JP2004510790A - 血液製剤中のウイルス粒子の不活化方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血液製剤、より詳細には赤血球および血小板中のウイルス粒子を不活化する方法に関し、該血液製剤を光増感剤と組み合わせる工程、および該光増感剤を活性化させる工程を包含する。本発明によれば、所定の構造を有する正に荷電した光増感剤が用いられる。驚くべきことに、血液製剤に対するダメージは大幅に低減される。
Description
【書類名】明細書
【発明の名称】血液製剤中のウイルス粒子の不活化方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】血液製剤中に存在するウイルス粒子を不活化する方法であって、
前記血液製剤を光増感剤と組み合わせる工程と、
前記光増感剤を活性化させる工程と、
を包含し、前記光増感剤として、化学式Ｉ、すなわち、
【化１】
の化合物を用いることで特徴付けられ、ここで、Ｒ１は、
・水素と、
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ２０）アシル、（Ｃ１−Ｃ２０）アシルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルであって、各々は直鎖状または分枝状であり得、またその各々は、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニル、および−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６から選択される１個から３個の基で置換され得、式中Ｒ５は、（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、Ｒ６は（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルであり、そしてｍおよびｎは、独立して１−１０であり、このアミノ基の各置換基は直鎖状または分枝状であり得、その各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、および
・ハロゲン原子、
から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
・（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ２０）複素環式アリール基であって、各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される１個から３個の基で置換され得、この各々は直鎖状または分枝状であり得、その各々が、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、
・ハロゲン原子、および
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
からなる群から選択され、
Ｒ ２ 、Ｒ ３ およびＲ ４ は、ピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ １ −Ｃ ４ ）のアルキル基で置換され、そしてＸは、薬学的に許容し得る対イオンである方法。
【請求項２】Ｒ１が、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される一つから三つの基で置換され得るアミノで置換されている（Ｃ ６ −Ｃ ２０ ）のアリール基であり、この各々は、直鎖状または分枝状であり得、そしてその各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ １ −Ｃ ３ ）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】光増感剤は、モノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィリンクロリドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血液製剤中のウイルス粒子を不活化させる方法に関し、この方法は、
−該血液製剤を光増感剤と組み合わせる工程、および
−前記光増感剤を活性化させる工程、を包含する。
【０００２】
感染した血液製剤の輸液によるウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）の伝染は、深刻な健康の問題である。
米国特許第５，３６０，７３４号は、血漿、赤血球、血小板、白血球および骨髄などの体液中のウイルス性病原体の不活化方法を記載する。
【０００３】
この方法は、光増感剤を血液製剤に添加し、光を照射してこの光増感剤を活性化させて、これによりウイルス性病原体を不活化する工程を包含する。米国特許第５，３６０，７３４号に開示される方法は、特に、赤血球の安定性を高めるために、血漿タンパク質の影響を減少させることを目標としている。
【０００４】
本発明の目的は、血液製剤、特に赤血球および血小板の安定性を高める更なる方法を提供することにあり、この方法は、米国特許第５，３６０，７３４号に開示される改良点と組み合わせて用いてもよく、組み合わせずに用いてもよい。
【０００５】
従って、本発明は、光増感剤として、化学式Ｉ
【０００６】
【化５】
の化合物を用いることで特徴付けられる上記の方法に関するものであり、ここで、Ｒ１は、
・水素と、
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ２０）アシル、（Ｃ１−Ｃ２０）アシルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルであって、各々は直鎖状または分枝状であり得、またその各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニル、および−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６から選択される１個から３個の基で置換され得、式中Ｒ５は（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、Ｒ６は（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルであり、そしてｍおよびｎは独立して１−１０であり、このアミノ基の各置換基は直鎖状または分枝状であり得、その各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、および
