DE19835325A1

DE19835325A1 - Verwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten zur Bekämpfung von NF-kB abhängigen Krankheiten

Info

Publication number: DE19835325A1
Application number: DE19835325A
Authority: DE
Inventors: Matthias Gehling; Joerg Baumgarten; Axel Kretschmer; Horst-Peter Antonicek; Peter Proksch; Bambang Wahyu Nugroho; Frank Bohnenstengel
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2000-02-10
Also published as: WO2000007579A3; AU5729099A; US6518274B1; WO2000007579A2; EP1102585A2

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Nuclear Faktor kappaB-abhängigen Krankheiten.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Cyclopentabenzofuran-Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von NF-κB abhängigen Krankheiten.

Extrakte aus der Pflanze Aglaia elliptifolia zeigen antileukämische Eigenschaften. Als erste wirksame Verbindung wurde ein Rocaglamid genanntes Dihydrocyclopentabenzo furanol-Derivat identifiziert (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1982. 1150; US 4 539 414). Daraufhin erschienen mehrere Arbeiten über schließlich auch erfolgreiche Synthese versuche. Erst 10 Jahre nach der Isolierung von Rocaglamid wurden seine insektiziden Eigenschaften beschrieben (Pestic. Sci 36 53 (1992); Phytochemistry 32, 67 (1993)) und darauf in einer anderen Art, Aglaia odorata, noch drei, sich nur in einem Substituenten unterscheidende Derivate gefunden (Phytochemistry 32, 307 (1993)).

Später wurden z. B. aus der Art Aglaia roxburghiana erst vier anellierte Derivate des Rocaglamids isoliert (WO 96/04 284), dann zahlreiche weitere neue Derivate sowie deren pharmakologische Eigenschaften beschrieben (vgl. z. B. J. Nat. Prod 59, 650 (1996); Tetrahedron 52, 6931 (1996); Phytochemistry 44, 1455 (1997); Phytochemistry 45 1579 (1997); Z. Naturforsch., C: Biosci. 52, Tetrahedron 52, 17625 (1997); B. W. Nugroho, Dissertation, Bayer. Julius-Maximilian Univ. Würzburg, 1997, WO 97/08 161 A1).

Ein bedeutender Schritt bei vielen endzündlichen Prozessen ist die Translocation des Proteins "Nuclear Factor kappa B", kurz NF-κB, in den Zellkern und die hierdurch verursachte Stimmulierung der Expression der Gene, deren Produkt für entzündliche Reaktionen verantwortlich sind (Trends Pharmacol. Sci. 8 46 (1997)). Beispiels weise bei Asthma ist die nicht nützliche, übermäßige (nicht selbstbegrenzende) Produktion dieser Proteine für die Verstärkung und Aufrechterhaltung des entzünd lichen Prozesses und die damit verbundenen unangenehmen bis lebensbedrohlichen Symptome dieser Krankheit verantwortlich. Weil die dem heutigen Stand der Technik entsprechende Langzeitbehandlung mit Glucocorticoiden mit einigen Nachteilen behaftet ist, wird NF-κB als ein zwingendes Target gesehen für die Entwicklung von neuen entzündungshemmenden Wirkstoffen gegen Asthma.

Es wurde nun gefunden, daß die Cyclopentabenzofuran-Derivate der Formel (I)

in welcher
[A] R¹für Wasserstoff steht,
R² für Methoxy steht,
R³ für Wasserstoff steht oder
R² und R³ gemeinsam für -OCH₂O- stehen,
R⁴ für Methoxy steht,
R⁵ für Hydroxy oder Acetoxy steht,
R⁶ und R⁷ jeweils für Wasserstoff stehen oder
R⁵ und R⁶ gemeinsam für Sauerstoff (Oxo) oder Hydroxyimino stehen,
R⁸ für -COOR¹² oder -CONR¹³R¹⁴ steht, worin
R¹² und R¹³ für Wasserstoff oder Methyl stehen und
R¹⁴ für Wasserstoff, Methyl, 4-Hydroxypropyl oder 2-Tetrahydro furyl steht oder
R⁵ und R⁸ gemeinsam für eine Gruppe der Formeln (a) oder (b)

