ES2287599T3 - Tecnica de formacion de imagenes de diagnostico. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para generar una imagen de un sujeto animal humano o no humano animado al que previamente se le ha administrado un agente de constraste, que implica generar una imagen de al menos una parte de dicho sujeto en el cual se ha distribuido dicho agente de contraste, que se caracteriza porque dicho agente de contraste es una composición de materia de fórmula I V-L-R (I) en la que V es un resto vector que tiene afinidad por un receptor de células endoteliales relacionado con la angiogénesis, L es un resto conector o un enlace, y R es un resto detectable, que se caracteriza porque V es un grupo orgánico no peptídico, o V es peptídico y R es una especie macromolecular o en partículas que proporciona una multiplicidad de marcadores detectables en la formación de imágenes in vivo.
Description
Técnica de formación de imágenes de
diagnóstico.
Esta invención se refiere a técnicas de
formación de imágenes de diagnóstico, en las que se pueden formar
imágenes de un estado de enfermedad utilizando un agente de
contraste dirigido. Más en concreto, la invención se refiere al uso
de estos agentes de contraste, en los que el vector de transporte
dirigido se une a receptores asociados con la angiogénesis. Estos
agentes de contraste pueden utilizarse, por tanto, para el
diagnóstico, por ejemplo, de enfermedades malignas, enfermedades
cardíacas, enfermedades relacionadas con la inflamación, artritis
reumatoide y sarcoma de Kaposi.
Pueden formarse nuevos vasos sanguíneos mediante
dos mecanismos: vasculogénesis o angiogénesis. La angiogénesis es
la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante ramificación a
partir de vasos existentes. El estímulo principal para este proceso
puede ser un suministro inadecuado de nutrientes y oxígeno (hipoxia)
a las células en un tejido. Las células pueden responder segregando
factores angiogénicos, de los cuales existen muchos; un ejemplo, al
cual se alude con frecuencia, es el factor del crecimiento
endotelial vascular (VEGF). Estos factores inician la secreción
de enzimas proteolíticas que degradan las proteínas de la membrana
basal, así como inhibidores que limitan la acción de estas enzimas
potencialmente perjudiciales. El otro efecto destacado de los
factores angiogénicos es provocar que las células endoteliales
migren y se dividan. Las células endoteliales que están unidas a la
membrana basal, que forma una lámina continua alrededor de los vasos
sanguíneos en el lado contraluminal, no sufre mitosis. El efecto
combinado de la pérdida de unión y las señales de los receptores de
los factores angiogénicos es provocar que las células endoteliales
se muevan, se multipliquen y también de disposición y, por último,
sinteticen una membrana basal alrededor de los nuevos vasos.
La angiogénesis es notable en el crecimiento y
remodelación de tejidos, incluyendo la curación de heridas y los
procesos inflamatorios. Los tumores deben iniciar la angiogénesis
cuando alcanzan un tamaño de milímetros para mantener su velocidad
de crecimiento. Puesto que la angiogénesis viene acompañada de
cambios característicos en las células endoteliales y su entorno,
este proceso es una diana prometedora para la intervención
terapéutica. La inhibición de la angiogénesis también se considera
una estrategia prometedora para la terapia antitumoral. Las
transformaciones que acompañan a la angiogénesis también son muy
prometedoras para el diagnóstico, siendo un ejemplo obvio las
enfermedades malignas, pero el concepto también puede ser muy
prometedor en la inflamación y en una diversidad de enfermedades
relacionadas con la inflamación, incluyendo la aterosclerosis,
siendo los macrófagos de las lesiones ateroscleróticas tempranas
una fuente potencial de factores angiogénicos. Estos factores
también están implicados en la revascularización de partes
infartadas del miocardio, que se produce si una estenosis se libera
en un corto espacio de tiempo.
La angiogénesis implica a receptores que son
exclusivos de células endoteliales. La superficie de estas células
se remodela en preparación para la migración y se exponen
estructuras crípticas en las que la membrana basal está degradada,
además de una diversidad de proteínas que están implicadas en
realizar y controlar la proteolisis.
En la tabla 1, a continuación, se lista una
serie de receptores/dianas conocidos asociados a la angiogénesis.
En el caso de los tumores, la red de vasos sanguíneos resultante
normalmente está desorganizada, con la formación de angulaciones
agudas y también de anastomosis arteriovenosas. Utilizando los
principios de la administración dirigida descritos en la presente
descripción puede detectarse la angiogénesis mediante la mayoría de
las modalidades de formación de imágenes que se utilizan en
medicina.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Como se indicó anteriormente, muchos trastornos
no deseados están relacionados con la neovascularización o
angiogénesis, el desarrollo o proliferación de nuevos vasos
sanguíneos. Los ejemplos de estos trastornos se listan en la tabla
2, a continuación.
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Las células de la superficie, células
endoteliales, de estos nuevos vasos sanguíneos tienen
concentraciones mayores que las normales de diversos receptores de
la superficie o transmembrana, tales como, por ejemplo, receptores
de tirosina quinasas (RTK), y se ha propuesto utilizar anticuerpos
marcados de forma radiactiva o con cromóforos para dichos
receptores, o análogos marcados de modo similar de ligandos
proteicos naturales para dichos receptores, como un medio para
detectar centros de angiogénesis (véanse, por ejemplo, los
documentos WO95/26364 (Orion), WO96/30046 (Genentech) y WO95/12414
(Repligen)).
Sin embargo, los ligandos peptídicos tienen
relativamente pocos sitios de unión para marcadores detectables
(indicadores), y la unión de indicadores en muchos sitios de estos
ligandos peptídicos afecta a las conformaciones que puede adoptar
el ligando. Otro problema con los péptidos es que a menudo son
inestables in vivo.
Por tanto, sigue habiendo necesidad de
procedimientos para generar imágenes en los que se utilicen agentes
de contraste dirigidos eficaces con afinidades por receptores
asociados con la angiogénesis.
Por tanto, considerada desde un aspecto, la
invención proporciona un procedimiento para generar una imagen de
un sujeto animal humano o no humano animado al que previamente se le
ha administrado un agente de constraste, que implica generar una
imagen de al menos parte de dicho sujeto, que se caracteriza porque
dicho agente de contraste es una composición de materia de fórmula
I
(I)V-L-R
en la que V es un resto vector que
tiene afinidad por un receptor de células endoteliales relacionado
con la angiogénesis, L es un resto conector o un enlace, y R es un
resto detectable, que se caracteriza porque V es un grupo orgánico
no peptídico, o V es peptídico y R es una especie macromolecular o
en partículas que proporciona una multiplicidad de marcadores
detectables en la formación de imágenes in
vivo.
Cuando R es una especie macromolecular o en
partículas que proporciona una multiplicidad de marcadores, éstos
pueden ser marcadores que son detectables de modo individual (por
ejemplo, especies paramagnéticas o radiactivas), o pueden
interaccionar para producir un material detectable, por ejemplo, en
virtud de un fenómeno magnético cooperativo. Los ejemplos de estos
multiindicadores incluyen poliquelatos y especies poliiónicas, y
partículas ferromagnéticas, ferrimagnéticas y
superparamagnéticas.
En muchos casos, la composición de materia de
fórmula I será un compuesto caracterizable. En otros puede ser una
combinación de compuestos enlazados o asociados de otra manera, por
ejemplo conjugados, entre sí. Por conveniencia, la composición de
materia se denomina en lo sucesivo agente.
Los agentes de contraste que comprenden
indicadores que contienen gases se describen en la solicitud de
patente internacional en tramitación junto con la presente nº
PCT/GB97/02958, presentada el 28 de octubre, 1997.
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para generar una imagen de un sujeto animal humano o
no humano (preferiblemente mamífero o aviar) animado al que se le ha
preadministrado un agente de contraste, por ejemplo hacia el
sistema vascular o el tracto gastrointestinal, y generar una imagen
de al menos parte de dicho sujeto en el que se ha distribuido dicho
agente de contraste, por ejemplo, mediante rayos X, MR,
ultrasonido, centellografía, PET, SEPCT, impedancia eléctrica,
modalidades de formación de imágenes ópticas o magnetométricas, que
se caracteriza porque como agente de contraste se utiliza un agente
de fórmula I.
Considerada desde otro aspecto, la invención
proporciona un procedimiento para controlar el efecto del
tratamiento de un sujeto animal humano o no humano con un fármaco
para combatir un trastorno asociado con la angiogénesis, por
ejemplo, un agente citotóxico, implicando dicho procedimiento
detectar la captación de una composición previamente administrada
de fórmula I
(I)V-L-R
en la que V es un resto vector que
tiene afinidad por un receptor de células endoteliales relacionado
con la angiogénesis, L es un resto conector o un enlace, y R es un
resto detectable, que se caracteriza porque V es un grupo orgánico
no peptídico, o V es peptídico y R es una especie macromolecular o
en partículas que proporciona una multiplicidad de marcadores
detectables en la formación de imágenes in vivo, mediante
receptores de células endoteliales relacionados con la angiogénesis,
mediante la generación de una imagen de al menos parte de dicho
sujeto, siendo realizadas dicha administración y detección de forma
opcional pero preferiblemente de manera repetida, por ejemplo,
antes, durante y después del tratamiento con dicho
fármaco.
Los agentes de fórmula I tienen tres componentes
característicos: un vector (V); un conector (L); y un indicador
(R). El vector debe tener la capacidad de dirigir el compuesto a una
región de angiogénesis, el indicador debe ser detectable en un
procedimiento de formación de imágenes de diagnóstico in
vivo, y el conector debe acoplar el vector al indicador, al
menos hasta que el indicador se haya transportado a la región de
angiogénesis y preferiblemente hasta que el procedimiento de
formación de imágenes se haya completado.
Como vector puede utilizarse cualquier compuesto
peptídico o, más preferiblemente, no peptítico que tenga afinidad
por los receptores asociados con la angiogénesis.
Se utilizan preferiblemente compuestos no
peptídicos porque los vectores peptídicos, en general, tienen poca
estabilidad biológica y pueden provocar respuestas no deseadas en el
cuerpo.
Preferiblemente, el vector es un compuesto que
no produce una respuesta biológica inaceptable, en especial que no
estimule de hecho la angiogénesis.
Se prefiere en particular que el vector sea un
inhibidor de la angiogénesis, se prefiere en especial un inhibidor
de la angiogénesis no peptídico.
Los ejemplos de inhibidores de la angiogénesis
no peptídicos se describen en los documentos WO94/17084 (British
Biotech), EP-A-618208 (Daiichi),
WO94/13277 (ICRT), WO95/06473 (Nipón Kayaku), WO94/21612 (Otsuka),
WO97/37655 (Merck), WO97/30035 (Zeneca),
EP-A-678296 (Tsumura), WO94/18967
(Harvard), WO95/08327 (Dept. of Health and Human Services) (véase
también el documento US-A-4590201
(Merck)) y EP-A-652000 (Eli
Lilly).
Los ejemplos de inhibidores de la angiogénesis
peptídicos se describen en los documentos WO94/02446 (British
Biotech), WO94/02447 (British Biotech), WO94/21625 (British
Biotech), WO94/24140 (British Biotech), WO95/
04033 (Celltech), EP-A-589719 (Eli Lilly), US-A-5399667 (Frazier), EP-A-241830 (The General Hospital Corporation) y WO97/38009 (Merck).
04033 (Celltech), EP-A-589719 (Eli Lilly), US-A-5399667 (Frazier), EP-A-241830 (The General Hospital Corporation) y WO97/38009 (Merck).
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Los inhibidores de la angiogénesis concretos que
se están desarrollando incluyen los listados en la tabla 3, a
continuación:
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así como los siguientes compuestos
de fármacos peptídicos y no
peptídicos:
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Otros compuestos conocidos capaces de dirigirse
a regiones de angiogénesis se listan en la tabla 4, a
continuación:
De forma similar, los compuestos descritos en el
documento WO95/08327 pueden utilizarse como vectores (véase también
Kohn et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
92:1307-1311 (1995), y J. Clin. Oncol.,
15:1985-1993 (1997)).
Los ejemplos concretos de compuestos vectores
descritos en algunas de las publicaciones de patentes mencionadas
anteriormente son los siguientes:
El documento WO95/08327 (Dept. of Health and
Human Services) describe compuestos inhibidores de la angiogénesis
de fórmula I y II:
(I)Y-(CH_{2})_{p}-Ar^{1}-X-Ar^{2}
en la que Ar^{1} y Ar^{2} son
grupos aromáticos y pueden ser diferentes o el mismo; y X es un
grupo conector, por ejemplo, O, S, SO_{2}, CO, CHCN, alquilo,
alcoxi o alcoxialquilo,
y
en la que A es N o CH, R1 es H,
-CONH, -CONHR^{5}, COOH, -COOR^{5}, SO_{2}NH_{2}; R2 es H,
NH_{2}, NHCOPh, -NHCOR^{5}, -NHCHO, -NHR^{5},
-N(R^{5})_{2}; y R^{5} es alquilo con
1-6 carbonos, por
ejemplo
El documento WO95/06473 (Nippon Kayaku Kabushiki
Kasai) describe compuestos antitumorales e inhibidores de la
angiogénesis de fórmula 1 y 2:
en la que X es O, COO; y M es un
metal de transición,
y
en la que X_{1} y X_{2} son
grupos fenilo o naftilo sustituidos o no sustituidos; Y_{1} e
Y_{2} son átomos de halógeno, grupos amino o grupo amino mono- o
disustituidos; y Z es NHC_{2}H_{4}NH, o un resto diamina
aromático sustituido o no sustituido, por
ejemplo
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El documento WO95/04033 (Celltech Limited)
describe los siguientes inhibidores de la angiogénesis:
en los que R^{1}
=
R3 es H, halógeno o CH_{3},
CF_{3} o OCH_{3}; R2 es H o CH_{3}, por ejemplo,
N^{4}-hidroxi-N^{1}-(1-(S)-carbamoil-2,2-dimetilpropil)-2-(R)-4-(clorofenil)succinamida;
N^{4}-hidroxi-N^{1}-(1-(S)-carbamoil-2,2-dimetilpropil)-2-(R)-(4-metilfenilpropil)-
succinamida; N^{4}-hidroxi-N^{1}-(1-(S)-carbamoil-2,2-dimetilpropil)-2-(R)-(4-metoxifenilpropil)succinamida; y N^{4}-hidroxi-N^{1}-(1-(S)-carbamoil-2,2-dimetilpropil)-2-(R)-(4-trifluorometilfenilpropil)succinamida.
succinamida; N^{4}-hidroxi-N^{1}-(1-(S)-carbamoil-2,2-dimetilpropil)-2-(R)-(4-metoxifenilpropil)succinamida; y N^{4}-hidroxi-N^{1}-(1-(S)-carbamoil-2,2-dimetilpropil)-2-(R)-(4-trifluorometilfenilpropil)succinamida.
El documento EP 241830 (The General Hospital
Corporation) describe la purificación del factor del crecimiento
derivado de hepatoma (HDGF), que es un mitógeno endotelial y un
potente factor angiogénico. También se describe el uso de HDGF para
controlar la angiogénesis y para detectar tumores hepáticos
cancerosos mediante el uso de un ensayo de inmunodiagnóstico. El
fragmento peptídico de HDGF tiene una secuencia de aminoácidos
N-terminal en la que los primeros 16 aminoácidos
son:
leu-pro-ala-leu-pro-glu-asp-gly-gly-xx-gly-ala-phe-pro-pro-gly
(xx = resto aminoácido no identificado)
También se describe un fragmento peptídico de
HDGF que tiene una extensión de secuencia de aminoácidos
N-terminal que comprende:
(ala/ser)-(leu/arg)-pro-(ala/gly)-(leu/pro)-ala-gly-thr-met-ala-(ala)-gly-ser-(isoleu)-thr-thr-leu
El documento EP 652000 (Eli Lilly and Company)
describe un inhibidor de la angiogénesis y compuestos inhibidores
de la enfermedad angiogénica que tienen la formula:
en la que R1 y R3 son H, Me,
-C(O)-(alquilo C_{1}-C_{6}),
-C(O)Ar; Ar es fenilo opcionalmente sustituido; y R2
es pirrolidino o piperidino, por
ejemplo
El documento EP 652000 [589719?] (Eli Lilly and
Company) describe el factor plaquetario-4 modificado
que tiene la secuencia de aminoácidos:
MPF-4
- \quad
- NH_{2}-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln- Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys- Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH
\vskip1.000000\baselineskip
CPF-4
- \quad
- NH_{2}-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln- Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys- Leu-Leu-Glu-Ser-COOH unido mediante enlace disulfuro a una segunda proteína que tiene la secuencia de aminoácidos NH_{2}-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH. Existen puentes disulfuro entre Cys-20 de MPF-4 y Cys-10 de dicha segunda proteína, y entre Cys-36 de MPF-4 y Cys-12 de dicha segunda proteína.