・ハロゲン原子、
から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
・（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ２０）複素環式アリール基であって、各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される１個から３個の基で置換され得、この各々は直鎖状または分枝状であり得、その各々が、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、
・ハロゲン原子、および
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
からなる群から選択され、
Ｒ ２ 、Ｒ ３ およびＲ ４ は、ピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ １ −Ｃ ４ ）のアルキル基で置換され、そしてＸは、薬学的に許容し得る対イオンである。
【０００７】
驚くべきことに、上記で開示したような光増感化合物を用いることによって、血液製剤に対するダメージは大幅に低減される。これは、血液製剤に対するダメージの程度を測定するためのモデルとして通常認識されている実験から明らかである。特に、これは溶血および機能的パラメータを測定する実験において示された。一般に、Ｒ１が脂肪族基の場合、１−６個の原子を有するような短鎖が好ましい。
【０００８】
本発明において、用語「血液製剤」は、ｉ）赤血球およびｉｉ）血小板のうちの少なくとも１つを含む任意の溶液として理解されるべきである。他の細胞型が存在していてもよく、そしてこの溶液は、水溶液ではあるが、当該分野で通常認められるように、タンパク質成分、塩、安定剤、クエン酸またはヘパリンなどの抗凝固剤を含んでいてもよい。
【０００９】
用語「光増感剤」は、当該分野で周知のように、光エネルギーを吸収して、その結果、その光増感剤が活性化されるような物質である。活性化された光増感剤は、次に他の化合物と反応し得る。その結果、光増感剤は修飾されるか、あるいは不活性化されることもあるが、どちらかといえば光増感剤は（光で活性化される前の）元の状態に戻って、その中で光増感剤が再び利用され得る光触媒サイクルを形成する。結果的には、吸収された光エネルギーは、ウイルス粒子の不活化に用いられる。
【００１０】
用語「ウイルス粒子」は、血液製剤中に発生し得る一本鎖または二本鎖の膜またはタンパク質の外被を有する、任意のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを意味するものと理解される。例は、ＨＩＶおよびＢ型肝炎である。
【００１１】
用語「薬学的に許容可能な対イオン」は、ＯＨ−、Ｃｌ−、酢酸イオンまたはクエン酸イオンのような、無機または有機の負に荷電した任意の対イオンであると理解される。実際の活性化合物Ｉの正電荷を中和するのに必要なだけの対イオンＸが存在することは言うまでもない。
【００１２】
Ｂｅｎ−Ｈｕｒ Ｅ．らは、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３５（５）、４０１−６頁（１９９９）において、赤血球を含む溶液中に存在するウイルスの不活化方法を開示している。赤血球を保護するために保護剤を添加しなければならない。その結果、出願人は、保護剤Ｔｒｏｌｏｘを溶解することが困難であったため、再現することができず、溶血は保存１０日後には１％を越えた。対照的に、本発明の方法では、保護剤無しで、５週間後、溶血は対照よりも多くても１％上回るだけである。以下に提示する実験は、血液細胞に対するダメージを低減するように設計された血液用の特別の容器ではなく、ガラス試験管中で行われたことに留意のこと。もちろん、本発明による方法は、ＰＣＴ／ＮＬ９９／００３８７に開示されているような保護剤の添加をも考慮に入れている。
【００１３】
第一の実施態様によれば、Ｒ１は、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される一つから三つの基で置換され得るアミノで置換されている（ Ｃ ６ −Ｃ ２０ ）のアリール基であり、この各々は、直鎖状または分枝状であり得、そしてその各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得る。アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ １ −Ｃ ３ ）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることが好ましい。
【００１４】
上記で定義された基の中の第四級窒素原子は、血液製剤の完全性を維持しながら、ウイルス粒子、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を排除するのに非常に適していることが見いだされた。
【００１５】
本発明を、以下、例示の実施態様および図面を参照して説明する。
【００１６】
実施例
血液製剤