stehen, wobei die dem N-Atom benachbarte Verknüpfungsstelle R⁵ entspricht und darüber hinaus R⁶ und R⁷ gemeinsam für eine direkte Bindung stehen,
R⁹ für Phenyl steht,
R¹⁰ für Methoxy steht,
R¹¹ für Wasserstoff, 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R¹⁰ und R¹¹ benachbart und gemeinsam für -OCH₂O- stehen, oder
[B] R¹, R³ und R⁸ jeweils für Wasserstoff stehen,
R² und R⁴ jeweils für Methoxy stehen,
R⁵ für Hydroxy steht,
R⁶ und R⁷ jeweils für Wasserstoff stehen oder
R⁵ und R⁶ gemeinsam für Sauerstoff (Oxo-Gruppe) stehen,
R⁹ für Phenyl steht,
R¹⁰ für Methoxy steht,
R¹¹ für 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R¹⁰ und R¹¹ benachbart und gemeinsam für -OCH₂O- stehen,
geeignet sind als Inhibitoren der Nuclear Factor kappa B (NF-xB)-vermittelten Genexpression zur Therapie pathophysiologischer Prozesse.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe sind aus o. a. Literatur bekannt.

Beispiele für die erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe der Formel (I) sind die Ver bindungen (I-1) bis (I-25) (in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt) sowie (I-26) bis (I-27).

Tabelle 1

Die erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe sind niedermolekulare Inhibitoren, die selektiv Nuclear Factor kappa B (NF-κB)-vermittelte pathophysiologische Prozesse hemmen. NF-κB-vermittelte Prozesse treten bei Entzündungskrankheiten, immuno logischen Erkrankungen, septischem Schock, Transplantatabstoßung, Strahlungs schäden, Reperfusionsverletzungen nach Ischämie, Thrombosen oder bei komplexen, chronisch-entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose auf.

Zur pharmakologischen Wirkung von Inhibitoren des Nuclear Factor kappa B

Nuclear Factor kappa B (NF-κB) ist ein in vielen Gewebezellen und insbesondere in Blutzellen vorkommender dimerer Proteinkomplex. NF-κB nimmt eine besondere Rolle zur Steuerung der Expression von Genen ein, die in ihrer Promotorsequenz eine NF-κB Bindesequenz aufweisen (5'-GGGPuNNPyPyCC-3'). Insofern ist NF-κB ein Transkriptionsfaktor. Die physiologische Aktivität von NF-cB zur Kontrolle der Genexpression unterliegt jedoch einem Regulationsprinzip, bei dem NF-κB aus einem Komplex mit dem Protein IKB freigesetzt wird, um als Transkriptionsfaktor in den Zellkern zur Genaktivierung zu translozieren. Das Regulationsprinzip zur Freisetzung von aktivem NF-κB aus einem Komplex mit dem Protein IκB ist noch nicht in Einzelheiten bekannt.

Ebenso ist nicht bekannt, wie die Bildung von homodimeren und heterodimeren NF- κB Proteinkomplexen erfolgt. NF-κB wirkt als dimerer Transkriptionsfaktor auf die Genaktivierung ein. Die Dimerisierung kann unter den strukturell verwandten Transkriptionsfaktoren Rel A, Rel B, c-Rel, p50 oder p52 erfolgen, die eine Familie von Transkriptionsfaktorproteinen bilden. Auch kann in der Dimerisierung der Untereinheiten zum NF-κB bereits ein Regulationsprinzip zur Steuerung der später näher beschriebenen Gene liegen, das noch nicht bekannt ist.

Ein entscheidendes Merkmal von NF-κB gegenüber anderen Transkriptionsfaktoren ist, daß NF-κB ein primärer Transkriptionsfaktor ist. Primäre Transkriptionsfaktoren sind in inaktiver (meist komplexgebundener) Form bereits in der Zelle vorhanden und werden nach einem entsprechenden Stimulus freigesetzt, um ihre Wirkung sehr schnell entfalten zu können. Primäre Transkriptionsfaktoren werden nicht erst durch die Aktivierung des zugehörigen Gens und anschließende Transkription und Translation gebildet.

Diese Eigenschaft des NF-κB, die Ausbildung homodimerer oder heterodimerer Rel- Proteine sowie die Ausbildung eines inaktiven Proteinkomplexes mit einem IκB Protein, bieten ganz andere Angriffspunkte für pharmakologisch wirksame Substan zen, als die Angriffspunkte der de novo Biosynthese von Transkriptionsfaktoren. Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, daß die Gene zur Bildung von NF-κB (Gene der Rel Familie) und die Gene zur Bildung der IκB Proteine (Genfamilie umfassend die Gene für IκB-α, IκB-β, p105/IκB-γ, p100/IκB-δ, IκB-ε u. a.) ihrerseits natürlich auch einer Regulation unterliegen, die Angriffspunkte für pharmazeutisch wirksame Sub stanzen darstellen können. So ist bekannt, daß die Expression der konstitutiv ge bildeten IrB Proteine p 105 und p 100 durch Stimuli erhöht wird, die auch NF-κB aktivieren, wie z. B. Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) oder Phorbolmyristatacetat (PMA).

