DE60130659T2

DE60130659T2 - Therapeutische verbindungen und verfahren

Info

Publication number: DE60130659T2
Application number: DE60130659T
Authority: DE
Inventors: Barbara Martha Gisborne MEURER-GRIMES; Jin Balwyn YU; Gino Luigi Northcote VAIRO
Original assignee: Government of State of Sarawak Malaysia Kuching; Sarawak Government of State of Malaysia
Current assignee: Government of State of Sarawak Malaysia Kuching; Sarawak Government of State of Malaysia
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2021-07-06
Also published as: EP1303520A4; WO2002002566A1; PT1303520E; CA2411818C; DE60130659D1; JP2004501983A; AUPQ866500A0; EP1303520B1; US20030181514A1; ES2295176T3; ATE374203T1; US6710075B2; EP1303520A1; CA2411818A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verbindungen mit einem Cyclopentabenzofurankern. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Cyclopentabenzofuranverbindungen, in welchen der Cyclopentabenzofurankern mit einem Dioxanyloxy-Rest substituiert ist. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Verbindungen in der Therapie sowie Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen umfassen.
HINTERGRUND
Aglaia ist eine große Gattung der Familie Meliaceae umfassend über 100 (meist holzige) Arten in Indo-Malaysia und der West-Pazifikregion. Verwendungen umfassen die Behandlung von Fieber, von Brüchen, der Niederkunft und von Entzündung. Extrakte werden auch als Bakterizide, Insektizide, in der Parfümerie, als Adstringens, als Tonikum, als Kühlmittel (Dr Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Databases) und zur Behandlung von Bauchgeschwulsten (Pannel, et al, 1992, Kew Bull., (16) 273–283) verwendet.
Kürzlich wurden mehrere 1-H-Cyclopenta[b]benzofuran-Lignane aus Aglaia-Arten isoliert (siehe beispielsweise WO 97/08161 ; JP 97171356 ; Ohse, et al, J Nat Prod, 1996, 59(7): 650–52; Lee et al, Chem. Biol. Interact., 1998, 115(3): 215–28; Wu et al, J. Nat. Prod., 1997, 60(6): 606–08; Bohnenstengel et al, Z. Naturforsch., 1999, 54c (12): 55–60 und Bohnenstengel et al, Z. Naturforsch, 1999, 54c (12): 1075–83, Xu, Y. J., et al, 2000, J. Nat. Prod, 63, 473–76). Mehrere dieser Verbindungen wurden auch hinsichtlich ihrer insektiziden Aktivität erwähnt (Janprasert, et al, 1993, Phytochemistry, 32 (1), 67–69; Ishibashi et al, 1993, Phytochemistry, 32 (2), 307–310; Hiort, et al, 1999, J. Nat. Prod., 62(12), 1632–1635). Insektizide Verbindungen mit einer eng verwandten Kernstruktur wurden aus Aglaia roxburghiana isoliert und in WO 9604284 zur Verwendung als aktive Inhaltsstoffe in agrochemischen Formulierungen beschrieben.
Es wurden nun neue Verbindungen (Verbindungen A und B wie hierin beschrieben) aus Aglaia leptantha, Miq. (Meliaceae) isoliert, welche in einzigartiger Weise eine Dioxanyloxy-Gruppe aufweisen, welche am Cyclopenta[b]benzofurankern angebracht ist. Es wurde gezeigt, dass die Verbindungen A und B starke zytotoxische und zytostatische Effekte auf das Krebszellwachstum und die Lebensfähigkeit von Krebszellen aufweisen und dass die Verbindungen der Erfindung deshalb als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Krebs und kanzerösen Zuständen oder anderen Erkrankungen, welche mit zellulärer Hyperproliferation assoziiert sind, nützlich sein können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Durch die Beschreibung und die folgenden Ansprüche wird das Wort „umfassend" und Abwandlungen davon wie beispielsweise „umfasst" und „umfassend" soweit es der Zusammenhang nicht anders erfordert so verstanden, dass die Einbeziehung einer spezifizierten ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe ganzer Zahlen oder Schritte impliziert ist, aber nicht der Ausschluss einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Cyclopentabenzofuranverbindung oder ein Salz, Derivat oder Prodrug davon, wie in Anspruch 1 beansprucht.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine Cyclopentabenzofuranverbindung oder ein Salz, ein Derivat oder ein Prodrug davon, wie in Anspruch 1 beansprucht, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsmittel oder Verdünnungsmittel.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Cyclopentabenzofuranverbindung oder eines Salzes, eines Derivats oder Prodrugs davon, wie in Anspruch 1 beansprucht, bei der Herstellung zur Behandlung von Krebs oder kanzerösen Zuständen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Verbindung A fördert die Differenzierung von THP-1 leukämischen Zellen.
THP-1-Zellen wurden für 4 Tage in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 10 nM Verbindung A wie angegeben kultiviert. Wo angezeigt, wurden die Zellen auch behandelt mit IFNy (100 ng/ml) (3 Tage) oder mit PMA (0,1 μM) (4 Tage) in Anwesenheit oder in Abwesenheit von Verbindung A. Abbildungen der Zellen wurden durch Phasenkontrastmikroskopie (Vergrößerung ×200) visualisiert.
2: Effekte von Verbindung A auf die Progression des Zellzyklus und die Lebensfähigkeit von THP-1-Zellen.
THP-1-Zellen wurden für 2 Tage mit der angegebenen Konzentration für Verbindung A oder 1000 nM Paclitaxel kultiviert, anschließend gewonnen und in 70% Ethanol vor Färbung mit Propidiumiodid fixiert, und es wurde der DNA-Gehalt durch Flusszytometrie bestimmt. Die Zahlen geben die % der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen relativ zu allen Zellen mit ≥ 2N DNA-Gehalt an und auch die % toten Zellen (d. h. subdiploid ≤ 2N Zellen) links des Markers (der vertikalen Linie), welche während des Kultivierungszeitraums auftraten.
3: Effekte von Verbindung A auf die Proliferation von A549-Zellen.
A549-Zellen wurden mit ~10000 Zellen/Well ausgesät und in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von Verbindung A oder Paclitaxel kultiviert. Die Zellen wurden gewonnen und die Zahl lebensfähiger Zellen wurde bestimmt durch Zählen der Trypanblau-gefärbten Zellen zu verschiedenen Zeiten mittels eines Hämozytometers. Die Ergebnisse sind die Durchschnittswerte ± SEM von jeweils drei Kulturen.
4: Effekte von Verbindung A auf die Progression des Zellzyklus und die Lebensfähigkeit von A549-Zellen.
A549-Zellen wurden für 6 Tage mit der angegebenen Konzentration für Verbindung A oder 1 μM Paclitaxel kultiviert, anschließend gewonnen und vor Färbung mit Propidiumiodid in 70% Ethanol fixiert und es wurde der DNA-Gehalt durch Flusszytometrie bestimmt. Die Zahlen geben die % der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen relativ zu allen Zellen mit ≥ 2N DNA-Gehalt an und auch die % toten Zellen (d. h. subdiploid ≤ 2N Zellen) links des Markers, welche während des Kultivierungszeitraums auftraten.
5: Die Verbindungen A und B induzieren G2/M-Phasenakkumulation von K562-leukämischen Zellen
K562-Zellen wurden für 3 Tage mit der angegebenen Konzentration für die Verbindungen A oder B kultiviert, anschließend gewonnen und vor dem Färben mit Propidiumiodid in 70% Ethanol fixiert und es wurde der DNA-Gehalt durch Flusszytometrie bestimmt. Die Zahlen geben die % der Zellen in den G0/G1-, S- und G2/M-Phasen des Zellzyklus an, jeweils relativ zu allen Zellen mit ≥ 2N DNA-Gehalt.
6: Zytostatische Effekte von Verbindung A auf A549-Zellen sind reversibel
A549-Zellen wurden ausgesät mit ~10000 Zellen/Well und kultiviert in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von Verbindung A oder Paclitaxel und die Zahl der lebensfähigen Zellen wurde bestimmt durch Zählen von Trypanblau-gefärbten Zellen zu verschiedenen Zeiten mittels eines Hämozytometers. An Tag 5 wurden einige der Zellen gewaschen, in frischem Medium, welches nicht den verschiedenen Behandlungen unterzogen wurden, resuspendiert und für weitere 4 Tage vor dem Zählen kultiviert.
7: Verbindung A hemmt Camptothecin- und Paclitaxel-induzierte Zytotoxizität von A549-Zellen
A549-Zellen wurden in 96 Well-Platten für 3 Tage in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 nM Verbindung A zusammen mit den angegebenen Konzentrationen an (A) Camptothecin oder (B) Paclitaxel kultiviert. Der Verlust der Membranintegrität wurde anschließend durch die Zugabe des fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffs YOYO-1 bewertet und die erhöhte Fluoreszenz, welche mit dem Zelltod einhergeht, wurde unter Verwendung einer Fluoreszenzplattenlesevorrichtung gemessen.
8: Verbindung A hemmt Zellzyklusarrest und Zelltod induziert durch Anti-Krebsmittel, aber nicht durch Staurosporin.
A549-Zellen wurden in 6 Well-Platten für 3 Tage in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 nM Verbindung A zusammen mit 0,1 μM Camptothecin, 10 μM Vinblastin, 1 μM Paclitaxel oder 1 μM Staurosporin wie angegeben kultiviert. Die Zellen wurden anschließend gewonnen und vor dem Färben mit Propidiumiodid in 70% Ethanol fixiert und es wurde DNA-Gehalt durch Flusszytometrie bestimmt. Die Zahlen geben die % der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen relativ zu allen Zellen mit ≥ 2N DNA-Gehalt an und auch die % toten Zellen (d. h. subdiploid ≤ 2N-Zellen) links des gepunkteten Markers, welche während des Kultivierungszeitraums auftraten.
9: Verbindung A induziert nicht Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase-Aktivität in A549-Zellen.
A549-Zellen wurden mit 10000 Zellen/Well in 6 Well-Platten in Anwesenheit oder Abwesenheit von variierenden Konzentrationen an Verbindung A (10–50 nM) oder 250 nM Doxorubicin für 10 Tage vor ihrer Verarbeitung ausgesät und hinsichtlich Seneszenz-assoziierter β-Galaktosidase-Aktivität wie kürzlich beschrieben über Nacht gefärbt (Dimri et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 1995 92(20): 9363–7). Für Verbindung A ist nur die 10 nM Behandlung gezeigt, aber es lag bei allen anderen untersuchten Konzentrationen keine detektierbare SA-β-gal-Aktivität vor. PC, Phasenkontrastmikroskopie, BF, Hellfeldbeleuchtungsmikroskopie, Vergrößerung ×200.
10: Verbindung A inhibiert das Wachstum von humanen Tumorzellen in einem Mausxenotransplantatmodell.
Athymische Balb/c nackte Mäuse (Rygard und Povisen, 1969, Acta Pathol Microbiol Scand, 77: 758) wurden subkutan in der dorsalen Flanke mit 2 × 10⁶ PC3-Zellen inokuliert. Verbindung A (3 mg/kg) wurde nach acht Tagen, wenn die Tumore palpabel wurden durch intraperitoneale Injektion dreimal wöchentlich verabreicht. Verbindung A wurde zuerst in Ethanol solubilisiert, anschließend mit Cremaphor 1:1 gemischt und in Salzlösung zur Injektion verdünnt. Kontrolltiere wurden auf analoge Art und Weise mit dem gleichen Vehikel, welches aber keine Verbindung A enthielt, behandelt. (A) Effekt von Verbindung A auf das mittlere Tumorvolumen. Die Tumorvolumen wurden zu den angegebenen Zeiten unter Verwendung eines Mikrometermesstasters gemessen. Die Daten repräsentieren das mittlere Tumorvolumen ± SEM. (B) Effekt von Verbindung A auf die mittlere Tumormasse. Am Ende des Experiments (29 Tage nach Inokulation von PC3-Zellen) wurden die Mäuse geopfert, die Tumore operativ entfernt und anschließend gewogen. Die Daten stellen das mittlere Tumorgewicht ± SEM dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Mehrere Cyclopenta[b]benzofurane wurden kürzlich beschrieben, Greger et al, 2001, Phytochemistry, 57, (1); 57–64. Die Verbindungen A und B der vorliegenden Verbindung tragen eine Dioxanylgruppe (ii) angebracht an einem Cyclopental[b]benzofurankern (i).
Die Dioxanylgruppe der Formel (ii) ist zuvor nicht aus einer natürlichen Quelle beschrieben worden. Ohne dass es beabsichtigt ist, die Erfindung durch die Theorie zu beschränken, wird angenommen, dass das Vorliegen einer sterisch sperrigen Gruppe, d. h. räumlich größer als eine Methoxygruppe, den Verbindungen mit einem Cyclopenta[b]benzofurankern sowohl zytotoxische als auch zytostatische Eigenschaften verleihen kann.
Der Ausdruck „Salz, oder Prodrug" bezeichnet ein beliebiges pharmazeutisch annehmbares Salz, einen Ester, ein Glycosid, ein Solvat, ein Hydrat oder eine beliebige andere Verbindung, welche nach Verabreichung an das Empfängersubjekt eine Verbindung der vorliegenden Erfindung wie hierin beschrieben bereitstellen kann (direkt oder indirekt).
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen Salze von pharmazeutisch annehmbaren anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Kohlensäure, Borsäure, Sulfaminsäure, Bromwasserstoffsäure oder Salze von pharmazeutisch annehmbaren organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Weinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Milchsäure, Schleimsäure, Gluconsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Oxasäure, Phenylessigsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Salicylsäure, Sulphanilsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Ethylendiamintetraessigsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Pantothensäure, Gerbsäure, Ascorbinsäure und Valeriansäure. Basische Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diejenigen, welche gebildet werden mit pharmazeutisch annehmbaren Kationen, wie beispielsweise Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Ammonium oder Alkylammonium.
Die Herstellung von Salzen kann durch Verfahren, welche im Fachbereich bekannt sind durchgeführt werden. Es wird anerkannt, dass nicht pharmazeutisch annehmbare Salze auch in den Bereich der Erfindung fallen, da sie als Zwischenstufen bei der Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Salzen nützlich sein können.
Die Verbindungen der Erfindung können in kristalliner Form oder als Solvat vorliegen (z. B. Hydrate). Lösungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Prodrugs der Verbindungen A oder B fallen ebenfalls in den Bereich der Erfindung. Der Ausdruck „Prodrug" umfasst Derivate, welche in vivo in die Verbindungen der Erfindung umgewandelt werden und umfasst beispielsweise Ester-, Acetat- und Glycosidderivate von freien Hydroxygruppen.
Die Derivatisierung von Hydroxygruppen der Verbindungen A und B kann durch im Fachbereich bekannte Verfahren zur Alkylierung, Arylierung oder Acetylierung von Hydroxygruppen durchgeführt werden, wie beispielsweise beschrieben in Protective Groups in Organic Synthesis T. W. Greene und P. G. M. Wutz (1999) Wiley Interscience, New York, und Advanced Organic Chemistry, J. March (4. Ausgabe), Wiley-InterScience. Beispielsweise können Hydroxygruppen unter Verwendung von Alkylhalogeniden alkyliert werden, wie beispielsweise Methyliodid oder Dialkylsulfaten, wie beispielsweise Dimethyl- und Dieethylsulfat. Eine Acetylierung kann bewirkt werden durch Behandlung mit geeigneten Carbonsäuren, Säurehalogeniden und Säureanhydriden in Anwesenheit einer Base oder eines Kupplungsmittels. Eine Benzylierung kann bewirkt werden durch Behandlung mit einer Benzylhalogenidverbindung, wie beispielsweise Benzylbromid, -chlorid oder -iodid. Eine Entesterung des Methylesters kann durch Behandlung des Esters mit einer wässrigen Base bewirkt werden. Eine Veresterung einer Carbonsäure kann erreicht werden durch übliche Mittel, umfassend Behandlung mit einem geeigneten Alkohol in der Gegenwart von Säure oder Behandlung mit Alkylsulfaten oder Alkylhalogenen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Alkyl", wenn er allein verwendet wird oder wenn er in zusammengesetzten Wörtern wie beispielsweise „Arylalkyl" verwendet wird, auf eine geradkettige oder verzweigte Gruppe, vorzugsweise C_1-20, wie beispielsweise C_1-10. Der Begriff „C₁-C₆-Alkyl" bezieht sich auf eine geradkettige oder verzweigte Gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für „C_1-6-Alkyl" umfassen Methyl, Ethyl, iso-Propyl, n-Propyl, n-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, 2,2-Dimethylpropyl, n-Hexyl, 2-Methylpentyl, 2,2-Dimethylbutyl, 3-Methylpentyl und 2,3-Dimethylbutyl. Zyklische Alkylgruppen können bis zu 20 Kohlenstoffatome aufweisen, z. B. bis zu 10 Kohlenstoffatome. Beispiele für zyklisches C_1-6-Alkyl umfassen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Andere Beispiele für Alkyl umfassen: Heptyl, 5-Methylhexyl, 1-Methylhexyl, 2,2-Dimethylpentyl, 3,3-Dimethylpentyl, 4,4- Dimethylpentyl, 1,2-Dimethylpentyl, 1,3-Dimethylpentyl, 1,4-Dimethylpentyl, 1,2,3-Trimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylbutyl, 1,1,3-Trimethylbutyl, Octyl, 6-Methylheptyl, 1-Methylheptyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl, Nonyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Methyloctyl, 1-, 2-, 3-, 4- oder 5-Ethylheptyl, 1-, 2- oder 3-Propylhexyl, Decyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- und 8-Methylnonyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Ethyloctyl, 1-, 2-, 3- oder 4-Propylheptyl, Undecyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 9-Methyldecyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Ethylnonyl, 1-, 2-, 3-, 4- oder 5-Propyloctyl, 1-, 2- oder 3-Butylheptyl, 1-Pentylhexyl, Dodecyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- oder 10-Methylundecyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Ethyldecyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Propylnonyl, 1-, 2-, 3- oder 4-Butyloctyl, 1-2-Pentylheptyl und dergleichen. Alkenyl- oder Alkynyl-Gruppen können geradkettig, verzweigt oder zyklisch sein (mit wenigstens 2 Kohlenstoffatomen) und einen, zwei oder mehr Grade an Unsättigung enthalten, vorzugsweise ein C_2-20-Alkenyl, stärker bevorzugt ein C_2-6-Alkenyl, oder ein C_2-20-Alkynyl, stärker bevorzugt ein C_2-6-Alkynyl.
Der Begriff „Aryl", wenn er allein verwendet wird oder in zusammengesetzten Wörtern, wie beispielsweise „Arylalkyl", bezeichnet einzelne, polynukleäre, konjugierte oder fusionierte Reste von aromatischen Kohlenwasserstoffen. Heteroaryl bezeichnet einzelne, polynukleäre, konjugierte oder fusionierte Reste von aromatischen heterozyklischen Ringsystemen, worin eines oder mehrere Kohlenstoffatome eines zyklischen Wasserstoffrests substituiert ist/sind mit einem Heteroatom, um einen aromatischen Rest bereitzustellen. Wenn zwei oder mehr Kohlenstoffatome ersetzt sind, kann dies durch zwei oder mehrere des gleichen Heteroatoms oder durch verschiedene Heteroatome sein. Geeignete Heteroatome umfassen O, N, S und Se.
Beispiele für "Aryl" oder "Heteroaryl" umfassen Phenyl, Biphenyl, Terphenyl, Quaterphenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, Anthracenyl, Dihydroanthracenyl, Benzanthracenyl, Dibenzanthracenyl, Phenanthrenyl, Fluorenyl, Pyrenyl, Idenyl, Azulenyl, Chrysenyl, Pyridyl, 4-Phenylpyridyl, 3-Phenylpyridyl, Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Indolyl, Pyridazinyl, Pyrazolyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Pyrimidinyl, Quinolinyl, Isoquinolinyl, Benzofuranyl, Benzothienyl, Purinyl, Quinazolinyl, Phenazinyl, Acridinyl, Benzoxazolyl, Benzothiazolyl und dergleichen. Bevorzugte Arylgruppen umfassen Phenyl und Naphthyl. Bevorzugte Heteroarylgruppen umfassen Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyrrolyl. Eine Aryl- oder Heteroarylgruppe kann ggf. substituiert sein mit einem oder mehreren optionalen Substituenten wie hierin definiert.
Der Begriff „Acyl" bezieht sich auf eine Gruppe -C(O)-R, wobei R ein Alkyl, Alkenyl, zyklisches Alkyl, Alkynyl, zyklisches Alkenyl, zyklisches Alkynyl, Heteroaryl oder eine Arylgruppe ist. Beispiele für Acyl umfassen geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl wie beispielsweise Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, 2-Methylpropanoyl, Pentanoyl, 2,2-Dimethylpropanoyl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Nonanoyl, Decanoyl, Undecanoyl, Dodecanoyl, Tridecanoyl, Tetradecanoyl, Pentadecanoyl, Hexadecanoyl, Heptadecanoyl, Octadecanoyl, Nonadecanoyl und Icosanoyl; Cycloalkylcarbonyl, wie beispielsweise Cyclopropylcarbonyl, Cyclobutylcarbonyl, Cyclopentylcarbonyl und Cyclohexylcarbonyl; Aroyl wie beispielsweise Benzoyl, Toluoyl und Naphthoyl; Aralkanoyl wie beispielsweise Phenylalkanoyl (z. B. Phenylacetyl, Phenypropanoyl, Phenylbutanoyl, Phenylisobutyloyl, Phenylpentanoyl und Phenylhexanoyl) und Naphthylalkanoyl (z. B. Naphthylacetyl, Naphthylpropanoyl und Naphthylbutanoyl]. Da die R-Gruppe wie vorausstehend beschrieben optional substituiert sein kann, wird „Acyl" herangezogen, um Bezug auf optional substituiertes Acyl zu nehmen.