本研究全体を通して用いられる血液製剤は、軟膜を有さない標準血球濃縮物（ＲＢＣＣ）であり、サンクイン血液銀行（Ｓａｎｑｕｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）（ライデン−ハーグランデン（Ｌｅｉｄｅｎ−Ｈａａｇｌａｎｄｅｎ）、ライデン、オランダ国）から供給され、健康人のボランティアから得られた。これらのドナーからの血液（５００±５０ｍｌ）を、四つのポリ塩化ビニルの袋（ＮＰＢＩ、エンマー−コンパスクーム（Ｅｍｍｅｒ−Ｃｏｍｐａｓｃｕｕｍ）、オランダ国）の中の７３ｍｌのクエン酸−リン酸−ブドウ糖（ＣＰＤ）中に採取した。ＲＢＣＣを、以前に記載されたように調製した（Ｎｏｖｏｔｎｙ、１９９２）。防腐作用のある生理食塩水−アデニン−グルコース−マンニトール（ＳＡＧ−Ｍ）でヘマトクリットを５６±４に調節した。ＳＡＧ−Ｍは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグルコース、２９ｍＭのマンニトールおよび１．２５ｍＭのアデニンを含む。白血球の数は、自動細胞計数装置（Ｓｙｓｍｅｘ Ｋ１０００、東亞医用電子（ＴＯＡＭｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、神戸、日本）で測定して、１．８±０．９＊１０９細胞／ｌであった。
【００１７】
ウイルス含有ＲＢＣＣの光力学的処理
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のストック溶液（Ｓａｎ Ｊｕａｎ株、ライデン大学メディカルセンター、ウイルス部門のご好意により提供）を、添加量がＲＢＣＣの総量の＜１０％となり、かつウイルス粒子の数が約１０５／ｍｌとなるようにＲＢＣＣに加えた。増感剤を、最終濃度が、フタロシアニンテトラスルホン酸アルミニウム（ＡＩＰｃＳ４、ポルフィリン・プロダクツ社（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ、米国）５μＭ、フタロシアニンケイ素、ＨＯ−ＳｉＰｃ（ＣＨ３）２（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２（Ｐｃ４、Ｍ．Ｅ．Ｋｅｎｎｅｙ博士、ケースウェスタンリザーブ大学、クリーブランド、オハイオ、米国より提供）０．４５μＭ、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ、ＩＣＮバイオメディカルズＢＶ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＢＶ）、ズーテルメール（Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ）、オランダ国）１５μＭ、および本発明により、モノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４ピリジル）ポルフィリンクロリド（ＴｒｉＰ（４）、ミッド−センチュリー社（Ｍｉｄ−Ｃｅｎｔｕｒｙ）、ポーセン（Ｐｏｓｅｎ）、イリノイ、米国）２５μＭとなるように添加した。懸濁液をよく混合し、そして直径９ｃｍのポリスチレン培養ディッシュ（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、アルフェン・アーン・ライン（Ａｌｐｈｅｎ ａ／ｄ Ｒｉｊｎ）、オランダ国）に６ｍｌのアリコートとして分取し、そして室温で水平往復振盪機（６０サイクル／分、ＧＦＬ、ブルグヴェーデル（Ｂｕｒｇｗｅｄｅｌ）、ドイツ）で暗所にて５分間撹拌した。このディッシュを（１回に１ディッシュずつ）上方から３００Ｗのハロゲンランプ（フィリップス社、アイントホーベン（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ）、オランダ国）で照射した。光は１ｃｍの水フィルターを通して、試料の加熱を避けた。全ての実験において、６００ｎｍを越える波長の光のみを通すカットオフフィルターを用いた。細胞層における放射度は、ＳＥＬ０３３検出器を備えたＩＬ１４００Ａ光度計（インターナショナル・ライト社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ）、ニューベリーポート、マサチューセッツ、米国）で測定して、３５ｍＷ／ｃｍ２であった。処理後、細胞をＡＳ３（７０ｍＭ ＮａＣｌ、６１．１ｍＭ グルコース、２．２２ｍＭ アデニン、２ｍＭクエン酸、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、および１５．５ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ５．８）中に懸濁し、５週間まで保存した。赤血球のダメージをこの期間中の溶血度を測定することによって確認した。Ｂｅｎ−Ｈｕｒ（既出）の結果と比較して、照射された溶液はウイルス量で１００，０００倍の減少を達成した。図１に示すように、本発明による方法は、保護剤無しでも、１０日後に、Ｂｅｎ−Ｈｕｒの方法よりも良好な結果を達成した。
【００１８】
表１は、ＳＡＧ−Ｍ中５６％赤血球濃縮物（ＲＢＣＣ）に添加された水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の光力学的不活化についての同様の実験結果を示す。種々の光増感剤の濃度は２５μＭであった。光源の強度は３５ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００１９】
【表１】
表２は、ＳＡＧ−Ｍ中５６％ＲＢＣＣを、２５μＭの種々の光増感剤および５ログのＶＳＶを不活化するのに必要な光量で処理したときの、４℃で保存した赤血球の溶血に対する影響を示す。光源の強度は３５ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００２０】
【表２】
これらの代表化合物は、電荷数が少ない（たとえば２）基をもつ化合物ほど赤血球に対してより大きなダメージを引き起こすのに対し、３電荷の代表化合物は、溶血および感染性粒子の不活化の両方において良好に作用することを示す。
【００２１】
光増感剤のリスト
