ES2296231T3

ES2296231T3 - Produccion de imagenes de señales fluorescentes con utilizacion de opticas telecentricas para la excitacion y la produccion de las imagenes.

Info

Publication number: ES2296231T3
Application number: ES06000788T
Authority: ES
Inventors: Martin Gutekunst; Frank Guse; Hans-Georg Heckmann; Martin Hessling; Joachim Koenig
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-01-18
Filing date: 2006-01-14
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2026-01-14
Also published as: DE602005000877T2; ATE359500T1; US7369227B2; ES2285578T3; EP1681556B1; DE602005000877D1; JP2006215025A; ATE378582T1; EP1681556A1; JP4605713B2; US20060194308A1; DE602006000216T2; DE602006000216D1

Abstract

Un sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples, que comprende: un soporte planar (2) constituido por un conjunto de análisis individuales múltiples (3); al menos una fuente luminosa (4) para emitir luz, que comprende al menos una frecuencia de excitación; un transductor (5) dispuesto para que reciba señales fluorescentes de dichos análisis múltiples, donde el transductor está adaptado para producir datos primarios computables; una trayectoria de haz entre dicha fuente luminosa (4) y dicho transductor (5), que se caracteriza por una excitación telecéntrica de dicho conjunto de análisis individuales múltiples y por una producción telecéntrica de imágenes de dichas señales fluorescentes (l7) generadas en cada análisis individual de dicho conjunto de análisis individuales múltiples (3); donde la luz de excitación (16) de dicha excitación telecéntrica tiene un ángulo de incidencia con dicho soporte planar (2) de dicho conjunto de análisis individuales múltiples(3) que es superior a 0º.

Description

Producción de imágenes de señales fluorescentes con utilización de ópticas telecéntricas para la excitación y la producción de las imágenes.

Ámbito del invento

El presente invento hace referencia al ámbito del análisis del ADN. En particular, se centra en un dispositivo para la captación de imágenes paralelas de intensidades fluorescentes en varios puntos.

Antecedentes tecnológicos

Los expertos conocen diversas aplicaciones de técnicas fluorescentes para el análisis de muestras biológicas. En el caso de las técnicas electroforéticas, las proteínas o el ADN se marcan con una sonda de fluorescencia para visualizar sus bandas electroforéticas en geles o en columnas. Por otra parte, hasta ahora la mayoría de las aplicaciones de las micromatrices multigénicas (genochips) se basan en una lectura de fluorescencia, donde se controla la fijación específica de una molécula seleccionada como objetivo fluoromarcada en una molécula de sonda inmovilizada sobre un soporte sólido. Las aplicaciones para análisis de ADN en la fase líquida comprenden las sondas de hibridación fluorescentes como el colorante SybrGreen I de fijación del ADN bicatenario, o las sondas de transferencia energética de resonancia fluorescente (FRET) que utilizan dos sondas fluorescentes y transferencia energética. Una aplicación muy importante de las técnicas fluorescentes en la fase líquida es la cuantificación de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, que también se conoce como PCR en tiempo real.

En todos estos casos se necesita un dispositivo de lectura fluorescente que aporte luz de una determinada longitud de onda para excitar el marcado fluorescente del análisis y que pueda detectar la luz fluorescente del mismo emitida en una longitud de onda algo diferente. Un problema importante de todos los dispositivos de lectura fluorescente es la enorme intensidad de la luz de excitación en comparación con la luz fluorescente emitida por el colorante, y de ahí la necesidad de impedir que el haz de excitación incida en el detector, para que el control de las señales fluorescentes sea exacto. Dicho de otro modo, la trayectoria óptica de la luz de excitación debe ser diferente de la trayectoria óptica de la luz fluorescente, cuando menos en parte.

La realización del principio de la fluorescencia es bastante sencilla cuando sólo debe controlarse una sonda fluorescente en la fase líquida de, por ejemplo, un capilar. En este caso basta una fuente de luz blanca y un conjunto de filtros y espejos dicroicos para satisfacer los requisitos. Ahora bien, si la muestra contiene más de un marcador fluorescente, o si debe controlarse una distribución lateral de puntos en un soporte sólido o la fluorescencia de una placa de pocillos, es más difícil satisfacer los requisitos del dispositivo lector de fluorescencia.

En principio, hay dos estrategias diferentes para excitar y controlar la fluorescencia de una distribución lateral de puntos. La primera estrategia consiste en explorar la distribución lateral de los puntos mediante el análisis sucesivo e individual de los mismos. La segunda estrategia consiste en iluminar toda la distribución de los puntos simultáneamente y en captar la fluorescencia correspondiente, por ejemplo, en un chip de un dispositivo de carga acoplada. La estrategia de la exploración presenta el lógico inconveniente de que el soporte tiene que moverse en dos dimensiones (WO-03/069.391, DE-1.020.049.9), o el detector tiene que moverse respecto al soporte (US-2002/159.057), o el detector tiene que moverse en una dimensión y el soporte en la otra, o la óptica tiene que incluir medios de exploración unidimensional o bidimensional, es decir, espejos de galvanómetro. Por otro lado, la principal dificultad de la estrategia consistente en iluminar todo el soporte al mismo tiempo estriba en asegurar una iluminación homogénea en toda la distribución de los puntos. Una alternativa a la iluminación homogénea de toda la distribución de los puntos es el uso de un conjunto de fuentes luminosas, mediante el cual cada punto quede iluminado por su propia fuente luminosa. En DE-1.013.168.7 se describe esta estrategia para la evaluación de la PCR en un termociclador con varios pocillos, utilizando un divisor del haz y un conjunto de diodos luminosos para la iluminación. En DE-1.015.514.2 describe el control en campo oscuro de las señales fluorescentes, donde la micromatriz multigénica también se ilumina mediante un conjunto de diodos luminosos, pero con la salvedad de que en esta forma de realización no se necesita divisor del haz.

En cuanto al requisito de separar la trayectoria óptica del haz de excitación y de la luz fluorescente, cuando menos en parte, también se dan dos posibilidades diferentes. La primera posibilidad es la iluminación desde arriba, donde se utilizan divisores de haz y el haz de excitación y la luz fluorescente comparten al menos una fracción del tren óptico. La segunda posibilidad es el uso de la iluminación oblicua. En este caso, el haz de excitación se dispone de manera que adquiera cierto ángulo respecto al normal de la superficie del soporte y el reflejo correspondiente del haz de excitación quede fuera del ángulo de aceptación del sistema detector (por ejemplo, en US-2002/000.549.3 A1, EP-I-2.759.54 A2).

En US-2003/001.177.2 A1 se describe un aparato óptico para observar simultáneamente varios fluorocromos en una sonda utilizando un divisor de haz. En DE-1.974.821.1 A1 se revela un sistema para controlar las señales fluorescentes generadas en los pocillos de una placa de pocillos utilizando simultáneamente un divisor de haz, una lente de campo y un conjunto de lentes que concentran la luz en cada pocillo. La detección se realiza reflejando la luz sobre un conjunto de fotodiodos o un chip de un dispositivo de carga acoplada. La luz fluorescente captada en esta forma de realización del sistema se designa según la cantidad de colorantes excitados por el cono de luz de la lente convergente y depende del nivel de llenado del pocillo. En WO-99/603.81 se reivindica un instrumento para controlar reacciones en cadena de la polimerasa simultáneamente en varias ampollas de un bloque de ciclado térmico. Entre los componentes ópticos de este instrumento vuelven a aparecer un divisor de haz, una lente de campo, un conjunto de lentes de ampolla que concentran haces luminosos individuales en cada ampolla y un medio de detección que concentra la emisión de luz en, por ejemplo, un detector de dispositivo de carga acoplada. La necesidad de contar con un conjunto de lentes de ampolla limita el tamaño y la densidad lateral de cada punto. En JP-2.002.014.044 se describe un aparato fluorométrico para controlar la fluorescencia generada en varios pocillos. Los componentes ópticos comprenden un divisor de haz y un sistema de lentes para iluminar los pocillos colectivamente con luz paralela a la dirección de la altura de los pocillos. No obstante, este sistema óptico de formación de imágenes condensa la luz en un medio de detección. En US-6.498.690 B1 se revela un método para producir imágenes de análisis con un objetivo que comprende una lente telecéntrica. En US-6.246.525 B1 se reivindica un dispositivo captador de imágenes para un soporte de muestras que comprende una lente Fresnel.

