ES2213899T3 - Agentes de contraste utilizados en tecnicas de formacion de imagen en base a la luz. - Google Patents

Agentes de contraste utilizados en tecnicas de formacion de imagen en base a la luz.

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ES2213899T3 ES98919335T ES98919335T ES2213899T3 ES 2213899 T3 ES2213899 T3 ES 2213899T3 ES 98919335 T ES98919335 T ES 98919335T ES 98919335 T ES98919335 T ES 98919335T ES 2213899 T3 ES2213899 T3 ES 2213899T3
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Daniel Joseph Nycomed Amersham Imaging DELECKI
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Vinay Chandrakant Nycomed Amersham Imaging DESAI
Edward Nycomed Amersham Imaging BACON
Kenneth R. Nycomed Amersham Imaging HOLLISTER
Eric Paul Nycomed Amersham Imaging HOHENSCHUH
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Abstract

Esta invención proporciona un agente de contraste para formar imágenes luminosas que tiene un peso molecular en el intervalo de 500 a 500000 y que contiene al menos dos cromóforos que tienen sistemas de electrones deslocalizados así como al menos un resto de poli{(}óxido de alquileno) (PAO) que tiene un peso molecular en el intervalo de 60 a 100000.

Description

Agentes de contraste utilizados en técnicas de formación de imagen en base a la luz.
Esta invención se relaciona con compuestos útiles como agentes de contraste en procedimientos de imagen luminosa, en particular con compuestos que contienen una pluralidad de cromóforos, así como uno o más restos de óxido de polialquileno ("PAO") hidrofílicos.
El uso en procedimientos de imagen diagnóstica de materiales (agentes de contraste) que aumentan el contraste de la imagen está bien establecido.
En los procedimientos de imagen luminosa, los agentes de contraste actuarán, en general, como dispersores de luz o como absorbedores o emisores de luz. La presente invención se relaciona con agentes de contraste que contienen cromóforos y, por lo tanto, absorben o emiten luz.
Tal como se usa en esta solicitud, "imagen luminosa" se refiere a procedimientos de diagnóstico que dan lugar a una imagen del interior del cuerpo o de la superficie del cuerpo por un proceso que implica la propagación a través del cuerpo o la reflexión desde el mismo de radiación electromagnética de una longitud de onda de 300 a 1.300 nm. La radiación electromagnética propagante puede originarse por irradiación del cuerpo o de una porción del cuerpo con luz en el rango de longitudes de onda especificado o por generación de luz dentro del rango de longitudes de onda en el cuerpo o en la superficie del cuerpo por procesos tales como bioluminiscencia, sonoluminiscencia o fluorescencia.
La luz que se propaga puede ser detectada directamente con sensores en la superficie o dentro del cuerpo o indirectamente después de la generación a partir de la luz o de otra forma de energía, tal como el sonido, el ultrasonido, el calor o radiación electromagnética fuera del rango de longitudes de onda de 300 a 1.300 nm. Un sensor es un dispositivo que convierte la luz, el sonido, el ultrasonido, el calor u otra forma de señal detectada en una forma registrable, tal como corriente eléctrica. Un ejemplo de sensor de luz es un tubo fotomultiplicador. Un sensor para la luz puede consistir también en un cable de fibra óptica que va desde el punto de detección hasta un tubo fotomultiplicador. En una realización simple de imagen luminosa, el sensor consiste en el ojo humano.
Por cromóforo se entiende un grupo en una composición de materia, por ejemplo un grupo orgánico o inorgánico, que absorbe y/o emite luz. El término incluye, por lo tanto, fluoróforos, grupos que son fluorescentes, así como grupos fosforescentes. En general, los cromóforos contendrán un ion metálico acomplejado o un sistema electrónico deslocalizado extenso. Un aspecto de la presente invención se relaciona, en particular, con este último tipo. A veces se hace aquí referencia a un compuesto que contiene un cromóforo como cromóforo.
Por luz se entiende radiación electromagnética que tiene longitudes de onda de 300-1.300 nm. Los cromóforos que tienen máximos de absorción y/o emisión en el espectro visible al infrarrojo lejano son particularmente relevantes para la invención.
Aunque determinadas moléculas orgánicas pequeñas que contienen cromóforos, tales como el verde de indocianina, han sido utilizadas como agentes de contraste en procedimientos de imagen luminosa, su utilidad es limitada, ya que son rápidamente aclaradas del torrente sanguíneo y por ello proporcionan una ventana de imagen relativamente corta o estrecha.
Es, por lo tanto, un objeto de la invención proporcionar agentes de contraste para imagen luminosa que den al usuario una ventaja de imagen prolongada y, por lo tanto, sean adecuadas, por ejemplo, para estudios del flujo sanguíneo, de perfusión o efusión y de vascularización de sitios de interés.
Por lo tanto, vista desde un aspecto, la invención proporciona un agente de contraste para imagen luminosa hidrosoluble fisiológicamente tolerable que tiene restos de la fórmula I:
1
donde:
cada L_{1} es un grupo independientemente seleccionado entre un resto orgánico de unión y un enlace químico;
cada X es independientemente seleccionado entre O, N-R_{1}, S, Se, Te, CH=CH y (CH_{3})_{2}C;
cada R_{1} es independientemente seleccionado entre el grupo consistente en un grupo metilo, un grupo etilo y un grupo alquilo C_{3-16} que eventualmente contiene uno o más heteroátomos seleccionados entre el grupo consistente en O, N y S, cuyos heteroátomos están separados entre sí por al menos 2 átomos de carbono y cuyos grupos etilo y alquilo contienen eventualmente uno o más grupos funcionales hidrofílicos seleccionados entre el grupo consistente en grupos hidroxilo, grupos carboxilo, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfato, grupos fosfonato, grupos amino y grupos aminoácido;
como ejemplos de grupos hidrofílicos sobre R_{1} se incluyen grupos carbohidrato C_{5-10}, grupos carboxilato y grupos oxicarbonilalquilo C_{2-10}, grupos dihidroxipropilo y similares;
cada Z, de los cuales al menos hay uno, es independientemente seleccionado entre el grupo consistente en H, un grupo metilo, un grupo etilo según se ha definido antes, un grupo alquilo C_{3-16} según se ha definido antes, un grupo alcoxilo C_{1-16}, la porción alquilo del cual es como se ha definido antes, un grupo carboxialquilo C_{1-16}, un grupo oxicarbonilalquilo C_{1-16}, un grupo sulfonato, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo sulfonamidoalquilo C_{1-16}, un grupo fenil-alquilo C_{1-16}, un grupo fenoxi-alquilo C_{1-16}, un grupo feniloxialquilo C_{1-16}, un grupo oxifenoxi-alquilo C_{1-16}, las porciones alquilo de cada uno de los cuales son como se ha definido antes, o un anillo aromático anillado que consiste en un anillo benz[e]aromático, un anillo benz-[f]-aromático o un anillo benz[g]aromático, donde e, f y g son como se define en relación a la estructura indol como plantilla y cada uno de los cuales puede estar substituido por grupos alquilo C_{1-16}, alcoxilo C_{1-16}, carboxilo, sulfonato, sulfonamido, fenilo o fenoxilo según se ha definido anteriormente;
cada R_{2} es independientemente elegido entre el grupo consistente en H o alquilo C_{1-16} según se ha definido antes, o dos grupos R_{2}, junto con los tres átomos de carbono intermedios, forman un anillo carbocíclico de 5 ó 6 miembros que eventualmente contiene un heteroátomo de anillo seleccionado entre el grupo consistente en O, N-R_{1} y S;
m es un número entero de hasta 1.200, preferiblemente de 5 a 1.200, más preferiblemente de 50 a 1.000, y
cada p es independientemente 0 ó 1 cuando L_{1} es un resto de unión orgánico.
La invención tiene utilización en un método de tratamiento del organismo humano o animal (por ejemplo, de mamífero, ave o reptil) para eliminar tejidos tumorales del mismo, donde se administra una cantidad efectiva de un compuesto que es un agente de contraste de imagen luminosa a dicho organismo y se deja que se acumule en el tejido o las células tumorales y donde se elimina o destruye in situ el tejido o las células tumorales en los que se ha acumulado dicho compuesto.
Los métodos de eliminación de tejido o células enfermas, tales como tumores, incluyen la excisión quirúrgica como método preferido. La excisión quirúrgica incluye, aunque sin limitación, técnicas tales como la cirugía asistida por endoscopia y laparoscopia, la cirugía asistida por láser, la microcirugía, la excisión quirúrgica a lo largo de un plano quirúrgico, PDT, SDT y métodos criogénicos, tales como la destrucción química/cirugía crioquirúrgica (aplicación de substancias cáusticas). Como métodos adicionales se incluyen, aunque sin limitación, la terapia fotodinámica ("PDT"), la terapia con microondas, la terapia de ablación con láser, la terapia hipertérmica, la terapia de radiación con rayos X, la terapia de radiación con radioisótopos, la terapia sonodinámica ("SDT") y sus combinaciones.
Vista desde aún otro aspecto más, la invención permite el uso de un agente de contraste de imagen luminosa hidrosoluble y fisiológicamente tolerable según se ha definido antes para la fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal para eliminar tejido o células enfermas del mismo o para destruir tejido o células enfermas en el mismo.
Vista desde aún otro aspecto más, la invención facilita un método de imagen del cuerpo humano o animal (por ejemplo, de mamífero, ave o reptil), preferiblemente un cuerpo vivo, donde se genera una imagen por una modalidad de imagen luminosa de al menos una parte de dicho cuerpo a la que se ha administrado previamente un agente de contraste de imagen luminosa según se ha definido antes y en la que dicho agente se distribuye y donde dicha modalidad comprende microscopía confocal de barrido láser ("CSLM"), tomografía por coherencia óptica ("OCT"), técnicas endoscópicas fotoacústicas, acústico-ópticas y de onda difusa, microscopía de excitación multifotónica, observación visual o técnica de imagen con resolución temporal. Tal como se usa aquí, "microscopía" es un método óptico con una resolución de entre 1 mm y 0,1 micra.
En particular, la presente invención proporciona un método de imagen del nódulo linfático centinela usando un agente de contraste de imagen luminosa como se describe aquí. La imagen del nódulo linfático centinela tiene una importancia particular, ya que este nódulo linfático se encuentra muy próximo al sitio tumoral.
Vista desde aún un aspecto más, la invención también facilita el uso de un material que contiene cromóforo fisiológicamente tolerable como se describe aquí para la fabricación de un medio de contraste para uso en un método de diagnóstico de un cuerpo humano o animal (por ejemplo, de mamífero, ave o reptil) que implica generación, mediante una técnica como se ha descrito anteriormente, de una imagen de una parte de dicho cuerpo en la que se distribuye dicho material.
Vista desde aún otro aspecto más, la invención proporciona una composición farmacéutica consistente en un agente de contraste de imagen luminosa fisiológicamente tolerable según se ha definido antes junto con al menos un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable, por ejemplo en un medio vehiculizante acuoso estéril libre de pirógenos.
Se puede hacer que los grupos funcionales sobre los grupos de unión reaccionen con grupos funcionales cromóforos en formas bien conocidas, muchas de las cuales están enumeradas en S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, 1991. Por ejemplo, se puede tratar un grupo de unión que contenga un o más de un grupo ácido carboxílico, tal como, por ejemplo, ácido succínico, ácido poliacrílico, ácido ftálico y ácido tartárico; grupos quelantes tales como DTPA; aminoácidos bloqueados en el nitrógeno (tales como los descritos en M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, NY 1984), y PEG-ácido dicarboxílico con un cromóforo que contenga un grupo amina primaria en presencia de una carbodiimida, tal como, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, para formar un enlace amida entre el cromóforo y el grupo de unión. Los cromóforos que contienen grupos isotiocianato o grupos éster activos o grupos haluro de ácido o grupos cloruro de sulfonilo pueden reaccionar con grupos de unión que contengan una o más de una amina, tales como, por ejemplo, polietilenamina, PEG diamina, tetramina Tetronic, diamina Pluronic, lisina, 1,4-butanodiamina, melamina, etilendiamina, polilisina, ácido aminocaproico y aminoácidos bloqueados en el ácido carboxílico (tales como los descritos en M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, NY 1984), para formar enlaces entre el cromóforo y el grupo de unión, tales como enlaces tiourea y enlaces amida entre el cromóforo y el grupo de unión.
Como ejemplos de cromóforos difuncionales se incluyen:
2
donde el oligómero se forma, por ejemplo, por transesterificación bajo catálisis ácida con HO-PEG-OH o por formación de amida, por ejemplo por amidación del grupo éster con grupos amino en H_{2}N-PEG-NH_{2} y HO-PEG-NH_{2}.
3
donde el oligómero se forma, por ejemplo, por esterificación de ácidos carboxílicos bajo catálisis ácida con HO-PET-OH o por formación de amida, por ejemplo por amidación de grupos éster de N-hidroxisuccinimida activados con grupos amino en H_{2}N-PEG-NH_{2} HO-PEG-NH_{2}.
4
donde el oligómero se forma, por ejemplo, por deshidratación del diol vicinal en condiciones de deshidratación ácida, seguido de eterificación del epóxido formado con HO-PEG-OH o por formación de amina, por ejemplo, de los grupos epóxido con grupos amino en H_{2}N-PEG-NH_{2} y HO-PEG-NH_{2}.
El cromóforo, el PAO o el grupo de unión pueden estar unidos a un vector de abordaje. Este vector se dirige a células o receptores celulares. Preferiblemente, el vector de abordaje o el ligando se dirige a células seleccionadas entre el grupo consistente en células miocárdicas, células endoteliales, células epiteliales, células tumorales y el receptor glicoproteico GPIIb/IIIa. También en realizaciones preferidas, el vector de abordaje o el ligando es un vector de abordaje seleccionado entre el grupo consistente en proteínas, péptidos, sacáridos, esteroides, análogos de esteroides, agentes bioactivos y material genético, siendo más preferidos las proteínas, los péptidos y los sacáridos. También se prefieren vectores que se dirigen a regiones arteriosclerosis, especialmente a la placa aterosclerótica.
En el caso de vectores de abordaje que contienen grupos sacáridos, como restos de sacárido adecuados se incluyen, por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos ejemplares pueden tener seis átomos de carbono y estos sacáridos incluyen alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, fructosa, psicosa, comatosa y tagatosa. Los restos de cinco carbonos incluyen ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, ribulosa y xilulosa. Los sacáridos de cuatro carbonos incluyen eritrosa, treosa y eritrulosa. Los disacáridos incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, isomaltosa y celobiosa.
Son vectores preferidos los que se dirigen al miocardio y los que se dirigen a las células cancerosas.
En otra realización, los componentes de esta invención consisten en un vector de abordaje, V, unido al PAO, cromóforo o ligante o a dos o más de ellos, por ejemplo a través de un enlace o de otro grupo de unión, L*, donde L* es el residuo de un agente de unión.
El término "residuo" es utilizado aquí en el contexto de una entidad química. Dicha entidad química consiste, por ejemplo, en un vector, o un cromóforo, o un PAO, o un grupo de unión, etc. El vector puede ser, por ejemplo, un grupo reconocedor de receptores, o un material inmunorreactivo, o una proteína inmunorreactiva, o un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o una proteína, o un péptido, o una pequeña molécula orgánica. El término "residuo" se define como aquella porción de dicha entidad química que permanece exclusivamente cuando se alteran, modifican o substituyen uno o más enlaces químicos de los que consta por lo demás dicha entidad química cuando se considera como una entidad química independiente, para constituir uno o más enlaces covalentes con una o más entidades químicas diferentes. Así, por ejemplo, en una realización el residuo de un cromóforo está constituido por un cromóforo que es al menos monovalentemente modificado mediante unión al residuo de otra entidad química, tal como, por ejemplo, al residuo de un grupo de unión.
Tal como se usa aquí, los términos "receptor" y "antígeno" se refieren a un grupo químico en una molécula que constituye un sitio activo en dicha molécula, o a una disposición de grupos químicos en una molécula que constituyen uno o más sitios activos en dicha molécula, o a una molécula constituida por uno o más grupos químicos o una o más disposiciones de grupos químicos, cuyo grupo o grupos o disposición de grupos constituyen uno o más sitios activos en dicha molécula. Un "sitio activo" de un receptor tiene una capacidad específica para unirse o tiene afinidad por la unión a un vector. Con respecto al uso con el término "receptor" o con el término "sitio activo en un receptor", el término "vector" o "ligando", tal como se usa aquí, se refiere a una molécula constituida por un grupo químico específico o una disposición específica de grupos químicos (grupo reconocedor de receptores), cuya molécula, grupo o disposición de grupos es complementaria o tiene afinidad específica por la unión a un receptor, especialmente a un sitio activo en un receptor. Como ejemplos se incluyen antígenos de superficie, receptores de la superficie celular e intracelulares que se unen a hormonas y receptores de la superficie celular e intracelulares que se unen a fármacos. Los sitios de asociación específica o de unión específica de hormonas a dichos receptores celulares y de unión específica de fármacos a receptores celulares son ejemplos de sitios activos de dichos receptores y las hormonas o fármacos, agonistas y antagonistas que se unen a receptores son ejemplos de vectores para los receptores respectivos.
El grupo vector, V, puede ser seleccionado entre una amplia variedad de materiales naturales o preparados sintéticamente, incluyendo, aunque sin limitación, enzimas, aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, hormonas, factores de crecimiento, esteroides, vitaminas, polisacáridos, lectinas, toxinas, ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos sentido y antisentido, ácidos péptidonucleicos), haptenos, avidina y sus derivados, biotina y sus derivados, anticuerpos (monoclonales y policlonales), anti-anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y materiales antigénicos (incluyendo proteínas y carbohidratos). El grupo vector, V, puede ser también seleccionado, aunque sin limitación, entre componentes o productos de virus, bacterias, protozoos, hongos, parásitos, rickettsias y mohos, así como sangre animal y humana y componentes de órganos y tejidos. Más aún, el grupo vector, V, puede ser un fármaco farmacéutico o un análogo sintético de cualquiera de los materiales antes citados, así como otros conocidos para un experto en la técnica. Se describen grupos vectores específicos adicionales en
WO 96/40285.
En una realización, V es preferiblemente un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, proteína o péptido que reconoce y es específico para un antígeno o receptor asociado a tumores. En algunas realizaciones, V puede contener un grupo reconocedor de receptores covalentemente unido al mismo a través de un enlace químico o de un grupo de unión derivado del residuo de un grupo reconocedor de receptores y el residuo de un grupo reactivo en V. Tal como se usa aquí, el término "grupo reconocedor de receptores", que puede ser abreviado como "RRG", incluye también un compuesto orgánico que es capaz de unirse covalentemente al vector y que se encuentra en un organismo vivo o que es útil en el diagnóstico, tratamiento o ingeniería genética de material celular o de organismos vivos, y que tiene capacidad de interaccionar con otro componente ("sitio activo" de un receptor) que puede encontrarse en fluidos biológicos o estar asociado a células que han de ser tratadas o sometidas a diagnóstico, tales como las células de un tumor.
El RRG puede ser seleccionado entre la misma amplia variedad de materiales naturales o sintéticamente preparados antes citados. Además, un RRG puede ser cualquier substancia que, al ser presentada a un huésped inmunocompetente, dará lugar a la producción de un anticuerpo específico capaz de unirse con esa substancia, o el anticuerpo así producido, que participa en una reacción antígeno-anticuerpo.
En una realización, son vectores preferidos anticuerpos y diversos fragmentos inmunorreactivos de los mismos, proteínas y péptidos siempre que contengan al menos un sitio reactivo para la reacción con un grupo reactivo con vectores o con un grupo de unión (L) como se describe aquí. Ese sitio puede ser inherente al vector o puede ser introducido a través de una modificación química apropiada del vector. Además de los anticuerpos y fragmentos producidos por las técnicas aquí señaladas, se incluyen específicamente otros anticuerpos, proteínas y péptidos producidos por técnicas de biología molecular, exhibición de fagos e ingeniería genética.
Tal como se usa aquí, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a un vector que contiene un residuo de un anticuerpo, cuyo anticuerpo exhibe de manera característica una afinidad por la unión a un antígeno. El término "afinidad por la unión a un antígeno", tal como se usa aquí, se refiere a la expresión termodinámica de la fuerza de interacción o de unión entre un sitio de combinación de un anticuerpo y un determinante antigénico y, por lo tanto, de la compatibilidad estereoquímica entre ellos; como tal, es la expresión de la constante de equilibrio o de asociación para la interacción anticuerpo-antígeno. El término "afinidad", tal como se usa aquí, se refiere también a la expresión termodinámica de la fuerza de interacción o de unión entre un vector y un receptor y, por lo tanto, de la compatibilidad estereoquímica entre ellos; como tal, es la expresión de la constante de equilibrio o de asociación para la interacción vector/receptor.
Los fragmentos de anticuerpos exhiben al menos un porcentaje de dicha afinidad por la unión a dicho antígeno, cuyo porcentaje está en el rango de un 0,001 por ciento a un 1.000 por ciento, preferiblemente de un 0,01 por ciento a un 1.000 por ciento, más preferiblemente de un 0,1 por ciento a un 1.000 por ciento y más preferiblemente de un 1,0 por ciento a un 1.000 por ciento de la afinidad relativa de dicho anticuerpo por la unión a dicho antígeno.
Se puede producir un fragmento de anticuerpo a partir de un anticuerpo por una reacción química consistente en una o más reacciones de escisión de enlaces químicos o por una reacción química consistente en una o más reacciones formadoras de enlaces químicos que emplean como reactivos uno o más componentes químicos seleccionados entre el grupo consistente en aminoácidos, péptidos, carbohidratos, grupos de unión como se define aquí, grupos espaciadores como se define aquí, grupos reactivos con vectores como se define aquí y fragmentos de anticuerpos tal como se producen como se describe aquí y por un proceso biológico molecular, un proceso bacteriano o un proceso constituido por, y que resulta de, ingeniería genética de genes de anticuerpos.
