CN104151386B - 苦马豆素衍生物及其科研试剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种苦马豆素衍生物及其科研试剂的制备方法，苦马豆素衍生物的合成步骤为：a、以苦马豆素为原料，以水为溶剂加入氯乙酸、氢氧化钾；b、血卟啉通入氯化亚砜，然后再加入冬虫夏草菌素；c、在步骤b得到的产物中倒入步骤a得到的产物，滴入新配制的乙醇钾，得到苦马豆素衍生物溶液。本发明的苦马豆素衍生物是在苦马豆素结构上衍生的产物，相比不同的是连接一种富集杂环，使本发明的苦马豆素衍生物具有富集癌细胞的功能，并能使药物趋向于患肿瘤的部位，而其他部位药物浓度甚微。

Description

苦马豆素衍生物及其科研试剂的制备方法

技术领域

本发明属于化学合成技术，特别涉及一种苦马豆素衍生物。

背景技术

1、癌在膜外转移的关键是唾液酸的黏附

癌症是以细胞异常增殖及转移为特点的一大类疾病，90％以上的癌症患者死于癌转移。

研究表明,癌症是几十种甚至几百种疾病的混合体，具有异质性特点。尽管癌症相当复杂，但癌症的发生有一个共同特征：患者体内唾液酸升高。肿瘤细胞表面的寡糖链末端是唾液酸，唾液酸的分支升高是黏附的关键环节，是癌细胞转移过程脱落和黏附的重要原因！本发明认为：癌转移的行为主要发生在膜外，它的限速步骤是克隆，但克隆的前一步却是黏附，消除黏附就导致肿瘤干细胞的失巢凋亡，是癌转移的薄弱环节。

2、苦马豆素的抗癌功能

苦马豆素的化学名称为：1、2、8三羟基八氢吲哚兹定。

苦马豆素的分子式为C₈H₁₅NO₃，相对分子质量173，熔点144℃一145℃，纯品为白色针状晶体，酸离解常数为7.4。

苦马豆素最初是从天然植物(醉马草、变性黄芪等)提取。由于物理提取法耗时长，效率低，提取物一般为混合物，提取过程产生神经毒性！这就是天然提取难以进行的原因。实验证明，天然提取和人工合成的苦马豆素抗癌效果相同。因此，研究开发人工合成苦马豆素为各国科学家所热衷。

苦马豆素能作用唾液酸末端，能消除癌转移的黏附，这已被国际科学界所证实。

苦马豆素具有免疫增强作用。实验证实，苦马豆素在治疗恶性肿瘤方面抑制率达73.8％，明显优于紫杉醇的治疗效果，且毒副作用远远低于其它抗肿瘤药物。国外报道苦马豆素已应用到三期临床,并被列为抗艾滋病病毒的侯选药物。

苦马豆素有四个手性原子的分子，这种看似简单的结构蕴藏着复杂的功能，有着独特的抗癌效果。苦马豆素能消除肿瘤细胞的黏附，诱导肿瘤干细胞失巢凋亡，控制癌转移；刺激机体的免疫系统，恢复NK细胞的能力；刺激机体骨髓细胞增殖。

目前苦马豆素存在问题是：国内外的动物、临床试验证明，苦马豆素溶液超过一定浓度，就会产生毒性，必须限制在规定浓度中。而且，苦马豆素用药后，在膀胱、肾和胸腺的含量最高，体内分布不均匀，杀肿瘤的剂量难以控制。

3、天然卟啉的定点靶向功能

为克服上述缺点，需要针对癌发生的部位，进行定点靶向治疗。卟啉类化合物具有靶向定位机理，具有招募癌细胞的功能。如果在苦马豆素结构加上卟啉环，由卟啉环吸引癌细胞，连接的苦马豆素分子可云集在癌细胞周围，定点消灭癌细胞。

卟啉是通过低密度脂蛋白(LDL)受体的吞噬作用与肿瘤细胞相结合来实现的，癌细胞具有较高浓度的低密度脂蛋白，因此卟啉类化合物可以在肿瘤细胞中选择性积聚。血中卟啉的含量可能与肿瘤有关，肿瘤组织中过氧化氢酶和细胞色素C大降低，癌细胞失去了合成卟啉的能力，肿瘤组织中几乎完全不存在卟啉，注射给患者的血卟啉类衍生物(hematoporphyrin derivative，HPD)能很快被肿瘤组织摄取。

图1为卟啉在正常组织和肿瘤组织中的酸平衡体系。在肿瘤组织的酸性环境中，卟啉共存在四种分子(离子)，其中中性分子HP⁺(CO₂H)(CO₂)占(44％)，而在正常组织中，平衡体系有三种分子(离子)，中性分子只占3％，与带电离子相比，中性分子更容易穿透细胞膜而进入细胞，这就为卟啉在肿瘤中的积聚提供了解释。

