ES2951663T3 - Administración de fármacos - Google Patents

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Andrew John Healey
Svein Kvåle
Per Christian Sontum
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Exact Therapeutics AS
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Abstract

La presente invención se refiere a la administración de agentes terapéuticos mediada por ultrasonido (EE.UU.), tal como la administración de un fármaco, gen, nanopartícula o radioisótopo, utilizando un sistema de micropartículas bifásico que comprende microburbujas de gas, microgotas de emulsión y grupos de los mismos. Por tanto, la presente invención se refiere a una composición agrupada y a una composición farmacéutica, y a su uso para la administración de agentes terapéuticos y como agente de contraste para imágenes por ultrasonido. Además se refiere a métodos para administrar dichos agentes terapéuticos y al uso de dichas composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Administración de fármacos
Sector de la invención
La presente invención se refiere a la administración de agentes terapéuticos mediada por ultrasonidos (US), tal como la administración de un fármaco, un gen, una nanopartícula o un radioisótopo, utilizando un sistema bifásico de micropartículas que comprende microburbujas de gas, microgotas de emulsión y agrupaciones de las mismas. De este modo, la presente invención se refiere a una composición de agrupaciones y a una composición farmacéutica, y a su utilización para la administración de agentes terapéuticos y como agente de contraste para formación de imágenes por ultrasonidos. Se refiere, además, a procedimientos para administrar estos agentes terapéuticos y a la utilización de dichas composiciones.
Estado de la técnica anterior
Un requisito previo para una terapia médica exitosa es que el fármaco alcance su patología diana y que la toxicidad frente al tejido sano sea limitada. Sin embargo, muchos fármacos muestran un bajo índice terapéutico, lo que limita gravemente su utilidad clínica. En las últimas décadas, la industria farmacéutica ha gastado recursos considerables para tratar de resolver este dilema con varios enfoques para la administración de fármacos dirigidos/localizados aplicando, por ejemplo, plataformas de nanopartículas, microburbujas o liposomas. Mediante la administración localizada del fármaco en la patología u órgano en cuestión, se minimiza la exposición sistémica (reduciendo la toxicidad) y se incrementa la concentración local y, por lo tanto, la eficacia.
A pesar de esfuerzos significativos, la administración controlada de fármacos permanece esencialmente sin resolver en la medicina clínica. En los últimos años, la investigación y el desarrollo han prestado especial atención a los sistemas de administración de fármacos activados externamente. Se han utilizado el calor, la luz, los ultrasonidos, los campos eléctricos y magnéticos como fuentes de energía externas para activar un sistema de formulación de fármacos in vivo para la liberación y administración de fármacos en lugares específicos dentro del cuerpo. Para una revisión reciente, véase Timko et al [B. P. Timko et al, Remotely triggerable drug delivery systems, Adv. Mater. 22 (2010) 4925-4943].
Durante las últimas dos décadas, ha habido un interés creciente en la administración de fármacos mediante ultrasonidos. Para una revisión reciente, véase Castle et al [Castle et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 1 de febrero de 2013, 304: H350-H357]. Muchos enfoques se basan en la utilización de microburbujas similares a las que se utilizan como agentes de contraste para ultrasonidos para aplicaciones con formación de imágenes médicas, para la liberación de fármacos incorporados o adheridos y/o para una captación mejorada de fármacos administrados o coadministrados sistémicamente.