Un fragmento de anticuerpo puede derivar de un anticuerpo por una reacción química constituida por una o más de las siguientes reacciones:
(a)
escisión de uno o más enlaces químicos de los que consta un anticuerpo, cuyos enlaces son seleccionados entre, por ejemplo, enlaces carbono-nitrógeno, enlaces azufre-azufre, enlaces carbono-carbono, enlaces carbono-azufre y enlaces carbono-oxígeno y donde el método de dicha escisión es seleccionado entre:
(i)
una reacción química catalizada consistente en las acciones de un catalizador bioquímico tal como una enzima, tal como papaína o pepsina, que los expertos en la técnica saben que produce fragmentos de anticuerpos a los que comúnmente se hace referencia como Fab y Fab'_{2}, respectivamente;
(ii)
una reacción química catalizada consistente en la acción de un catalizador químico electrofílico tal como un ion hidronio, que, por ejemplo, se produce favorablemente a un pH igual o menor de 7;
(iii)
una reacción química catalizada consistente en la acción de un catalizador nucleofílico, tal como un ion hidróxido, que, por ejemplo, se produce favorablemente a un pH igual o mayor de 7;
(iv)
una reacción química consistente en una reacción de reducción, tal como la reducción de un enlace disulfuro, y
(v)
una reacción química consistente en una reacción de oxidación, tal como la oxidación de un enlace carbono-oxígeno de un grupo hidroxilo o la oxidación de un enlace carbono-carbono de un grupo diol vicinal, tal como se produce en un resto de carbohidrato; o
(b)
formación de uno o más enlaces químicos entre uno o más reactivos, tales como la formación de uno o más enlaces covalentes seleccionados entre, por ejemplo, enlaces carbono-nitrógeno (tales como, por ejemplo, enlaces amida, enlaces amina, enlaces hidrazona y enlaces tiourea), enlaces azufre-azufre tales como enlaces disulfuro, enlaces carbono-carbono, enlaces carbono-azufre y enlaces carbono-oxígeno, y empleando como reactivos en dicha formación de enlaces químicos uno o más reactivos consistentes en aminoácidos, péptidos, carbohidratos, grupos de unión tal como se define aquí, grupos espaciadores tal como se define aquí, grupos reactivos con vectores tal como se define aquí y fragmentos de anticuerpos tales como los producidos según se ha descrito antes en (a); o
(c)
se puede derivar un fragmento de anticuerpo por formación de uno o más enlaces no covalentes entre uno o más reactivos. Dichos enlaces no covalentes están constituidos por interacciones hidrofóbicas tales como las que se producen en un medio acuoso entre especies químicas que están independientemente constituidas por regiones mutuamente accesibles de baja polaridad, tales como regiones constituidas por grupos alifáticos y carbocíclicos, y por interacciones de enlaces de hidrógeno tales como las que se producen en la unión de un oligonucleótido a un oligonucleótido complementario; o
(d)
se puede producir un fragmento de anticuerpo como resultado de los métodos de biología molecular o por ingeniería genética de genes de anticuerpos, por ejemplo en la ingeniería genética de un grupo inmunorreactivo de una sola cadena, un fragmento Fv o una unidad de reconocimiento mínima.
Se puede producir un fragmento de anticuerpo como resultado de la combinación de uno o más de los métodos anteriores.
Si se desea, se puede modificar o alterar químicamente un vector para obtener grupos reactivos para la unión a los residuos de un resto receptor o de un antígeno que se encuentra en o sobre tejidos y células de interés. Dichas técnicas incluyen el uso de restos de unión y de modificación química, tal como se describe en WO-A-89/02931 y WO-A-89/2932, que se dirigen a la modificación de oligonucleótidos, y en la Patente EE.UU. Nº 4.719.182.
Dos usos altamente preferidos para los compuestos de eta invención son la imagen diagnóstica de tejidos enfermos, tales como tumores, y el tratamiento terapéutico de tejidos enfermos, tales como tejidos tumorales. Los vectores preferidos incluyen, por lo tanto, anticuerpos (a los que a veces se hará aquí referencia más adelante como Ab) para antígenos asociados a tumores. Como ejemplos específicos no limitantes se incluyen B72.3 y anticuerpos relacionados (descritos en las Patentes EE.UU. Nº 4,522.918 y 4.612.282), que reconocen tumores colorrectales; 9.2.27 y anticuerpos anti-melanoma relacionados; D612 y anticuerpos relacionados, que reconocen tumores colorrectales; UJ13A y anticuerpos relacionados, que reconocen carcinomas pulmonares de células pequeñas; NRLU-10, NRCO-02 y anticuerpos relacionados, que reconocen carcinomas pulmonares de células pequeñas y tumores colorrectales (Pan-carcinoma); 7E11C5 y anticuerpos relacionados, que reconocen tumores de próstata; CC49 y anticuerpos relacionados, que reconocen tumores colorrectales; TNT y anticuerpos relacionados, que reconocen tejido necrótico; PR1A3 y anticuerpos relacionados, que reconocen el carcinoma de colon; ING-1 y anticuerpos relacionados, que están descritos en WO-A-90/02569; B174, C174 y anticuerpos relacionados, que reconocen carcinomas de células escamosas; B43 y anticuerpos relacionados, que son reactivos con ciertos linfomas y leucemias, y anticuerpos anti-HLB y anticuerpos monoclonales relacionados y otros anticuerpos específicos de tumores, tejidos o células conocidos para los expertos en la técnica.
Son vectores más preferidos las proteínas, especialmente proteínas humanas recombinantes, tales como las producidas o modificadas por técnicas biológicas moleculares, de exhibición de fagos o de ingeniería genética, cuyas modificaciones consisten en la incorporación, substitución, inserción y deleción independientes de aminoácidos específicos en una secuencia peptídica de dicha proteína para producir proteínas humanas recombinantes que contienen un RRG que tiene afinidad por la unión a un sitio activo de un receptor. Un vector proteico recombinante así modificado tiene una afinidad por un sitio activo de un receptor que es mayor que la afinidad del vector natural no modificado por el sitio activo del receptor.
En otra realización, el vector consiste en una proteína de fusión. Tal como se utiliza aquí, el término "proteína de fusión" se refiere a un material de ingeniería genética constituido por una proteína cuya región codificante consta de la región codificante de un residuo de una primera proteína fusionada en marco con la región codificante de un residuo de una segunda proteína. Preferiblemente, dicha proteína de fusión consta de una proteína cuya región codificante está constituida por la región codificante de un residuo de un RRG fusionada en marco con la región codificante de uno o más residuos de un vector o de un ligante, cuyo ligante puede ser una proteína o un péptido. La proteína de fusión de ingeniería genética anterior que constituye el vector puede estar formada por una proteína cuya región codificante está independientemente constituida por la región codificante de un residuo de una primera proteína humana o no humana fusionada en marco con la región codificante de un residuo de una segunda proteína humana o no humana. Preferiblemente, dichas regiones codificantes son independientemente humanas y bacterianas o están modificadas por técnica de ingeniería genética como se ha indicado antes.
Son vectores incluso más preferidos péptidos, oligopéptidos o peptoides, cuyos vectores están compuestos por un o más de un aminoácido cuya secuencia y composición comprenden una molécula, un grupo químico específico o una disposición específica de grupos químicos, que son complementarios de un receptor o que tienen afinidad específica por la unión a éste. Dichos péptidos pueden ser idénticos en cuanto a composición a los aminoácidos que constituyen el RRG de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas o proteínas de fusión que reconocen el mismo receptor. Alternativamente, dichos vectores peptídicos pueden no tener una secuencia de aminoácidos idéntica a otros RRG, pero serán equivalentes estructural o tridimensionalmente a otros RRG que se unen al mismo receptor. Dichos péptidos equivalentes pueden ser identificados por técnicas biológicas moleculares, tales como la mutación puntual, la exhibición de fagos, la ingeniería genética y otras técnicas conocidas para los expertos en este campo. Además, se pueden diseñar vectores peptídicos u oligopeptídicos de novo usando las muy practicadas metodologías de química computacional y de síntesis de péptidos. Los vectores peptídicos sintéticos no se restringen a disposiciones lineales de aminoácidos, sino que también pueden ser cíclicos y contener más de un RRG por péptido. Los vectores peptídicos o peptoides pueden estar compuestos de L-aminoácidos, D-aminoácidos, aminoácidos no naturales, substitutos sintéticos de aminoácidos, moléculas orgánicas o mezclas de todos éstos y unirse entre sí por enlaces peptídicos (amida)
o no-amida.
Son vectores especialmente preferidos las moléculas peptidomiméticas, cuyas moléculas son materiales orgánicos sintéticos que son el equivalente estructural o funcional de RRG derivados o identificados a partir de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas, proteínas de fusión, péptidos o peptoides y que tienen afinidad por el mismo receptor. Otros vectores que se consideran peptidomiméticos incluyen entidades químicas tales como fármacos, por ejemplo, que muestran afinidad por el receptor y especialmente por el sitio activo del receptor, de interés. Los vectores peptidomiméticos pueden ser identificados mediante el uso de técnicas de biología molecular tales como mutación puntual, exhibición de fagos, ingeniería genética y otras técnicas conocidas para los expertos en este campo. Los vectores peptidomiméticos pueden ser diseñados y sintetizados de novo usando métodos químicos actuales, así como las técnicas de química computacional y química combinatoria.
Tal como se utiliza aquí, "grupo reactivo con un vector" se refiere a uno o más grupos químicos que pueden reaccionar con un grupo funcional reactivo que se encuentra típicamente sobre un vector o que se introduce en él para formar un grupo de unión entre el cromóforo y el vector. Se contempla específicamente que se pueda usar un grupo reactivo con un vector para conjugar un cromóforo de esta invención con una biomolécula no proteica, así como con una molécula no biológica, tal como una substancia química sintética, por ejemplo un fármaco u otra molécula que tenga afinidad por el sitio activo de un receptor de interés. También se pueden usar grupos reactivos con un vector con fines de detección de dicha molécula en una mezcla que puede contener tal substancia química sintética y cuya substancia contiene un grupo reactivo con el grupo reactivo con un vector. Así, los grupos reactivos con un vector útiles en la práctica de esta invención incluyen aquellos grupos que pueden reaccionar con una molécula, preferiblemente una molécula biológica (tal como una proteína, un carbohidrato, un ácido nucleico y un lípido) que contiene un grupo reactivo para formar un grupo de unión entre el cromóforo y la molécula. Si la molécula es una proteína, como grupos reactivos preferidos se incluyen grupos amina y grupos sulfhidrilo. Las moléculas biológicas especialmente preferidas contienen un RRG como se ha descrito anteriormente.
Los grupos reactivos con un vector útiles en la práctica de esta invención incluyen también aquellos grupos que pueden reaccionar con una molécula biológica que está químicamente modificada, por ejemplo por oxidación, por reducción o por formación de enlaces covalentes, tal como por formación de enlaces amida, con otra especie química como tal, por ejemplo una amina, un aminoácido, una amina substituida o un aminoácido substituido, para introducir un grupo reactivo en la molécula biológica y para formar un grupo de unión entre el cromóforo y la molécula biológica químicamente modificada.
Se pueden seleccionar grupos reactivos con un vector preferidos entre, aunque sin limitación, grupos que reaccionarán directamente con un grupo amina, tal como un grupo épsilon amina de la lisina o un grupo amina terminal, en una proteína o péptido, o con un grupo sulfhidrilo, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína comúnmente encontrado sobre una proteína u otra molécula biológica. Como ejemplos de tales grupos reactivos con proteínas se incluyen grupos que contienen halógeno activo, tales como grupos clorometilfenilo, grupos clorometilcarbonilo y grupos yodometilcarbonilo; grupos etilsulfonilo y etilcarbonilo substituidos en 2 con un grupo saliente activado, tales como grupos 2-cloroetilsulfonilo y grupos 2-cloroetilcarbonilo; grupos vinilsulfonilo; grupos vinilcarbonilo; grupos oxiranilo; grupos isocianato; grupos isotiocianato; grupos aldehído; grupos aziridilo; grupos succinimidoxicarbonilo; grupos acilo activados, tales como grupos haluro de ácido carboxílico; grupos anhídrido; grupos tioéster; carbonatos, tales como nitrofenilcarbonatos; ésteres de ácidos sulfónicos; fosforamidatos; haluros cianúricos, tales como monocloruros cianúricos y dicloruros cianúricos y tricloruros cianúricos; isotiocianatos; cianatos; grupos mostaza de nitrógeno y mostaza de azufre; cloruros de ácido y bromuros de ácido, tales como cloruros de ácidos carboxílicos y cloruros de ácidos sulfónicos, y otros grupos conocidos como útiles como agentes endurecedores en emulsiones fotográficas, tales como gelatina o polímeros sintéticos usados en revestimientos fotográficos.
Se describen grupos funcionales químicos típicamente útiles y métodos para la unión de ligantes y vectores entre sí y para la unión de cromóforos y ligantes entre sí en S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press Inc., Boston, 1991 (ISBN 0-8493-5886-8).
En una realización, estos grupos son también útiles para la reacción de cromóforos con grupos de unión para formar los compuestos poliméricos de la invención.
Los grupos reactivos con un vector antes enumerados pueden reaccionar con una proteína o un vector o un ligante o un cromóforo que estén químicamente modificados para contener grupos reactivos, tales como grupos amina y tales como grupos sulfhidrilo.
Se pueden introducir grupos amina en un cromóforo, un ligante o un vector por técnicas bien conocidas, tales como, por ejemplo, nitración con ácido nítrico y ácido sulfúrico y a veces ácido nítrico en anhídrido acético. La nitración se produce en un grupo aromático, tal como un grupo fenilo o un grupo naftilo o un grupo benz, tal como un grupo benz(e)indol, tal como los encontrados en algunos cromóforos de cianina y ftalocianina o en algunos grupos de unión. A veces, es ventajoso introducir grupos nitro (así como otros grupos funcionales) en un sitio específico de un precursor usado en la síntesis de un cromóforo. El grupo nitro puede ser entonces reducido a una amina por reducción tal como mediante reducción con amalgama de aluminio o reducción con hidruro de boro o mediante hidrogenación catalítica. También se pueden introducir grupos amina por conversión de una amida primaria en una amina por tratamiento con cloruro hipohaloso y por conversión de un grupo hidroxilo de un alcohol en un éster de ácido sulfónico, seguido de desplazamiento con un grupo azida y posterior reducción a una amina, y similares. Se pueden introducir grupos sulfhidrilo por técnicas bien conocidas, tales como, por ejemplo, conversión de un grupo hidroxilo de un alcohol en un éster de ácido sulfónico, seguido de desplazamiento con sulfuro de sodio. También se pueden introducir grupos sulfhidrilo después de la formación de enlaces amida por deshidratación entre un grupo amina de una proteína y un grupo ácido carboxílico de una cisteína acetilada usando un reactivo de carbodiimida, seguido de tratamiento con hidroxilamina, y similares.
Además, cuando se puede modificar químicamente una proteína, péptido, peptoide o peptidomimético tal como por oxidación parcial para introducir un grupo aldehído o un grupo ácido carboxílico, se puede seleccionar un "grupo reactivo con un vector" preferido entre grupos amino, aminoalquilo, aminoarilo, alquilamino, arilamino, hidrazino, alquilhidrazino, arilhidrazino, carbazido, semicarbazido, tiocarbazido, tiosemicarbazido, sulfhidrilo, sulfhidrilalquilo, sulfhidrilarilo, hidroxi, carboxi, carboxialquilo y carboxiarilo. Las porciones alquilo del grupo reactivo con proteínas puede contener de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono y las porciones arilo del grupo reactivo con proteínas puede contener de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 átomos de carbono.
Un grupo reactivo con un vector preferido adicional puede contener un residuo de un agente entrecruzante. Un agente entrecruzante útil puede reaccionar con un grupo funcional tal como, por ejemplo, un grupo amina o sulfhidrilo o ácido carboxílico o un grupo aldehído que se encuentra en un ligante y con un grupo funcional tal como, por ejemplo, un grupo amina o sulfhidrilo o ácido carboxílico o un grupo aldehído que se encuentra en un vector o en una proteína químicamente modificada o molécula biológica tal como se ha descrito antes. Los residuos de determinados agentes entrecruzantes útiles, tales como, por ejemplo, endurecedores de gelatina difuncionales, bisepóxidos y bisisocianatos, se convierten en parte de, es decir, un grupo de unión en, un conjugado vector-ligante que se forma como resultado de la reacción de entrecruzamiento de dicho grupo reactivo con un vector entrecruzante con un cromóforo. Los grupos reactivos con vectores derivados de diversos reactivos entrecruzantes heterobifuncionales tales como los enumerados en el Pierce Chemical Company Catalog and Handbook - Protein Modification Section (1994/5), son útiles y como ejemplos no limitantes de dichos reactivos se incluyen:
Sulfo-SMCC: 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo,
Sulfo-SIAB: (4-yodoacetil)aminobenzoato de sulfosuccinimidilo,
Sulfo-SMPB: 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo,
2-IT: 2-iminotiolano y
SATA: S-acetiltioacetato de N-succinimidilo.
Otros agentes entrecruzantes útiles, sin embargo, facilitan el entrecruzamiento, por ejemplo, como catalizadores consumibles y no están presentes en el conjugado final. Son ejemplos de dichos agentes entrecruzantes los agentes entrecruzantes de carbodiimida y carbamoilonio ddescritos en la Patente EE.UU 4.421.847 y los éteres dicatiónicos de la Patente EE.UU. 4.877.724. Con estos agentes entrecruzantes, uno de los reactivos puede tener un grupo carboxilo y el otro un grupo amina o sulfhidrilo. El agente entrecruzante reacciona primeramente de forma selectiva con el grupo carboxilo, preferiblemente un grupo carboxilo sobre un vector o cromóforo, y luego se separa durante la reacción del grupo carboxilo "activado" con una amina, preferiblemente un grupo amina de un ligante, para formar un enlace amida entre el vector y un ligante o cromóforo de esta invención, uniendo así los restos covalentemente. Una ventaja de eta aproximación es que se puede evitar el entrecruzamiento de moléculas similares, por ejemplo cromóforo con cromóforo, mientras que la reacción de agentes entrecruzantes bifuncionales es no selectiva, de tal forma que se pueden obtener moléculas entrecruzadas no deseadas.
Como grupos reactivos con un vector preferidos adicionales se incluyen semicarbazido, tiocarbazido, tiosemicarbazido, isocianato e isotiocianato; vinilsulfonilalquiloxi, cuyo grupo alquilo contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono; vinilsulfonilalquilpoli(oxialquil)oxi, cuyo grupo alquileno de su porción sulfonilalquilo contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono; el grupo alquileno de la porción polioxialquilo contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono, conteniendo preferiblemente dicha porción poli(oxialquilo) un grupo poli(oxietileno) o un grupo copolimérico poli(oxietileno)-co-poli(oxipropileno), y el polímero contiene de 2 a aproximadamente 100 unidades monoméricas de oxialquileno; amidatoalquiloxi, cuyo grupo alquileno contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono; hidrazidoalquiloxi, cuyo grupo alquileno contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono; azidocarbonilalquiloxi, cuyo grupo alquileno contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono; ariloxicarboniloxialquiloxi, cuyo grupo alquileno contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono y cuyo grupo arilo es como se ha descrito antes; ariloxicarbonil(polioxialquil)oxi, cuyo grupo arilo es como se ha descrito antes y cuyo grupo alquileno de la porción polioxialquilo contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono y es como se ha descrito antes, conteniendo dicha porción poli(oxialquilo) preferiblemente un grupo poli(oxietileno) o un grupo copolimérico poli(oxietileno)-co-poli(oxipropileno), y el polímero contiene de 2 a aproximadamente 100 unidades monoméricas de oxialquileno; triazinas, tales como 4,6-dicloro-2-triazinilamino, 4,6-dicloro-2-triaziniloxi, 4,6-diclo-rotriazinil-2-oxi(polialquiloxi), 4-alcoxi-6-cloro-2-tri-aziniloxi y 4-alcoxi-6-cloro-2-triazinil(polioxialquil)-oxi, conteniendo preferiblemente cada uno de los grupos alquilo de las porciones alcoxi de 2 a 10 átomos de carbono y conteniendo preferiblemente cada uno de los grupos alquileno de las porciones polioxialquilo de 2 a 10 átomos de carbono, incluyendo dicha porción poli(oxialquilo) preferiblemente un grupo poli(oxietileno) o un grupo copolimérico poli(oxietileno)-co-poli(oxipropileno), en donde el polímero contiene de 2 a aproximadamente 100 unidades monoméricas de oxialquileno; formilalquilo, cuyo grupo alquilo contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono; aminoalquilo, cuyo grupo alquilo contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono; ésteres activos, por ejemplo succinimidoxicarbonilo; anhídridos activos y anhídridos mixtos; carbonatos activos, tales como arilcarbonatoarilo, alquilcarbonatoarilo, arilcarbonatoalquilo y alquilcarbonatoalquilo, cuyos grupos alquilo contienen preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono y son como se ha descrito con anterioridad y cuyos grupos arilo están constituidos preferiblemente por un anillo de seis miembros que contiene substituyentes retiradores de electrones, tales como, por ejemplo, nitro y halógeno, y que contienen eventualmente grupos hidrosolubilizantes, tales como una sal sulfonato; sulfhidrilo; sulfhidrilalquilo, cuyo grupo alquilo contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono; tioalquilcarbonilaminoalquiloxi, cuyo grupo alquileno de la porción tioalquilcarbonilo contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono y cuyo grupo alquileno de la porción aminoalquiloxi contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono; maleimidoalquilcarbonilaminoalquiloxi, cuyo grupo alquileno de la porción maleimidoalquilcarbonilo contiene preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono y cuyo grupo alquileno de la porción aminoalquiloxi contiene preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono; azido; yodoalquilcarbonilamino, cuyo grupo alquileno contiene de 1 a 10 átomos de carbono; amidatoalquilamino, cuyo grupo alquileno contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y amidatoarilalquilamino, cuyo grupo alquileno contiene de 1 a 10 átomos de carbono y cuyo grupo arilo es como se ha descrito antes.