Optionale Substituenten für Alkyl, Alkenyl, zyklisches Alkyl, Alkynyl, zyklisches Alkenyl, zyklisches Alkynyl, Heteroaryl, Aryl oder Acyl umfassen Halogen (Brom, Fluor, Chlor, Iod), Hydroxy, C_1-6-Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl (n- und i-Isomere)), C_1-6-Alkoxy (z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy (n- und i-Isomere), Butoxy (n-, sec- und t-Isomere), Nitro, Amino, C_1-6-Alkylamino (z. B. Methylamino, Ethylamino, Propyl (n- und i-Isomere)amino), C_1-6-Dialkylamino (z. B. Dimethylamino, Diethylamino, Diisopropylamino), Halogenmethyl (z. B. Trifluormethyl, Tribrommethyl, Trichlormethyl), Halogenmethoxy (z. B. Trifluormethoxy, Tribrommethoxy, Trichlormethoxy) und Acetyl.
Eine Alkyl-, Alkenyl-, zyklische Alkyl-, Alkynyl-, zyklische Alkenyl- oder zyklische Alkynylgruppe kann ebenfalls substituiert sein (vorzugsweise terminal) durch eine Aryl- oder eine zyklische Alkylgruppe. Eine Acylgruppe kann substituiert sein (beispielsweise terminal substituiert sein) mit Aryl, Heteroaryl oder einer zyklischen Alkylgruppe.
Glycosidbildung kann chemisch bewirkt werden, z. B. durch Umsetzen der Ausgangsverbindung mit einer geschützten Zuckerverbindung, in welcher C-1 aktiviert worden ist durch Halogenierung zur Kupplung mit den Hydroxyl- oder Carboxylgruppen und die Zuckerhydroxyle durch Schutzgruppen blockiert worden sind. Alternativ kann Glycosidbildung enzymatisch bewirkt werden unter Verwendung einer geeigneten Glycosyltransferase wie beispielsweise UDP-Galactose-abhängige Galactocyltransferase und UDP-Glucose-abhängige Glycocyltransferase (SIGMA).
Bevorzugte C-1-verknüpfte Saccharide sind ein Furanose- oder Pyranose-Saccharid (Zucker)-Substituent, welcher an die Rückgratstruktur geknüpft ist, die in Formel (I) gezeigt ist durch den 1-Kohlenstoff des Saccharids (übliche chemische Nummerierung) zur Bildung einer Acetalverknüpfung an einer beliebigen Position der Positionen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ oder R₇ oder einer Esterverknüpfung an Position R₈ oder ein Amid an Positionen R₉ oder R₁₀. Beispielhafte Saccharidgruppen umfassen reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, Ribose, Arabinose, Xylose, Mannose und Galactosen, wobei jede mit einem Sauerstoffatom der Struktur der Formel (I) durch den C-1-Kohlenstoff der Saccharidgruppe verknüpft ist.
Der Fachmann erkennt, dass ein vernünftiger Schutz und/oder Entschützung von einer oder mehreren der Oxy- und/oder Carboxygruppen des Cyclopentabenzofurankerns notwendig sein kann, um eine oder mehrere der Derivatgruppen wie hierin definiert einzubauen. Eine selektive Derivatisierung einer oder mehrerer Hydroxy- oder Carboxygruppen kann erreicht werden mittels üblicher Techniken durch Verwendung von Schutzgruppen mit einem unterschiedlichen Grad an Stabilität unter den jeweiligen Bedingungen.
Verfahren zur Umwandlung einer Carbonsäure- oder Estergruppe in ein Amid sind dem Fachmann bekannt und umfassen die Behandlung einer Carbonsäure mit einem geeigneten Amin in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes, wie beispielsweise DCC, oder die Behandlung eines Säurehalogenids mit einem geeigneten Amin. Andere Verfahren, welche geeignet sein können, werden beschrieben in Larock, R. E. Comprehensive Organic Transformations S. 963–995, VCH Publishers (1989).
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Schutzgruppe" auf eine eingeführte Funktionalität, welche eine bestimmte funktionelle Gruppe, z. B. eine Hydroxy- oder Carbonsäuregruppe, unter bestimmten Bedingungen, unter denen die Gruppe sonst reaktiv wäre, zeitweise inaktiv gestalten kann. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt, wie beispielsweise beschrieben in Protective Groups in Organic Synthesis (vorausstehend). Geeignete Schutzgruppen für Hydroxy umfassen Alkyl (wie beispielsweise C₁-C₆-Alkyl), Acyl (wie beispielsweise C(O)C₁-C₅-Alkyl, Benzoyl und dergleichen), Benzyl-, und Silylgruppen (wie beispielsweise Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl und dergleichen). Andere geeignete Gruppen für Hydroxysubstituenten und einen Carboxysubstituenten (Säure, Amid etc) können Greene, vorausstehend, entnommen werden. Die Stabilität verschiedener Gruppen unter verschiedenen Bedingungen ist für den Fachmann selbstverständlich und wird ferner in Protective Groups in Organic Synthesis (vorausstehend) beispielhaft dargestellt.
Es ist selbstverständlich, dass die Dioxanylgruppe der Formel (II) asymmetrische Zentren aufweisen kann und deshalb in mehr als einer stereoisomeren Form existieren kann. Die Erfindung betrifft deshalb sowohl auch Verbindungen in im Wesentlichen reiner isomerer Form an einem oder mehreren asymmetrischen (chiralen) Zentren der Dioxanylgruppe, z. B. mehr als 90% ee, wie beispielsweise etwa 95% oder 97% ee, vorzugsweise mehr als 99% ee, als auch Gemische umfassend racemische Gemische davon. Derartige Isomere können durch übliche Verfahren, z. B. Chromatographie, oder durch Verwendung eines auflösenden Mittels aufgelöst werden.
Es ist auch selbstverständlich, dass Cyclopentabenzofuranverbindungen, welche einen Methoxy- oder Hydroxysubstituenten aufweisen, wie beispielsweise diejenigen, welche hierin in den Referenzen zitiert sind, z. B. Referenzverbindungen 1–3 (wie in Beispiel 3 beschrieben), demethyliert werden können wo geeignet, und dass die sich ergebende Hydroxygruppe mit einem geeigneten V-Precursor zur Bildung einer OY-Gruppe umgesetzt werden kann. Verfahren hierzu sind im Fachbereich bekannt, beispielsweise kann ein Verfahren das Umsetzen der OH-Gruppe mit einer V-Halogenverbindung umfassen, wobei Halogen Cl, Br und I umfasst.
Die Verbindungen der Erfindung können Anwendung finden bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von kanzerösen Zuständen und anderen Zuständen, welche mit zellulärerer Hyperproliferation assoziiert sind, in einem Subjekt. Subjekte, welche mit den Verbindungen der Erfindung behandelt werden können, umfassen Säuger, wie beispielsweise Menschen, Primaten, Tiere aus Viehbeständen (z. B. Schafe, Kühe, Pferde, Ziegen, Schweine), Haustiere (z. B. Hunde, Katzen, Kaninchen, Meerschweinchen), Versuchstiere (z. B. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen, Hunde, Kaninchen, Primaten) oder eingefangene Wildtiere. Am stärksten bevorzugt sind Menschen die zu behandelnden Subjekte.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Behandlung" das Vorbeugen, das Verlangsamen, das Unterbrechen oder das Anhalten des Wachstums von Krebs, eines Tumors oder einer hyperproliferativen Zelle umfassen oder eine Verringerung hinsichtlich der Zahl der Zielzellen (oder der Größe der Wachstumsmasse) oder die totale Zerstörung der Zelle, wobei die Zellen Krebszellen, Tumorzellen oder hyperproliferative Zellen sind.
Kanzeröse Zustände, welche mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen Zustände, in welchen der Krebs oder die Tumore einfach (monoklonal, d. h. bestehend aus einem einzigen neoplastischen Zelltyp), gemischt (polyklonal, d. h. zusammengesetzt aus mehr als einem neoplastischen Zelltyp) oder vermischt (d. h. bestehend aus mehr als einem neoplastischen Zelltyp und abgeleitet aus mehr als einem Keimblatt) sein können und können gutartige und bösartige Neoplasie/Hyperplasie umfassen. Einige Beispiele für kanzeröse Zustände, welche durch die vorliegende Erfindung behandelt werden können, umfassen Leukämie und Brust-, Dickdarm-, Uterus-, Prostata-, Lungen-, Eierstock-, Gehirn-, Haut-, Leber-, Darm- und Magenkrebs, -Tumore und -Melanome. Beispiele für gutartige Hyperplasie umfassen Hyperplasie von vaskulärem Gewebe (z. B. Hämangiom), Prostatagewebe, Nierengewebe, Nebennierengewebe, Lebergewebe, Dickdarmgewebe (z. B. Kolonkrypt), Gewebe der Nebenschilddrüse und andere Gewebe.
Da die Verbindungen der Erfindung sowohl zytostatische als auch zytotoxische Eigenschaften aufweisen können, können sie auch eine mögliche Verwendung als therapeutische Mittel bei der Suppression des Wachstums von Zielzellpopulationen, welche anders als Krebs oder Tumorzellen sind, aufweisen, wie beispielsweise Erkrankungsstadien oder -zustände, welche assoziiert sind mit zellulärer Hyperproliferation. Solche Zustände können umfassen Atherosklerose und Restinose (neointimale Hyperplasie) und Hyperproliferation aufgrund von oder in Begleitung einer Entzündungsreaktion, z. B. Arthritis (umfassend rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis und entzündliche Arthritis), Psoriasis und eine Erkrankung des Zahnfleisches oder zelluläre Hyperproliferation aufgrund der viralen Infektion von Zellen wie beispielsweise dem menschlichen Papilloma-Virus.
Die Verbindungen der Erfindung können kombiniert werden mit anderen therapeutischen Verbindungen, wie beispielsweise Anti-Krebsverbindungen, umfassend Paclitaxel, Camptothecin, Vinblastin und Doxorubicin.
Deshalb betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder kanzerösen Zuständen zur Verwendung in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln.
Die Verbindungen der Erfindung und das weitere therapeutische Mittel können gleichzeitig verabreicht werden, als eine einzige Zusammensetzung oder als getrennte Zusammensetzungen oder können getrennt verabreicht werden, d. h. eine nach der anderen in geeigneten Zeitabständen, wie es durch den zuständigen Arzt bestimmt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „effektive Menge" einer Verbindung auf eine Menge einer Verbindung, welche, wenn sie gemäß einem gewünschten Dosierungsplan verabreicht wird, die gewünschte therapeutische Wirksamkeit bereitstellt. Eine Dosierung kann stattfinden in Intervallen von Minuten, Stunden, Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren oder kann über einen beliebigen dieser Zeiträume kontinuierlich erfolgen. Geeignete Dosierungen liegen innerhalb des Bereichs von etwa 0,1 ng pro kg Körpergewicht bis 1 g pro kg Körpergewicht pro Dosierung. Die Dosierung liegt vorzugsweise im Bereich von 1 μg bis 1 g pro kg Körpergewicht pro Dosierung, wie beispielsweise im Bereich von 1 mg bis 1 g pro kg Körpergewicht pro Dosierung. In einer Ausführungsform ist die Dosierung im Bereich von 1 mg bis 500 mg pro kg Körpergewicht Dosierung. in einer anderen Ausführungsform ist die Dosierung im Bereich von 1 mg bis 250 mg pro kg Körpergewicht pro Dosierung. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Dosierung im Bereich von 1 μg bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Dosierung, wie beispielsweise bis zu 50 mg pro kg Körpergewicht pro Dosierung. Der Dosierungsplan für jedes Subjekt kann vom Alter, dem Gewicht, der Gesundheit und der Anamnese des Subjekts abhängig sein sowie dem Ausmaß und der Progredienz des zu behandelnden Zustands und kann durch den behandelnden Arzt bestimmt werden.
Der aktive Inhaltsstoff kann in einer einzelnen Dosis oder in einer Reihe von Dosen verabreicht werden. Obwohl es möglich ist, den aktiven Inhaltsstoff allein zu verabreichen, ist es bevorzugt, wenn er als Zusammensetzung präsentiert wird, vorzugsweise als eine pharmazeutische Zusammensetzung.
Der Träger muss dahingehend pharmazeutisch annehmbar sein, dass er mit den anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzungen kompatibel ist und für das Subjekt nicht schädlich ist. Zusammensetzungen umfassen diejenigen, welche geeignet sind zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (umfassend buccal und sublingual), vaginalen oder parentalen (umfassend subkutan, intramuskulär, intravenös und intradermal) Verabreichung. Die Zusammensetzungen werden geeigneterweise in einer Einheitsdosierungsform präsentiert und können durch beliebige Verfahren, welche im Fachgebiet der Pharmazie bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt des Zusammenbringens des aktiven Inhaltsstoffs mit dem Träger, welcher einen oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt durch gleichmäßiges und enges Inkontaktbringen des aktiven Inhaltsstoffs mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem und anschließend, falls nötig, Formen des Produkts.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, welche zur oralen Verabreichung geeignet sind, können präsentiert werden als diskrete Einheiten, wie beispielsweise Kapseln, Päckchen oder Tabletten, wobei jede/jedes eine vorbestimmte Menge des aktiven Inhaltsstoffs enthält; als ein Pulver oder als ein Granulat; als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder als eine Öl-in-Wasser-Flüssigemulsion oder als eine Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion. Der aktive Inhaltsstoff kann auch präsentiert werden als ein Bolus, als Latwerge oder als Paste.
Eine Tablette kann hergestellt werden durch Kompression oder Formen, ggf. mit einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen. Komprimierte Tabletten können hergestellt werden durch Komprimieren in einer geeigneten Maschine des aktiven Inhaltsstoffs in einer frei fließenden Form, wie beispielsweise einem Pulver oder Granulat, ggf. gemischt mit einem Bindemittel (z. B. inertes Verdünnungsmittel, konservierendes Disintegrationsmittel wie beispielsweise Natriumstärkeglycolat, quer-verknüpftes Polyvinypyrrolidon, quer-verknüpfte Natriumcarboxymethylcellulose), einem Oberflächen-aktiven Mittel oder einem dispergierendem Mittel. Geformte Tabletten können hergestellt werden durch Formen eines Gemisches der gepulverten Verbindung in einer geeigneten Maschine, welche mit einem inerten flüssigen Verbindungsmittel angefeuchtet ist. Die Tabletten können ggf. beschichtet werden oder angeritzt werden und können formuliert werden, um eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des darin enthaltenen aktiven Inhaltsstoffs bereitzustellen, wobei beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen. Tabletten können ggf. mit einer enterischen Beschichtung bereitgestellt werden, um eine Freisetzung in anderen Teilen des Bauchs als dem Magen bereitzustellen.
Zusammensetzungen, welche zur topischen Verabreichung im Mund geeignet sind, schließen Lutschtabletten ein, umfassend den aktiven Inhaltsstoff in einer aromatisierten Grundlage, üblicherweise Saccharose und Akazien- oder Tragantgummi; Pastillen, welche den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Grundlage enthalten, wie beispielsweise Gelatine oder Glycerin oder Saccharose und Akaziengummi; und Mundspülungen, welche den aktiven Inhaltsstoff in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten.
Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung können präsentiert werden als Zäpfchen mit einer geeigneten Grundlage umfassend beispielsweise Kakaobutter, Gelatine, Polyethylenglycol.
Zusammensetzungen, welche zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, können präsentiert werden als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen zusätzlich enthaltend zum aktiven Inhaltsstoff Träger, von denen im Fachbereich bekannt ist, dass sie geeignet sind.
Zusammensetzungen, welche zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nicht-wässrige isotonische sterile Injektionslösungen, welche Antioxidanzien, Puffer, Bakterizide und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Zusammensetzung zum Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch gestalten; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, welche suspendierende Mittel und Verdickungsmittel enthalten können. Die Zusammensetzungen können präsentiert werden in verschlossenen Behältern für eine Einheitsdosis oder mehrere Dosen, wie beispielsweise Ampullen und Glasgefäßen, und können gelagert werden im gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand, welcher nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers erfordert, wie beispielsweise Wasser für Injektionen, kurz vor der Verwendung. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulat und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungszusammensetzungen sind solche, welche eine Tagesdosis oder eine Einheit, eine tägliche Unterdosis wie hierin vorausstehend beschrieben oder einen geeigneten Teil davon, des aktiven Inhaltsstoffs enthalten.
Es sollte selbstverständlich sein, dass zusätzlich zu den aktiven Inhaltsstoffen, welche vorausstehend besonders beschrieben wurden, die Zusammensetzungen der Erfindung andere Mittel enthalten können, welche im Fachbereich im Hinblick auf die Art der fraglichen Zusammensetzung üblich sind; beispielsweise können solche, welche zur oralen Verabreichung geeignet sind, weitere Mittel umfassen, wie Bindemittel, Süßstoffe, Verdickungsmittel, Aromastoffe, disintegrierende Mittel, Beschichtungsmittel, Konservierungsstoffe, Presszusätze und/oder Verzögerungsmittel. Geeignete Süßstoffe umfassen Saccharose, Lactose, Glucose, Aspartam oder Saccharin. Geeignete disintegrierende Mittel umfassen Kornstärke, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Xanthangummi, Bentonit, Alginsäure oder Agar. Geeignete Aromastoffe umfassen Pfefferminzöl, Wintergrünöl, Kirschen-, Orangen- oder Himbeeraroma. Geeignete Beschichtungsmittel umfassen Polymere oder Copolymere von Acrylsäure und/oder Methacrylsäure und/oder deren Ester, Wachse, Fettalkohole, Zein, Schellack oder Gluten. Geeignete Konservierungsmittel umfassen Natriumbenzoat, Vitamin E, Alpha-Tocopherol, Ascorbinsäure, Methylparaben, Propylparaben oder Natriumbisulphit. Geeignete Presszusätze können umfassen Magnesiumstearat, Stearinsäure, Natriumoleat, Natriumchlorid oder Talk. Geeignete Verzögerungsmittel können Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat umfassen.
Eine oder mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch Zusammensetzungen, Mittel oder Verbindungen bereitstellen, welche einen Vorteil aufweisen (oder einen Nachteil vermeiden), welcher mit bekannten Verfahren, Zusammensetzungen, Mitteln oder Verbindungen verbunden ist, die bei der chemotherapeutischen Behandlung von kanzerösen Zuständen und von Zuständen, welche mit der Hyperproliferation von Zellen verbunden sind, verwendet werden. Solche Vorteile können einen Vorteil oder mehrere Vorteile der im folgenden genannten Vorteile umfassen: Erhöhte therapeutische Wirksamkeit, verringerte Nebeneffekte, reduzierte Zytotoxizität gegenüber nicht-kanzerösen oder nicht-proliferativen Zellen, verbesserte Löslichkeit oder Dispersionseigenschaften zur Formulierung in pharmazeutische Zusammensetzungen, verbesserte Stabilität oder ein leichter zur Verfügung stehendes Mittel zum Erhalten der Verbindungen, z. B. furch einfachere, kostengünstigere synthetische Verfahren oder Isolationsverfahren oder synthetische Verfahren oder Isolationsverfahren mit höheren Ausbeuten.
Der Fachmann erkannt an, dass die hierin beschriebene Erfindung gegenüber Variationen und Modifikationen, welche sich von den hierin spezifisch beschriebenen unterscheiden, zugänglich ist. Es ist selbstverständlich, dass die Erfindung alle diese Variationen und Modifikationen, welche in den Bereich der Ansprüche fallen, umfasst.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche zum Zwecke der Veranschaulichung von Ausführungsformen der Erfindung enthalten sind und welche nicht dazu gedacht sind, die allgemeinen Grundsätze, welche hierin zuvor beschrieben wurden, zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung der Verbindungen A und B aus Aglaia leptantha
Die Verbindungen A und B wurden isoliert unter Verwendung des folgenden Arbeitsverfahrens:

a. Behandeln einer Probe gemahlener Rinde der Baumart Aglaia leptantha mit Methanol.
b. Filtern des Extrakts und Konzentrieren der sich ergebenden Lösung unter Vakuum.
c. Fraktionieren des Extrakts via Festphasenextraktion auf einer C-18-Varian-Extraktionssäule (10 g) unter Verwendung von 0,1% Ameisensäure in Acetonitril/Wasser mit ansteigenden Acetonitril-Konzentrationen.
d. Sammeln des Eluats, welches mit einem Acetonil/Wasser-Verhältnis von 7:20 erhalten wurde. Die Verbindungen A und B weisen ein UV-Absorptionsmaximum von 200, 273 nm auf (Acetonitril/Wasser/0,1% Ameisensäure) und HPLC-Retentionszeiten von etwa 30,67 (Verbindung A) und 31,05 Minuten (Verbindung B) unter den folgenden Bedingungen: C-8-Symmetriesäule (WATERS), 4,6 × 250 mm, 5 μm 1 ml/Min, linearer Gradient von 0% bis 90% Acetonitril in Wasser in 40 Minuten mit 0,1% Ameisensäure.
e. Konzentrieren der in Schritt (d) erhaltenen Fraktion.
f. Chromatographieren des unter Schritt (e) erhaltenen Konzentrats auf einer präparativen C-18-Säule (WATERS, Nova-Pak C-18, 6 Mikrometer, 2,5 × 25 cm) mit einer Flussgeschwindigkeit von 20 ml/Min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 25% bis 45% Acetonitril in Wasser in 30 Minuten mit 0,1% Ameisensäure.
g. Sammeln und Konzentrieren der Eluate mit den chromatographischen und spektroskopischen Eigenschaften, welche in Schritt (d) dargelegt sind bei etwa 22 Minuten.
h. Chromatographieren eines jeden unter (g) erhaltenen Eluats auf einer Sephadex LH20-Säule unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel. Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen mit den in (d) dargestellten Spektraleigenschaften.
i. (i) Alternativ zu den Schritten (b), (c) und (d) kann der unter (a) erhaltene Ethanolextrakt partitioniert werden mit gleichen Volumen an Wasser und Dichlormethan. Die Dichlormethanphase wird anschließend gemäß den Schritten (e) bis (h) verarbeitet.