El documento WO94/13277 (Imperical Cancer
Research Technology Limited) describe el uso de compuestos de
fórmula I:
en la que R1 a R4 son cada uno
independientemente uno o más de -X, N_{3}, -NO_{2}, halógeno,
trifluorometilo, R^{5}, OR^{5}, -CH_{2}OR^{6}, -OCOR^{5},
-CH_{2}OCOR^{5}, -NHCOR^{5}, -CH_{2}NHCOR^{5},
-NR^{5}R^{6}, CH_{2}NR^{5}R^{6}, -CH_{2}NO_{2},
CONR^{5}R^{6}, CH_{2}CONR^{5}R^{6}, -COOR^{5},
-CH_{2}COOR^{5}, -CHO y CH_{2}CHO, y -X es independientemente
-SO_{3}R^{5}, -CH_{2}PO_{3}R^{5}R^{6},
-CH_{2}SO_{3}R^{5}, -OSO_{3}R^{5}, -CH_{2}OSO_{3}R^{5}, -NHSO_{3}R^{5}, -CH_{2}NHSO_{3}R^{5}, OPO_{3}R^{5}R^{6}, -CH_{2}OPO_{3}R^{5}R^{6} y -PO_{3}R^{5}R^{6}, en los que R^{5} y R^{6} se eligen independientemente de -H y alquilo inferior, y en la que A es un grupo químico que comprende al menos 5 y no más de 30 enlaces que unen directamente los grupos naftilo, con la condición de que (i) el compuesto no es suramina, y (ii) cuando A no es
-CH_{2}SO_{3}R^{5}, -OSO_{3}R^{5}, -CH_{2}OSO_{3}R^{5}, -NHSO_{3}R^{5}, -CH_{2}NHSO_{3}R^{5}, OPO_{3}R^{5}R^{6}, -CH_{2}OPO_{3}R^{5}R^{6} y -PO_{3}R^{5}R^{6}, en los que R^{5} y R^{6} se eligen independientemente de -H y alquilo inferior, y en la que A es un grupo químico que comprende al menos 5 y no más de 30 enlaces que unen directamente los grupos naftilo, con la condición de que (i) el compuesto no es suramina, y (ii) cuando A no es
en la que m y n son
independientemente 0, 1 ó 2, entonces al menos uno de R1 a R4 es -OH
o un grupo ácido; y las sales farmacéuticamente aceptables,
ésteres, sales de dichos ésteres o amidas de dichos
compuestos.
También se describen compuestos en los que el
enlace de A al anillo naftilo se realiza a través de un grupo amida
o sulfonamida. Además, A puede ser, en algunos casos, un grupo de
fórmula II. A también puede seleccionarse de grupos alquilo de
cadena lineal o ramificada, grupos arilo, grupos alquilarilo, ácidos
dicarboxílicos alifáticos, polienos y sus derivados, y polioles y
sus derivados. Otros compuestos tienen las fórmulas:
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El documento EP 678296 (Tsumura & Co.)
describe inhibidores de la angiogénesis de fórmula general:
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por
ejemplo
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El documento WO94/18967 (President and Fellows
of Harvard College) describe una clase de imidazoles que inhiben la
angiogénesis:
\newpage
El documento
EP-A-618208 (Daiichi Pharmaceutical)
describe compuestos de fórmula:
por
ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
El documento WO94/02446 (British Biotechnology
Limited) describe compuestos de fórmula:
por
ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El documento WO94/02447 (British Biotechnology
Limited) describe compuestos de fórmula:
por
ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
El documento WO94/21625 (British Biotechnology
Limited) describe compuestos de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
por
ejemplo
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\newpage
El documento WO94/24149 (British Biotechnology
Limited) describe compuestos de fórmula (I):
en la que X es -CONHOH o COOH, que
se caracterizan principalmente por la presencia en el sustituyente
R3 y/o R4 de un grupo de fórmula
(II)
por
ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores particularmente preferidos incluyen
derivados de aminoácidos tales como los descritos en el documento
WO94/02446, derivados de ácido hidroxámico tales como los descritos
en el documento WO94/02447, tiazolopirimidinas tales como las
descritas en el documento
EP-A-618208, triazoles tales como
los descritos en el documento WO95/08327, quinazolinas tales como
las descritas en el documento WO97/30035, isoindolonas tales como
las descritas en el documento WO97/37655, inhibidores de
integrinas, antagonistas de VEGF, antagonistas de bFGF,
trombospondina y fragmentos de trombospondina, CD36 y factores del
crecimiento (por ejemplo, VEGF, bFGF, etc.).
\newpage
También puede utilizarse CAM-D y
otras técnicas de identificación y evaluación de candidatos como se
mencionó anteriormente para descubrir o evaluar otros vectores
candidatos peptídicos o no peptídicos.
También es posible obtener moléculas que se unen
específicamente a receptores asociados con la angiogénesis mediante
la selección directa de bancos moleculares. La selección de bancos
peptídidos también puede utilizarse para identificar estructuras
peptídicas que, en general, son eficaces, a partir de las cuales
pueden generarse análogos no péptidicos mediante química
convencional o combinatoria. Los restos de unión identificados de
esta manera pueden acoplarse a una molécula de conector,
constituyendo una herramienta general para unir cualquier molécula
(o moléculas) vector al indicador.
Las moléculas vector pueden generarse a partir
de bancos combinatorios sin conocer necesariamente la diana
molecular exacta, mediante la selección funcional (in vitro, ex
vivo o in vivo) para descubrir moléculas que se unan a
la región/estructura de la cual se va a generar una imagen.
Como se mencionó anteriormente, los agentes de
fórmula I comprenden restos vectores, conectores e indicadores. Un
resto conector puede actuar para conectar un vector a un indicador;
como alternativa, puede conectar más de un vector y/o más de un
indicador. De forma similar, un indicador o un vector puede estar
conectado a más de un conector. La utilización, de esta manera, de
una pluralidad de indicadores (por ejemplo, varios restos
conectores-indicadores unidos a un vector, o varios
indicadores unidos a un conector que, a su vez, está unido a un
vector) puede permitir que aumente la detectabilidad del agente de
contraste (por ejemplo, aumentando la radioopacidad, ecogenicidad o
atenuación), o puede permitir su detección en más de una modalidad
de formación de imágenes. La utilización, de esta manera, de una
pluralidad de indicadores puede aumentar la eficacia de transporte
dirigido del agente de contraste, o puede hacer que el agente de
contraste sea capaz de dirigirse a más de un sitio, por ejemplo,
receptores diferentes para un agente que tiene heterogeneidad de
receptores. Así, por ejemplo, el agente de fórmula I puede incluir
restos vectores con sitios de afinidad diferentes de los receptores
asociados a la angiogénesis, por ejemplo, con afinidades por
superficies celulares en las superficies de las paredes de
conductos corporales. Por consiguiente, el agente puede incluir
vectores, tales como fragmentos de anticuerpos y oligopéptidos, por
ejemplo, que contengan RGD o motivos peptídicos de unión a la
superficie celular análogos (por ejemplo, como se describe en el
documento EP-A-422937 y
EP-A-422938 (Merck)) u otros
vectores, tal como se describe en el documento GB 9700699.3. Estos
vectores extra también pueden seleccionarse de cualquiera de las
moléculas que, en la naturaleza, se concentran en un órgano, tejido,
célula o grupo de células diana seleccionados, o cualquier otro
emplazamiento en el cuerpo de un mamífero, in vivo. Éstos
pueden incluir aminoácidos, oligopéptidos (por ejemplo,
hexapéptidos), unidades de reconocimiento molecular (MRU),
anticuerpos de cadena sencilla (SCA), proteínas, moléculas orgánicas
no peptídicas, fragmentos Fab, y anticuerpos. Los ejemplos de
moléculas dirigidas a sitio incluyen polisacáridos (por ejemplo, CCK
y hexapéptidos), proteínas (tales como lectinas, asialofetuína, IgG
policlonal, proteínas coagulantes de la sangre (por ejemplo,
hirudina), lipoproteínas y glicoproteínas), hormonas, factores del
crecimiento, factores coagulantes (tales como PF4), fragmentos de
fibrina polimerizados (por ejemplo, E_{1}), proteínas del
precursor amiloide sérico (SAP), precursores de lipoproteínas de
baja densidad (LDL), albúmina sérica, proteínas de la superficie de
eritrocitos intactos, moléculas de unión a receptores, tales como
estrógenos, proteínas/polímeros específicos del hígado, tales como
galactosil-neoglicoalbúmina (NGA) (véase Vera et
al. en Radiology, 151:191 (1984)), copolímeros de
N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA) con
un número variable de galactosaminas unidas (véase Duncan et
al., Biochim. Biophys. Acta, 880:62 (1986)), y alil- y
6-aminohexilglicósidos (véase Wong et al.,
Carbo. Res., 170:27 (1987)), y fibrinógeno. La proteína dirigida a
sitio también puede ser un anticuerpo. La elección del anticuerpo,
en particular la especificidad de antígeno del anticuerpo, dependerá
del sitio diana previsto concreto para el agente. Se prefieren los
anticuerpos monoclonales frente a los anticuerpos policlonales. La
preparación de anticuerpos que reaccionan con un antígeno deseado es
muy conocida. En el mercado se encuentran disponibles preparaciones
de anticuerpos de una diversidad de fuentes. El fragmento de
fibrina E_{1} puede prepararse como se describe en Olexa et
al. en J. Biol. Chem., 254:4925 (1979).
La preparación de precursores de LDL y proteínas SAP se describe en de Beer en J. Immunol. Methods, 50:17 (1982).
La preparación de precursores de LDL y proteínas SAP se describe en de Beer en J. Immunol. Methods, 50:17 (1982).
Se prefiere especialmente que estos vectores
extra se unan de forma que frenen, pero no eviten, el movimiento
del agente en la corriente sanguínea, y para que lo anclen en su
sitio cuando esté unido a un sitio de receptor asociado con la
angiogénesis.
Pueden emplearse grupos funcionales (por
ejemplo, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos carboxi, grupos
tiol, etc.) en el compuesto vector para la unión del vector al
resto conector, o directamente al resto indicador, por ejemplo,
utilizando técnicas de acoplamiento químico convencionales.
Cuando el vector es un compuesto peptídico, el
indicador es un multiindicador, por ejemplo, un poliquelante
metalizado (preferiblemente un poliquelante dendrimétrico), una
partícula magnética (preferiblemente superparamagnética), una
vesícula que contiene partículas de contraste eficaz o una
disolución de moléculas de contraste eficaz, una especie poliiónica
(por ejemplo, un polímero que porta una multiplicidad de grupos
iónicos, preferiblemente grupos aniónicos, por ejemplo, un polímero
de carboxilato, fosfato o sulfonato).
Cuando el vector es no peptídico, el indicador
puede ser un multiindicador o, como alternativa, puede comprender
uno o un número pequeño (por ejemplo, hasta 10) marcadores
detectables, por ejemplo, iones metálicos paramagnéticos quelados,
radioisótopos quelados o unidos covalentamente, y cromóforos (o
fluoróforos, etc.). Cuando el indicador es o comprende un
radionúclido unido covalentemente, éste es preferiblemente un
radionúclido de yodo, en lugar de un átomo de tritio o
^{13}C.
Puede emplearse una amplia variedad de
conectores, incluyendo conectores biodegradables y biopolímeros.
El componente conector del agente de contraste
es, en su forma más simple, un enlace entre el resto vector e
indicador. Sin embargo, más en general, el conector proporciona un
esqueleto mono- o multimolecular que enlaza, covalente o no
covalentemente, uno o más vectores a uno o más indicadores, por
ejemplo un esqueleto molecular lineal, cíclico, ramificado o
reticulado, o un agregado molecular, con grupos dentro de la
estructura o colgantes que se unen, covalente o no covalentemente,
por ejemplo, de forma coordinada, con los restos vector e
indicador, o que encapsula, atrapa o ancla dichos restos.
Por tanto, puede lograrse la unión de una unidad
de indicador con un vector deseado por medios covalentes o no
covalentes, que normalmente implica la interacción con uno o más
grupos funcionales localizados sobre el indicador y/o vector. Los
ejemplos de grupos funcionales químicamente reactivos que pueden
emplearse para este fin incluyen grupos amino, hidroxilo,
sulfihidrilo, carboxilo y carbonilo, así como grupos carbohidrato,
dioles vecinales, tioéteres, 2-aminoalcoholes,
2-aminotioles, guanidinilo, imidazolilo y grupos
fenólicos.
Por tanto, el acoplamiento covalente del
indicador y vector puede realizarse utilizando agentes conectores
que contengan restos reactivos capaces de reaccionar con dichos
grupos funcionales. Los ejemplos de restos reactivos capaces de
reaccionar con grupos sulfihidrilo incluyen compuestos de
\alpha-haloacetilo de tipo
X-CH_{2}CO- (en el que X = Br, Cl o I), que
muestren una reactividad particular con grupos sulfihidrilo, pero
que también se pueden utilizar para modificar los grupos
imidazolilo, tioéter, fenol y amino, como se describe en Gurd,
F.R.N. en Methods Enzymol. (1967), 11:532. También se considera que
los derivados de N-maleimida son selectivos para
grupos sulfihidrilo, pero también pueden ser útiles para acoplar
grupos amino bajo ciertas condiciones. Reactivos tales como
2-iminotiolano, por ejemplo, como se describe en
Traut, R. et al. en Biochemistry (1973), 12:3266, que
introducen un grupo tiol mediante la conversión de un grupo amino,
pueden considerarse como reactivos de sulhidrilo si el enlace se
produce a través de la formación de puente disulfuro. Por tanto,
los reactivos que introducen enlaces disulfuro reactivos en el
indicador o en el vector pueden ser útiles, puesto que la unión
puede lograrse mediante un intercambio disulfuro entre el vector y
el indicador; los ejemplos de estos reactivos incluyen el reactivo
de Ellman (DTNB), 4,4'-ditiopiridina, disulfuro de
metil-3-nitro-2-piridilo,
y disulfuro de metil-2-piridilo
(descrito por Kimura, T. et al. en Analyt. Biochem. (1982),
122:271).
Los ejemplos de restos reactivos capaces de
reaccionar con grupos amino incluyen agentes alquilantes y
acilantes. Los agentes alquilantes representativos incluyen:
i) compuestos de
\alpha-haloacetilo, que muestran especificidad por
grupos amino en ausencia de grupos tiol reactivos, y son del tipo
X-CH_{2}CO- (en el que X = Cl, Br o I), por
ejemplo, como se describe en Wong, Y-H.H. en
Biochemistry (1979), 24:5337;
ii) derivados de N-maleimida,
que pueden reaccionar con grupos amino a través de una reacción de
tipo Michael, o a través de una acilación mediante la adición al
grupo carbonilo del anillo, como se describe en Smyth, D.G. et
al. en J. Am. Chem. Soc. (1960), 82:4600, y Biochem. J. (1964),
91:589;
iii) haluros de acilo, tales como compuestos
nitrohaloaromáticos reactivos;
iv) haluros de alquilo, como se describe en
McKenzie, J.A. et al. en J. Protein Chem. (1988), 7:581;
v) aldehídos y cetonas capaces de la formación
de bases de Schiff con grupos amino, estabilizándose los aductos
formados normalmente a través de una reducción para producir una
amina estable;
vi) derivados epoxídicos, tales como
epiclorohidrina y bisoxiranos, que pueden reaccionar con grupos
amino, sulfhidrilo o hidroxilo fenólico;
vii) derivados que contienen cloro de
s-triazinas, que son muy reactivos con nucleófilos,
tales como grupos amino, sulfhidrilo e hidroxi;
viii) aziridinas basadas en compuestos de
s-triazina detallados anteriormente, por ejemplo,
como se describe en Ross, W.C.J. en Adv. Cancer Res. (1954),
2:1, que reaccionan con nucleófilos, tales como los grupos amino
mediante la apertura del anillo;
ix) ésteres dietílicos del ácido escuárico, como
se describe en Tietze, L.F. en Chem. Ber. (1991), 124:1215; y
x) éteres de
\alpha-haloalquilo, que son agentes alquilantes
más reactivos que los haluros de alquilo normales debido a la
activación provocada por el átomo de oxígeno etéreo, por ejemplo,
como se describe en Benneche, T. et al. en Eur. J. Med.
Chem. (1993), 28:463.
\newpage
Los agentes acilantes reactivos con amino
representativos incluyen:
i) isocianatos e isotiocianatos, en particular
derivados aromáticos, que forman derivados de urea y tiourea
estables, respectivamente, y que se han utilizado para el
entrecruzamiento de proteínas, como se describe en Schick, A.F.
et al. en J. Biol. Chem. (1961), 236:2477;
ii) cloruros de sulfonilo, que se han descrito
en Herzig, D.J. en Biopolymers (1964), 2:349, y que pueden ser
útiles para la introducción de un grupo indicador fluorescente en el
conector;
iii) haluros de ácido;
iv) ésteres activos, tales como
nitrofenilésteres o ésteres de
N-hidroxisuccinimidilo;
v) anhídridos de ácido, tales como
N-carboxianhídridos, mixtos o simétricos;
vi) otros reactivos útiles para la formación de
enlaces amida como se describe en Bodansky, M. et al. en
"Principles of Peptide Síntesis" (1984),
Springer-Verlag;
vii) acilazidas, por ejemplo, en las que el
grupo azida se genera a partir de un derivado de hidracida
preformado utilizando nitrito de sodio, por ejemplo, como se
describe en Wetz, K. et al. en Anal. Biochem. (1974),
58:347;
viii) azlactonas unidas a polímeros, tales como
bisacrilamida, por ejemplo, como se describe en Rasmussen, J.K. en
Reactive Polymers (1991), 16:199; y
ix) imidoésteres, que forman aminidas estables
tras la reacción con grupos amino, por ejemplo, como se describe en
Hunter, M.J. y Ludwig, M.L. en J. Am. Chem. Soc. (1962),
84:3491.
Los grupos carbonilo, tales como funciones
aldehído, pueden hacerse reaccionar con bases proteicas débiles a
un pH tal que se protonen las funciones de la cadena lateral
nucleofílicas de la proteína. Las bases débiles incluyen
1,2-aminotioles, tales como los que se encuentran en
restos cisteína N-terminales, que forman, de manera
selectiva, anillos tiazolidina de 5 miembros estables con grupos
aldehído, por ejemplo, como se describe en Ratner, S. et al.
en J. Am. Chem. Soc. (1937), 59:200. Pueden emplearse otras bases
débiles, tales como fenilhidrazonas, por ejemplo, como se describe
en Heitzman, H. et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974),
71:3537.
Los aldehídos y las cetonas también pueden
hacerse reaccionar con aminas para formar bases de Schiff, que
pueden estabilizarse, de manera ventajosa, mediante una aminación
reductora. Los restos alcoxilamino reaccionan con facilidad con
cetonas y aldehídos para producir alcoxaminas estables, por ejemplo,
como se describe en Webb, R. et al. en Bioconjugate Chem.
(1990), 1:96.