Ein Regulationsmechanismus ist in der Literatur beschrieben, in dem gezeigt wird, daß die Überexpression von IκB aktives NF-κB bindet und damit inaktiviert. Dies gilt auch, wenn das NF-κB bereits eine Komplexbindung mit der DNA eingegangen ist (P. A. Baeuerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 2 141-179, 1994). Daraus kann geschlossen werden, daß es mehrere spezifische Angriffspunkte in der biochemischen Funktion von NF-κB und IκB Proteinen gibt, die es ermöglichen sollten, eine unge wünschte, pathophysiologische, NF-κB-abhängige Genaktivierung selektiv zu hemmen.

Eine chemische Verbindung, die selektiv die Funktion von NF-κB hemmt oder die Funktion von IκB Proteinen oder IκB Genen verstärkt, sollte als Pharmazeutikum zur Unterdrückung von NF-κB-vermittelten Krankheitsprozessen Verwendung finden können.

Primär kann NF-κB alle pathophysiologischen Prozesse fördern, an denen Gene beteiligt sind, die in ihrem Promotor die NF-κB Bindesequenz aufweisen. Namentlich sind dies Gene, die bei immunologischen Komplikationen, bei Entzündungskrank heiten, Autoimmunerkrankungen, septischem Schock, Transplantatabstoßung, Thrombosen oder aber auch bei chronisch-entzündlichen Krankheiten wie Arteriosklerose, Arthritis und Rheuma eine entscheidende ursächliche Rolle spielen.

NF-κB Bindesequenzen enthalten z. B. die Promotoren von Rezeptoren lymphoider Zellen (T-Zellrezeptoren), von MHCI- und MHCII-Genen, von Zelladhäsionsmole külen (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1), von Zytokinen und Wachstumsfaktoren (siehe auch nachfolgende Tabelle). Weiterhin finden sich NF-κB Bindesequenzen in den Promotoren von Akutphasenproteinen (Angiotensinogen, Komplementfaktoren u. a.).

Eine chronisch erhöhte oder akut überschießende Aktivierung der genannten Gene führt zu vielfältigen pathophysiologischen Prozessen und Syndromen.

So ist die schnelle und überschießende Produktion von Zytokinen der Entzündungs reaktion (TNFα, Interleukin-6, Interleukin-8 u. a.) und der Adhäsionsmoleküle (ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1) in Leukozyten, insbesondere in Makrophagen und auch in Endothelzellen, ein ursächliches Merkmal für oft tödlich verlaufende Prozesse bei septischem Schock; oder führt bei Strahlungsschäden und bei Transplantat abstoßung zu erheblichen Komplikationen. Hemmstoffe, die die NF-κB-vermittelte Genexpression verhindern, greifen bei einigen Krankheiten sehr floh in die Aus prägung pathophysiologischer Veränderungen ein und können daher ein sehr wirkungsvolles therapeutisches Prinzip darstellen. Ein Beispiel sind auch NF-κB Inhibitoren für Krankheiten, die auf eine Überexpression von Akutphasenproteinen zurückzuführen sind. Eine ungewünschte Überexpression von Akutphasenproteinen kann eine komplexe Allgemeinreaktion hervorrufen, bei der Gewebeschäden ver schiedenster Art, Fieber und lokale Symptome wie Entzündungen und Nekrosen auftreten können. Meist ist das Blutbild verändert. NF-κB induziert zum Beispiel stark das Serum Amyloid A Vorläuferprotein in der Leber im Zuge einer Induktion von Akutphasenproteinen.

Bei anderen Krankheitsbildern wie Gewebeschädigung nach Reperfusion können Hemmstoffe der NF-κB-vermittelten Genexpression ebenfalls einen bedeutenden Therapiefortschritt darstellen. Es gibt Evidenzen, daß durch Oxidationsreaktionen, die zu oxidativem Streß nach Reperfusion von ischämischem Gewebe führen, NF-κB- gesteuerte Gene induziert werden. Auf diese Weise wird eine Uberexpression von Zytokinen und Zelladhäsionsmolekülen im ischämischen Gewebe eine übermäßige Rekrutierung von infiltrierenden Lymphozyten ausgelöst. Die rekrutierten Lymphozy ten tragen ursächlich zur Gewebeschädigung bei.