En EP-0.987.540 A se revela un dispositivo productor de imágenes fluorescentes provisto de una trayectoria de haz formadora de imagen telecéntrica. En EP-1.406.082 A se describe un lector fluorescente con una trayectoria de haz de excitación telecéntrica. En EP-1.275.954 A se revela un dispositivo productor de imágenes fluorescentes provisto de iluminación oblicua.

Por tanto, el presente invento se propone aportar un dispositivo mejorado para el control simultáneo de señales fluorescentes originadas en una distribución lateral de puntos, optimizando para ello la trayectoria óptica hacia una iluminación homogénea y una detección exacta. En un aspecto concreto del presente invento, el problema que debe resolverse tiene relación con las mejoras en el control de la PCR múltiple en tiempo real y en un formato de placa de pocillos.

Breve descripción del invento

Por tanto, el presente invento se centra en un instrumento óptico para producir imágenes de la fluorescencia de un conjunto de puntos individuales múltiples, que comprende una excitación homogénea en toda la zona del conjunto y la producción de imágenes exactas de las señales de fluorescencia correspondientes.

Más concretamente, el presente invento se centra en un instrumento óptico para analizar simultáneamente varias multiplicaciones de la PCR que tienen lugar al mismo tiempo en los pocillos de una placa de pocillos, o para producir imágenes de la intensidad fluorescente de una micromatriz multigénica como medida para interacciones específicas del objetivo con la sonda.

En el contexto del presente invento, un conjunto de puntos individuales múltiples resume objetos compuestos de dos o más puntos separados espacialmente y distribuidos lateralmente. Estos puntos pueden ser, por ejemplo, pocillos de una placa de pocillos, o zonas superficiales funcionalizadas de un portaobjeto de microscopio. En la mayoría de los casos, el conjunto de puntos individuales múltiples se dispondrá de una manera uniforme y cada punto tendrá un contenido diferente para realizar análisis múltiples. Dentro del ámbito del presente invento, el soporte planar del conjunto es una fase sólida planar. En el caso de una micromatriz multigénica, el soporte planar del conjunto es la superficie de esta fase sólida planar, donde se hayan dispuesto los puntos. En el caso de una placa de pocillos, el soporte planar del conjunto es el plano donde se hayan dispuesto las aperturas de los pocillos. El soporte planar del conjunto queda fijado por un medio de sujeción que estabiliza la posición de cada punto en el emplazamiento deseado de la trayectoria óptica.

Dentro del ámbito del presente invento, la frase "fuente luminosa" ("LS", por sus siglas en inglés) comprende iluminantes que emiten luz con una sola frecuencia o con varias frecuencias. Además, la fuente luminosa puede consistir en una disposición de más de uno de dichos iluminantes.

En el contexto del presente invento, un transductor (Det) es un dispositivo capaz de convertir luz visible en señales eléctricas tratables por un ordenador, por ejemplo, un chip de un dispositivo de carga acoplada.

Dentro del ámbito del presente invento, una óptica telecéntrica es una óptica con un tope de apertura que los elementos ópticos situados entre el tope de apertura y el objeto proyectan al infinito. Dicho de otro modo, los rayos principales de una óptica telecéntrica son cuasiparalelos, en el espacio del objeto. El término "rayos principales" se aplica a todos los rayos que pasan por el centro del tope de apertura. Los términos "objeto", "plano del objeto" y "espacio del objeto" se utilizan para describir el soporte planar 2 con el conjunto de puntos individuales múltiples 3. En dicha óptica telecéntrica, tanto la disposición de la lente de excitación 10 como la disposición de la lente de producción de imagen 12 tienen su propio tope de apertura. Dicha óptica telecéntrica es telecéntrica para la trayectoria de excitación y para la trayectoria de detección. Cada punto del objeto situado en un plano perpendicular al eje óptico corresponde a un rayo principal de excitación y también a un rayo principal de detección. Como todos los rayos principales de excitación y todos los rayos principales de detección son cuasiparalelos, se asegura una buena homogeneidad lateral en el plano del objeto y los puntos situados en el centro del conjunto son comparables a los situados en el borde del conjunto.

\newpage

En la totalidad del presente invento, una óptica telecéntrica siempre comprende una lente de campo. En el contexto del presente invento, la lente de campo es la más próxima al objetivo, por ella pasan la luz de excitación y las señales fluorescentes, puede comprender uno o más componentes y contribuye a la telecentricidad en el espacio del objeto y/o de la imagen en combinación con otros componentes ópticos del aparato. El o los componentes de la lente de campo pueden ser elementos de lente que se encuentren espacialmente separados.

La lente de campo del presente invento transfiere luz de excitación procedente de la fuente luminosa al conjunto de puntos individuales múltiples, así como señales fluorescentes procedentes del conjunto de puntos individuales múltiples al transductor. Esto no excluye la introducción de otros componentes ópticos en la trayectoria del haz, por ejemplo, entre la fuente luminosa y la lente de campo, entre la lente de campo y el transductor, o entre la lente de campo y el conjunto de puntos individuales múltiples.

El ángulo de incidencia \alpha se define como el ángulo formado entre los rayos principales cuasiparalelos del haz de luz de excitación y el normal de la interfaz, que es el soporte del conjunto en el ámbito del presente invento.

Un instrumento de PCR en tiempo real puede comprender (a) un instrumento óptico de acuerdo con el presente invento, y (b) medios para calentar y enfriar un soporte con uno o más pocillos que contengan sendas mezclas de reacción capaces de realizar una reacción PCR.

Dentro del ámbito del presente invento, los medios para calentar y enfriar comprenden cualquier medio capaz de controlar y alterar la temperatura del conjunto de puntos individuales múltiples de una manera cíclica, a fin de realizar la multiplicación de ácidos nucleicos con PCR cíclica. Preferiblemente, los medios de retención pueden calentarse y enfriarse a través del contacto térmico con el soporte planar del conjunto de puntos individuales múltiples.

El presente invento, centrado en un sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples, comprende: un soporte planar constituido por un conjunto de análisis individuales múltiples; al menos una fuente luminosa para emitir luz con al menos una frecuencia de excitación; un transductor dispuesto para que reciba señales fluorescentes de dichos análisis múltiples, donde el transductor está adaptado para producir datos primarios computables; una trayectoria de haz entre dicha fuente luminosa y dicho transductor que se caracteriza por una excitación telecéntrica de dicho conjunto de análisis individuales múltiples y por una producción telecéntrica de imágenes de dichas señales fluorescentes generadas en cada análisis individual de dicho conjunto de análisis individuales múltiples; donde la luz de excitación de dicha excitación telecéntrica tiene un ángulo de incidencia con dicho soporte planar de dicho conjunto de análisis individuales múltiples que es superior a 0º.

Un conjunto de análisis individuales múltiples comprende objetos compuestos por dos o más análisis que se separan espacialmente para realizar un análisis paralelo. Estos análisis pueden realizarse, por ejemplo, en pocillos de una placa de pocillos, o en zonas superficiales funcionalizadas de un portaobjeto de microscopio.

La frase "trayectoria de haz" se utiliza en la totalidad del presente invento para abarcar todas las zonas que el haz luminoso atraviesa en su camino desde la fuente luminosa y a través de al menos la lente de campo hasta el conjunto de análisis individuales múltiples, y desde el conjunto de análisis individuales múltiples a través de al menos la lente de campo hasta el transductor.

Un sistema para realizar y controlar varias reacciones PCR en tiempo real y de manera simultánea puede comprender: una placa de pocillos con varios puntos individuales que contienen sendas mezclas de reacciones capaces de realizar una reacción en cadena de la polimerasa; entidades fluorescentes de fijación del ADN; y un instrumento de PCR en tiempo real que comprende un instrumento óptico según el presente invento para iluminar toda la placa de pocillos con luz telecéntrica y detectar las señales fluorescentes llegadas de cada pocillo de dicha placa de pocillos mediante un transductor dispuesto para que reciba las señales fluorescentes correspondientes a fin de producir datos primarios computables.