Las microburbujas tienen el potencial de alterar la estructura del tejido y las membranas celulares a través de mecanismos, tales como la sonoporación, lo que mejora la extravasación del fármaco liberado o coadministrado al tejido diana. La aplicación de ultrasonidos hace oscilar las microburbujas presentes en la microcirculación e induce mecanismos bien establecidos que aumentan la permeabilidad local de la vasculatura, lo que permite que los fármacos se difundan a una velocidad mayor en el espacio tisular [O’Neill, BE y Li, KC, Int. J. Hyperthermia, septiembre de 2008; 24(6): 506-520]. Se conocen varios mecanismos para inducir tales efectos biológicos, entre los que se incluyen la sonoporación y endocitosis para la administración intracelular, la alteración del endotelio y/o aumento de la apertura/modificación (reversible) de los poros de fenestración o alteración del endotelio vascular, u otros mecanismos de transporte y difusión mejorados, tales como fuerza de radiación y “microstreaming”. La importancia relativa y la naturaleza exacta de los mecanismos y la relación con la dosimetría ultrasónica requieren mayor investigación y elucidación. El trabajo reciente ha estado motivado también para abordar los problemas de la administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica y la administración a tumores sólidos. La barrera hematoencefálica se caracteriza por uniones endoteliales vasculares estrechas que inhiben el paso de moléculas grandes al espacio tisular. La vasculatura del tumor es, en general, más “permeable”, pero sufre de una presión oncótica y de líquido intersticial más elevada que puede impedir el paso del fármaco a través de la masa tumoral. La captación de agentes quimioterapéuticos establecidos puede ser muy variable dependiendo del tipo de tumor y estas diferencias de captación pueden contribuir a la naturaleza variable del efecto terapéutico. Aunque los mecanismos de administración mediados por microburbujas se han demostrado claramente in vivo, existen efectos biológicos relacionados que plantean problemas de seguridad para el enfoque. Con toda probabilidad, están implicados mecanismos de cavitación de microburbujas y, en particular, se han observado microhemorragias y daños vasculares irreversibles. Para las técnicas que abordan la aplicación a la barrera hematoencefálica, también existen problemas relacionados con la administración de suficiente energía de ultrasonidos al área patológica de interés, en particular, si el hueso del cráneo que lo recubre permanece intacto y no se extrae.
La forma más básica de administración de fármacos mediada por ultrasonidos/microburbujas es la administración de una formulación de microburbujas junto con un fármaco administrado sistémicamente, tal como una captación mejorada para la patología diana. Un ejemplo de este enfoque ha entrado recientemente en ensayos clínicos [Kotooulis et al, Med Phys., 40(7) (2013)], en el que el agente de contraste para ultrasonidos comercial Sonovue (Braceo Spa.) se coadministra con gemcitabina, seguido de irradiación para el tratamiento del cáncer de páncreas. Además del enfoque de coadministración, hay tres clases generales de tecnologías de microburbujas exploradas para la administración de fármacos [Geers et al, Journal of Controlled Release 164 (2012) 248-255]: (1) microburbujas cargadas con fármaco; (2) microburbujas formadas in situ a partir de nanogotas; y (3) microburbujas dirigidas (por ejemplo, microburbujas con ligandos unidos para dirigirse a los receptores de la superficie celular). A lo largo de los años, sin embargo, se ha reconocido que todos estos enfoques presentan limitaciones fundamentales, que efectivamente han dificultado la transición a la práctica clínica. Quizás la mayor limitación es la cantidad de fármaco que se puede incorporar en los sistemas de microburbujas. La fina cubierta o membrana estabilizante transporta un volumen limitado disponible para la carga del fármaco, y se ha estimado que se requerirán litros de un agente de contraste de US normal para obtener una dosis terapéutica para los fármacos quimioterapéuticos habituales [Geers et al, Journal of Controlled Release 164 (2012) 248-255]. Además, para la unión y/o incorporación de la carga de fármaco a los sistemas de microburbujas, puede ser necesaria la modificación química del fármaco, con posibles cambios en la actividad biológica.
Las microburbujas también son rastreadores sanguíneos de flujo libre y, tan pronto como se activan para liberar su carga útil, el fármaco comenzará a eliminarse inmediatamente con el flujo sanguíneo. Tal como se ha señalado, un enfoque de microburbujas más básico incluye la inyección conjunta con una formulación de fármaco normal. Aunque dicho concepto no tiene la limitación de una baja carga de fármaco, las microburbujas tienen un tamaño de micras y, como tales, permanecen en el espacio vascular y, en consecuencia, los efectos biológicos, tales como la sonoporación para facilitar la captación mejorada, estarán restringidos al endotelio vascular. Además, las microburbujas son pequeñas y normalmente no están en contacto con las paredes de los vasos, lo que limita la magnitud y el alcance de los efectos biológicos para mejorar la absorción del fármaco.