Die auf diese Art und Weise erhaltenen Verbindungen weisen die folgenden Spektraleigenschaften und physikalischen Eigenschaften auf:
UV/Vis-Absorptionsmaxima: 223, 275 nm (in MeCN/H₂O, 0,1% HCOOH).
MS: Massenspektren wurden erhalten auf einem Finnigan LCQ-Ionenfallenmassenspektrometer unter Verwendung der ESI-Quelle im positiven Ionenmodus. Die Probe wurde gelöst in 0,1% FA in MeOH und in die Quelle durch Infusion mit einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 3 μl/Min eingeführt. Für Verbindung A wurden Signale beobachtet bei m/z 677 [M+Na⁺]⁺; MS² ergab m/z 659 [M+Na-H₂O]⁺; MS³ ergab m/z 627 (Verlust von 32 amu); MS⁴ ergab m/z 595 (Verlust von weiteren 32 amu) und m/z 451 (Verlust von 176 amu, entsprechend der Dioxanseitenkette). Für Verbindung B wurden im positiven Ionmodus Signale beobachtet bei m/z 677,2 [M+Na⁺]⁺; MS² ergab Tochterionen bei m/z 627,2 und m/z 659,2. Weitere Fragmentierung des Signals bei m/z 627,2 ergab ein Tochterion bei m/z 595.3.
Genaue Massenspektren für Verbindung A wurden erhalten auf dem Bruker 47e Fourier Transform-Ionenzyklotronresonanzmassenspektrometer (FTMS), welches ausgerüstet war mit einer Analytica Electrospray Source (ESI). Die Probe wurde gelöst in MeOH und in die Quelle durch direkte Infusion mit einer Spritzenpumpe bei einer Rate von 60 μl/Min eingeführt. Die Quelle wurde betrieben mit einer Kapillarspannung von 100 V. Es wurde ein Signal beobachtet bei m/z 677.2194 [M+Na]⁺ gemessen; C₃₄H₃₈O₁₃Na⁺ erfordert 677.2204.
NMR