Ebenso ist die Beteiligung der NF-κB-gesteuerten Genexpression bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen evident. Insbesondere bei Nervenkrankheiten, bei denen der Redoxzustand von Zellen des neuronalen Gewebes gestört ist, wird der selektiven Hemmung von Genen mit NF-κB Bindesequenz ein therapeutischer Nutzen beigemessen. Ein gestörter Redoxzustand neuronaler Zellen wird bei amytropher Lateralsklerose und bei Down-Syndrom angenommen.

Es ist bekannt, daß NF-κB ein häufig anzutreffender Transkriptionsfaktor in neuronalem Gewebe ist und daß NF-κB im Gehirn ein Redoxpotential-gesteuerter Transkriptionsfaktor ist (P. A. Bauerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179, 1994). Ein Aufstellung Der Gene, die durch NF-xB induziert werden ist in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Gene, die durch NF-κB induziert werden (P. A. Bauerle, T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179, 1994)

Immunorezeptoren	Immunoglobulin κ light chain
T cell receptor β
T cell receptor α chain (human)
Major histocompatibility complex class I (H-2K)
β₂-Microglobulin
Invariant chain I
Tissue factor-1
Zelladhäsionsmoleküle	Endothelial leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1)
Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1)
Intercellular cell adhesion molecule 1 (ICAM-1)*
Zytokine und Wachstumsfaktoren	β-Interferon
Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)
Macrophage colony-stimulating actor (M-CSF)
Melanoma growth stimulating activity (groα-γ/MGSA)
Interleukin-2
Interleukin-6
Interleukin-8
TNFα
Lymphotoxin (TNF-β)
Proenkephalin
MPC-1/JE*
Akutphasenproteine	Angiotensinogen
Serum amyloid A precursor
Complement factor B
Complement factor c4
Urokinase-type plasminogen activator*

* Die Bindung von NF-κB an den Promotor des genannten Gens ist noch nicht schlüssig experimentell nachgewiesen.

Neben den bereits genannten Genen, deren Aktivität mit der Freisetzung des NF-κB gesteuert wird und die besonders bei Entzündungsprozessen, septischem Schock und Transplantatabstoßung eine Rolle spielen, seien auch noch NF-κB-gesteuerte Gene in Viren erwähnt und solche, die oncogene zelluläre Veränderungen hervorrufen (Oncogene wie c-myc, c-rel, Melanoma Growth Stimulating Activity MGSA). Auch bei diesen Genen stellt eine selektive Hemmung der NF-κB Bindung ein viel versprechendes, therapeutisch nutzbares Konzept dar. Die Genexpression lympho tropher Viren wie HIV, HTLV und Epstein-Barr Virus wird entweder direkt oder durch NF-κB aktiviert oder in der infizierten Wirtszelle wird NF-κB induziert, was der Virusreplikation förderlich ist. Neben HIV wirkt NF-κB positiv auf die Gen expression im Zytomegalievirus (CMV) und Adenovirus. Auch hier sind antivirale Effekte mit NF-κB Inhibitoren denkbar.

Die Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Stoffe geht aus den nach folgenden Beispielen hervor.

Anwendungsbeispiele Beispiel A Hemmung der NF-κB-vermittelten Genegpression des Tumor Nekrose Faktor-α (TNFα) Gens in menschlichen Monozyten

Der Promotor des humanen TNFα Gens enthält drei NF-κB Bindesequenzen, die als k1, k2 und k3 bezeichnet werden. Die NF-κB Bindesequenzen finden sich im Promotor des TNFα Gens an den Nukleotid-Positionen k1 = -587 bis -577, k2 = -210 bis -202 und k3 = -98 bis -87 und diese DNA Sequenzen binden spezifisch NF-κB (A. E. Goldfield et al., Proc. Natl. Acad. Scri. USA 87 9769-9773, 1990). Lipopoly saccharid oder Phorbolester (wie z. B. Phorbolmyristatacetat) induzieren die NF-κB Freisetzung (M. J. Lenardo et al., Cell 58 227-229, 1989).

Daher wird zum Nachweis der Inhibition der NF-κB-vermittelten TNFα Gen expression durch die hier beschriebenen Substanzen folgender biologischer Test durchgeführt.