Un enfoque diferente utiliza tecnologías de nanoemulsión. Se han descrito técnicas de vaporización acústica de microgotas (ADV, Acoustic microdroplet vaporisation) para una serie de aplicaciones entre las que se incluyen administración de fármacos y emboloterapia [Stanley, S. et al., Microcirculation 19: 501-509 (2012), Reznik, N., Phys. Med. Biol. 57 (2012) 7205-7217]. Estas microgotas son lo suficientemente pequeñas (normalmente de menos de 200 nm) para extravasar los vasos sanguíneos (del tumor) mediante el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR, enhancedpermeability and retention) y tienen la ventaja de superar el corto tiempo de circulación de las microburbujas cargadas de fármaco. Se puede inducir su evaporación (transición de fase líquida a gaseosa, es decir, cambio de fase) in vivo mediante la aplicación de irradiación de ultrasonidos. Sin embargo, estas nanomicrogotas tienen la desventaja de requerir una potencia acústica muy elevada para facilitar un cambio de fase del aceite en las nanomicrogotas a una fase gaseosa y proporcionar una microburbuja de gas. Dentro de los US médicos, la potencia acústica normalmente se describe mediante el “índice mecánico” (MI, Mechanical Index). Este parámetro se define como la presión negativa máxima en el campo de ultrasonidos (pNp, peak negative pressure), reducida en 0,3 dB/cm/MHz dividida por la raíz cuadrada de la frecuencia central del campo de ultrasonidos en MHz (Fc) [American Institute of Ultrasound in Medicine. Acoustic Output Measurement Standard for Diagnostic Ultrasound Equipment. 1 st ed. 2nd ed. Laurel, M. D.: American Institute of Ultrasound in Medicine; 1998, 2003].
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Los requisitos regulatorios durante las ecografías médicas son utilizar un MI inferior a 1,9. Durante las ecografías con agentes de contraste de microburbujas, se recomienda un MI inferior a 0,7 para evitar efectos biológicos perjudiciales, tales como microhemorragias y daño vascular irreversible, y la utilización de un MI inferior a 0,4 se considera la “mejor práctica” [Miller et al, J Ultrasound Med 2008; 27:611-632, AIUM Consensus Report on Potential Bioeffects of Diagnostic Ultrasound].
Para ADV, normalmente, se debe aplicar un MI > 4 a 3,5 MHz para facilitar un cambio de fase eficaz del aceite, potencias que estén muy por encima de los requisitos regulatorios para las ecografías médicas (MI ≤ 1,9) y muy por encima del MI recomendado de menos de 0,7, y tienen efectos biológicos relacionados significativos que plantean problemas de seguridad para el enfoque, en particular microhemorragias y daño vascular irreversible. Además, tienden a recondensarse en microgotas casi inmediatamente después del cambio de fase; por lo tanto, los potenciales mecanismos de sonoporación para mejorar la biodisponibilidad del fármaco son limitados.
Hasta cierto punto, las microburbujas dirigidas pueden mejorar la especificidad de la administración del fármaco a la patología diana y/o el alcance de los efectos biológicos de la sonoporación, pero la tecnología es compleja y, una vez más, estos esfuerzos han permitido un éxito y una transición a la utilización clínica limitados.
También se han sugerido alternativas a los enfoques revisados anteriormente, reconocidos como técnica anterior a la presente invención. Téngase en cuenta que en la revisión breve del estado de la técnica que se presenta a continuación, se mantiene la terminología utilizada en estas patentes. Esto puede desviarse ligeramente de las definiciones utilizadas en la presente invención y detalladas en las páginas 4 a 6.
