos naturales (es decir, que no habían sido expuestos a PDT) se muestran en la Figura 7. La supervivencia fue expresada como logaritmo N_{0}/N, donde N_{0} y N representan el número de CFU/ml de las suspensiones de células tratadas y no tratadas. Análisis estadísticos con la prueba T demostraron que las diferencias entre los 2 valores no era significativa (P > 10%).

Conclusiones

La fotosensibilización de la bacteria S. aureus ATCC BAA-44 con el Compuesto 10 no indujo ningún desarrollo de resistencia apreciable. De hecho, la eficiencia de la actividad fotodinámica del Compuesto 10 permaneció invariable en las 10 sesiones de secuencia fotodinámica consecutiva, aún cuando las células bacterianas, que fueron expuestas en tratamientos anteriores, fueron cultivadas y reexpuestas al Compuesto 10 y a la luz. Por lo tanto, el tratamiento de bacterias usando el Compuesto 10 de forma fotodinámica se potencia también por la aparente ausencia de inducción a la resistencia bacteriana, a diferencia de las terapias con antibióticos, donde la resistencia a múltiples medicamentos es un aspecto significativo.

Ejemplo E Perfil de toxicidad - selectividad de los compuestos ejemplares para bacterias Metodología

Los compuestos de prueba fueron analizados para detectar la toxicidad ante células dérmicas humanas cultivadas usando queratocitos epidérmicos humanos normales (NHEK, por su expresión inglesa normal human epidermal keratinocytes) y fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF, por su expresión inglesa normal human dermal fibroblasts), comprados en CellSystems Biothecnology GmbH, Alemania.

Las células NHEK y NHDF fueron usadas entre los pasajes 3 y 10. Las células fueron sembradas con 7,5 y/o 15 x 10^{4} células/pocillo (placas para microtitulación) y se les permitió acoplarse durante la noche en una incubadora (37ºC, CO_{2} 5%). Después de la incubación con diferentes concentraciones de los fotosensibilizadores seleccionados, las células fueron iluminadas durante quince minutos (Fuente de luz 236, Waldmann; 15,2 mW/cm^{2}, 13,7 J/cm^{2}) y fueron incubadas durante 24 horas en la oscuridad.

La fototoxicidad fue probada mediante el ensayo MTT estándar (Mosman et al., 1983, Immunological Methods 65:55-63). El MTT es un indicador de las células metabólicamente activas. En dependencia de la actividad de la enzima en la mitocondria se puede visualizar una reacción de color, la cual puede ser medida por medio del lector ELISA (540 nm). Los datos de viabilidad celular fueron normalizados, es decir los valores OD de las células después de aplicar PDT sin fotosensibilizadores se ajustaron a uno. Cada experimento se repitió tres veces.

Resultados

Los resultados de los estudios de fototoxicidad en los queratocitos y fibroblastos se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

70

71

72

La Figura 8 muestra la toxicidad del Compuesto 8 ante fibroblastos humanos y el S. aureus BAA-44 en distintas dosis.

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Conclusiones

Los datos anteriores demuestran que los compuestos de la invención, por ejemplo el Compuesto 8 (en una dosis de 0,01 \muM), el Compuesto 12 (en una dosis de 0,1 \muM) y el Compuesto 10 (en una dosis de 0,01 \muM), son tóxicos de manera preferencial para las células bacterianas en comparación con las células de la piel humanas.

Por el contrario, el Compuesto 1 de referencia exhibe igual toxicidad ante las células bacterianas y las células humanas.

Ejemplo F Estudios de estabilidad Metodología

Se desarrolló a medida una fuente de luz capaz de producir luz a una longitud de onda apropiada (417 nm) para activar los compuestos de prueba (fuente de luz Waldmann 236). La fuente de luz tiene una intensidad de luz de 15 mW/cm^{2} después de 3 minutos a temperatura ambiente (25ºC), produciendo una dosis de luz de 14 J/cm^{2}. Ésta consiste en una caja de luz (493 mm de largo x 278 mm de ancho x 93,3 mm de altura) las muestras a ser probadas se colocan en la superficie superior de la caja de luz y se les ilumina desde abajo.