シルセンス（Ｓｙｌｓｅｎｓ）Ａ：メソ−テトラ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンス：モノ−フェニル−トリ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＣ：ｔｒａｎｓ−ジフェニル−ジ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＤ：ｃｉｓ−ジフェニル−ジ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＥ：トリフェニル−モノ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＲ：テトラ−（Ｎ−２−ヒドロキシ−エチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＯ：テトラ（４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウム）−ポルフィリンクロリド
インビボ用途のための赤血球濃縮物の光滅菌の効果を試験する実験を行った。そのために、シルセンスで光力学的に処理したＲＢＣのインビボでの生存率を研究した。２匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ Ｍｕｌａｔａ）から得た赤血球を、標準的手順に従って５１Ｃｒで標識した。各々のサルに、上記の手順に従ってシルセンスで処理済みの、あるいは未処理の自己血が与えられた。細胞を保存する場合には、５１Ｃｒでの標識は細胞を再注入する直前に行った。結果を、処理の直後（Ｉ）、または処理後５週間の保存の後（ＩＩ）の再注入の両方についての、再注入してから２４時間後の赤血球の回収率（％）として、表３に示す。
【００２２】
【表３】
表３の結果は、本発明に従って処理された赤血球が、実用目的のインビボでの使用に完全に適していることを示す。図２および３は、表３のデータ（ならびに中間およびその後のデータ）をサル毎に示す（図ａはサルＢＢ２６、ｂはサルＣＯ３３）。処理（○）細胞と未処理（■）細胞との間で生存率の差はない。
【００２３】
図４は、サルＣＯ３３とＢＢ２６から採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣを光力学的処理した後に暗所で保存した間に得られた、インビトロでの溶血データを示す。光力学的処理は採血の直後に行った。溶菌の程度は非常に満足すべきものであることが明らかであり、処理が試験管中ではなく、血液細胞に対するダメージを制限するように設計された特別な血液容器中で行われる場合にも要求を十分満たすであろう。ヒトの赤血球での実験も同様の結果を与えた。
【００２４】
図５は、２５μＭのシルセンスの存在下での緑膿菌および黄色ブドウ球菌の不活化に対する光量（ｋＪ／ｍ２）の依存性を示す。パーセンテージは１００％から約０．００１以下まで低下する。
【００２５】
図６は、対照（）、赤血球（ＲＢＣＣ）および２５μＭのシルセンスで光力学的に処理されたＲＢＣＣの、保存（１週間）の間のＡＳ３中のＡＴＰ含量（μｍｏｌ／ｇヘモグロビン、ライデン大学メディカルセンターの中央臨床化学研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の標準的手順で測定）を示す。同様に、対照と処理ＲＢＣＣとの間で、保存中のグルコース消費、乳酸産生、２，３−ＤＰＧ含量およびｐＨに差異はなかった（データは示さず）。白血球はこの光力学的処理で大きな影響を受けることが見いだされた。特に同種異系刺激に対する反応が強力に低減され、またその抗原提示能力にも悪影響を及ぼす。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による化合物（ＴｒｉＰ４）、および２つの対照化合物を用いての溶血の程度を示す。
【図２】２ａおよび２ｂは、２匹のアカゲザルから採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣＣを、処理直後に輸血した後のＲＢＣの生存率を示す。■、対照；○、処理。
【図３】図２の２匹のアカゲザルから採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣＣを処理後５週間保存した後に輸血した後のＲＢＣの生存率を示す。■、対照；○、処理。
【図４】図２の２匹のアカゲザルから採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣＣを光力学的処理した後に暗所で保存している間の溶血を示す。光力学的処理は、採血の直後に行った。■、対照：△、暗所対照；○、処理。
【図５】種々の光量での２つのタイプの細菌（黒、グラム陽性；白、グラム陰性）の不活化を示す。
【図６】処理（黒）および未処理（白、対照）の赤血球のＡＴＰ含有量を示す。
【発明の名称】血液製剤中のウイルス粒子の不活化方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】血液製剤中に存在するウイルス粒子を不活化する方法であって、
前記血液製剤を光増感剤と組み合わせる工程と、
前記光増感剤を活性化させる工程と、
を包含し、前記光増感剤として、化学式Ｉ、すなわち、
【化１】
・水素と、
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ２０）アシル、（Ｃ１−Ｃ２０）アシルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルであって、各々は直鎖状または分枝状であり得、またその各々は、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニル、および−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６から選択される１個から３個の基で置換され得、式中Ｒ５は、（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、Ｒ６は（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルであり、そしてｍおよびｎは、独立して１−１０であり、このアミノ基の各置換基は直鎖状または分枝状であり得、その各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、および
・ハロゲン原子、
