ES2295176T3 - Metodos y compuestos terapeuticos. - Google Patents

Abstract

Compuesto de ciclopentabenzofurano que comprende un grupo de fórmula (ii) unido, mediante un átomo de oxígeno a un núcleo de ciclopentabenzofurano de fórmula (i) y que tiene las siguientes características de espectro de RMN: 1H RMN (CDCl3) (ppm) 3, 49, s, 3H; 3, 56, dd, 11, 7, 2Hz, 1H; 3, 61, m, 1H, 3, 61, 2H; 3, 65, s, 3H; 3, 71, s, 3H; 3, 87, s, 3H; 3, 89, dd, 14, 2, 6, 7 Hz, 1H; 4, 13, t, 11, 2 Hz, 1H; 4, 23, ta, 11, 3 Hz, 1H; 4, 28, d, 14, 2 Hz, 1H; 4, 59, s, 1H; 5, 03, d, 6, 7 Hz, 1H; 5, 28, s, 1H; 6, 28, d, 2Hz, 1H; 6, 43, d, 2Hz, 1H; 6, 68, da, 9Hz, 2H; 6, 84, m, 2H; 7, 06, m, 2H; 7, 06, m, 1H; 7, 10, da, 9Hz, 2H; 13C RMN (CDCl3) (ppm) 50, 03, 52, 06, 55, 03, 55, 05, 55, 1, 55, 9, 59, 63, 3, 68, 3, 70, 6, 79, 6, 92, 8, 93, 4, 93, 9, 94, 95, 2, 101, 9, 109, 6, 112, 7, 126, 2, 126, 6, 127, 8. 127, 8, 128, 9, 136, 7, 157, 1, 158, 8, 160, 160, 6, 170, 6; o una sal, derivado o profármaco del mismo, en el que el profármaco o derivado es un éster, glicósido, alquiloxilo opcionalmente sustituido, alcoxilo cíclico opcionalmente sustituido, alqueniloxilo opcionalmente sustituido, alqueniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, alquiniloxilo opcionalmente sustituido, alquiniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, aciloxilo opcionalmente sustituido de fórmula -O-C(O)-R, en la que R es un grupo alquilo, alquilo cíclico, alquenilo, alquenilo cíclico, alquinilo, alquinilo cíclico, heteroarilo o arilo, o ariloxilo opcionalmente sustituido o heteroariloxilo opcionalmente sustituido; y los sustituyentes opcionales para dicho alquiloxilo opcionalmente sustituido, alcoxilo cíclico opcionalmente sustituido, alqueniloxilo opcionalmente sustituido, alqueniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, alquiniloxilo opcionalmente sustituido, alquiniloxilo cíclico opcionalmente sustituido y aciloxilo opcionalmente sustituido se seleccionan de uno o más de halo, hidroxilo, alquilo C1-6, alcoxilo C1-6, nitro, amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1-6, halometilo, halometoxilo, acetilo, arilo, heteroarilo o un grupo alquilo cíclico y los sustituyentes opcionales para dicho ariloxilo opcionalmente sustituido y heteroariloxilo opcionalmente sustituido se seleccionan de uno o más de halo, hidroxilo, alquilo C1-6, alcoxilo C1-6, nitro, amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1-6, halometilo, halometoxilo o acetilo.

Description

Métodos y compuestos terapéuticos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a compuestos que tienen un núcleo de ciclopentabenzofurano. Más particularmente, la presente invención se refiere a compuestos de ciclopentabenzofurano en los que el núcleo de ciclopentabenzofurano está sustituido con un resto dioxaniloxilo. La invención también se refiere al uso de estos compuestos en el tratamiento y composiciones que comprenden dichos compuestos.

Antecedentes

Aglaia es un gran género de la familia de las meliáceas que comprende más de 100 especies (principalmente leñosas) en Indomalasia y la región del pacífico occidental. Los usos incluyen el tratamiento de fiebre, fracturas, partos e inflamación. Los extractos también se usan como bactericidas, insecticidas, en perfumería, como astringentes, tónicos, refrigerantes (Dr Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Databases) y para el tratamiento de tumores abdominales (Pannel, et al, 1992, KewBull., (16) 273-283).

Más recientemente, se han aislado varios lignanos de 1H-ciclopenta[b]benzofurano de especies de Aglaia (véanse por ejemplo, los documentos WO97/08161; JP 97171356; Ohse, et al, J Nat Prod, 1996, 59(7):650-52; Lee et al, Chem. Biol. Interact., 1998, 115(3):215-28; Wu et al, J. Nat. Prod., 1997, 60(6):606-08; Bohnenstengel et al, Z. Naturforsch., 1999, 54c (12): 55-60 y Bohnenstengel et al, Z. Naturforsch, 1999, 54c (12):1075-83, Xu, Y. J., et al, 2000, J. Nat. Prod., 63, 473-76. También se ha observado que varios de estos compuestos tienen actividad insecticida (Janprasert, et al, 1993, Phytochemistry, 32 (1), 67-69; Ishibashi et al, 1993, Phytochemistry, 32 (2), 307-310; Hiort, et al, 1999, J. Nat. Prod., 62 (12), 1632-1635). Se aislaron compuestos insecticidas con una estructura central estrechamente relacionada de Aglaia roxburghiana y se describen en el documento WO 9604284 para su uso como principios activos en formulaciones agroquímicas.

Ahora se han aislado nuevos compuestos (compuestos A y B, tal como se describen en el presente documento) de Aglaia leptantha, Miq. (meliáceas) que presentan de manera única un grupo dioxaniloxilo unido al núcleo de ciclopenta[b]benzofurano. Se ha mostrado que los compuestos A y B muestran potentes efectos citotóxicos y citostáticos sobre el crecimiento y viabilidad de células cancerosas y por tanto los compuestos de la invención pueden ser útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento del cáncer y condiciones cancerosas u otras enfermedades asociadas con la hiperproliferación celular.

Sumario de la invención

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas mencionados pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un compuesto de ciclopentabenzofurano o sal, derivado o profármaco del mismo según la reivindicación 1.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de ciclopentabenzofurano o sal, derivado o profármaco del mismo según la reivindicación 1 junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención también se refiere al uso de un compuesto de ciclopentabenzofurano o sal, derivado o profármaco del mismo según la reivindicación 1 en la fabricación para el tratamiento de cáncer o condiciones cancerosas.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 El compuesto A promueve la diferenciación de células leucémicas THP-1

Se cultivaron células THP-1 durante 4 días en presencia o ausencia de compuesto A 10 nM según se indica. Donde se muestran las células se trataron también con IFN\gamma (100 ng/ml) (3 días) o con PMA (0,1 \muM) (4 días) en presencia o ausencia de compuesto A. Las imágenes son de células visualizadas mediante microscopía de contraste de fases (aumento x200).

Figura 2 Efectos del compuesto A sobre la progresión del ciclo celular y viabilidad de células THP-1

Se cultivaron células THP-1 durante 2 días con la concentración indicada de compuesto A o paclitaxel 1000 nM y después se recogieron y se fijaron en etanol al 70% antes de la tinción con yoduro de propidio y se determinó el contenido en ADN mediante citometría de flujo. Los números indican el % de células en las diversas fases del ciclo celular con respecto a todas las células con un contenido en ADN \geq 2 N y también el % de células muertas (es decir, células con subdiploide \leq 2 N) a la izquierda del marcador (la línea vertical) que surgieron durante el periodo de cultivo.

Figura 3 Efectos del compuesto A sobre la proliferación de células A549

Se sembraron células A549 a \sim10.000 células/pocillo y se cultivaron en presencia de las concentraciones indicadas de compuesto A o paclitaxel. Se recogieron las células y se determinó el número de células viables mediante recuento con hemocitómetro de células teñidas con azul de tripano en diversos tiempos. Los resultados son los promedios \pm EEM de cultivos por triplicado.

Figura 4 Efectos del compuesto A sobre la progresión del ciclo celular y viabilidad de células A549

Se cultivaron células A549 durante 6 días con la concentración indicada de compuesto A o paclitaxel 1 \muM y después se recogieron y se fijaron en etanol al 70% antes de la tinción con yoduro de propidio y se determinó el contenido en ADN mediante citometría de flujo. Los números indican el % de células en las diversas fases del ciclo celular con respecto a todas las células con un contenido en ADN \geq 2 N y también el % de células muertas (es decir, células con subdiploide \leq 2 N) a la izquierda del marcador que surgieron durante el periodo de cultivo.