据报道，为了利用卟啉环对癌细胞的富集作用，有多种抗癌药都与卟啉连接，提高抗癌效果。例如，顺铂、氮芥、氟脲嘧啶、甲氨喋呤、蒽醌、哌嗪等，都与卟啉连成体系，在一定程度上降低了毒副作用、增加了靶向效果。

然而，苦马豆素正在国外进行三期临床实验，虽然抗癌疗效基本肯定，但对药物浓度、耐药性和靶向用药也处于攻坚状态，尚未进行卟啉环的连接。

4、连接卟啉和苦马豆素的连接剂本发明的连接剂是冬虫夏草菌素(虫草素)，化学结构如下：

冬虫夏草菌素(虫草素)是一种无毒的连接剂，将苦马豆素和天然卟啉连成一种弱的共价键，弱的共价键易水解，在靶向部位分解成游离的苦马豆素和天然卟啉。根据天然卟啉能招募癌细胞的特点，靠连接剂的引领，苦马豆素能云集在癌细胞周围，从而发挥双重的抗癌功能。

药理作用：对人鼻咽癌细胞(KB)生长有抑制作用，注射于艾氏腹水癌的小鼠腹腔的小(15～200mg/kg)能延长小鼠存活的时间，对枯草杆菌(1mg/ml)有抑制作用，另对鸟型结核杆菌也有抑制作用。

这种连接苦马豆素和天然卟啉的物质，是一种新的化合物，由此称为苦马豆素衍生物。

5、β-环糊精作为包含物

β-环糊精是一种无毒的试剂，包裹着苦马豆素衍生物，制成了一种超分子包含物。用口服方法，可防止胃液对弱连接剂的水解。

为此，我们通过化学合成制成苦马豆素-卟啉体系，并进行动物实验，相比之下，比单纯的苦马豆素靶向效果要好。

发明内容

本发明的目的是提供一种苦马豆素衍生物及其科研试剂，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种苦马豆素衍生物，其化学结构式如下：

一种β-环糊精包裹的超分子包含物，用β-环糊精包裹权利要求1中所述苦马豆素衍生物。

上述的苦马豆素衍生物的合成方法，有以下合成步骤：

a、以苦马豆素为原料，以水为溶剂加入氯乙酸、氢氧化钾；合成反应式如下：

b、血卟啉通入氯化亚砜，然后再加入冬虫夏草菌素，反应式如下：

c、在步骤b得到的产物中倒入步骤a得到的产物，滴入新配制的乙醇钾，得到苦马豆素衍生物溶液，反应式如下：

本发明的有益效果：本发明的苦马豆素衍生物与苦马豆素具有相同的抗癌功能，即能消除肿瘤细胞的黏附，诱导肿瘤干细胞失巢凋亡，控制癌转移；刺激机体的免疫系统，恢复NK细胞的能力；刺激机体骨髓细胞增殖。但是，本发明的苦马豆素衍生物是在苦马豆素结构上衍生的产物，相比不同的是连接一种富集杂环，使本发明的苦马豆素衍生物具有富集癌细胞的功能，并能使药物趋向于患肿瘤的部位，而其他部位药物浓度甚微。

其优点为：

第一、一种富集杂环具有招募癌细胞的功能，具有靶向作用；

第二、不杀害正常细胞，而是消除癌细胞的黏附，使之发生“失巢凋亡”；

第三、药物浓度集中在癌病灶，其他部位药物浓度甚微，这也就避免了苦马豆素的肝毒性。

第四、改变苦马豆素的构象，生成产物手性醇，消除了与多巴胺相似的构象，失去了竞争性抑制的效果，才能使本发明的苦马豆素衍生物具有高效、无毒的抗癌药。

第五、从经济效益来看，由原料制成苦马豆素纯品，成本极高、工艺复杂、环境污染严重，虽然价格昂贵，但与本发明的苦马豆素衍生物相比，赢利甚微，销售困难、竞争对手多。如以苦马豆素为原料，生产本发明的苦马豆素衍生物，其市场情况正好相反。

第六、苦马豆素用于治疗，一方面要控制药物本身的浓度，另一方面还要考虑药物在患者体内的云集浓度。药理学要考虑耐药性，毒理学还要考虑“醉马草”本身的毒性、用药后残余的神经片段毒副作用。而本发明的苦马豆素衍生物上的一种富集杂环使药物浓度集中在癌病灶上，并生成产物手性醇，从源头上杜绝了隐患。本发明的苦马豆素衍生物属于配制型产品，适用于流水线生产，便于大量灌装口服制剂，生产效益极为壮观。

附图说明

图1为卟啉在正常组织和肿瘤组织中的酸平衡体系；

图2为用苦马豆素衍生物检验SiHa和HCT116的癌细胞株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

(一)本实施例采用的药品(分析纯)