En la totalidad del presente invento, todas las entidades fluorescentes fijadoras del ADN son fluorocromos o conjuntos de fluorocromos conocidos por los expertos y utilizables para detectar ADN multiplicado; a saber, por ejemplo, colorantes de fijación del ADN bicatenario, sondas TaqMan, balizas moleculares, sondas de un solo marcador o sondas de hibridación FRET.

Un método para multiplicar, detectar y/o cuantificar múltiples secuencias de ADN objetivo comprende: aportación de una mezcla de reacción o composición capaz de realizar reacciones en cadena de la polimerasa; sujeción de dicha mezcla de reacción a un protocolo de termociclado que haga posible la multiplicación de dichas secuencias de ADN objetivo múltiples; y control de la presencia y la cantidad de cada secuencia de ADN al menos una vez después de varios ciclos de multiplicación utilizando entidades fijadoras del ADN fluorescentes y un instrumento de PCR en tiempo real que comprenda un sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de acuerdo con el presente invento.

La mezcla de reacción o composición capaz de realizar reacciones en cadena de la polimerasa comprende en la totalidad del presente invento amortiguadores, nucleótidos, enzimas, cebadores y las entidades fijadoras del ADN fluorescentes.

Un protocolo de termociclado es el protocolo que define el tratamiento térmico cronológico de la composición PCR, las temperaturas de fusión e hibridación, el número de ciclos de multiplicación y el tiempo de calentamiento y enfriamiento.

Descripción de las figuras

La figura 1 es una imagen esquemática de una forma de realización del instrumento óptico según el presente invento;

La figura 2 es una imagen esquemática de otra forma de realización del instrumento óptico según el presente invento, que comprende una unidad plegadora de haces de luz: A) excitación y B) producción de la imagen;

La figura 3 es una imagen tridimensional de una forma de realización del instrumento óptico según el presente invento, que comprende una unidad plegadora de haces de luz;

La figura 4 es un esquema ilustrativo de la correlación existente entre parámetros del instrumento óptico;

La figura 5 presenta la sensibilidad del instrumento óptico;

La figura 6 presenta la reproducibilidad de la producción de imágenes fluorescentes;

La figura 7 presenta la imagen fluorescente de una placa de pocillos;

La figura 8 presenta la intensidad fluorescente en función de la altura de llenado de los pocillos.

Descripción detallada del invento

Un instrumento óptico para producir imágenes de señales fluorescentes procedentes de múltiples puntos individuales comprende: una unidad de retención 1 para retener un soporte planar 2 con un conjunto de puntos individuales múltiples 3; al menos una fuente luminosa 4 para emitir luz que comprende al menos una frecuencia de excitación; un transductor 5 dispuesto para que reciba señales fluorescentes de dicho conjunto de puntos individuales múltiples 3, donde el transductor 5 está adaptado para producir datos primarios computables; una lente de campo 6 para transferir luz de excitación 16 procedente de dicha fuente luminosa 4 a dicho conjunto de puntos individuales múltiples 3 y transferir señales fluorescentes 17 procedentes de dicho conjunto de puntos individuales múltiples 3 a dicho transductor 5; una disposición de lente de excitación 10 para transferir luz de excitación 16 procedente de dicha fuente luminosa 4 a dicha lente de campo 6; una disposición de lente productora de imágenes 12 para transferir señales fluorescentes 17 procedentes de dicha lente de campo 6 a dicho transductor 5; donde dicha lente de campo 6 produce luz de excitación 16 que tiene un ángulo de incidencia \alpha con dicho soporte planar 2 de dicho conjunto de puntos individuales múltiples 3 que es superior a 0º; y donde la trayectoria de haz de dicha luz de excitación 16 y la trayectoria de haz de dichas señales fluorescentes procedentes de puntos individuales múltiples son telecéntricas en el lado de dicha lente de campo 6 correspondiente al objeto.

Los expertos conocen un gran número de instrumentos capaces de producir imágenes de señales fluorescentes. Si el instrumento óptico debe ser capaz de producir simultáneamente imágenes de las señales fluorescentes de un conjunto de puntos individuales múltiples, por ejemplo, los pocillos de una placa de pocillos o los puntos de una micromatriz multigénica, es preciso garantizar que la excitación de los colorantes y la producción de imágenes de las señales fluorescentes en el centro y en el borde del conjunto sean comparables. Además, aunque se satisfaga el requisito de una distribución de intensidad homogénea en todo el haz luminoso, la alineación del soporte planar sigue siendo importante para asegurar que el soporte en su conjunto esté en el plano focal de la óptica de producción de imágenes, así como de la óptica de excitación. Por otra parte, también surgen varios problemas concretos cuando el soporte tiene profundidad, como en el caso de las placas de pocillos.

Una solución de dichos problemas es el uso de ópticas telecéntricas. En una óptica telecéntrica, los rayos principales procedentes de cada punto del objeto son cuasiparalelos. En consecuencia, todos los puntos del objeto situados dentro de un campo visual finito se observan con aproximadamente la misma perspectiva y la misma intensidad; dicho de otro modo, la óptica telecéntrica tiene una gran profundidad de campo y unas características de producción de imágenes o de excitación homogéneas.

Las propiedades de una óptica pueden describirse mediante su apertura numérica (NA), que en general deberá ser tan grande como sea posible para realizar una resolución de buena producción de imágenes y alta sensibilidad:

NA = n sen A,

siendo n el índice de refracción del medio y A el ángulo de apertura.

El diseño de un instrumento óptico para la excitación telecéntrica de una distribución lateral de puntos y la producción telecéntrica de imágenes de señales fluorescentes procedentes de dichos puntos exige tener en cuenta varios aspectos.

Por una parte, el valor NA deberá ser tan grande como sea posible, porque un valor NA pequeño para la óptica de producción de imágenes se traduce en una mala resolución de producción de imágenes, y un valor NA pequeño para la óptica de excitación supone un derroche de potencial de iluminación para la excitación. Por otra parte, minimizar el valor NA puede aumentar la profundidad del foco de la óptica telecéntrica, lo cual reviste la máxima importancia si el conjunto de puntos individuales tiene cierta profundidad, como en el caso de las placas de pocillos. Además, desde un punto de vista comercial, también se prefiere un valor NA pequeño, porque en general una óptica de baja apertura tiene costes de producción más económicos.

Si el instrumento óptico telecéntrico debe poder aplicarse a una gama completa de frecuencias, la óptica también tiene que ser acromática. Para la propia producción de imágenes fluorescentes hay que abordar aún más requisitos, ya que la producción de imágenes fluorescentes debe estar apropiadamente escalada para una reproducción correcta de la distribución lateral de los puntos en el transductor. Además, deben controlarse errores de imagen como las aberraciones de esfericidad o cromáticas, comas, astigmatismos o curvaturas del campo.

Hay varias formas de crear ópticas telecéntricas. En general, una óptica telecéntrica es un diseño de lente de varios elementos, en el que se disponen dos o más lentes sucesivamente en la trayectoria de haz. Una óptica telecéntrica puede prepararse como telecéntrica en el plano del objeto, o como telecéntrica en el plano de la imagen, o como telecéntrica en ambos planos, que también se denomina óptica doblemente telecéntrica. Además, es posible iluminar un objeto con luz telecéntrica y/o controlar un objeto de una manera telecéntrica. En general, basta con aportar telecentricidad a una óptica en el plano del objeto, porque esto garantiza ya una iluminación homogénea de todo el objeto lateralmente y en la tercera dimensión, así como la captación exacta de la luz irradiada por el objeto.

Es bien conocida la existencia de instrumentos que utilizan ópticas telecéntricas para producir imágenes de señales fluorescentes, pero la excitación suele realizarse de forma no telecéntrica, por ejemplo, mediante iluminación posterior, iluminación oblicua, o con un campo evanescente. En la totalidad del presente invento, tanto la excitación de los puntos individuales múltiples, como la producción de imágenes de las señales fluorescentes recibidas de los puntos individuales múltiples, se realiza de manera telecéntrica.