Figura 5 Los compuestos A y B inducen acumulación de fase G2/M de células leucémicas K562

Se cultivaron células K562 durante 3 días con la concentración indicada de compuestos A o B y después se recogieron y se fijaron en etanol al 70% antes de la tinción con yoduro de propidio y se determinó el contenido en ADN mediante citometría de flujo. Los números indican el % de células en las fases G0/G1, S y G2/M del ciclo celular respectivamente con respecto a todas las células con un contenido en ADN \geq 2 N.

Figura 6 Los efectos citostáticos del compuesto A sobre células A549 son reversibles

Se sembraron células A549 a \sim10.000 células/pocillo y se cultivaron en presencia de las concentraciones indicadas de compuesto A o paclitaxel y se determinaron los números de células viables mediante recuento con hemocitómetro de células teñidas con azul de tripano en diversos tiempos. El día 5 se lavaron algunas de las células, se resuspendieron en medio reciente que carecía de los diversos tratamientos y se cultivaron durante otros 4 días antes del recuento.

Figura 7 El compuesto A inhibe la citotoxicidad inducida por camptotecina y paclitaxel de células A549

Se cultivaron células A549 en placas de 96 pocillos durante 3 días en presencia o ausencia de compuesto A 10 nM junto con las concentraciones indicadas de (A) camptotecina o (B) paclitaxel. Entonces se evaluó la pérdida de integridad de membrana mediante la adición del tinte de unión a ADN fluorescente YOYO-1 y se midió el aumento de fluorescencia que acompañaba a la muerte celular usando un lector de fluorescencia para placas.

Figura 8 El compuesto A inhibe la parada del ciclo celular y la muerte celular inducida por agentes anticancerígenos pero no por estaurosporina

Se cultivaron células A549 en placas de 6 pocillos durante 3 días en presencia o ausencia de compuesto A 10 nM junto con camptotecina 0,1 \muM, vinblastina 10 \muM, paclitaxel 1 \muM o estaurosporina 1 \muM según se indica. Entonces se recogieron las células y se fijaron en etanol al 70% antes de la tinción con yoduro de propidio y se determinó el contenido en ADN mediante citometría de flujo. Los números indican el % de células en las diversas fases del ciclo celular con respecto a todas las células con contenido en ADN \geq 2 N y también el % de células muertas (es decir, células con subdiploide \leq 2 N) a la izquierda del marcador de puntos que surgieron durante el periodo de cultivo.

Figura 9 El compuesto A no induce la actividad \beta-galactosidasa asociada con la senescencia en células A549

Se sembraron células A549 a 10.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos en presencia o ausencia de diversas concentraciones de compuesto A (10 - 50 nM) o doxorubicina 250 nM durante 10 días antes de su tratamiento y tinción durante la noche para determinar la actividad \beta-galactosidasa asociada con la senescencia tal como se describió anteriormente (Dimri et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 1995 92(20):9363-7). Para el compuesto A sólo se muestra el tratamiento con 10 nM pero no hubo actividad SA-\beta-gal detectable en ninguna otra concentración sometida a prueba. PC, microscopía de contraste de fases. BF, microscopía de campo brillante. Aumento x200.

Figura 10 El compuesto A inhibe el crecimiento de células tumorales humanas en un modelo de xenoinjerto de ratón

Se inoculó por vía subcutánea en el flanco dorsal a ratones desnudos Balb/c atímicos (Rygard y Povisen, 1969, Acta Pathol Microbiol Scand, 77: 758) 2 x 10^{6} células PC3. Se administró el compuesto A (3 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal tres veces por semana tras ocho días cuando los tumores se volvieron palpables. En primer lugar se disolvió el compuesto A en etanol y después se mezcló 1:1 con cremaphor y se diluyó en solución salina para inyección. Se trataron animales control de manera análoga con el mismo vehículo pero sin compuesto A. (A) Efecto del compuesto A sobre el volumen tumoral medio. Se midieron los volúmenes tumorales usando un calibrador micrométrico en los tiempos indicados. Los datos representan el volumen tumoral medio \pm EEM (B) Efecto del compuesto A sobre la masa tumoral media. Al final del experimento (29 días tras la inoculación de células PC3) se sacrificaron
los ratones, se extirparon los tumores y entonces se pesaron. Los datos representan el peso tumoral medio \pm EEM.

Descripción detallada de la invención

Anteriormente se han notificado varios ciclopenta[b]benzofuranos, Greger et al, 2001, Phytochemistry, 57, (1); 57-64. Los compuestos A y B de la presente invención llevan un grupo dioxanilo (ii) unido a un núcleo de ciclopenta[b]benzofurano (i).

1

El grupo dioxanilo de fórmula (ii) no se ha notificado anteriormente a partir de una fuente natural. Si pretender limitar la invención por la teoría, se cree que la presencia de un grupo estéricamente voluminoso, es decir, espacialmente mayor que un grupo metoxilo, puede conferir propiedades tanto citotóxicas como citostáticas a los compuestos que tienen un núcleo de ciclopenta[b]benzofurano.

El término "sal, o profármaco" significa cualquier sal, éster, glicósido, solvato, hidrato o cualquier otro compuesto farmacéuticamente aceptable que, al administrarse al sujeto receptor, puede proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la invención tal como se describe en el presente documento.

Sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como ácidos acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, laúrico, pantoténico, tánico, ascórbico y valérico. Las sales de bases incluyen, pero no se limitan a, las formadas con cationes farmacéuticamente aceptables tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio.

La preparación de sales puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. También se apreciará que las sales no aceptables farmacéuticamente también entran dentro del alcance de la invención, ya que pueden ser útiles como productos intermedios en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina o como solvato (por ejemplo, hidratos). Los expertos en la técnica conocerán métodos de disolución.

Los profármacos de compuestos A o B también están dentro del alcance de la invención. El término "profármaco" incluye derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención e incluyen por ejemplo, derivados de éster, acetato y glicósido de grupos hidroxilo libres.

La derivatización de los grupos hidroxilo de los compuestos A y B puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica para alquilar, arilar o acilar grupos hidroxilo, por ejemplo tal como se describe en Protective Groups in Organic Synthesis T.W. Greene y P.G.M. Wutz, (1999) Wiley Interscience, Nueva York, y Advanced Organic Chemisty, J. March, (4ª Edición), Wiley-InterScience. Por ejemplo, los grupos hidroxilo pueden alquilarse usando haluros de alquilo tales como yoduro de metilo o sulfatos de dialquilo tales como sulfato de dimetilo y dietilo. La acilación puede realizarse mediante tratamiento con ácidos carboxílicos apropiados, haluros de ácidos y anhídridos de ácidos en presencia de una base o agente de acoplamiento. La bencilación puede realizarse mediante tratamiento con un compuesto de haluro de bencilo tal como bromuro, cloruro o yoduro de bencilo. La desesterificación del éster metílico puede realizarse mediante tratamiento del éster con una base acuosa. La esterificación de un ácido carboxílico puede lograrse mediante medios convencionales incluyendo tratamiento con un alcohol apropiado en presencia de ácido, o tratamiento con sulfatos de alquilo o haluros de alquilo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "alquilo", cuando se usa solo o en palabras compuestas tales como "arilalquilo", se refiere a un grupo ramificado o de cadena lineal, preferiblemente C_{1-20}, tal como C_{1-10}. El término "alquilo C_{1}-C_{6}" se refiere a un grupo ramificado o de cadena lineal de 1 a 6 átomos de carbono. Ejemplos de "alquilo C_{1-6}" incluyen metilo, etilo, iso-propilo, n-propilo, n-butilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, isopentilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 3-metilpentilo y 2,3-dimetilbutilo. Los grupos alquilo cíclico pueden tener hasta 20 átomos de carbono, por ejemplo hasta 10 átomos de carbono. Ejemplos de alquilo C_{1-6} cíclico incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Otros ejemplos de alquilo incluyen: heptilo, 5-metilhexilo, 1-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 4,4-dimetilpentilo, 1,2-dimetilpentilo, 1,3-dimetilpentilo, 1,4- dimetil-pentilo, 1,2,3-trimetilbutilo, 1,1,2-trimetilbutilo, 1,1,3-trimetilbutilo, octilo, 6-metilheptilo, 1-metilheptilo, 1,1,3,3-tetrametilbutilo, nonilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- o 7-metil-octilo, 1-, 2-, 3-, 4- o 5-etilheptilo, 1-, 2- o 3-propilhexilo, decilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- y 8-metilnonilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- o 6-etiloctilo, 1-, 2-, 3- o 4-propilheptilo, undecilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- o 9-metildecilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- o 7-etilnonilo, 1-, 2-, 3-, 4- o 5-propiloctilo, 1-, 2- o 3- butilheptilo, 1-pentilhexilo, dodecilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- o 10-metilundecilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8- etildecilo, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- o 6-propilnonilo, 1-, 2-, 3- o 4-butiloctilo, 1-2-pentilheptilo y similares. Los grupos alquenilo o alquinilo pueden ser lineales, ramificados o cíclicos (teniendo al menos 2 átomos de carbono) y contienen uno, dos o más grados de insaturación, preferiblemente un alquenilo C_{2-20}, más preferiblemente un alquenilo C_{2-6}, o un alquinilo C_{2-20}, más preferiblemente un alquinilo C_{2-6}.