苦马豆素纯品(德国进口) 上海哈灵生物科技有限公司

原卟啉 上海哈灵生物科技有限公司

冬虫夏草菌素(虫草素) 上海士锋生物科技有限公司

β-环糊精 上海哈灵生物科技有限公司

溶解度大的客分子加有机溶媒促进沉淀与包含物的分离。

水中难溶的客分子，加少量溶媒溶解后再加入饱和溶液中。

包含物为沉淀，则过滤、水洗，取少量适当有机溶媒洗除残留药物，干燥即得。

苦马豆素衍生物科研试剂的制备方法，具体步骤如下：

本发明是以苦马豆素为原料，利用原卟啉进行修饰，将冬虫夏草菌素(虫草素)作为弱的共价键，连接苦马豆素和原卟啉，再用β-环糊精包裹，制成超分子化合物。这种超分子化合物是一种复合物，用于动物实验。

具体步骤如下：

1、将苦马豆素药品配成溶液

苦马豆素是一种有效的抗癌药物，但含量稍高(＞1.9×10^-7mol/L)，便可引起人和动物中毒。故苦马豆素溶液的浓度1.9×10^-7mol/L是动物和临床实验的限量浓度。

将一毫克苦马豆素溶解在三十升0.9％的生理盐水中，便可配制成1.9×10^-7mol/L的苦马豆素溶液。

由于一毫克苦马豆素是微量物质，仅在瓶壁上显示微弱的粉渣痕迹，而且苦马豆素价格昂贵，为200美元/毫克，故在称量上比较困难。

为较准确地配制1.9×10^-7mol/L，采取一次溶解逐量稀释法配制溶液浓度。

具体操作为：

(1)将1mg(0.001g)苦马豆素用少量0.9％的生理盐水溶解在50毫升烧杯中，再倒入体积为100毫升的容量瓶中，滴到刻度，振荡、静置。

0.001g÷173ɡ/mol÷0.1L＝0.0000578mol/L＝5.78×10^-5mol/L

(2)再从这100毫升溶液中取出10毫升，再倒入体积为100毫升的容量瓶中，滴到刻度，振荡、静置。

0.0000578mol/L×0.01L＝0.000000578mol

0.000000578mol÷0.1L＝0.00000578mol/L＝5.78×10^-6mol/L

(3)将第二次配制的100毫升溶液分成三十份(3.3333毫升/份)，取其一份(其余放入冰箱保存)，再倒入体积为100毫升的容量瓶中，滴到刻度，振荡、静置。

0.00000578mol/L×0.1L＝0.000000578mol 0.000000578mol÷30＝0.000000019mol0.000000019mol÷0.1L＝0.00000019mol/L＝1.9×10^-7mol/L

(4)这样，便可配制成1.9×10^-7mol/L的苦马豆素溶液，放入冰箱保存。

2、原卟啉的浓度

实验证明，当注射的天然卟啉的剂量达到每千克20毫克时，药物的抗癌作用最强，接受研究的85％的实验鼠身上的肿瘤完全消失。

根据天然卟啉每千克20毫克的剂量，为0.02毫克/克，每只小白鼠质量如为20克，注射的原卟啉的剂量应为20克×0.02毫克/克＝0.4毫克。(相当于苦马豆素每支的用量)0.4毫克×50支＝20毫克(原卟啉)

苦马豆素每支用量为：

0.00003287毫克/毫升×5毫升＝0.00016435毫克。

故苦马豆素：原卟啉＝0.00016435毫克：0.4毫克

即将8毫克原卟啉与0.003287毫克苦马豆素溶解在第三步的100毫升溶液中，得到最佳剂量的配比浓度。

3、连接剂-冬虫夏草菌素(虫草素)作为弱共价键的连接剂。4、β-环糊精的浓度

(1)包合材料

环糊精cyclodextrin,

又称Schardinger dextrin，

常见的α、β和γ三种，分别由6个、7个、8个葡萄糖所组成。

(2)环糊精的结构与性质

环糊精系淀粉经酶解环合后得到的由6－12个葡萄糖分子连结而成的环状低聚糖化合物。

(3)饱和水溶液法

溶解度大的客分子加有机溶媒促进沉淀与包含物的分离。水中难溶的客分子，加少量溶媒溶解后再加入饱和溶液中。

包含物为沉淀，则过滤、水洗，取少量适当有机溶媒洗除残留药物，干燥即得。

(三)化学合成步骤

1、在常温下，将配制的1.9×10^-7mol/L浓度的苦马豆素溶液100ml倒入1000ml的烧杯中，逐滴加入氯乙酸10ml，用电动搅拌器搅拌30～60分钟，再用0.1mol/L的氢氧化钾逐滴加入上述溶液中，作用掉过量的氯乙酸，用pH试纸检测到中性即可；放冷后，倒入贴有标签的130ml的试剂瓶中，备用；反应式如下：