から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
・（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ２０）複素環式アリール基であって、各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される１個から３個の基で置換され得、この各々は直鎖状または分枝状であり得、その各々が、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、
・ハロゲン原子、および
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
からなる群から選択され、
Ｒ ２ 、Ｒ ３ およびＲ ４ は、ピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ １ −Ｃ ４ ）のアルキル基で置換され、そしてＸは、薬学的に許容し得る対イオンである方法。
【請求項２】Ｒ１が、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される一つから三つの基で置換され得るアミノで置換されている（Ｃ ６ −Ｃ ２０ ）のアリール基であり、この各々は、直鎖状または分枝状であり得、そしてその各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ １ −Ｃ ３ ）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】光増感剤は、モノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィリンクロリドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血液製剤中のウイルス粒子を不活化させる方法に関し、この方法は、
−該血液製剤を光増感剤と組み合わせる工程、および
−前記光増感剤を活性化させる工程、を包含する。
【０００２】
感染した血液製剤の輸液によるウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）の伝染は、深刻な健康の問題である。
米国特許第５，３６０，７３４号は、血漿、赤血球、血小板、白血球および骨髄などの体液中のウイルス性病原体の不活化方法を記載する。
【０００３】
この方法は、光増感剤を血液製剤に添加し、光を照射してこの光増感剤を活性化させて、これによりウイルス性病原体を不活化する工程を包含する。米国特許第５，３６０，７３４号に開示される方法は、特に、赤血球の安定性を高めるために、血漿タンパク質の影響を減少させることを目標としている。
【０００４】
本発明の目的は、血液製剤、特に赤血球および血小板の安定性を高める更なる方法を提供することにあり、この方法は、米国特許第５，３６０，７３４号に開示される改良点と組み合わせて用いてもよく、組み合わせずに用いてもよい。
【０００５】
従って、本発明は、光増感剤として、化学式Ｉ
【０００６】
【化５】
・水素と、
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ２０）アシル、（Ｃ１−Ｃ２０）アシルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルであって、各々は直鎖状または分枝状であり得、またその各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニル、および−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６から選択される１個から３個の基で置換され得、式中Ｒ５は（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、Ｒ６は（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルであり、そしてｍおよびｎは独立して１−１０であり、このアミノ基の各置換基は直鎖状または分枝状であり得、その各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、および
・ハロゲン原子、
から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
・（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ２０）複素環式アリール基であって、各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される１個から３個の基で置換され得、この各々は直鎖状または分枝状であり得、その各々が、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、
・ハロゲン原子、および
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
からなる群から選択され、
Ｒ ２ 、Ｒ ３ およびＲ ４ は、ピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ １ −Ｃ ４ ）のアルキル基で置換され、そしてＸは、薬学的に許容し得る対イオンである。
【０００７】
驚くべきことに、上記で開示したような光増感化合物を用いることによって、血液製剤に対するダメージは大幅に低減される。これは、血液製剤に対するダメージの程度を測定するためのモデルとして通常認識されている実験から明らかである。特に、これは溶血および機能的パラメータを測定する実験において示された。一般に、Ｒ１が脂肪族基の場合、１−６個の原子を有するような短鎖が好ましい。
【０００８】
本発明において、用語「血液製剤」は、ｉ）赤血球およびｉｉ）血小板のうちの少なくとも１つを含む任意の溶液として理解されるべきである。他の細胞型が存在していてもよく、そしてこの溶液は、水溶液ではあるが、当該分野で通常認められるように、タンパク質成分、塩、安定剤、クエン酸またはヘパリンなどの抗凝固剤を含んでいてもよい。