Fotoestabilidad del Compuesto 10

La fotoestabilidad de los compuestos ejemplares fue investigada usando procedimientos fotodinámicos estándar. Se preparó una solución de 10 \muM del Compuesto 10 en una solución buffer fosfato salina /etanol, como se describe anteriormente, y fue iluminada con luz azul (15 mW/cm^{2}) usando una fuente de luz con una absorbancia máxima de 417 nm. La solución se iluminó durante varios períodos: 10, 20 y 30 minutos. Después de cada período de iluminación predeterminado, se midió la absorbancia de 404 nm correspondiente al pico de absorbancia máxima del compuesto. Se llevaron a cabo experimentos paralelos en los que se midió la absorbancia de la soluciones del Compuesto 10 que habían sido mantenidas en la oscuridad durante los mismos períodos de tiempo de iluminación. Después de un período de tiempo de iluminación mayor de 30 minutos se observó una pequeña pérdida en el valor de absorbancia a 404 nm (véase Figura 10A).

La susceptibilidad del Compuesto 10 a la fotodecoloración cuando es sometido a una luz a un ritmo de fluencia mayor (150 mW/cm^{2}; es decir, diez veces la que se usa normalmente) fue investigada. Con este sistema de iluminación, la solución se mantuvo en una cubeta de cuarzo durante la iluminación mientras que una solución equivalente se mantuvo en la oscuridad. Se encontró que la reducción de la absorbancia causada por fotodecoloración era de aproximadamente entre 15-20% a una concentración de 10 \muM después de 30 minutos de iluminación (véase Figura 10B).

Los resultados anteriores indican que el Compuesto 10 sufre una fotodecoloración mucho menor que otras porfirinas conocidas en la literatura (por ejemplo, véase Reddi et al., 2002, Photochem. Photobiol. 75:462-470).

Estabilidad química

La siguiente metodología de HPLC se estableció para el análisis de los compuestos ejemplares de la invención.

El método comprende la detección por UV a una longitud de onda de 420 nm, la cual es muy específica para estos compuestos. Con el fin de monitorear las impurezas no relativas a la estructura de la porfirina (y por tanto que no absorben a 420 nm) los espectros UV de todos los cromatogramas también se registraron entre 200 nm y 700 nm mediante DAD (por su expresión inglesa Diode Array Detector, detector tipo diodo) en algunos experimentos.

Columna: Zorbax Phenyl, 250 x 4,6 mm, 5 \mum

Eluente A: 1,5 dodecilsulfato de sodio + 1 ml de ácido fórmico en 1000 ml de agua

Eluente B: 1,5 dodecilsulfato de sodio + 1 ml de ácido fórmico en 200 ml de agua + 800 ml tetrahidrofurano

Gradiente:

73

Velocidad de Flujo:

0,4 ml/min

Detección:

420 nm

Temperatura de la Columna:

25ºC

Volumen de Inyección:

10 \mul

Soluciones: Derivados de la porfirina fueron disueltos en el eluente A para lograr una concentración final de aproximadamente 0,3 mg/ml.

\vskip1.000000\baselineskip

El tiempo de retención típico de los compuestos ejemplares fue de aproximadamente 8 minutos (18 minutos de funcionamiento).

Se efectuaron pruebas de estrés cualitativas en los compuestos ejemplares de la invención. Se realizó el análisis mediante HPLC y LC-MS. Se le efectuó la prueba de estrés a los compuestos en su forma sólida, en una solución acuosa y en una solución buffer fosfato salina. Las muestras fueron inicialmente incubadas durante más de 7 días a 50ºC y se extrajo una muestra para la prueba. Las muestras fueron entonces incubadas por otros 7 días a 70ºC, se extrajeron muestras como antes y las muestras fueron incubadas después durante 7 días a 90ºC. Se efectuaron análisis de HPLC de soluciones recién preparadas y se compararon con las muestras después de 7, 14 y 21 días de incubación. Se efectuó, entonces, una comparación visual de los cromatogramas y se determinaron los contenidos de los productos principales y los subproductos en forma de valores de por ciento de área (véase Figura 11).