El término "arilo", cuando se usa solo o en palabras compuestas tales como "arilalquilo", indica residuos individuales, polinucleares, conjugados o condensados de hidrocarburos aromáticos. Heteroarilo indica residuos individuales, polinucleares, conjugados o condensados de sistemas de anillos heterocíclicos aromáticos, en los que uno o más átomos de carbono de un residuo de hidrocarburo cíclico está(n) sustituido(s) por un heteroátomo para proporcionar un residuo aromático. Cuando dos o más átomos de carbono están sustituidos, puede ser por dos o más del mismo heteroátomo o por diferentes heteroátomos. Los heteroátomos adecuados incluyen O, N, S y Se.

Ejemplos de "arilo" o "heteroarilo" incluyen fenilo, bifenilo, terfenilo, quaterfenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, antracenilo, dihidroantracenilo, benzoantracenilo, dibenzoantracenilo, fenantrenilo, fluorenilo, pirenilo, idenilo, azulenilo, crisenilo, piridilo, 4-fenilpiridilo, 3-fenilpiridilo, tienilo, furilo, pirrolilo, indolilo, piridazinilo, pirazolilo, pirazinilo, tiazolilo, pirimidinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzofuranilo, benzotienilo, purinilo, quinazolinilo, fenacinilo, acridinilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo y similares. Grupos arilo preferidos incluyen fenilo y naftilo. Grupos heteroarilo preferidos incluyen piridilo, tienilo, furilo, pirrolilo. Un grupo arilo o heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes opcionales tal como se definen en el presente documento.

El término "acilo" se refiere a un grupo -C(O)-R en el que R es un grupo alquilo, alquenilo, alquilo cíclico, alquinilo, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, heteroarilo o arilo. Ejemplos de acilo incluyen alcanoilo ramificado o de cadena lineal tal como acetilo, propanoilo, butanoilo, 2-metilpropanoilo, pentanoilo, 2,2-dimetilpropanoilo, hexanoilo, heptanoilo, octanoilo, nonanoilo, decanoilo, undecanoilo, dodecanoilo, tridecanoilo, tetradecanoilo, pentadecanoilo, hexadecanoilo, heptadecanoilo, octadecanoilo, nonadecanoilo y icosanoilo; cicloalquilcarbonilo, tal como ciclopropilcarbonilo, ciclobutilcarbonilo, ciclopentilcarbonilo y ciclohexilcarbonilo; aroilo tal como benzoilo, toluoilo y naftoilo; aralcanoilo tal como fenilalcanoilo (por ejemplo fenilacetilo, fenilpropanoilo, fenilbutanoilo, fenilisobutililo, fenilpentanoilo y fenilhexanoilo) y naftilalcanoilo (por ejemplo naftilacetilo, naftilpropanoilo y naftilbutanoilo]. Ya que el grupo R puede estar opcionalmente sustituido tal como se describió anteriormente, se entiende que "acilo" se refiere a acilo opcionalmente sustituido.

Los sustituyentes opcionales para alquilo, alquenilo, alquilo cíclico, alquinilo, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, heteroarilo, arilo o acilo incluyen halo (bromo, fluoro, cloro, yodo), hidroxilo, alquilo C_{1-6} (por ejemplo, metilo, etilo, propilo (isómeros n e i)), alcoxilo C_{1-6} (por ejemplo metoxilo, etoxilo, propoxilo (isómeros n e i), butoxilo (isómeros n, sec y t), nitro, amino, alquilamino C_{1-6} (por ejemplo metilamino, etilamino, propil(isómeros n e i)amino), dialquilamino C_{1-6} (por ejemplo dimetilamino, dietilamino, diisopropilamino), halometilo (por ejemplo trifluorometilo, tribromometilo, triclorometilo), halometoxilo (por ejemplo trifluorometoxilo, tribromometoxilo, triclorometoxilo) y acetilo.

Un grupo alquilo, alquenilo, alquilo cíclico, alquinilo, alquenilo cíclico o alquinilo cíclico también puede estar sustituido (preferiblemente en el extremo terminal) con un grupo arilo o un grupo alquilo cíclico. Un grupo acilo puede estar sustituido (por ejemplo, sustituido en el extremo terminal) con un grupo arilo, heteroarilo o alquilo cíclico.

La formación glicosídica puede realizarse químicamente, por ejemplo haciendo reaccionar el compuesto de partida con un compuesto de azúcar protegido en el que se ha activado el C-1 mediante halogenación para el acoplamiento con los grupos hidroxilo o carboxilo y se han bloqueado los hidroxilos del azúcar mediante grupos protectores. Alternativamente, la formación de glicósido puede realizarse enzimáticamente usando una glicosiltransferasa apropiada tal como galactosiltransferasa dependiente de UDP-galactosa y glicosiltransferasa dependiente de UDP-glucosa (SIGMA).

Los sacáridos unidos en C-1 preferidos son un sustituyente de sacárido (azúcar) furanosa o piranosa que está unido a la estructura principal mostrada en la fórmula (I) mediante el carbono 1 del sacárido (numeración química convencional) para formar un enlace acetal en una cualquiera de las posiciones R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} o R_{7} o un enlace éster en el R_{8} o una amida en la posición R_{9} o R_{10}. Grupos sacáridos a modo de ejemplo incluyen azúcares reductores tales como glucosa, ribosa, arabinosa, xilosa, manosa y galactosas, estando cada una unida a un átomo de oxígeno de la estructura de fórmula (I) mediante el carbono C-1 del grupo sacárido.

El experto reconocerá que con el fin de instalar selectivamente uno cualquiera o más de los grupos derivados tal como se definen en el presente documento, esto puede requerir la protección y/o desprotección juiciosa, de uno o más de los grupos oxilo y/o carboxilo del núcleo de ciclopentabenzofurano. Puede lograrse la derivatización selectiva de uno o más grupos hidroxilo o carboxilo mediante técnicas convencionales mediante el uso de grupos protectores con diferentes grados de estabilidad en condiciones apropiadas.

Los métodos para la conversión de un grupo ácido carboxílico o éster en una amida los conoce el experto y puede incluir tratamiento de un ácido carboxílico con una amina apropiada en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como DCC o tratamiento de un haluro de ácido con la amina apropiada. Otros métodos que pueden ser adecuados se describen en Larock, R.E, Comprehensive Organic Transformations, págs. 963-995, VCH Publishers (1989).

Tal como se usa en el presente documento, el término "grupo protector", se refiere a una funcionalidad introducida que puede inactivar temporalmente un grupo funcional particular, por ejemplo hidroxilo o ácido carboxílico, en ciertas condiciones en las que el grupo podría ser de otro modo reactivo. Los expertos en la técnica conocen grupos protectores adecuados, por ejemplo tal como se describe en Protective Groups in Organic Synthesis (citado anteriormente). Los grupos protectores adecuados para hidroxilo incluyen grupos alquilo (tales como alquilo C_{1}-C_{6}), acilo (tales como C(O)alquilo C_{1}-C_{6}, benzoilo y similares), bencilo y sililo (tales como trimetilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo y similares). Otros grupos adecuados para sustituyentes de hidroxilo y un sustituyente de carboxilo (ácido, amida etc) pueden encontrarse en Greene citado anteriormente. El experto entiende la estabilidad de diversos grupos en ciertas condiciones y se muestra a modo de ejemplo adicionalmente en Protective Groups in Organic Synthesis (citado anteriormente).

También se reconocerá que el grupo dioxanilo de fórmula (ii) puede presentar centros asimétricos y por tanto puede existir en más de una forma estereoisomérica. Por tanto, la invención se refiere también a compuestos en forma isomérica sustancialmente pura en uno o más centros asimétricos (quirales) del grupo dioxanilo, por ejemplo, superior a aproximadamente el 90% de ee, tal como aproximadamente el 95% o el 97% de ee, preferiblemente superior al 99% de ee, así como mezclas, incluyendo mezclas racémicas, de los mismos. Tales isómeros pueden resolverse mediante métodos convencionales, por ejemplo, cromatografía, o el uso de un agente de resolución.