Los ejemplos de restos reactivos capaces de
reaccionar con grupos carboxilo incluyen compuestos diazoicos,
tales ésteres de diazoacetato y diazoacetamidas, que reaccionan con
alta especificidad para generar grupos éster, por ejemplo, como se
describe en Herriot, R.M. en Adv. Protein Chem. (1947), 3:169.
También se pueden emplear, de forma útil, reactivos modificadores
de ácido carboxílico, tales como carbodiimidas, que reaccionan a
través de la formación de O-acilurea, seguido de la
formación de enlaces amida; la unión puede facilitarse mediante la
adición de una amina, o puede producir el acoplamiento directo del
vector-receptor. Las carbodiimidas solubles en agua
útiles incluyen
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida
(CMC) y
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC), por ejemplo, como se describe en Zot, H.G. y Pret, D. en J.
Biol. Chem. (1989), 264:15552. Otros reactivos modificadores de
ácido carboxílico útiles incluyen derivados de isoxazolio, tales
como reactivo K de Woodward; cloroformiatos, tales como
p-nitrofenilcloroformiato; carbonildiimidazoles,
tales como 1,1'-carbonildiimidazol; y
N-carbalcoxidihidroquinoleínas, tales como
N-(etoxicarbonil)-2-etoxi-1,2-dihidroquinoleína.
Otros restos reactivos potencialmente útiles
incluyen dionas vecinales, tales como
p-fenilendiglioxal, que pueden emplearse para que
reaccionen con grupos guanidinilo, por ejemplo, como se describe en
Wagner et al. en Nucleic Acid Res. (1978), 5:4065; y sales
de diazonio, que pueden sufrir reacciones de sustitución
electrófila, por ejemplo, como se describe en Ishizaka, K. e
Ishizaka, T. en J. Immunol. (1960), 85:163. Los compuestos de
bis-diazonio se preparan con facilidad mediante el
tratamiento de arildiaminas con nitrito de sodio en disoluciones
ácidas. Se apreciará que los grupos funcionales en el indicador y/o
el vector pueden convertirse, si se desea, en otros grupos
funcionales antes de la reacción, por ejemplo, para conferir aún más
reactividad o selectividad. Los ejemplos de procedimientos útiles
para este fin incluyen la conversión de aminas en ácidos
carboxílicos utilizando reactivos tales como anhídridos
dicarboxílicos; la conversión de aminas en tioles utilizando
reactivos tales como tiolactona de
N-acetilhomocisteína, anhídrido
S-acetilmercaptosuccínico,
2-iminotiolano o derivados de succinimidilo que
contienen tiol; la conversión de tioles en ácidos carboxílicos
utilizando reactivos tales como
\alpha-haloacetatos; la conversión de tioles en
aminas utilizando reactivos tales como etilenimina o
2-bromoetilamina; la conversión de ácidos
carboxílicos en aminas utilizando reactivos tales como
carbodiimidas, seguido de diaminas; y la conversión de alcoholes en
tioles utilizando reactivos tales como cloruro de tosilo, seguido
de una tranesterificación con tioacetato y una hidrólisis con
acetato de sodio para producir el tiol.
\newpage
El acoplamiento del
vector-indicador también puede efectuarse utilizando
enzimas, tales como agentes de entrecruzamiento de longitud cero;
así, por ejemplo, se ha utilizado transglutaminasa, peroxidasa y
xantina oxidasa para producir productos entrecruzados. También
puede utilizarse una proteolisis inversa para el entrecruzamiento a
través de la formación de enlaces amida.
El acoplamiento no covalente del
vector-indicador puede efectuarse, por ejemplo,
mediante interacciones de cargas electrostáticas, mediante
quelación en forma de complejos metálicos estables, o mediante
interacción de unión de alta afinidad.
Un vector que se acopla a un conector peptídico,
de lipooligosacárido o de lipopéptido que contenga un elemento
capaz de mediar en la inserción en la membrana también puede ser
útil. Un ejemplo se describe en Leenhouts, J.M. et al. en
Febs. Letters (1995), 370(3):189-192.
El acoplamiento también puede lograrse
utilizando avidina o estreptavidina, que tienen cuatro sitios de
unión de alta afinidad para la biotina. Por tanto, la avidina puede
emplearse para conjugar el vector al indicador, si tanto el vector
como el indicador están biotinilados. Los ejemplos se describen en
Bayer, E.A. y Wilchek, M. en Methods Biochem. Anal. (1980), 26:1.
Este procedimiento también puede extenderse para incluir la unión
de indicador a indicador, un proceso que puede estimular la
asociación del agente y una consecuente eficacia potencialmente
aumentada. Como alternativa, la avida o estreptavidina puede unirse
directamente a la superficie de partículas indicadoras.
El acoplamiento no covalente también puede
utilizar la naturaleza bifuncional de inmunoglobulinas
biespecíficas. Estas moléculas pueden unir específicamente dos
antígenos, enlazándolos por tanto entre sí. Por ejemplo, pueden
utilizarse IgG biespecíficas o fragmentos F(ab)'_{2}
biespecíficos químicamente modificados como agentes conectores.
También se han indicado anticuerpos biespecíficos
heterobifuncionales para la unión de dos antígenos diferentes, por
ejemplo, como se describe en Bode, C. et al. en J. Biol.
Chem. (1989), 264:944, y Staerz, U.D. et al. en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1988), 83:1453. De forma similar, cualquier
indicador y/o vector que contenga dos o más determinantes
antigénicos (por ejemplo, como se describe en Chen, Aa. et
al. en Am. J. Pathol. (1988), 130:216) pueden ser entrecruzados
por moléculas de anticuerpo y conducir a la formación de
construcciones entrecruzadas de agentes de fórmula I de eficacia
potencialmente aumentada.
Los denominados agentes conectores de longitud
cero, que inducen la unión covalente directa de dos grupos químicos
reactivos sin introducir otro material conector (por ejemplo, como
en la formación de enlaces amida inducida utilizando carbodiimidas
o de forma enzimática) pueden utilizarse, si se desea, según la
invención, así como agentes tales como sistemas de biotina/avidina
que inducen la unión no covalente del
indicador-vector, y agentes que inducen
interacciones electrostáticas.
Sin embargo, de modo más habitual, el agente
conector comprende dos o más restos reactivos, por ejemplo, como se
describió anteriormente, conectados por un elemento espaciador. La
presencia de dicho espaciador permite que los conectores
bifuncionales reaccionen con grupos funcionales específicos dentro
de una molécula, o entre dos moléculas diferentes, dando como
resultado un enlace entre estos dos componentes y la introducción de
un material extrínseco derivado del conector en el conjugado de
indicador-vector. Los restos reactivos en un agente
conector pueden ser los mismos (agentes homobifuncionales) o
diferentes (agentes heterobifuncionales o, cuando están presentes
varios restos reactivos diferentes, agentes heteromultifuncionales),
proporcionando una diversidad de reactivos potenciales que pueden
lograr la unión covalente entre cualquier especie química, de forma
intramolecular o intermolecular.
La naturaleza de material extrínseco introducido
por el agente conector puede presentar una relación crítica sobre
la capacidad de transporte dirigido y la estabilidad general del
producto final. Por tanto, puede resultar deseable introducir
enlaces lábiles, por ejemplo, que contengan brazos espaciadores que
son biodegradables o químicamente sensibles, o que incorporen
sitios de ruptura enzimática. Como alternativa, el espaciador puede
incluir componentes poliméricos, por ejemplo, para actuar como
tensioactivos y potenciar la estabilidad del agente. El espaciador
también puede contener restos reactivos, por ejemplo, como se
describió anteriormente para potenciar el entrecruzamiento de
supeficies.
Los elementos espaciadores consisten, de forma
típica, en cadenas alifáticas que separan, de modo eficaz, los
restos reactivos del conector por distancias entre 5 y 30 ring{A}.
También pueden comprender estructuras macromoleculares, tales como
polietilenglicoles. Estas estructuras poliméricas, denominadas en lo
sucesivo PEG, son poliéteres sencillos neutros que han sido
destacados en aplicaciones biotécnicas y biomédicas (véase, por
ejemplo, Milton Harris, J. (ed), "Poly(ethylene glycol)
chemistry, biotechnical and biomedical applications", Plenum
Press, Nueva York, 1992). Los PEG son solubles en la mayoría de los
disolventes, incluyendo el agua, y se encuentran altamente
hidratados en entornos acuosos, uniéndose dos o tres moléculas a
cada segmento de etilenglicol; esto tiene el efecto de evitar la
adsorción de otros polímeros o de proteínas sobre las superficies
modificadas con PEG. Se sabe que los PEG no son tóxicos y no
perjudican a las proteínas activas o células, mientras que se sabe
que los PEG unidos covalentemente no son inmunogénicos ni
antigénicos. Además, los PEG pueden modificarse con facilidad y
unirse a otras moléculas con un efecto pequeño sobre su química. Su
solubilidad y propiedades biológicas ventajosas son evidentes a
partir de los muchos usos posibles de los PEG y sus copolímeros,
incluyendo copolímeros en bloque, tales como
PEG-poliuretanos y
PEG-polipropilenos.
\newpage
Los pesos moleculares apropiados para los
espaciadores de PEG utilizados según la invención pueden ser, por
ejemplo, entre 120 Daltons y 20 kDaltons.
El mecanismo principal para la captación de
partículas por las células del sistema reticuloendotelial (RES) es
la opsonización por proteínas plasmáticas en la sangre; éstas marcan
a las proteínas extrañas que entonces son captadas por el RES. Las
propiedades biológicas de los elementos espaciadores de PEG
utilizados según la invención puede servir para aumentar el tiempo
en circulación del agente de una manera similar a la observada para
los liposomas PEGilados (véase, por ejemplo, Klibanov, A.L. et
al. en FEBS Letters (1990), 268:235-237, y
Blume, G. y Cevc, G. en Biochim. Biophys. Acta (1990),
1029:91-97). También puede lograrse una mayor
eficacia de acoplamiento a áreas de interés utilizando anticuerpos
unidos a los terminales de los espaciadores de PEG (véase, por
ejemplo, Maruyama K. et al. en Biochim. Biophys. Acta (1995),
1234:74-80, y Hansen, C.B. et al. en
Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239:133-144).
Otros elementos espaciadores representativos
incluyen polisacáridos de tipo estructural, tales como ácido
poligalaturónico, glicosaminoglicanos, heparinoides, celulosa y
polisacáridos marinos, tales como alginatos, quitosanos y
carragenannos; polisacáridos de tipo sustancia de almacenamiento,
tales como almidón, glucógeno, dextrano y aminodextranos;
poliaminoácidos y sus ésteres metílicos y etílicos, como en homo- y
copolímeros de lisina, ácido glutámico y ácido aspártico; y
polipéptidos, oligosacáridos y oligonucleótidos, que pueden
contener o no sitios de ruptura enzimática.
En general, los elementos espaciadores pueden
contener grupos escindibles, tales como grupos glicoles vecinales,
azo, sulfona, éster, tioéster o disulfuro. Los espaciadores que
contienen grupos metilen diéster o diamida biodegradables de
fórmula
-(Z)_{m}.Y.C.C(R^{1}R^{2}).X.Y.(Z)_{n}-
\vskip1.000000\baselineskip
[en la que X y Z se seleccionan de
-O-, -S- y -NR- (en el que R es hidrógeno o un grupo orgánico); cada
Y es un grupo carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o un
grupo formador de ácidos similar; m y n son cada uno cero o 1; y
R^{1} y R^{2} son cada uno hidrógeno, un grupo orgánico o un
grupo -X.Y.(Z)_{m}-, o juntos forman un grupo orgánico
divalente] también pueden ser útiles; como se analiza, por ejemplo,
en el documento WO-A-9217436, estos
grupos se biodegradan con facilidad en presencia de esterasas, por
ejemplo, in vivo, pero son estables en ausencia de estas
enzimas. Por tanto, pueden unirse, de forma ventajosa, a agentes
terapéuticos para permitir su liberación
lenta.
lenta.
Las
poli[N-(2-hidroxietil)metacrilamidas]
son materiales espaciadores potencialmente útiles en virtud de su
bajo grado de interacción con células y tejidos (véase, por ejemplo,
Volfová, I., Rihová, B. y V.R., y Vetvicka, P. en J. Bioact. comp.
Polymers (1992), 7:175-190). Un estudio sobre un
polímero similar, que consiste principalmente en el derivado de
2-hidroxipropilo estrechamente relacionado,
demuestra que fue endocitado por el sistema de fagocitos
mononucleares sólo en un grado bastante bajo (véase Goddard, P.,
Williamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L.E., Nicholls, J. y Petrak,
K. en J. Bioct. Compat. Polym. (1991), 6:4-24).
Otros materiales espaciadores poliméricos
potencialmente útiles incluyen:
i) copolímeros de metacrilato de metilo con
ácido metacrílico; éstos pueden ser erosionables (véase Lee, P.I.
en Pharm. Res. (1993), 10:980), y los sustituyentes carboxilato
pueden provocar un grado de hinchamiento mayor que con polímeros
neutros;
ii) copolímeros en bloque de polimetacrilatos
con poliésteres biodegradables (véase, por ejemplo, San Roman, J. y
Guillén-García, P. en Biomaterials (1991),
12:236-241);
iii) cianoacrilatos, es decir, polímeros de
ésteres del ácido 2-cianoacrílico; éstos son
biodegradables y se han utilizado en forma de nanopartículas para
la administración selectiva de fármacos (véase Forestier, F.,
Gerrier, P., Chaumard, C., Quero, A.M., Couvreur, P. y Labarre, C.
en J. Antimicrob. Chemoter. (1992),
30:173-179);
iv) poli(alcoholes vinílicos), que son
solubles en agua y se consideran, en general, biocompatibles (véase,
por ejemplo, Langer R. en J. Control. Release (1991),
16:53-30);
v) copolímeros de vinil metil éter con anhídrido
maleico, que se han indicado como bioerosionables (véase Finne, U.,
Hannus, M. y Urtti, A. en Int. J. Pharm. (1992),
78:237-241);
vi) polivinilpirrolidonas, por ejemplo, con un
peso molecular menor que aproximadamente 25.000, que son filtradas
con rapidez por los riñones (véase Hespe, W., Meier, A.M. y
Blankwater, Y.M. en Arzeim.-Forsch./Drug Res. (1977),
27:1158-1162);
vii) polímeros y copolímeros de hidroxiácidos
alifáticos de cadena corta, tales como ácido glicólico, láctico,
butírico, valérico y caproico (véase, por ejemplo, Carli F. en Chim.
Ind. (Milán) (1993), 75:494-499), incluyendo
copolímeros que incorporan hidroxiácidos aromáticos para aumentar su
velocidad de degradación (véase Imasaki, K., Yoshida, M., Fukuzaki,
H., Asano, M., Kumakura, M., Mashimo, T., Yamanaka, H. y Nagai, T.
en Int. J. Pharm. (1992), 81:31-38);
viii) poliésteres que consisten en unidades
alternantes de etilenglicol y ácido tereftálico, por ejemplo,
Dacron®, que no son degradables pero son altamente
biocompatibles;
ix) copolímeros en bloque que comprenden
segmentos biodegradables de polímeros de hidroácidos alifáticos
(véase, por ejemplo, Younes, H., Nataf, P.R., Cohn, D., Appelbaum,
Y.J., Pizov, G. y Uretzky, G. en Biomater. Artif. Cell Artif.
Organs (1988), 16:705-719), por ejemplo, junto con
poliuretanos (véase Kobayashi, H., Hyon, S.H. e Ikada, Y. en
"Water-curable and biodegradable prepolymers",
J. Biomed. Mater. Res. (1991), 25:1481-1494);
x) poliuretanos, conocidos por ser bien
tolerados en los implantes, y que pueden combinarse con segmentos
"blandos" flexibles, por ejemplo, que comprenden
politetrametilenglicol, polipropilenglicol o polietilenglicol, y
segmentos "duros" aromáticos, por ejemplo, que comprenden
4,4'-metilenbis(isocianato de fenileno)
(véase, por ejemplo, Ratner, B.D., Johnston, A.B. y Lenk, T.J. en
J. Biomed. Mater. Res.: Applied Biomaterials (1987),
21:59-60; Sa Da Costa, V. et al. en J. Coll.