Mononukleare Zellen aus Spenderblut werden mit Vacutainer CPT(^TM) Röhrchen (Becton Dickinson and Company, Franidin Lakes, NJ. 07417-1885) isoliert, entsprechend den Vorschriften des Herstellers. Die Vacutainer CPT Röhrchen ent halten 1,0 ml phosphatgepufferte Saline mit 120 USP Einheiten Natriumheparin über 3,0 g eines Polyestergels, das 2,0 ml einer Ficoll-Lösung überschichtet. Nach der Zentriftigation des Spenderbluts werden die Monozyten aus einer Zone oberhalb des Polyestergels genommen und mit einer Zelldichte von 250 × 10⁵ Zellen pro well ind 96-well Mikrotiterplatten für die Zellkultur ausgesät.

Die Zellen werden 4-6 Stunden in Medium RPMI-1640 (Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Dieselstr. 5, 76344 Eggenstein) inkubiert. Anschließend wird der Kulturüberstand abgesaugt, es wird erneut Medium RPMI-1640 hinzugefügt und die zu testenden Substanzen werden in Konzentrationen üblicherweise zwischen 0 µM (Negativ-Kontrolle) und 20 µM zugesetzt. Direkt anschließend wird bakterielles Lipopolysaccharid (LPS), Fa. Sigma-A1drich Chemie GmbH, Grünwalder Weg 30, 82039 Deisenhofen, Best.-Nr.: L 4391, in einer Konzentration von 125 ng/ml zur Stimulierung der NF-κB-vermittelten TNFα Genexpression zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 18 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ Atmosphäre wird aus den Mikrotiterplatten Kulturüberstand entnommen und darin der TNFα Gehalt quantitativ bestimmt mit kommerziell verfügbaren enzymgebundenen Immunosorbentassays (ELISA).

TNFα ELISA zur Konzentrationsbestimmung werden z. B. von Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Grünwalder Weg 30, 82039 Deisenhofen unter der Bezeichnung Human TNFα ELISA Kit, Best.-Nr.: CKH-200A, vertrieben. Entsprechend der Ge brauchsanweisung des Herstellers wird die Konzentration des gebildeten TNFα im Kulturüberstand der Monozytenkultur nach LPS Stimulation mit und ohne Inhibitor substanz quantitativ bestimmt.

Die Ergebnisse der TNFα-Konzentrationsbestimmung werden in einem x-y-Achsen diagramm gegeneinander aufgetragen. Der Graph der y-Koordinaten (TNFα-Konzen tration im Kulturüberstand) und der x-Koordinaten (Konzentration des eingesetzten Inhibitors) erlaubt es, die Hemmung der NF-κB-vermittelten TNFα Synthese in Abhängigkeit von der Konzentration der Inhibitorsubstanz abzulesen. Auf diese Weise kann diejenige Wirkstoftkonzentration des zugesetzten Inhibitors aus dem Diagramm abgelesen werden, die z. B. die TNFα Synthese um 50% hemmt. Diese Wirkstoff konzentration, die eine 50%-ige Hemmung hervorruft, wird effektive Hemmstoff konzentration für 50%-Hemmung (IC₅₀) genannt.

Beispielsweise betragen die Konzentrationen der halbmaximalen TNFα Synthese- Inhibition (IC₅₀) der Verbindung I-2 (aus Tabelle 1) 0,3 µM, bei Verbindung I-15 1,0 µM und bei Verbindung I-21 0,5 µm. Die Verbindungen stellen damit potente Inhibitoren der NF-κB-vermittelten TNFα Synthese dar.

Beispiel B Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression des menschlichen Tissue- Factor Gens in Monozyten

Tissue Factor ist ein membranständiges Protein, das den primären Initiator der Blut- Koagulationskaskade darstellt und eine Schlüsselfunktion bei Herzkreislaufer krankungen wie unstabiler Angina pectoris, akuten Implikationen nach Plaque- Ruptur, Gefäßocclusionen verschiedener Ätiologie, arteriosklerotischen Prozessen und anderen Krankheiten wie septischem Schock oder Krebs einnimmt. Das Tissue Factor Gen wird insbesondere in Monozyten und Endothelzellen durch NF-κB- Aktivierung induziert. Der Promotor des humanen Tissue Factor Gens enthält eine NF-κB Bindestelle, die entscheidend zur Aktivierung des Promotors beiträgt (P. Oeth et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17, 365-374, 1997).

Daher wurde zum weiteren Nachweis der Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression durch die erflndungsgemäßen Inhibitoren folgender biologischer Test durchgeführt:

Das Promotor-Fragment des humanen Tissue Factor Gens, das die NF-κB Binde sequenz enthält, wurde mit Oligonukleotid-Primern der Sequenz 5'-TCC CTC GAG ATC TCC CAG AGG CAA ACT GCC AGA T-3' (5'-Primer der Position -925) und 5'-TCC TCG AGC CAT GGC TAC CAG TTG GGC GGC GAG ATC-3' (3'-Primer enthaltend das ATG-Startcodon der kodierenden Sequenz des Tissue-Factor Gens) durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert und durch eine NcoI-/ XhoI- Kloniening mit dem Luciferase Startcodon im Plasmid pGL3-Basic Vector (Promega Corp. 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711-5399 USA) fusioniert.