Las figuras 1 y 2 presentan imágenes esquemáticas de dos instrumentos ópticos según las formas de realización preferidas del presente invento, que a continuación se explican detalladamente.

Una parte central de todas las ópticas telecéntricas es la lente de campo. Esta lente es la más próxima al objeto y determina el diámetro del campo visual del instrumento. En consecuencia, el diámetro de esta lente tiende a aumentar de tamaño cuando el conjunto de puntos individuales múltiples se distribuye por una zona grande. Las lentes de campo pueden ser individuales (una sola lente) o acromáticas, por ejemplo, dos lentes unidas. Otro tipo especial que puede utilizarse para el presente invento es la lente Fresnel. Una lente Fresnel tiene una curvatura compleja especial con múltiples regiones cónicas en al menos una superficie óptica útil que aporta las mismas propiedades telecéntricas de una lente de campo. En la mayoría de los casos, las lentes Fresnel sólo tienen una superficie con múltiples regiones cónicas que se soporta mediante una superficie planar perpendicular al eje óptico y, por consiguiente, son más finas que las lentes de campo normales. En casos especiales se utilizan lentes Fresnel que también tienen una superficie de soporte curvada o que cuentan con múltiples regiones cónicas en ambos lados de la lente. Además, a veces las lentes Fresnel se fabrican en material plástico y, por consiguiente, pueden ser más baratas que las lentes de campo grandes producidas con vidrio. Pero, por otro lado, la calidad de la imagen (sobre todo en cuanto al contraste y las interferencias) de estas lentes Fresnel es menor que la de las lentes de campo normales, debido a la dispersión de la luz en los puntos de la lente que presentan una curvatura discontinua.

Un problema común en todos los instrumentos de producción de imágenes fluorescentes es la enorme diferencia de intensidad entre la luz de excitación y las señales fluorescentes. En consecuencia, la relación señal-ruido para la producción de imágenes es insuficiente, si la luz de excitación incide junto con las señales fluorescentes en el transductor. Hay dos estrategias principales para sortear este problema, que son el uso de divisores del haz y una iluminación oblicua.

Normalmente, un divisor del haz es un espejo dicroico que deja pasar o refleja la luz, según su longitud de onda, y que, por tanto, permite separar dos componentes de un haz luminoso y enviarlos en direcciones diferentes. Para que esta aplicación en un instrumento óptico produzca imágenes de señales fluorescentes, es preciso que el espejo dicroico refleje la luz de excitación y deje pasar la luz fluorescente, o a la inversa. La principal desventaja de utilizar un divisor del haz es que sólo sirve con un cierto número limitado de fluorocromos que tengan frecuencias de excitación y señales fluorescentes en ventanas de frecuencia definidas. Por tanto, si ha de utilizarse otro fluorocromo, el instrumento óptico también necesita otro divisor del haz. Esto es costoso y lleva tiempo.

El uso de la iluminación oblicua permite prescindir del divisor del haz. Aquí, el haz de luz de excitación tiene un ángulo de incidencia con dicho soporte planar 2 de dicho conjunto de puntos individuales múltiples 3 que es superior a 0º. En consecuencia, el reflejo de dicho haz de luz de excitación también se produce con un ángulo correspondiente respecto a dicho soporte planar, y se aleja del transductor que sigue orientado normalmente respecto al soporte planar. Según cómo sean los otros componentes ópticos del instrumento óptico, es posible utilizar esta configuración con una gama de frecuencias mayor que la permitida por una configuración de divisor del haz, pudiendo emplearse diferentes fluorocromos sin cambiar el instrumento óptico.

Según la aplicación y los parámetros de los componentes ópticos que se utilicen, un ángulo de incidencia diferente es adecuado para el haz de luz de excitación. En el caso de un conjunto de puntos individuales múltiples que tengan casi cualquier profundidad, el ángulo de incidencia puede llegar incluso a los 40º, porque no se producen sombras de iluminación susceptibles de obstaculizar la excitación de una fracción de los fluorocromos. Un ejemplo de dicho conjunto de puntos individuales múltiples es un grupo de puntos funcionalizados sobre un soporte sólido planar.

En el caso de, por ejemplo, una placa de pocillos o cualquier soporte que tenga cierta estructura tridimensional, la situación en cuanto al ángulo de incidencia es diferente (véase la figura 4). Con un ángulo de incidencia creciente, la topografía del soporte produce cada vez más sombras. Sobre todo en el caso de los pocillos de una placa de pocillos, un ángulo de incidencia grande hace que sólo se ilumine una parte del interior de los pocillos. En consecuencia, un ángulo de incidencia menor de 20º es apropiado para las placas de pocillos.

En una forma de realización preferida del instrumento óptico según el presente invento, el ángulo de incidencia \alpha de la luz de excitación 16 es menor de 20º, preferiblemente menor de 10º, y muy preferiblemente menor de 5º.

Obsérvese que, por otra parte, el ángulo de incidencia \alpha también queda limitado a valores menores, debido a la apertura finita tanto de la óptica de excitación como de la óptica de producción de imágenes, que es superior a cero.

En otra forma de realización preferida del instrumento óptico según el presente invento, el ángulo de incidencia
\alpha es

\alpha \geq A_{1} + A_{2},

siendo A_{1} el semiángulo de apertura de la óptica de excitación y A_{2} el semiángulo de apertura de la óptica de producción de imágenes.

El semiángulo de apertura A_{1} de la óptica de excitación y de la óptica de producción de imágenes se define mediante la correspondiente apertura numérica NA_{i} como NA_{i} = n_{i} sen A_{i}, siendo n_{i} el índice de refracción del medio entre el objeto y la óptica respectiva y donde i = 1 representa la óptica de excitación, e i = 2 representa la óptica de producción de imágenes. Como se demuestra en la figura 4, si el ángulo de incidencia \alpha llega a ser menor que el definido por la ecuación anterior, una cantidad creciente del reflejo del haz luminoso de excitación incide en el transductor. Esta afirmación se cumple para un conjunto de puntos funcionalizados de un soporte sólido planar y también para una placa de pocillos.

En otra variante preferida, el instrumento óptico según el presente invento también comprende un sistema de filtro de excitación 8 capaz de transferir al menos una frecuencia de excitación procedente de dicha fuente luminosa a dicho conjunto de puntos individuales múltiples, al tiempo que bloquea otras frecuencias.

Dicho sistema de filtro de excitación adicional puede bloquear ciertas frecuencias procedentes de la fuente luminosa, susceptibles de plantear problemas a los fluorocromos. Un sistema de filtro de excitación adecuado es, por ejemplo, la llamada rueda de filtros, constituida por varios filtros individuales que tienen propiedades ópticas diferentes. El uso de dicha rueda de filtros aporta un medio sencillo para cambiar las frecuencias de excitación. Un sistema de filtro de excitación especial es, por ejemplo, un filtro que adsorba frecuencias de infrarrojos (IR) o luz ultravioleta (UV). Dicho sistema de filtro de excitación especial puede realizarse mediante un componente óptico separado, por ejemplo, un filtro de película fina, o mediante un revestimiento activo óptico sobre otros componentes ópticos del aparato.

En otra forma más de realización preferida, el instrumento óptico según el presente invento también comprende un sistema de filtro de producción de imágenes 9 capaz de transferir las señales fluorescentes 17 procedentes de dicho conjunto de puntos individuales múltiples a dicho transductor, al tiempo que bloquea la luz con las frecuencias de excitación.

Dicho sistema de filtro de producción de imágenes adicional puede bloquear ciertas frecuencias generadas en los puntos individuales múltiples o procedentes del reflejo de excitación, susceptibles de plantear problemas al proceso de producción de imágenes. De nuevo, un sistema de filtro de producción de imágenes adecuado es una rueda que contenga filtros diferentes. De manera análoga al caso del sistema de filtro de excitación, un sistema especial de filtro de producción de imágenes puede ser, por ejemplo, un filtro de infrarrojos (IR) o un filtro ultravioleta (UV). Los sistemas de filtro especiales de producción de imágenes pueden realizarse mediante un componente óptico separado, por ejemplo, un filtro de película fina, o mediante un revestimiento activo óptico sobre otros componentes ópticos del aparato. Otro sistema de filtro de producción de imágenes es un sistema que evita la detección de la fotodispersión por el detector.