Los gráficos en 3D de los cromatogramas no muestran indicaciones de formaciones adicionales de fragmentos (no hay señal a longitudes inferiores de onda).

En el gráfico de la Figura 12 se observa una muestra después de 21 días en un buffer PBS, la cual mostró el mayor efecto de degradación. Los resultados demostraron una degradación mínima en el análisis del medicamento sólido y el medicamento en una solución calentada a 80ºC durante varias semanas.

\newpage

Conclusiones

Se encontró que los Compuestos 10 y 12 exhiben una buena estabilidad y eran muy estables incluso en las condiciones extremas del protocolo de prueba. Aunque el Compuesto 8 era menos estable que los compuestos 10 y 12, se encontró que la estabilidad demostrada era suficiente para su uso práctico.

Estabilidad de los compuestos ejemplares en las formulaciones

La estabilidad de los tres compuestos ejemplares de la invención (Compuestos 8, 10 y 12) y un compuesto de referencia (Compuesto 1), almacenados a 40ºC en la oscuridad durante 8 semanas en frascos de polietileno en varias formulaciones de base acuosa, fue evaluada como sigue:

-

Sulfato sódico láureo (SLES, por su expresión inglesa Sodium laureth sulphate) + agua

-

9:1 de agua:etanol

-

SLES + mezcla 9:1 de agua:etanol

Los espectros UV fueron registrados en el intervalo de 350-700 nm durante un período de 7 semanas y se realizó una evaluación visual de las muestras a las 8 semanas.

Los resultados indican que todos los compuestos probados exhibieron una buena estabilidad durante un período de 8 semanas (véase Figura 13).

Para los Compuestos 8 y 10, los estudios de estabilidad se extendieron por 17 semanas (véase Figura 14).

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Ejemplo G Estudios de distribución Distribución en la piel humana

Se empleó piel humana (intacta) en el sistema celular Franz para examinar la distribución de los Compuestos 10 y 12 en los compartimentos de la piel después de 22 horas de incubación a altas concentraciones. Se efectuaron tres experimentos separados, cada uno usando una muestra de piel (del mismo donante), para cada formulación. Se aplicaron, en oclusión, 250 \muL de cada formulación y fueron retirados después de 22 horas. Se separó la piel y se determinó el contenido de los compuestos en el estrato córneo, la dermis y la epidermis y la solución receptora usando HPLC.

Se estableció la siguiente metodología de HPLC para el análisis de los compuestos ejemplares de la invención:

Detalles del sistema HPLC: Membrana degasificadora TSP SCM1000, bomba cuaternaria P4000, muestrador automático AS300, detector PDA UV6000LP W/Vis, controlador SN4000, software PC 1000 Ver. 3.5.1. Zorbax SB-Phenyl, 5 \mum, columna 250 x 4,6 mm y una capa previa de seguridad de Phenyl (Phenomenex). Fase móvil: 550 ml de agua; 450 ml tetrahidrofurano; 1,5 g dodecilsulfato de sodio y 1 ml de ácido fórmico a un ritmo de flujo de 0,8 ml/min. El volumen de inyección fue de 50 \muL (ciclo completo de inyección) y la temperatura de operación fue 25ºC. El detector fue configurado a una longitud de onda de 409 nm más el barrido UV/Vis (240-752 nm, paso 4 nm). El tiempo típico de retención de los compuestos ejemplares fue de aproximadamente 8 minutos (18 minutos de duración del ciclo).

Se encontró que la mayoría de los compuestos asociados con la piel residían en el estrato córneo. Se detectaron concentraciones bajas en la epidermis (aprox. 0,01 \muM), es decir, concentraciones potencialmente antibacterianas. Se detectaron concentraciones más bajas en la dermis (aprox. 0,002 \muM). No se detectaron compuestos en la solución receptora.