【０００９】
用語「光増感剤」は、当該分野で周知のように、光エネルギーを吸収して、その結果、その光増感剤が活性化されるような物質である。活性化された光増感剤は、次に他の化合物と反応し得る。その結果、光増感剤は修飾されるか、あるいは不活性化されることもあるが、どちらかといえば光増感剤は（光で活性化される前の）元の状態に戻って、その中で光増感剤が再び利用され得る光触媒サイクルを形成する。結果的には、吸収された光エネルギーは、ウイルス粒子の不活化に用いられる。
【００１０】
用語「ウイルス粒子」は、血液製剤中に発生し得る一本鎖または二本鎖の膜またはタンパク質の外被を有する、任意のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを意味するものと理解される。例は、ＨＩＶおよびＢ型肝炎である。
【００１１】
用語「薬学的に許容可能な対イオン」は、ＯＨ−、Ｃｌ−、酢酸イオンまたはクエン酸イオンのような、無機または有機の負に荷電した任意の対イオンであると理解される。実際の活性化合物Ｉの正電荷を中和するのに必要なだけの対イオンＸが存在することは言うまでもない。
【００１２】
Ｂｅｎ−Ｈｕｒ Ｅ．らは、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３５（５）、４０１−６頁（１９９９）において、赤血球を含む溶液中に存在するウイルスの不活化方法を開示している。赤血球を保護するために保護剤を添加しなければならない。その結果、出願人は、保護剤Ｔｒｏｌｏｘを溶解することが困難であったため、再現することができず、溶血は保存１０日後には１％を越えた。対照的に、本発明の方法では、保護剤無しで、５週間後、溶血は対照よりも多くても１％上回るだけである。以下に提示する実験は、血液細胞に対するダメージを低減するように設計された血液用の特別の容器ではなく、ガラス試験管中で行われたことに留意のこと。もちろん、本発明による方法は、ＰＣＴ／ＮＬ９９／００３８７に開示されているような保護剤の添加をも考慮に入れている。
【００１３】
第一の実施態様によれば、Ｒ１は、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される一つから三つの基で置換され得るアミノで置換されている（ Ｃ ６ −Ｃ ２０ ）のアリール基であり、この各々は、直鎖状または分枝状であり得、そしてその各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得る。アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ １ −Ｃ ３ ）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることが好ましい。
【００１４】
上記で定義された基の中の第四級窒素原子は、血液製剤の完全性を維持しながら、ウイルス粒子、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を排除するのに非常に適していることが見いだされた。
【００１５】
本発明を、以下、例示の実施態様および図面を参照して説明する。
【００１６】
実施例
血液製剤
本研究全体を通して用いられる血液製剤は、軟膜を有さない標準血球濃縮物（ＲＢＣＣ）であり、サンクイン血液銀行（Ｓａｎｑｕｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）（ライデン−ハーグランデン（Ｌｅｉｄｅｎ−Ｈａａｇｌａｎｄｅｎ）、ライデン、オランダ国）から供給され、健康人のボランティアから得られた。これらのドナーからの血液（５００±５０ｍｌ）を、四つのポリ塩化ビニルの袋（ＮＰＢＩ、エンマー−コンパスクーム（Ｅｍｍｅｒ−Ｃｏｍｐａｓｃｕｕｍ）、オランダ国）の中の７３ｍｌのクエン酸−リン酸−ブドウ糖（ＣＰＤ）中に採取した。ＲＢＣＣを、以前に記載されたように調製した（Ｎｏｖｏｔｎｙ、１９９２）。防腐作用のある生理食塩水−アデニン−グルコース−マンニトール（ＳＡＧ−Ｍ）でヘマトクリットを５６±４に調節した。ＳＡＧ−Ｍは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグルコース、２９ｍＭのマンニトールおよび１．２５ｍＭのアデニンを含む。白血球の数は、自動細胞計数装置（Ｓｙｓｍｅｘ Ｋ１０００、東亞医用電子（ＴＯＡＭｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、神戸、日本）で測定して、１．８±０．９＊１０９細胞／ｌであった。
【００１７】
ウイルス含有ＲＢＣＣの光力学的処理
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のストック溶液（Ｓａｎ Ｊｕａｎ株、ライデン大学メディカルセンター、ウイルス部門のご好意により提供）を、添加量がＲＢＣＣの総量の＜１０％となり、かつウイルス粒子の数が約１０５／ｍｌとなるようにＲＢＣＣに加えた。増感剤を、最終濃度が、フタロシアニンテトラスルホン酸アルミニウム（ＡＩＰｃＳ４、ポルフィリン・プロダクツ社（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ、米国）５μＭ、フタロシアニンケイ素、ＨＯ−ＳｉＰｃ（ＣＨ３）２（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２（Ｐｃ４、Ｍ．Ｅ．Ｋｅｎｎｅｙ博士、ケースウェスタンリザーブ大学、クリーブランド、オハイオ、米国より提供）０．４５μＭ、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ、ＩＣＮバイオメディカルズＢＶ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＢＶ）、ズーテルメール（Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ）、オランダ国）１５μＭ、および本発明により、モノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４ピリジル）ポルフィリンクロリド（ＴｒｉＰ（４）、ミッド−センチュリー社（Ｍｉｄ−Ｃｅｎｔｕｒｙ）、ポーセン（Ｐｏｓｅｎ）、イリノイ、米国）２５μＭとなるように添加した。