Como ya se ha indicado, el instrumento óptico según el presente invento comprende una disposición de lente de excitación 10, transfiriendo dicha lente de excitación luz procedente de dicha fuente luminosa 4 a dicha lente de
campo 6.

En consecuencia, la luz procedente de la fuente luminosa se reproduce en el conjunto de puntos individuales múltiples utilizando una óptica de excitación que comprende la lente de campo 6 y una disposición de lente de excitación 10. Dicha óptica de excitación aporta una luz de excitación telecéntrica en el lado de la lente de campo 6 correspondiente al objeto y, por consiguiente, es una óptica de excitación telecéntrica. La disposición de la lente de excitación comprende al menos una lente y, preferiblemente, al menos tres lentes para aumentar la apertura de la excitación y aprovechar mejor la potencia de la fuente luminosa. La disposición de la lente de excitación podrá comprender una asfera, si es preciso reducir la cantidad de lentes. Preferiblemente, la óptica de excitación telecéntrica se diseña para que sea acromática, a fin de realizar una distribución de intensidad homogénea en todo el conjunto de puntos individuales múltiples con independencia de la longitud de onda de la excitación.

En otra forma de realización del presente invento, dicha fuente luminosa emite luz que comprende diversas frecuencias, preferiblemente dicha fuente luminosa es una fuente de luz blanca, muy preferiblemente dicha fuente luminosa es una lámpara de descarga luminosa, como una lámpara de xenón, o una lámpara de mercurio, o una lámpara de filamento, por ejemplo, una lámpara de tungsteno.

En otra forma más de realización del presente invento, dicha fuente luminosa emite luz de una sola frecuencia, preferiblemente dicha fuente luminosa es un láser, y muy preferiblemente dicha fuente luminosa es un diodo luminoso.

El uso de una fuente luminosa que emita luz con diferentes frecuencias tiene la ventaja de que esta fuente luminosa puede utilizarse para fluorocromos diferentes, simplemente cambiando el sistema de filtro de excitación y/o el sistema de filtro de producción de imágenes. Es preferible utilizar ruedas de filtros como sistema de filtro de excitación y/o sistema de filtro de producción de imágenes, que contengan cierto número de filtros, a fin de pasar fácilmente de un fluorocromo a otro. Por otra parte, si la fuente luminosa emite luz de una sola frecuencia, los requisitos del conjunto del filtro pueden cumplirse fácilmente, pero el instrumento óptico queda limitado a un número reducido de fluorocromos.

En una forma de realización del presente invento, la ventana de la fuente luminosa tiene un revestimiento activo óptico que actúa como sistema de filtro de excitación especial para adsorber rayos infrarrojos y/o luz ultravioleta.

En otra variante preferida más del presente invento, dicha fuente luminosa comprende una combinación de más de un iluminante, preferiblemente más de un láser, y muy preferiblemente más de un diodo luminoso.

En esta forma de realización preferida se utiliza un conjunto de diferentes iluminantes para aportar un instrumento óptico según el presente invento con más de una frecuencia de excitación. En dicha forma de realización con, por ejemplo, dos fuentes luminosas diferentes según el presente invento, cada fuente luminosa tiene preferiblemente su propio sistema de filtro de excitación 8 y su propia disposición de lente de excitación 10.

En otra variante según el presente invento, dicha fuente luminosa también comprende un dispositivo para seleccionar uno o más de dichos iluminantes.

Un dispositivo para seleccionar uno de dichos iluminantes puede realizarse de maneras diferentes. Una posibilidad consiste en utilizar espejos giratorios para inyectar en la trayectoria óptica la luz de un iluminante seleccionado. Otra posibilidad consiste en desplazar la disposición de los iluminantes para inyectar en la trayectoria óptica la luz de un iluminante seleccionado.

La óptica de excitación telecéntrica según el presente invento puede comprender varios componentes añadidos a la lente de campo 6, el sistema de filtro de excitación 8 y la disposición de la lente de excitación 10. En una forma de realización, la óptica de excitación telecéntrica también comprende una guía luminosa 14 y la luz procedente de la fuente luminosa se acopla a dicha guía luminosa 14 para transferir la luz procedente de la fuente luminosa a los componentes ópticos del sistema óptico. Utilizando una guía luminosa es posible acoplar luz procedente de varias fuentes y transferir simultáneamente esta luz combinada a los componentes ópticos. Todos los tipos de guías luminosas son aplicables al objeto del presente invento. Son posibles guías luminosas, por ejemplo, las guías luminosas gaseosas, las de fibras, o los conjuntos de guías luminosas de fibras. En una forma de realización del presente invento, en uno o en ambos extremos de dicha guía luminosa hay un revestimiento activo óptico que actúa como sistema de filtro de excitación especial para adsorber rayos infrarrojos y/o luz ultravioleta.

Si es necesario, la óptica de excitación telecéntrica puede comprender otro espejo 7 para alterar la dirección de la luz de excitación. Dicho espejo 7 aparece en la forma de realización de la figura 1.

En otra forma más de realización según el presente invento, la óptica de excitación telecéntrica también comprende un mezclador de luz 15 que mezcla luz procedente de dicha fuente luminosa y reproduce la superficie iluminada de dicho mezclador de luz 15 sobre el conjunto de puntos individuales múltiples.

Un mezclador de luz 15 es un dispositivo con una superficie iluminada muy homogéneamente, utilizable como fuente luminosa que aporta luz con una distribución homogénea de la intensidad en toda su extensión. Un mezclador de luz es una entidad alargada que se fabrica con material transparente óptico y cuyos límites son paralelos a la trayectoria óptica. Dicho de otro modo, un mezclador de luz es un tipo de fibra óptica. La luz que se inyecta en dicho mezclador de luz experimenta múltiples reflejos totales en la interfaz interna del material transparente óptico, produciendo un área transversal en el extremo de la fibra que está iluminado de manera muy homogénea. Los reflejos totales en la interfaz interna del material transparente óptico se basan sencillamente en el cambio del índice de refracción en dicha interfaz o pueden deberse a revestimientos reflectantes. La proporción entre la longitud de dicho mezclador de luz y su área transversal reviste importancia para la homogeneidad de la iluminación. Es preferible que dicha proporción sea superior a 2.

La luz procedente de la fuente luminosa, particularmente del área transversal en uno de los extremos del mezclador de luz, se reproduce en el conjunto de puntos individuales múltiples utilizando la óptica de excitación telecéntrica que comprende la lente de campo 6 y una disposición de lente de excitación 10. Por consiguiente, en esta forma de realización del presente invento, la excitación de los puntos individuales múltiples se realiza con una óptica de excitación que es telecéntrica en el espacio del objeto.

El instrumento óptico según el presente invento también se adapta a la producción de imágenes de quimioluminiscencia y de bioluminiscencia. Como en estos casos no se necesita luz de excitación, puede prescindirse de la fuente luminosa 4, la disposición de lente de excitación 10 y el sistema de filtro de excitación 8.

En una nueva variante preferida, el instrumento óptico según el presente invento también comprende una unidad plegadora de haces de luz 11 que contiene uno, dos o más espejos plegadores, plegando dicha unidad plegadora la luz recibida de dicha fuente luminosa y dichas señales fluorescentes 17 procedentes de dicho conjunto de puntos individuales múltiples.