TABLA 6 Experimento 1: 32 \muM del Compuesto 10 en la mezcla 9:1 agua:etanol

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TABLA 7 Experimento 2: Comparación directa de tres formulaciones que contenían 16 \muM del Compuesto 10

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Resultados y conclusiones

Los resultados de los estudios de distribución en la piel humana se muestran arriba en las Tablas 6 y 7.

Los hallazgos principales son los siguientes:

(i)

Una vasta mayoría del Compuesto 10 se recuperó de la superficie del estrato córneo.

(ii)

Concentraciones mucho más bajas, pero aún así potencialmente antibacterianas, del Compuesto 10 se recuperaron dentro del estrato córneo.

(iii)

En ausencia de etanol, concentraciones subterapéuticas del Compuesto 10 fueron encontradas en la epidermis y en la dermis.

(iv)

En presencia de etanol, concentraciones más altas del Compuesto 10 fueron encontradas en la epidermis.

(v)

Ninguna formulación causó que una concentración potencialmente antibacteriana del Compuesto 10 alcanzara la dermis.

(vi)

Las formulaciones que contienen SLES fueron las únicas en las cuales se detectó el Compuesto 10 en concentraciones muy bajas en la fase receptora.

(vii)

La distribución del Compuesto 10 en la piel puede, a un cierto grado, ser manipulada mediante la formulación usada.

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Distribución de las células en la piel humana: estudios de imagen

Se investigó la distribución subcelular de las tinturas en los fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) y los queratinocitos dérmicos humanos (NHEK). Se cultivaron NHDF en portaobjetos de microscopio durante la noche y las células fueron entonces incubadas con el Compuesto 10 durante 5 minutos, durante 1 y 4 horas, células solas o incubadas fueron coteñidas con tinturas específicas de organelos. Para el etiquetado de lisosomas y mitocondrias se usaron LysoTrackerGreen (Sondas Moleculares) y Rodamina G6 (Sigma) respectivamente. Inmediatamente después de la incubación se examinó la localización subcelular por medio de microscopía fluorescente (Zeis Vario AxioTech, Alemania) usando un juego de filtros de dos bandas apropiado (Omega Optical) para la excitación y emisión. Usando una aplicación de software apropiada, es posible sobreponer fotografías digitales (fluorescencia) a fotografías de microscopía de luz transparentemente. Por la tanto la distribución de las tinturas puede ser localizada en una imagen. Además, la superposición de varias fotos digitales usando diferentes imágenes coloreadas es también posible.

Las células NHDF fueron cultivadas en portaobjetos de microscopio. A continuación, las células fueron incubadas con 1 \muM Compuesto 10 (fluorescencia verde) durante 1 hora y coteñidas con (A) tintes específicos de organelos para mitocondria (Rodamina G6; 50 ng/ml, 5 minutos, fluorescencia roja) y núcleo (Hoechst 33342, fluorescencia azul) o (B) tintes específicos de organelos para lisosomas (Lyso TrackerGreen, 10 \muM, 2 h, fluorescencia verde) y núcleo (Hoechst 33342, fluorescencia azul). La localización subcelular fue examinada por microscopía de fluorescencia (Zeis Vario Axio Tech, Alemania) usando un juego de filtro de doble banda adecuado (Omega Optical) para excitación y emisión. La colocalización es absorbida en fluorescencia amarilla.

La tinción de (A) lisosomas y (B) mitocondrias sin cotinción se muestra en la Figura 15.

La Figura 16 muestra la distribución de fluorescencia intracelular de las células NHDF incubadas con 1 \muM del Compuesto 10 durante 1 hora.

La fluorescencia del Compuesto 10 se localiza extranuclearmente y la cotinción con Rodamina G6 específica para mitocondria trajo como resultado la colocalización del Compuesto 10 (verde) y la fluorescencia de la mitocondria (roja). La colocalización es absorbida en fluorescencia amarilla (Figura 16).