Dadurch wird die Expression der Luciferase im so entstandenen rekombinanten Plasmid durch den humanen Tissue Factor Promoter reguliert. Dieses Expressionskonstrukt wurde zur Analyse der DNA-Sequenzierung unterworfen und in die Monozytenzellinie RAW 264.7 (American Type Culture Collection 12301 Parklane Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) transfiziert. Die Transfektion, Selektion und Klon-Analyse erfolgte nach Standardmethoden, wie sie beschrieben sind (siehe Transfection of Mammalian Cells in Culture, L. G. Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sci. Publishing Co., New York 1986). Nach der Selektion von RAW-Klonen, die das Expressionskonstrukt stabil im Genom integriert hatten, wurde eine dieser Transfektanten, genannt RAW-A3, für den Test der Inhibitoren ausgewählt.

Testdurchführung

In 12-well Mikrotiterplatten werden in jede Vertiefung 106 RAW-A3 Zellen ausgesät. Schrittweise wird die Serum-Konzentration in drei Tagen im RPMI Medium von 10% fötalem Kälberserum auf 0,5% und 0,1% Serum-Anteil abgesenkt, um die serum-abhängige Tissue Factor Promotor Aktivierung auf ein Minimum zu senken. Nach 24 Stunden Kultur in Medium mit 0,1% Serum wird der NF-κB Inhibitor zugesetzt und anschließend Serum bis zu einer Konzentration von 15% im Medium zur Promotor-Induktion zugesetzt.

Nach weiteren 6 Stunden wird der Kulturüberstand abgesaugt und die Zellen werden zur Messung der Luciferase-Aktivität gemäß der Vorschrift des "Luciferase Assay System" (Technical Bulletin der Fa. Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711-5399 USA, Produkte E4030, E1483, E1501) verarbeitet. Das Zelllysat wird mit dem Luciferase Assay Substrat inkubiert und in einem Luminometer zur Messung des emittierten Lichts vermessen. Bei einer Auftragung in einem x-y- Achsendiagramm mit dem jeweils emittierten Licht (angegeben in relative light units) als y-Koordinate und den Inhibitorkonzentrationen als x-Koordinaten ergibt sich ein Graph für f(x), bei dem der halbmaximale y-Wert einer Inhibitorkonzentration x zuzuordnen ist, die der Hemmkonzentration IC₅₀ in diesem Test entspricht.

Zum Beispiel beträgt der IC₅₀-Wert der Verbindung I-2 (aus Tabelle 1) 0,4 µM und der Verbindung I-21 4,0 µM. Die NF-κB-vermittelte Expression der Luciferase durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren mit einer Konzentration im unteren mikromolaren oder im submikromolaren Bereich weist auf die hohe Wirksamkeit der Hemmung einer NF-kB-vermittelten Genexpression hin.

Beispiel C Hemmung der NF-κB-vermittelten Genexpression des Tumor Nekrose Faktor-α (TNFα) Gens in menschlichen Monozyten in Abhängigkeit von drei verschiedenen TNFα Synthesestimuli

Die NF-κB-vermittelte Induktion der TNFα-Synthese ist unabhängig von den unterschiedlichen Stimuli, die durch LPS, opsonisiertem Zymosan oder Phorbol myristatacetat (PMA) für die Aktivierung des TNFα Promotors eingesetzt werden (A. Baldwin, Annual Rev. Immunology 14, 649, 1996). Daher sollte der Einsatz der erfindungsgemäßen Inhibitoren auch zu einer vergleichbar starken Hemmung der INFα Synthese führen unabhängig von der Art der Stimulierung der TNFα Synthese.

Die Tests für diesen Nachweis der stimulusunabhängigen Hemmung der TNFα Synthese erfolgten von der Art der Testdurchführung genauso wie es unter Beispiel A beschrieben ist mit dem Unterschied, daß neben LPS als Stimulus auch Zellkulturansätze mit 100 nM PMA oder mit 100 µg/ml opsonisiertem Zymosan stimuliert wurden. Zymosan und Phorbolmyristatacetat (PMA) können von der Firma Sigma, Grünwalder Weg 30, 82041 Deisenhofen, Deutschland unter den Bestell-Nrn. Z4250 und P8139 bezogen werden. Zymosan wird in humanem Serum opsonisiert.