NMR-Spektren der Verbindungen A und B wurden erhalten auf 400 und 500 MHz Varian (NOVA NMR-Spektrometern in CD₃OD bzw. CDCl₃. Es wurden die folgenden Experimente durchgeführt: ¹H, ¹³C, DEPT, HMQC, HMBC, COSY. Die ¹H NMR chemischen Verschiebungen (erhalten in CDCl₃) und die 130 NMR chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Tabelle 1

Positionszuordnung		Verbindung A		Verbindung B
Positionszuordnung		¹H NMR (ppm)	¹³C NMR (ppm)	¹H NMR (ppm)	¹³C NMR (ppm)
1	CH	5.03, d, 6.7 Hz, 1H	79.6	5.04, d, 6.8 Hz, 1H	79.6
2	CH	3.89, dd, 14.2, 6.7 Hz, 1H	50.03	3.9, dd, 14, 6.8 Hz, 1H	50
	COOCH₃		170.6		170.7
	COOCH₃	3.65, s, 3H	52.06	3.66, s, 3H	52
3	CH	4.28, d, 14.2 Hz, 1H	55.03	4.28, d, 14 Hz, 1H	55
3a	C		101.9		101.8
4a	C		160.6		160.2
5	CH	6.43, d, 2 Hz, 1H	92.8	6.45, d, 2 Hz, 1H	92.8
	C		157.1		157.1
	OCH₃	3.87, s, 3H	55.9	3.86, s, 3H	55.8
7	CH	6.28 d, 2 Hz, 1H	93.9	6.29 d, 2 Hz, 1H	94.3
	C		160		159.8
8a	C		109.6		109.4
8b	C		93.4
1'	C		126.2		126.2
2', 6'	2 × CH	7.10, br d, 9 Hz, 2H	128.9	7.10, br d, 9 Hz, 2H	128.9
3', 5'	2 × CH	6.68, br d, 9 Hz, 2H	112.7	6.69, br d, 9 Hz, 2H	112.8
4'	C		158.8		158.8
	OCH₃	3.71, s, 3H	55.05	3.72, s, 3H	55
1''			136.7		136.6
2'', 6''	2 × CH	6.84, m, 2H	127.8	6.86, m, 2H	127.5
3'', 5''	2 × CH	7.06, m, 2H	127.8	7.06, m, 2H	127.5
4''	CH	7.06, m, 1H	126.6	7.06, m, 1H	126.6

1'''	CH	5.28, s, 1H	94	5.26, s, 1H	93.4
2'''	CH	4.59, s, 1H	95.2	4.60, s, 1H	95.2
	OCH₃	3.49, s, 3H	55.1	3.5, s, 3H	55
		4.13, t, 11.2 Hz, 1H		4.02, t, 11.2 Hz, 1H
3'''	CH₂	3.56, dd, 11.7, 2 Hz, 1H	59	3.78, dd, 11.7, 2.4 Hz, 1H	59.6
4'''	CH	4.23, br t, 11.3 Hz, 1H	68.3	4.12, ddd, 11, 6.8, 2.8 Hz, 1H	67.6
5'''	CH	3.61, m, 1H	70.6	3.66, m, 1H	71.4
6'''	CH₂	3.61, m, 2H	63.3	3.61, dd, 10.4, 4.4 Hz, 1H 3.72, m, 1H	62.5

Beispiel 2
Die Verbindungen A und B sind für humane Tumorzelllinien zytostatisch und zytotoxisch
Die Verbindungen A und B wurden identifiziert aus einer Baumrindenprobe von Aglaia lepthantha über ihre Fähigkeit, die Produktion von Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) durch THP-1 humane promonozytische Leukämiezellen (Tsuchiya, et al, Int. J. Cancer, 1980, 26(2): 171–6) aktiviert mit Lipopolysaccharid (LPS) zu hemmen. Tabelle 2 fasst die Ergebnisse zusammen, welche die Aktivität der Verbindungen A und B zur Hemmung von TNF-α-Produktion mit ihren Effekten auf den allgemeinen Zellzyklusmetabolismus vergleichen, welche gemessen wurde unter Verwendung von WST-1-Reduktion, DNA-Synthese und Proteinsyntheseassays für THP-1-Zellen. Die Verbindungen A und B hemmten die TNF-α-Produktion bei im Allgemeinen ähnlichen Konzentrationen, welche hinsichtlich der WST-1-Reduktion, den DNA- und Proteinsyntheseassays aktiv waren. Zum Vergleich wurden die Effekte der Verbindungen A und B auf A549-Lungenepithelialkarzinomazellen (Leiber et al, Int J Cancer, 1976, 17(1): 62–70) ebenfalls gemessen und die Daten sind von Tabelle 2 ebenfalls umfasst. Die Verbindungen A und B sind zur Hemmung der Interleukin-1 (IL-1)-induzierten Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1)-Expression durch A549-Zellen signifikant weniger potent, obwohl in diesen Zellen die Protein- und DNA-Synthesehemmung bei im Allgemeinen ähnlichen Konzentrationen wie für THP-1-Zellen auftritt.
Tabelle 2: Vergleich der Effekte der Verbindungen A und B in THP-1 und A549-Zellen.

Es wurden gereinigte Verbindung A oder Verbindung B, welche in DMSO gelöst waren, über einen breiten Konzentrationsbereich parallel zur hemmenden Aktivität in den verschiedenen Assays sowohl in THP-1 als auch in A549-Zellen getestet. Es ist die Konzentration gezeigt, welche zu einer 50%-Hemmung hinsichtlich der relevanten Reaktion (IC₅₀) führt. Die Produktion von TNF-α durch THP-1-Zellen wurde gemessen als die, welche in den Kulturüberstand über 18 Stunden hinweg freigesetzt wird durch einen Enzymgekoppelten Immunadsorptionsassay (ELISA) im Sandwich-Verfahren unter Verwendung der im Folgenden beschriebenen Anti-TNFα-monoklonalen Maus-Antikörper (Fangantikörper, MAB610; Detektionsantikörper, biotinyliert MAB210; beide von R & D Systems, Minneapolis MN, USA). Die Oberflächenexpression von ICAM-1 durch A549-Zellen wurde nach 24 Stunden Kultur durch direkte Antikörperbindung unter Verwendung eines Europium-markierten Maus-Anti-ICAM-1-monoklonalen Antikörpers (R & D Systems Cat Nr. BBA3) untersucht und durch zeitaufgelöste Fluoreszenz unter Verwendung des Delfia-Assays (EG&G Wallac, Turku, Finnland) gemessen. Die Reduktion von WST-1 (Roche, Kat. Nr. 1644807) durch THP-1-Zellen wurde nach 18 Stunden Kultur gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Proteinsynthese wurde gemessen als die Aufnahme von [¹⁴C]-Leucin (0,5 μCi/ml) nach 48 Stunden für THP-1-Zellen und 72 Stunden für A549-Zellen kultiviert in Wachstumsmedium (RPMI-1640, 10% FBS), welches 10% der üblichen L-Leucinkonzentration (5 mg/ml) enthielt. Die DNA-Synthese wurde gemessen als die Aufnahme von [¹⁴C]-Thymidin (0,5 μCi/ml) nach 48 Stunden für THP-1-Zellen und 72 Stunden für A549-Zellen in normalem Wachstumsmedium.

Verbindung	IC₅₀ (μM)
	THP-1-Zellen				A549-Zellen
	TNF-α-Produktion	WST-1-Reduktion	Protein-Synthese	DNA-Synthese	ICAM-1-Produktion	Protein-Synthese	DNA-Synthese
Verbindung A	0,06	0,03	0,06	0,015	2	0,02	0,007
Verbindung B	0,015	0,04	0,003	0,003	5	0,01	0,004

Verbindung A wurde hinsichtlich der zytotoxischen und zytostatischen Aktivität gegenüber einem Panel von Zelllinien untersucht, welche aus verschiedenen humanen Tumortypen abgeleitet waren, zusätzlich zu THP-1- und A549-Zellen (Tabelle 3). Diese umfassten K562-Leukämiezellen (Lozzio und Lozzio, 1975, Blood 45: 321–34), PC3-Prostatatumorzellen (Kaighn et al., 1979, Invest. Urol. 17: 16–23) und SF268-Glioblastomzellen (Westphal et al, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun., 132: 284–9). Verbindung A zeigte eine starke zytostatische Aktivität in nahezu allen untersuchten Zelllinien mit GI₅₀-Werten im Bereich von zwischen 1–7 nM. Verbindung A zeigte auch starke zytotoxische Effekte gegenüber den verschiedenen Tumorzelllinien. Interessanterweise erwiesen sich die THP-1- und PC3-Zellen als die am schnellsten getöteten Zellen mit einem kleinen Unterschied hinsichtlich der LC₅₀-Werte, welche nach 3 oder 6 Kulturtagen erhalten wurden. Jedoch ist die zytotoxische Stärke von Verbindung A nach 6 Kulturtagen für die K562-, A549- und SF268-Zellen drastisch erhöht. Es sollte angemerkt werden, dass die Konzentration an Verbindung A, welche erforderlich war, um die Zellproliferation zu hemmen, signifikant niedriger war als diejenigen, welche notwendig waren, um eine zytotoxische Reaktion auszulösen. Deshalb ist der zytostatische Effekt von Verbindung A biochemisch unterscheidbar von ihrer Fähigkeit, Zelltod zu induzieren. Tabelle 4 zeigt, dass Verbindung B zytotoxische Effekte gegenüber den verschiedenen Tumorzelllinien mit vergleichbarer Stärke zu der aufwies, welche für Verbindung A beobachtet wurde.
Tabelle 3: Verbindung A weist eine starke zytostatische und zytotoxische Aktivität in verschiedenen humanen Tumorzelllinien in vitro auf.

Gereinigte Verbindung A wurde über einen Konzentrationsbereich bis zu einem Maximum von 1 × 10^–6 M (1000 nM) hinsichtlich zytostatischer und zytotoxischer Aktivität gegenüber einem Panel von Zelllinien getestet, welche wie angegeben aus verschiedenen humanen Tumorarten abgeleitet waren. Der G150-Wert stellt die Konzentration der Verbindung dar, welche die Zellzahlzunahme (relativ zu unbehandelten Zellen) nach 3 Kulturtagen um 50% hemmte. Die relative Zellzahl wurde bestimmt durch Messen zellulärer DNA unter Verwendung eines fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffs (YOYO-1) nach Lysieren der Zellen mit Digitonin (Becker et al., Anal Biochem, 1994, 221(1): 78–84). Der LC₅₀-Wert stellt die Verbindungskonzentration dar, welche 50% der Zellen tötete. Der Zelltod wurde gemessen als Anteil der toten Zellen, welche einen sub-diploiden DNA-Gehalt aufwiesen, wobei dies durch Flusszytometrie nach Färbung mit Propidiumiodid bestimmt wurde (Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 1991, 139: 271–79).

Tumorquelle	Tumorzelllinie	Verbindung A
Tumorquelle	Tumorzelllinie	GI₅₀ (nM) (3 Tage Kulturen)	LC₅₀ (nM) (3 Tage Kulturen)	LC₅₀ (nM) (6 Tage Kulturen)
Leukämie	THP-1 K562	- 1	36 > 1000	24 10
Lunge	A549	7	914	21
Prostata	PC3	5	18	12
Gehirn	SF268	3	461	29

Tabelle 4: Die Verbindungen A und B zeigen ähnliche zytotoxische Aktivität
Es wurde die zytotoxische Aktivität der Verbindungen A und B für die verschiedenen Tumorzelllinien wie in Tabelle 3 beschrieben verglichen.