La cotinción con el tinte específico para lisosomas (Lyso TrackerGreen) produjo una localización diferente del Compuesto 10 (rojo) y una fluorescencia lisosomal (verde) (Figura 16).

Conclusiones

No se observó asociación nuclear del Compuesto 10 en material nuclear en los materiales nucleares estudiados lo cual puede indicar que existe una baja posibilidad de actividad del compuesto contra el ADN.

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Referencias citadas en la descripción Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido. Literatura no relacionada con patentes citada en la descripción

\bulletTUNGER et al. Int. J. Microb. Agents, 2000, vol. 15, 131-135 [0002]

\bulletJORGENSEN et al. Clin. Infect. Dis., 2000, vol. 30, 799-808 [0002]

\bulletMALIK et al. J. Photochem. Photobiol. B Biol., 1990, vol. 5, 281-293 [0003]

\bulletBERTOLONI et al. Microbios, 1992, vol. 71, 33-46 [0003]

\bulletMALIK et al. J. Photochem. Photobiol. B Biol., 1992, vol. 14, 262-266 [0003]

\bulletBERTOLONI et al. FEMS Microbiol. Lett., 1990, vol. 71, 149-156 [0004]

\bulletNITZAN et al. Photochem. Photobiol., 1992, vol. 55, 89-97 [0004]

\bulletEHRENBERG et al. Photochem. Photobiol., 1985, vol. 41, 429-435 [0004]

\bulletVALDUGA et al. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 1993, vol. 21, 81-86 [0004]

\bulletMERCHAT et al. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 1996, vol. 32, 153-157 [0005]

\bulletMINNOCK et al. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 1996, vol. 32, 159-164 [0005]

\bulletMERCHAT et al. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 1996, vol. 35, 149-157

\bulletVALDUGA et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, vol. 256, 84-88 [0006]

\bulletREMINGTON. The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publishing Company, 1995 [0068]

\bulletSMITH. Curr Probl Cancer., 2002, vol. 26 (2), 67-108 [0081]

\bulletHOPPER. Lancet Oncol., 2000, vol. 1, 212-9 [0081]

\bulletDOUGHERTY. J Clin Laser Med Surg., 2002, vol. 20 (1), 3-7 [0081]

\bulletCEBURKOV; GOLLNICK. Eur J Dermatol., 2000, vol. 10 (7), 568-75 [0081]

\bullet Andrews' diseases of the skin: clinical dermatology. 2000, 312-4 [0092]

\bulletSADICK et al. Dermatologic Clinics, 1997, vol. 15 (2), 341-9 [0098]

\bullet Atopic Dermatitis, Eczema, and non-infectious immunodeficiency disorders. Andrews' diseases of skin. 69-76 [0107]

\bulletBREUER K et al. British Journal of Dermatology, 2002, vol. 147, 55-61 [0112]

\bullet C. BRÜCKER et al. J. Porphyrins Phthalocyanines, 1998, vol. 2, 455 [0144]

\bulletWIEHE, A.; SIMONENKO, E. J.; SENGE, M. O.; ROEDER, B. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines, 2001, vol. 5, 758-761 [0185] [0218]

\bulletMEHTA, GOVERDHAN; MUTHUSAMY, SENGODAGOUNDER; MAIYA, BHASKAR G.; AROUNAGUIRI, S. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1999, vol. 1, 2177-2182 [0234]

\bulletREDDI et al. Photochem. Photobiol., 2002, vol. 75 (5), 462-470 [0254]

\bulletLIN et al. Cancer Res., 1991, vol. 51, 1109-1116 [0267]

\bulletMOAN et al. Brit. J. Cancer, 1979, vol. 39, 398-407 [0267]

\bulletLOWRY et al. J. Biol. Chem., 1951, vol. 193, 265-275 [0277]

\bulletMOSSMAN et al. Immunological Methods, 1983, vol. 65, 55-63 [0286]

\bulletREDDI et al. Photochem. Photobiol., 2002, vol. 75, 462-470 [0294]

Claims (55)

1. Un compuesto de la fórmula I

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76

en el cual:

X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} representan de forma independiente un átomo de hidrógeno, un resto lipofílico, un grupo fenilo, un grupo inferior alquilo, alcarilo o aralquilo, o un grupo catiónico con la fórmula siguiente:

-L-R_{1}-N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4}

en el cual:

L está ausente o es un resto lipofílico seleccionado de un grupo consistente en fenoxi, fenileno, sulfonilamido, aminosulfonilo, sulfonilimino, fenilsulfonilamido, fenilaminosulfonilo, urea, uretano y restos de enlace de carbamato;

R_{1} representa un alquileno inferior, un alquenileno inferior o un alquinileno inferior, el cual es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrumpido con oxígeno), flúor, OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8}R_{9}, NR_{10}R_{11} y N^{+}R_{12}R_{13}R_{14}; y

R_{2}, R_{3} y R_{4} representan independientemente H, arilo, alquilo inferior, alquenilos inferior o alquinilo inferior, de los cuales los últimos tres son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrumpido con oxígeno), arilo, OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8}R_{9}, NR_{10}R_{11} y N^{+}R_{12}R_{13}R_{14}.

R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} representan independientemente H o un alquilo inferior

y en el cual:

el resto lipofílico es un grupo alquilo saturado de cadena lineal de fórmula -(CH_{2})_{p}CH_{3} donde "p" es un entero entre 1 y 22;

los grupos alquilos inferiores son seleccionados independientemente de un grupo consistente en grupos C_{1}-C_{20} alquilos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno;

los grupos alquilenos inferiores son seleccionados independientemente del grupo consistente en grupos C_{1}-C_{20} alquilenos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno;

los grupos alquenilos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C_{2}-C_{20} alquenilos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno;

los grupos alquenilenos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C_{2}-C_{20} alquenileno, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno;

los grupos alquinilos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C_{2}-C_{20} alquinilo, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno;

los grupos alquinilenos inferiores son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos C_{2}-C_{20} alquinilenos, lineales o ramificados, cíclicos o acíclicos, los cuales pueden ser interrumpidos con oxígeno;

los grupos arilos son independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos aromáticos carbocíclicos de seis a diez miembros, los cuales son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de flúor, ciano, nitro, alquilo inferior (según se define anteriormente; es decir, alcarilo), OR_{5}, C(O)R_{6}, C(O)OR_{7}, C(O)NR_{8}R_{9} y NR_{10}R_{11}; y

los grupos aralquilos son seleccionados independientemente del grupo consistente en grupos arilos (según se define anteriormente) enlazados al anillo de porfirina a través de un grupo alquilo inferior (según se define anteriormente)

siempre que al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} sea un grupo catiónico según se define anteriormente, compensado con un anión de compensación, y al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} sea un átomo de hidrógeno.

2. Un compuesto de la fórmula II

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en el cual M es un elemento metálico diamagnético o un elemento metaloide

y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son los que se definen en la Reivindicación 1.

3. Un compuesto según la Reivindicación 2, en el cual M es un elemento metálico divalente o trivalente.

4. Un compuesto según las reivindicaciones 2 ó 3, en el cual M es seleccionado de Zn(II), La(III), Lu(III), Y(III), In(III) Cd(II), Mg(II), Al(III), y Pd(II).

5. Un compuesto según la Reivindicación 2, en el cual M es un elemento metaloide.

6. Un compuesto según la Reivindicación 5, en el cual el elemento metaloide es silicio (Si) o germanio (Ge).

7. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual R_{1} es un grupo alquileno inferior no sustituido, un grupo alquenileno inferior o un grupo alquinileno inferior.

8. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual

R_{1} es

-(CH_{2})_{m}-

y "m" es un entero entre 1 y 20.

9. Un compuesto según la Reivindicación 8, en el cual "m" es un entero entre 1 y 10.

10. Un compuesto según la Reivindicación 9, en el cual "m" es un entero entre 1 y 3.

11. Un compuesto según la Reivindicación 10, en el cual "m" es 3.

12. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual R_{2}, R_{3} y/o R_{4} es un grupo alquilo inferior, un grupo alquenilo inferior o un grupo alquinilo inferior.