También se entenderá que los compuestos de ciclopentabenzofurano, que tienen un sustituyente de metoxilo o hidroxilo, tales como los descritos en las referencias citadas en el presente documento por ejemplo los compuestos 1-3 de referencia (tal como se describen en el ejemplo 3), pueden estar desmetilados, cuando sea apropiado, y el grupo hidroxilo resultante puede hacerse reaccionar con un precursor Y adecuado para formar un grupo OY. Los métodos para ello se conocen en la técnica, por ejemplo, un método puede implicar hacer reaccionar el grupo OH con un compuesto Y-halógeno en el que el halógeno incluye Cl, Br y I.

Los compuestos de la invención pueden tener uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de condiciones cancerosas, u otras condiciones asociadas con la hiperproliferación celular, en un sujeto. Los sujetos que pueden tratarse con los compuestos de la invención incluyen mamíferos, por ejemplo, seres humanos, primates, animales de ganado (por ejemplo, ovejas, vacas, caballos, cabras, cerdos), animales de compañía, (por ejemplo perros, gatos, conejos, cobayas), animales para pruebas de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas, perros, conejos, primates) o animales salvajes capturados. Lo más preferiblemente, los seres humanos son los sujetos que van a tratarse.

Tal como se usa en el presente documento se pretende que el término "tratamiento" incluya la prevención, ralentización, interrupción o detención del crecimiento de una célula cancerosa, tumoral o hiperproliferativa, o una reducción del número de células diana (o tamaño de la masa en crecimiento) o la destrucción total de dicha célula, en el que dichas células son células cancerosas, tumorales o hiperproliferativas.

Las condiciones cancerosas que pueden tratarse con los compuestos de la presente invención incluyen condiciones en las que los cánceres o tumores pueden ser sencillos (monoclonales, es decir, compuestos por un único tipo de célula neoplásica), mixtos (policlonales, es decir, compuestos por más de un tipo de célula neoplásica) o compuestos (es decir, compuestos por más de un tipo de célula neoplásica y derivados de más de una capa germinal) y pueden incluir neoplasia/hiperplasia benigna y maligna. Algunos ejemplos de condiciones cancerosas que pueden tratarse por la presente invención incluyen leucemia y melanomas, tumores y cánceres de mama, colon, útero, próstata, pulmón, ovarios, cerebro, piel, hígado, intestino y estómago. Ejemplos de hiperplasias benignas incluyen las vasculares (por ejemplo, hemangioma), de próstata, renales, suprarrenales, hepáticas, de colon (por ejemplo, cripta del colon), de glándula paratiroidea y otros tejidos.

Ya que los compuestos de la invención pueden tener propiedades citostáticas así como citotóxicas, también pueden tener un posible uso como agentes terapéuticos para la supresión del crecimiento de poblaciones de células diana distintas de células cancerosas o tumorales, por ejemplo, condiciones o estados patológicos asociados con hiperproliferación celular. Tales condiciones pueden incluir aterosclerosis y restinosis (hiperplasia neoíntima) e hiperproliferación debida a o que acompaña una respuesta inflamatoria, por ejemplo artritis, (incluyendo artritis reumatoide, artrosis y artritis inflamatoria), psoriasis y enfermedad periodontal, o hiperproliferación celular debida a la infección viral de células tales como virus de papiloma humano.

Los compuestos de la invención pueden combinarse con otros compuestos terapéuticos, tales como compuestos anticancerígenos, incluyendo paclitaxel, camptotecina, vinblastina y doxorubicina.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un uso de un compuesto de fórmula (I) en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer o condiciones cancerosas para su uso junto con otros agentes terapéuticos.

Los compuestos de la invención y el agente terapéutico adicional pueden administrarse simultáneamente, como una única composición o como composiciones diferenciadas, o pueden administrarse por separado, es decir, uno después del otro a intervalos adecuados según se determine por el médico encargado.

Tal como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" de un compuesto se refiere a una cantidad de compuesto que, cuando se administra según un régimen de dosificación deseado, proporciona la actividad terapéutica deseada. La dosificación puede producirse a intervalos de minutos, horas, días, semanas, meses o años o de manera continua a lo largo de uno cualquiera de estos periodos. Las dosificaciones adecuadas se encuentran dentro del intervalo de aproximadamente 0,1 ng por kg de peso corporal a 1 g por kg de peso corporal por dosificación. La dosificación está preferiblemente en el intervalo de 1 \mug a 1 g por kg de peso corporal por dosificación, tal como en el intervalo de 1 mg a 1 g por kg de peso corporal por dosificación. En una realización, la dosificación está en el intervalo de 1 mg a 500 mg por kg de peso corporal por dosificación. En otra realización, la dosificación está en el intervalo de 1 mg a 250 mg por kg de peso corporal por dosificación. Aún en otra realización, la dosificación está en el intervalo de 1 \mug a 100 mg por kg de peso corporal por dosificación, tal como hasta 50 mg por kg de peso corporal por dosificación. El régimen de dosificación para cada sujeto puede depender de la edad, peso, salud e historia clínica del sujeto y el grado y la evolución de la condición que va a tratarse, y puede determinarse por el médico encargado.

El principio activo puede administrarse en una única dosis o en una serie de dosis. Aunque es posible administrar el principio activo solo, es preferible presentarlo como una composición, preferiblemente como una composición farmacéutica.

El vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de que sea compatible con los otros componentes de la composición y no perjudicial para el sujeto. Las composiciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parental (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las composiciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de poner en asociación el principio activo con el vehículo que constituye uno o más componentes auxiliares. En general, las composiciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente el principio activo con vehícu-
los líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después si es necesario conformando el producto.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades diferenciadas tales como cápsulas, bolsas o comprimidos conteniendo cada una una cantidad predeterminada del principio activo; como polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como un bolo, electuario o pasta.

Un comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes auxiliares. Los comprimidos sometidos a compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en una forma que fluye libremente tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un agente aglutinante (por ejemplo, diluyente inerte, conservante, disgregante tal como glicolato sódico de almidón, polivinilpirrolidona reticulada, carboximetilcelulosa reticulada) tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humectado con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente recubiertos o ranurados y pueden formularse de manera que proporcionen liberación lenta o controlada del principio activo en el mismo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en diversas proporciones para proporcionar el perfil de liberación deseado. Los comprimidos pueden proporcionarse opcionalmente con un recubrimiento entérico, para proporcionar la liberación en partes del intestino distintas del estómago.

Las composiciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden el principio activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el principio activo en un vehículo líquido adecuado.

Las composiciones para la administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao, gelatina, polietilenglicol.

Las composiciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen además del principio activo vehículos tales como los que se sabe en la técnica que son apropiados.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bactericidas y solutos que hacen que la composición sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en un estado deshidratado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos de la clase descrita anteriormente.

Las composiciones de dosificación unitaria preferidas son las que contienen una unidad o dosis diaria, subdosis diaria, tal como se describió anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del principio activo.

Debe entenderse que además de los principios activos particularmente mencionados anteriormente, las composiciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que se refiere al tipo de composición en cuestión, por ejemplo, los adecuados para la administración oral pueden incluir agentes adicionales tales como aglutinantes, edulcorantes, espesantes, agentes aromatizantes, agentes disgregantes, agentes de recubrimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes de retardo en el tiempo. Edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo o sacarina. Agentes disgregantes adecuados incluyen almidón de maíz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma xantano, bentonita, ácido algínico o agar-agar. Agentes aromatizantes adecuados incluyen esencia de menta, aceite de gaulteria, aromatizante de cereza, naranja o frambuesa. Agentes de recubrimiento adecuados incluyen polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, ceína, laca o gluten. Conservantes adecuados incluyen benzoato de sodio, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabeno, propilparabeno o bisulfito de sodio. Lubricantes adecuados pueden incluir estearato de magnesio, ácido esteárico, oleato de sodio, cloruro de sodio o talco. Agentes de retardo en el tiempo adecuados pueden incluir monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Una o más realizaciones de la presente invención también pueden proporcionar agentes o compuestos de composiciones que tienen una ventaja sobre (o evitan un inconveniente asociado con) métodos, composiciones, agentes o compuestos conocidos usados en el tratamiento quimioterapéutico de condiciones cancerosas o condiciones asociadas con la hiperproliferación de células. Tales ventajas pueden incluir una o más de: aumento de la actividad terapéutica, reducción de los efectos secundarios, reducción de la citotoxicidad frente a células no cancerosas o no proliferativas, mejora de la solubilidad o dispersibilidad para la formulación en composiciones farmacéuticas, mejora de la estabilidad o un medio más fácilmente disponible para obtener dichos compuestos, por ejemplo, mediante procedimientos de aislamiento o sintéticos más sencillos, más baratos o con mayor rendimiento.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Ha de entenderse que la invención incluye todas de tales variaciones y modificaciones que entran dentro del alcance de las reivindicaciones.