Tumorquelle Tumorzelllinie LC₅₀ (nM) (6 Tage Kulturen)

Verbindung A Verbindung B

Leukämie THP-1 K562 11 12 15 15

Lunge A549 15 12

Prostata PC3 12 12

Gehirn SF268 12 22
Beispiel 3
Die zytotoxische Aktivität von Verbindung A wird von anderen bekannten verwandten Verbindungen, welchen die neue Dioxanyloxysubstitution fehlt, nicht geteilt.
Tabelle 5 vergleicht die zytostatischen und zytotoxischen Effekte von Verbindung A mit drei zuvor identifizierten 1H-Cyclopenta[b]benzofuran-Lignanen, welche die neue Dioxanyloxygruppe nicht aufweisen. Die Referenzverbindungen sind: Rocaglaol (Referenzverbindung 1) (Ohse et al., J Nat Prod, 1996, 59(7): 650–52); 4'-Demethoxy-3',4'-methylendioxyrocaglaol (Referenzverbindung 2); Methyl-4'-demethoxy-3',4'-methylendioxyrocaglate (Referenzverbindung 3) (Lee et al., Chem Biol Interact, 1998, 115(3): 215–28). Alle vier Verbindungen zeigten detektierbare zytostatische Aktivität in A549-Zellen, wobei Verbindung A die stärkste war und in absteigender Reihenfolge die Referenzverbindungen 3, 2 bzw. 1 folgten. Wichtig ist, dass von den untersuchten Verbindungen, anders als Verbindung A, keine der Referenzverbindungen eine nennenswerte Zytotoxizität weder in THP-1- noch in A549-Zellen bis hin zu Dosierungen von 5000 nM über den 3 Tage-Assay zeigte. Ohne dass es beabsichtigt ist, die Erfindung durch Theorie zu beschränken, wird vorgeschlagen, dass die neue Dioxanyloxysubstitution für die zytotoxische Aktivität, welche von Verbindung A gezeigt wird, wichtig ist und sie von allen anderen zuvor identifizierten 1H-Cyclopenta[b]benzofuran-Lignanen unterscheidet.
Tabelle 5: Verwandte 1H-Cyclopenta[b]benzofuran-Lignane, welchen die neue Dioxanyloxy-Seitenkette fehlt, zeigen keine zytotoxische Aktivität.

A549- und THP-1-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen der verschiedenen Verbindungen bis zu einem Maximalwert von 5 × 10^–6 M (5000 nM) behandelt und es wurden die Effekte auf die Zellproliferation und die Zelllebensfähigkeit nach 3 Kulturtagen bestimmt. Die GI₅₀-Werte wurden bestimmt durch Messen der relativen Veränderungen hinsichtlich der Zellzahl unter Verwendung von YOYO-1 wie für Tabelle 3 beschrieben. Die LC₅₀-Werte wurden bestimmt durch Messen des Zelltods als Funktion des Verlusts an Membranintegrität unter Verwendung von YOYO-1-Aufnahme (Becker et al., Anal Biochem, 1994, 221(1): 78–84). Die Strukturen der Referenzverbindungen sind ebenfalls gezeigt.

Verbindung	A549-Zellen		THP-1-Zellen
Verbindung	GI₅₀ (nM)	LC₅₀ (nM)	LC₅₀ (nM)
Verbindung A	13	514	15
Referenzverbindung 1	3980	> 5000	> 5000
Referenzverbindung 2	389	> 5000	> 5000
Referenzverbindung 3	56	> 5000	> 5000

Beispiel 4
Verbindung A weist akute Proteinsynthese-hemmende Aktivität auf
Verbindung A wurde auch untersucht, um zu bestimmen, ob sie die allgemeine Biosynthese schnell hemmen kann: Unter Verwendung von [¹⁴C] Leucin-Einbau in unlösliches zelluläres Material als Assay für die allgemeine Proteinsynthese zeigt Tabelle 6, dass Verbindung A einen hemmenden Effekt aufwies, welcher 3 Stunden nach Zugabe zu THP-1-Zellen mit einem IC₅₀ von 30 nM sichtbar wurde. Die DNA-Synthese, welche über die gleiche Zeit hinweg gemessen wurde, wurde ebenfalls gehemmt, aber weniger stark (10₅₀ ~ 70 nM), und kann zur Proteinsynthesehemmung sekundär sein. Cycloheximid, ein bekannter Proteinsyntheseinhibitor (Obrig et al, 1971, J. Biol. Chem. 246(1), 174–181) hemmte ebenfalls sowohl die Protein- als auch die DNA-Synthese, wobei Verbindung A hinsichtlich ihrer Effekte signifikant stärker war als Cycloheximid. Tabelle 6 zeigt, dass Verbindung A auch die allgemeine Proteinsynthese in A549-Zellen mit einem IC₅₀ von ~30 nM hemmte, wobei dies zu dem in den THP-1-Zellen beobachteten Effekt ähnlich ist.
Tabelle 6: Verbindung A hemmt die allgemeine Proteinbiosynthese.
THP-1-Zellen und A549-Zellen wurden vorbehandelt mit den angegebenen Konzentrationen an Verbindung A für 1 Stunde vor der Zugabe von (1 μCi/ml) [¹⁴C] Leucin (Proteinsynthese) oder [¹⁴C] Thymidin (DNA-Synthese) für weitere 2 Stunden. Die IC₅₀-Werte stellen die Konzentration von Verbindung A dar, welche benötigt wurde, um den Einbau von Isotop um 50% relativ zu unbehandelten Kontrollzellkulturen zu hemmen.

Verbindung IC₅₀ (nM)

THP-1-Zellen

Proteinsynthese DNA-Synthese Proteinsynthese

Verbindung A 27 72 32

Cycloheximid 263 303 238
Beispiel 5
Verbindung A induziert Differenzierung von humanen leukämischen Zelllinien.
In den Experimenten mit den THP-1-monozytischen leukämischen Zellen, welche normalerweise nicht anhaftend in Suspension wachsen, beobachteten wir, dass eine verlängerte Exposition der Zellen gegenüber 10 nM Verbindung A zu einer Akkumulation der Zellen führte, welche am Kunststoff anhafteten und zahlreiche Pseudopodien zeigten (1). Es handelt sich dabei um eine Morphologie, welche für reife Makrophagen in hohem Maße charakteristisch ist und es wurden ähnliche morphologische Effekte beobachtet, wenn die Zellen mit anderen bekannten Induktionsmitteln von Makrophagendifferenzierung behandelt wurden, umfassend Interferon-γ (IFN-γ) oder Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA). Um dies weiter zu untersuchen, wurden die Effekte von Verbindung A auf HL60 humane promyelozytische leukämische Zellen (Collins, et al, Nature, 1977, 270: 347–9) untersucht (Tabelle 7). Diese weitverbreitet verwendete Zelllinie ist gut charakterisiert als Modell zur humanen myelomonozytischen Differenzierung (Collins, Blood, 1987, 70(5): 1233–44). In diesem Experiment wurde die monozytische Differenzierung quantifiziert durch Messen der CD14-Oberflächen-Antigen-Expression mittels Flusszytometrie-Analyse. CD14, ein LPS-Bindungsprotein, wird auf der Oberfläche von Zellen mit myelomonozytischer Abstammung exprimiert und wird üblicherweise in undifferenzierten HL60-Zellen in sehr niedrigen Mengen exprimiert (Ferrero et al., Blood, 1983, 61(1): 171–9). Konsistent mit den THP-1-Daten, welche vorausgehend beschrieben wurden, zeigt Tabelle 7, dass Verbindung A bei größeren Dosierungen als 10 nM die CD14-Expression in den lebensfähigen HL60-Zellen, welche nach 4 Kulturtagen übrig waren, signifikant steigerte. Zusammengenommen zeigen diese Daten nachhaltig, dass Verbindung A die Fähigkeit aufweist, die Differenzierung von humanen leukämischen Zelllinien zu induzieren.
Tabelle 7: Verbindung A fördert die monozytische Differenzierung von HL60 leukämischen Zellen.
HL60-Zellen wurden kultiviert für 4 Tage mit der angegebenen Konzentration von Verbindung A, anschließend gewonnen und in 70% Ethanol fixiert. Die Zellen wurden anschließend gefärbt mit dem Maus-monoklonalen Anti-CD14-Antikörper (OKM1) und dies wurde unter Verwendung des FITC-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-IgG1 als sekundärem Antikörper gemessen. Die gefärbten Zellen wurden visualisiert mittels Flusszytometrie und die Analyse wurde auf solche Zellen beschränkt, welche zum Zeitpunkt der Fixierung auf Grundlage ihrer Lichtstreu-Charakteristika nach vorne und zur Seite als lebensfähig eingestuft wurden. Eine nicht-spezifische Färbung von Zellen wurde kontrolliert durch Inkubation nur mit sekundärem Antikörper.