13. Un compuesto según la Reivindicación 12, en el cual R_{2}, R_{3} y/o R_{4} son grupos alquilos inferiores no sustituidos.

14. Un compuesto según las Reivindicaciones 12 ó 13, en el cual al menos uno de R_{2}, R_{3} y R_{4} es un grupo alquilo el cual es sustituido con un grupo amino primario, secundario o terciario, o con un grupo amonio cuaternario.

15. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual R_{1} es -(CH_{2})_{3}-, R_{2} y R_{3} son CH_{3} y R_{4} es -(CH_{2})_{3}-N(CH_{3})_{2}.

16. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, en el cual R_{1} es -(CH_{2})_{3}-, y R_{2}, R_{3} y R_{4} son cada uno CH_{3}.

17. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, en el cual R_{1} es -(CH_{2})_{3}-, y R_{2}, R_{3} y R_{4} son cada uno C_{2}H_{5}.

18. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} son

78

en el cual R es -R_{1}-N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4} según se define en la Reivindicación 1 y "n" es un entero entre 1 y 3.

19. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} son

79

en el cual R es -R_{1}-N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4} como se define en la Reivindicación 1 y "m" es un entero entre 1 y 3.

20. Un compuesto, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual X_{1}, X_{2}, X_{3} y/o X_{4} son:

80

en el cual cada R de forma independiente es -R_{1}-N^{+}(R_{2})(R_{3})R_{4}, según se define en la Reivindicación 1 y "n" y "m" son enteros entre 1 y 3 y donde la suma de "n" y "m" es un entero entre 1 y 3.

21. Un compuesto, según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 18 a la 20, en el cual "n" o "m" es 3.

22. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 18 a la 20, en el cual "n" o "m" es 2.

23. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 18 a la 20 ó 22, en el cual "n" y/o "m" es 1.

24. Un compuesto, según una cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el cual el compuesto comprende dos grupos catiónicos, según se define en la Reivindicación 1, en lados opuestos del anillo de porfirina, es decir, en las posiciones 5 y 15 del anillo o en las posiciones 10 y 20 del anillo.

25. Un compuesto, según la Reivindicación 24, en el cual X_{1} y X_{3} son un átomo de hidrógeno, un resto lipofílico, un grupo fenilo, un grupo alquilo, alcarilo o aralquilo inferiores y X_{2} y X_{4} son grupos catiónicos, o viceversa.

26. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 24, en el cual el compuesto comprende dos grupos catiónicos, según se define en la Reivindicación 1, en posiciones vecinas del anillo de porfirina, o sea, en las posiciones 5 y 10 del anillo, o en las posiciones 10 y 15 del anillo, o en las posiciones 15 y 20 del anillo o en las posiciones 20 y 5 del anillo.

27. Un compuesto según la Reivindicación 26, en el cual X_{1} y X_{2} son hidrógenos y X_{3} y X_{4} son grupos catiónicos, o X_{2} y X_{3} son hidrógenos y X_{4} y X_{1} son grupos catiónicos.

28. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual al menos uno de X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} es un resto lipofílico.

29. Un compuesto según la Reivindicación 28, en el cual el resto lipofílico es un grupo alquilo saturado, de cadena lineal de fórmula -(CH_{2})_{p}CH_{3}, en el cual "p" es un entero entre 1 y 18.

30. Un compuesto según la Reivindicación 29, en el cual "p" es un entero entre 2 y 16.

31. Un compuesto según la Reivindicación 30, en el cual "p" es un entero entre 4 y 12.

32. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 27, en el cual ni X_{1}, ni X_{2}, ni X_{3} ni X_{4} es un resto lipofílico.

33. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el cual ni X_{1}, ni X_{2}, ni X_{3} ni X_{4} es un grupo fenilo.

34. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el cual el compuesto es soluble en agua.