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen para el fin de ilustrar las realizaciones de la invención y no deben interpretarse como limitativos de la generalidad descrita anteriormente en el presente documento.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de compuestos A y B de Aglaia leptantha

Se aislaron los compuestos A y B usando el siguiente procedimiento:

(a) tratar una muestra de corteza molida de la especie de árbol Aglaia leptantha con metanol.

(b) filtrar el extracto y concentrar la solución resultante a vacío.

(c) fraccionar el extracto mediante extracción en fase sólida en una columna de extracción C-18 Varian (10 g) usando ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo/agua con concentraciones crecientes de acetonitrilo.

(d) recoger el eluato obtenido con una razón de acetonitrilo/agua ratio de 7:20. Los compuestos A y B tienen un máximo de absorción UV de 200, 273 nm (acetonitrilo/agua/ácido fórmico al 0,1%) y tiempos de retención en HPLC de aproximadamente 30,67 (compuesto A) y 31,05 minutos (compuesto B) en las siguientes condiciones: columna C-8 Symmetry (WATERS), 4,6 x 250 mm, 5 \mum 1 ml/min, gradiente lineal de desde el 0% hasta el 90% de acetonitrilo en agua en 40 minutos con ácido fórmico al 0,1%.

(e) concentrar la fracción obtenida en la etapa (d).

(f) someter a cromatografía el concentrado obtenido en la etapa (e) en una columna preparativa C-18 (WATERS, Nova-Pak C- 18,6 micras, 2,5 x 25 cm) a una velocidad de flujo de 20 ml/min usando un gradiente lineal de desde el 25% hasta el 45% de acetonitrilo en agua en 30 minutos con ácido fórmico al 0,1%.

(g) recoger y concentrar los eluatos con las características cromatográficas y espectroscópicas expuestas en la etapa (d) a aproximadamente 22 minutos.

(h) someter a cromatografía cada eluato obtenido en (g) en una columna Sephadex LH20 usando metanol como disolvente. Recoger y concentrar las fracciones con características espectrales expuestas en (d).

(i) alternativamente a las etapas (b), (c) y (d), el extracto en metanol obtenido en (a) puede repartirse con volúmenes iguales de agua y diclorometano. Entonces se procesa la fase de diclorometano según las etapas (e) a (h).

Los compuestos así obtenidos tienen las siguientes características espectroscópicas y físicas;

máximo de absorción UV/Vis: 223, 275 nm (en MeCN/H_{2}O, HCOOH al 0,1%).

EM: se obtuvieron espectros de masa en un espectrómetro de masas por trampa de iones Finnigan LCQ usando la fuente de ESI en el modo de iones positivos. Se disolvió la muestra en AF al 0,1% en MeOH y se introdujo en la fuente mediante infusión con una bomba con jeringuilla a una velocidad de 3 \mul/min. Para el compuesto A, se observaron señales a m/z 677 [M+Na^{+}]^{+}; EM^{2} produjo m/z 659 [M+Na^{-} H_{2}O]^{+}; EM^{3} produjo m/z 627 (pérdida de 32 uma); EM^{4} produjo m/z 595 (pérdida de otras 32 uma) y m/z 451 (pérdida de 176 uma, equivalente a la cadena lateral de dioxano). Para el compuesto B, se observaron señales en el modo de iones positivos a m/z 677,2 [M+Na^{+}]^{+}; EM^{2} produjo iones hijos a m/z 627,2 y m/z 659,2. La fragmentación adicional de la señal a m/z 627,2 produjo un ión hijo a m/z 595,3.

Se obtuvieron espectros de masas precisos para el compuesto A en el espectrómetro de masas por resonancia de ión-ciclotrón con transformada de Fourier (FTMS) Bruker 47e equipado con una fuente de electrospray (ESI) Analytica. Se disolvió la muestra en MeOH y se introdujo en la fuente mediante infusión directa con una bomba con jeringuilla a una velocidad de 60 \mul/min. Se hizo funcionar la fuente con un potencial capilar de 100 v. Se observó una señal a m/z 677,2194 [M+Na]^{+} medido; C_{34}H_{38}O_{13}Na^{+} requiere 677,2204.

RMN

Se adquirieron los espectros de RMN de los compuestos A y B en espectrómetros de RMN Varian INOVA de 400 y 500 MHz, en CD_{3}OD y CDCl_{3}, respectivamente. Se realizaron los siguientes experimentos: ^{1}H, ^{13}C, DEPT, HMQC, HMBC, COSY. Los desplazamientos químicos de ^{1}H RMN (obtenidos en CDCl_{3}) y los desplazamientos químicos de ^{13}C RMN se enumeran en la tabla 1.

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TABLA 1

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Ejemplo 2 Los compuestos A y B son citostáticos y citotóxicos para línea celulares de tumores humanos

Los compuestos A y B se identificaron a partir de una muestra de corteza de Aglaia lepthantha mediante su capacidad para inhibir la producción de factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha) por células de leucemia promonocítica humanas THP-1 (Tsuchiya, et al, Int. J. Cancer, 1980, 26(2):171-6) activadas con lipopolisacárido (LPS). La tabla 2 resume los resultados que comparan la actividad de los compuestos A y B para la inhibición de la producción de TNF-\alpha con sus efectos sobre el metabolismo celular general medido usando ensayos de reducción de WST-1, de síntesis de ADN y de síntesis de proteínas para células THP-1. Los compuestos A y B inhibieron potentemente la producción de TNF-\alpha a concentraciones ampliamente similares que fueron activas en los ensayos de reducción de WST-1, de síntesis de ADN y de proteínas. Para comparación, también se midieron los efectos de los compuestos A y B sobre células de carcinoma epitelial de pulmón A549 (Leiber et al, Int. J. Cancer, 1976, 17(1):62-70) y los datos también se incluyen en la tabla 2. Los compuestos A y B son significativamente menos potentes para la inhibición de la expresión de molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1) inducida por interleucina 1 (IL-1) por células A549 aún cuando en estas células la inhibición de la síntesis de proteínas y ADN se produce a concentraciones ampliamente similares que para las células THP-1.

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TABLA 2 Comparación de los efectos de los compuestos A y B en células THP-1 y A549

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Se sometió a ensayo el compuesto A para determinar la actividad citotóxica y citostática frente a un panel de líneas celulares derivadas de una variedad de tipos de tumores humanos además de células THP-1 y A549 (tabla 3). Éstas incluyeron células leucémicas K562 (Lozzio y Lozzio, 1975, Blood 45:321-34), células de tumor de próstata PC3 (Kaighn et al., 1979, Invest. Urol. 17:16-23) y células de glioblastoma SF268 (Westphal et al, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun., 132:284-9). El compuesto A mostró una potente actividad citostática en casi todas las líneas celulares sometidas a prueba con valores de IC_{50} que oscilaban entre 1-7 nM. El compuesto A también mostró potentes efectos citotóxicos frente a las diversas líneas de células tumorales. De manera interesante, las células THP-1 y PC3 demostraron ser las más rápidamente destruidas con poca diferencia en los valores de CL_{50} obtenidos tras 3 o 6 días de cultivo. Sin embargo, la potencia citotóxica del compuesto A aumentó drásticamente tras 6 días de cultivo para las células K562, A549 y SF268 células. Debe observarse que la concentración de compuesto A requerida para inhibir la proliferación celular fue significativamente inferior a la requerida para provocar una respuesta citotóxica. Por tanto, el efecto citostático del compuesto A es bioquímicamente distinguible de su capacidad para inducir la muerte celular. La tabla 4 muestra que el compuesto B mostró efectos citotóxicos frente a las diversas líneas de células tumorales con potencia comparable a la observada con el compuesto A.