懸濁液をよく混合し、そして直径９ｃｍのポリスチレン培養ディッシュ（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、アルフェン・アーン・ライン（Ａｌｐｈｅｎ ａ／ｄ Ｒｉｊｎ）、オランダ国）に６ｍｌのアリコートとして分取し、そして室温で水平往復振盪機（６０サイクル／分、ＧＦＬ、ブルグヴェーデル（Ｂｕｒｇｗｅｄｅｌ）、ドイツ）で暗所にて５分間撹拌した。このディッシュを（１回に１ディッシュずつ）上方から３００Ｗのハロゲンランプ（フィリップス社、アイントホーベン（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ）、オランダ国）で照射した。光は１ｃｍの水フィルターを通して、試料の加熱を避けた。全ての実験において、６００ｎｍを越える波長の光のみを通すカットオフフィルターを用いた。細胞層における放射度は、ＳＥＬ０３３検出器を備えたＩＬ１４００Ａ光度計（インターナショナル・ライト社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ）、ニューベリーポート、マサチューセッツ、米国）で測定して、３５ｍＷ／ｃｍ２であった。処理後、細胞をＡＳ３（７０ｍＭ ＮａＣｌ、６１．１ｍＭ グルコース、２．２２ｍＭ アデニン、２ｍＭクエン酸、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、および１５．５ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ５．８）中に懸濁し、５週間まで保存した。赤血球のダメージをこの期間中の溶血度を測定することによって確認した。Ｂｅｎ−Ｈｕｒ（既出）の結果と比較して、照射された溶液はウイルス量で１００，０００倍の減少を達成した。図１に示すように、本発明による方法は、保護剤無しでも、１０日後に、Ｂｅｎ−Ｈｕｒの方法よりも良好な結果を達成した。
【００１８】
表１は、ＳＡＧ−Ｍ中５６％赤血球濃縮物（ＲＢＣＣ）に添加された水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の光力学的不活化についての同様の実験結果を示す。種々の光増感剤の濃度は２５μＭであった。光源の強度は３５ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
光増感剤のリスト
シルセンス（Ｓｙｌｓｅｎｓ）Ａ：メソ−テトラ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンス：モノ−フェニル−トリ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＣ：ｔｒａｎｓ−ジフェニル−ジ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＤ：ｃｉｓ−ジフェニル−ジ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＥ：トリフェニル−モノ−（Ｎ−メチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＲ：テトラ−（Ｎ−２−ヒドロキシ−エチル−４−ピリジル）−ポルフィリンクロリド
シルセンスＯ：テトラ（４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウム）−ポルフィリンクロリド
インビボ用途のための赤血球濃縮物の光滅菌の効果を試験する実験を行った。そのために、シルセンスで光力学的に処理したＲＢＣのインビボでの生存率を研究した。２匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ Ｍｕｌａｔａ）から得た赤血球を、標準的手順に従って５１Ｃｒで標識した。各々のサルに、上記の手順に従ってシルセンスで処理済みの、あるいは未処理の自己血が与えられた。細胞を保存する場合には、５１Ｃｒでの標識は細胞を再注入する直前に行った。結果を、処理の直後（Ｉ）、または処理後５週間の保存の後（ＩＩ）の再注入の両方についての、再注入してから２４時間後の赤血球の回収率（％）として、表３に示す。
【００２２】
【表３】
【００２３】
図４は、サルＣＯ３３とＢＢ２６から採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣを光力学的処理した後に暗所で保存した間に得られた、インビトロでの溶血データを示す。光力学的処理は採血の直後に行った。溶菌の程度は非常に満足すべきものであることが明らかであり、処理が試験管中ではなく、血液細胞に対するダメージを制限するように設計された特別な血液容器中で行われる場合にも要求を十分満たすであろう。ヒトの赤血球での実験も同様の結果を与えた。
【００２４】
図５は、２５μＭのシルセンスの存在下での緑膿菌および黄色ブドウ球菌の不活化に対する光量（ｋＪ／ｍ２）の依存性を示す。パーセンテージは１００％から約０．００１以下まで低下する。
【００２５】
図６は、対照（）、赤血球（ＲＢＣＣ）および２５μＭのシルセンスで光力学的に処理されたＲＢＣＣの、保存（１週間）の間のＡＳ３中のＡＴＰ含量（μｍｏｌ／ｇヘモグロビン、ライデン大学メディカルセンターの中央臨床化学研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の標準的手順で測定）を示す。同様に、対照と処理ＲＢＣＣとの間で、保存中のグルコース消費、乳酸産生、２，３−ＤＰＧ含量およびｐＨに差異はなかった（データは示さず）。白血球はこの光力学的処理で大きな影響を受けることが見いだされた。特に同種異系刺激に対する反応が強力に低減され、またその抗原提示能力にも悪影響を及ぼす。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による化合物（ＴｒｉＰ４）、および２つの対照化合物を用いての溶血の程度を示す。