Interface Sci. (1981), 80:445-452, y Affrossman, S.
et al. en Clinical Materials (1991),
8:25-31);
8:25-31);
xi)
poli(1,4-dioxan-2-onas),
que pueden considerarse como ésteres biodegradables a la vista de
sus enlaces éster hidrolizables (véase, por ejemplo, Song, C.X.,
Cui, X.M. y Schindler, A. en Med. Biol. Eng. Comput. (1993),
31:S147-150), y que pueden incluir unidades de
glicólido para mejorar su absorbabilidad (véase Bezwada, R.S.,
Shalaby, S.W. y Newman, H.D.J. en Agricultural and synthetic
polymers: Biodegradability and utilization (1990) (ed. Glass J.E. y
Swift, G.), 167-174, ACS Symposium Series, nº 433,
Washington D.C., EEUU, American Chemical Society);
xii) polianhídridos, tales como copolímeros del
ácido sebácico (ácido octandioico) con
bis(4-carboxifenoxi)propano, que han
demostrado, en estudios con conejos (véase Brem, H., Kader, A.,
Epstein, J.I., Tamargo, R.J., Dombe, A., Langer, R. y Leong, K.W.
en Sel. Cancer Ther. (1989), 5:55-65) y en estudios
con ratas (véase Tamargo, R.J., Epstein, J.I., Reinhard, C.S.,
Chasin, M. y Brem, H. en J. Biomed. Mater. Res. (1989),
23:253-266), que son útiles para la liberación
controlada de fármacos en el cerebro sin efectos tóxicos
evidentes;
xiii) polímeros biodegradables que contienen
grupos ortoéster, que se han empleado para la liberación controlada
in vivo (véase Maa, Y.F. y Heller, J. en J. Control. Release
(1990), 14:21-28); y
xiv) polifosfazenos, que son polímeros
inorgánicos que consisten en átomos de fósforo y nitrógeno
alternantes (véase Crommen, J.H., Vandorpe, J. y Schacht, E.H. en
J. Control. Release (1993), 24:167-180).
Las siguientes tablas listan los agentes
conectores que pueden ser útiles en agentes de transporte dirigido
según la invención.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Agentes conectores
bifuncionales
Agentes conectores
homobifuncionales
\vskip1.000000\baselineskip
Agentes de
biotinilación
\vskip1.000000\baselineskip
Agentes para la modificación de
proteínas
\newpage
Además de los conectores de tipo PEG de cadena
lineal y ramificada ya contemplados (por ejemplo, polietilenglicoles
y otros que contienen de 1 a 100 unidades recurrentes de óxido de
etileno), los conectores en el sistema VLR puede ser,
independientemente, un enlace químico o el resto de un grupo
conector. La frase "resto de un grupo conector", tal como se
utiliza en la presente, se refiere a un resto que permanece, resulta
o se deriva de la reacción de un grupo reactivo del vector con un
sitio reactivo en otro vector. La frase "grupo reactivo del
vector", tal como se utiliza en la presente, se refiere a
cualquier grupo que puede reaccionar con grupos funcionales que se
encuentran, de forma típica, sobre vectores, cuya derivatización
sólo afecta mínimamente a la capacidad del vector para unirse a su
receptor. Sin embargo, se contempla específicamente que dichos
grupos reactivos del vector también puedan reaccionar con grupos
funcionales que se encuentran, de forma típica, sobre moléculas
proteicas pertinentes. Así, en un aspecto, los conectores útiles en
la práctica de esta invención se derivan de aquellos grupos que
pueden reaccionar con cualquier molécula pertinente que comprende un
vector, como se describió anteriormente, que contiene un grupo
reactivo, tanto si esa molécula pertinente es una proteína como si
no, para formar un grupo conector.
Los grupos conectores preferidos se derivan de
grupos reactivos del vector seleccionados, pero sin limitación, de
un grupo que reacciona directamente con grupos carboxi, aldehído,
amina (NHR), alcohol, sulfhidrilo, metilenos activados y similares,
sobre el vector, por ejemplo, grupos que contienen halógenos activos
incluyendo, por ejemplo, grupos clorometilfenilo y grupos
cloroacetilo [ClCH_{2}(C(=O)-], grupos 2-(sustituido con un
grupo saliente)etilsulfonilo y etilcarbonilo activados,
tales como 2-cloroetilsulfonilo y
2-cloroetilcarbonilo; vinilsulfonilo;
vinilcarbonilo; epoxi; isocianato; isotiocianato; aldehído;
aziridina; succinimidoxicarbonilo; grupos acilo activados, tales
como haluros de ácido carboxílico; anhídridos mixtos y
similares.
Un grupo que puede reaccionar con facilidad con
moléculas de vector modificadas que contienen un grupo reactivo del
vector, es decir, vectores que contienen un grupo reactivo
modificado para que contenga grupos reactivos, tales como los
mencionados en las tablas anteriores, por ejemplo, mediante la
oxidación del vector para producir un aldehído o un ácido
carboxílico, en cuyo caso, el "grupo conector" puede derivarse
de grupos reactivos seleccionados de amino, alquilamino, arilamino,
hidrazino, alquilhidrazino, arilhidrazino, carbazido, semicarbazido,
tiocarbazido, tiosemicarbazido, sulfhidrilo, sulfhidrilalquilo,
sulfhidrilarilo, hidroxi, carboxi, carboxialquilo y carboxiarilo.
Las porciones alquilo de dichos grupos conectores pueden contener de
1 a aproximadamente 20 átomos de carbono. Las porciones arilo de
dichos grupos conectores pueden contener de aproximadamente 6 a
aproximadamente 20; y un grupo que puede conectarse al vector que
contiene un grupo reactivo, o al vector modificado como se indicó
anteriormente, mediante el uso de un agente de entrecruzamiento. Los
restos de ciertos agentes de entrecruzamiento útiles, tales como,
por ejemplo, endurecedores de gelatina homobifuncionales y
heterobifuncionales, bisepóxidos y bisisocianatos, pueden formar
parte de un grupo conector durante la reacción de entrecruzamiento.
Sin embargo, otros agentes de entrecruzamiento útiles pueden
facilitar el entrecruzamiento, por ejemplo, como catalizadores
consumibles, y no están presentes en el conjugado final. Los
ejemplos de estos agentes de entrecruzamiento son agentes de
entrecruzamiento de carbodiimida y carbamoilonio, como se describe
en la patente de EEUU nº 4.421.847, y los éteres de la patente de
EEUU nº 4.877.724. Con estos agentes de entrecruzamiento, uno de
los reactivos, tal como el vector, debe tener un grupo carboxilo, y
el otro, tal como un espaciador de cadena larga, debe tener un
grupo amina, alcohol o sulfhidrilo reactivo. En la formación del
enlace amida, el agente de entrecruzamiento reacciona, en primer
lugar, de forma selectiva con el grupo carboxilo, y después se
escinde durante la reacción del grupo carboxilo así "activado"
con una amina, para formar un enlace amida entre ambos, uniendo
covalentemente, con ello, a los dos restos. Una ventaja de esta
estrategia es que se evita el entrecruzamiento de moléculas
similares, por ejemplo vector a vector, mientras que la reacción,
por ejemplo, de agentes de entrecruzamiento homobifuncionales no es
selectiva y se obtienen moléculas entrecruzadas no deseadas.
Los grupos conectores útiles preferidos se
derivan de diversos reactivos de entrecruzamiento
heterobifuncionales, tales como los listados en Pierce Chemical
Company Immunotechnology Catalog - Protein Modification Section
(1995 y 1996). Unos ejemplos no limitantes útiles de estos reactivos
incluyen:
Sulfo-SMCC:
4-(N-maleimidometil)ciclohexan)-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo
Sulfo-SIAB:
(4-yodoacetil)aminobenzoato de
sulfosuccinimidilo
Sulfo-SMPB:
4-(p-maleimidofenil)butirato de
sulfosuccinimidilo
2-IT:
2-iminotiolano
SATA: S-acetiltioacetato de
N-succinimidilo
Además de la descripción anterior, los grupos
conectores, por completo o en parte, también pueden estar formados
y derivarse de secuencias complementarias de nucleótidos y restos de
nucleótidos, que aparecen en la naturaleza y modificados,
preferiblemente secuencias oligonucleotídicas que no se autoasocien.
Los reactivos particularmente útiles, no limitantes, para la
incorporación de restos nucleótidos modificados que contienen grupos
funcionales reactivos, tales como grupos amina y sulfhidrilo, en
una secuencia oligonucleotídica están disponibles en el mercado,
por ejemplo, en Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, California),
e incluyen Uni-Link AminoModifier (nº de catálogo
5190), fosforamidita Biotin-ON (nº de catálogo
5191),
N-MNT-C6-AminoModifier
(nº de catálogo 5202), AminoModifier II (nº de catálogo 5203),
DMT-C6-3'Amine-ON
(nº de catálogo 5222), C6-ThiolModifier (nº de
catálogo 5211) y similares. En un aspecto, los grupos conectores de
esta invención se derivan de la reacción de un grupo funcional
reactivo, tal como un grupo amina o sulfhidrilo, tal como están
disponibles en los anteriores reactivos de Clontech, habiéndose
incorporado uno o más de los cuales en una secuencia
oligonucleotídica, por ejemplo, con uno o más de los grupos
reactivos del vector previamente descritos, tal como un grupo
heterobifuncional en el vector.
Mediante la unión de dos secuencias
oligonucleotídicas complementarias, una al vector y la otra al
indicador, el oligonucleótido hibridado bicatenario resultante
comprende, entonces, el grupo conector entre el vector y el
indicador.
indicador.
Otros sistemas poliméricos que actúan como
conectores incluyen: -poli(L o D o
DL-aminoácidos) = proteínas y péptidos;
seudopoli(aminoácidos) naturales o sintéticos = aminoácidos
enlazados mediante enlaces no amídicos; poli(D o D o
DL-lactidas) y sus copolímeros, por ejemplo,
poli(L-lactida/DL-lactida)poli(glicólido);
copolimeros de L-lactida/glicólido;
policaprolactona y sus copolímeros; polianhídridos; poli(orto
ésteres); polifosfacenos; lípidos (y fosfolípidos) de cadena larga
lineales y ramificados; azúcares y carbohidratos; oligonucleótidos
(véase anteriormente); asi como mezclas de los anteriores.
Los agentes conectores empleados según la
invención producirán, en general, la unión del vector al indicador,
o un indicador a otro indicador, con algún grado de especificidad, y
también pueden utilizarse para unir uno o más agentes
terapéuticamente activos.
Por consiguiente, los agentes proporcionan una
herramienta para la administración terapéutica de fármacos, en
combinación con el transporte dirigido, mediado por vector, del
producto hasta el sitio deseado. "Terapéutico" o
"fármaco" significa un agente que tiene un efecto beneficioso
sobre una enfermedad específica en un animal humano o no humano
vivo.
Los compuestos terapéuticos pueden encapsularse
en el interior de un agregado molecular o conector en partículas, o
unirse o incorporarse en las paredes encapsulantes de un conector
vesicular. Por tanto, el compuesto terapéuticos puede estar unido a
una parte de la superficie, por ejemplo, mediante enlaces covalentes
o iónicos, o puede mezclarse físicamente en un material
encapsulante, en particular si el fármaco tiene una polaridad o
solubilidad similar al material, para evitar que se escape del
producto antes de su actuación prevista en el cuerpo. La liberación
del fármaco puede iniciarse simplemente mediante el contacto
humedecedor con la sangre después de la administración, o como
consecuencia de otras influencias internas o externas, por ejemplo
procesos de disolución catalizados por enzimas, o el uso de
calentamiento magnético cuando el indicador es una partícula
magnética.
La sustancia terapéutica puede estar unida
covalentemente a la superficie de la membrana encapsulante de un
conector vesicular utilizando un agente conector adecuado, por
ejemplo, como se describió en la presente anteriormente. Así, por
ejemplo, se puede preparar, inicialmente, un derivado de fosfolípido
al cual se une el fármaco a través de un enlace o conector
biodegradable, y después incorporar este derivado en el material
utilizado para preparar la membrana de la vesícula, como se
describió anteriormente. Como alternativa, el agente puede
prepararse inicialmente sin el compuesto terapéutico, que entonces
puede acoplarse o revestirse sobre los agentes en partículas (por
ejemplo, vesiculares) antes del uso. Así, por ejemplo, un compuesto
terapéutico puede añadirse a una suspensión de liposomas en un
medio acuoso y agitarse para unir o adherir el compuesto
terapéutico a los liposomas.
El compuesto terapéutico puede ser, por ejemplo,
un fármaco o profármaco conocido por ser utilizado para combatir la
angiogénesis o tumores.
Mediante el transporte dirigido de un agente que
contiene una enzima activadora de profármaco a áreas patológicas se
puede formar una imagen del transporte dirigido de la enzima,
haciendo posible visualizar el momento en que el agente se ha
transportado correctamente y el momento en que el agente desaparece
de las áreas que no son diana. De esta manera se puede determinar
el tiempo óptimo para la inyección de un profármaco en pacientes
individuales.
Otra alternativa es incorporar un profármaco,
una enzima activadora de profárcao y un vector en el mismo
indicador-conector en partículas, de tal forma que
el profármaco sólo se activa después de un estímulo externo. Este
estímulo puede ser, por ejemplo, una estimulación lumínica de un
indicador cromofórico, o el calentamiento magnético de un indicador
superparamagnético después de lograr el transporte dirigido
deseado.
Los denominados profármacos también pueden
utilizarse en agentes según la invención. Así, los fármacos pueden
derivatizarse para alterar sus propiedades fisicoquímicas y para
adaptarse al agente de la invención; estos fármacos derivatizados
pueden considerarse como profármacos, y normalmente están inactivos
hasta que la escisión del grupo derivatizante regenera la forma
activa del fármaco.
Pueden transportarse con facilidad compuestos
terapéuticos a los sitios de angiogénesis.
Como ejemplo, cuando el indicador es una especie
metálica quelada (por ejemplo, un ion metálico paramagnético o un
radionúclido metálico), el conector puede comprender una cadena
unida a un grupo quelante metálico, una cadena polimérica con una
pluralidad de grupos quelantes metálicos que cuelgan del esqueleto
molecular o incorporados en el esqueleto molecular, un polímero
ramificado con grupos quelantes metálicos en los extremos terminales
de las ramificaciones (por ejemplo, un poliquelante dendrimérico),
etc. Lo que se pide al conector es, simplemente, que una entre sí
los restos vector e indicador durante un periodo de tiempo adecuado.
Un periodo de tiempo adecuado significa un periodo suficiente para
que el agente de contraste ejerza sus efectos deseados, por
ejemplo, aumentar el contraste in vivo durante un
procedimiento de formación de imágenes de diagnóstico.
Por tanto, en ciertas circunstancias, puede ser
deseable que el conector se biodegrade después de la administración.
Seleccionando de forma apropiada un conector biodegradable es
posible modificar los patrones de biodistribución y bioeliminación
para el vector y/o indicador. Cuando el vector y/o indicador son
biológicamente activos, o son capaces de ejercer unos efectos no
deseados si persisten después de terminar el procedimiento de
formación de imágenes, puede resultar deseable diseñar una
biodegradabilidad del conector que asegure la bioeliminación o
degradación metabólica adecuadas de los restos vector y/o indicador.
Por tanto, un conector puede contener una función biodegradable
que, tras la degradación, produce productos de degradación con
patrones de biodistribución modificados que resultan de la
liberación del indicador del vector, o de la fragmentación de una
estructura macromolecular. Como ejemplo, para conectores que portan
indicadores de iones metálicos quelados, es posible que el conector
incorpore una función biodegradable que, tras la degradación, libere
un compuesto quelado excretable que contiene el indicador. Por
consiguiente, puede resultar deseable incorporar funciones
biodegradables dentro de la estructura del conector,
preferiblemente en sitios que son (a) sitios de ramificación, (b) en
sitios de unión para vectores o indicadores, o cerca de éstos, o
(c) de tal forma que la biodegradación produce fragmentos
fisiológicamente tolerables o rápidamente excretables.
Los ejemplos de funciones biodegradables
adecuadas incluyen incluyen funciones éster, amida, éster doble,
fosfoéster, éter, tioéter, guanidilo, acetal y cetal.
Como se analizó anteriormente, el grupo
conector, si se desea, puede tener en su esqueleto molecular grupos
que afectan a la biodistribución del agente de contraste, o que
aseguran la conformación espacial apropiada para el agente de
contraste, por ejemplo, para permitir que el agua acceda a los
indicadores de iones metálicos paramagnéticos quelados. Como
ejemplo, el esquelesto del conector puede estar formado, en parte o
casi totalmente, por una o más cadenas de poli(óxido de
alquileno).
Por tanto, el conector puede considerarse como
un material compuesto de opcionalmente grupos de unión de vector
(V_{b}) y de unión de receptor (R_{b}) biodegradables, unidos a
través de grupos de esqueleto conectores (L_{b}), pudiendo portar
dichos grupos de esqueleto conectores grupos de cadena lateral
conectores (L_{SC}) para modificar la biodistribución, etc., y
pueden incorporar, en sí mismos, funciones biodegradables. Los
grupos de unión V_{b} y R_{b} puede colgar del esqueleto
conector, o pueden estar en los terminales del esqueleto conector,
por ejemplo, estando un grupo R_{b} o V_{b} en extremo L_{b}
terminal, estando los grupos R_{b} o V_{b} conectando dos
L_{b} terminales, o portando un terminal L_{b} dos o más grupos
R_{b} o V_{b}. Los grupos L_{b} y L_{SC} serán, de forma
conveniente, estructuras oligómeras o polímeras (por ejemplo,
poliésteres, poliamidas, poliéteres, poliaminas, oligopéptidos,
polipéptidos, oligo- y polisacáridos, oligonucleótidos, etc.),
preferiblemente estructuras que tengan, al menos en parte, una
naturaleza hidrófila o lipófila, por ejemplo estructuras
hidrófilas, anfifílicas o lipófilas.
El conector puede tener un peso molecular bajo,
medio o alto, por ejemplo, hasta 2 MD. En general, se prefieren los
conectores de mayor peso molecular si van a ser cargados con una
multiplicidad de vectores o indicadores, o si es necesario separar
el vector y el indicador entre sí, o si el conector, en sí mismo,
desempeña un papel en la modificación de la biodistribución. Sin
embargo, en general, los conectores tendrán de 100 a 100.00 D, en
especial de 120 D a 20 kD de peso molecular.
La conjugación del conector al vector, y del
conector al indicador, puede realizarse mediante cualquier técnica
de conjugación química apropiada, por ejemplo, enlace covalente (por
ejemplo, formación de éster o amida), quelación metálica u otro
enlace coordinado o iónico metálico, de nuevo como se describió
anteriormente.
Los ejemplos de sistemas conectores adecuados
incluyen las estructuras poliquelantes magnificantes de los
documentos US-A-5364613 y
PCT/EP90/00565, poliaminoácidos (por ejemplo, polilisina), PEG
funcionalizado, polisacáridos, glicosaminoglicanos, polímeros
dendríticos, tales como los descritos en el documento WO93/06868 y
por Tomalia et al. en Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
29:138-175 (1990), polímeros quelantes de PEG, tales
como los descritos en los documentos WO94/08629, WO94/09056 y
WO96/26754, etc.