Además de su utilidad como grupos reactivos con un vector, dichos grupos aquí descritos son también útiles para la unión covalente de cromóforos a grupos de unión para formar los polímeros de esta invención y para la unión covalente de vectores de abordaje a los polímeros de esta invención. La unión se puede producir con grupos de unión entre dos cromóforos o a través de un grupo de unión que está unido a un cromóforo.
"Vector de abordaje" se refiere, según se describe en WO-A-96/40285 (Unger), a cualquier material o substancia que pueda promover el abordaje de tejidos y/o receptores in vivo con las composiciones de la presente invención. El vector de abordaje puede ser sintético, semisintético o natural. Como materiales o substancias que pueden servir como vectores de abordaje se incluyen, por ejemplo, proteínas, incluidos los anticuerpos, glicoproteínas y lectinas, péptidos, polipéptidos, sacáridos, incluidos los mono- y polisacáridos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides, hormonas, cofactores, agentes bioactivos y material genético, incluidos los nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.
Un "precursor" de un vector de abordaje se refiere a cualquier material o substancia que pueda convertirse en un vector de abordaje. Dicha conversión puede implicar, por ejemplo, el anclaje de un precursor a un vector de abordaje. Como ejemplos de restos precursores que se dirigen a un blanco se incluyen grupos maleimida, grupos disulfuro, tales como grupos 2-piridilditío, grupos vinilsulfona, grupos azida y grupos \alpha-yodoacetilo.
"Péptido" se refiere a un compuesto nitrogenado que puede contener de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido.
"Proteína" se refiere a un compuesto nitrogenado que puede contener más de aproximadamente 100 residuos de aminoácido.
"Tejido" se refiere, en general, a células especializadas que pueden realizar una función particular. Habría que entender que el término "tejido", tal como se usa aquí, puede hacer referencia a una célula individual o a una pluralidad o agregado de células, por ejemplo membranas u órganos. El término "tejido" incluye también referencia a una célula anormal o a una pluralidad de células anormales. Como ejemplos de tejidos se incluyen el tejido miocárdico (al que también se hace referencia como corazón o miocardio), incluidas las células miocárdicas y los cardiomiocitos, tejidos membranosos, incluido el endotelio y el epitelio, láminas, tejido conectivo, incluido el tejido intersticial, y tumores.
"Receptor" se refiere a una estructura molecular dentro de una célula o sobre la superficie de la célula que se caracteriza, en general, por la unión selectiva de una substancia específica. Como ejemplos de receptores se incluyen receptores de la superficie celular para hormonas peptídicas, neurotransmisores, antígenos, fragmentos del complemento e inmunoglobulinas, y receptores citoplásmicos para hormonas esteroideas. Un ejemplo de receptor en el contexto de la presente invención es la glicoproteína GP2b/IIIa, que es una integrina plaquetaria.
"Células endoteliales" o "endotelio" se refiere a un agregado de células y/o tejido que puede ser normal y/o enfermo y que puede consistir en una sola capa de células endoteliales transparentes aplanadas que pueden unirse por sus bordes o de un modo solapante para formar una membrana. Las células endoteliales se encuentran en las superficies libres de las membranas serosas, como parte de la membrana de revestimiento del corazón, de los vasos sanguíneos y de los vasos linfáticos, sobre la superficie del cerebro y de la médula espinal y en cámara anterior del ojo.
El endotelio se origina del mesoblasto embrionario e incluye el tejido cardíaco, incluido el tejido cardíaco infartado, la cardiovasculatura, la vasculatura periférica, tal como las arterias, las venas y los capilares (de cuya localización se dice que es periférica al corazón), los coágulos sanguíneos y la región que rodea a la placa aterosclerótica.
"Células epiteliales" o "epitelio" se refiere a un agregado de células y/o tejido que puede ser normal y/o enfermo y que puede consistir en una o más capas de células que pueden unirse entre sí por una substancia cementante intersticial soportada sobre una membrana basal. El epitelio puede ser clasificado en varias clases, incluyen, por ejemplo, una sola capa de células (epitelio simple), más de una sola capa de células (epitelio estratificado) y aproximadamente tres o cuatro capas de células que se adaptan entre sí substancialmente sin la aparición de estratificación. Normalmente, se hace referencia a las diferentes formas de epitelio simple como escamoso, pavimentoso, columnar, glandular, esferoidal y/o ciliado. El epitelio se origina del epiblasto o hipoblasto embrionario. El epitelio incluye el tejido cardíaco, incluido el tejido cardíaco infartado, la cardiovasculatura, la vasculatura periférica, tal como las arterias, las venas y los capilares, los coágulos sanguíneos y la región que rodea a la placa aterosclerótica.
En una realización, las composiciones de la presente invención incluyen además un vector de abordaje. Los vectores de abordaje pueden asociarse a compuestos lipídicos, proteínas, polímeros y/o vesículas covalente o no covalentemente. Así, en el caso de las composiciones lipídicas, el vector de abordaje puede unirse, por ejemplo, mediante un enlace covalente o no covalente a un lípido. Generalmente se prefiere que el vector de abordaje se una a un lípido o a una vesícula covalentemente. Preferiblemente, en el caso de composiciones lipídicas que contienen colesterol, el vector de abordaje se une al colesterol substancialmente sólo de un modo no covalente y/o el vector de abordaje se une covalentemente a un componente de la composición, por ejemplo otro lípido, tal como un fosfolípido, distinto del colesterol.
Si se desea, los vectores de abordaje pueden unirse también, por ejemplo, a polímeros biocompatibles, según se describe aquí. Los vectores de abordaje incorporados en las composiciones de la presente invención son preferiblemente substancias capaces de dirigirse hacia receptores y/o tejidos in vivo. Con respecto a la dirección hacia un tejido, como se ha indicado anteriormente, los vectores de abordaje son deseablemente capaces de dirigirse al tejido cardíaco, incluidas las células miocárdicas, y a tejidos membranosos, incluidas las células endoteliales y epiteliales. En el caso de los receptores, los vectores de abordaje son deseablemente capaces de dirigirse hacia los receptores GPIIb/IIIa. Se contempla seleccionar vectores de abordaje preferidos para uso en el abordaje de tejidos y/o receptores, incluyendo los tejidos y receptores de los que se han dado ejemplos anteriormente, entre el grupo consistente en proteínas, péptidos, sacáridos, esteroides, análogos de esteroides, agentes bioactivos y material genético, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos, glicoproteínas y lectinas, siendo preferidos los péptidos. Un ejemplo de una proteína que puede ser preferida para uso como vector de abordaje es la Proteína A, que es una proteína producida por la mayor parte de los Staphylococcus aureus. La Proteína A puede ser adquirida comercialmente, por ejemplo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). La Proteína A puede ser entonces usada para unirse a una variedad de anticuerpos IgG. Hablando en general, como péptidos que son particularmente útiles como vectores de abordaje se incluyen péptidos naturales, naturales modificados o sintéticos que incorporan modos adicionales de resistencia a la degradación por las esterasas, amidasas o peptidasas de circulación vascular. Un método muy útil de estabilización de restos peptídicos incorpora el uso de técnicas de ciclación. Como ejemplo, la ciclación de extremo a extremo mediante la cual se une covalentemente el extremo carboxi al extremo amina mediante un enlace amida puede ser útil para inhibir la degradación peptídica y aumentar la vida media circulante. Adicionalmente, una ciclación de cadena lateral a cadena lateral es también particularmente útil para inducir estabilidad. Además, una ciclación de extremo a cadena lateral puede ser una modificación útil. Además, la substitución con un L-aminoácido de un D-aminoácido en una región estratégica del péptido puede ofrecer resistencia a la degradación biológica. Los vectores de abordaje adecuados y los métodos para su preparación serán fácilmente aparentes para un experto en la técnica una vez provisto de la presente descripción.
En relación con el abordaje de células endoteliales, como vectores de abordaje adecuados se incluyen, por ejemplo, uno o más de los siguientes: factores de crecimiento, incluyendo, por ejemplo, el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), el factor de crecimiento ácido de fibroblastos (aFGF), el factor alfa de crecimiento transformante (TGF-\alpha), el factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta), el factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento humano (HGF); angiogenina; factores de necrosis tumoral, incluyendo el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y el factor beta de necrosis tumoral (TNF-\beta); angiotropina polirribonucleotídica que contiene cobre, con un peso molecular de aproximadamente 4.500, así como factores angiogénicos no peptídicos de bajo peso molecular, tales como el 1-butirilglicerol; las prostaglandinas, incluyendo, por ejemplo, la prostaglandina E1 (PGE1) y la prostaglandina E2 (PGE2); nicotinamida; adenosina; dipiridamol; dobutamina; productos de degradación del ácido hialurónico, tales como, por ejemplo, los productos de degradación que resultan de la hidrólisis de las uniones b, incluyendo el ácido hialobiurónico; inhibidores de la angiogénesis, incluyendo, por ejemplo, inhibidores de la colagenasa; minociclina; medroxiprogesterona; quitina químicamente modificada con grupos 6-O-sulfato y 6-O-carboximetilo; esteroides angiostáticos, tales como el tetrahidrocortisol, y heparina, incluyendo fragmentos de heparina, tales como, por ejemplo, fragmentos que tienen un peso molecular de aproximadamente 6.000, mezclados con esteroides, tales como, por ejemplo, cortisona o hidrocortisona; inhibidores de la angiogénesis, incluyendo la angioinhibina (AGM-1470 - un antibiótico angiostático); factor plaquetario 4; protamina; complejos de peptidoglicanos y polisacáridos sulfatados derivados de la pared bacteriana de una especie de Arthrobacter; inhibidores de la angiogénesis derivados de hongos, tales como la fumagilina derivada de Aspergillus fumigatus; D-penicilamina; tiomalato de oro; trombospondina; análogos de la vitamina D3, incluyendo, por ejemplo, 1-\alpha, 25-dihidroxivitamina D3 y un análogo sintético, 22-oxa-1-\alpha,25-dihidroxivitamina D3; \alpha-interferon; citokinas, tales como las interleukinas, incluyendo, por ejemplo, interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2) e interleukina-8 (IL-8); factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF); heparina, incluyendo fragmentos de bajo peso molecular de la heparina o análogos de la heparina; polisacáridos sulfatos simples, tales como las ciclodextrinas, incluyendo la \alpha-, \beta- y \gamma-ciclodextrina; tetradecasulfato; transferrina; ferritina; factor plaquetario 4; protamina; Gly-His-Lys acomplejado con cobre, ceruloplasmina; ácido (12R)-hidroxieicosatrienoico; ácido okadaico; lectinas; anticuerpos; CdIIa/CD18, e Integrina de Acción Muy
Tardía-4 (VLA-4).
Las moléculas de adhesión endotelial de leucocitos (ELAM) son antígenos que se expresan por las células endoteliales en condiciones de estrés y que facilitan luego la migración del leucocito a través del endotelio que reviste la vasculatura hacia los tejidos circundantes. Es también un descubrimiento sorprendente que estas mismas moléculas de adhesión endotelial de leucocitos pueden ser ventajosamente explotadas como receptores para dirigir polímeros cromóforos. Estas moléculas de adhesión a células endoteliales pertenecen a una familia conocida como selectinas, en donde los miembros conocidos, tales como GMP-140, participan todos en la adhesión endotelial de leucocitos e incluyen ELAM-1, LAM-1 y la proteína de la membrana de los gránulos 140 (GMP-140), también conocida como proteína de la membrana externa de gránulos dependiente de la activación plaquetaria (PADGEM), VCAM-1/INCAM-110 (Molécula de Adhesión Vascular/Molécula de Adhesión Inducible) e ICAM-1 (Molécula de Adhesión Intercelular). La familia de las cadherinas de moléculas de adhesión celular puede ser también usada como vectores de abordaje, incluyendo, por ejemplo, las E-, N- y P-cadherinas, la cadherina-4, la cadherina-5, la cadherina-6, la cadherina-7, la cadherina-8, la cadherina-9, la cadherina-10 y la cadherina-11, y más preferiblemente la cadherina C-5. Además, se pueden usar anticuerpos dirigidos a las cadherinas, tales como, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal Ec6C 10, para reconocer cadherinas expresadas localmente por células endoteliales específicas.
Se puede seleccionar una amplia variedad de vectores de abordaje diferentes para unirse a los dominios citoplásmicos de las moléculas ELAM. Los vectores de abordaje en este sentido pueden incluir lectinas, una amplia variedad de restos de carbohidratos o de azúcares, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fragmentos Fab, tales como, por ejemplo, Fab2, y péptidos sintéticos, incluyendo, por ejemplo, Arginina-Glycina-Ácido Aspártico (R-G-D), que pueden dirigirse hacia la curación de heridas. Mientras que muchos de estos materiales pueden derivar de fuentes naturales, algunos pueden ser sintetizados por técnicas recombinantes de biología molecular y otros pueden ser de origen sintético. Se pueden preparar péptidos por una variedad de diferentes técnicas de química combinatoria, como es sabido en este campo. También se pueden usar vectores de abordaje derivados o modificados con un origen en los leucocitos humanos, tales como CD11a/CD18, y la glicoproteína de la superficie de las células leucocitarias (LFA-1), ya que se sabe que éstos se unen al receptor de las células endoteliales ICAM-1. El miembro inducible por citokinas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, VCAM-1, que es selectivo de los leucocitos mononucleares, puede ser también usado como vector de abordaje. VLA-4, derivado de monocitos humanos, puede ser usado para dirigirse hacia VCAM-1. Se pueden emplear anticuerpos y otros vectores de abordaje para dirigirse a la endoglina, que es un marcador de proliferación de las células endoteliales. La endoglina es regulada a más sobre las células endoteliales en tumores sólidos diversos. Un vector de abordaje que puede ser usado para dirigirse a la endoglina es el anticuerpo TEC-11.
R-E. Thorpe y F.J. Burrows, Breast Cancer Research and Treatment, Vol. 36, pp. 237-51 (1995).
La activación endotelial en el marco de la aterosclerosis es usada en esta invención para dirigir las composiciones de polímeros cromóforos hacia regiones de arteriosclerosis, incluyendo, por ejemplo, la placa aterosclerótica. Uno de tales blancos que puede ser usado es la molécula de adhesión endotelial de leucocitos mononucleares inducible reconocida por Rbl/9 como un ATHERO-ELAM. Los anticuerpos monoclonales, H4/18 y H18/7, pueden ser usados para dirigirse hacia los antígenos de la superficie de las células endoteliaales que son inducidos por lo mediadores citokinas. Como realización preferida de esta invención, se dirigen polímeros cromóforos a la placa aterosclerótica para detectar de un modo no invasivo vasos sanguíneos enfermos antes de haberse producido un daño grave, por ejemplo, antes de un accidente cerebrovascular o de un infarto de miocardio, de tal forma que se pueda llevar a cabo una intervención médica o quirúrgica apropiada. ATHERO-ELAM es un blanco preferido y se pueden usar vectores, tales como anticuerpos, péptidos o lectinas o sus combinaciones para abordar este epitopo de la superficie celular expresado en células endoteliales en el contexto de la aterosclerosis. Alternativamente, se pueden usar lipoproteínas o fragmentos de lipoproteínas derivados de proteína lipoproteicas de baja o alta densidad como vectores de abordaje. Adicionalmente, se puede usar colesterol para abordar las células endoteliales y localizar los polímeros cromóforos en regiones de placa aterosclerótica.
Se puede usar un vector de abordaje dirigido hacia material trombótico en la placa para diferenciar entre regiones activas e inactivas de la placa aterosclerótica. Las placas activas en proceso de generar trombos son más peligrosas, ya que estas placas pueden finalmente ocluir un vaso o dar lugar a un émbolo. En este sentido, además de fragmentos de heparina de bajo peso molecular, se pueden usar otros vectores de abordaje, tales como, por ejemplo, anticuerpo anti-fibrina, activador del plasminógeno de tejidos (t-PA), anticuerpo anti-trombina y anticuerpos de fibrina dirigidos hacia facciones de activación plaquetaria para abordar placas activas con desprendimiento de coágulos. Son vectores de abordaje más preferidos los que se dirigen hacia un GPIIb/IIIa asociado a membrana plasmática además de dirigirse hacia la P-selectina y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo asociado dirigido a GPIIb/IIIa. La presente invención es también útil para detectar regiones de infarto de miocardio agudo. Convenientemente, uniendo anticuerpo anti-miosina (particularmente cardiomiosina) o anticuerpos anti-actina a los polímeros, se puede detectar un miocardio infartado por los métodos de la presente invención. Para el abordaje del tejido de granulación (heridas en curación), pueden ser útiles muchos de los vectores de abordaje anteriores. El tripéptido de curación de heridas, arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), puede ser también empleado como vector de abordaje en este sentido.
Como con las células endoteliales antes discutidas, se puede emplear una amplia variedad de péptidos, proteínas y anticuerpos como vectores de abordaje para dirigirse hacia células epiteliales. Preferiblemente, se puede seleccionar un péptido, incluyendo péptidos sintéticos, semisintéticos o naturales, con alta afinidad por el receptor de células epiteliales buscado, siendo más preferidos los péptidos sintéticos. En relación a estas realizaciones preferidas, se prefieren péptidos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 residuos de aminoácido. Se pueden usar anticuerpos como anticuerpo entero o como fragmentos de anticuerpo, por ejemplo Fab o Fab'_{2}, ya sean de origen natural o recombinante. Los anticuerpos de origen natural pueden ser de origen animal o humano o pueden ser quiméricos (murino/humano). Se prefieren los anticuerpos recombinantes o quiméricos humanos y se prefieren los fragmentos al anticuerpo entero.
Como ejemplos de anticuerpos monoclonales que pueden ser empleados como vectores de abordaje en las presentes composiciones se incluyen CALAM 27, que se forma inmunizando ratones BALB/c con carcinoma de células escamosas humano entero de la lengua y formando hibridomas cruzando células esplénicas extraídas con las de una línea celular de mieloma singénico NS1. Gloanni, J. y col., Cancer Research, Vol. 47, pp. 4417-4424 (1987). CALAM se dirige a los epitopos superficiales de células epiteliales tanto normales como malignas. Los nódulos linfáticos normales generalmente no contienen células que expresen estos epitopos. Véase Cancer Research, Vol. 47, pp. 4417-4424 (1987). En consecuencia, se pueden usar polímeros cromóforos que contengan este anticuerpo para dirigirse hacia metástasis en los nódulos linfáticos. Se puede emplear el anticuerpo monoclonal 3C2 como vector de abordaje para abordar células epiteliales malignas de carcinomas ováricos y carcinomas endometrioides graves. Otro ejemplo de vector de abordaje es MAb 4C7 (véase Cancer Research, Vol. 45, 2358-2362, 1985), que puede ser usado para abordar el carcinoma mucinoso, el carcinoma endometrioide y el carcinoma mesonefroide. Para abordar el carcinoma de células escamosas en el cáncer de cabeza y de cuello, se puede usar MAb E48 (Biological Abstract, Vol. 099, artículo 066, Ref. 082748), que puede ser usado como vector de abordaje. Para abordar el melanoma maligno, se puede emplear el anticuerpo monoclonal 225.28s (Pathol. Biol., Vol. 38(8), pp. 866-869, 1990).
Se pueden seleccionar los vectores de abordaje para abordar antígenos, incluyendo antígenos asociados al cáncer de mama, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el rector del factor de crecimiento fibroblástico, erbB2/HER-2 y los antígenos carbohidrato asociados a tumores (Cancer, Vol. 74(3), pp. 1006-12 (1994)). CTA 16.88, homólogo de las citokeratinas 8, 18 y 19, es expresado por la mayoría de los tumores derivados del epitelio, incluyendo carcinomas de colon, páncreas, mama, ovario y pulmón. Así, se pueden emplear anticuerpos dirigidos a estas citokeratinas, tales como 16.88 (IgM y 88BV59 (IgG3k), que reconocen diferentes epitopos sobre CTA 16.88 (Semin. Nucl. Med., Vol. 23(2), pp. 165-79 (1993)), como vectores de abordaje. Para dirigirse hacia el cáncer de colon, se pueden emplear fragmentos Fab' de IgG anti-CEA como vectores de abordaje. También se pueden usar anticuerpos Fab'-Fab biespecíficos anti-antígeno de la superficie celular, anti-hapteno conjugados químicamente como vectores de abordaje. Se puede seleccionar la serie MG de anticuerpos monoclonales para abordar, por ejemplo, el cáncer gástrico (Chin. Med. Sci. J., Vol. 6(1), pp. 56-59 (1991).
Hay una variedad de epitopos de la superficie celular sobre las células epiteliales para los que se pueden seleccionar vectores de abordaje. Por ejemplo, se ha asociado a la proteína del virus del papiloma humano (HPV) con proliferaciones epiteliales benignas y malignas en la piel y en las mucosas. Se pueden abordar dos proteínas oncogénicas del HPV, E6 y E7, ya que éstas pueden expresarse en ciertos cánceres derivados de epitelio, tales como el carcinoma cervical. Véase Curr. Opin. Immunol., Vol. 6(5), pp. 746-54 (1994). También se pueden seleccionar receptores de membrana para factores de crecimiento peptídicos (PGF-R), que están implicados en la proliferación de las células cancerosas, como antígenos tumorales. Véase Anticancer Drugs, Vol. 5(4), pp. 379-93 (1994). También se pueden abordar el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la interleukina-2 con vectores de abordaje adecuados, incluyendo péptidos, que se unen a estos receptores. Se pueden abordar determinados antígenos asociados a melanomas (MAA), tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y moléculas de adhesión (Tumor Biol., Vol. 15(4), pp. 188-202 (1994)), que se expresan en las células de melanomas malignos, con los compuestos cromóforos poliméricos y las composiciones aquí provistas. También se puede seleccionar como objetivo el antígeno asociado a tumores FAB-72 sobre la superficie de células de carcinoma.