La Patente WO 98/17324, “Improvements in or relating to contrast agents”, propone una preparación combinada que comprende 1) una composición de microburbujas y 2) una “composición difusible”, por ejemplo, en forma de una emulsión de aceite en agua, capaz de difundirse in vivo en la composición de microburbujas, aumentando transitoriamente su tamaño. De forma resumida, esta patente enseña que la aplicación de ultrasonidos, después de la coadministración de estas dos composiciones, activa el sistema bifásico (gas/líquido) con el consiguiente cambio de fase de líquido a gas del componente difusible y la generación de burbujas de cambio de fase grandes que se atrapan transitoriamente en la microvasculatura y, de esta manera, se podrían utilizar como un rastreador de depósito, agente de contraste para US. Para la composición difusible, la patente enseña la utilización de aceites que son esencialmente insolubles e inmiscibles en agua y que existen como gases o muestran una presión de vapor sustancial a la temperatura corporal. La Patente WO 98/17324 señala la posibilidad de utilizar el sistema propuesto para la administración de fármacos uniendo un componente terapéutico a la composición de microburbujas. La patente también señala la posibilidad de mezclar las dos composiciones antes de la administración simultánea, pero establece que la mezcla normalmente tendría que almacenarse a presiones elevadas o temperaturas reducidas para evitar el crecimiento espontáneo de las microburbujas antes de la administración.
La Patente WO 98/51284, “Novel acoustically active drug delivery systems”, propone un sistema de administración terapéutica que comprende una microburbuja, en el que la burbuja comprende un aceite, un surfactante y un agente terapéutico disueltos en la capa de aceite. De forma resumida, esta patente enseña que la aplicación de ultrasonidos, después de la administración, romperá las microburbujas e inducirá una liberación localizada de su carga de fármaco. También enseña la utilización preferente de aceites con un punto de fusión entre -20 a 42 °C. El componente de aceite se presenta como un vehículo (disolvente) para el agente terapéutico y con el intervalo de punto de fusión en cuestión, estos aceites no servirán como un “componente difusible”, tal como se enseña en la Patente WO 98/17324.
La Patente WO 99/53963, “Improvements in or relating to contrast agents” se basa adicionalmente en la invención detallada en la Patente WO 98/17324. De forma resumida, esta patente enseña que la eficacia de las preparaciones del tipo descrito en la Patente WO 98/17324 se puede mejorar sustancialmente si los dos componentes se formulan de manera que las microburbujas y el componente difusible tengan afinidad entre sí, por ejemplo, como resultado de fuerzas electrostáticas atractivas. La Patente WO 99/53963 también señala la posibilidad de utilizar el sistema propuesto para la administración de fármacos uniendo un componente terapéutico a la composición de microburbujas. Al igual que en la Patente WO 98/17324, la patente señala la posibilidad de mezclar las dos composiciones antes de la administración simultánea, pero establece que la mezcla normalmente tendría que almacenarse a presiones elevadas o temperaturas reducidas para evitar el crecimiento espontáneo de las microburbujas antes de la administración.
Tanto la Patente WO 98/17324 como la Patente WO 99/53963 describen consistentemente la administración (simultánea, separada o secuencial) de dos composiciones distintas; una composición de gas disperso (microburbujas) y una composición difusible (emulsión de microgotas).
Ni la Patente WO 98/17324 ni la Patente WO 99/53963 describen la carga de un agente terapéutico en la composición difusible (emulsión de microgotas).
Ni la Patente WO 98/17324 ni la Patente WO 99/53963 describen la utilización de insonación con US después de la activación del evento de cambio de fase para facilitar la extravasación del fármaco desde el compartimento vascular al tejido diana.
Si bien la técnica anterior citada anteriormente representa mejoras potenciales sobre las tecnologías exploradas actualmente que utilizan microburbujas como tales, no ha habido transición a la práctica clínica y todavía existe una gran necesidad de un procedimiento mejorado para la administración de fármacos mediada por ultrasonidos.
Definiciones
En el presente documento, el término o la expresión “microburbuja” o “microburbuja de contraste normal” se utilizan para describir microburbujas con un diámetro en el intervalo de 0,2 a 10 micras, normalmente con un diámetro promedio entre 2 y 3 μm. Entre las “microburbujas de contraste normales” se incluyen agentes disponibles en el mercado, tales como Sonazoid (GE Healthcare), Optison (GE Healthcare), Sonovue (Bracco Spa.), Definity (Lantheus Medical Imagin), Micromarker (VisualSonics Inc.) y Polyson L (Miltenyi Biotec GmbH).
En el presente documento, el término microburbuja HEPS/PFS se utiliza para describir las microburbujas formadas al reconstituir el primer componente (véase el ejemplo 1) con 2 ml de agua.