Cuando el indicador es un ion metálico quelado,
el grupo conector, en general, incorpora el resto quelante. Como
alternativa, el metal quelado puede estar portado sobre o dentro de
un indicador en partículas. En cualquiera de los casos, pueden
emplearse grupos quelantes de metales convencionales, tales como los
conocidos en los ámbitos de la radiofarmacia y los medios de
contraste de MRI, por ejemplo ácidos
poliamino-policarboxílicos lineales, cíclicos y
ramificados, y los equivalentes de oxiácido de fósforo, y otros
ligandos de azufre y/o nitrógeno conocidos en la técnica, por
ejemplo, DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DO3A, TMT (véase, por
ejemplo, el documento
US-A-5367080), BAT y análogos
(véase, por ejemplo, Ohmono et al., J. Med. Chem.,
35:157-162 (1992), y Kung et al., J. Nucl.
Med., 25:326-332 (1984)), el quelante de
N_{2}S_{2} ECD de Neurolite, MAG (véase Jurisson et al.,
Chem. Rev., 93:1137-1156 (1993)), HIDA, DOXA (ácido
1-oxa-4,7,10-triazaciclododecantriacético),
NOTA (ácido 1,4,7-triazaciclononantriacético),
TET_{A} (ácido
1,4,6,11-tetraazaciclotetradecantetraacético), THT
(4'-(3-amino-4-metoxifenil)-6,6''-bis(N',N'-dicarboximetil-N-metilhidrazino)-2,2':6',2''-terpiridina),
etc. A este respecto, se remite al lector a la bibliografía de
patentes de Sterling Winthropp, Nycomed (incluyendo Nycomed Imaging
y Nycomed Salutar), Schering, Mallinckrodt, Bracco y Squibb con
relación a agentes quelantes para metales de diagnóstico, por
ejemplo, en MR, rayos X y agentes de radiodiagnóstico. Véanse, por
ejemplo, los documentos
US-A-4647447,
EP-A-71564,
US-A-4687659, WO89/00557,
US-A-4885363 y
EP-A-232751.
Los restos indicadores en los agentes de
contraste de la invención pueden ser cualquier resto capaz de
detectar, de forma directa o indirecta, en un procedimiento de
formación de imágenes de diagnóstico in vivo, por ejemplo,
restos que emiten o puede provocarse que emitan una radiación
detectable (por ejemplo, mediante descomposición radiactiva,
excitación de fluorescencia, excitación de resonancia de espín,
etc.), restos que afectan a los campos electromagnéticos locales
(por ejemplo, especies paramagnéticas, superparamagnéticas,
ferrimagnéticas o ferromagnéticas), restos que absorben o dispersan
energía de radiación (por ejemplo, cromóforos y fluoróforos),
partículas (incluyendo vesículas que contienen líquidos), elementos
pesados y sus compuestos, y restos que generan una sustancia
detectable, etc.
En la técnica se conoce una gama muy amplia de
materiales detectables mediante las modalidades de formación de
imágenes de diagnóstico, y el indicador se seleccionará según la
modalidad de formación de imágenes que se vaya a utilizar. Así, por
ejemplo, para la formación de imágenes por ultrasonido, normalmente
se seleccionará un material ecogénico, o un material capaz de
generar un material ecogénico, para la formación de imágenes de
rayos X el indicador, en general, será o contendrá un átomo pesado
(por ejemplo, de peso atómico 38 o mayor), para la formación de
imágenes de MR el indicador será un isótopo de espín nuclear no cero
(tal como ^{19}F) o un material que tenga espines de electrones
desapareados y, por tanto, tiene propiedades paramagnéticas,
superparamagnéticas, ferrimagnéticas o ferromagnéticas, para la
formación de imágenes ópticas el indicador será un dispersor de luz
(por ejemplo, una partícula coloreada o no coloreada), un absorbente
de luz o un emisor de luz, para la formación de imágenes
magnetométricas el indicador tendrá propiedades magnéticas
detectables, para la formación de imágenes de impedancia eléctrica
el indicador afectará a la impedancia eléctrica, y para la
centellografía, SEPCT, PET, etc., el indicador será un
radionúclido.
Los ejemplos de indicadores adecuados son muy
conocidos en la bibliografía de formación de imágenes de
diagnóstico, por ejemplo partículas de óxido de hierro magnéticas,
vesículas que contienen agentes de contraste de rayos X, metales
paramagnéticos quelados (tales como Gd, Dy, Mn, Fe, etc.). Véanse,
por ejemplo, los documentos
US-A-4647447, PCT/GB91/00067,
US-A-4863715,
US-A-4770183, WO96/09840,
WO85/027772, WO92/17212, PCT/GB97/00459,
EP-A-554213,
US-A-5228446, WO91/15243,
WO91/15243, WO93/05818, WO96/23524, WO96/
17628, US-A-5387080, WO95/26205, GB9624918.0, etc.
17628, US-A-5387080, WO95/26205, GB9624918.0, etc.
Se prefieren particularmente como indicadores
los iones metálicos paramagnéticos quelados, tales como Gd, Dy, Fe
y Mn, en especial cuando están quelados por grupos quelantes
macrocíclicos (por ejemplo, quelantes de tetraazaciclododecano,
tales como DOTA, DO3A, HP-D03A y sus análogos), o
por grupos quelantes conectores, tales como DTPA,
DTPA-BMA, EDTA, DPDP, etc.; radionúclidos metálicos,
tales como ^{90}Y, ^{99m}Tc, ^{111}In, ^{47}Sc, ^{67}Ga,
^{51}Cr, ^{177m}Sn, ^{67}Cu, ^{161}Tm, ^{91}Ru,
^{188}Re, ^{177}Lu, ^{198}Au, ^{203}Pb y ^{141}Ce;
cristales de óxido de hierro superparamagnéticos; cromóforos y
fluoróforos que tienen un máximo de absorción y/o emisión en el
intervalo de 300-1400 nm, en especial de 600 nm a
1200 nm, en particular de 650 a 100 nm; iones agregados de metales
pesados quelados (por ejemplo, polioxoaniones de W o Mo, o los
análogos de azufre u oxígeno/azufre mixtos); átomos no metálicos
unidos covalentemente que tienen un alto número atómico (por
ejemplo, yodo) o son radiactivos, por ejemplo ^{123}I, ^{131}I,
etc.; vesículas que contienen compuestos yodados; etc.
En términos generales, el indicador puede ser
(1) un metal quelable o un ion que contiene un metal poliatómico
(es decir, TcO, etc.), en el que el metal es un metal de alto número
atómico (por ejemplo, un número atómico mayor que 37), una especie
paramagnética (por ejemplo, un metal de transición o lantánido, o un
isótopo radiactivo; (2) una especie no metálica unida
covalentemente que es un sitio de electrón desapareado (por ejemplo,
un oxígeno o carbono en un radical libre persistente), un no metal
de alto número atómico, o un radioisótopo; (3) un agregado
poliatómico o cristal que contiene átomos de alto número atómico,
que muestra un comportamiento magnético cooperativo (por ejemplo,
superparamagnetismo, ferrimagnetismo o ferromagnetismo) o que
contiene radionúclidos; (4) un cromóforo (en el que se incluyen las
especies que son fluorescentes o fosforescentes), por ejemplo, una
estructura inorgánica u orgánica, en particular un ion metálico
complejado o un grupo orgánico que tiene un sistema de electrones
deslocalizados extenso; o (5) una estructura o grupo que tiene
características variables de impedancia eléctrica, por ejemplo, en
virtud de un sistema de electrones deslocalizados extenso.
Los ejemplos de grupos indicadores preferidos
concretos se describen con más detalle a continuación.
Indicadores de metales quelados:
radionúclidos metálicos, iones metálicos paramagnéticos, iones
metálicos fluorescentes, iones de metales pesados y iones
agregados.
Los radionúclidos metálicos preferidos incluyen
^{90}Y, ^{99m}Tc, ^{111}In, ^{47}Sc, ^{67}Ga, ^{51}Cr,
^{177m}Sn, ^{67}Cu, ^{167}Tm, ^{97}Ru, ^{188}Re,
^{177}Lu, ^{198}Au, ^{203}Pb y ^{141}Ce.
Los iones metálicos paramagnéticos preferidos
incluyen iones de metal de transición y lantánidos (por ejemplo,
metales que tienen números atómicos de 6 a 9, 21-29,
42, 43, 44 ó 57-71), en particular iones de Cr, V,
Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er,
Tm, Yb y Lu, en especial de Mn, Cr, Ge, Gd y Dy, más especialmente
de Gd.
Los iones metálicos fluorescentes preferidos
incluyen lantánidos, en particular La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd,
Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb y Lu. Se prefiere especialmente Eu.
Los indicadores que contienen metales pesados
preferidos pueden incluir átomos de Mo, Bi, Si y W, y en particular
pueden ser iones agregados poliatómicos (por ejemplo, compuestos de
Bi y óxidos de W y Mo), como se describe en los documentos
WO91/14460, WO92/17215, WO96/40287 y WO96/22914.
Los iones metálicos son quelados, de forma
deseable, por grupos quelantes sobre el resto conector, o en o
sobre una partícula (por ejemplo, una vesícula o un sólido orgánico
o inorgánico poroso o no poroso), en particular quelantes lineales,
macrocíclicos, de terpiridina y N_{2}S_{2}, tales como, por
ejemplo, DTPA, DTPA-BMA, EDTA, D03A, TMT. Otros
ejemplos de grupos quelantes apropiados se describen en los
documento US-A-464744, WO89/00557,
US-A-5367080,
US-A-5364613, etc.
El resto conector o la partícula pueden contener
uno o más de dichos grupos quelantes, si se desea, metalados por
más de una especie metálica (por ejemplo, para proporcionar
indicadores detectables en diferentes modalidades de formación de
imágenes).
En particular, cuando el metal no es radiactivo,
se prefiere utilizar un conector poliquelante o un indicador en
partículas.
Un quelante o grupo quelante, como se denomina
en la presente, puede comprender el resto de uno o más de una
amplia variedad de agentes quelantes que pueden complejar un ion
metálico o un ion poliatómico (por ejemplo, TcO).
Como se sabe, un agente quelante es un compuesto
que contiene átomos donantes que se pueden combinar, mediante un
enlace coordinado, con un átomo metálico para formar una estructura
cíclica denominada complejo de quelación o quelato. Esta clase de
compuestos se describe en Kirk-Othmer Enciclopedia
of Chemical Technology, vol. 5, 339-368.
El resto de un agente quelante adecuado puede
seleccionarse de polifosfatos, tales como tripolifosfato de sodio y
ácido hexametafosfórico; ácidos aminocarboxílicos, tales como ácido
etilendiaminotetraacético, ácido
N-(2-hidroxi)etilendiaminotetraacético, ácido
nitriloacético,
N,N-di(2-hidroxietil)glicina,
etilenbis(hidroxifenil-glicina) y ácido
dietilentriaminopentaacético; 1,3-dicetonas, tales
como acetilacetona, trifluoroacetilacetona, y
tenoiltrifluoroacetona; ácidos hidroxicarboxílicos, tales como
ácido tartárico, ácido cítrico, ácido glucónico, y ácido
5-sulfosalicílico; poliaminas, tales como
etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetraamina, y
triaminotrietilamina; aminoalcoholes, tales como trietanolamina y
N-(2-hidroxietil)etilendiamina; bases
heterocíclicas aromáticas, tales como
2,2'-diimidazol, picolinamina, dipicolinamina, y
1,10-fenantrolina; fenoles, tales como
salicilaldehído, disulfopirocatecol, y ácido cromotrópico;
aminofenoles, tales como 8-hidroxiquinoleína y
ácidos oximasulfónico; oximas, tales como dimetilglioxima y
salicilaldoxima; péptidos que contienen una funcionalidad quelante
proximal, tales como policisteína, polihistidina, poli(ácido
aspártico), poli(ácido glutámico), o combinaciones de estos
aminoácidos; bases de Schiff, tales como disalicilaldehído,
1,2-propilendiimina; tetrapirroles, tales como
tetrafenilporfina y ftalocianina; compuestos de azufre, tales como
toluenditiol, ácido
meso-2,3-dimercaptosuccínico,
dimercaptopropanol, ácido tioglicólico, xantato de etilo de
potasio, dietilditiocarbamato de sodio, ditizona, ácido
dietilditiofosfórico, y tiourea; compuestos macrocíclicos
sintéticos, tales como
dibenzo[18]corona-6,
(CH_{3})_{6}-[14]-4,11]-dien-N_{4},
y (2.2.2.-criptato); ácidos fosfónicos, tales como ácido
nitrilotrimetilenfosfónico, etilendiaminotetra(ácido
metilenfosfónico), y ácido hidroxietildiendifosfónico, o
combinaciones de dos o más de los anteriores agentes. El resto de
un grupo quelante adecuado comprende preferiblemente un grupo
poli(ácido carboxílico), y los ejemplos preferidos incluyen: ácido
etilendiamino-N,N,N',N'-tetraacético
(EDTA); ácido
N,N,N',N'',N'''-dietilentriaminopentaacético
(DTPA); ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N'',N'''-tetraacético
(DOTA); ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N''-triacético
(D03A); ácido
1-oxa-4,7,10-triazaciclododecan-N,N',N''-triacético
(OTTA); y ácido
trans(1,2)-ciclohexandietilentriaminopentaacético
(CDTPA).
Otros restos de agentes quelantes adecuados
comprenden proteínas modificadas para la quelación de metales,
tales como tecnecio y renio, como se describe en la patente de EEUU
nº 5078985.
Los restos de agentes quelantes adecuados
también pueden derivarse de compuestos que contienen N3S y N2S2,
como por ejemplo, los descritos en las patentes de EEUU nº 4444690;
4670545; 4673562; 4897255; 4965392; 4980147; 4988496; 5021556; y
5075099.
Otros restos de quelantes adecuados se describen
en el documento PCT/US91/08253.
Los grupos quelantes preferidos se seleccionan
del grupo que consiste en 2-aminometilpiridina,
ácido iminoacético, ácido iminodiacético, ácido
etilandiaminotetraacético (EDTA), ácido
dietilentriamino-pentaacético (DTPA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacético
(DOTA), ácido carboniliminodiacético, ácido metileniminoacético,
ácido metileniminodiacético, ácido etilentioetileniminoacético,
ácido etilentioetilen-iminodiacético, TMT, un grupo
terpiridinilo, un agente quelante que comprende un grupo terpiridilo
y un grupo carboximetilamino, o una sal de cualquiera de los ácidos
anteriores. Los grupos quelantes especialmente preferidos son DTPA,
DTPA-BMA, DPDP, TMT, DOTA y HPD03A.
También se describen grupos quelantes
representativos en los documentos US 5559214 A, WO 9526754, WO
9408624, WO 9409056, WO 9429333, WO 9408624, WO 9408629 A1, WO
9413327 A1 y WO 9412216 A1.
Los procedimientos para metalar cualquier agente
quelante presente están dentro del nivel de los expertos en la
técnica. Los metales pueden incorporarse en un resto quelante
mediante uno de tres procedimientos generales: incorporación
directa, síntesis de moldes y/o transmetalación. Se prefiere la
incorporación directa.
Por tanto, resulta deseable que el ion metálico
pueda complejarse con facilidad en el agente quelante, por ejemplo,
simplemente exponiendo o mezclando una disolución acuosa del resto
que contiene el agente quelante con una sal metálica en una
disolución acuosa que tenga preferiblemente un pH en el intervalo de
aproximadamente 4 a aproximadamente 11. La sal puede ser cualquier
sal, pero preferiblemente la sal es una sal soluble en agua del
metal, tal como una sal de halógeno, y más preferiblemente estas
sales se seleccionan de modo que no interfieran con la unión del
ion metálico con el agente quelante. El resto que contiene el agente
quelante se encuentra preferiblemente en disolución acuosa a un pH
entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, más preferiblemente a
un pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. El resto que
contiene el agente quelante puede mezclarse con sales tamponantes,
tales como citrato, acetato, fosfato y borato, para producir el pH
óptimo. Preferiblemente, las sales tamponantes se seleccionan de
modo que no interfieran con la posterior unión del ion metálico con
el agente quelante.
En la formación de imágenes de diagnóstico, el
constructo de
vector-conector-indicador (VLR)
contiene preferiblemente una proporción de ion de radionúclido
metálico y agente quelante que es eficaz en dichas aplicaciones de
formación de imágenes de diagnóstico. En realizaciones preferidas,
la proporción molar de ion metálico por agente quelante es de
aproximadamente 1:1.000 a aproximadamente 1:1.
En aplicaciones radioterapéuticas, el VLR
contiene preferiblemente una proporción de ion de radionúclido
metálico y agente quelante que es eficaz en estas aplicaciones
terapéuticas. En realizaciones preferidas, la proporción molar de
ion metálico por agente quelante es de aproximadamente 1:100 a
aproximadamente 1:1. El radionúclido puede seleccionarse, por
ejemplo, de radioisótopos de Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn,
Ge, Mo, Ru, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta y Ti. Los
radionúclidos preferidos incluyen ``Se, ^{64}Cu, ^{67}Cu,
^{212}Pb, ^{68}Ga, ^{90}Y, ^{153}Sm, ^{212}Bi, ^{186}Re
y ^{188}Re. De éstos, se prefiere especialmente ^{90}Y. Estos
radioisótopos pueden ser atómicos o preferiblemente iónicos.
Los siguientes isótopos o pares de isótopos
pueden utilizarse para la formación de imágenes y para terapia sin
tener que cambiar la metodología de marcaje radiactivo o quelante:
^{47}SC_{21}; ^{141}Ce_{58}: ^{188}Re_{75};
^{177}Lu_{71}; ^{199}Au_{79;} ^{47}SC_{21};
^{131}I_{53}; ^{67}CU_{29}; ^{131}I_{53} y
^{123}I_{53;} ^{188}Re_{75} y ^{99m}TC_{43};
^{90}Y_{39} y ^{87}Y_{39}; ^{47}SC_{21} y
^{44}SC_{21}; ^{90}Y_{39} y ^{123}I_{53};
^{146}Sm_{62} y ^{153}Sm_{62}; y ^{90}Y_{39} y
^{111}In_{49}.
