NL1009472C2 - Werkwijze voor het inactiveren van virussen. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het inactiveren van virussen

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het inactiveren van virussen in een erytrocyten-bevattende vloeistof onder gebruikmaking van licht, waarbij een sensitizer aan de vloeistof wordt toegevoegd.

5 Een dergelijke werkwijze is beschreven in de niet vóórgepubliceerde Nederlandse octrooiaanvrage 1006219. Hierbij wordt aan een erytrocyten-bevattende vloeistof, zoals bijvoorbeeld verdund bloed, een sensitizer toegevoegd, waarna de vloeistof met licht wordt bestraald, waarbij de sensitizer 10 wordt geëxciteerd. Door interactie tussen de geëxciteerde sensitizer en aanwezige zuurstof ontstaan reactieve zuurstof-species waardoor een aanwezig virus wordt geïnactiveerd. Door andere interacties van de geëxciteerde sensitizer kunnen radicalen en andere reactieve species ontstaan, waardoor even-15 eens een aanwezig virus kan worden geïnactiveerd.

Een nadeel van het toepassen van een dergelijke bekende werkwijze voor het inactiveren van virussen is, dat naast het virus ook de erytrocyten zelf worden beschadigd door reactieve zuurstofspecies. Hierdoor wordt de mate waarin 20 de virussen kunnen worden geïnactiveerd beperkt.

De onderhavige uitvinding heeft als doel dit nadeel te vermijden. Dit doel wordt volgens de onderhavige uitvinding bereikt doordat een aan het oppervlak van een erytrocyt bindend, tegen inwerking van singlet-zuurstof en/of radicalen 25 beschermend agens aan de vloeistof wordt toegevoegd. De vloeistof zal in het algemeen zuurstof bevatten.

Zoals uit de voorbeelden hierna blijkt, wordt door het toevoegen van het agens volgens de uitvinding de erytrocyt in hogere mate beschermd tegen fotodynamische beschadi-30 ging dan het virusdeeltje.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm is het agens aan een aan het erytrocyt-oppervlak bindende drager gebonden, met voordeel covalent. Hierdoor is een groter aantal agensmo-leculen beschikbaar. Bovendien is de specificiteit "vrij" te 35 kiezen. Bij voorkeur is deze drager een antilichaam tegen een 1009472 2 oppervlak-antigeen van de erytrocyt, zoals IgM. IgM bindt zwak en is zodoende naderhand weer makkelijk te verwijderen.

Volgens een ander kenmerk volgens de uitvinding is het agens een ligand voor een transporteiwit, bij voorkeur 5 een anionentransporteiwit.

Dergelijke transporteiwitten komen in betrekkelijk grote aantallen op het celoppervlak voor en bieden derhalve een geschikte mogelijkheid het celoppervlak te beschermen.

Volgens een ander kenmerk volgens de uitvinding is 10 het transporteiwit een Band 3-eiwit, dat deel uitmaakt van een complex dat onder andere het voor erytrocyten belangrijke HCO3-transport verzorgt. De "concentratie" van Band 3-eiwit-ten aan het celoppervlak is hoog (~106 kopieën per cel). Verder komen aan Band 3 verwante structuren niet/vrijwel niet 15 voor op het oppervlak van membraanvirusdeeltjes, zodat voor Band 3 specifieke liganden een veel lagere affiniteit zullen hebben voor het oppervlak van het virusdeeltje. Bovendien is Band 3 intensief bestudeerd en zijn er vele liganden bekend die aan Band 3 binden.

20 Volgens één uitvoeringsvorm bindt het ligand aan een transportplaats van het transporteiwit, waarbij het ligand bij voorkeur pyridoxaalfosfaat (PDP) of een derivaat ervan is. PDP is een vitamine, zodat het in behandelde erytrocyten-suspensie achterblijven van relatief kleine hoeveelheden er-25 van geen problemen op zal leveren. Er dient opgemerkt te worden, dat de gebruikte golflengte van het licht zodanig moet worden gekozen dat dit bij gebruik van PDP (zelf ook een sensitizer) alleen de als sensitizer beoogde, toegevoegde verbinding aanslaat en niet PDP.

30 Volgens een andere uitvoeringsvorm bindt het ligand aan de kanaalplaats van het eiwit, waarbij het ligand bij voorkeur dipyridamol (DIP) of een derivaat ervan is. DIP is een reeds geregistreerd geneesmiddel, waarvan bekend is dat neveneffecten van het gebruik ervan beperkt zijn.