Se puede seleccionar una amplia variedad de vectores de abordaje para dirigirse a las células miocárdicas. Como ejemplos de vectores de abordaje se incluyen, por ejemplo, anticuerpo anti-cardiomiosina, que puede comprender anticuerpo policlonal y fragmentos Fab'_{2} o ser de origen humano, de origen animal, por ejemplo de origen murino, o de origen quimérico. Como vectores de abordaje adicionales se incluyen dipiridamol; digitalis; nifedipina; apolipoproteína; lipoproteínas de baja densidad (LDL), incluyendo alfa-LDL, vLDL y metil-LDL; rianodina; endotelina; receptor de complemento tipo 1; IgG Fc; beta 1-adrenérgico; dihidropiridina; adenosina; mineralocorticoides; acetilcolina nicotínica y acetilcolina muscarínica; anticuerpos para el receptor alfa 1A-adrenérgico humano; agentes bioactivos, tales como fármacos, incluyendo el antagonista alfa 1 prazosina; anticuerpos para el receptor anti-beta; fármacos que se unen al receptor anti-beta; anticuerpos anti-RyR cardíaco; endotelina-1, que es un péptido vasoconstrictor derivado de células endoteliales que ejerce un potente efecto inotrópico positivo sobre el tejido cardíaco (la endotelina-1 se une a las vesículas sarcolémicas cardíacas); anticuerpos monoclonales que pueden generarse para el alfa-beta receptor de las células T y ser así empleados para generar vectores de abordaje; el inhibidor del complemento sCR1; fármacos, péptidos o anticuerpos que se generan para el receptor de dihidropiridina; se pueden usar anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el receptor anti-interleukina-2 como vectores de abordaje para dirigir los presentes compuestos y composiciones poliméricas cromóforas a áreas de tejido miocárdico que expresan este receptor y que pueden ser reguladas de modo creciente en condiciones de inflamación; ciclosporina para dirigir de forma similar las composiciones a áreas de tejido miocárdico inflamado; metil-isobutilisonitrilo; lectinas que se unen a azúcares específicos sobre las membranas de los miocitos cardíacos y las células endoteliales cardíacas; adrenomedulina (ADM), que es un péptido endógeno hipotensor y vasorrelajante; péptido natriurético atrial (ANP); péptido natriurético de tipo C (CNP), que es un péptido de 22 aminoácidos de origen en las células endoteliales y que está estructuralmente relacionado con el péptido natriurético atrial, pero que es genéticamente distinto y posee actividad vasoactiva y antimitogénica; péptido vasonatrina (VNP), que es una quimera de péptido natriurético atrial (ANP) y péptido natriurético de tipo C (CNP) y consiste en 27 aminoácidos; trombina; factor relajante derivado del endotelio (EDRF); endopeptidasa neutra 1 (NEP-1); inhibidores competitivos del EDRF, incluyendo, por ejemplo, NG-monometil-L-arginina (L-NNMA); antagonistas de los canales del potasio, tales como caribdotoxina y gibenclanmida; anticuerpos anticardíacos, que pueden ser identificados en pacientes con cardiomiopatía dilatada idiopática, pero que preferiblemente no provocan citolisis en el miocardio; anticuerpos dirigidos contra el translocador del nucleótido de adenosina, la deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada o la miosina cardíaca; antagonistas específicos para el receptor de endotelina-A, a los que se puede hacer referencia como BQ-123, y anticuerpos para el receptor de angiotensina-II.
Dos de los antígenos mayores del sarcolema de la fibra muscular cardíaca son glicoproteínas que se unen al calcio y que copurifican con el receptor de dihidropiridina. Se pueden producir antisueros, incluyendo anticuerpos policlonales o monoclonales, contra el sarcolema purificado. Estos anticuerpos pueden ser también empleados como vectores de abordaje. Se pueden aislar fracciones purificadas de las glicoproteínas que se unen al calcio a partir de las membranas plasmáticas del sarcolema y usarlas luego para generar anticuerpos. El ANP, que, como se ha indicado anteriormente, puede ser usado como vector de abordaje, puede ser obtenido a partir de cultivos de células endoteliales aórticas humanas. El ANP se localiza generalmente en el endotelio, pero también puede localizarse en el tejido endotelial o miocárdico. El ANP puede ser preparado, por ejemplo, usando técnicas recombinantes, así como por síntesis del péptido usando técnicas de síntesis peptídica conocidas para los expertos en este campo. Es también posible usar un anticuerpo, ya sea policlonal o monoclonal, dirigido hacia el ANP. De forma similar, se puede usar un péptido dirigido al ANP para abordar células endoteliales y/o miocárdicas. Se pueden usar tanto la forma beta como la alfa del factor natriurético atrial como vectores potenciales de abordaje para dirigir los presentes compuestos y composiciones de cromóforos poliméricos al tejido miocárdico.
Se puede emplear una amplia variedad de vectores de abordaje para dirigir las presentes composiciones de cromóforos poliméricos, y particularmente composiciones de cromóforo-PAO-cromóforo, al receptor GPIIb/IIIa. Las composiciones que se dirigen al receptor GPIIb/IIIa son altamente útiles para abordar las trombosis o coágulos vasculares y son útiles para diagnosticar, así como para tratar, dichos coágulos. Se incluyen entre dichos vectores de abordaje, por ejemplo, péptidos, tales como Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS), Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP) y Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP). También son útiles pentapéptidos que contienen la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD), incluyendo, por ejemplo, G4120, que es un péptido cíclico que contiene la secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Asp (RGD). También son útiles los péptidos derivados del Factor XIIIA de coagulación humano, incluyendo, por ejemplo, fragmentos tales como: NK
LIVRRGQSFYVQIDFSRPYDPRRDLFRVEYVIGRYPQENKGTYIPVPIVSELQSGKWGAKIVMREDRSVRLSIQ
SSPKCIVGKFRMYVAVWTPYGVLRTSRNPETDTYILFNPWCEDDAVYLDNEKEREEYVLNDIGVIFYGEVND
IKTRSWSYGQF-R', donde R' es -CONH_{2} o -NH_{2}. Además, péptidos que son fragmentos del fragmento del Factor XIIIA, que incluyen en su secuencia la secuencia NKLIVRRGOSFYVQIDFSRPYDPRRD o DDAVYLDNEKE
REEYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQF.
Como péptidos adicionales que pueden ser útiles como vectores de abordaje para dirigirse hacia el receptor GPIIb/IIIa, se incluyen, por ejemplo, péptidos que contienen la secuencia tripeptídica de arginina-tirosina-ácido aspártico (Arg-Tyr-Asp, también abreviada como RGD), unida del extremo amino al carboxi, y que pueden unirse a la región de unión de GPIIb/IIIa en plaquetas activadas. Como ejemplos de tales péptidos se incluyen, por ejemplo, péptidos de fórmula general R^{1}-(X^{1})_{n}-Arg-Tyr-Asp-(Y)_{o}-(X^{2})_{m}-R^{2}, donde cada uno de X^{1}, X^{2} e Y pueden ser independientemente uno o más residuos de aminoácido, mientras que, en ciertos casos, se prefiere que Y sea distinto de un residuo de serina o de alanina, y cada uno de m, n y o es independientemente 0 ó 1, siempre que, en determinados casos, cuando m es 1, entonces o sea 1, y R^{1} es un grupo amino terminal protegido o no protegido y R^{2} es un grupo carboxi terminal protegido o no protegido. En una realización preferida, X^{1} es el péptido Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr y X^{2} es el péptido Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr. Como péptidos útiles se incluyen Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr y Ala-Arg-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr.
También se pueden usar compuestos sintéticos que combinan una secuencia de aminoácidos natural con aminoácidos sintéticos como vector de abordaje, tales como un compuesto antagonista de los receptores de fibrinógeno que comprende la secuencia XX-Gly-Asp, donde XX- es un alfa-aminoácido sintético que contiene una cadena lateral lineal, tal como
-(CH_{2})_{n}-AA-(CH_{2})_{n'}-NH-C(N=H)-NHR
donde n + n' es 3, AA es un enlace sencillo y R es fenilo o bencilo,
o
-(CH_{2})_{n}-AA-(CH_{2})_{n'}-NHR
donde n es un número entero de 1 a 4; n' es un número entero de 2 a 4; AA es oxígeno, azufre o un enlace sencillo, y R es H, alquilo C_{1-6}, arilo eventualmente substituido, arilmetilo eventualmente substituido o cicloalquilo eventualmente substituido, siempre que, en determinados casos, cuando AA es un enlace sencillo y R es H, entonces n + n' sea distinto de 3 ó 4. Otro de tales compuestos consiste en un antagonista del receptor de fibrinógeno de fórmula:
cíclico-[XX-Gly-Asp-ZZ-]
donde XX es un alfa-aminoácido sintético que contiene una cadena lateral lineal que tiene la fórmula
-(CH_{2})_{n}-AA-(CH_{2})_{n'}-NH-C(N=H)-NHR,
\hskip7,5cm
o
-(CH_{2})_{n}-AA-(CH_{2})_{n'}-NHR
donde n es un número entero de 1 a 4; n' es un número entero de 2 a 4; AA es oxígeno, azufre o un enlace sencillo, y R es H, alquilo C1-6 o cicloalquilo eventualmente substituido, siempre que, en determinados casos, cuando AA es un enlace sencillo y R es H, entonces n + n' sea distinto de 3 ó 4, y ZZ es una secuencia de 1 a 4 aminoácidos eventualmente substituidos.
Otros péptidos útiles para uso como vectores de abordaje incluyen, por ejemplo, la "Elegantina", que tiene la siguiente secuencia: Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Ala-Asp-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-Lys-R-R'-Arg-Thr-Ile-Cys-Arg-
Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-Asp-Asp-Arg-Cys-Thr-Gly-Gln-Ser-Ala-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Gly-Tyr, donde cada uno de R y R' es independientemente cualquier aminoácido; la "Albolabrina", que tiene la siguiente secuencia: Glu-Ala-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Leu-Pro-Gly-
Ala-Gln-Cys-Gly-Glu-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Ser-Phe-Met-Lys-Lys-Gly-Thr-Ile-Cys-Arg-Arg-ala-Arg-
Gly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Ile-Ser-Ala-Gly-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Leu-His-Ala; la "Batroxostatina", que tiene la siguiente secuencia: Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Thr-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-Lys-Gly-
Ala-Gly-Lys-Ile-Cys-Arg-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-Asp-Asp-Cys-Thr-Gly-Gln-Ser-Ala-Asp-Cys-Pro-Arg-
Phe, y la "Flavoridina", que tiene la siguiente secuencia: Gly-Gly-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Ala-Asp-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-
Lys-R-R'-Arg-Thr-Ile-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Asp-Asp-Arg-Cys-Thr-Gly-Leu-Ser-Ala-Asp-Cys-
Pro-Arg-R-Asn-Asp-Leu, donde cada uno de R y R' es independientemente cualquier aminoácido.
Otros vectores útiles para dirigirse al receptor GPIIb/IIIa incluyen compuestos sintéticos, tales como Ac-(D)-Phe-Pro-boroArg y la sal metanosulfonato del ciclo(ácido D-2-aminobutirato-N-metil-L-Arginil-Glicil-L-Aspartil-3-aminometilbenzoico) peptidomimética cíclica. Como péptidos que pueden ser también utilizados se incluye una librería de hexapéptidos flanqueados por residuos de cisteína (capaz de formar disulfuros cíclicos) y formas cíclicas unidas por disulfuro de péptidos con la secuencia Arg-Gly-Asp o Lys-Gly-Asp, así como el péptido derivado carboxi-terminal, REYVVMWK. Ciertas glicoproteínas de la matriz, tales como la trombospondina, son también útiles en este sentido. Los miembros de la familia de las serpinas de los inhibidores de las serina-proteasas, tales como el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1), son también vectores útiles.
En general, se prefiere emplear como vectores de abordaje para el receptor GPIIb/IIIa un péptido que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 aminoácidos, siendo más preferidos péptidos que tienen de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 aminoácidos. Incluso más preferiblemente, los vectores de abordaje para el receptor GPIIb/IIIa pueden consistir en péptidos que tienen aproximadamente 8 aminoácidos, siendo aún más preferidos péptidos que tienen de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 aminoácidos o aproximadamente 5 aminoácidos. Si se desea, los péptidos se pueden ciclar, por ejemplo, por (1) uniones covalentes de cadena lateral-a-cadena lateral, incluyendo, por ejemplo, la formación de una unión disulfuro mediante la oxidación de dos aminoácidos que contienen tiol o análogos de los mismos, incluyendo, por ejemplo, cisteína o penicilamina; (2) uniones covalentes de extremo-a-cadena lateral, incluyendo, por ejemplo, el uso del extremo amino de la secuencia de aminoácidos y un grupo carboxilato de la cadena lateral, tal como, por ejemplo, un grupo ácido glutámico o ácido aspártico no crítico. Alternativamente, la unión covalente de extremo a cadena lateral puede implicar al extremo carboxilato de la secuencia de aminoácidos y a un grupo amino, amidina o guanidina de la cadena lateral u otro grupo de la cadena lateral que contenga un átomo de nitrógeno nucleofílico, tal como grupos de cadena lateral que incluyen, por ejemplo, lisina, arginina, homoarginina, homolisina o similares; (3) uniones covalentes de extremo-a-extremo, que son uniones amida covalentes, o similares. Dichos procedimientos son bien conocidos para los expertos en la técnica. Además, se puede emplear la "pseudociclación", en donde se produce una ciclación por interacciones no covalentes, tales como interacciones electrostáticas, que inducen un plegamiento de la estructura secundaria para formar un tipo de resto cíclico. Se contempla que los iones metálicos pueden ayudar a la inducción de una formación "pseudocíclica". Este tipo de formación pseudocíclica puede ser análoga a los "dedos de zinc". Como sabe alguien con conocimientos ordinarios en la técnica, los dedos de zinc implican la formación por interacciones electrostáticas entre un ion zinc (Zn^{2+}) y cisteína, penicilamina y/o homocisteína de una región en forma de bucle (el dedo). En el caso de la homocisteína, la secuencia RGD residiría en la punta del dedo. Por supuesto, se reconoce que, en el contexto de la presente invención de polímeros cromóforos, sería adecuado cualquier tipo de ciclación estabilizadora en la medida en que el vector peptídico de reconocimiento y unión, tal como, por ejemplo, RGD, mantenga la conformación y/o topografía apropiadas para unirse al receptor apropiado en coágulos con una constante de Michaelis-Menten (k_{m}) o constante de unión razonable. Tal como se usa aquí, el término "conformación" se refiere a la organización tridimensional del esqueleto del péptido, peptoide o pseudopéptido y el término "topografía", tal como se usa aquí, se refiere a la organización tridimensional de la cadena lateral del péptido, peptoide o pseudopéptido.
Otros vectores de abordaje adecuados incluyen los siguientes compuestos:
Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Phe-Gly-Cys-CONH_{2}; Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-CONH_{2}; Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asn-Cys-CONH_{2}; Ac-Cys-Asn-Thr-Leu-Lys-Gly-Asp-Cys-CONH_{2}; Ac-Cys-Asn-Trp-Lys-Arg-
Gly-Asp-Cys-CONH_{2}, y Ac-Cys-N-metil-Arg-Gly-Pen-CONH_{2}, donde "Pen" se refiere a penicilamina (beta,beta-dimetilcisteína).
Otros compuestos que pueden ser útiles como vectores de abordaje incluyen péptidos o sus derivados, representados por la fórmula
A-B-Arg-Gly-Asp-C-D
donde:
A es prolina, tioprolina, hidroxiprolina, deshidroprolina, ácido 2-oxo-4-tiazolidinacarboxílico, N-alquilglicina o un derivado de aminoácido de fórmula:
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triptófano o un derivado de triptófano de fórmula:
6
ácido piroglutámico o ácido 2-azetidinona-4-carboxílico;
B es serina, glicina, valina, alanina, treonina o beta-alanina;
C es un grupo aminoácido que tiene un grupo funcional hidrofóbico y
D es hidroxi o amino;
donde:
R_{1} es hidrógeno, -(CH_{2})_{p}CH_{3} o -CO- (CH_{2})_{p}CH_{3};
R_{2} es hidrógeno o alquilo;
R_{3} es hidrógeno o alcoxi;
R_{4} es hidrógeno o alquilo;
R_{5} es hidrógeno, amino o acilamino;
m es un número entero de 2 a 5;
n es un número entero de 0 a 2;
p es un número entero de 0 a 5, y
q es un número entero de 0 a 3.
Otro vector de abordaje que puede ser adecuado para uso en relación con las presentes composiciones poliméricas de tinción es un péptido, un derivado de péptido o una sal del mismo de fórmula:
A-B-Arg-Gly-Asp-C-D
donde:
A es ácido orótico o ácido hidroorótico,
B es un aminoácido,
C es un aminoácido que tiene un grupo funcional hidrofóbico y
D es hidroxi o amino.
En los anteriores compuestos, son ejemplos de aminoácidos que tienen grupos funcionales hidrofóbicos en la definición de "C" triptófano y fenilalanina.
Se describen diversos péptidos que resultarían adecuados para uso como vector de abordaje en relación a la presente invención de polímeros cromóforos, especialmente para dirigirse a GPIIb/IIIa, por ejemplo, en Sat y col., Patente EE.UU. Nº 5.498.601 y las siguientes Solicitudes publicadas de Patente Europea: 0.368.486 A, 0.382.451 A y 0.422.938 B1. Otros vectores de abordaje que pueden ser usados en las composiciones de la presente invención, además de los ejemplos anteriores, resultarán aparentes para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica una vez provisto de la presente descripción. Otros vectores de abordaje adecuados incluyen, por ejemplo, péptidos conjugados, tales como, por ejemplo, glicoconjugados y lectinas, que son péptidos unidos a restos de azúcares. Las composiciones pueden incluir un solo vector de abordaje, así como dos o más vectores de abordaje diferentes.
En los agentes de contraste de esta invención, se pueden unir el cromóforo o un grupo de unión a un vector de abordaje, Q, o a un precursor del mismo. En realizaciones en las que Q es un vector de abordaje, Q se dirige preferiblemente a células o receptores seleccionados entre el grupo consistente en células miocárdicas, células endoteliales, células epiteliales, células tumorales y el receptor glicoproteico GPIIb/IIIa. En determinadas realizaciones preferidas, Q se dirige a células o receptores seleccionados entre el grupo consistente en células miocárdicas, células endoteliales, células epiteliales y el receptor glicoproteico GPIIb/IIIa. Además, en realizaciones en las que Q es un vector de abordaje, Q es preferiblemente seleccionado entre el grupo consistente en proteínas, péptidos, sacáridos, esteroides, análogos de esteroides, agentes bioactivos y material genético. En estas últimas realizaciones, Q es preferiblemente seleccionado entre el grupo consistente en proteínas, péptidos y sacáridos. En realizaciones en las Q está constituido por un péptido, Q es preferiblemente el péptido -Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val o un péptido cíclico, tal como DMP 728. (Véase, por ejemplo, Mousa y col., Thrombosis Research, Vol. 76(2), pp. 109-119 (1994)). En realizaciones en las que Q consiste en una proteína, Q es preferiblemente Proteína A. En realizaciones en las que Q consiste en un sacárido, Q puede ser seleccionado entre el grupo consistente en monosacáridos y disacáridos. Como monosacáridos útiles en la invención, se incluyen monosacáridos que tienen seis carbonos, tales como alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, fructosa, psicosa y tagatosa; monosacáridos que tienen cinco carbonos, tales como ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, ribulosa y xilulosa; monosacáridos que tienen cuatro carbonos, tales como eritrosa, treosa y eritulosa. Como disacáridos útiles se incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, isomaltosa y celobiosa. En realizaciones en las que Q consiste en un sacárido, Q es preferiblemente un monosacárido, siendo más preferidas la manosa y la glucosa.
En realizaciones en las que Q es un precursor de un vector de abordaje, Q preferiblemente consiste en un anillo monocíclico parcialmente insaturado o aromático de 5 a 7 miembros que contiene 1 ó 2 átomos de N, O o S, y más preferiblemente un resto de maleimida o un resto de piridilo. En realizaciones en las que Q es un vector de abordaje, preferiblemente Q es un vector de abordaje que se dirige a células o receptores seleccionados entre el grupo consistente en células miocárdicas, células endoteliales, células epiteliales, células tumorales y el receptor glicoproteico GPIIa/IIIb. También en realizaciones preferidas, Q es un vector de abordaje seleccionado entre el grupo consistente en proteínas, péptidos, sacáridos, esteroides, análogos de esteroides, agentes bioactivos y material genético, siendo más preferidos las proteínas, los péptidos y los sacáridos. También son preferidos los vectores de abordaje que se dirigen a regiones de arteriosclerosis, especialmente a la placa aterosclerótica. También se prefieren vectores de abordaje que se dirigen al miocardio infartado. En ciertas realizaciones, los vectores de abordaje se dirigen a las células cancerosas.
Las anteriores realizaciones preferidas de los compuestos de la presente invención son preferidas por varias razones, incluyendo la facilidad de síntesis, la eficacia de diagnóstico, la mayor biocomptabilidad y/o la mayor eficacia de abordaje.
El vector de abordaje puede ser incorporado a las presentes composiciones de polímeros cromóforos en una variedad de formas. Hablando en general, el vector de abordaje puede ser incorporado a las presentes composiciones asociándolo covalente o no covalentemente a uno o más de los cromóforos y/o a los grupos de unión de los polímeros cromóforos de esta invención. En una forma preferida, el vector de abordaje se asocia covalentemente a uno o más de los cromóforos y/o aa lo grupos de unión. En compuestos preferidos de la presente invención, los vectores de abordaje se asocian preferiblemente de un modo covalente a los grupos de unión de los compuestos poliméricos cromóforos.