Cuando el resto conector contiene un único
quelante, este quelante puede estar unido directamente al resto
vector, por ejemplo, a través de grupos coordinantes metálicos del
quelante, que pueden formar un enlace éster, amida, tioéster o
tioamida con un grupo amino, tiol o hidroxilo sobre el vector. Como
alternativa, el vector y el quelante pueden estar unidos
directamente a través de una funcionalidad unida al esqueleto del
quelante, por ejemplo, un grupo
CH_{2}-fenil-NCS unido a un
carbono del anillo de DOTA, como propuso Meares et al. en
JACS, 100:6266-6267 (1988), o indirectamente a
través de un conector homo- o heterobifuncional, por ejemplo, una
bisamina, bisepóxido, diol, diácido, PEG difuncionalizado, etc. En
este caso, el conector bifuncional proporciona, de modo
conveniente, una cadena de 1 a 200, preferiblemente de 3 a 30 átomos
entre el resto vector y quelante.
Cuando el resto conector contiene una pluralidad
de grupo quelantes, el conector preferiblemente es o contiene
porciones de fórmula
en la que Ch es un resto quelante y
Li es un componente del esqueleto conector, es decir, el conector
preferiblemente tiene quelantes colgantes, quelantes dentro del
esqueleto, o quelantes terminales, o una combinación de éstos. Las
estructuras poliméricas colgantes y dentro del esqueleto pueden ser
ramificadas pero más preferiblemente son lineales, y la unidades
repetidas (LiCh) u otras unidades repetidas en el polímero pueden
tener grupos modificadores de la biodistribución dentro del
esqueleto o colgantes, por ejemplo, grupos polialquileno como en
los documentos WO94/08629, WO94/09056 y WO96/20754. Las estructuras
quelantes terminales Li(Ch)_{n}, que pueden ser
polímeros dendríticos como en el documento WO93/06868, pueden tener
grupos modificadores de la biodistribución unidos a los terminales
no ocupados por quelantes, y pueden tener sitios de potenciación de
la biodegradación dentro de la estructura del conector, como en el
documento
WO95/28966.
Los restos quelantes dentro del conector
poliquelante pueden estar unidos a través de la funcionalización
del esqueleto del quelante, o mediante la utilización de uno o más
de los grupos coordinados metálicos del quelante, o mediante la
formación de un enlace amida o éter entre el quelante ácido y un
esqueleto de conector que porta grupos amino o hidroxilo, por
ejemplo, como en polilisina-poliDTPA,
polilisin-poliDOTA, y en los denominados
poliquelantes magnificadores del documento PCT/EP96/00565. Estos
conectores poliquelantes pueden estar conjugados con uno o más
grupos vector directamente (por ejemplo, utilizando grupos amino,
ácido o hidroxilo en el conector poliquelante), o mediante un
compuesto conector bifuncional, como se analizó anteriormente para
los conectores monoquelantes.
Cuando la especia quelada es portada por un
conector en partículas (o un agregado molecular, por ejemplo,
vesicular), el quelato puede ser, por ejemplo, un mono- o
poliquelato sin unir (tal como Gd DTP-BMA o Gd
HP-D03A) encerrado dentro de una partícula, o puede
ser un mono- o poliquelato conjugado con la partícula mediante
enlace covalente o mediante la interacción de un grupo de anclaje
(por ejemplo, un grupo lipófilo) sobre el mono/poliquelato con la
membrana de una vesícula (véase, por ejemplo, el documento
PCT/GB95/02378).
Los indicadores atómicos no metálicos preferidos
incluyen radioisótopos, tales como ^{123}I y ^{131}I, así como
átomos de espín nuclear no cero, tales como ^{19}F, y átomos
pesados, tales como I.
Estos indicadores, preferiblemente una
pluralidad de éstos, por ejemplo de 2 a 200, pueden estar unidos
covalentamente al esqueleto del conector, directamente usando
técnicas de síntesis química convencionales, o a través de un grupo
portador, por ejemplo, un grupo triyodofenilo.
En una realización de esta invención, se
contempla específicamente el uso de radioisótopos de yodo. Por
ejemplo, si el vector o conector está formado por sustituyentes que
pueden sustituirse químicamente con yodo en una reacción de
formación de enlace covalente, tales como, por ejemplo,
sustituyentes que contienen una funcionalidad hidroxifenilo, estos
sustituyentes pueden marcarse mediante procedimientos muy conocidos
en la técnica con un radioisótopo de yodo. La especie de yodo puede
utilizarse en aplicaciones de formación de imágenes terapéuticas y
de diagnóstico, mientras que, al mismo tiempo, un metal en el agente
quelante en el mismo vector-conector también puede
utilizarse en aplicaciones de formación de imágenes terapéuticas y
de diagnóstico. Al igual que los quelantes metálicos analizados
anteriormente, estos indicadores atómicos metálicos pueden unirse al
conector, o ser portados en o sobre un conector en partículas, por
ejemplo en una vesícula (véanse los documentos WO95/26205 y
GB9624918.0).
Pueden utilizarse conectores del tipo descrito
anteriormente en conexión con indicadores metálicos para indicadores
atómicos no metálicos, tomando el puesto los indicadores atómicos
no metálicos o los grupos que portan dichos indicadores, de algunos
o todos los grupos quelantes.
Los indicadores cromofóricos y fluorofóricos
orgánicos preferidos incluyen grupos que tiene un sistema de
electrones deslocalizados extenso, por ejemplo, cianinas,
merocianinas, ftalocianinas, naftalocianinas, trifenilmetinas,
porfirinas, tintes de pirilio, tintes de tiapirilio, tintes de
escuarilio, tintes de croconio, tintes de azulenio, indoanilinas,
tintes de benzofenoxazinio, tintes de benzotiafenotiazinio,
antraquinonas, naftoquinonas, indatrenos, ftaloilacridonas,
trisfenoquinonas, tintes azoicos, tintes y complejos de tintes de
transferencia de carga intramolecular e intermolecular, troponas,
tetrazinas, complejos de bis(ditioleno), complejos de
bis(benceno-ditiolato), tintes de
yodoanilina, complejos de bis(S,O-ditioleno),
etc. Pueden encontrarse ejemplos de cromóforos orgánicos u
orgánicos metalados adecuados en "Topics in Applied Chemistry:
Infrared absorbing dyes", Ed. M. Matsuoka, Plenum, NY, 1990;
"Topics in Applied Chemistry: The Chemistry and Application of
Dyes", Waring et al., Plenum, NY, 1990; "Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals", Haugland, Molecular
Probes, Inc., 1996; documentos
DE-A-4445065,
DE-A-4326466,
JP-A-3/228046; Narayanan et
al., J. Org. Chem., 60:2391-2395 (1995);
Lipowska et al., Heterocyclic Comm.,
1:427-430 (1995); Fabian et al., Chem. Rev.,
92:1197 (1992); documento WO96/23525; Strekowska et al., J.
Org. Chem., 57:4578-4580 (1992); documentos WO
(Axis) y WO96/17628. Los ejemplos concretos de cromóforos que
pueden utilizarse incluyen xilencianol, fluoresceína, dansilo, NBD,
verde de indocianina, DODCI, DTDCI, DOTCI y DDTCI.
Se prefieren particularmente los grupos que
tienen unos máximos de absorción entre 600 y 1000 nm para evitar
interferencias con la absorción de hemoglobina (por ejemplo,
xilencianol).
Otros ejemplos incluyen:
tintes de cianina: tales como tintes de
heptametincianina, por ejemplo, los compuestos 4a a 4g de la tabla
II en la página 26 de Matsuoka (supra)
4a: en la que Y = S, X = I, R =
Et;
4b: en la que Y = S, X = ClO_{4}, R = Et;
4c: en la que Y = CMe_{2}, X = I, R = Me;
4d: en la que Y = CMe_{2}, X = ClO_{4}, R =
Me;
4e: en la que Y = CH=CH, X = I, R = Et;
4f: en la que Y = CH=CH, X = Br, R = Et;
4g: en la que Y = CH=CH, X = ClO_{4}, R =
Et;
y en la tabla III de la página 28 de Matsuoka
(supra), es decir,
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y = O, X = I, R =
Me;
en la que Y = CMe_{2}, X = I, R = Me;
en la que Y = S, X = Br, R = Et;
tintes de chalcogenopirilometina, por ejemplo,
los compuestos 12 de la página 31 de Matsuoka (supra), es
decir,
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y = Te, Se, O o
NR;
tintes de monochalcogenopirilometina, por
ejemplo, los compuestos 13 de la página 31 de Matsuoka
(supra), es decir,
en la que n = 1 ó
2;
tintes de pirilio, por ejemplo, los compuestos
14 (X = O) de la página 32 de Matsuoka (supra), es decir,
en la que X = O, S o
Se;
\newpage
tintes de tiapirilio, por ejemplo, los
compuestos 15 de la página 32, y el compuesto I de la página 167 de
Matsuoka (supra), es decir,
en la que n = 1 ó
2;
tintes de escuarilio, por ejemplo, el compuesto
10 y la tabla IV de la página 30 de Matsuoka (supra), es
decir,
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
X = CH=CH, Y = H, y R = Et;
X = S, Y = H, y R = Et; y
X = CMe_{2}, Y = H, y R = Me;
y el compuesto 6, página 26, de Matsuoka
(supra), es decir,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X = CH=CH, Y = H, y R =
Et;
tintes de croconio, por ejemplo, el compuesto 9
y la tabla IV de la página 30 de Matsuoka (supra), es
decir,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
X = CH=CH, Y = H, y R = Et;
X = S, Y = H, y R = Et; y
X = CMe_{2}, Y = H, y R = Me;
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
y el compuesto 7, página 26, de Matsuoka
(supra), es decir,
en la que X = CH=CH, Y = H, y R =
Et;
tintes de azulenio, por ejemplo, el compuesto 8
de la página 27 de Matsuoka (supra), es decir,
tintes de merocianina, por ejemplo,
el compuesto 16, R = Me, de la página 32 de Matsuoka (supra),
es
decir,
tintes de indoanilina, tales como
complejos de cobre y níquel de tintes de indoanilina, por ejemplo,
el compuesto 6 de la página 63 de Matsuoka (supra), es
decir,
en la
que
R = Et, R' = Me, M = Cu;
R = Et, R' = Me, M = Ni;
R = Me, R' = H, M = Cu; o
R = Me, R' = H, M = Ni;
tintes de benzo[a]fenoxazinio y
tintes de benzo[a]fenotiazinio, por ejemplo, como se
muestra en la página 201 de Matsuoka (supra),
en la que X = O o
S;
\global\parskip1.000000\baselineskip
1,4-diaminoantraquinona(N-alquil)-3'-tioxo-2,3-dicarboximidas,
por ejempl, el compuesto 20 de la página 41 de Matsuoka
(supra),
pigmentos de indantreno, por
ejemplo,
véase el compuesto 21 de la página
41 de Matsuoka
(supra);
tintes de
2-arilamino-3,4-ftaloilacridona,
por ejemplo, el compuesto 22 de la página 41 de Matsuoka
(supra),
tintes de trisfenoquinona, por
ejemplo, el compuesto 23 de la página 41 de Matsuoka
(supra),
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
tintes azoicos, por ejemplo, el
tinte monoazoico, compuesto 2 de la página 90 de Matsuoka
(supra), es
decir,
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
X = CH=C(CN)_{2}, R_{1} =
R_{2} = Et, R_{3} = R_{4} = H;
X = C(CN)=C(CN)_{2},
R_{1} = R_{2} = Et, R_{3} = R_{4} = H; o
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
X =
e Y = C=O, R_{1} = R_{2} = Et,
R_{3} = R_{4} =
H;
o Y = SO_{2}, R_{1} = H, R_{2} =
CH(Me)nBu, R_{3} = OMe, y R_{4} = NHAc;
tintes azoicos, por ejemplo, el tinte
poliazoico, compuesto 5 de la página 91 de Matsuoka (supra),
es decir,
tintes de infrarrojo de
transferencia de carga donante-aceptor
intramolecular, por ejemplo, los compuestos 6 y 7 de la página 91
de Matsuoka (supra), es
decir,
y
tintes aromáticos no benzenoides,
por ejemplo, el compuesto 8, una tropona, de la página 92 de
Matsuoka (supra), es
decir,
tintes de radicales de tetrazina,
por ejemplo, el compuesto 9 de la página 92 de Matsuoka
(supra), es
decir,
en la
que
X = p-fenileno, o
\global\parskip1.000000\baselineskip
X = p-terfenileno, así como el
compuesto 10 de la página 92 de Matsuoka (supra), es
decir,
en la que X =
p-bifenilo;
sales catiónicas de tintes de radicales de
tetrazina, por ejemplo, el compuesto 11 de la página 92 de Matsuoka
(supra),
en la que X =
p-fenileno;
tintes de transferencia de carga
donante-aceptor intermolecular, por ejemplo,
complejos de CT de los compuestos 13b y 14a a 14c de la página 93
de Matsuoka (supra), es decir,
en la
que
X =
CH=N-N(Ph)_{2} en el donante, y
a) Y = CN, Z = NO_{2};
b) Y = CN, Z = H; o
c) Y = Cl, Z = NO_{2} en el aceptor;
tintes de antraquinona, por ejemplo, los
compuestos 12 (X = S o Se) en la página 38 de Matsuoka
(supra), es decir,
en la que X = S o Se, e Y =
tetracloro, tetrabromo, ácido 2,3-dicarboxílico,
anhídrido 2,3-dicarboxílico, o
N-fenilimida del ácido
2,3-dicarboxílico;
tintes de naftoquinona, por ejemplo, los
compuestos 2, 3 y 4 de la página 37 de Matsuoka (supra), es
decir,
\vskip1.000000\baselineskip
y
tintes azoicos metalados, tales
como tintes azoicos que contienen níquel, cobalto, cobre, hierro y
manganeso;
tintes de ftalocianina, por ejemplo, el
compuesto 1 en la tabla II de la página 51 de Matsuoka
(supra), por ejemplo,
tintes de naftalocianina, por
ejemplo, el compuesto 3 en la tabla II de la página 51 de Matsuoka
(supra), por
ejemplo,
ftalocianinas metálicas, tales como
ftalocianinas que contienen aluminio, silicio, níquel, cinc, plomo,
cadmio, magnesio, vanadio, cobalto, cobre y hierro, por ejemplo, el
compuesto 1 en la tabla III de la página 52 de Matsuoka
(supra), por
ejemplo,
en la que, por ejemplo, M =
Mg;
\global\parskip0.930000\baselineskip
naftalocianinas metálicas, tales como
naftalocianinas que contienen aluminio, cinc, cobalto, magnesio,
cadmio, silicio, níquel, vanadio, plomo, cobre y hierro, véase el
compuesto 3 en la tabla III de la página 52 de Matsuoka
(supra), por ejemplo,
en la que, por ejemplo, M =
Mg;
complejos metálicos de bis(ditioleno) que
comprenden un ion metálico, tal como níquel, cobalto, cobre y
hierro, coordinado con cuatro átomos de azufre en un complejo de
ligando de bis(S,S'-bidentado), por ejemplo,
véase la tabla I de la página 59 de Matsuoka (supra),
en la
que
R_{1} = R_{2} = CF_{3}, M = Ni;
R_{1} = R_{2} = fenilo, M = Pd;
R_{1} R_{2} = fenilo, M = Pt;
R_{1} = alquilo C4 a C10, R_{2} = H, M =
Ni;
R_{1} = alquilo C4 a C10, R_{2} = H, M =
Pd;
R_{1} = alquilo C4 a C10, R_{2} = H, M =
Pt;
R_{1} = R_{2} = fenilo, M = Ni;
R_{1} = R_{2} =
p-CH_{3}-fenilo, M = Ni;
R_{1} = R_{2} =
p-CH_{3}O-fenilo, M = Ni;
R_{1} = R_{2} =
p-Cl-fenilo, M = Ni;
R_{1} = R_{2} =
p-CF_{3}-fenilo, M = Ni;
R_{1} = R_{2} =
3,4-diCl-fenilo, M = Ni;
R_{1} R_{2} =
o-Cl-fenilo, M = Ni;
R_{1} R_{2} =
o-Br-fenilo, M = Ni;
R_{1} R_{2} =
3,4-diCl-fenilo, M = Ni;
R_{1} R_{2} = p-CH_{3}, M
= Ni;
R_{1} R_{2} = 2-tienilo, M =
Ni;
R_{1} =
p-(CH_{3})_{2}N-fenilo, R_{2} = fenilo,
M = Ni; y
R_{1} =
p-(CH_{3})_{2}N-fenilo, R_{2} =
p-H_{2}N-fenilo, M = Ni;
complejos metálicos de
bis(bencenditiolato) que comprenden un ion metálico, tal como
níquel, cobalto, cobre y hierro, coordinado con cuatro átomos de
azufre en un complejo de ligando, por ejemplo, véase la tabla III
de la página 62 de Matsuoka (supra), es decir,
en la
que
X = tetrametilo, M = Ni;
X = 4,5-dimetilo, M = Ni;
X = 4-metilo, M = Ni;
X = tetracloro, M = Ni;
X = H, M = Ni;
X = 4-metilo, M = Co;
X = 4-metilo, M = Cu; y
X = 4-metilo, M = Fe;
tintes de indoanilina
N,O-bidentados que comprenden un ion metálico, tal
como níquel, cobalto, cobre y hierro, coordinado con dos átomos de
nitrógeno y dos de oxígeno de dos ligandos de indoanilina
N,O-bidentados, por ejemplo, el compuesto 6 en la
tabla IV de la página 63 de Matsuoka (supra), por
ejemplo,
en la
que
R = Et, R' = Me, M = Cu;
R = Et, R' = Me, M = Ni;
\global\parskip1.000000\baselineskip
R = Me, R' = H, M = Cu; y
R = Me, R' = H, M = Ni;
complejos metálicos de
bis(S,O-ditioleno) que comprenden un ion
metálico, tal como níquel, cobalto, cobre y hierro, coordinado con
dos átomos de azufre y dos átomos de oxígeno en un complejo de
ligando bis(S,O-bidentado), por ejemplo,
véase la patente de EEUU 3.806.462, por ejemplo,
complejos de
a-diimina-ditioleno que comprenden
un ion metálico, tal como níquel, cobalto, cobre y hierro,
coordinado con dos átomos de azufre y dos átomos de
imino-nitrógeno en un complejo de diligando mixto
S,S- y N,N-bidentado, por ejemplo, véase la tabla
II de la página 180, segundo desde abajo, de Matsuoka (supra)
(véanse también las patentes japonesas 62/39.682, 63/126.889 y
63/139.303), por
ejemplo,
y complejos de
tris(a-diimina) que comprenden un ion
metálico coordinado con seis átomos de nitrógeno en un complejo de
triligando, por ejemplo, véase la tabla II en la página 180 de
Matsuoka (supra), último compuesto (véanse también las
patentes japonesas 61/20.002 y 61/73.902), por
ejemplo,
Los ejemplos representativos de tintes visibles
incluyen derivados de fluoresceína, derivados de rodamina,
cumarinas, tintes azoicos, tintes metalizables, tintes de
antraquinona, tintes de benzofuranona, tintes de carbonilo
aromático policíclico, tintes de indigoide, tintes de polimetina,
tintes de azacarbocianina, tintes de hemicianina, barbituatos,
tintes de diazahemicianina, tintes de estirilo, tintes de
diarilcarbonio, tintes de triarilcarbonio, tintes de ftalocianina,
tintes de quinoftalona, tintes de trifenodioxazina, tintes de
formazán, tintes de fenotiazina, tales como azul de metileno, azur
A, azur B y azur C, tintes de oxazina, tintes de tiazina, tintes de
naftolactama, tintes de diazahemicianina, tintes de azopiridona,
tintes de azobenceno, tintes de mordiente, tintes ácidos, tintes
básicos, tintes metalizados y premetalizados, tintes de xanteno,
tintes directos, leucotintes que pueden oxidarse para producir
tintes con matices batocrómicos desplazados de los de los
leucotintes precursores, y otros tintes, tales como los listados en
Waring, D.R. y Hallas, G., en "The Chemistry and Application of
Dyes", Topics in Applied Chemistry, Plenum Press, Nueva York,
N.Y., 1990. Pueden encontrarse otros tintes listados en Haugland,
R.P., "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals",
6ª edición, Molecular Probes, Inc., Eugene OR, 1996.