35 Volgens weer een andere uitvoeringsvorm bindt het ligand aan de conformatieplaats van het eiwit. Een dergelijk ligand kan bijvoorbeeld een translokatieremmer zijn zoals bijvoorbeeld nifluminezuur.

I 0 0 §4 7 2 3

Hierna zal de onderhavige uitvinding nader worden toegelicht aan de hand van uitvoeringsvoorbeelden.

Voorbeeld 1 5 Bloed, verkregen van gezonde donoren, werd kort na afname gecentrifugeerd, en de erytrocyten werden drie keer gewassen met NaCl-HEPES buffer (150 mM NaCl-10 mM HEPES (ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio), pH 7,6). Door verdunning in deze buffer werd een 2% erytrocytensuspensie verkregen.

10 Hieraan werden 105 Vesiculair Stomatitis-virus (VSV) -deeltjes per ml toegevoegd (San Juan strain, verkregen van de afdeling Virologie, LUMC, Leiden). Verder werd als sensitizer dimethylmethyleenblauw (Aldrich, Nederland) in een eindcon-centratie van 1 μΜ toegevoegd. De verkregen erytrocytensus-15 pensie werd in vier porties verdeeld (A, B, C en D). Aan portie A werd niets toegevoegd; aan portie B 1 mM pyridoxaal-fosfaat PDP; aan C 0,1 mM dipyridamol DIP; en aan D 1 mM py-ridoxaalfosfaat plus 0,1 mM dipyridamol. Vervolgens werden de porties A, B, C en D bestraald met licht van een 500 W halo-20 geenlamp, welk licht door een waterfilter (voor het wegnemen van warmte-effecten) was gepasseerd en vervolgens door een laagdoorlaatfilter met een afkapwaarde van 590 nm. De lichtintensiteit was uiteindelijk 15 mW/cm2. Vervolgens werden bepaald: 25 - de kalium-lekkage (K-lek) uit erytrocyten na ver schillende belichtingstijden (fig. 1); - virusinactivering na verschillende belichtingstijden (fig. 2) .

Het bleek dat het virus door de combinatie pyri-30 doxaalfosfaat/dipyridamol in geringe mate werd beschermd tegen fotodynamische inactivering, terwijl (met name na korte belichtingstijden) de erytrocyt in sterke mate werd beschermd tegen (fotodynamisch veroorzaakte) celwandschade zoals blijkt uit de kleine K-lek. Een grote K-lek is een teken dat aan-35 zienlijke celschade is opgetreden.

Voorbeeld 2

Ter controle is een experiment uitgevoerd, om aan te tonen dat het belichten van de erytrocytensuspensie zonder de 1009472 4 sensitizer geen fotodynamische schade levert aan de erytrocyt en/of het virus.

Het experiment van voorbeeld 1 werd herhaald, dit keer in aanwezigheid van dipyridamol en/of pyridoxaalfosfaat, 5 maar in afwezigheid van de sensitizer dimethylmethyleenblauw. Het belichten van de erytrocytensuspensie had inderdaad geen enkel effect voor wat betreft de virusinactivatie.

1003472

Claims (12)

1. Werkwijze voor het inactiveren van virussen in een erytrocyten-bevattende vloeistof onder gebruikmaking van licht, waarbij een sensitizer aan de vloeistof wordt toegevoegd, met het kenmerk, dat een aan het oppervlak van een 5 erytrocyt bindend, tegen inwerking van singlet-zuurstof en/of radicalen beschermend agens aan de vloeistof wordt toegevoegd .

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het agens aan een aan het erytrocyt-oppervlak bindende 10 drager is gebonden.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de drager een antilichaam tegen een oppervlak-antigeen van de erytrocyt is.

4. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, 15 met het kenmerk, dat het agens een ligand voor een trans- porteiwit is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het transporteiwit een anionentransporteiwit is.

6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het ken-20 merk, dat het transporteiwit een Band 3-eiwit is.

7. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het ligand bindt aan de transportplaats van het eiwit.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, 25 dat het ligand pyridoxaalfosfaat (PDP) of een derivaat ervan is.

9. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies 3-5, met het kenmerk, dat het ligand bindt aan de kanaal-plaats van het eiwit.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het ligand dipyridamol (DIP) of een derivaat ervan is.

11. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het ligand bindt aan de conformatie-plaats van het eiwit.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het ligand nifluminezuur is. 1009472