Dentro del ámbito del presente invento, una unidad plegadora de haces de luz es una unidad que aporta una trayectoria óptica larga, al mismo tiempo que sólo requiere una cantidad de espacio reducida. Este resultado puede obtenerse, por ejemplo, mediante una disposición de dos espejos plegadores como los de las figuras 1 y 2. Para limitar el ángulo máximo de los rayos principales en las proximidades del tope de apertura, un parámetro que puede modificarse es la trayectoria óptica que la luz debe atravesar. Aumentando la trayectoria óptica también se reducen los ángulos máximos de los rayos principales en el sistema del filtro de excitación 8, por hallarse junto al tope de apertura. Como el rendimiento del sistema del filtro de excitación 8 se resiente si los ángulos de los rayos principales llegan a ser muy grandes, la trayectoria óptica debería ser más bien larga. Dada la imposibilidad de utilizar instrumentos grandes, puede recurrirse a los espejos plegadores para realizar una trayectoria óptica larga y reducir al mismo tiempo el tamaño del instrumento.

Como ya se ha indicado, el instrumento óptico según el presente invento comprende una disposición de lente de producción de imágenes 12, transfiriendo dicha disposición de lente de producción de imágenes 12 luz procedente de dicha lente de campo 6 a dicho transductor 5.

En consecuencia, las señales fluorescentes 17 generadas en el conjunto de puntos individuales múltiples se reproducen en un transductor 5 mediante una óptica telecéntrica de producción de imágenes que comprende la lente de campo 6 y una disposición de lente de producción de imágenes 12. En otras formas de realización del presente invento, la óptica telecéntrica de producción de imágenes también comprende, por ejemplo, una unidad plegadora de haces de luz 11 y/o sistemas especiales de filtros de producción de imágenes 9.

La óptica telecéntrica de producción de imágenes debe ajustarse al tamaño del transductor y al tamaño espacial del conjunto de puntos individuales múltiples. Como en el caso de la disposición de la lente de excitación 10, la disposición de la lente de producción de imágenes 12 comprende al menos una lente, preferiblemente un conjunto formado por un mínimo de cinco lentes. Se necesitan muchas lentes para la disposición de la lente de producción de imágenes, porque la óptica de producción de imágenes plantea requisitos aún más altos que la óptica de excitación. La producción de imágenes fluorescentes requiere un escalado adecuado para la reproducción correcta de la distribución lateral de los puntos en el transductor. Además, deben controlarse errores de imagen como las aberraciones de esfericidad o cromáticas, comas, astigmatismos, errores especiales o curvaturas del campo. Debido a la reproducción de las señales fluorescentes en el transductor, la producción de imágenes fluorescentes se realiza con una óptica de producción de imágenes que es telecéntrica sólo en el lado de la lente de campo 6 correspondiente al objeto.

En otra forma de realización preferida del instrumento óptico según el presente invento, dicha disposición de la lente de producción de imágenes 12 se acopla a dicho transductor 5 para formar una unidad de producción de
imágenes 13.

Obsérvese que, en esta forma de realización preferida del presente invento, la óptica telecéntrica de producción de imágenes es diferente de los objetivos normales, por cuanto en éstos todas las lentes se disponen y se fijan de una manera definida para formar el objetivo y la totalidad de dicho objetivo se sitúa entre el transductor y el objeto. Por el contrario, en esta forma de realización preferida del presente invento, la disposición de la lente de producción de imágenes 12 se acopla al transductor 5 para formar una unidad de producción de imágenes 13. Para satisfacer los requisitos relativos a la precisión y la resolución de las imágenes, el emplazamiento de la disposición de la lente de producción de imágenes y del transductor reviste especial importancia. En esta forma de realización, dichos requisitos se satisfacen optimizando la posición entre la disposición de la lente de producción de imágenes y el transductor antes de fijarse la posición optimizada. Dicho acoplamiento entre la disposición de la lente de producción de imágenes y el transductor se mantiene durante todo el uso previsto y sólo se libera si es necesario volver a optimizar el emplazamiento.

En una forma de realización del instrumento óptico según el presente invento, dicho transductor comprende un dispositivo semiconductor o preferiblemente un dispositivo de carga acoplada.

En el contexto del presente invento, un transductor es un dispositivo capaz de convertir luz en señales eléctricas procesables por un ordenador. Esto puede realizarse mediante dispositivos semiconductores con una banda prohibida menor que la energía correspondiente a las señales fluorescentes que deban detectarse. Los electrones generados en la banda de conducción del semiconductor por la iluminación del dispositivo producen una señal medible que puede traducirse en datos computables. Son ejemplos de estos dispositivos semiconductores los fotodiodos o un dispositivo de carga acoplada (CCD).

Una nueva variante preferida del instrumento óptico según el presente invento es un instrumento óptico en el cual los puntos individuales de dicho conjunto son pocillos, la luz de excitación 16 tiene un ángulo inferior a 20º respecto a las paredes laterales de dichos pocillos, y la solución que llena dichos pocillos comprende fluorocromos.

Un ejemplo de esta nueva variante preferida del instrumento óptico es un dispositivo para el control simultáneo de la multiplicación de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que tiene lugar en los diversos pocillos de una placa de pocillos. La luz de excitación tiene un ángulo inferior a 20º respecto a las paredes laterales de los pocillos, a fin de iluminar gran parte del interior de los pocillos con independencia de la altura de llenado de los mismos. Como se utiliza una óptica telecéntrica para la excitación y también para la producción de imágenes fluorescentes, los resultados procedentes de un pocillo situado en el centro de la placa son comparables a los procedentes de pocillos situados en el borde de la misma.

En el caso de las multiplicaciones de la PCR realizadas en pocillos individuales, todas las entidades fluorescentes son aplicables como fluorocromos que se fijan específicamente a ácidos nucleicos bicatenarios. En el contexto del presente invento, estos fluorocromos se denominan entidades fluorescentes fijadoras del ADN, siendo una entidad fluorescente fijadora del ADN una molécula o un par de moléculas que aportan una luz fluorescente característica, si se fijan a un ADN bicatenario. En el campo del control instantáneo de la PCR se conocen los siguientes formatos de detección: formato de colorante fijador del ADN (por ejemplo, SybrGreen I), sondas TaqMan, balizas moleculares, formato de sondas de un solo marcador (SLP) o sondas de hibridación FRET.

Otra forma de realización preferida del instrumento óptico según el presente invento es un instrumento óptico, donde los puntos individuales de dicho conjunto son puntos situados en un soporte planar y los fluorocromos están incorporados a dichos puntos.

Un ejemplo de esta forma de realización preferida del instrumento óptico es un dispositivo para la producción simultánea de imágenes de señales fluorescentes procedentes de puntos diversos situados en un conjunto planar. En una forma de realización concreta, dicho conjunto es un conjunto de ADN cuyas zonas limitadas laterales están funcionalizadas con sondas de ADN que tienen secuencias diferentes. En este caso, el instrumento óptico según el presente invento puede controlar sucesos de hibridación con muestras que contienen ácidos nucleicos, por ejemplo, si la cadena del ADN complementario está marcada con un fluorocromo. Como alternativa al marcado de las moléculas del ADN en la muestra, los sucesos de hibridación también pueden visualizarse mediante fluorocromos fijadores del ácido nucleico bicatenarios.

El presente invento puede utilizarse en un instrumento de PCR en tiempo real que comprenda: un instrumento óptico según el presente invento, y medios para calentar y enfriar un soporte con uno o más pocillos que contengan sendas mezclas de reacciones capaces de realizar una reacción en cadena de la polimerasa.

Dentro del ámbito del presente invento, los medios para calentar y enfriar comprenden cualquier medio capaz de controlar y alterar la temperatura del conjunto de puntos individuales múltiples de forma cíclica para conseguir una multiplicación cíclica de ácidos nucleicos con PCR cíclica. Cada ciclo de PCR comprende varias etapas: una etapa de hibridación con temperatura decreciente, una etapa de multiplicación enzimática a temperaturas relativamente bajas junto con una etapa de detección mediante el uso de fluorocromos y una etapa de fusión a altas temperaturas.