Estos cromóforos y fluoróforos pueden unirse
covalentamente al vector directamente, o a una estructura de
conector o dentro de ésta. De nuevo, pueden emplearse conectores del
tipo descrito anteriormente en conexión con los indicadores
metálicos, para cromóforos o fluoróforos orgánicos, tomando el
puesto los cromóforos/fluoróforos de algunos o todos los grupos
quelantes.
Al igual que los quelantes metálicos analizados
anteriormente, los cromóforos/fluoróforos puede ser portados sobre
o en grupos conectores en partículas, por ejemplo, en o sobre una
vesícula, o pueden unirse covalentemente a partículas de matriz
inertes que también pueden actuar como indicador de dispersión de
luz.
Los indicadores y
conectores-indicadores en partículas se encuadran,
en general, en dos categorías: aquellos en los que las partículas
comprenden una matriz o envuelta que porta o contiene el indicador,
y aquellos en los que la matriz de partículas es, en sí misma, el
indicador. Los ejemplos de la primera categoría son: vesículas (por
ejemplo, micelas y liposomas) que contienen un fase sólida o líquida
que contiene el indicador de contraste eficaz, por ejemplo, un
radionúclido o metal paramagnético quelado, o un agente de contraste
de rayos X yodado soluble en agua; partículas porosas cargadas con
el indicador, por ejemplo, partículas de tamiz molecular cargadas
con metal paramagnético; y partículas sólidas, por ejemplo, de un
polímero biotolerable inerte, sobre el cual el indicador se une o
se reviste, por ejemplo, partículas de polímeros cargadas con
tinte.
Los ejemplos de la segunda categoría son:
partículas orgánicas o inorgánicas dispersoras de luz; partículas
magnéticas (es decir, partículas superparamagnéticas,
ferromagnéticas o ferrimagnéticas); y partículas de tinte.
Los indicadores o
indicadores-conectores en partículas preferidos
incluyen partículas superparamagnéticas (véanse los documentos
US-A-4770183, PCT/GB97/00067,
WO96/09840, etc.), vesículas ecogénicas (véanse los documentos
WO92/17212, PCT/GB97/00459, etc.), vesículas que contienen yodo
(véanse los documentos WO95/26205 y GB9624918.0), y partículas de
polímero cargadas con tinte (véase el documento WO96/23524).
Los indicadores en partículas pueden tener uno o
más vectores unidos directa o indirectamente a su superficie. En
general, se prefiere unir una pluralidad (por ejemplo, de 2 a 50) de
restos vectores por partícula. De forma particularmente
conveniente, además del vector de transporte dirigido deseado,
también se unen vectores desacelerantes de flujo a las partículas,
es decir, vectores que tienen afinidad por el lumen capilar u otras
superficies de órganos, que son suficientes para frenar el paso del
agente de contraste a través de los capilares o el órgano diana,
pero no son suficientes, por sí mismos, para inmovilizar al agente
de contraste. Estos vectores desacelerantes de flujo (descritos,
por ejemplo, en el documento GB9700699.3) pueden servir, además,
para anclar el agente de contraste cuando se ha unido a su sitio
diana.
Los medios mediante los cuales se logra la unión
del vector a la partícula dependerán de la naturaleza de la
superficie de la partícula. Para partículas inorgánicas, la unión a
la partícula puede ser, por ejemplo, mediante una interacción entre
un grupo de unión de metal (por ejemplo, un grupo fosfato, fosfonato
u oligo- o polifosfato) sobre el vector o sobre un conector unido
al vector. Para partículas orgánicas (por ejemplo, poliméricas), la
unión del vector puede realizarse mediante enlace covalente directo
entre grupos sobre la superficie de la partícula y grupos reactivos
en el vector, por ejemplo, enlaces amida o éster, o mediante unión
covalente del vector y la partícula a un conector. Pueden emplearse
los conectores del tipo descrito anteriormente en conexión con los
indicadores de metal quelado, aunque, en general, no se utilizarán
los conectores para acoplar a las partículas entre sí.
Para partículas no sólidas, por ejemplo, gotas
(por ejemplo, de líquidos yodados insolubles en agua, como se
describe en los documentos
US-A-5318767,
US-A-5451393,
US-A-5352459 y
US-A-5569448) y vesículas, el
conector puede contener, de modo conveniente, grupos "de
anclaje" hidrófobos, por ejemplo, cadenas C12-30
saturadas o insaturadas, que penetran la superficie de la partícula
y unen el vector a la partícula. Así, para vesículas de
fosfolípidos, el conector puede servir para unir covalentemente el
vector a un fosfolípido compatible con la membrana de la vesícula.
Los ejemplos de conectores que se unen a vesículas y partículas
inorgánicas se describen en los documentos GB9622368.0 y
PCT/GB97/00067.
Además de los vectores, pueden unirse otros
grupos a la superficie de las partículas, por ejemplo,
estabilizantes (para evitar la agregación) y modificadores de la
biodistribución, tales como PEG. Estos grupos se analizan en los
documentos PCT/GB97/00067, WO96/09840,
EP-A-284549 y
US-A-4904479.
Preferiblemente, los agentes
V-L-R tienen los vectores de
transporte dirigido a receptores acoplados directa o indirectamente
a un indicador, por ejemplo, con radioisótopos de yodo unidos
covalentemente, con quelatos metálicos unidos directamente o a
través de un grupo conector orgánico o acoplados a un indicador o
conector-indicador en partículas, por ejemplo,
cristales superparamagnéticos (opcionalmente revestidos, por
ejemñplo, como en el documento PCT/GB97/00067), o una vesícula, por
ejemplo, una micela o liposoma que contiene un agente de contraste
yodado.
Brevemente, para las modalidades de formación de
imágenes de MRI, rayos X, formación de imágenes ópticas, formación
de imágenes nucleares, magnetotomografía y tomografía de impedancia
eléctrica, los indicadores preferidos pueden ser los
siguientes:
MRI: partículas de óxido de hierro
superparamagnéticas, que tienen un tamaño de partícula, en general,
menor que aproximadamente 80 nm. En particular se prefieren óxidos
de hierro revestidos con diversos materiales de revestimiento,
tales como polielectrolitos, PEG, almidón y almidón hidrolizado.
También son útiles sustancias metálicas paramagnéticas, incluyendo
quelatos y materiales en partículas.
Formación de imágenes ópticas: cualquier grupo
indicador de formación de imágenes ópticas. El foco debe centrarse
en sustancias que absorben cerca del intervalo de los
infrarrojos.
Medicina nuclear: quelatos radiactivos que
comprenden ^{99}Tc o ^{111}In, así como vectores radiomarcados
directos que tienen sustituyentes halógenos radiomarcados, tales
como ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{75}Br o ^{77}Br.
Magnetotomografía: partículas de óxido de hierro
superparamagnéticas, como se describió anteriormente.
Tomografía de impedancia eléctrica: especies
poliiónicas, por ejemplo, polímeros con grupos iónicos en las
unidades repetidas.
Los agentes pueden administrarse a los pacientes
para la formación de imágenes en cantidades suficientes para
producir el contraste deseado con la técnica de formación de
imágenes concreta. Cuando el indicador es un metal, en general,
unas dosificaciones de 0,001 a 5,0 mmoles de ion metálico de
formación de imágenes quelado por kilogramo de peso corporal del
paciente son eficaces para lograr unas potenciaciones del contraste
adecuadas. Para la mayoría de las aplicaciones de MRI, las
dosificaciones preferidas de ion metálico de formación de imágenes
estarán en el intervalo de 0,02 a 1,2 mmoles/kg de peso corporal,
mientras que para aplicaciones de rayos X, unas dosificaciones de
0,05 a 2,0 mmoles/kg son eficaces, en general, para lograr la
atenuación de los rayos X. Las dosificaciones preferidas para la
mayoría de las aplicaciones de rayos X son de 0,1 a 1,2 mmoles del
compuesto de lantánido o metal pesado/kg de peso corporal. Cuando el
indicador es un radionúclido, unas dosificaciones de 0,01 a 100
mCi, preferiblemente de 0,1 a 50 mCi normalmente serán suficientes
por 70 kg de peso corporal. Cuando el indicador es una partícula
superparamagnética, la dosificación será normalmente de 0,5 a 30 mg
de Fe/kg de peso corporal.
Los compuestos pueden formularse con adyuvantes
farmacéuticos o veterinarios convencionales, por ejemplo,
emulsionantes, ésteres de ácidos grasos, agentes gelificantes,
estabilizantes, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad,
tampones, agentes de ajuste del pH, etc., y pueden estar en una
forma adecuada para la administración parenteral, por ejemplo
mediante inyección o infusión, o para la administración directamente
a la vasculatura. Por tanto, los compuestos de la presente
invención pueden estar en formas de administración farmacéutica
convencionales, tales como disoluciones, suspensiones y dispersiones
en medios vehículo fisiológicamente aceptables, por ejemplo, agua
para inyección.
Por tanto, los compuestos pueden formularse para
la administración utilizando vehículos o excipientes
fisiológicamente aceptables de una manera que está dentro de la
técnica. Por ejemplo, los compuestos, opcionalmente con la adición
de excipientes farmacéuticamente aceptables, pueden suspenderse o
disolverse en un medio acuoso, esterilizándose después la
disolución o suspensión resultante.
Las formas de administración parenteral, por
ejemplo, disoluciones intravenosas, deben ser estériles y estar
exentas de agentes fisiológicamente inaceptables, y deben tener una
baja osmolalidad para minimizar la irritación u otros efectos
adversos tras su administración y, por tanto, el medio de contraste
debe ser preferiblemente isotónico o ligeramente hipertónico. Los
vehículos adecuados incluyen vehículos acuosos que se emplean
habitualmente para administrar disoluciones parenterales, tales
como cloruro de sodio para inyección, inyección de Ringer,
inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio,
inyección de Ringer lactada y otras disoluciones, tales como las
que se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª
edición, Ëaston: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412
y 1461-1487 (1975), y The National Formulary XIV,
14ª edición, Washington: American Pharmaceutical Association
(1975). Las disoluciones pueden contener conservantes, agentes
antimicrobianos, tampones y antioxidantes que se emplean
convencionalmente para disoluciones parenterales, excipientes y
otros aditivos que son compatibles con los quelatos y que no
interfieren con la fabricación, conservación o uso de los
productos.
La presente invención se ilustrará a
continuación más a fondo mediante los siguientes ejemplos no
limitantes. A menos que se indique lo contrario, todos los
porcentajes aparecen en peso.
Compuesto
1
Se añade lisina (0,1 g, 0,7 mmol) a una
disolución de
N^{2}-[3S-hidroxi-4-(N-hidroxiamino)-2R-isobutilsuccinil]-L-(4-oximetilcarboxi)fenilalanin-N^{1}-metilamida
(preparada según el documento WO94/02447, 0,3 g, 0,7 mmol) y DCC
(N,N-diciclohexilcarbodiimida) en DMF
(N,N-dimetilformamida) seca. La mezcla de reacción
se agita a temperatura ambiente y después se realiza una TLC.
La dispersión se deja durante la noche a +4ºC.
La dispersión se filtra y el disolvente se evapora con rotación
antes de purificar la sustancia mediante cromatografía.
Compuesto
2
Se disuelve dianhídrido del ácido
dietilentriamino-pentaacético (17,9 g, 50 mmol) en
DMF seca y se añade el compuesto 1 (0,3 g, 0,5 mmol) disuelto en
DMF seca. La mezcla de reacción se agita a temperatura elevada bajo
una atmósfera de nitrógeno. Tras la reacción se realiza una TLC. El
disolvente se evapora con rotación y la sustancia se purifica
mediante cromatografía.
A una disolución del compuesto 2 (0,4 g, 0,4
mmol) en agua se le añade óxido de gadolinio Gd_{2}O_{3} (0,1
g, 0,2 mmol) y la mezcla se calienta a 95ºC. Después de una
filtración, la disolución se evapora y se seca al vacío a 50ºC.
Compuesto
3
Se añade lisina (0,1 g, 0,7 mmol) a una
disolución de
N-(4-octilfenil)-3-(2-carboxietil)-6,7-dihidro-5H-tiazolo[3,2-a]pirimidin-2-carboxamida
(preparada según el documento
E-PA-618208, 0,3 g, 0,7 mmol) y DCC
(N,N-diciclohexilcarbodiimida) en DMF
(N,N-dimetilformamida) seca. La mezcla de reacción
se agita a temperatura ambiente y después se realiza una TLC. La
dispersión se deja durante la noche a +4ºC. La dispersión se filtra
y el disolvente se evapora con rotación antes de purificar la
sustancia mediante cromatografía.
Compuesto
4
Se disuelve dianhídrido del ácido
dietilentriamino-pentaacético (17,9 g, 50 mmol) en
DMF seca y se añade el compuesto 3 (0,3 g, 0,5 mmol) disuelto en
DMF seca. La mezcla de reacción se agita a temperatura elevada bajo
una atmósfera de nitrógeno. Tras la reacción se realiza una TLC. El
disolvente se evapora con rotación y la sustancia se purifica
mediante cromatografía.
A una disolución del compuesto 4 (0,4 g, 0,4
mmol) en agua se le añade óxido de gadolinio Gd_{2}O_{3} (0,1
g, 0,2 mmol) y la mezcla se calienta a 95ºC. Después de una
filtración, la disolución se evapora y se seca al vacío a 50ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 2 del ejemplo 1 (1 mg) se disuelve
en NaOH 0,1 N. Se disuelve SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (100 \mug)
en HCl 0,05 N y se añade una disolución de ^{99m}Tc
10-100 mCi en forma de pertecnetato de sodio en
disolución salina. El pH de la disolución se ajusta a pH
7-8 mediante la adición de tampón fosfato 0,5 M (pH
5) después de menos de un minuto. Tras la reacción se realiza una
TLC y la sustancia se purifica mediante cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 4 del ejemplo 2 (1 mg) se disuelve
en NaOH 0,1 N. Se disuelve SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (100 \mug)
en HCl 0,05 N y se añade una disolución de ^{99m}Tc
10-100 mCi en forma de pertecnetato de sodio en
disolución salina. El pH de la disolución se ajusta a pH
7-8 mediante la adición de tampón fosfato 0,5 M (pH
5) después de menos de un minuto. Tras la reacción se realiza una
TLC y la sustancia se purifica mediante cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Una disolución acuosa de ^{131}I_{2} (2
equivalentes) y perclorato de sodio (1 equivalente) se añade a una
disolución acuosa de
N^{2}-[3S-hidroxi-4-(N-hidroxiamino)-2R-isobutilsuccinil]-L-fenilalanin-N^{1}-metilamida
(preparada según el documento WO94/02446, 1 equivalente). El
disolvente se evapora con rotación y la sustancia se purifica
mediante cromatografía.
Una mezcla de ácido
2-amino-4,5-dimetoxibenzoico
(9,9 mg, 0,050 mmol) y formamida (5 ml) se calentó a 190ºC durante
6 horas. La mezcla se enfrió hasta 80ºC y se vertió en agua (25 ml).
El material precipitado se retiró mediante filtración, se lavó con
agua y se secó al vacío. Rendimiento, 1,54 g (15%), un polvo marrón.
La estructura se confirmó mediante análisis de RMN de ^{1}H (500
MHz) y de ^{13}C (125 MHz).