Como ejemplos de enlaces covalentes mediante los cuales se asocian los vectores de abordaje a los polímeros se incluyen, por ejemplo, amida (-CONH-); tioamida (-CSN-H-); éter (ROR', donde R y R' pueden ser iguales o diferentes y son distintos de hidrógeno); éster (-COO-), tioéster (-COS-); -O-; -S-; -S_{n}- donde n es mayor de 1, preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 8 y más preferiblemente aproximadamente 2; carbamatos; -NH-; NR-, donde R es alquilo, por ejemplo alquilo de 1 a aproximadamente 4 carbonos; uretano, e imidato substituido, y combinaciones de dos o más de éstos. Se pueden conseguir enlaces covalentes entre vectores de abordaje y cromóforos y enlaces covalentes entre vectores de abordaje y grupos de unión utilizando moléculas que pueden actuar como espaciadores para aumentar la flexibilidad conformacional y topográfica del vector. Como ejemplos de dichos espaciadores se incluyen, por ejemplo, ácido succínico, ácido 1,6-hexanodioico, ácido 1,8-octanodioico y similares, así como aminoácidos modificados, tales como, por ejemplo, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutanoico y similares. Además, en el caso de vectores de abordaje que contienen restos peptídicos, el entrecruzamiento de cadena lateral-a-cadena lateral puede ser complementado con cruzamiento de cadena lateral-a-extremo y/o entrecruzamiento de extremo-a-extremo. Además, se pueden usar pequeñas moléculas espaciadoras, tales como dimetilsuberimidato, para alcanzar objetivos similares. También se pueden emplear agentes, incluyendo los usados en reacciones de tipo base de Schiff, tales como glutaraldehído. Se puede hacer que las uniones de base de Schiff, que pueden ser uniones reversibles, se conviertan en uniones covalentes más permanentes usando procedimientos de aminación reductora. Ésta puede incluir, por ejemplo, agentes reductores químicos tales como agentes reductores de hidruro de litio y aluminio o sus análogos más débiles, incluyendo el hidruro de litio, aluminio y diisobutilo (DIBAL), el borohidruro de sodio (NaBH_{4}) o el cianoborohidruro de sodio (NaBH_{3}CN).
La unión covalente de los vectores de abordaje a los cromóforos y a los grupos de unión en los presentes compuestos puede ser conseguida usando técnicas orgánicas sintéticas, que serán obvias para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica, en base a la presente descripción. Por ejemplo, los vectores de abordaje pueden unirse a los cromóforos o a los grupos de unión usando agentes de copulación o activación conocidos. Como es sabido para el experto en la técnica, los agentes activadores son generalmente electrofílicos. Esta electrofilicidad puede ser empleada para estimular la formación de un enlace covalente. Como ejemplos de agentes activantes que pueden ser usados se incluyen, por ejemplo, carbonildiimidazol (CDI), diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), cloruro de metilsulfonilo, Reactivo de Castro y cloruro de difenilfosforilo.
Los enlaces covalentes pueden implicar entrecruzamiento y/o polimerización. El entrecruzamiento se refiere preferiblemente a la unión de dos cadenas de moléculas de polímero por puentes, compuestos por un elemento, un grupo o un compuesto que unen determinados átomos de carbono de las cadenas por enlaces químicos covalentes. Por ejemplo, se puede producir entrecruzamiento en polipéptidos que se unen por los enlaces disulfuro del residuo de cistina. Se puede conseguir entrecruzamiento, por ejemplo, por (1) adición de una substancia química (agente entrecruzante) y exposición de la mezcla al calor, o (2) sometiendo un polímero a radiación de alta energía. Se describen una variedad de agentes entrecruzantes, o "ligantes" de diferentes longitudes y/o funcionalidades, descritos, por ejemplo, en R.L. Lunbland, Techniques in Protein Modification, CRC Press, Inc., Ann Arbor, NE, pp. 249-68 (1995). Como entrecruzantes ejemplares se incluyen, por ejemplo, 3,3'-ditiobis(succinimi-dilpropionato), dimetilsuberimidato y sus variaciones, en base a la longitud del hidrocarburo, y bis-N-maleimido-1,8-octano.
El residuo de un vector se une independientemente a otro componente del polímero de esta invención a través de un enlace químico o de un grupo de unión, según se describe en US-A-5583206 (Snow y col.). Los grupos de unión preferidos pueden derivar de grupos reactivos con vectores e incluir, por lo tanto, átomos de nitrógeno en grupos tales como grupos amino, imido, nitrilo e imino; alquileno, preferiblemente de 1 a 18 átomos de carbono, tales como metileno, etileno, propileno, butileno y hexileno, tal como alquileno eventualmente interrumpido por 1 o más heteroátomos, tales como oxígeno, nitrógeno y azufre, o grupos que contienen heteroátomos; carbonilo; sulfonilo; sulfinilo; éter; tioéter; éster, es decir, carboniloxi y oxicarbonilo; tioéster, es decir, carboniltío, tiocarbonilo, tiocarboniloxi y oxitiocarboxi; amida, es decir, iminocarbonilo y carbonilimino; tioamida, es decir, iminotiocarbonilo y tiocarbonilimino; tío; ditío; fosfato; fosfonato; uretano; tioureleno; uretano, es decir, iminocarboniloxi y oxicarbonilimino; una unión de aminoácidos, es decir, un grupo
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donde k = 1 y X_{1}, X_{2} y X_{3} son independientemente H, alquilo de 1 a 18, preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo y propilo, tal como alquilo eventualmente interrumpido por 1 o más heteroátomos, tales como oxígeno, nitrógeno y azufre, arilo substituido o no substituido de 6 a 18, preferiblemente de 6 a 10 átomos de carbono, tal como fenilo, hidroxiyodofenilo, hidroxifenilo, fluorofenilo y naftilo, aralquilo, preferiblemente de 7 a 12 átomos de carbono, tal como bencilo, heterociclilo, preferiblemente de 5 a 7 carbonos nucleares y con uno o más heteroátomos, tales como S, N, P u O, siendo ejemplos de heterociclilo preferidos piridilo, quinolilo, imidazolilo y tienilo; heterociclilalquilo, cuyas porciones heterociclilo y alquilo son preferiblemente como se ha descrito anteriormente, o una unión peptídica, por ejemplo, un grupo
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donde k > 1 y cada X está independientemente representado por un grupo según se ha descrito para los X_{1}, X_{2} y X_{3} anteriores. Se pueden usar dos o más grupos de unión, tales como, por ejemplo, alquilenimino e iminoalquileno. Se contempla que otros grupos de unión pueden ser adecuados para uso aquí, tales como los grupos de unión comúnmente usados en la conjugación heterobifuncional y homobifuncional de proteínas y la química de entrecruzamiento descrita anteriormente. Como grupos de unión especialmente preferidos se incluyen grupos amida y también grupos amino. Cuando se unen al residuo de un cromóforo mediante un grupo isotiocianato sobre el cromóforo, los grupos amina se convierten en grupos tiourea.
Los grupos de unión pueden contener diversos substituyentes que no interfieren con la reacción de copulación entre el cromóforo y los otros componentes de esta invención. Los grupos de unión pueden contener también substituyentes que, por lo demás, pueden interferir con dicha reacción, pero a los que se impide hacerlo durante la reacción de copulación con grupos protectores adecuados comúnmente conocidos en la técnica y cuyos substituyentes se regeneran después de la reacción de copulación mediante desprotección adecuada. Los grupos de unión pueden contener también substituyentes que se introducen después de la reacción de copulación. Por ejemplo, el grupo de unión puede estar substituido con substituyentes tales como halógenos, tales como F, Cl, Br o I; un grupo éster; un grupo amida; alquilo, preferiblemente de 1 a aproximadamente 18, más preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo y similares; arilo substituido o no substituido, que preferiblemente contiene de 6 a aproximadamente 20, más preferiblemente de 6 a 10 átomos de carbono, tal como fenilo, naftilo, dihidroxifenilo, yodofenilo, hidroxiyodofenilo, fluorofenilo y metoxifenilo; aralquilo substituido o no substituido, que preferiblemente contiene de 7 a aproximadamente 12 átomos de carbono, tal como bencilo y feniletilo; alcoxi, cuya porción alquilo preferiblemente contiene de 1 a 18 átomos de carbono según se ha descrito anteriormente para el alquilo; alcoxiaralquilo, tal como etoxibencilo; heterociclilo substituido o no substituido, que preferiblemente contiene de 5 a 7 carbonos nucleares y heteroátomos tales como S, N, P u O, siendo ejemplos de grupos heterociclilo preferidos piridilo, quinolilo, imidazolilo y tienilo; un grupo carboxilo; un grupo carboxialquilo, cuya porción alquilo preferiblemente contiene de 1 a 8 átomos de carbono; o el residuo de un cromóforo.
Según realizaciones preferidas, los vectores de abordaje pueden conectarse o unirse a los cromóforos y a los grupos de unión de los polímeros de esta invención mediante un grupo de enlace. Se dispone de una variedad de grupos de enlace y serán evidentes para un experto en la técnica una vez provisto de la presente descripción. Preferiblemente, el grupo de enlace consiste en un polímero hidrofílico. Como polímeros de enlace hidrofílicos adecuados se incluyen, por ejemplo, polivinilpirrolidonas, poli(vinil metil éteres), poliacrilamidas, tales como, por ejemplo, poli(metacrilamidas), poli(N,N-dimetilacrilamidas) y poli(hidroxipropilmetilamidas), poli(acrilatos de hidroxietilo), poli(metacrilatos de hidroxipropilo), polimetiloxazolinas, polietiloxazolinas, polihidroxietiloxazolinas, polihidroxipropiloxazolinas, alcoholes polivinílicos, polifosfacenos, poli(ácidos hidroxialquilcarboxílicos), polioxazolidinas y poliaspartamida. Los polímeros hidrofílicos son preferiblemente seleccionados entre el grupo consistente en alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona y copolímeros de éstos. El polímero hidrofílico usado como grupo de enlace es preferiblemente un polímero bifuncional. En este caso, un extremo del polímero hidrofílico se une a un cromóforo o grupo de unión del polímero de esta invención y el otro extremo del polímero hidrofílico se une al vector de abordaje, por ejemplo por medio de un enlace amida. También se puede usar un polímero hidrofílico substituido con un grupo ácido carboxílico terminal en un extremo y un grupo amino terminal en el otro extremo. Estos últimos polímeros hidrofílicos bifuncionales pueden ser preferidos en algunas realizaciones, ya que poseen diversas similitudes con respecto a los aminoácidos. Se puede usar la metodología estándar de péptidos para unir el vector de abordaje con el cromóforo o los grupos de enlace del polímero de eta invención. Se pueden sintetizar polímeros hidrofílicos bifuncionales usando metodologías de química orgánica estándar. Además, muchos de estos materiales tienen accesibilidad comercial. Una ventaja del uso de un material polimérico hidrofílico como grupo de enlace es que el tamaño del polímero puede variar de tal forma que el número de subunidades monoméricas puede ser de tan sólo, por ejemplo, aproximadamente 5, o de hasta, por ejemplo, aproximadamente 500 o incluso más. En consecuencia, el "ligante" o la longitud de la unión pueden variar según se desee. Esto puede ser importante dependiendo, por ejemplo, del vector de abordaje particular empleado. Por ejemplo, un vector de abordaje constituido por una gran molécula proteica puede requerir un ligante corto, de tal forma que simulará una proteína unida a membrana. Un ligante corto permitiría también al polímero cromóforo residir próximo a la célula de interés y, por lo tanto, facilitaría más polímero cromóforo para la interacción celular, tal como cromóforo hidrofóbico en el polímero para lípidos o proteínas en la membrana celular.
Se pueden seleccionar los restos de enlace (L, L', L'', L''', etc.) entre el grupo consistente en un grupo alquileno C_{1} a C_{16}, que eventualmente contiene grupos funcionales hidrofílicos seleccionados entre el grupo consistente en grupos hidroxilo, grupos carboxilo, grupos fosfonato, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfato, grupos amino, grupos aminoácido o un átomo de oxígeno éter; un grupo éster oxicarbonílico; un grupo carbonato; un diéster de succinato; un grupo fenilurea; un grupo feniltiourea; un grupo nitrilo; un grupo oxiaceto; un grupo 2-oxitriazin-4-ilo; un átomo de azufre; un grupo sulfona; un grupo sulfóxido; un grupo carboniloxi; un grupo oxifenilaminotiocarbonilamino; un grupo oxifenilaminocarbonilamino; un grupo fosfato, y un grupo aminoácido; un grupo urea; un grupo tiourea; un grupo uretano, y un grupo tiouretano.
Como ejemplos de grupos de enlace, se incluyen grupos alquileno,tales como grupos metileno y grupos alquileno C_{2-16} de cadena lineal y ramificada, tales como etileno, n-propileno, isopropileno, n-butileno, isobutileno, n-pentileno, isopentileno, hexileno, heptileno, octileno y similares, eventualmente substituidos con grupos carboxi, grupos carboximetilo, grupos sulfato, grupos sulfonatoalquilo, grupos que contienen halógenos, tales como grupos perfluoroalquilo, como trifluorometilo, y grupos alcoxi, tales como metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, terc-butoxi y similares, que, junto con los carbonos del grupo alquileno, totalizan menos de o igual a 17 carbonos. Como ejemplos adicionales de grupos de enlace se incluyen grupos fenileno C_{6} y grupos alquilenilfenileno C_{7-16} y grupos alquilenfenilenalquileno C_{8-16}. Éstos están eventualmente substituidos con grupos carboxi, grupos carboximetilo, grupos sulfato, grupos sulfonatometilo, átomos de flúor, tal como de uno a cuatro átomos de flúor en el anillo de fenileno, y perfluorados en los grupos alquileno, grupos perfluoroalquilo C_{1-10}, grupos sulfonatoalquilo C_{1-10} cuya porción alquilo ha sido descrita anteriormente, grupos alquilo C_{1-10} cuya porción alquilo es como se ha descrito anteriormente, grupos alcoxilo C_{1-10} cuya porción alquilo es como se ha descrito anteriormente, grupos alquileno que eventualmente contienen heteroátomos seleccionados entre O, S y N separados por al menos dos átomos de carbono y grupos tiocarbonilaminofenileno.
Otros ejemplos de grupos de unión son unidades poliméricas. Tal como se usa aquí, una unidad polimérica puede ser de origen natural, semisintético (natural modificado) o sintético. El término "unidad polimérica" significa un compuesto constituido por dos o más unidades monoméricas repetitivas y preferiblemente por 10 o más unidades monoméricas repetitivas. La expresión unidad polimérica semisintética (o unidad polimérica natural modificada), tal como se emplea aquí, significa una unidad polimérica natural que ha sido químicamente modificada de alguna forma. Como ejemplos de unidades poliméricas naturales adecuadas para uso en la presente invención se incluyen polisacáridos naturales. Dichos polisacáridos incluyen, por ejemplo, arabinanos, fructanos, fucanos, gatocarolosa, ácido péctico, pectinas, incluyendo amilosa, pululano, glicógeno, amilopectina, celulosa, dextrano, dextrina, dextrosa, polidextrosa, pustulano, quitina, agarosa, caratano, condroitano, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma xantano, almidón y otros varios homopolímeros o heteropolímeros naturales, tales como los que contienen uno o más de los siguientes: aldosas, cetosas, ácidos o aminas: eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa, manitol, sorbitol, lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, glicina, sereno, treonina, cisteína, tirosina, asparraguina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina y ácido neuramínico y sus derivados naturales. En consecuencia, como polímeros adecuados se incluyen, por ejemplo, proteínas, tales como albúmina. Como ejemplos de unidades poliméricas semisintéticas se incluyen carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa y metoxicelulosa. Como ejemplos de unidades poliméricas sintéticas adecuadas para uso en la presente invención se incluyen polietilenglicol (PEG), polimetilenos (tales como, por ejemplo, polietileno y también tereftalato de polietileno), polipropilenos (tales como, por ejemplo, poli(propilenglicol), poliuretanos, poli(acetato de vinilo), acetato de polivinilo parcialmente hidrolizado (tal como, por ejemplo, poli(acetato de vinilo-co-alcohol polivinílico), poli(alcohol vinílico), tal como, por ejemplo, alcohol polivinílico (PVA), poli(cloruro de vinilo), poli(N-vinilpirrolidona), poliamidas, incluyendo poliamidas de nilón, poliestireno, poli(3-metoxiestire-no), poli(4-metoxiestireno), poli(3,4-dimetoxiestireno), poli(3,4-metilendioxiestireno), ácidos polilácticos, hidrocarburos fluorados, carbonos fluorados (tales como, por ejemplo, politetrafluoroetileno) y metacrilato de polimetilo y sus derivados. Son preferidas las unidades poliméricas o las unidades copoliméricas sintéticas biocompatibles preparadas a partir de monómeros, tales como etileno, ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), ácido láctico, ácido glicólico, E-caprolactona, acroleína, cianoacrilato, bisfenol A, epiclorohidrina, acrilatos de hidroxialquilo, siloxano, dimetilsiloxano, óxido de etileno, óxido de propileno, etilenglicol, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas N-substituidas, metacrilamidas N-substituidas, N-vinil-2-pirrolidona, 2,4-penta-dien-1-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-aminoestireno, p-aminobencilestireno, p-vinilbencilamina, estirensulfonato de sodio, 2-sulfoxietilmetacrilato de sodio, vinilpiridina, 2-metil-5-vinilpiridina, 2-vinilpiridina, 4-vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo, cloruro de 2-metacriloiloxitrimetilamonio y polivinilideno, así como monómeros entrecruzantes polifuncionales, tales como N,N'-metilenbisacrilamida, dimetacrilatos de etilenglicol, dimetacrilato de 2,2'-(p-fenilendioxi)dietilo, divinilbenceno, trialilamina y metilenbis(4-fenilisocianato), incluyendo sus combinaciones. Como unidades poliméricas preferibles se incluyen poli(ácido acrílico), poli(etilenimina), poli(ácido metacrílico), poli(metacrila-to de metilo), polisiloxano, polidimetilsiloxano, ácido poliláctico, poli(E-caprolactona), resina epoxi, melaminas, triazinamina, triamino-s-triazina y polímeros de poliamida (nilón). Como unidades copoliméricas preferibles se incluyen los siguientes: polivinilideno-poliacrilonitrilo-poli(metacrilato de metilo), poliestireno-poliacrilonitrilo y polímeros de poli-d,l-lactida-co-glicolida.
Se puede seleccionar convenientemente una unidad polimérica hidrofílica entre el grupo consistente en polietilenglicoles (PEG), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, polimetacrilamidas, polifosfazenos, poli(ácidos hidroxialquilcarboxílicos) y polioxazolidinas.
El peso molecular del ligante puede variar dependiendo, por ejemplo, del uso final particular de los compuestos.
En un aspecto, el grupo de unión es una unidad polimérica que tiene un peso molecular que varía entre aproximadamente 100 y aproximadamente 10.000 y todas sus combinaciones y subcombinaciones de rangos. Más preferiblemente, es una unidad polimérica que tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000. También son preferidas unidades poliméricas que exhiben polidispersidades que van desde más de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3, y todas sus combinaciones y subcombinaciones de rangos. Más preferiblemente, el grupo de unión es una unidad polimérica que tiene una polidispersidad de más de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, siendo más preferidas polidispersidades de más de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5 y siendo aún más preferidas polidispersidades de más de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,2.
Otros monómeros y unidades poliméricas biocompatibles adecuados resultarán evidentes para los expertos una vez provistos de la presente descripción. Éstos incluyen lípidos cargados negativamente, tales como ácidos fosfatídicos, y lípidos portadores de un polímero hidrofílico, tales como un lípido covalentemente unido a la unidad polimérica. El polímero puede unirse al cromóforo a través de un enlace covalente, tal como una unión amida o carbamato.
Por lo tanto, el grupo de enlace puede ser un lípido seleccionado entre el grupo consistente en lecitinas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, cardiolipinas, colesteroles, colesterolaminas, lisofosfátidos, eritrosfingosinas, esfingomielinas, ceramidas, cerebrósidos, fosfolípidos saturados, fosfolípidosinsaturados y fosfolípidos
krill.
Alternativamente, el grupo de enlace puede ser un lípido seleccionado entre el grupo consistente en 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas, 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosforac(1-gliceroles)], 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfatos, 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosfoserinas], lisofosfatidilcolinas, lisofosfatidilgliceroles, 1,2-diacil-sn-gliceroles, 1,2-diaciletilenglicoles, N-(n-caproilamina)-1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas, N-dodecanilamina-1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas, N-succinil-1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas,
N-glutaril-1,2-diacil-sn-glicerol-3-fosfoetanolaminas y N-dodecanil-1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas. Más preferiblemente, el grupo de enlace es un lípido seleccionado entre el grupo consistente en 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas, 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosforac(1-gliceroles)], 1,2-di-acil-sn-glicero-3-fosfatos, 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosfoserinas], lisofosfatidilcolinas, lisofosfatidilgliceroles y 1,2-diacil-sn-gliceroles.
En otras realizaciones preferidas, el grupo de enlace es una proteína o un péptido, tal como una proteína que incluye la albúmina.
En otra realización de la presente invención, los grupos de enlaces de esta invención pueden consistir en el residuo de grupos que pueden interaccionar con la radiación de rayos X. Son ejemplos de tales grupos los que contienen yodo, tales como grupos aromáticos yodados, como yohexol y derivados de yodobenceno, diyodobenceno y triyodobenceno, siendo preferidos los derivados del triyodobenceno. Los compuestos aromáticos yodados, cuando se usan como grupos de enlace, están preferiblemente substituidos con grupos hidrofílicos, tales como derivados de glicerol, alcohol dihidroxipropílico, dihidroxipropilamina, tal como grupos dihidroxipropilamido, y grupos carbohidrato.