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TABLA 3 El compuesto A tiene potente actividad citostática y citotóxica en diversas líneas de células tumorales humanas in vitro

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TABLA 4 Los compuestos A y B muestran actividad citotóxica similar

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Ejemplo 3 La actividad citotóxica del compuesto A no está compartida por otros compuestos relacionados conocidos que carecen de la sustitución con dioxaniloxilo novedosa

La tabla 5 compara los efectos citostático y citotóxico del compuesto A con tres ligandos de 1H-ciclopenta[b]benzofurano previamente identificados que carecen del grupo dioxaniloxilo novedoso. Los compuestos de referencia son: Rocaglaol (compuesto de referencia 1) (Ohse et al., J Nat Prod, 1996, 59(7): 650-52); 4'-desmetoxi-3',4'-metilendioxirocaglaol (compuesto de referencia 2); 4'-desmetoxi-3',4'-metilendioxirocaglato de metilo (compuesto de referencia 3) (Lee et al., Chem Biol Interact, 1998, 115(3): 215-28). Los cuatro compuestos mostraron actividad citostática detectable en células A549 siendo el compuesto A el más potente seguido en orden decreciente por los compuestos de referencia 3, 2 y 1 respectivamente. De manera importante, de los compuestos sometidos a prueba, a parte del compuesto A, ninguno de los compuestos de referencia mostró ninguna citotoxicidad apreciable en células THP-1 ni A549 a dosis de hasta 5000 nM a lo largo del ensayo de 3 días. Sin pretender limitar la invención por la teoría, se sugiere que la sustitución con dioxaniloxilo novedosa es importante para la actividad citotóxica mostrada por el compuesto A y lo distingue de cualquier otro ligando de 1H-ciclopenta[b]benzofurano previamente
identificado.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 4 El compuesto A tiene actividad inhibidora de la síntesis de proteínas de efecto inmediato

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También se examinó el compuesto A para determinar si podía inhibir rápidamente la biosíntesis de proteínas generales. Usando la incorporación de [^{14}C]-leucina en el material celular insoluble como ensayo para determinar la biosíntesis de proteínas generales, la tabla 6 muestra que el compuesto A tuvo un efecto inhibidor evidente en el plazo de 3 h tras la adición a células TPIP-1 con una CI_{50} de \sim 30 nM. También se inhibió la síntesis de ADN medida a lo largo del mismo tiempo, pero de manera menos potente (CI_{50} \sim 70 nM) y puede ser secundario a la inhibición de la síntesis de proteínas. La cicloheximida, un inhibidor conocido de la síntesis de proteínas (Obrig et al, 1971, J. Biol. Chem. 246(1), 174-181), también inhibió la síntesis tanto de proteínas como de ADN teniendo el compuesto A efectos significativamente más potentes que la cicloheximida. La tabla 6 muestra que el compuesto A también inhibió la síntesis de proteínas generales en células A549 con una CI_{50} de \sim 30 nM que es similar a lo observado en las células THP-1.

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TABLA 6 El compuesto A inhibe la biosíntesis de proteínas generales

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Ejemplo 5 El compuesto A induce la diferenciación de líneas de células leucémicas humanas

En los experimentos con las células de leucemia monocítica THP-1, que normalmente crecen sin unirse en suspensión, se observó que la exposición prolongada de las células a compuesto A 10 nM dio como resultado la acumulación de células que se adhirieron al plástico y mostraron numerosas pesudópodos (figura 1). Esto es una morfología sumamente característica de macrófagos maduros y se observaron efectos morfológicos similares cuando se trataron las células con otros inductores conocidos de la diferenciación de macrófagos incluyendo interferón \gamma (IFN\gamma) o forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). Para investigar esto adicionalmente se examinaron los efectos del compuesto A sobre células leucémicas promielocíticas humanas HL60 (Collins, et al, Nature, 1977, 270:347-9) (tabla 7). Esta línea celular ampliamente usada está bien caracterizada como modelo de diferenciación mielomonocítica humana (Collins, Blood, 1987, 70(5):1233-44). En este experimento, se cuantificó la diferenciación monocítica midiendo la expresión del antígeno de superficie CD14 mediante análisis de citometría de flujo. CD14, una proteína de unión a LPS, se expresa sobre la superficie de células del linaje mielomonocítico y normalmente se expresa a niveles muy bajos en células HL60 no diferenciadas (Ferrero et al., Blood, 1983,61(1): 171-9). De manera coherente con los datos de THP-1 anteriores, la tabla 7 muestra que el compuesto A a dosis superiores a 10 nM potenció significativamente la expresión de CD14 en las células HL60 viables que quedaban tras 4 días de cultivo. Tomados juntos, estos datos indican fuertemente que el compuesto A tiene la capacidad de inducir la diferenciación de líneas de células leucémicas humanas.

TABLA 7 El compuesto A promueve la diferenciación monocítica de células leucémicas HL60

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Ejemplo 6 La actividad citostática del compuesto A está asociada con una inhibición general de la progresión del ciclo celular en células A549

El análisis del contenido en ADN de células THP-1 tratadas con diversas concentraciones de compuesto A (figura 2) demostró que a 10 nM sólo era débilmente citotóxico (aumento de la acumulación de células muertas desde el 7% hasta el 17%) y en estas condiciones hizo que las células se acumulasen en las fases G0/G1 del ciclo celular. Esto indica que el compuesto A también tiene actividad citostática en células THP-1. Para comparación, la figura 2 muestra que el fármaco paclitaxel desestabilizador de microtúbulos (Sorger et al., Curr Opin Cell Biol. 1997, 9(6):807-14) que también indujo la muerte de células THP-1, hizo que las células se acumulasen en las fases G2/M del ciclo celular.

El efecto citostático del compuesto A sobre la proliferación de las células A549 se confirmó contando directamente el número de células a intervalos a lo largo de un periodo de nueve días (figura 3). Cuando se comparó con células sin tratar, el compuesto A 10 nM evitó el aumento del número de células en más del 95% con menos del 10% de células muertas observadas en este momento (medidas mediante exclusión con azul de tripano). Por tanto, en estas condiciones, la reducción del número de células no puede explicarse sencillamente por el aumento de muerte celular. Se observó una inhibición significativa del número de células en el plazo de 2 días, lo que indica que el compuesto A actúa de una manera rápida. A concentraciones superiores de 50 nM y 250 nM, el compuesto A tuvo efectos citotóxicos y aumentó la muerte celular hasta el 86% y el 100% respectivamente tras 9 días y representa la disminución del número de células hasta niveles inferiores al número de partida original en este momento. A la concentración no citotóxica de 10 nM, el compuesto A tiene un efecto citostático rápido y potente sobre células A549.

Para ayudar a identificar un posible mecanismo para los efectos del compuesto A, se realizó un análisis del contenido en ADN para determinar en qué parte del ciclo celular ejercía su efecto (figura 4). El análisis del ciclo celular de células A549 tratadas con compuesto A durante 6 días mostró que a 10 nM, cuando no había citotoxicidad obvia evidente, había una disminución menor en la proporción de células en las fases G0/G1 del ciclo celular con un aumento concomitante de células en las fases G2/M. Tomados junto con los datos de la curva de crecimiento en la figura 3 anterior, estos datos indican que el compuesto A 10 nM da como resultado una prolongación general de todas las fases del ciclo celular quizás con un alargamiento ligeramente más pronunciado de las fases G2/M. Esto contrasta con los efectos de paclitaxel, un fármaco que se sabe que actúa selectivamente en las fases G2/M del ciclo celular (figura 4). A medida que se aumentó la concentración de compuesto A y sus efectos citotóxicos se volvieron evidentes, la proporción de células en las fases S y G2/M se redujo con un aumento correspondiente de células en las fases G0/G1. Aunque hubo una pequeña diferencia en el número de células muertas entre 50 nM y 250 nM, la dosis superior dio como resultado una mayor acumulación de células en las fases G0/G1 del ciclo celular. Por tanto, en comparación con las células THP-1 (véase la figura 2), se requieren concentraciones superiores del compuesto A para inhibir la progresión a través de las fases G0/G1 del ciclo celular en células A549.

Las células leucémicas K562 tratadas con compuestos A o B 10-15 nM mostraron una acumulación característica de células en fases G2/M del ciclo celular (figura 5). Esto se produjo a lo largo de un estrecho intervalo de concentraciones ya que los compuestos A o B a menos de 5-8 nM o más de 25 nM no provocaban una acumulación en la fase G2/M. Estos datos indican que diferentes líneas celulares pueden variar en su sensibilidad y respuestas a los compuestos A y B para efectos específicos de la fase del ciclo celular.