Die erfindungsgemäßen NF-κB-Inhibitoren hemmen unabhängig vom Stimulus mit IC₅₀ Werten im submikromolaren Bereich in vergleichbarer Weise die TNFα Synthese in humanen Monozyten wie es im Beispiel A gezeigt wurde. So ist für Verbindung I-2 der IC₅₀-Wert nach PMA-Stimulus 0,4 µM und nach Zymosan-Stimulus 0,4 µM.

Beispiel D Hemmung der NF-κB vermittleten Genexpression des Adhäsionsproteins ELAM-1 an humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC)

Die Rekrutierung von Leukozyten aus der Blutzirkulation in den extravaskulären Raum ist essentiell bei inflammatorischen Antworten und bei derReparierung von Gewebeschäden. Der Prozeß der Leukozyteneinwanderung beinhaltet mehrere hinter einander geschaltete Schritte. Die initiale Interaktion zwischen Leukozyten und dem Endothel der Blutgefäße wird durch TNF und Il-1 abhängige Expression des Adhäsionsproteins ELAM-1 am Endothel vermittelt. Sie vermittelt das sogenannte Rolling der Leukozyten entlang der Blutgefäßwand. Die transskriptionale Regulation der ELAM-1 Expression ist abhängig sowohl von der Nuclear Faktor-κB (NF-κB) Aktivierung und Bindung am ELAM-1 Promotor als auch von der "AP-1 binding site." MA. Read et al., J. Biol. Chem. Vol. 272. 2753-2761, (1997).

Der Einfluß von Verbindung I-2 auf die Expression von ELAM-1 wurde in zwei unterschiedlichen Testansätzen überprüft. Es wurde in einem funktionellen Ansatz die Adhäsion von humanen Neutrophilen an TNF-α stimulierten HUVEC-Zellen gemessen. Die Expression von ELAM-1 an der Oberfläche der HEVECs wurde mit einem fluoreszenz-markierten ELAM-1 spezifischen monoklonalen Antikörper mittels FACS-(Cell Sorting) Analyse bestimmt.

Versuchsdurchführung ELAM-1 abhängige Neutrophilen-Adhäsion an Endothelzellen

Die Neutrophilen wurden aus menschlichem Blut (100 ml) isoliert. Dazu wurde in einem Zentrifugenbecher 3,5 ml Polyprep vorgelegt und mit 5 ml Blut vorsichtig über schichtet. Nach 30 Minuten Zentrifugieren bei 2100 min^-1 wurde die Neutrophilen bande in der Mitte des Zentrifugenbechers abgesaugt. Nach 1 : 2 Verdünnungen in Endothelial Cell Basal Medium (EBM) Fa. Clonetics wurde wiederum 20 Minuten bei 1000 min^-1 zentrifugiert und anschließend zu einer Zellkonzentration von 10⁶ Zellen/ml aufgenommen.

Die Nabelschnur-Endothelzellen wurden in 96 Well-Mikrotiterplatten in EBM + 10% FCS zur Konfluenz angezogen. Bei Versuchsbeginn wurde das Medium gegen EBM ohne FCS ausgetauscht und anschließend die Versuchssubstanzen eingesetzt. Nach 20 Minuten wurden die HTJVECs mit 10 nM TNF-α stimuliert. Nach 4 Stunden Inkubation wurden gegen 200 µl/Well der Neutrophilensuspension ausgetauscht. Die Neutrophilen wurden vorher 20 Minuten mit einer 25 µM BCESP-Fluoreszenzfarb stoffiösung markiert. Nach 30 Minuten Inkubation wurde die BCECP-Neutrophilen- Lösung mit überschüssigen Neutrophilen abgezogen und gegen 200 µl/Well 0,5%iger NaOH-Lösung ausgetauscht. Die Fluoreszenz der anhaftenden Neutrophilen wurde anschließend im Fluoreszenzphotometer gemessen.

Sowohl die Adhäsion der Neutrophilen an TNF-α stimulierten HIJVECs, als auch die Expression von ELAM-1 an der Zelloberfläche konnte durch die Verbindungen zu 50% inhibiert werden. Die maximale Inhibition der Zelladhäsion wurde mit 10 nM für Verbindung I-2 bestimmt. Die maximale 50%ige Hemmung der ELAM-1 Expression steht in guter Übereinstimmung mit der gleichzeitig NF-κB und AP-1 abhängigen Regulation des ELAM-1-Promotors.