El presente invento, centrado en un sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples, comprende: un soporte planar 2 constituido por un conjunto de análisis individuales múltiples; al menos una fuente luminosa 4 para emitir luz que comprende al menos una frecuencia de excitación; un transductor 5 dispuesto para que reciba señales fluorescentes de dichos análisis múltiples, donde el transductor está adaptado para producir datos primarios computables; una trayectoria de haz entre dicha fuente luminosa 4 y dicho transductor 5, que se caracteriza por una excitación telecéntrica de dicho conjunto de análisis individuales múltiples y por una producción telecéntrica de imágenes de dichas señales fluorescentes 17 generadas en cada análisis individual de dicho conjunto de análisis individuales múltiples 3; donde la luz de excitación 16 de dicha excitación telecéntrica tiene un ángulo de incidencia con dicho soporte planar 2 de dicho conjunto de análisis individuales múltiples 3 que es superior a 0º.

Un conjunto de análisis individuales múltiples comprende objetos compuestos por dos o más análisis que se separan espacialmente para realizar un análisis paralelo. Estos análisis pueden realizarse, por ejemplo, en pocillos de una placa de pocillos, o en zonas superficiales funcionalizadas de un portaobjeto de microscopio. En la mayoría de los casos, el conjunto de análisis individuales múltiples se dispondrá de una manera uniforme y cada análisis tendrá un contenido diferente para realizar análisis múltiples. En el caso de las micromatrices multigénicas, cada punto del conjunto está funcionalizado con un oligómero que tiene cierta secuencia; mientras que en el caso de los inmunoanálisis, cada punto del conjunto está funcionalizado con, por ejemplo, proteínas que tienen afinidades diferentes. En el caso de las placas de pocillos, por ejemplo, en cada pocillo se realiza una PCR diferente.

En una forma de realización preferida del sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples según el presente invento, dicho sistema también comprende una lente de campo, pasando dicha trayectoria de haz dos veces por dicha lente de campo.

En otra forma de realización preferida del sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples según el presente invento, dicho sistema también comprende una disposición de lente de producción de imágenes 12, acoplándose dicha disposición de lente de producción de imágenes 12 a dicho transductor 5 para formar una unidad de producción de imágenes 13.

En otra forma de realización preferida del sistema según el presente invento, el ángulo de incidencia \alpha es

a \geq A_{1} + A_{2},

siendo A_{1} el semiángulo de apertura de la excitación y A_{2} el semiángulo de apertura de la producción de imágenes fluorescentes.

Otra forma de realización preferida del sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples según el presente invento también comprende un sistema de filtro de excitación capaz de transferir al menos una frecuencia de excitación procedente de dicha fuente luminosa a dicho conjunto de puntos individuales múltiples, al tiempo que bloquea otras frecuencias, y/o un sistema de filtro de producción de imágenes capaz de transferir las señales fluorescentes procedentes de dicho conjunto de puntos individuales múltiples a dicho transductor, al tiempo que bloquea la luz con las frecuencias de excitación.

El presente invento puede utilizarse en un sistema para realizar y controlar varias reacciones en cadena de la polimerasa de manera simultánea e instantánea, que comprenda: una placa de pocillos con varios puntos individuales que contienen sendas mezclas de reacciones capaces de realizar una reacción en cadena de la polimerasa; entidades fluorescentes de fijación del ADN; y un instrumento de PCR en tiempo real que comprenda un instrumento óptico según el presente invento para iluminar toda la placa de pocillos con luz telecéntrica y detectar las señales fluorescentes llegadas de cada pocillo de dicha placa de pocillos mediante un transductor dispuesto para que reciba las señales fluorescentes correspondientes a fin de producir datos primarios computables.

En general, existen diferentes formatos de entidades fluorescentes de fijación del ADN para la detección simultánea del ADN multiplicado, siendo los siguientes muy conocidos y utilizados por los expertos:

a) Formato de colorante de fijación del ADN

Como la cantidad de producto de multiplicación bicatenario suele exceder la cantidad de ácido nucleico presente originalmente en la muestra que se va a analizar, pueden utilizarse colorantes específicos de ADN bicatenario que, previa excitación con una longitud de onda adecuada, muestren fluorescencia mejorada sólo si están fijados a ADN bicatenario. Preferiblemente, sólo pueden utilizarse colorantes que, como el SybrGreen I, por ejemplo, no perjudiquen la eficacia de la reacción en cadena de la proliferasa.

Todos los demás formatos conocidos por los expertos requieren el diseño de una sonda de hibridación marcada fluorescente que sólo emita fluorescencia cuando se fije al ácido nucleico elegido como objetivo.

b) Sonda TaqMan

Una sonda de hibridación bicatenaria se marca con dos componentes. Cuando el primer componente se excita por efecto de una luz de la longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere al segundo componente, el llamado extintor de fluorescencia, según el principio de la transferencia energética de resonancia fluorescente (FRET). Durante la etapa de hibridación de la reacción en cadena de la polimerasa, la sonda de hibridación se fija al ADN seleccionado como objetivo y se degrada por la actividad de exonucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento subsiguiente. En consecuencia, se produce la separación espacial del componente fluorescente excitado y del extintor de fluorescencia, y es posible medir una emisión fluorescente del primer componente (US-5.538.348).

c) Balizas moleculares

Estas sondas de hibridación también se marcan con un primer componente y con un extintor de fluorescencia, ubicándose preferiblemente los marcadores en ambos extremos de la sonda. Debido a la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes se hallan espacialmente próximos en la solución. Tras la hibridación en los ácidos nucleicos seleccionados como objetivos, ambos componentes quedan separados y, previa excitación con luz de una longitud de onda adecuada, es posible medir la emisión de fluorescencia del primer componente (US-5.118.801).

d) Formato de sondas de un solo marcador (SLP)

Este formato de detección consiste en un solo oligonucleótido marcado con un solo fluorocromo en el extremo 5' ó 3' (WO-02/145.55). Para el oligomarcado pueden utilizarse dos diseños diferentes: sondas de extinción G y sondas de desextinción con nitroindol.

En la forma de realización de la extinción G, el fluorocromo se incorpora a una C en el extremo oligo 5' ó 3'. La fluorescencia disminuye significativamente cuando la sonda se hibrida al objetivo, si se han ubicado dos G en la cadena seleccionada como objetivo frente a la C y en la posición 1 junto a la sonda oligonucleótida complementaria.

En la forma de realización de la desextinción con nitroindol, el fluorocromo se incorpora al nitroindol en el extremo 5' ó 3' del oligonucleótido. El nitroindol disminuye la señalización fluorescente de la sonda libre. La fluorescencia aumenta cuando la sonda se hibrida al ADN seleccionado como objetivo, debido a un efecto de desextinción.

e) Sondas de hibridación FRET

El formato de la prueba de la sonda de hibridación FRET es especialmente útil para todos los tipos de análisis de hibridación homogéneos (Matthews, J.A. y Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 (1988) l-25). Se caracteriza por un par de sondas de hibridación bicatenarias que se utilizan simultáneamente y que son complementarias de puntos adyacentes de la misma cadena del ácido nucleico multiplicado que se haya seleccionado como objetivo. Ambas sondas se marcan con componentes fluorescentes distintos. Cuando se excita por efecto de una luz de la longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente según el principio de la transferencia energética de resonancia fluorescente (FRET), de tal manera que es posible medir una emisión fluorescente del segundo componente cuando ambas sondas de hibridación se fijan a posiciones adyacentes de la molécula seleccionada como objetivo a detectar.

Cuando se hibridan a la secuencia seleccionada como objetivo, las sondas de hibridación deben quedar muy próximas entre sí, en una disposición cabeza-cola. Normalmente, la separación entre el extremo marcado 3' de la primera sonda y el extremo marcado 5' de la segunda sonda es lo más pequeña posible, es decir, 1-5 bases. Esto permite una estrecha proximidad del compuesto donante de la FRET y del compuesto receptor de la FRET, que suele ser de
10-100 angstromios.

Como alternativa al control del aumento de la fluorescencia del componente receptor de la FRET, también es posible controlar el descenso de la fluorescencia del componente donante de la FRET como medición cuantitativa del suceso de hibridación.