Ejemplo 7 El efecto citostático del compuesto A es reversible en células A549

Se determinó la reversibilidad de los efectos del compuesto A. Para ello, células A549 permanecieron sin tratar o se cultivaron en presencia de diversas concentraciones de compuesto A o con paclitaxel durante 5 días antes de retirar los compuestos y se cultivaron las células durante otros 4 días antes de determinar el número de células (figura 6). El compuesto A 10 nM suprimió significativamente el aumento de número de células durante hasta 9 días sin citotoxicidad significativa. Sin embargo, para estos cultivos, cuando se eliminó el compuesto A tras 5 días, hubo un aumento de más de cinco veces del número de células a lo largo de los 4 días posteriores de cultivo, lo que representa 2-3 multiplicaciones de la población. Los efectos de los tratamientos que eran perjudiciales para las células, tales como concentraciones superiores de compuesto A o presencia de paclitaxel, no se invirtieron al retirarse.

Ejemplo 8 El compuesto A inhibe la citotoxicidad dependiente del ciclo celular provocada por diversos agentes anticancerígenos

Para examinar adicionalmente los efectos sobre el ciclo celular del compuesto A, se combinó una concentración citostática de este compuesto junto con otros agentes anticancerígenos que se sabe que actúan en puntos específicos en el ciclo celular para ver si el compuesto A podía perturbar sus efectos dependientes del ciclo celular. Se sometió a ensayo la viabilidad celular tras 3 días midiendo la exclusión del tinte fluorescente YOYO-1 de unión a ADN (Becker et al., Anal Biochem, 1994, 221(1):78-84). Se trataron células A549 con dosis no citotóxica de 10 nM de compuesto A en presencia de concentraciones crecientes de camptotecina y paclitaxel. La camptotecina es un inhibidor de la ADN topoisomerasa 1, una enzima requerida para la replicación del ADN, y da como resultado la perturbación de la fase S del ciclo celular con posterior muerte celular debida a la activación de un punto de control de la fase S (Darzynkiewicz et al., Ann N Y Acad Sci, 1996, 803:93-100). Paclitaxel, tal como ya se mencionó, inhibe la función de microtúbulos requerida para la formación del huso acromático mitótico dando así como resultado la activación de un punto de control de la fase M y posterior muerte celular (Sorger et al., Curr Opin Cell Biol, 1997 9(6): 807-14). La figura 7 muestra que el compuesto A 10 nM redujo significativamente los efectos citotóxicos tanto de camptotecina como de paclitaxel incluso cuando se añadieron estos fármacos hasta un exceso de 2000 veces. El compuesto A puede prevenir, de una manera dominante, los efectos citotóxicos dependientes del ciclo celular de camptotecina y paclitaxel.

Esto se examinó con mayor detalle usando el análisis del contenido en ADN para medir específicamente la progresión del ciclo celular y la muerte celular. En este experimento, además de camptotecina y paclitaxel, las células también se trataron con vinblastina (otro inhibidor de microtúbulos) (Sorger et al., 1997, citado anteriormente) y estaurosporina (un inhibidor de la cinasa) (Gescher, Crit Rev Oncol Hematol., 2000, 34(2):127-35). Tal como se encontró anteriormente, las células A549 tratadas con compuesto A 10 nM mostraron una reducción menor de células en la fase G0/G1 con un ligero aumento de células en la fase G2/M, sin aumento detectable de muerte celular a lo largo de los tres días de cultivo (figura 8). De manera coherente con su mecanismo de acción conocido, la camptotecina dio como resultado la acumulación de células en la fase S del ciclo celular y también aumentó el nivel de células muertas detectadas como aquellas con un contenido en ADN de subdiploide. También tal como se esperaba, tanto vinblastina como paclitaxel dieron como resultado que la mayor parte de las células se detuviesen en las fases G2/M del ciclo celular y aumentó la aparición de células muertas con subdiploide. Sin embargo, para todos estos agentes, la presencia de compuesto A 10 nM evitó su detención característica del ciclo celular e inhibió significativamente sus efectos citotóxicos, reduciendo drásticamente la aparición de células muertas con subdiploide. En cambio, el compuesto A tuvo poco efecto sobre los efectos citotóxicos de la estaurosporina, un agente que parece poder destruir células en todas las fases activas del ciclo celular.

Ejemplo 9 Los efectos citostáticos del compuesto A no se correlacionan con un biomarcador para la senescencia replicativa

La tasa de crecimiento drásticamente reducida de las células A549 cultivadas en presencia de compuesto A 10 nM (véase la figura 3) condujo a la consideración de la posibilidad de que este compuesto inducía la senescencia replicativa de estas células tumorales inmortales. De manera coherente con esta posibilidad en estas condiciones, se observaron con frecuencia células A549 con una morfología sumamente sugerente de un fenotipo senescente, que están sumamente aplanadas con un área superficial agrandada en comparación son su aspecto habitual (compárense por ejemplo las figuras 9, subpaneles a y b). Esto se evaluó adicionalmente midiendo la actividad \beta-galactosidasa asociada con la senescencia (SA-\beta-gal), un biomarcador que se ha descrito previamente que se correlaciona bien con la senescencia de células humanas (Dimri et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995 92(20): 9363-7). Recientemente se ha encontrado que algunos agentes anticancerígenos que actúan mediante diversos mecanismos, incluyendo doxorubicina, cisplatino, citarabina, etopósido y paclitaxel, pueden inducir actividad SA-\beta-gal en una variedad de líneas de células tumorales (Chang et al., Cancer Res 1999, 59(15): 3761-7). Por tanto, además del compuesto A, las células A549 también se trataron con doxorubicina como control experimental. Este fármaco actúa estabilizando los complejos de ADN/topoisomerasa II provocando así daño al ADN que da como resultado la posterior detención del ciclo celular en la fase S y/o la muerte celular (Froelich-Ammon y Osheroff, 1995, J. Biol. Chem. 270(37): 21429-21432). La figura 9 muestra que de manera coherente con los informes anteriores, las células A549 tratadas con doxorubicina 250 nM presentaron el fenotipo agrandado aplanado de células senescentes y mostraron actividad SA-\beta-gal. En cambio, el compuesto A a diversas dosis desde 10-50 nM no logró inducir actividad SA-\beta-gal aún cuando las células mostraron la morfología agrandada aplanada. Por tanto, al contrario que una variedad de otros fármacos anticancerígenos, los efectos citostáticos del compuesto A no se correlacionan con este marcador particular de senescencia celular.

Ejemplo 10 El compuesto A inhibe la proliferación celular pero no el aumento del tamaño celular

Se sabe bien que la proliferación celular y el crecimiento celular reflejado como aumento de la masa de células individuales son procesos bioquímicamente separables (Pardee, Science, 1989, 246:603-8). Aunque a ciertas concentraciones el compuesto A puede inhibir la proliferación celular sin citotoxicidad manifiesta, también se evaluó si el compuesto A también afectaba al crecimiento celular. Para estos experimentos, se trataron células A549 con diversas dosis no citotóxicas del compuesto A de hasta 10 nM y se determinó el tamaño celular relativo tras 6 días de cultivo midiendo la dispersión de la luz frontal usando un citómetro de flujo. Los datos representados en la tabla 8 muestran que en presencia de compuesto A las células A549 muestran un aumento de la dispersión frontal media en más del 20%. Esto se produjo sólo a concentraciones que eran citostáticas para ese tipo de células.

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TABLA 8 El compuesto A aumenta el tamaño celular

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Ejemplo 11 El compuesto A inhibe el crecimiento de líneas de células tumorales humanas en un modelo de tumor de xenoinjerto de ratón

Se evaluó la capacidad del compuesto A para inhibir el crecimiento de células tumorales humanas in vivo usando ratones atímicos machos a los que se inyectaron por vía subcutánea en la región del flanco dorsal 2 x 10^{6} células de tumor de próstata humanas PC3. La administración de compuesto A (3 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal comenzó tras ocho días una vez que el tumor de PC3 era palpable y continuó tres veces por semana hasta 29 días tras la inoculación inicial de las células tumorales. En este momento, se sacrificaron todos los ratones y se extirparon y pesaron los tumores. La figura 10A muestra que en comparación con los animales de control tratados con vehículo solo, los ratones tratados con compuesto A mostraron un aumento del volumen tumoral medio muy reducido a lo largo del transcurso del experimento. Esto se confirmó al final del experimento cuando se extirparon y pesaron los tumores, se encontró que el tratamiento con compuesto A redujo el peso tumoral medio en un \sim 60% (figura 10B). El peso corporal no se vio afectado, mostrando los grupos tanto control como tratado una reducción similar del \sim12% del peso corporal medio a lo largo de la duración del experimento. Por tanto, el compuesto A muestra actividad antitumoral
in vivo.