2、将血卟啉8mg加入带导管的双孔胶塞的烧瓶中，通入氯化亚砜，20～30分钟后，旋转蒸发除去多余的氯化亚砜；30～60分钟后，加入冬虫夏草菌素(虫草素)16mg，继续搅拌1h～2h；反应式如下：

3、在连接血卟啉的冬虫夏草菌素(虫草素)的烧瓶中，倒入连有乙酸残基的苦马豆素溶液，用电动搅拌器搅拌1h～2h；5分钟间歇滴入新配制的乙醇钾三滴，直到实验完毕！此时得到的是苦马豆素衍生物溶液；反应式如下：

4、动物灌肠苦马豆素衍生物溶液时，经胃液水解，连接剂断开，失去定点靶向作用，故用β-环糊精包裹。本发明用饱和水溶液法配制包含物，将β-环糊精粉末加入到苦马豆素衍生物溶液中，用电动搅拌器搅拌1h～2h。逐渐加入，直至配成饱和溶液。过滤上层清液，倒入贴有标签的130ml的试剂瓶中，在2～8℃的冰箱中冷藏，备用。得到β-环糊精包裹的超分子包含物。

(四)癌细胞株实验

用苦马豆素衍生物检验SiHa和HCT116的癌细胞株，如图2。

说明：1、SiHa细胞——人子宫颈鳞癌细胞株。

在裸鼠中，此细胞能形成低分化表皮样(三级)。

癌基因：PRB和P53阳性。

2、HCT116细胞-人结肠癌细胞株，能贴壁生长，成癌性强。

该图的纵坐标为癌细胞的成活率百分比(％)，横坐标为苦马豆素衍生物的浓度(μg/ml)。

由图可见，杀死癌细胞与苦马豆素衍生物的浓度成正比，当达到3μg/ml时，抑制率达90％以上。随着时间的延长，抑制率提高，在相同浓度下，72小时比24小时抑制率更高！

由于癌细胞株处于离体状态，苦马豆素衍生物的浓度为3μg/ml才能杀死癌细胞，浓度显然偏高。这个实验证明了苦马豆素衍生物的抗癌功能，不适于体内抗癌的浓度。

苦马豆素衍生物在体内抑制癌细胞的转移，是以消除黏附为手段，达到癌细胞失巢凋亡的结果。为此，苦马豆素衍生物在体内用量较低，溶液浓度在1.9×10^-7mol/L时，便可消除癌细胞的黏附。实验证明，治疗浓度在1.9×10^-7mol/L时，对动物和人体是安全的。这和一些化疗药物的副作用是不同的。

Claims (4)

1.一种苦马豆素衍生物，其特征在于：其化学式如下：

2.一种β-环糊精包裹的超分子包含物，其特征在于：

用β-环糊精包裹权利要求1中所述苦马豆素衍生物。

3.如权利要求1所述的苦马豆素衍生物的合成方法，其特征在于：有以下合成步骤：

a、以苦马豆素为原料，以水为溶剂加入氯乙酸、氢氧化钾；合成反应式如下：

b、血卟啉通入氯化亚砜，然后再加入冬虫夏草菌素，反应式如下：

c、在步骤b得到的产物中倒入步骤a得到的产物，滴入新配制的乙醇钾，得到苦马豆素衍生物溶液，反应式如下：

。

4.一种权利要求2所述的β-环糊精包裹的超分子包含物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、在常温下，将配制的1.9×10^-7mol/L浓度的苦马豆素溶液100ml倒入1000ml的烧杯中，逐滴加入氯乙酸10ml,用电动搅拌器搅拌30～60分钟，再用0.1mol/L氢氧化钾逐滴加入上述溶液中，作用掉过量的氯乙酸，用pH试纸检验到中性即可；放冷后，倒入贴有标签的130ml的试剂瓶中，备用；

(2)、将血卟啉8mg加入带导管的双孔胶塞的烧瓶中，通入氯化亚砜，20～30分钟后，旋转蒸发去多余的氯化亚砜；30～60分钟后，加入冬虫夏草菌素16mg，继续搅拌1h～2h；

(3)、在装有步骤(2)制备得到的连接血卟啉的冬虫夏草菌素的烧瓶中，倒入步骤(1)制备得到的连有乙酸残基的苦马豆素溶液，用电动搅拌器搅拌1h～2h，5分钟间歇滴入新配制的乙醇钾三滴，得到苦马豆素衍生物溶液；

(4)、用饱和水溶液法配制包含物，将β-环糊精粉末加入到苦马豆素衍生物溶液中，用电动搅拌器搅拌1h～2h，逐渐加入，直至配成饱和溶液，过滤上层清液，倒入贴有标签的130ml的试 剂瓶中，在2～8℃的冰箱中冷藏，备用。