En otra realización, el grupo de enlace puede consistir en una unidad monomérica. Tal como se usa aquí, el término unidad monomérica se refiere a cualquier grupo que pueda enlazar dos o más cromóforos o PAO. Como ejemplos de unidades monoméricas adecuadas para uso en la presente invención se incluyen etileno, fenileno, diácidos tales como ácido succínico, ácido adípico y ácido tartárico, aminoácidos tales como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparraguina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina y ácido neuramínico y sus derivados naturales, monosacáridos tales como eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa, manitol, sorbitol, lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, celobiosa y similares. Los ejemplos de monosacáridos pueden tener seis átomos de carbono y estos sacáridos incluyen alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, fructosa, psicosa y tagatosa. Los ejemplos de monosacáridos pueden tener cinco átomos de carbono y estos sacáridos incluyen ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, ribulosa y xilulosa. Los ejemplos de monosacáridos pueden tener cuatro átomos de carbono y estos sacáridos incluyen eritrosa, treosa y eritrulosa.
En aún otras realizaciones preferidas, el grupo de enlace puede ser una unidad monomérica o una combinación de unidades monoméricas. Se seleccionan unidades monoméricas representativas entre el grupo consistente en un aminoácido, ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, ácido láctico, ácido glicólico, E-caprolactona, acroleína, cianoacrilato, bisfenol A, epiclorohidrina, acrilatos de hidroxialquilo, siloxano, dimetilsiloxano, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas N-substituidas, metacrilamidas N-substituidas, N-vinil-2-pirrolidona, 2,4-pentadien-1-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-aminoestireno, p-aminobencilestireno, estirensulfonato de sodio, 2-sulfoxietilmetacrilato de sodio, vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo y cloruro de 2-metacriloiloxitrimetilamonio. Otras unidades monoméricas incluyen melaminas, triazinamina, triamino-s-triazina y grupos aromáticos yodados tales como yohexol y derivados de yodobenceno, diyodobenceno y triyodobenceno, siendo preferidos los derivados de triyodobenceno. Otros grupos de enlace monoméricos incluyen derivados de etilendiamina, tales como ácido etilendiaminatetraacético, dietilentriamina tal como ácido dietilentriaminapentaacético y quelatos metales de estos derivados, donde el metal se describe a continuación.
Otras unidades monoméricas que pueden ser usadas incluyen agentes quelantes. Un grupo quelante tal como se utiliza aquí incluye el residuo de uno oo más de una amplia variedad de agentes quelantes que pueden tener un ion metálico asociados a ellos. En los compuestos de la invención en que el grupo de enlace incluye un residuo de agente quelante, se prefiere, en particular, que dicho residuo esté metalizado con un ion metálico terapéutica o diagnósticamente efectivo, por ejemplo un ion de metal pesado o un grupo de iones, un ion metálico paramagnético, un ion metálico fluorescente o un radionúclido.
Como es bien sabido, un agente quelante es un compuesto quecontiene átomos donantes que pueden combinarse por enlaces coordinados con un átomo metálico para formar una estructura cíclica llamada complejo de quelación o quelato. Esta clase de compuestos está descrita en la Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 5, 339-368.
Se puede seleccionar el residuo de un agente quelante adecuado entre polifosfatos, tales como tripolifosfato de sodio y ácido hexametafosfórico; ácidos aminocarboxílicos, tales como ácido etilendiaminatetraacético, ácido N-(2-hidroxietil)etilendiaminatriacético, ácido nitrilotriacético, N,N-di(2-hidroxietil)glicina, etilenbis(hidroxifenilglicina) y ácido dietilentriaminapentaacético; 1,3-dicetonas, tales como acetilacetona, trifluoroacetilacetona y tenoiltrifluoroacetona; ácidos hidroxicarboxílicos, tales como ácido tartárico, ácido cítrico, ácido glucónico y ácido 5-sulfosalicílico; poliaminas, tales como etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina y triaminotrietilamina; aminoalcoholes, tales como trietanolamina y N-(2-hidroxietil)etilendiamina; bases heterocíclicas aromáticas, tales como 2,2'-diimidazol, picolinamina, dipicolinamina y 1,10-fenentrolina; fenoles, tales como salicilaldehído, disulfopirocatecol y ácido cromotrópico; aminofenoles, tales como 8-hidroxi-quinolina y ácido oximesulfónico; oximas, tales como dimetilglioxima y salicilaldoxima; péptidos que contienen funcionalidad quelante proximal, tales como policisteína, polihistidina, ácido poliaspártico, ácido poliglutámico o combinaciones de dichos aminoácidos; bases de Schiff, tales como disalicilaldehído 1,2-propilendiimina; tetrapirroles, tales como tetrafenilporfina y ftalocianina; compuestos azufrados, tales como toluenditiol, ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico, dimercaptopropanol, ácido tioglicólico, etilxantato de sodio, dietilditiocarbamato de sodio, ditizona, ácido dietilditiofosfórico y tiourea; compuestos macrocíclicos sintéticos, tales como dibenzo[18]corona-6, (CH_{3})_{6}-[14]-4,11-dieno-N_{4} y (2.2.2-criptato); ácidos fosfónicos, tales como ácido nitrilotrimetilenfosfónico, ácido etilendiaminatetra(metilenfosfónico) y ácido hidroxietilidendifosfónico, o combinaciones de dos o más de los agentes anteriores.
El residuo de un agente quelante adecuado contiene preferiblemente un grupo ácido policarboxílico e incluye: ácido etilendiamina-N,N,N',N'-tetraacético (EDTA), ácido N,N,N',N'',N''-dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N''-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N''-
triacético (DO3A), ácido 1-oxa-4,7,10-triaza-ciclododecano-N,N',N''-triacético (OTTA) y ácido trans-(1,2)-ciclohexanodietilentriaminapentaacético (CDTPA).
En una realización, otros residuos adecuados de agentes quelantes incluyen proteínas modificadas para la quelación de metales, tales como tecnecio y renio, según se describe en la Patente EE.UU. Nº 5.078.985.
En otra realización, los residuos adecuados de agentes quelantes derivan de compuestos que contienen N_{3}S y compuestos que contienen N_{2}S_{2}, como, por ejemplo, los descritos en las Patentes EE.UU. Nº 4.444.690, 4.670.545, 4.673.562, 4.897.255, 4.965.392, 4.980.147, 4.988.496, 5.021.556 y 5.075.099.
Se describen otros residuos adecuados de agentes quelantes en PCT/US91/08253.
Si los compuestos de la invención contienen el residuo de múltiples agentes quelantes, dichos agentes pueden unirse entre sí mediante grupos de enlace tales como los aquí descritos.
Los grupos quelantes preferidos son seleccionados entre el grupo consistente en 2-aminometilpiridina, ácido iminoacético, ácido iminodiacético, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido carboniliminodiacético, ácido metileniminoacético, ácido metileniminodiacético, ácido etilentioetileniminoacético, ácido etilentio-etileniminodiacético, TMT (véase Journal of The American Chemical Society (1993), 115, 11032), un grupo terpiridinilo, un agente quelante que contiene un grupo terpiridilo y un grupo carboximetilamino, o una sal de cualquiera de los ácidos anteriores. Un grupo quelante especialmente preferido es el DTPA.
También se describen grupos quelantes representativos en US-A-5559214, WO 95/26754, WO 94/08624, WO 94/09056, WO 94/29333, WO 94/08624, WO 94/08629, WO 94/13327 y WO 94/12216.
Como agentes quelantes preferibles se incluyen, por ejemplo, ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido dietilendiaminatetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7,10-tetraciclododecano-N,N',N''-tri-acético (DO3A), ácido 3,6,9-triaza-12-oxa-3,6,9-tricarboximetilen-10-carboxi-13-feniltridecanoico (B-19036), ácido hidroxibenciletilendiaminadiacético (HBED), ácido N,N'-bis(piridoxil-5-fosfato)etilendiamina-N,N'-diacetato (DPDP), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N''-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N'',N'''-tetraacético(TETA), criptandos (complejos macrocíclicos) y desferrioxamina. Más preferiblemente, los agentes quelantes son EDTA, DTPA, DOTA, DO3A y criptandos, más preferiblemente DTPA. Como quelatos lipofílicos preferibles se incluyen derivados alquilados de los agentes quelantes EDTA y DOTA, por ejemplo N,N'-bis(carboxidecilamidometil-N-2,3-dihidroxipropil)etilendiamina-N,N'-diacetato (EDTA-DDP), N,N'-bis(carboxioctadecilami-dometil-N-2,3-dihidroxipropil)etilendiamina-N,N'-diacetato (EDTA-ODP), N,N'-bis(carboxilaurilamidometil-N-2,3-dihidroxipropil)etilendiamina-N,N'-diacetato (EDTA-LDP) y similares. Como macromoléculas proteicas preferibles se incluyen, por ejemplo, albúmina, colágeno, poliarginina, polilisina, polihistidina, gamma-globulina y beta-globulina, siendo más preferidas la albúmina, la poliarginina, la polilisina y la polihistidina.
Como complejos quelantes adecuados que pueden ser incorporados como ligantes en los compuestos de la invención, por lo tanto, se incluyen Mn(II)-DTPA, Mn(II)-EDTA, Mn(II)-DOTA, Mn(II)-DO3A, Mn(II)-criptandos, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-DO3A, Gd(III)-criptandos, Cr(III)-EDTA, Y(III)-DTPA, Y(III)-DOTA, Y(III)-DO3A, Y(III)-criptandos, Y(III)-TMT o hierro-desferroamina, especialmente Mn(II)-DTPA, Y(III)-TMT o Gd(III)-DTPA.
En otra realización de la invención, los grupos de enlace de esta invención pueden consistir en un grupo que contiene un ion metálico, tal como, por ejemplo, un grupo quelante de iones metálicos. El término "ion metálico", tal como se utiliza aquí, pretende incluir cualquier ion de un elemento distinto de hidrógeno que tenga un estado de oxidación igual o superior a 1 y que pueda unirse a un agente quelante como un grupo de enlace de esta invención a través de la interacción con sitios de alta densidad de electrones en el agente quelante, tal como en sitios heteroatómicos. La interacción del ion metálico con los sitios de alta densidad de electrones en el agente quelante puede tomar la forma de una interacción ácido-base de Lewis, donde el estado de oxidación del ion metálico se estabiliza por interacción con densidad de electrones donada por los sitios de alta densidad de electrones del agente quelante. Un ion metálico puede también interaccionar con sitios de alta densidad de electrones en un agente quelante para formar una sal en forma de asociación iónica entre un ion metálico cargado positivamente, tal como un ion lantánido o un ion itrio, y un substituyente cargado negativamente sobre el agente quelante, tal como un substituyente constituido por un anión carboxilato. Un ion metálico también puede interaccionar con sitios de alta densidad de electrones en el agente quelante para formar un enlace covalente entre el metal que tiene un estado de oxidación igual o superior a 1 , tal como renio o tecnecio, y un heteroátomo del agente quelante, tal como un átomo de azufre o de nitrógeno o de oxígeno.
Los iones metálicos pueden acomplejarse fácilmente con el agente quelante en el grupo de enlace, por ejemplo, simplemente exponiendo o mezclando una solución acuosa que contiene el agente quelante en el grupo de enlace con una sal metálica, preferiblemente en una solución acuosa. Preferiblemente, dicha solución tiene un pH en el rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 11. La sal del ion metálico puede ser cualquier composición que contenga el ion metálico, incluyendo composiciones que contienen ácidos orgánicos, iones de ácidos orgánicos y agentes quelantes, tales como ácido acético, ion acetato, ácido salicílico, ion salicilato, ácido cítrico, ion citrato, ácido oxálico, ion oxalato, acetilacetona, ion acetilacetonato, soluciones que contienen aminoácidos e iones de aminoácidos, tales como soluciones de ácido glutámico y de ácido aspártico, y soluciones de ácido iminodiacético, ácido etilendiaminatetraacético y compuestos relacionados. Las sales con una baja solubilidad en agua (es decir, una sal metálica tal como sulfuro de plomo o fosfato de itrio que tiene un producto de gran solubilidad o baja solubilidad acuosa en ausencia de un agente solubilizante, tal como un agente quelante) son útiles, pero preferiblemente la sal es una sal hidrosoluble del metal, tal como, por ejemplo, una sal de halógeno o de nitrato, como cloruro de europio o cloruro de itrio o nitrato de cobre. Más preferiblemente, dichas sales son seleccionadas de manera que no interfieran con la unión del ion metálico al agente quelante en el grupo de enlace. Dicha interferencia puede producirse, por ejemplo, como resultado de la eliminación del ion de la solución por precipitación. Esto daría lugar a una menor velocidad de unión del ion metálico deseado al agente quelante en el grupo de enlace con respecto a la velocidad que puede ocurrir en presencia de una sal soluble. El agente quelante en el grupo de enlace está preferiblemente en solución acuosa a un pH de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, más preferiblemente a un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. El agente quelante puede mezclarse con sales tampón, tales como citrato, acetato, fosfato y borato, para producir el pH óptimo. Preferiblemente, dichas sales tampón son seleccionadas de forma que no interfieran con la posterior unión del ion metálico al agente quelante en el grupo de enlace según se ha descrito anteriormente. Las soluciones acuosas tamponadas actualmente preferidas consisten en acetato de sodio más ácido acético en agua, así como ácido cítrico más citrato de sodio en agua. Los iones metálicos actualmente preferidos son In^{+3}, Eu^{+3}, Gd^{+3} e Y^{+3} y son sales de iones metálicos actualmente preferidas InCl_{3}, EuCl_{3}, GdCl_{3} y YCl_{3}.
En otra realización, los iones M_{1} y M_{2} de dos elementos independientes pueden ser quelados simultáneamente con los agentes quelantes de los grupos de enlace de esta invención. Esto se puede hacer mediante un procedimiento consistente en la exposición secuencial de dicho agente quelante a una solución 1 que contiene el ion metálico M_{1} descrito anteriormente durante un tiempo efectivo para permitir la acomplejación de todo o de parte de M_{1} por el agente quelante del grupo de enlace, seguido de eliminación eventual del exceso del ion metálico M_{1} de la vecindad del agente quelante del grupo de enlace (por ejemplo, por precipitación y filtración), seguido de la posterior exposición de la especie M_{1} quelada del grupo de enlace así formado a una solución 2 que contiene un segundo ion metálico M_{2} durante un tiempo y en condiciones de tampón y de pH según se ha descrito antes suficientes para permitir la formación de un quelato de M_{1} y M_{2}. Preferiblemente, la cantidad molar del ion M_{1} en la solución 1 es igual o inferior a la cantidad molar de los polímeros colorantes de esta invención y la cantidad molar del ion M_{2} en la solución 2 puede ser inferior, igual o superior a la cantidad molar del agente quelante de esta invención acomplejado con M_{1}. Más preferiblemente, la cantidad molar del ion M_{2} en la solución 2 es inferior o igual a la cantidad molar de los polímeros colorantes de esta invención acomplejados con M_{1}. La cantidad preferida de tiempo para la formación de un complejo metálico es de aproximadamente un segundo a aproximadamente dos horas, preferiblemente de 15 segundos a una hora y más preferiblemente de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos.
En otra realización, los iones M_{1} y M_{2} de dos elementos independientes pueden ser quelados secuencialmente con agentes quelantes de los grupos de enlace de esta invención. Esto se puede hacer mediante un procedimiento consistente en la exposición secuencial de dicho agente quelante a una solución 1 que contiene el ion metálico M_{1} descrito anteriormente durante un tiempo efectivo para permitir la acomplejación de todo o de parte de M_{1} por el agente quelante, seguido de eliminación eventual del exceso del ion metálico M_{1}, tal como por precipitación y filtración de la vecindad del agente quelante del grupo de enlace, seguido de la posterior exposición de la especie M_{1} quelada así formada a una solución 2 que contiene un segundo ion metálico M_{2} durante un tiempo y en condiciones de tampón y de pH según se ha descrito antes suficientes para permitir la formación de un quelato de M_{2}. Además de iones de metales alcalinos tales como sodio, potasio y cesio, y de iones de metales alcalinotérreos como magnesio, calcio y bario, se pueden seleccionar iones metálicos preferidos, aunque sin limitación, entre iones de elementos de los grupos IIA a VIA. Como metales preferidos se incluyen los de número atómico 12, 13 y 20, los elementos de transición 21 a 33, 38 a 52, 56, 72 a 84 y 88 y los de la serie de los lantánidos (número atómico 57 a 71, a los que a veces se hará aquí referencia a continuación como metales lantánidos). Son especialmente preferidos los iones de itrio y de los metales lantánidos.
En otra realización, el quelato metálico del grupo de enlace de esta invención puede contener un ion metálico fluorescente. El ion metálico fluorescente puede ser seleccionado, aunque sin limitación, entre metales de número atómico 57 a 71. Se prefieren iones de los siguiente metales: La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb y Lu. Son especialmente preferidos el Gd^{+3} y el Eu^{+3}.
Los complejos de iones metálicos fluorescentes de grupos quelantes de los grupos de enlace de esta invención, tales como, por ejemplo, un quelato de ion Eu^{+3}, pueden exhibir utilidad en la fluorescencia de tiempo retardado y en ensayos que implican fluorescencia de tiempo retardado, tal como en la detección de iones metálicos fluorescentes tales como Eu^{+3}. En dicho ensayo, se expone un compuesto de esta invención que tiene un agente quelante en un grupo de enlace a un material, tal como una solución que contiene un ion metálico fluorescente, tal como un ion Eu^{+3}, durante un tiempo efectivo, de tal forma que se forme un complejo entre el agente quelante y el ion Eu^{+3}. Un tiempo preferido es de aproximadamente un segundo a una hora, preferiblemente de 15 segundos a 10 minutos. El complejo es irradiado a continuación con una luz de excitación tal como, por ejemplo, un pulso de luz que tiene una intensidad máxima a una longitud de onda de aproximadamente 385 nanometros. Se detiene entonces el pulso de luz de excitación o se bloquea su posterior acceso al complejo metálico, se deja que transcurra un tiempo efectivo, tal como aproximadamente 400 microsegundos, y se detecta y se mide luego la emisión de luz con un detector capaz de determinar la intensidad de luz en función de la longitud de onda. La longitud de onda de la luz emitida es mayor que la longitud de onda de la luz de excitación. El retraso temporal efectivo es preferiblemente de aproximadamente 400 microsegundos o más, de tal forma que no se produzca ninguna interferencia con los emisores fluorescentes ambientales con la detección de la fluorescencia deseada en este tipo de ensayo. Una composición preferida para este tipo de ensayo contiene un grupo de enlace tal como un agente quelante oligo-2,6-piridina substituido con grupos ácido iminodiacético y quelado con un ion Eu^{+3}.
En otra realización, un quelato metálico de los restos de enlace de los compuestos de esta invención puede incluir un ion paramagnético adecuado para uso en aplicaciones de resonancia magnética nuclear, que incluyen la imagen diagnóstica in vitro e in vivo, tal como de tejidos animales y humanos, usando técnicas de MRI, así como en aplicaciones tales como en reactivos de desplazamiento químico para resonancia magnética nuclear. El ion paramagnético es un ion de un elemento que puede ser seleccionado entre elementos de número atómico 21 a 29, 43, 44 y 57 a 71. Se prefieren los siguientes elementos: Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb y Lu. Son especialmente preferidos el Mn, el Gd y el Dy. El Gd^{+3} y el Dy^{+3} son iones especialmente preferidos. La quelación de un ion metálico con cada agente quelante es útil en este sentido. Dicho quelato metálico puede formarse como se ha descrito anteriormente.
En otra realización, un quelato metálico de los restos de enlace de los compuestos de esta invención puede contener un radionúclido. El radionúclido puede ser seleccionado, por ejemplo, entre radioisótopos de Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Tc, Ru, In, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta y Ti. Como radionúclidos preferidos se incluyen ^{44}Sc, ^{64}Cu, ^{67}Cu, ^{111}In, ^{212}Pb, ^{68}Ga, ^{90}Y, ^{87}Y, ^{153}Sm, ^{212}Bi, ^{99m}Tc, ^{186}Re y ^{188}Re. De éstos, es especialmente preferido el ^{90}Y.
En algunas aplicaciones, es útil una mezcla de iones metálicos tales como iones sodio e iones itrio. Por ejemplo, se puede tratar una solución del quelato metálico de esta invención en un tampón de acetato de sodio con una cantidad por debajo de la estequiométrica de un radionúclido tal como ^{90}Y y, después de un tiempo efecto durante el cual se produce la quelación de substancialmente todo el radionúclido, la mezcla ulterior que contiene ^{90}Y unido al quelato metálico más la sal sódica de quelato metálico que no contiene ^{90}Y puede ser útil sin posterior separación de los componentes individuales, por ejemplo, en el análisis de radiocentelleo de proteínas separadas por electroforesis o para la solubilización de radionúclidos tales como ^{90}Y en presencia de iones tales como iones fosfato, que de otro modo se combinarían con el ion metálico para formar un precipitado tal como fosfato de itrio. En masa, una solución del quelato metálico más agente quelante que no contiene radionúclido de un grupo de enlace en esta realización de esta invención preferiblemente contiene una razón de ion de radionúclido metálico con respecto a la cantidad total de agente quelante que es efectiva en tales aplicaciones. En realizaciones preferidas, la razón molar de dicho ion metálico por agente quelante en una solución en masa es de aproximadamente 1:1.000 a aproximadamente 1:1.
Los compuestos agentes de contraste usados según la invención pueden ser administrados por cualquier vía conveniente, por ejemplo por inyección o infusión en músculo, tejido tumoral o vasculatura, subcutánea o intersticialmente, mediante administración en una cavidad corporal que se abre al exterior (por ejemplo, en el tracto digestivo (por ejemplo, oral o rectalmente), en la vagina, en el útero, en la vejiga, en las orejas, en la nariz o en los pulmones), por administración transdérmica (por ejemplo, por iontoforesis o por aplicación tópica), o por aplicación tópica a un sitio quirúrgicamente expuesto.
En general, se preferirá la administración parenteral, por ejemplo de una solución o dispersión del, o que contiene el, compuesto cromóforo.