En particular, el formato de la sonda de hibridación FRET puede utilizarse en la PCR en tiempo real, para detectar el ADN multiplicado que se haya seleccionado como objetivo. Entre todos los formatos de detección conocidos por los expertos en la PCR en tiempo real, el formato de la sonda de hibridación FRET ha demostrado ser muy sensible, exacto y seguro (WO-97/467.07; WO-97/467.12; WO-97/467.14). No obstante, a veces el diseño de las secuencias de sondas de hibridación FRET apropiadas puede quedar limitado por las características especiales de la secuencia de ácido nucleico seleccionada como objetivo a detectar.

Como alternativa al uso de dos sondas de hibridación FRET, también es posible utilizar un cebador de marcado fluorescente y sólo una sonda oligonucleótida marcada (Bernard, P. S., et al., Anal Biochem. 255 (1998) 101-107). En este sentido puede escogerse arbitrariamente, tanto si el cebador se marca con el compuesto donante de la FRET como con el receptor de la FRET.

El presente invento también hace referencia a un método para multiplicar, detectar y/o cuantificar múltiples secuencias de ADN seleccionadas como objetivo, que comprende: aportación de una mezcla de reacción o composición capaz de realizar reacciones en cadena de la polimerasa; sujeción de dicha mezcla de reacción a un protocolo de termociclado que haga posible la multiplicación de dichas secuencias múltiples de ADN seleccionadas como objetivo; y control de la presencia y la cantidad de cada secuencia de ADN al menos una vez después de varios ciclos de multiplicación utilizando entidades fijadoras del ADN fluorescentes y un instrumento de PCR en tiempo real según el presente invento.

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Ejemplos

Los ejemplos siguientes se realizaron con un instrumento óptico, tal como se explica en la descripción detallada y como puede verse en la figura 3. La óptica de excitación telecéntrica se ajustó para manipular frecuencias de entre 450 y 650 nm y la óptica telecéntrica de producción de imágenes para manipular frecuencias de 500 a 740 nm. La fuente luminosa fue una lámpara de xenón y como transductor se utilizó un chip de dispositivo de carga acoplada de 2/3'' enfriado, con 1024 x 1344 píxeles. El instrumento óptico se diseñó para producir imágenes de un área de
83 x 117 mm, a fin de poder utilizar placas de 96 pocillos (distancia 9 mm, diámetro 5 mm) y de 384 pocillos (distancia 4,5 mm, diámetro 3 mm). La longitud de onda adecuada para excitar y producir imágenes de ciertos fluorocromos se ajustó mediante ruedas de filtros.

La óptica de excitación telecéntrica tenía una apertura numérica de 0,35 en el lado correspondiente a la fuente luminosa y de 0,014 en el lado correspondiente a la placa de pocillos. Por razones geométricas, la fuente luminosa se dispuso perpendicular al chip de dispositivo de carga acoplada y el haz de luz de excitación tuvo que orientarse hacia la placa de pocillos con un espejo adicional. El haz de luz de excitación tenía un ángulo de incidencia de 2º con la placa de pocillos y una variación de intensidad a través del campo del objeto (88 x 122 mm) inferior al 10%. La óptica de producción de imágenes tenía una apertura de 0,014 en el lado correspondiente al objeto y una escala de reproducción de -0,075 con una distancia de 800 mm entre el objeto y la imagen. Esta distancia tan grande se realizó con dos espejos plegadores. La óptica de producción de imágenes tenía una profundidad de campo de +/- 3 mm.

Ejemplo 1

Sensibilidad y reproducibilidad

La sensibilidad de un instrumento óptico, como ya se ha explicado, se investigó con una serie de diluciones utilizando fluoresceína-sodio en agua. Se probaron tres tipos de placas de pocillos, una placa negra (denominada MTP 1), una transparente (MTP 2) y una blanca (MTP 3), todas ellas capaces de aportar sensibilidades muy similares. Las mediciones, realizadas a 58ºC con un tiempo de integración de 1000 ms, se efectuaron 50 veces para todos los puntos del diagrama de la figura 5.

Las 50 mediciones mencionadas permitieron comprobar la reproducibilidad del instrumento óptico, presentándose la progresión de la intensidad en la figura 6, en un ejemplo referido a una placa de pocillos negra y dos instrumentos ópticos diferentes. Utilizando los valores de medición 20 a 50 para una concentración de fluoresceína-sodio en agua de 85 nmol/l en cuatro pocillos diferentes, con dos tipos de placas de pocillos y dos instrumentos ópticos diferentes, se obtuvieron las variaciones siguientes: 0,25% para la placa MTP 1, 0,39% para la MTP 2. Para la placa de pocillos blanca se realizó la misma prueba con una concentración de 21 nmol/l, que produjo una variación del 0,98%.

Ejemplo 2

Interferencia

La figura 7 presenta una imagen de una placa de pocillos transparente que contiene fluoresceína-sodio en cinco pocillos. La imagen de la placa de pocillos presenta dos tipos de reflejos de los pocillos fluorescentes. El primer reflejo se detectó dentro de la distancia hasta los pocillos contiguos, tenía el mismo diámetro y una intensidad aproximada del 0,5% desde el pocillo. El segundo reflejo tenía un diámetro que era aproximadamente 2-3 veces superior al diámetro del pocillo y una intensidad reducida en un factor de 2\cdot10^{4} - 3\cdot10^{4}.

Resumiendo, la intensidad media en los pocillos contiguos se redujo en un factor aproximado de 3.10^{4} para la placa de pocillos negra y en un factor aproximado de 1.10^{3} para la blanca y la transparente.

Ejemplo 3

Altura de llenado

Este ejemplo se realizó para evaluar la dependencia entre las señales fluorescentes y la altura de llenado en el interior de los pocillos. Los resultados se presentan en la figura 8. Se pipetearon diferentes cantidades de solución de fluoresceína-sodio con una concentración de 169 nmol/l en los pocillos, presentándose en la figura 8 las intensidades medias de 10 pocillos. Como era de prever, en una producción de imágenes que es independiente de la altura de llenado en el interior de los pocillos, se detectó una dependencia lineal entre la intensidad de la fluorescencia y el volumen de concentración constante aplicado.

Lista de referencias

Bernard. P. S., et al., Anal. Biochem. 255 (1998) 101-107

DE-1.013.168.7

DE-1.015.514.2

DE-1.020.049.9

DE-1.974.821.1 A1

EP-1.275.954 A2

JP-2.002.014.044

Matthew, J.A. y Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25

US-2002/000.549.3 A1

US-2002/159.057

US-2003/001.177.2 A1

US-5.118.801

US-5.538.848

US-6.246.525 B1

US-6.498.690 B1

WO-02/145.55

WO-03/069.391

WO-97/467.07

WO-97/467.12

WO-97/467.14

WO-99/603.81

Claims

1. Un sistema para producir imágenes de señales fluorescentes de análisis múltiples, que comprende: un soporte planar (2) constituido por un conjunto de análisis individuales múltiples (3); al menos una fuente luminosa (4) para emitir luz, que comprende al menos una frecuencia de excitación; un transductor (5) dispuesto para que reciba señales fluorescentes de dichos análisis múltiples, donde el transductor está adaptado para producir datos primarios computables; una trayectoria de haz entre dicha fuente luminosa (4) y dicho transductor (5), que se caracteriza por una excitación telecéntrica de dicho conjunto de análisis individuales múltiples y por una producción telecéntrica de imágenes de dichas señales fluorescentes (l7) generadas en cada análisis individual de dicho conjunto de análisis individuales múltiples (3); donde la luz de excitación (16) de dicha excitación telecéntrica tiene un ángulo de incidencia con dicho soporte planar (2) de dicho conjunto de análisis individuales múltiples (3) que es superior a 0º.

2. Un sistema según la reivindicación 2, que también comprende una lente de producción de imágenes (12), donde dicha disposición de lente de producción de imágenes (12) se acopla a dicho transductor (5) para formar una unidad de producción de imágenes (13).

3. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que también comprende una lente de campo (6), donde dicha trayectoria de haz pasa dos veces por dicha lente de campo.

4. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el ángulo de incidencia \alpha es \alpha \geq A_{1} + A_{2}, siendo A_{1} el semiángulo de apertura de la excitación y A_{2} el semiángulo de apertura de la producción de imágenes fluorescentes.