Versuchsdurchführung Quantitative Messung der TNF-induzierten Expression von ELAM-1 in HWECs

Nabelschnur-Endothelzellen (HCUVEC) wurden wie oben beschrieben kultiviert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml TNF in Gegenwart oder Abwesenheit von Testsubstanzen für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aus den Mikrotiterplatten durch Inkubation mit 5 mM EDTA in PBS herausgelöst, für 5 Minuten bei 1000 min^-1 zentrifugiert, und in 100 µl PBS plus 1% Rinderserum Albumin (BSA, Fa. Sigma- Aldrich GmbH, Best. Nr. A7906) in einem Anti-ELAM 1 Antikörper (monoklonaler Antikörper, Fa. Becton and Dickinson, Erembodegem, Belgien, Best. Nr. 550 023, 30 µg/ml) bei RT inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Zellen erneut zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in PBS plus 1% BSA gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das erhaltene Zellpellet in PBS plus 1% BAS und einem Ziege-anti-Maus Antikörper (Fa. Dianova, Raboisen S. Hamburg, Best. Nr. 115-096-062; 30 µg/ml) für die Dauer von 15 Minuten inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren und Waschen wurden die Zellen in 1 ml PBS plus 1% BSA aufgenommen und in einem Flow-Cytometer (Fa. Becton and Dickinson) bei 488 nm vermessen. Gemessen wird mit diesem Verfahren die Intensität der Fluoreszenz in Abhängigkeit von gebundenem anti-ELAM-1-Antikörper pro Zelle. Für jeden Wert wurden 5000 Zellen vermessen.

HUVECs, die mit TNF für 4 Stunden stimuliert wurden, zeigten nach Inkubation mit anti-ELAM-1-Antikörpern deutlich stärkere Floureszenzsignale als Zellen, die dem gegenüber nicht mit TMF inkubiert wurden. Die Verbindung I-2 vermochte diese induzierte Expression von ELAM-1 in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,05 µM und 5 µM signifikant zu inhibieren, die Expression von ELAM-1 wurde allerdings bei keiner der untersuchten Konzentrationen vollständig inhibiert.

Claims

1. Verwendung von Cyclopentabenzofüran-Derivaten der Formel (I)
in welcher
[A] R¹ für Wasserstoff steht,
R² für Methoxy steht,
R³ für Wasserstoff steht oder
R² und R³ gemeinsam für -OCH₂O- stehen,
R⁴ für Methoxy steht,
R⁵ für Hydroxy oder Acetoxy steht,
R⁶ und R⁷ jeweils für Wasserstoff stehen oder
R⁵ und R⁶ gemeinsam für Sauerstoff (Oxo) oder Hydroxyimino stehen,
R⁸ für -COOR¹² oder -CONR¹³R¹⁴ steht, worin
R¹² und R¹³ für Wasserstoff oder Methyl stehen und
R¹⁴ für Wasserstoff, Methyl, 4-Hydroxypropyl oder 2- Tetrahydrofuryl steht oder
R⁵ und R⁸ gemeinsam für eine Gruppe der Formeln (a) oder (b)
stehen, wobei die dem N-Atom benachbarte Verknüpfungsstelle R⁵ entspricht und darüber hinaus R⁶ und R⁷ gemeinsam für eine direkte Bindung stehen,
R⁹ für Phenyl steht,
R¹⁰ für Methoxy steht,
R¹¹ für Wasserstoff, 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R¹⁰ und R¹¹ benachbart und gemeinsam für -OCH₂O- stehen, oder
[B] R¹, R³ und R⁸ jeweils für Wasserstoff stehen,
R² und R⁴ jeweils für Methoxy stehen,
R⁵ für Hydroxy steht,
R⁶ und R⁷ jeweils für Wasserstoff stehen oder
R⁵ und R⁶ gemeinsam für Sauerstoff (Oxo-Gruppe) stehen,
R⁹ für Phenyl steht,
R¹⁰ für Methoxy steht,
R¹¹ für 2-Methoxy oder 2-Rhamnosyl steht, oder
R¹⁰ und R¹¹ benachbart und gemeinsam für -OCH₂O- stehen,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Nuclear Faktor κB-abhängigen Krankheiten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Arzneimittel zur Behandlung von Entzündungskrankheiten, immunologischen Erkran kungen, septischem Schock, Transplantatabstoßung, Strahlungsschäden, Reperfusionsverletzungen nach Ischämie, Thrombosen oder komplexen, chronisch-entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose hergestellt wird.