Verbindung A Konzentration (nM) % Zellen, welche CD14 exprimieren

0 1,3%

5 3,3%

10 5,7%

25 46,0%

50 43,0%
Beispiel 6
Die zytostatische Aktivität von Verbindung A ist assoziiert mit einer allgemeinen Hemmung der Progression des Zellzyklus in A549-Zellen
Eine DNA-Gehaltsanalyse von THP-1-Zellen, welche mit variierenden Konzentrationen von Verbindung A (2) behandelt worden waren, zeigte, dass sie bei 10 nM nur schwach zytotoxisch war (erhöhte Akkumulation von toten Zellen von 7% auf 17%) und unter diesen Bedingungen Zellen dazu brachte, sich in den G0/G1-Phasen des Zellzyklus zu akkumulieren. Dies zeigt, dass Verbindung A auch zytotoxische Aktivität in THP-1-Zellen aufweist. Zum Vergleich zeigt 2, dass das die Mikrotubuli-destabilisierende Arzneimittel Paclitaxel (Sorger et al., Curr Opin Cell Biol, 1997, 9(6): 807–14), welches auch THP-1-Zelltod induziert, Zellen dazu brachte, sich in den G2/M-Phasen des Zellzyklus zu akkumulieren.
Der zytostatische Effekt von Verbindung A auf die Proliferation von A549-Zellen wurde bestätigt durch direktes Zählen der Zellzahlen in Intervallen über einen neun-Tages-Zeitraum hinweg (3). Im Vergleich mit unbehandelten Zellen verhinderten 10 nM Verbindung A einen Anstieg der Zellzahl um mehr als 95%, wobei weniger als 10% tote Zellen zu diesem Zeitpunkt beobachtet wurden (gemessen durch Trypanblau-Ausschluss). Deshalb kann unter diesen Bedingungen die erhöhte Zellzahl nicht nur mit einem erhöhten Zelltod begründet werden. Eine signifikante Hemmung der Zellzahl wurde innerhalb eines 2-Tages-Zeitraums gesehen, wodurch gezeigt wird, dass Verbindung A in einer schnellen Art und Weise wirkt. Bei den höheren Konzentrationen von 50 nM und 250 nM wies Verbindung A zytotoxische Effekte auf und erhöhte den Zelltod auf 86% bzw. 100% nach 9 Tagen und begründet die Abnahme der Zellzahl auf Mengen unterhalb der ursprünglichen Ausgangszahl zu diesem Zeitpunkt. Bei der nicht-zytotoxischen Konzentration von 10 nM weist Verbindung A einen schnellen und starken zytostatischen Effekt auf A549-Zellen auf.
Um einen möglichen Mechanismus für die Effekte von Verbindung A zu identifizieren, wurde eine DNA-Gehaltsanalyse durchgeführt, um zu bestimmen, an welcher Stelle des Zellzyklus sie ihren Effekt ausübt (4). Die Zellzyklusanalyse von A549-Zellen, welche mit Verbindung A für 6 Tage behandelt worden waren, zeigte dass bei 10 nM, wobei hier keine offensichtliche Zytotoxizität erwiesen war, ein kleiner Abfall hinsichtlich des Anteils an Zellen in den G0/G1-Phasen des Zellzyklus vorlag, mit einem begleitendem Anstieg von Zellen in den G2/M-Phasen. Zusammengenommen mit den Wachstumskurvendaten in 3 vorausstehend, zeigen diese Daten, dass 10 nM Verbindung A zu einer allgemeinen Verlängerung von alten Phasen des Zellzyklus führt, mit einer vielleicht etwas stärker betonten Elongation der G2/M-Phasen. Dies steht im Gegensatz zu den Effekten von Paclitaxel, wobei es sich um ein Arzneimittel handelt, von welchem bekannt ist, dass es selektiv auf die G2/M-Phasen des Zellzyklus wirkt (4). Als die Konzentration von Verbindung A erhöht wurde und seine zytotoxischen Effekte offensichtlich wurden, erniedrigte sich der Anteil an Zellen in den S- und G2/M-Phasen mit einem korrespondierendem Anstieg an Zellen in den G0/G1-Phasen. Obwohl ein kleiner Unterschied hinsichtlich der Zahl an toten Zellen zwischen 50 nM und 250 nM vorlag, führte die höhere Dosierung zu einer größeren Akkumulation von Zellen in den G0/G1-Phasen des Zellzyklus. Deshalb sind im Vergleich zu THP-1- Zellen (siehe 2) höhere Konzentrationen an Verbindung A erforderlich, um eine Progression durch die G0/G1-Phasen des Zellzyklus in A549-Zellen zu hemmen.
K562 leukämische Zellen, welche mit 10–15 nM an Verbindungen A oder B behandelt worden waren, zeigten eine charakteristische Akkumulation von Zellen in den G2/M-Phasen des Zellzyklus (5). Dies geschah über einen engen Konzentrationsbereich, da die Verbindungen A oder B bei weniger als 5–8 nM oder mehr als 25 nM nicht zu einer G2/M-Phasenakkumulation führten. Diese Daten zeigen, dass die verschiedenen Zelllinien hinsichtlich ihrer Sensitivität und Reaktionen auf die Verbindungen A und B im Hinblick auf Zellzyklusphasenspezifische Effekte variieren können.
Beispiel 7
Der zytostatische Effekt von Verbindung A ist in A549-Zellen reversibel
Die Reversibilität der Effekte der Verbindung A wurde untersucht. Hierzu blieben A549-Zellen unbehandelt oder wurden kultiviert in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an Verbindung A oder mit Paclitaxel für 5 Tage vor der Entfernung der Verbindungen und die Zellen wurden für weitere 4 Tage vor der Bestimmung der Zellzahl (6) kultiviert. 10 nM Verbindung A supprimierten signifikant die erhöhte Zellzahl für bis zu 9 Tage ohne signifikante Zytotoxizität. Jedoch lag in diesen Kulturen, wenn Verbindung A nach 5 Tagen entfernt wurde, ein fünffacher Anstieg hinsichtlich der Zellzahl über die anschließenden 4 Kulturtage vor, wobei dies 2–3 Populationsverdopplungen entspricht. Die Effekte der Behandlung, welche für die Zellen schädlich waren, wie beispielsweise bei höheren Konzentrationen an Verbindung A oder bei Vorliegen von Paclitaxel wurden nach deren Entfernung nicht umgekehrt.
Beispiel 8
Verbindung A hemmt die Zellzyklus-abhängige Zytotoxizität, welche von verschiedenen Anti-Krebs-Mitteln ausgelöst wird
Um die Zellzykluseffekte von Verbindung A weiter zu untersuchen, wurde eine zytostatische Konzentration dieser Verbindung zusammen mit anderen Anti-Krebs-Mitteln kombiniert, von welchen bekannt ist, dass sie an spezifischen Punkten im Zellzyklus wirken, um zu sehen ob Verbindung A deren Zellzyklus-abhängige Effekte stören konnte. Die Zelllebensfähigkeit wurde untersucht nach 3 Tagen durch Messen des Ausschlusses des fluoreszierenden DNA-Bindungsfarbstoffs YOYO-1. (Becker et al., Anal Biochem, 1994, 221(1): 78–84). Die A549-Zellen wurden behandelt mit einer 10 nM nicht-zytotoxischen Dosierung von Verbindung A in Gegenwart steigender Konzentrationen an Camptothecin und Paclitaxel. Camptothecin ist ein Inhibitor der DNA-Topoisomerase I, wobei es sich um ein Enzym handelt, welches zur DNA-Replikation notwendig ist, und zu Störungen in der S-Phase des Zellzyklus führt, mit anschließendem Zelltod aufgrund der Aktivierung eines S-Phasen-Kontrollpunkts (Darzynkiewicz et al., Ann N Y Acad Sci, 1996, 803: 93–100). Paclitaxel hemmt, wie bereits erwähnt, die Mikrotubuli-Funktion, welche zur Bildung der mitotischen Spindeln notwendig ist, was zur Aktivierung eines M-Phasen-Kontrollpunkts und anschließendem Zelltod führt (Sorger et al., Curr Opin Cell Biol, 1997 9(6): 807–14). 7 zeigt, dass 10 nM Verbindung A die zytotoxischen Effekte sowohl von Camptothecin und Paclitaxel signifikant reduzierte, auch wenn diese Arzneimittel mit einem bis zu 2000-fachen Überschuss zugegeben wurden. Verbindung A kann in einer dominanten Art und Weise den Zellzyklus-abhängigen zytotoxischen Effekten von Camptothecin und Paclitaxel vorbeugen.
Dies wurde ausführlicher untersucht unter Verwendung von DNA-Gehaltsanalyse, um die Progression des Zellzyklus und des Zelltods spezifisch zu messen. In diesem Experiment wurden die Zellen zusätzlich zu Camptothecin und Paclitaxel auch mit Vinblastin (ein anderer Mikrotubuli-Inhibitor) (Sorger et al., 1997, vorausstehend) und Staurosporin (ein Kinaseinhibitor) (Gescher, Crit Rev Oncol Hematol., 2000, 34(2): 127–35) behandelt. Wie zuvor herausgefunden, zeigten A549-Zellen, welche mit 10 nM Verbindung A behandelt worden waren, eine schwache Abnahme hinsichtlich von Zellen in G0/G1, mit einer leichten Zunahme von Zellen in der G2/M-Phase bei keinem detektierbaren Anstieg an Zelltod über die drei Tage Kultur hinweg (8). Konsistent mit seinem bekannten Mechanismus führte Camptothecin zur Akkumulation von Zellen in der S-Phase des Zellzyklus und erhöhte auch die Menge an toten Zellen, welche als solche Zellen mit einem sub-diploiden DNA-Gehalt detektiert wurden. Ebenso wie erwartet führten sowohl Vinblastin als auch Paclitaxel bei der Mehrheit der Zellen zu einem Arrest in den G2/M-Phasen des Zellzyklus und zu einem erhöhten Auftreten von sub-diploiden toten Zellen. Jedoch beugte bei allen diesen Mitteln das Vorliegen von 10 nM Verbindung A ihrem charakteristischen Zellzyklusarrest vor und hemmte ihre zytotoxischen Effekte signifikant, wobei das Auftreten von sub-diploiden toten Zellen drastisch reduziert wurde. Im Gegensatz dazu hatte Verbindung A nur einen geringen Effekt auf die zytotoxischen Effekte von Staurosporin, wobei es sich um ein Mittel handelt, welches in der Lage zu sein scheint, Zellen in allen aktiven Phasen des Zellzyklus zu töten.
Beispiel 9
Die zytostatischen Effekte von Verbindung A korrelieren nicht mit einem Biomarker für replikative Seneszenz.
Die drastisch erniedrigte Wachstumsrate von A549-Zellen, welche in Anwesenheit von 10 nM Verbindung A (siehe 3) kultiviert wurden, führte zu der Überlegung hinsichtlich der Möglichkeit, dass diese Verbindung replikative Seneszenz dieser immortalen Tumorzellen induzierte. Konsistent mit dieser Möglichkeit wurden unter diesen Bedingungen A549-Zellen oft mit einer Morphologie erhalten, welche in hohem Ausmaße einen seneszenten Phänotyp nahelegt, wobei sie in starkem Ausmaße abgeflacht mit einer vergrößerten Oberfläche im Vergleich zu ihrem üblichen Erscheinen waren (vergleiche beispielsweise 9, Subpanele a und b). Dies wurde ferner durch Messen der Seneszenz-assoziierten β-Galactosidase (SA-β-gal)-Aktivität bewertet, wobei es sich um einen Biomarker handelt, von dem kürzlich beschrieben wurde, dass er mit der Seneszenz von humanen Zellen gut korreliert (Dimri et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995 92(20): 9363–7). Es wurde kürzlich herausgefunden, dass einige Anti-Krebs-Mittel, welche durch unterschiedliche Mechanismen wirken, einschließlich Doxorubicin, Cisplatin, Cytarabin, Etoposid und Paclitaxel alle SA-β-gal-Aktivität in verschiedenen Tumorzelllinien induzieren können (Chang et al., Cancer Res 1999, 59(15): 3761–7). Deshalb wurden die A549-Zellen zusätzlich zu Verbindung A alle mit Doxorubicin als experimenteller Kontrolle behandelt. Dieses Arzneimittel wirkt durch Stabilisieren von DNA/Topoisomerase II-Komplexen, wodurch DNA-Schaden verursacht wird, welcher zu einem nachfolgenden S-Phasen-Zellzyklus-Arrest und/oder Zelltod führt (Froelich-Ammon und Osheroff, 1995, J. Biol. Chem. 270(37): 21429–21432). 9 zeigt, dass in Übereinstimmung mit der früheren Beschreibung A549-Zellen, welche mit 250 nM Doxorubicin behandelt worden waren, den abgeflachten vergrößerten Phänotyp von seneszenten Zellen zeigten und SA-β-gal-Aktivität aufwiesen. Im Gegensatz dazu konnte Verbindung A bei verschiedenen Dosierungen von 10–50 nM keine SA-β-gal-Aktivität induzieren, auch wenn die Zellen die abgeflachte vergrößerte Morphologie aufwiesen. Deshalb korrelieren im Gegensatz zu einer Vielzahl von anderen Anti-Krebs-Mitteln die zytostatischen Effekte von Verbindung A nicht mit diesem speziellen Marker von Zellseneszenz.
Beispiel 10
Verbindung A hemmt die Zellproliferation, aber nicht eine gesteigerte Zellgröße
Es ist wohlbekannt, dass Zellproliferation und Zellwachstum, welche sich in einer erhöhten Masse von einzelnen Zellen widerspiegeln, biochemisch unterscheidbare Prozesse darstellen (Pardee, Science, 1989, 246: 603–8). Obwohl bei bestimmten Konzentrationen Verbindung A Zellproliferation ohne offenkundige Zytotoxizität hemmen kann, wurde auch bewertet, ob Verbindung A das Zellwachstum beeinflussen kann. Für diese Experimente wurden A549-Zellen mit verschiedenen nicht-zytotoxischen Dosierungen von Verbindung A bis zu 10 nM behandelt und es wurde die relative Zellgröße nach 6 Kulturtagen durch Messen der Lichtstreuung in Vorwärtsrichtung unter Verwendung eines Flusszytometers bestimmt. Die in Tabelle 8 dargestellten Daten zeigen, dass bei Vorliegen von Verbindung A A549-Zellen einen Anstieg hinsichtlich des vorwärts gestreuten Lichts um 20% zeigten. Dies geschah nur bei Konzentrationen, welche für diesen Zelltyp zytostatisch sind.
Tabelle 8: Verbindung A steigert die Zellgröße
A549-Zellen, welche für 6 Tage mit den verschiedenen nicht-zytotoxischen Konzentrationen von Verbindung A wie angegeben kultiviert worden waren, wurden durch Flusszytometrie hinsichtlich ihrer Vorwärtslichtstreuungscharakteristika untersucht, welche mit der Zellgröße in direkter Beziehung stehen. Die %-Zunahme hinsichtlich des mittleren Zellvolumens stellen die relative Veränderung im mittleren Lichtvorwärtsstreuwert für die behandelten gegenüber den unbehandelten Zellpopulationen dar.