Las formas de administración usadas pueden ser cualesquiera de las formas convencionalmente utilizadas para administración de productos farmacéuticos, por ejemplo soluciones, suspensiones, dispersiones, jarabes, polvos, tabletas, cápsulas, pulverizaciones, cremas, geles, etc.
Los compuestos agentes de contraste son hidrosolubles y pueden ser administrados en forma de una solución acuosa. Alternativamente, y en muchos casos de forma preferible, los compuestos agentes de contraste pueden presentarse en forma particulada, por ejemplo como gotitas líquidas del, o que contienen el, agente de contraste (por ejemplo, en solución en un fluido inmiscible en agua), o como partículas sólidas o semisólidas del, o que contienen o están revestidas con el, agente de contraste. Esta última categoría incluye vesículas (por ejemplo, liposomas, micelas o microbalones) que contienen el compuesto agente de contraste.
Debido a su efecto intrínseco de dispersión de la luz, las partículas son una forma de presentación para el agente de contraste. Los tamaños de partícula pueden variar entre unos cuantos nanometros y aproximadamente 20 micrometros, por ejemplo entre 10 y 5.000 nm. Sin embargo, los tamaños de partícula más grandes (por encima de 10 micrometros) serán generalmente usados sólo con partículas deformables.
Cuando las partículas contienen otros componentes además del compuesto agente de contraste, por ejemplo, materiales formadores de matriz o de membrana, agentes de revestimiento, solventes, gases o generadores de gas, etc., ésos serán convenientemente materiales que son fisiológicamente tolerables a las dosificaciones utilizadas. La formación de gotitas, partículas revestidas, partículas compuestas, vesículas, etc. está bien descrita en la literatura, especialmente en la relacionada con la preparación y formulación de agentes farmacéuticos y de contraste (por ejemplo, agente de contraste para ultrasonidos).
Cuando se ha de usar un agente de contraste hidrosoluble para marcar tumores para su eliminación quirúrgica, se puede preferir entonces administrar el agente en forma de partículas para reducir la tinción y por ello la eliminación del tejido sano que rodea el tumor.
Estos compuestos agentes de contraste pueden ser administrados por vía oral para absorción a través del revestimiento del estómago, del intestino y del colon; véanse, por ejemplo, Carrier-mediated intestinal transport of drugs, Tsuji, A.; Tamai, I., Pharmaceutical Research (New York), Vol. 13, Nº 7, pp. 963-977, 1996; Oral protein drug delivery, Wang, Wei, J. Drug Targeting, Vol. 4, Nº 4, 1996, pp. 195-232; Improved passive drug delivery via prodrugs, Taylor, Michael D., Adv. Drug Delivery Rev., Vol. 19, Nº 2, 1996, pp. 131-148; Oral colon-specific drug delivery: a review, Van den Mooter, Guy; Kinget, Renaat, Drug Delivery, Vol. 2, Nº 2, 1995, pp. 81-93; Present status of controlled drug delivery system-overview, Nalk, S.R., Shanbhag, V., Indian Drugs, Vol. 30, Sept. 1993, pp. 423-429; Novel formulation strategies for improving "oral" bioavailability of drugs with poor membrane permeation or presystemic metabolism, Aungst, B.J., Journal of Pharmaceutical Sciences (USA), Vol. 82, Nº Oct. 1993, pp. 979-987; Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Publishing Co., 1975, Parte 6, capítulo 40 y sus referencias (pp. 731-753), Parte 8, todos los capítulos (pp. 1355-1644); The Extra Pharmacopoeia, Martindale, 29ª Edición, The Pharmaceutical Press, Londres, 1989.
La administración de fármacos y de otros agentes por esta vía es también preferida debido a la mayor aceptación por parte del paciente (para dosificaciones repetidas) y a la facilidad de administración. Es bien sabido en la técnica que no todos los agentes son biodisponibles a través de esta vía, es decir, que no todas las moléculas son 1) químicamente estables en los ambientes del intestino, 2) transportables a través de las membranas alimentarias para su absorción hacia la sangre/linfa y 3) activo incluso si es accesible debido a los procesos metabólicos del interior del intestino o a posibles cuestiones de solubilidad, etc. Sin embargo, es también sabido en la técnica que la alteración de la estructura molecular para controlar la hidrofobicidad relativa de la molécula (es decir, coeficiente de reparto entre octanol y agua; log(P)) dentro de un rango preferido puede aumentar la disponibilidad oral del agente.
Estos agentes pueden ser también administrados a través de cavidades corporales tales como la boca, el recto, la vagina, la cavidad peritoneal (es decir, inyección intraperitoneal), etc., así como por administración tópica, intramuscular, subcutánea y pulmonar. Se contemplan todas las vías conocidas de administración de fármacos/agentes a mamíferos según la presente invención.
El agente de contraste puede ser inyectado en la vasculatura antes de la cirugía o durante ella. Para la detección de nódulos linfáticos, se puede inyectar en un conducto linfático que drena hacia al área quirúrgica. Alternativamente, se puede aplicar durante la cirugía como ungüento tópico, líquido o pulverización.
Para aplicaciones dermatológicas, los agentes de contraste descritos en WO 96/23524 pueden ser modificados para ser administrados a través de parchestransdérmicos o por iontoforesis; la administración por iontoforesis es preferida, ya que se puede controlar la cantidad del agente que se administra.
Los compuestos de la invención pueden ser administrados a pacientes para la obtención de imagen en cantidades suficientes para ser visualizables o para ser efectivas en la terapia fotodinámica (PDT) o la terapia sonodinámica (SDT) en la técnica quirúrgica particular.
La dosificación de los compuestos cromóforos de la invención dependerá de la condición que se esté tratando, pero en general será del orden de 1 pmol/kg a 1 mmol/kg de peso corporal.
Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados con ayudas farmacéuticas o veterinarias convencionales, por ejemplo emulsores, ésteres de ácidos grasos, agentes gelificantes, estabilizadores, antioxidantes, agentes para el ajuste de la osmolalidad, tampones, agentes para el ajuste del pH, etc., y pueden estar en una forma adecuada para administración parenteral o enteral, por ejemplo por inyección o infusión o administración directamente en una cavidad corporal que tiene un conducto de salida hacia el exterior, por ejemplo el tracto gastrointestinal, la vejiga o el útero. Así, los compuestos de la presente invención pueden estar en formas de administración farmacéutica convencionales, tales como tabletas, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, dispersiones, jarabes, supositorios, etc. Sin embargo, las soluciones, suspensiones y dispersiones en medios vehiculizantes fisiológicamente aceptables, por ejemplo agua para inyecciones, serán generalmente preferidas.
Los compuestos según la invención pueden ser, por lo tanto, formulados para administración usando vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables de un modo que queda totalmente dentro del conocimiento de la técnica. Por ejemplo, los compuestos, eventualmente con adición de excipientes farmacéuticamente aceptables, pueden ser suspendidos o disueltos en un medio acuoso, esterilizando luego la solución o suspensión resultante.
Para algunas porciones del organismo, el modo más preferido para administrar los compuestos de la invención es el parenteral, por ejemplo por administración intravenosa. Las formas administrables por vía parenteral, por ejemplo soluciones o dispersiones intravenosas, deben ser estériles y estar libres de agentes fisiológicamente inaceptables y deben tener una baja osmolalidad para minimizar la irritación u otros efectos adversos tras la administración y, por lo tanto, el medio de contraste debe ser preferiblemente isotónico o ligeramente hipertónico. Como vehículos adecuados se incluyen vehículos acuosos habitualmente utilizados para administrar soluciones o dispersiones parenterales, tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer lactato y otras soluciones tales como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª ed., Easton, Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 y 1461-1487 (1975), y en The National Formulary XIV, 14ª ed., Washington: American Pharmaceutical Association (1975). Las soluciones o dispersiones pueden contener conservantes, agentes antimicrobianos, tampones y antioxidantes convencionalmente usados para soluciones parenterales, excipientes y otros aditivos compatibles con los compuestos de la invención y que no interferirán con la fabricación, el almacenamiento o el uso.
Los compuestos agentes de contraste de la presente invención pueden ser formulados en formulaciones biológicamente compatibles y administrados a humanos por vía intravenosa o por otras vía comúnmente usadas de administración.
Aunque los compuestos agentes de contraste de la invención son particularmente adecuados para uso en PDT y SDT intraoperatorias y post-quirúrgicas para facilitar la visualización de los márgenes del tumor y optimizar la eliminación quirúrgica y la destrucción por PDT y SDT de tejidos y células tumorales, pueden ser también usados como agentes de contraste en la imagen luminosa del tejido tumoral, de las células tumorales y de los nódulos linfáticos enfermos. La técnica de imagen luminosa puede implicar el registro de una imagen fotográfica de la superficie de un tejido o de un órgano iluminada con una fuente de luz que hace que el agente de contraste ejerza un efecto incrementador del contraste y haga que el tejido enfermo destaque más claramente del tejido sano circundante, por ejemplo debido a la absorción de luz o a la fluorescencia características por parte del agente de contraste. Dicha imagen fotográfica puede ser registrada de una superficie expuesta (por ejemplo, expuesta durante la cirugía), o puede ser registrada por inserción de un endoscopio en una cavidad corporal a través de un orificio corporal o a través de una incisión quirúrgica.
Alternativamente, se pueden registrar imágenes de luz (generalmente luz láser, especialmente a longitudes de onda del infrarrojo próximo) dispersada a partir de, o transmitida por, el tejido corporal.
Un método preferido para el uso de luz dispersada o reflejada en la generación de imágenes es la obtención de imágenes por ondas difusivas, en donde se modula la amplitud de la luz incidente a una frecuencia de ultrasonidos y se mide la amplitud o la fase de la onda difusiva que se propaga desde el punto de inyección de luz en uno o más puntos incidentes. Un método preferido para la obtención de imágenes con luz transmitida es la imagen de resolución temporal, en donde se separan fotones que han viajado un trayecto relativamente recto a través del cuerpo porque han sufrido sólo unos cuantos fenómenos de dispersión o porque los fenómenos de dispersión cambian su dirección de propagación sólo ligeramente de los fotones altamente dispersos en base a su momento de llegada a la zona de detección. También se prefieren métodos en los cuales la luz incidente está altamente polarizada y los fotones que llegan al detector después de haber sufrido relativamente pocos fenómenos de dispersión se separan de la luz altamente dispersa en base a su polarización residual.
En estas técnicas, el uso de un agente de contraste facilita la detección y localización de estructuras por debajo de la superficie, por ejemplo tumores.
También se pueden registrar imágenes con métodos híbridos que implican varias combinaciones de luz incidente o detectada con luz incidente o detectada de un tipo diferente. Las técnicas de este tipo incluyen la imagen luminosa guiada por imagen de resonancia magnética ("MRI"), la imagen fotoacústica y la imagen acustoóptica. En algunos casos, tales como la imagen guiada por MRI, el método híbrido puede simplemente conllevar el corregistro de imagen e información funcional obtenida por las dos técnicas por separado. Una de las ventajas del corregistro de información es que puede permitir la extracción de información química y física de un cuerpo específico con luz conservando al mismo tiempo la resolución inherente del método de imagen secundario. En otros casos, el método híbrido puede depender de forma inherente de la interacción de los dos diferentes tipos de radiación dentro del cuerpo para la generación de una imagen.
La imagen fotoacústica conlleva el uso de cualquier tipo de radiación para la creación de una imagen médica cuando se detecta una onda de sonido o depresión que se genera por absorción de la radiación incidente. La imagen es primariamente una consecuencia de cómo se absorbe la radiación y se convierte en calor. La onda de sonido o de presión sirve como un "mensajero" que revela cómo tuvo lugar la absorción de radiación. Un agente de contraste para imagen fotoacústica funciona absorbiendo selectivamente la radiación en ciertos órganos o partes de órganos y convirtiendo de manera eficiente esa radiación en ondas de presión o dispersando y difundiendo la luz incipiente, de tal forma que ilumina los órganos deseados más uniformemente. La radiación puede ser radiación electromagnética en la parte visible, infrarroja, de microondas u otras del espectro electromagnético.
La imagen acustoóptica es una aproximación modificada a la imagen óptica en donde se usa ultrasonido focalizado para aislar señales ópticas procedentes del cuerpo. El método deriva del fenómeno de la dispersión de la luz por ondas de sonido de Brillouin, que ha sido conocido durante muchos años. La dispersión de Brillouin implica la interferencia constructiva entre los componentes de un rayo de luz que pasa a través de los frentes de ondas en movimiento de una onda de sonido. En efecto, la onda acústica forma regiones en movimiento de diferente presión, densidad e índice de refracción que interaccionan con la luz del mismo modo que una red difractora. El movimiento de las ondas de sonido induce además un efecto Doppler de la frecuencia de sonido en la frecuencia luminosa.
Cuando se usa ultrasonido focalizado como componente de la imagen óptica, el sonido introduce fluctuaciones en las propiedades ópticas de la luz que pasa a través del órgano blanco, que lo diferencian del fondo general de la luz que pasa a través del cuerpo en su conjunto. Aunque un tubo fotomultiplicador u otro detector sobre la superficie del cuerpo recogerá tanto la luz dispersa que ha seguido muchos cursos a través del cuerpo como la señal de la luz que ha pasado realmente a través de la región de interés, la señal de la región de interés puede ser separada del resto de la luz por el hecho de que se modula a la frecuencia del ultrasonido focalizado.
La imagen acustoóptica amplía realmente la capacidad de la imagen óptica para proporcionar información funcional, ya que el grado en el que las ondas de sonido focalizado interaccionan con la luz difusa dependerá de las propiedades mecánicas del cuerpo en el lugar de la focalización del sonido. La capacidad para medir el coeficiente de tracción y otras propiedades mecánicas de una lesión sospechosa facilita mucho la identificación de la lesión como maligna o benigna. Los agentes de contraste que aumentan el grado en el que se ha modificado la señal de luz por el ultrasonido tendrán un valor particular para mejorar el grado en el cual se puede extraer esta información.
Se pueden usar otras técnicas de imagen luminosa para registrar imágenes intensificadas por contraste de estructuras que están a poca profundidad por debajo de la superficie.
La microscopía confocal de barrido láser ("CSLM") da imágenes selectivas de un solo punto en un objeto de ensayo enfocando la luz de una fuente puntiforme sobre ese punto. La luz que se transmite más allá o que se refleja desde ese punto es entonces enfocada de nuevo sobre un segundo punto que filtra la luz espuria. Así, el detector que está por detrás del punto recoge sólo la imagen del punto. El barrido explorador del punto a través de un plano completo que pasa a través de la muestra con la ayuda de espejos móviles genera la imagen de un plano completo de puntos. De este modo, la CSLM es un medio para seccionar "ópticamente" una muestra de ensayo.
La tomografía por coherencia óptica ("OCT") realiza el seccionamiento óptico de un modo relacionado, aunque algo diferente. Se refleja un haz colimado de luz de la muestra y se compara entonces con un haz de referencia que ha viajado a lo largo de una distancia conocida con precisión. Sólo la luz que ha viajado a lo largo de exactamente la misma distancia hasta la muestra y de vuelta como lo ha hecho el haz de referencia desde la fuente hasta el detector interfiere de forma constructiva con el haz de referencia y se detecta. Así, se selecciona de nuevo la luz de un solo plano dentro de la muestra.
Las técnicas CSLM, OCT, fotoacústica, acustoóptica, de ondas difusivas, de imagen de resolución temporal, endoscópica, de microscopía de excitación multifotónica o de observación visual son particularmente adecuadas para el examen de tejido extirpado. Sin embargo, también podrían ser usadas para la biopsia óptica in vivo de lesiones cutáneas sospechosas y para la caracterización de superficies corporales que pueden ser expuestas endoscópica o quirúrgicamente.
Se anticipa que la CSLM, la OCT u otras formas de microscopía in vivo serán especialmente útiles en la resección o destrucción de tumores guiadas ópticamente. Por ejemplo, cualquier dispositivo unido a un colonoscopio facilitará la determinación de la profundidad apropiada a la que se debería extirpar un pólipo maligno de colon para asegurar la completa eliminación del tejido canceroso. Como aplicaciones adicionales se incluyen, aunque sin limitación, el diagnóstico y el tratamiento de condiciones morbosas del resto del tracto digestivo, el tratamiento quirúrgico de la colitis ulcerativa y el diagnóstico y tratamiento de la endometriosis.
Cuando se usa la CSLM o la OCT como herramienta dermatológica, se cree que la dispersión a partir de los melanosomas de la piel es la responsable de la producción de contraste. El efecto primario de estos sitios es dispersar o reflejar la luz que incide en ellos. Los agentes de contraste sintéticos pueden actuar como agentes de dispersión o de absorción.
Un agente de contraste preferido para las técnicas intraoperatorias CSLM, OCT, fotoacústica, acustoóptica, de ondas difusivas, de imagen de resolución temporal, endoscópica, de microscopía de excitación multifotónica o de observación visual tendrá las siguientes propiedades: consistirá en partículas estabilizadas en solución acuosa o tamponada. El tamaño de partícula será de alrededor de 100 a 1.300 nm (es decir, aproximadamente igual a la longitud de onda de la fuente de luz). El índice de refracción de las partículas diferirá del de los fluidos corporales, tales como la sangre y la linfa, en al menos 0,01. Las partículas pueden estar hechas de un compuesto polimérico cromóforo o pueden contener o estar revestidas de un compuesto polímero cromóforo; por ejemplo, las partículas pueden consistir en un material de matriz (por ejemplo, un polímero sintético o no sintético fisiológicamente tolerable, tal como un acrilato o polisacárido) que incorpora un compuesto polimérico cromóforo, un núcleo de un compuesto polimérico cromóforo revestido con un agente de revestimiento o encapsulado por un material formador de membrana, o un núcleo de un material de matriz con un compuesto polimérico cromóforo que lo reviste o que está unido a la superficie de la partícula. Las partículas pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas y pueden ser estructuras en capas, tales como vesículas (por ejemplo, micelas, liposomas y microbalones). El compuesto polimérico cromóforo usado será preferiblemente un material fluorescente, particularmente un material que tiene un máximo de emisión en el rango del infrarrojo próximo, especialmente en el rango de 650 a 900 nm. Eventualmente, las partículas pueden tener agentes modificadores de la superficie adecuados, tales como poli(etilenglicol), para hacer más lenta su captación por los macrófagos del organismo. Se describen ejemplos de agentes particulados adecuados en WO 96/23524. Eventualmente, las partículas pueden ser células revestidas con los polímeros de esta invención. Estas células revestidas pueden formarse en el organismo con agentes inyectados o externamente a partir de células extraídas del organismo y luego inyectadas en el
organismo.
Los compuestos cromóforos para uso como agentes de contraste en los métodos de imagen luminosa según la invención, por ejemplo en asociación con la CSLM, la OCT u otras formas de microscopía in vivo, pueden ser también cromóforos hidrosolubles poliméricos o monoméricos.
En algunas situaciones, la resolución de la CSLM o de la OCT in vivo o de otras formas de microscopía in vivo puede ser lo suficientemente alta como para permitir la separación de las imágenes de los núcleos y citoplasmas de células individuales. Un agente de contraste que se localice específicamente en el núcleo o en el citoplasma de las células aumentará el contraste entre estos sitios y el del fondo. Los agentes para este fin serán formas no tóxicas de cromóforos de tinción ya usados para el examen histológico del tejido extirpado. Se puede encontrar una lista de tales cromóforos de tinción selectiva en cualquier manual de tinciones histológicas.
La perfusión de tejido expuesto quirúrgicamente es un indicador importante de la salud de ese tejido. Uno de los indicadores del grado de perfusión es la velocidad del flujo sanguíneo en el tejido. El flujo sanguíneo en la piel puede ser detectado por medición del flujo de sangre por láser Doppler o por interferometría de manchas por láser, bien por si solas, bien en asociación con CSLM, OCT u otras formas de microscopía in vivo.
El láser Doppler y la interferometría de manchas están relacionadas y cada una se basa en el hecho de que la intensidad de luz detectada después de un haz de luz láser que interacciona con una colección de partículas en movimiento cambia con el tiempo (Ruth, B., "Blood Flow Determination by The Laser Speckle Method", Int. J. Microcirc.: Clin. Exp., 1990, 9, 21-45). El análisis matemático de los cambios proporciona una base de cálculo de la velocidad a la que se mueven las partículas.
Cuando se refleja luz láser con una longitud de onda de entre 600 y 1.200 nm por la piel, el patrón de cambio necesario de la luz que se refleja de nuevo a un detector de luz resulta en gran medida del movimiento de las células sanguíneas en el interior de la dermis. Sin embargo, la interferometría de manchas es más adecuada para la determinación del flujo de sangre en vasos con diámetros de entre 0,08 y 1 mm. La medición por láser Doppler es mejor usada para vasos sanguíneos de 0,08 mm y posiblemente de un tamaño menor (UY'Yanov, S.S., Tuchin, Bednow, Brill, G.E., Zakharova, E.I., "The Application of Speckle Interferometry for The Monitoring of Blood and Lymph Flow in Microvessels", Lasers in Medical Science, 1996, 11, 97-107). La luz reflejada por vasos de mayor tamaño, que descansan en profundidad dentro de la dermis y el tejido subyacente, sólo sirve para complicar el análisis de la luz de los vasos menores que están aproximadamente 0,5 mm por debajo de la superficie de la piel (Abbot, N.C., Ferrell, W.R., Lockhart, J.C., Lowe, J.G., "Laser Doppler Perfusion Imaging of Skin Blood Flow Using Red and Near-Infrared Sources", J. Invest. Dermatol., 1996, 107, 882-886).
Cuando la vasculatura contiene un cromóforo absorbente, la ley de Beer muestra que la luz que pasa a través de vasos sanguíneos de mayor tamaño será más fuertemente atenuada que la luz que pasa a través de vasos más pequeños. Más aún, la dispersión de la luz por las células sanguíneas en vasos profundos de la piel y el tejido subyacente será más atenuada que la luz dispersada por las células sanguíneas en vasos próximos a la superficie de la piel. Así, la presencia en la sangre de un agente de contraste con un máximo de absorción próximo a la longitud de onda de la luz láser utilizada para las mediciones por Doppler o por interferometría de manchas del flujo sanguíneo mejora la selectividad de la medición para vasos más pequeños próximos a la superficie de la piel. Un agente del tipo mostrado en esta invención es necesario, ya que tiene que haber una concentración estable del agente en la sangre en el curso de la invención.