35. Un compuesto según la Reivindicación 1, en el cual el compuesto es seleccionado del grupo consistente en:

5,15-bis-(4-{3-[(3-Dimetilamino-propil)-dimetil-amonio]-propil-oxi}-fenil)-dicloruro de porfirina;

5,15-bis-[4-(3-Trietilamonio-propiloxi)-fenil]-dicloruro de porfirina;

5,15-bis-[3-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-dicloruro de porfirina;

5,15-bis-[4-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-dicloruro de porfirina;

5-[3,5-bis-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15-dicloruro de undecilporfirina;

5-{4-[3-Dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio-propiloxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-cloruro de porfirina;

3-[({3-[(3-{4-[15-(4-Dodeciloxi-fenil)-porfirin-5-il]-fenoxi}-propil)-dimetil-amonio]-propil}-dimetil-amonio)-
propil]-trimetil-tricloruro de amonio;

5,15-bis-[3-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-10-undecil-dicloruro de porfirina;

5-{4-[3-Dimetil-(3-trimetilamonio-propil)-amonio-propiloxi]-fenil}15-(4-dodeciloxi-fenil)-dicloruro de porfirina

5-[4-(3-Dimetildecil-amoniopropiloxi)-fenil]-15-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amoniopropiloxi]-fenil}-
dicloruro de porfirina; y formas metaladas los mismos.

36. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar como un agente terapéutico fotodinámico selectivo.

37. Un compuesto según la Reivindicación 36, en el cual la toxicidad del compuesto contra el microorganismo diana es al menos dos veces mayor que la toxicidad del compuesto contra las células de mamíferos.

38. Un compuesto según la Reivindicación 37, en el cual la toxicidad del compuesto contra un microorganismo diana es al menos diez veces mayor que la toxicidad de ese compuesto contra las células de mamíferos.

39. Un compuesto según la Reivindicación 37 ó la 38, en el cual el compuesto es sustancialmente no tóxico para las células de mamíferos.

40. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el anión de compensación está seleccionado de un grupo consistente en haluros, sulfatos, nitratos, percloratos, sulfonatos y trifluoroacetato.

41. Un compuesto según la Reivindicación 40, en el cual el anión de compensación es un haluro.

42. Un compuesto según la Reivindicación 41, en el cual el haluro es seleccionado del grupo consistente en fluoruro, cloruro y bromuro.

43. Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42 en una mezcla con un adyuvante, diluente o portador farmacéutica o veterinariamente aceptable.

44. Un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42 para ser usado en medicina.

45. El uso de un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42 en la preparación de un medicamento para ser usado en la terapia fotodinámica.

46. El uso de un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42 en la preparación de un medicamento para ser usado en el tratamiento curativo y/o profiláctico de las infecciones microbianas.

47. El uso de un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42 en la preparación de un medicamento para eliminar microorganismos.

\newpage

48. El uso según la Reivindicación 46 ó 47, en el cual los microorganismos son seleccionados de un grupo consistente en bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos y virus.

49. El uso según la Reivindicación 46 ó 47, en el cual los microorganismos son bacterias las cuales son resistentes a uno o más agentes antibióticos convencionales.

50. El uso de un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42 en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la infección dermatológica, infección pulmonar, infección de heridas y/o úlceras.

51. Una solución esterilizante que comprende un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42.

52. Una solución esterilizante según la Reivindicación 51 que además comprende un agente tensoactivo.

53. Un método para eliminar microorganismos in vitro que comprende el poner a los microorganismos en contacto con un compuesto según una cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 42, e iluminar el compuesto para destruir los microorganismos.

54. Un método para producir 5-[3,5-bis-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15-undecil-porfirina, comprendiendo el método la reacción de 5-(15-Undecil-porfirina-5-il)-benceno-1,3-diol con bromuro de (1-bromopropil)-trimetilamonio.

55. Un método para producir dicloruro de 5,15-bis-[4-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina, comprendiendo el método la reacción de 5,15-bis-[4-(3-Bromo-propiloxi)-fenil]-porfirina con trimetilamina.