Verbindung A Konzentration (nM) % Zunahme hinsichtlich des mittleren Zellvolumens

0 -

2,5 10,4%

5,0 10,7%

10,0 22,4%
Beispiel 11
Verbindung A hemmt das Wachstum von humanen Tumorzelllinien in einem Maus-Xenotransplantat-Tumormodell.
Es wurde die Fähigkeit von Verbindung A untersucht, das Wachstum von humanen Tumorzelllinien in vivo zu hemmen, wobei männliche athymische Mäuse verwendet wurden, welchen dorsal in den Flankenbereich 2 × 10⁶ PC3 humane Prostata-Tumorzellen subkutan injiziert wurden. Die Verabreichung von Verbindung A (3 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion begann acht Tage nachdem der PC3-Tumor palbabel war und wurde fortgeführt dreimal wöchentlich bis 29 Tage nach der anfänglichen Inokulation der Tumorzellen. Zu diesem Zeitpunkt wurden alle Mäuse getötet und die Tumore wurden chirurgisch entfernt und gewogen. 10A zeigt, dass im Vergleich mit den Kontrolltieren, welche nur mit Vehikel behandelt worden waren, die Mäuse, welche mit Verbindung A behandelt worden waren, eine in großem Ausmaß reduzierte Zunahme des mittleren Tumorvolumens über den Verlauf des Experiments zeigten. Dies wurde am Ende des Experiments bestätigt, wenn die Tumore chirurgisch entfernt und gewogen wurden, und es wurde herausgefunden, dass die Behandlung mit Verbindung A das mittlere Tumorgewicht um ~60% (10B) reduzierte. Das Körpergewicht blieb sowohl in den Kontrollgruppen als auch in den behandelten Kontrollgruppen unbeeinflusst, welche eine ähnliche ~12% Abnahme hinsichtlich des mittleren Körpergewichts über die Dauer des Experiments zeigten. Deshalb zeigt Verbindung A in vivo-Anti-Tumor-Aktivität.

Claims

Cyclopentabenzofuranverbindung umfassend eine Gruppe der Formel (ii)
welche mittels eines Sauerstoffatoms an einen Cyclopentabenzofurankern der Formel (i)
angefügt ist und welche die folgenden NMR Spektralcharakteristika aufweist: ¹H NMR (CDCl₃) (ppm) 3,49, s, 3H; 3,56, dd, 11,7, 2 Hz, 1H; 3,61, m, 1H; 3,61, 2H; 3,65, s, 3H; 3,71, s, 3H; 3,87, s, 3H; 3,89, dd, 14,2, 6,7 Hz, 1H; 4,13, t, 11,2 Hz, 1H; 4,23, brt, 11,3 Hz, 1H; 4,28, d, 14,2 Hz, 1H; 4,59, s, 1H; 5,03, d, 6,7 Hz, 1H; 5,28, s, 1H; 6,28, d, 2 Hz, 1H; 6,43, d, 2 Hz, 1H; 6,68, brd, 9 Hz, 2H; 6,84, m, 2H; 7,06, m, 2H, 7,06, m, 1H; 7,10, brd, 9 Hz, 2H; ¹³C NMR (CDCl₃) (ppm) 50,03, 52,06, 55,03, 55,05, 55,1, 55,9, 59, 63,3, 68,3, 70,6, 79,6, 92,8, 93,4, 93,9, 94, 95,2, 101,9, 109,6, 112,7, 126,2, 126,6, 127,8, 127,8, 128,9, 136,7, 157,1, 158,8, 160, 160,6, 170,6; oder ein Salz, ein Derivat oder ein Prodrug davon, wobei das Prodrug oder Derivat ein Ester, Glycosid, gegebenenfalls substituiertes Alkyloxy, gegebenenfalls substituiertes cyclisches Alkoxy, gegebenenfalls substituiertes Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertes cyclisches Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertes Alkinyloxy, gegebenenfalls substituiertes cyclisches Alkinyloxy, gegebenenfalls substituiertes Acyloxy gemäß der Formel -O-C(O)-R, wobei R eine Alkyl-, cyclische Alkyl-, Alkenyl-, cyclische Alkenyl-, Alkinyl-, cyclische Alkinyl-, Heteroaryl- oder Aryl-Gruppe ist, oder gegebenenfalls substituiertes Aryloxy oder gegebenenfalls substituiertes Heteroaryloxy ist; und die optionalen Substituenten für das gegebenenfalls substituierte Alkyloxy, gegebenenfalls substituierte cyclische Alkoxy, gegebenenfalls substituierte Alkenyloxy, gegebenenfalls substituierte cyclische Alkenyloxy, gegebenenfalls substituierte Alkinyloxy, gegebenenfalls substituierte cyclische Alkinyloxy und gegebenenfalls substituierte Acyloxy ausgewählt sind aus einem oder mehreren von Halogen, Hydroxy, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Nitro, Amino, C_1-6-Alkylamnio, C_1-6-Dialkylamino, Halogenmethyl, Halogenmethoxy, Acetyl, Aryl, Heteroaryl oder einer cyclischen Alkylgruppe und die optionalen Substituenten für das gegebenenfalls substituierte Aryloxy und das gegebenenfalls substituierte Heteroaryloxy ausgewählt sind aus einem oder mehreren von Halogen, Hydroxy, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Nitro, Amino, C_1-6-Alkylamnio, C_1-6-Dialkylamino, Halogenmethyl, Halogenmethoxy oder Acetyl.
Cyclopentabenzofuranverbindung umfassend eine Gruppe der Formel (ii)
welche mittels eines Sauerstoffatoms an einen Cyclopentabenzofurankern der Formel (i)
angefügt ist und welche die folgenden NMR Spektralcharakteristika aufweist: ¹H NMR (CDCl₃) (ppm) 3,5, s, 3H; 3,61, dd, 10,4, 4,4 Hz, 1H; 3,66, m, 1H; 3,66, s, 3H; 3,72, m; 3,72, s, 3H; 3,78, dd, 11,7, 2,4 Hz, 1H; 3,86, s, 3H; 3,9, dd, 14, 6,8 Hz, 1H; 4,02, t, 11,2 Hz, 1H; 4,12, ddd, 11, 6,8, 2–8 Hz, 1H; 4,28, d, 14 Hz, 1H; 4,60, s, 1H; 5,04, d, 6,8 Hz, 1H; 5,26, s, 1H; 6,29, d, 2 Hz, 1H; 6,45, d, 2 Hz, 1H; 6,69, brd, 9 Hz, 2H; 6,86, m, 2H; 7,06, m, 2H; 7,06, m, 1H; 7,10, brd, 9 Hz, 2H; ¹³C NMR (CDCl₃) (ppm) 50, 52, 55, 55, 55, 55,8, 59,6, 62,5, 67,6, 71,4, 79,6, 92,8, 93,4, 94,3, 95,2, 101,8, 109,4, 112,8, 126,2, 126,6, 127,5, 127,5, 128,9, 136,6, 157,1, 158,8, 159,8, 160,2, 170,7; oder ein Salz, ein Derivat oder ein Prodrug davon, wobei das Prodrug oder Derivat ein Ester, Glycosid, gegebenenfalls substituiertes Alkyloxy, gegebenenfalls substituiertes cyclisches Alkoxy, gegebenenfalls substituiertes Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertes cyclisches Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertes Alkinyloxy, gegebenenfalls substituiertes cyclisches Alkinyloxy, gegebenenfalls substituiertes Acyloxy gemäß der Formel -O-C(O)-R, wobei R eine Alkyl-, cyclische Alkyl-, Alkenyl-, cyclische Alkenyl-, Alkinyl-, cyclische Alkinyl-, Heteroaryl- oder Aryl-Gruppe ist, oder gegebenenfalls substituiertes Aryloxy oder gegebenenfalls substituiertes Heteroaryloxy ist; und die optionalen Substituenten für das gegebenenfalls substituierte Alkyloxy, gegebenenfalls substituierte cyclische Alkoxy, gegebenenfalls substituierte Alkenyloxy, gegebenenfalls substituierte cyclische Alkenyloxy, gegebenenfalls substituierte Alkinyloxy, gegebenenfalls substituierte cyclische Alkinyloxy und gegebenenfalls substituierte Acyloxy ausgewählt sind aus einem oder mehreren von Halogen, Hydroxy, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Nitro, Amino, C_1-6-Alkylamnio, C_1-6-Dialkylamino, Halogenmethyl, Halogenmethoxy, Acetyl, Aryl, Heteroaryl oder einer cyclischen Alkylgruppe und die optionalen Substituenten für das gegebenenfalls substituierte Aryloxy und das gegebenenfalls substituierte Heteroaryloxy ausgewählt sind aus einem oder mehreren von Halogen, Hydroxy, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Nitro, Amino, C_1-6-Alkylamnio, C_1-6-Dialkylamino, Halogenmethyl, Halogenmethoxy oder Acetyl.
Zusammensetzung umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsmittel oder Verdünnungsmittel.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder eines kanzerösen Zustands.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Krebs oder kanzeröse Zustand ausgewählt ist aus Leukämie, Brust-, Dickdarm-, Uterus-, Prostata-, Gehirn-, Lungen-, Eierstock-, Haut-, Leber- und Darm- und Magenkrebs, -tumoren und -melanoma.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Erkrankungsstadiums oder Erkrankungszustands, welches/welcher mit zellulärer Hyperproliferation assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Erkrankungsstadium oder der Erkrankungszustand Atherosklerose, Restenose, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, entzündliche Arthritis, Psoriasis, eine Erkrankung des Zahnfleischs oder viral induzierte zelluläre Hyperproliferation ist.
Verbindung erhältlich durch (a) Behandeln einer Probe gemahlener Rinde von der Baumart Aglaia leptantha mit Methanol; (b) Filtern des sich ergebenden Extrakts und Konzentrieren der sich ergebenden Lösung unter Vakuum; (c) Fraktionieren des sich ergebenden Extrakts mittels Festphasenextraktion auf einer C-18 Varian Extraktionssäule (10 g) unter Verwendung von 0,1% Ameisensäure in Acetonitril/Wasser mit ansteigenden Acetonitrilkonzentrationen; (d) Sammeln des Eluats, welches mit einem Acetonitril/Wasser-Verhältnis von 7:20 erhalten wurde; (e) Konzentrieren der Fraktion aus (d); (f) Chromatographieren des unter Schritt (e) erhaltenen Konzentrats auf einer präparativen C-18 Säule mit einer Flußgeschwindigkeit von 20 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 25% bis 45% Acetonitril in Wasser in 30 Minuten mit 0,1% Ameisensäure; (g) Sammeln und Konzentrieren der Eluate mit Absorptionsmaxima bei 200 und 273 nm und HPLC-Retentionszeiten von etwa 30,67 und 31,05 Minuten; (h) Chromatographieren eines jeden in (g) erhaltenen Eluats auf einer Sephadex LH2O-Säule unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel; Sammlen und Konzentrieren der Fraktionen mit den in Schritt (g) dargestellten Spektraleigenschaften.