Se pueden obtener imágenes útiles desde el punto de vista del diagnóstico tras administración usando imagen endoscópica, imagen microscópica confocal, imagen de fluorescencia de tiempo retardado, imagen de modulación de fases, imagen fotoacústica u otras técnicas de imagen.
Se puede conseguir la aplicación terapéutica usando estos compuestos en forma de aplicación citotóxica de luz en forma de terapia fotodinámica, donde los tejidos a tratar o destruir son tratados primeramente con agentes de contraste a los que se permite asociarse íntimamente con el tejido y luego por irradiación con luz que es absorbida por los agentes de contraste in vivo, eventualmente en presencia de oxígeno en la sangre, o en solución salina oxigenada, o en plasma oxigenado, o fluido linfático oxigenado y similares.
La aplicación terapéutica usando estos compuestos puede conseguirse a veces con terapia sonodinámica, donde se tratan primeramente los tejidos que han de ser tratados o destruidos con agentes de contraste a los que se permite asociarse íntimamente con el tejido y luego por sonicación con sonido de alta frecuencia, tal como ultrasonido, eventualmente en presencia de oxígeno en la sangre, o en solución salina oxigenada, o en plasma oxigenado, o fluido linfático oxigenado y similares.
Cualquier mención en el texto al término "PM medio" o "peso molecular medio" se refiere a una media ponderal.
La invención será ahora todavía descrita en relación a los siguientes Ejemplos no limitantes y Figuras.
La Figura 1a es un gráfico de datos de biodistribución comparativos del agente de contraste Polímero 3 (NC 100448) frente a verde de indocianina como control en ratones hembras inmunodeficientes que contienen tumores HT-29 una hora después de la inyección intravenosa de soluciones salinas tamponadas con fosfatos de cada uno. El Polímero 3 se detecta en el tumor, mientras que el compuesto de control se detecta insignificantemente.
La Figura 1b es un gráfico de datos de biodistribución comparativos del agente de contraste Polímero 3 (NC 100448) frente a verde de indocianina como control en ratones hembras inmunodeficientes que contienen tumores HT-29 a las tres horas de la inyección intravenosa de soluciones salinas tamponadas con fosfatos de cada uno. El Polímero 3 se detecta en el tumor, mientras que el compuesto de control se detecta insignificantemente. En relación a la Figura 3A, la concentración del agente de contraste en el tumor ha aumentado, mientras que la concentración en la sangre ha disminuido.
La Figura 2 muestra una imagen comparativa de tumores tomados de ratones 24 horas después de haber sido inyectados con 0,05 mg/(g de peso corporal) del agente de contraste infrarrojo NC 100448 en PBS. La fotografía fue tomada con película de infrarrojos en blanco y negro usando irradiación a 780 nm por una disposición de diodos emisores de luz. Estas condiciones dieron una máxima absorción e intensificación del contraste de NC100448, según evidenciaba la mancha obscurecida del agente de contraste sobre el gráfico de papel. Los tumores aparecen uniformemente más obscuros que los tumores control (no mostrados), pero no muestran obscurecimiento alrededor de los bordes, como se ve en tumores de ratones inyectados con NC100526 (Figura 4). La biodistribución medida del agente de contraste en los ratones (véase la Tabla 1) muestra que los tumores contienen NC100448.
La Tabla 1 presenta los datos de biodistribución a las 3, 6 y 24 horas, dados como porcentaje de la dosis inyectada del agente de contraste por gramo de tejido, de un experimento independiente de ratones intravenosamente inyectados con agente de contraste NC100448 a 0,05 mg/(g de peso corporal) en PBS. A las 24 horas, la concentración del agente de contraste en los tumores seguía siendo relativamente alta, mientras que el agente de contraste se había aclarado en gran medida de la sangre y no había aumentado en el músculo.
TABLA 1
Datos de biodistribución del NC100448 en ratones con tumores HT-29
Plasma Tumor Músculo
3 h 14,33\pm1,33 5,57\pm0,73 nd
6 h 8,44\pm1,33 8,6\pm1,53 nd
24 h 0,46\pm0,40 7,53\pm0,74 nd
nd = no detectado
La Figura 3 es una fotografía de un conjunto de tumores extirpados irradiados con luz infrarroja de 780 nm que habían sido extraídos de ratones 24 horas después de la inyección de soluciones en PBS de NC100448 (fila superior) y verde de indocianina (fila inferior). La imagen fue registrada con una cámara CCD sensible a infrarrojos (Bischke, Tipo N-CCD-4024, equipada con una lente Computar TV Zoom 1:1,2/12,5-75) sobre una cinta VHS (Maxell HGX Plus) a 30 fotogramas/segundo usando un Reproductor de Videocassette Panasonic AG-1310P HQ con Cabezal super 4 VHS SQPB). La cinta fue digitalizada y se imprimió un fotograma usando Adobe Photoshop 4.01. Los tumores de ratones a los que se había inyectado NC100448 (máxima de absorción aproximadamente a 780 nm) aparecían significativamente más obscuros en comparación con los tumores de ratones a los que se había inyectado
ICG.
La Tabla 2 muestra la biodistribución, dada como porcentaje de dosis inyectada del agente de contraste por gramo de tejido, a varios puntos temporales tras la inyección de NC100481 en ratones hembras inmunodeficientes con tumores HT-29. Mientras que el agente de contraste se había aclarado en 24 horas de la sangre y del músculo, seguía estando a una concentración elevada en el tumor después de 48 horas.
TABLA 2
Biodistribuciones del NC100481
Plasma Tumor Músculo
6 h 7,4\pm0,03 21,0\pm7,1 10,3\pm17,9
24 h nd 16,6\pm3,9 nd
48 h nd 9,1\pm4,5 59,5\pm42,9
nd = no detectado
Los siguientes ejemplos, en la medida en que se relacionan con materia objeto que queda fuera del alcance de las reivindicaciones, están incluidos con fines informativos y han de ser considerados como comparativos.
Ejemplo 1 Preparación de 2-[2-[2-(4-isotiociano)fenoxi-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)1H-benz[e]indolio, sal interna
Se usó el siguiente esquema de reacción para producir el compuesto del título:
9
Ejemplo 2 Preparación de 2-[2-[2-(4-isotiociano)fenoxi-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)1H-benz[e]indolio, sal interna, sal sódica, producto de reacción con PEG_{3.400}-\alpha, \omega-diamina
Se usó el siguiente esquema de reacción para producir el compuesto del título:
10
donde X es NH-CS-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}NH-CS-NH), un polímero de peso molecular 3.400.
Ejemplo 3 Preparación de 2-[2-[2-(4-isotiociano)fenoxi-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)1H-benz[e]indolio, sal interna, sal sódica, producto de reacción con PEG_{10.000}-\alpha, \omega-diamina
Se produjo el compuesto del título de un modo análogo al del Ejemplo 2.
Ejemplo 4 Método general usado para la medición de la distribución de los polímeros cromóforos en ratón
Especie: Tac:N:NIH(S)-nufDF, ratones hembras inmunodeficientes; Tac:Cr:NCr-nufBr, ratones hembras
inmunodeficientes.
Tumor: Carcinoma de colon humano HT29.
A) Métodos en ratones
Se distribuyó a los ratones aleatoriamente en grupos basados en los volúmenes tumorales. El día del estudio, se inyectaron los artículos del ensayo (Polímeros 1 y 2) en los ratones a través de la vena de la cola. Se usó tetrasulfonato de cloroaluminio y ftalocianina como compuesto de referencia (control) en un grupo de ratones en estos estudios. Se sacrificó a los ratones humanitariamente una hora después de la dosificación mediante inhalación de halotano y dislocación cervical. Se recogió la sangre por punción cardíaca y se puso en tubos con EDTA o con heparina lítica. Se centrifugaron entonces las muestras y se recogió y pesó el plasma. Se recogieron el bazo, el hígado, los riñones, el músculo y el tumor, se lavaron con PBS y se pesaron en tubos previamente tarados. Se refrigeraron entonces las muestras para su análisis inmediato o se congelaron a -20 grados Celsius y se analizaron posteriormente.
B) Recogida y preparación del plasma
Se recogió el plasma en tubos Eppendorf tarados y se pesaron los tubos. Se añadió a cada tubo 1 ml de etanol. Se mezclaron los contenidos de los tubos con una mezcladora vorticial y se microcentrifugaron después a 14.000 rpm durante 2 min. Se transfirió el líquido sobrenadante mediante pipeta a un tubo de Eppendorf limpio y marcado. Se repitió este procedimiento para todas las muestras de plasma Se transfirió cada muestra a una cubeta limpia y se determinó la cantidad de cromóforo por absorbancia a una longitud de onda predeterminada. Se determinó la concentración del cromóforo en la muestra por comparación con una curva patrón generada a partir de concentraciones conocidas de cromóforo.
C) Recogida y preparación de órganos
Se extrajeron los órganos de los ratones, se pusieron en tubos de muestra tarados y se registraron los nuevos pesos. Se añadió a cada tubo 1 ml de agua desionizada y se homogeneizaron los órganos. Se transfirió el homogenado a un tubo de Eppendorf tarado y se registró el peso. Se añadieron a este homogenado 500 \mul de etanol, se mezcló la mezcla con una mezcladora vorticial y se centrifugaron los contenidos del tubo en una microcentrífuga a 8.000 rpm durante 2 min. Se transfirió el sobrenadante con pipeta a un tubo de Eppendorf limpio. Se añadieron a la pella residual 500 \mul de etanol, se mezcló la mezcla agitando vigorosamente en una mezcladora vorticial y se centrifugó de nuevo la muestra. Se combinaron los sobrenadantes, se transfirieron a una cubeta limpia y se determinó la concentración del cromóforo espectroscópicamente a una absorbancia predeterminada por comparación con la curva patrón. Se determinó la concentración media del cromóforo en cada órgano por análisis de regresión.
Ejemplo 5 Preparación de cloruro de N-[5-anilino-3-cloro-2,4-[2-etoxicarbonilpropano-1,3- diil)-2,4-pentadien-1-iliden]-anilinio
A 34 ml de N,N-dimetilformamida anhidra, agitada bajo nitrógeno y moderada a 0 a 5ºC con un baño de hielo seco/isopropanol, se añadieron gota a gota a lo largo de 20 minutos 28 ml de oxicloruro de fósforo. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara durante 1 h hasta los 15ºC. Se añadió a ésta luego gota a gota a lo largo de 5 minutos una solución de 10 g de 4-oxociclohexanocarboxilato de etilo (Aldrich Chemical Co.) en 20 ml de cloruro de metileno. Después de remitir una breve exotermia, se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante 2 horas. Se eliminó entonces el solvente por evaporación rotatoria y se enfrió el residuo viscoso de color naranja obscuro en hielo. Se añadió a éste, a lo largo de 35 minutos, una solución de 22 ml de anilina disueltos en 22 ml de etanol. La adición fue acompañada de desprendimiento de humos y de una elevación en la temperatura, que fue moderada usando un baño de hielo-sal. Después de completarse la adición, se vertió el producto de reacción viscoso sobre 250 g de hielo que contenían 25 ml de ácido clorhídrico concentrado. Se dejó entonces reposar a esta mezcla en un congelador durante 2 días. Se aisló el producto bruto por filtración, se lavó con agua y luego con éter y se secó sobre P_{2}O_{5} a vacío, para obtener 14 g de sólido. Se usó este material sin mayor purificación.
Ejemplo 6 Preparación de 3-(2,3,3-trimetil-1H-benz[e]indolio)propanosulfonato
A una solución agitada magnéticamente de 8,72 g de 1,1,2-trimetil-1H-benz[e]indol (Fisher Chemical Co.) en 100 ml de acetonitrilo anhidro bajo nitrógeno a temperatura ambiente se añadieron 5,09 g de 1,3-propanosulto-na (Aldrich Chemical Co.) en 3 ml de acetonitrilo. Se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante 24 horas y se enfrió después hasta la temperatura ambiente. Se aisló el precipitado de color blanco sucio del líquido verde obscuro acompañante, se lavó con 100 ml de acetonitrilo y luego con 100 ml de éter y se secó después al aire para obtener 10,24 g del compuesto deseado.
Ejemplo 7 Preparación de 2-[2-[2-cloro-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden)etiliden]-5-(etoxicarbonil)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolio, sal interna, sal sódica
Se calentó una mezcla de 1,87 g de cloruro de N-[5-anilino-3-cloro-2,4-(2-etoxicarbonilpropano-1,3-di-il)-2,4-pentadien-1-iliden]anilinio y 4,3 g de 3-(2,3,3-trimetil-1H-benz[e]indolio)propanosulfonato en 190 ml de n-butanol que contenían 75 ml de tolueno a reflujo durante una hora con eliminación de agua. Se añadieron entonces a esta mezcla 0,65 g acetato de sodio anhidro y se continuó a reflujo durante otras dos horas y media. Se eliminó entonces el solvente por destilación hasta un punto en que empezaron a formarse cristales. Después de enfriar, se aislaron los cristales por filtración, se trituraron con éter etílico y se recristalizaron luego con éter etílico metanólico, para obtener 1,7 g del compuesto deseado.
Ejemplo 8 Preparación del producto de reacción bistioéter tinte:polímero 2:1 entre 2-[2-[2-cloro-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol- 2-iliden]etili-den]-5-(etoxicarbonil)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3- (3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolio, sal interna, sal sódica, y PEG_{3.400}-\alpha, \omega-ditiolato disódico, Polímero 3 (NC 100448)
11
Se trató una solución de 1,9 g de poli(etilenglicol)-\alpha, \omega-ditiol de 3.400 de peso molecular de Shearwater Polymers, Inc. en 8,5 ml de dimetilformamida seca rociada con nitrógeno con 0,1 g de hidruro de sodio al 50% y se añadió entonces por goteo bajo nitrógeno a temperatura ambiente y a lo largo de 15 minutos a una solución agitada de 0,89 g de 2-[2-[2-cloro-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-5-(etoxicarbonil)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolio en 9 ml de dimetilformamida anhidra rociada con nitrógeno. Después de dos horas y media, se trató la mezcla de reacción con un exceso de dióxido de carbono, se evaporó el solvente y se aisló el aducto tinte:polímero 2:1 deseado por cromatografía en columna (SiO_{2}: metanol al 15% en cloroformo).
Los resultados de la biodistribución son presentados en las Figuras 1a(una hora post-dosificación) y 1b (tres horas post-dosificación).
Ejemplo 9 Preparación del producto de reacción bistioéter tinte:polímero 2:1 entre 2-[2-[2-cloro-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-5-(etoxicarbonil)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolio, sal interna, sal sódica, y PEG_{10.000}-\alpha, \omega-ditiolato disódico (NC 100524)
12
Se trató una solución de 2,45 g de poli(etilenglicol)-\alpha, \omega-ditiol de 10.000 de peso molecular de Shearwater Polymers, Inc. en 14 ml de dimetilformamida seca rociada con nitrógeno con 43 mg de hidruro de sodio al 50% y 1,5 ml de dimetilformamida seca. Al cabo de aproximadamente media hora, se añadió esta solución gota a gota en un tercio de hora a una solución rociada con nitrógeno de 0,4 g de 4-(2-[4-cloro-7-(3,3-dimetil-1-(3-sulfonatopropil)benz(e)indolin-2-iliden-3,5-(2-etoxicarbonilpropano-1,3-diil)-1,3,5-hepatatrien-1-il)-3,3-dimetil-3H-benz(e)indolio)propanosulfonato de sodio en 5 ml de dimetilformamida seca rociada con nitrógeno con agitación. Después de cuatro horas de agitación bajo una atmósfera de nitrógeno, se trató la mezcla de reacción con un exceso de dióxido de carbono, seguido de evaporación del solvente. Se aisló el aducto de tinte:polímero 2:1 de color verde obscuro deseado por cromatografía en columna (SiO_{2}: metanol al 20% en cloroformo). Máximas de absorción en solución salina tamponada con fosfatos: 814 nm, 744 nm. El espectro de masas tenía una distribución centrada aproximadamente en 12.000 unidades de masas, tal como se esperaba.
Ejemplo 10 Uso de medios de contraste para aumentar la medición por láser Doppler del flujo sanguíneo en la piel
Aproximadamente 0,5 a 1 hora antes de hacer las mediciones, se administra una solución estéril de un medio de contraste que contiene 5-20 mg de un tinte con una máxima de absorción entre 600 y 1.300 nm por inyección intravenosa. Se realiza la medición real del flujo sanguíneo con un instrumento láser Doppler estándar, por ejemplo el de Lisca Development AB, Kinkoping, Suecia, que puede ser eventualmente modificado para incorporar una fuente de láser que opera a 830 ó 780 nm (Abbot, N.C., Ferrell, W.R., Lockhart, J.C., Lowe, J.G., "Laser Doppler Perfusion Imaging of Skin Blood Flow Using Red and Near-Infrared Sources", J. Invest. Dermatol., 1996, 107, 882-886) después de haberse estabilizado la concentración de agente de contraste en la sangre. De este modo, se pueden identificar estructuras altamente vascularizadas, particularmente tumorales.

Claims (9)

1. Un agente de contraste para imagen luminosa hidrosoluble fisiológicamente tolerable que contiene restos de fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
13
donde:
cada L_{1} es un grupo independientemente seleccionado entre un resto orgánico de unión y un enlace químico;
cada X es independientemente seleccionado entre O, N-R_{1}, S, Se, Te, CH=CH y (CH_{3})_{2}C;
cada R_{1} es independientemente seleccionado entre el grupo consistente en un grupo metilo, un grupo etilo y un grupo alquilo C_{3-16} que eventualmente contiene uno o más hetero-átomos seleccionados entre el grupo consistente en O, N y S, cuyos heteroátomos están separados entre sí por al menos 2 átomos de carbono y cuyos grupos etilo y alquilo contienen eventualmente uno o más grupos funcionales hidrofílicos seleccionados entre el grupo consistente en grupos hidroxilo, grupos carboxilo, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfato, grupos fosfonato, grupos amino y grupos aminoácido;
cada Z, de los cuales al menos hay uno, es independientemente seleccionado entre el grupo consistente en H, un grupo metilo, un grupo etilo según se ha definido antes, un grupo alquilo C_{3-16} según se ha definido antes, un grupo alcoxilo C_{1-16}, la porción alquilo del cual es como se ha definido antes, un grupo carboxialquilo C_{1-16}, un grupo oxicarbonilalquilo C_{1-16}, un grupo sulfonato, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo sulfonamidoalquilo C_{1-16}, un grupo fenil-alquilo C_{1-16}, un grupo fenoxi-alquilo C_{1-16}, un grupo feniloxialquilo C_{1-16}, un grupo oxifenoxi-alquilo C_{1-16}, las porciones alquilo de cada uno de los cuales son como se ha definido antes, o un anillo aromático anillado que consiste en un anillo benz[e]aromático, un anillo benz-[f]-aromático o un anillo benz[g]aromático, donde e, f y g son como se define en relación a la estructura indol como plantilla y cada uno de los cuales puede estar substituido por grupos alquilo C_{1-16}, alcoxilo C_{1-16}, carboxilo, sulfonato, sulfonamido, fenilo o fenoxilo según se ha definido anteriormente;
cada R_{2} es independientemente elegido entre el grupo consistente en H o alquilo C_{1-16} según se ha definido antes, o dos grupos R_{2}, junto con los tres átomos de carbono intermedios, forman un anillo carbocíclico de 5 ó 6 miembros que eventualmente contiene un heteroátomo de anillo seleccionado entre el grupo consistente en O, N-R_{1} y S;
m es un número entero de hasta 1.200, y
cada p es independientemente 0 ó 1 cuando L_{1} es un resto de unión orgánico.
2. Un agente de contraste según se reivindica en la reivindicación 1, donde dicho m es un número entero de 5 a 1.200.
3. Un agente de contraste según se reivindica en la reivindicación 1, donde m es un número entero de 50 a 1.000.
4. Un compuesto agente de contraste según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además incluye un vector de abordaje.
5. Uso de un agente de contraste para imagen luminosa hidrosoluble fisiológicamente tolerable según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento de un organismo humano o animal para eliminar tejido o células enfermas del mismo o para destruir tejido o células enfermas en el mismo.
6. Un método de obtención de imágenes del cuerpo humano o animal (por ejemplo, mamífero, aviar o reptil) donde se genera una imagen por una modalidad de imagen luminosa de al menos una parte de dicho cuerpo al que se ha administrado previamente un agente de contraste para imagen luminosa según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y en la que dicho agente se distribuye, y donde dicha modalidad es microscopía confocal de barrido láser (CSLM), tomografía por coherencia óptica (OCT), imagen fotoacústica, acustoóptica, de onda difusiva o de resolución temporal, microscopía endoscópica o de exitación multifotónica o técnicas de observación visual.
7. Un método según se reivindica en la reivindicación 6, donde dicha parte de dicho cuerpo es el nódulo linfático centinela.
8. Uso de un agente de contraste fisiológicamente tolerable según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medio de contraste para uso en un método de diagnóstico de un cuerpo humano o animal (por ejemplo, mamífero, aviar o reptil), que conlleva la generación por una técnica de microscopía confocal de barrido láser (CSLM), tomografía por coherencia óptica (OCT), imagen fotoacústica, acustoóptica, de onda difusiva o de resolución temporal, microscopía endoscópica o de exitación multifotónica o de observación visual de una imagen de una parte de dicho cuerpo en el que dicho material se distribuye.
9. Una composición farmacéutica consistente en un agente de contraste para imagen luminosa fisiológicamente tolerable según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con al menos un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable en un medio vehiculizante acuoso estéril libre de pirógenos.
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