Claims (8)

1. Compuesto de ciclopentabenzofurano que comprende un grupo de fórmula (ii)

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unido, mediante un átomo de oxígeno a un núcleo de ciclopentabenzofurano de fórmula (i)

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15

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y que tiene las siguientes características de espectro de RMN:

\quad

^{1}H RMN (CDCl_{3}) (ppm)

\quad

3,49, s, 3H; 3,56, dd, 11,7, 2 Hz, 1H; 3,61, m, 1H, 3,61, 2H; 3,65, s, 3H; 3,71, s, 3H; 3,87, s, 3H; 3,89, dd, 14,2, 6,7 Hz, 1H; 4,13, t, 11,2 Hz, 1H; 4,23, ta, 11,3 Hz, 1H; 4,28, d, 14,2 Hz, 1H; 4,59, s, 1H; 5,03, d, 6,7 Hz, 1H; 5,28, s, 1H; 6,28, d, 2 Hz, 1H; 6,43, d, 2 Hz, 1H; 6,68, da, 9 Hz, 2H; 6,84, m, 2H; 7,06, m, 2H; 7,06, m, 1H; 7,10, da, 9 Hz, 2H;

\quad

^{13}C RMN (CDCl_{3}) (ppm)

\quad

50,03, 52,06, 55,03, 55,05, 55,1, 55,9, 59, 63,3, 68,3, 70,6, 79,6, 92,8, 93,4, 93,9, 94, 95,2, 101,9, 109,6, 112,7, 126,2, 126,6, 127,8. 127,8, 128,9, 136,7, 157,1, 158,8, 160, 160,6, 170,6;

o una sal, derivado o profármaco del mismo, en el que el profármaco o derivado es un éster, glicósido, alquiloxilo opcionalmente sustituido, alcoxilo cíclico opcionalmente sustituido, alqueniloxilo opcionalmente sustituido, alqueniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, alquiniloxilo opcionalmente sustituido, alquiniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, aciloxilo opcionalmente sustituido de fórmula -O-C(O)-R, en la que R es un grupo alquilo, alquilo cíclico, alquenilo, alquenilo cíclico, alquinilo, alquinilo cíclico, heteroarilo o arilo, o ariloxilo opcionalmente sustituido o heteroariloxilo opcionalmente sustituido;

y los sustituyentes opcionales para dicho alquiloxilo opcionalmente sustituido, alcoxilo cíclico opcionalmente sustituido, alqueniloxilo opcionalmente sustituido, alqueniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, alquiniloxilo opcionalmente sustituido, alquiniloxilo cíclico opcionalmente sustituido y aciloxilo opcionalmente sustituido se seleccionan de uno o más de halo, hidroxilo, alquilo C_{1-6}, alcoxilo C_{1-6}, nitro, amino, alquilamino C_{1-6}, dialquilamino C_{1-6}, halometilo, halometoxilo, acetilo, arilo, heteroarilo o un grupo alquilo cíclico y los sustituyentes opcionales para dicho ariloxilo opcionalmente sustituido y heteroariloxilo opcionalmente sustituido se seleccionan de uno o más de halo, hidroxilo, alquilo C_{1-6}, alcoxilo C_{1-6}, nitro, amino, alquilamino C_{1-6}, dialquilamino C_{1-6}, halometilo, halometoxilo o acetilo.

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2. Compuesto de ciclopentabenzofurano que comprende un grupo de fórmula (ii)

16

unido, mediante un átomo de oxígeno a un núcleo de ciclopentabenzofurano de fórmula (i)

17

y que tiene las siguientes características de espectro de RMN:

\quad

^{1}H RMN (CDCl_{3}) (ppm)

\quad

3,5, s, 3H; 3,61, dd, 10,4, 4,4 Hz, 1H; 3,66, m, 1H; 3,66, s, 3H; 3,72, m; 3,72, s, 3H; 3,78, dd, 11,7, 2,4 Hz, 1H; 3,86, s, 3H; 3,9, dd, 14, 6,8 Hz, 1H; 4,02, t, 11,2 Hz, 1H; 4,12, ddd, 11, 6,8, 2-8 Hz, 1H; 4,28, d, 14 Hz, 1H; 4,60, s, 1H; 5,04, d, 6,8 Hz, 1H; 5,26, s, 1H; 6,29, d, 2 Hz, 1H; 6,45, d, 2 Hz, 1H; 6,69, da, 9 Hz, 2H; 6,86, m, 2H; 7,06, m, 2H; 7,06, m, 1H; 7,10, da, 9 Hz, 2H;

\quad

^{13}C RMN (CDCl_{3}) (ppm)

\quad

50, 52, 55, 55, 55, 55,8, 59,6, 62,5, 67,6, 71,4, 79,6, 92,8, 93,4, 94,3, 95,2, 101,8, 109,4, 112,8, 126,2, 126,6, 127,5, 127,5, 128,9, 136,6, 157,1, 158,8, 159,8, 160,2, 170,7;

o una sal, derivado o profármaco del mismo, en el que el profármaco o derivado es un éster, glicósido, alquiloxilo opcionalmente sustituido, alcoxilo cíclico opcionalmente sustituido, alqueniloxilo opcionalmente sustituido, alqueniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, alquiniloxilo opcionalmente sustituido, alquiniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, aciloxilo opcionalmente sustituido de fórmula -O-C(O)-R, en la que R es un alquilo, alquilo cíclico, alquenilo, alquenilo cíclico, alquinilo, alquinilo cíclico, heteroarilo o arilo grupo, o ariloxilo opcionalmente sustituido o heteroariloxilo opcionalmente sustituido;

y los sustituyentes opcionales para dicho alquiloxilo opcionalmente sustituido, alcoxilo cíclico opcionalmente sustituido, alqueniloxilo opcionalmente sustituido, alqueniloxilo cíclico opcionalmente sustituido, alquiniloxilo opcionalmente sustituido, alquiniloxilo cíclico opcionalmente sustituido y aciloxilo opcionalmente sustituido se seleccionan de uno o más de halo, hidroxilo, alquilo C_{1-6}, alcoxilo C_{1-6}, nitro, amino, alquilamino C_{1-6}, dialquilamino C_{1-6}, halometilo, halometoxilo, acetilo, arilo, heteroarilo o un grupo alquilo cíclico y los sustituyentes opcionales para dicho ariloxilo opcionalmente sustituido y heteroariloxilo opcionalmente sustituido se seleccionan de uno o más de halo, hidroxilo, alquilo C_{1-6}, alcoxilo C_{1-6}, nitro, amino, alquilamino C_{1-6}, dialquilamino C_{1-6}, halometilo, halometoxilo o acetilo.

3. Composición que comprende un compuesto según la reivindicación 1 o 2, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

4. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 o 2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer o una condición cancerosa.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que el cáncer o condición cancerosa se selecciona de leucemia, melanomas, tumores y cánceres de mama, colon, útero, próstata, cerebro, pulmón, ovarios, piel, hígado e intestino y estómago.

6. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 o 2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición o estado patológico asociado con la hiperproliferación celular.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que la condición o estado patológico es aterosclerosis, restinosis, artritis reumatoide, artrosis, artritis inflamatoria, psoriasis, enfermedad peridontal o hiperproliferación celular inducida por virus.

8. Compuesto que puede obtenerse mediante:

(a) tratar una muestra de corteza molida de la especie de árbol Aglaia leptantha con metanol;

(b) filtrar el extracto resultante y concentrar la solución resultante a vacío;

(c) fraccionar el extracto resultante mediante extracción en fase sólida sobre una columna de extracción C-18 Varian (10 g) usando ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo/agua con concentraciones crecientes de acetonitrilo,

(d) recoger el eluato obtenido con una razón de acetonitrilo/agua de 7:20;

(e) concentrar la fracción de (d);

(f) someter a cromatografía el concentrado obtenido en la etapa (e) en una columna preparativa C-18 a una velocidad de flujo de 20 ml/min usando un gradiente lineal desde el 25% hasta el 45% de acetonitrilo en agua en 30 minutos con ácido fórmico al 0,1%;

(g) recoger y concentrar los eluatos con máximo de absorción UV a 200 y 273 nm y tiempos de retención en HPLC de aproximadamente 30,67 y 31,05 minutos;

(h) someter a cromatografía cada eluato obtenido en (g) en una columna Sephadex LH20 usando metanol como disolvente; recoger y concentrar las fracciones con características espectrales expuestas en la etapa (g).