【図２】２ａおよび２ｂは、２匹のアカゲザルから採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣＣを、処理直後に輸血した後のＲＢＣの生存率を示す。■、対照；○、処理。
【図３】図２の２匹のアカゲザルから採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣＣを処理後５週間保存した後に輸血した後のＲＢＣの生存率を示す。■、対照；○、処理。
【図４】図２の２匹のアカゲザルから採血したばかりの血液から調製されたＲＢＣＣを光力学的処理した後に暗所で保存している間の溶血を示す。光力学的処理は、採血の直後に行った。■、対照：△、暗所対照；○、処理。
【図５】種々の光量での２つのタイプの細菌（黒、グラム陽性；白、グラム陰性）の不活化を示す。
【図６】処理（黒）および未処理（白、対照）の赤血球のＡＴＰ含有量を示す。
Claims (7)
- 血液製剤中に存在するウイルス粒子を不活化する方法であって、
前記血液製剤を光増感剤と組み合わせる工程と、
前記光増感剤を活性化させる工程と、
を包含し、前記光増感剤として、化学式Ｉａ−Ｉｄ、すなわち、
・水素と、
・ハロゲン原子と、
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ２０）アシル、（Ｃ１−Ｃ２０）アシルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルであって、各々は直鎖状または分枝状であり得、またその各々は、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニル、および−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６から選択される１個から３個の基で置換され得、式中Ｒ５は、（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、Ｒ６は（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルであり、そしてｍおよびｎは、独立して１−１０であり、このアミノ基の各置換基は直鎖状または分枝状であり得、その各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、および
・ハロゲン原子、
から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
・（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ２０）複素環式アリール基であって、各々が、
・ヒドロキシル、
・アミノであって、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される１個から３個の基で置換され得、この各々は直鎖状または分枝状であり得、その各々が、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るもの、
・ニトリル、
・ハロゲン原子、および
・（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、から選択される１つ以上の基で置換され得、該複素環式アリール基は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される少なくとも１つの原子を含み、ここでＰ、ＮまたはＳは、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される基で置換され得、この各々は直鎖または分枝であり得、かつ各々が、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得るものと、
からなる群から独立して選択され、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１つは、第四級窒素原子を含み、ここでＸは、薬学的に許容し得る対イオンである方法。 - Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つが窒素原子を含む（Ｃ６−Ｃ２０）複素環式アリール基であり、この窒素原子は、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される基で置換され、この各々は、直鎖状または分枝状であり得、そしてその各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記複素環式アリール基がピリジニウム基であり、その窒素が（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つがアミノ基で置換された（Ｃ６−Ｃ２０）アリール基であり、このアミノ基は、（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキニルから選択される１個から３個の基で置換され得、この各々は直鎖状または分枝状であり得、その各々は、ヒドロキシルおよびハロゲン原子から選択される１つ以上の基で置換され得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記アリール基がトリアルキルアミノフェニル基であり、ここでアルキルが独立して（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも２つが第四級窒素原子を含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
- Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの３つが第四級窒素原子を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
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