Una suspensión del compuesto de a) (1,03 g, 5,00
mmol) en oxicloruro de fósforo (20 ml) se sometió a reflujo durante
3 horas. La disolución oscura se concentró y el residuo se suspendió
en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una disolución
saturada de bicarbonato de sodio y se secó (MgSO_{4}). La
disolución se filtró a través de una columna corta de sílice y se
concentró para producir 392 mg (35%) de material blancuzco. Los
espectros de RMN de ^{1}H (300 MHz) y de ^{13}C (75 MHz) estaban
de acuerdo con la estructura.
Una mezcla del compuesto de b) (112 mg, 0,500
mmol) y ácido 4-aminofenilacético (76 mg, 0,50 mmol)
en 2-propanol (8 ml) se sometió a reflujo durante 3
horas. La mezcla de reacción se enfrió y el material precipitado se
aisló, se lavó con 2-propanol y se secó al vacío.
Rendimiento, 183 mg (97%), un material sólido de color amarillo
pálido. La estructura se verificó mediante análisis de RMN de
^{1}H (500 MHz) y de ^{13}C (125 MHz). Se llevó a cabo otra
caracterización utilizando una espectrometría de masas MALDI (matriz
de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico),
dando m/z para [MH]^{+} a 341, esperado 340.
A una suspensión del compuesto de c) (38 mg,
0,10 mmol) y clorhidrato de
N-Boc-1,6-diaminohexano
(25 mg, 0,10 mmol) en DMF (2,0 ml) se le añadió
N,N-diisopropiletilamina (34 ml, 0,20 mmol). A la
disolución transparente se le añadió clorhidrato de
N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
(19 mg, 0,10 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (15 mg,
0,10 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante la noche y luego se vertió en 25 ml de agua que contenía
carbonato de sodio (2,5 g) y cloruro de sodio (4,0 g). El material
orgánico se extrajo en cloroformo y la fase orgánica se lavó con
agua y se secó (Na_{2}SO_{4}). La disolución se filtró y se
concentró. El producto se purificó mediante una cromatografía en
columna (sílice, cloroformo/metanol/ácido acético 85:10:5) y, por
último, se liofilizó del ácido acético. Rendimiento, 54 mg (90%), un
material sólido de color amarillo-blanco (acetato).
El producto se caracterizó mediante una espectrometría de masas
MALDI (matriz de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico),
dando m/z para [MH]^{+} a 539, como se esperaba.
Se llevó a cabo otra caracterización utilizando
espectroscopia de RMN de ^{1}H (500 MHz) y de ^{13}C (125
MHz).
El compuesto de d) (27 mg, 0,050 mmol) se
disolvió en dioxano (3 ml) mediante calentamiento suave. A la
disolución se le añadió HCl 4 N en dioxano (0,5 ml). La mezcla de
reacción se agitó durante la noche y se concentró al vacío para
producir un rendimiento cuantitativo del compuesto del título. La
caracterización se realizó utilizando espectrometrías de masas
MALDI (matriz de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico),
dando m/z para [MH]^{+} a 439, como se esperaba. Se llevó
a cabo otra caracterización utilizando HPLC analítica (columna Vydac
218TP54, gradiente de B al 12-24% a lo largo de 20
min, A = agua/TFA al 0,1%, B = acetonitrilo/TFA al 0,1%, caudal 1,0
ml/min) dando un único pico de producto con un tiempo de retención
de 13,0 min detectado a 340 nm. La caracterización también se llevó
a cabo mediante espectroscopia de RMN, dando unos espectros de
^{1}H (500 MHz) y de ^{13}C (125 MHz) de acuerdo con la
estructura.
Se añadió
N,N-diisopropiletilamina (17 \mul, 0,10 mmol) a
una suspensión del compuesto de e) (0,05 mmol) y anhídrido de DTPA
(179 mg, 0,500 mmol) en DMF (5 ml). La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío. Un análisis de
HPLC (columna Vydac 218TP54, gradiente de B al
16-28% a lo largo de 20 minutos, A = agua/TFA al
0,1%, B = acetonitrilo/TFA al 0,1%, caudal 1,0 ml/min) produjo un
pico de producto a 7,9 min, el cual se demostró mediante
LC-MS (ESI) que se correspondía con el compuesto del
título (m/z para [MH]^{+}
a 813, esperado 814). El producto se purificó mediante HPLC preparativa (columna Vydac 218TP1022, gradiente de B al 16-28% a lo largo de 60 minutos, A = agua/TFA al 0,1%, B = acetonitrilo/TFA al 0,1%, caudal 1,0 ml/min, detección a 254 nm), dando un rendimiento de 6,7 mg de material purificado. Un análisis de HPLC analítico del material purificado mostró un desplazamiento en el tiempo de retención de 5,6 min (condiciones analíticas como las descritas anteriormente), que mediante una espectrometría de masas MALDI demostró corresponder al complejo de hierro, dando m/z a 870 para el complejo, y 816 para el ligando libre.
a 813, esperado 814). El producto se purificó mediante HPLC preparativa (columna Vydac 218TP1022, gradiente de B al 16-28% a lo largo de 60 minutos, A = agua/TFA al 0,1%, B = acetonitrilo/TFA al 0,1%, caudal 1,0 ml/min, detección a 254 nm), dando un rendimiento de 6,7 mg de material purificado. Un análisis de HPLC analítico del material purificado mostró un desplazamiento en el tiempo de retención de 5,6 min (condiciones analíticas como las descritas anteriormente), que mediante una espectrometría de masas MALDI demostró corresponder al complejo de hierro, dando m/z a 870 para el complejo, y 816 para el ligando libre.
El compuesto de f) (0,1 mg) se disolvió en una
disolución acuosa de tricloruro de gadolinio (concentrado, 2 mg/ml,
0,1 ml). La mezcla se agitó durante la noche. La conversión
cuantitativa al complejo de gadolinio se verificó mediante
espectrometría de masas MALDI (matriz de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico),
dando picos m/z a 970, 992 y 1014 para el complejo de gadolinio
(gadolinio, gadolinio/sodio y gadolinio/disodio, respectivamente),
y a 816/838 correspondiendo al complejo de ligando/sodio libre. No
se detectaron trazas del complejo de hierro.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una HPLC analítica de la mezcla de reacción en
el ejemplo 6f) también produjo un pico a 16,8 min, el cual se
demostró mediante análisis de LC-MS (EIS) que se
correspondía con la bisamida de DTPA mostrada anteriormente, dando
m/z a 1233 para [MH]^{+} como se esperaba, y 616,6 como se
esperaba para [MH_{2}]^{2+}. El producto se purificó
mediante HPLC preparativa (condiciones como las descritas en el
ejemplo 6f)) para producir 14 mg de material puro después de la
liofilización. Un análisis de HPLC analítica del material purificado
mostró un desplazamiento en el tiempo de retención de 16,8 min (en
la mezcla bruta) hasta 11,1 min debido a la formación del complejo
de hierro durante la purificación, según se verificó mediante
espectrometría de masas MALDI (matriz de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico),
dando m/z a 1291 para el complejo de hierro, y 1237 para el ligando
libre.
El compuesto de a) se trató con tricloruro de
gadolinio como se describió en el ejemplo 6g). Después de 2 horas
de tiempo de reacción, una espectrometría de masas MALDI demostró la
conversión al complejo de gadolinio, dando m/z a 1391 para el
complejo de gadolinio, y 1235 para el ligando libre.
A una disolución en THF (130 ml) de ácido
3-bromo-4-metilbenzoico
(5,0 g, 23,25 mmol) bajo una atmósfera de nitrógeno y enfriada
hasta -78ºC (hielo seco/metanol) se la añadió MeMgBr en éter (3,0 M,
8,5 ml, 25,57 mmol) a una velocidad tal que la temperatura no
aumentó por encima de -75ºC. Después se dejó que la temperatura
aumentase hasta -60ºC, y después de que hubo cesado la emisión de
gas, la disolución se volvió a enfriar hasta -78ºC. Entonces se
añadió BuLi en hexano (1,6 M, 29,06 ml, 46,50 mmol) gota a gota de
forma que la temperatura no aumentara por encima de -75ºC. La
mezcla entonces se agitó a esta temperatura durante 15 minutos antes
de añadir hielo seco triturado (4,4 g, 100 mmol). El precipitado se
agitó vigorosamente a medida que se dejaba que la temperatura
aumentase libremente hasta la temperatura ambiente. La mezcla se
hizo ácida utilizando HCl 6 N, y el material sólido se recogió
mediante filtración, se lavó con éter dietílico y se secó. Una
recristalización en agua produjo el compuesto puro de color
blancuzco (81%), p.f. 296-298ºC (sublimado). La RMN
se ajusta a la estructura esperada.
Una mezcla del compuesto (2) (2,83 g, 15,71
mmol), cloruro de tionilo (50 ml) y DMF (3 gotas) se calentó a
reflujo durante 2 horas. Después de enfriar hasta la temperatura
ambiente, se eliminó el exceso de cloruro de tionilo a presión
reducida (evaporador rotatorio). El aceite oscuro que se obtuvo se
disolvió en tetracloruro de carbono (30 ml), se trató con piridina
(1 ml, 12,43 mmol) y metanol (20 ml), y se agitó a temperatura
ambiente durante 2 horas. Los disolventes se evaporaron y el
residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida
(sílice, hexano/EtOAc (9:1)).
Una mezcla de (4) (0,96 g, 4,61 mmol), peróxido
de dibenzoílo (56 mg, 0,23 mmol) y
N-bromosuccinimida (NBS) (0,82 g, 4,61 mmol) en
tetracloruro de carbono (20 ml) se calentó a reflujo durante 20
horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente y una
filtración, el disolvente se evaporó para producir un aceite
amarillo. Una cromatografía de resolución rápida (sílice,
hexano/EtOAc (7:3)) produjo el compuesto puro.
Una disolución de (5) (511 mg, 1,78 mmol) en
tolueno (10 ml) se trató con Et_{3}N (744 \mul, 5,33 mmol) y
N1-piridin-2-iletan-1,2-diamina
(244 mg, 1,78 mmol) [preparada mediante el tratamiento de
2-bromopiridina con un exceso de etilendiamina y
piridina], y la mezcla se sometió a reflujo durante 6 horas. Después
de enfriar hasta la temperatura ambiente y la evaporación del
disolvente, el residuo se purificó mediante cromatografía de
resolución rápida (sílice, CH_{2}Cl_{2}/acetona 3:2).
Una disolución en metanol (6 ml) de (6) (301 mg,
0,97 mmol) y NaOH 1 N (3 ml) se agitó a temperatura ambiente
durante 24 horas. La disolución se hizo ácida utilizando una
disolución de NaHSO_{4} 1 M, y el producto precipitado se recogió
mediante filtración, se lavó a fondo con agua y se secó sobre
P_{2}O_{5}/gel azul durante 24 horas.
Una disolución de (7) (166 mg, 0,56 mmol),
N-metilmorfolina (185 \mul, 1,68 mmol), BOP (322
mg, 0,73 mmol) y
H-\beta-ala-OtBu
(152 mg, 0,84 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente
durante 20 horas. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (10 ml)
y después se lavó una vez con cada uno de H_{2}O, NaHCO_{3},
KHSO_{4} al 10% y salmuera (5 ml), se secó (MgSO_{4}) y se
concentró. Una cromatografía de resolución rápida (sílice, EtOAc)
produjo el éster (8) como un sólido blanco.
Una disolución del éster (8) (252 mg, 0,60
mmol), TFA (4 ml) y CH_{2}Cl_{2} (8 ml) se agitó a temperatura
ambiente durante 3 horas. La mezcla se evaporó hasta la sequedad y
el residuo se purificó mediante una cromatografía de resolución
rápida (sílice, EtOH/NH_{4}OH 19:1) para proporcionar (9) como una
espuma blancuzca. La RMN se ajusta a la estructura.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución del ácido (9) (20 mg, 0,054
mmol) en DMF (2 ml) se le añadió N-metilmorfolina
(NMM) (16,40 mg, 0,162 mmol), BOP (reactivo de Castro, 31,05 mg,
0,070 mmol) y la diamina protegida con BOC (13 mg, 0,081 mmol) y la
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Después de
una dilución con EtOAc (5 ml), la disolución se lavó una vez con
cada uno de H_{2}O, NaHCO_{3} saturado, KHSO_{4} al 10% y
salmuera. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró.
Cromatografía de resolución rápida (sílice, CH_{2}Cl_{2}/acetona
1:1); MALDI-MS: 510,59.
Una disolución de CH_{2}Cl_{2} (3 ml) de
(10) (20 mg, 0,039 mmol) y TFA (2 ml) se agitó en condiciones
ambientales durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró y el
residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida
(sílice, CH_{2}Cl_{2}/acetona 19:1) para proporcionar (4) como
un sólido blanco; MALDI-MS: 410,48.
Una disolución de (11) (15 mg, 0,36 mmol),
N,N-diisopropilamina (17 \mul, 0,10 mmol) y
anhídrido de DTPA (129 mg, 0,36 mmol) en DMF (2 ml) se agitó a
temperatura ambiente durante 3 hoas y se concentró al vacío. El
residuo se purificó mediante HPLC preparativa (acetonitrilo/TFA al
0,1% en agua).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron
1-[2-(4-clorobenciloxi)-2-(2,4-diclorofenil)etil]-1H-imidazol
(1 g, 2,25 mmol) y bromoacetato de terc-butilo (1
ml, 6,8 mmol) en 15 ml de acetonitrilo y se calentó a reflujo
durante la noche. Una TLC mostró la converción completa del
material de partida. El disolvente se enfrió, se evaporó al vacío y
el aceite residual se disolvió en cloroformo y se trituró con éter.
El producto se identificó mediante una espectrometría de masas
MALDI, y se utilizó en la siguiente etapa sin más purificación.
\newpage
El compuesto de a) (500 mg, 1 mmol) se disolvió
en 2 ml de diclorometano y se enfrió en un baño de hielo. Se
añadieron 2 ml de ácido trifluoroacético, se retiró el baño de hielo
y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora. Una TLC mostró la
conversión completa del material de partida. El disolvente se
eliminó al vacío, y el producto se utilizó en la siguiente etapa
sin más purificación.
El producto de b) se convirtió en c) mediante el
procedimiento descrito en el ejemplo 6d), y el producto se purificó
mediante cromatografía de resolución rápida.
El producto de c) se convirtió en d) mediante el
procedimiento descrito en el ejemplo 6e). El producto se utilizó
sin más purificación.
El producto de d) se convirtió en e) mediante el
procedimiento descrito para el ejemplo 6f). La purificación se
realizó mediante HPLC preparativa como se describe en el ejemplo
6f).
f) La preparación del complejo de gadolinio del
compuesto e) se realizó mediante el procedimiento descrito en el
ejemplo 6g).
Claims (10)
1. Un procedimiento para generar una imagen de
un sujeto animal humano o no humano animado al que previamente se
le ha administrado un agente de constraste, que implica generar una
imagen de al menos una parte de dicho sujeto en el cual se ha
distribuido dicho agente de contraste, que se caracteriza
porque dicho agente de contraste es una composición de materia de
fórmula I
(I)V-L-R
en la que V es un resto vector que
tiene afinidad por un receptor de células endoteliales relacionado
con la angiogénesis, L es un resto conector o un enlace, y R es un
resto detectable, que se caracteriza porque V es un grupo
orgánico no peptídico, o V es peptídico y R es una especie
macromolecular o en partículas que proporciona una multiplicidad de
marcadores detectables en la formación de imágenes in
vivo.
2. Un procedimiento para controlar el efecto de
un tratamiento de un sujeto animal humano o no humano con un
fármaco para combatir o provocar efectos asociados con la
angiogénesis, implicando dicho procedimiento detectar la captación
de una composición, previamente administrada, de fórmula (I)
(I)V-L-R
en la que V es un resto vector que
tiene afinidad por un receptor de células endoteliales relacionado
con la angiogénesis, L es un resto conector o un enlace, y R es un
resto detectable, que se caracteriza porque V es un grupo
orgánico no peptídico, o V es peptídico y R es una especie
macromolecular o en partículas que proporciona una multiplicidad de
marcadores detectables en la formación de imágenes in vivo,
mediante receptores de células endoteliales relacionados con la
angiogénesis, mediante la generación de una imagen de al menos
parte de dicho sujeto, siendo realizadas dicha administración y
detección de forma opcional pero preferiblemente de manera
repetida, por ejemplo, antes, durante y después del tratamiento con
dicho
fármaco.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que V es un vector para el receptor de
integrina.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que V es un vector para el receptor de
fibronectina.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que V es un vector para el receptor de
VEGF.
6. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que V es un vector para el receptor del
activador de plasminógeno de uroquinasa (UPAR).
7. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que V se selecciona de la lista de
restos vectores que comprende:
N^{2}-[3S-hidroxi-4-(N-hidroxiamino)-2R-isobutilsuccinil]-L-(4-oximetilcarboxi)fenilalanin-N^{1}-metilamida,
N-(4-octilfenil)-3-(2-carboxietil)-6,7-dihidro-5H-tiazolo[3,2-a]pirimidin-2-carboxamida,
N^{2}-[3S-hidroxi-4-hidroxiamino)-2R-isobutilsuccinil]-L-fenilalanin-N^{1}-metilamida,
clorhidrato de
N-(6-aminohexil)-[4-(6,7-dimetoxi-quinazolin-4-ilamino)fenil]acetamida,
[2-(2-aminoetilcarbamoil)etil]amida
del ácido
3-oxo-2-[2-(piridin-2-ilamino)etil]-2,3-dihidro-1H-isoindol-5-carboxílico,
y
N-(6-aminohexil)-2-{3-[2-(4-clorobenciloxi)-2-(2,4-diclorofenil)etil]-3H-imidazol-1-il}acetamida.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que V-L-R
se selecciona de los siguientes restos: quelatos de Gd(III),
^{99m}Tc o ^{131}I_{2} de los derivados de DTPA de los restos
vectores según la reivindicación 7.
9. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que R es un radionúclido.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que R es un radionúclido de yodo o de metal.
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