En el presente documento, las expresiones “burbujas de cambio de fase”, “burbujas de cambio de fase grandes”, “burbujas activadas grandes” y “burbujas activadas” se utilizan para describir las burbujas grandes (> 10 μm) que se forman después de la activación inducida por US de la composición de agrupaciones.
En el presente documento, el término “microgota” se utiliza para describir microgotas de emulsión con un diámetro en el intervalo de 0,2 a 10 micras.
En el presente documento, el término “emulsión” se utiliza para describir una suspensión o dispersión acuosa de microburbujas.
En el presente documento, el término “surfactante” se utiliza para compuestos químicos que reducen la tensión superficial entre dos líquidos, por ejemplo, se utiliza como estabilizante en una dispersión de microgotas, o un gas y un líquido, por ejemplo, se utiliza como estabilizante en una dispersión de microburbujas.
En el presente documento, el término “nanopartícula” se utiliza para describir partículas con dimensiones lineales inferiores a 200 nm.
“Insonación” o “irradiación con US” son términos que se utilizan para describir la exposición a ultrasonidos o el tratamiento con los mismos.
En el presente documento, la expresión “rastreador de depósito” se utiliza en relación con las burbujas de cambio de fase activadas, en el sentido de que el atrapamiento mecánico temporal de las burbujas grandes en la microcirculación implica que la deposición regional de burbujas de cambio de fase en el tejido reflejará la cantidad de sangre que fluye a través de la microcirculación del tejido en el momento de la deposición de burbujas activadas. De este modo, el número de burbujas de cambio de fase “depositadas” atrapadas dependerá linealmente de la perfusión del tejido en el momento de la deposición.
En el presente documento, las expresiones “cambio de fase” o “proceso de cambio de fase” se utilizan para describir la transición de fase del estado líquido al estado gaseoso de la materia. Específicamente, la transición o proceso del cambio de estado de líquido a gas del componente oleoso de las microgotas de la composición de agrupaciones. El término “bifásico” se refiere a un sistema que comprende dos estados de fase, específicamente estados líquido y gaseoso, tales como los componentes de microburbujas (gas) y microgotas (líquido) de la composición de agrupaciones.
En el presente documento, se entiende que las expresiones “administración terapéutica/agente o agentes terapéuticos” y “administración de uno o más fármacos” incluyen la administración de moléculas farmacológicas, nanopartículas y sistemas de administración de nanopartículas, genes y radioisótopos.
En el presente documento, la expresión “primer componente” se utiliza para describir el componente de gas disperso (microburbuja).
En el presente documento, la expresión “segundo componente” se utiliza para describir el componente de fase oleosa dispersa (microgota) que comprende un componente difusible.
En el presente documento, la expresión “composición de agrupaciones” se utiliza para describir la composición que resulta de una combinación del primer componente (microburbuja) y el segundo componente (microgota).
En el presente documento, la expresión “componente difusible” se utiliza para describir un componente químico de la fase oleosa del segundo componente que es capaz de difundirse in vivo en las microburbujas del primer componente, aumentando transitoriamente su tamaño.
En el presente documento, la expresión “capacidad de carga” se utiliza para describir la cantidad o capacidad del fármaco que se puede incorporar en el vehículo de administración del fármaco.
En el presente documento, la expresión utilizada “composición farmacéutica” tiene su significado convencional y, en particular, está en una forma adecuada para la administración a mamíferos, especialmente mediante inyección parenteral. Por la expresión “en una forma adecuada para la administración a mamíferos” se entiende una composición que es estéril, libre de pirógenos, carece de compuestos que producen efectos tóxicos o adversos excesivos y está formulada a un pH biocompatible (aproximadamente, pH 4,0 a 10,5). Esta composición está formulada de modo que no se produzca precipitación al contacto con fluidos biológicos (por ejemplo, sangre), contiene sólo excipientes biológicamente compatibles y es, preferentemente, isotónica.
En el presente documento, el término o la expresión “Sonometría o sistema de sonometría” se refiere a un sistema de medición para dimensionar y contar burbujas de cambio de fase activadas dinámicamente utilizando una técnica acústica.
En el presente documento, el término “reactividad” se utiliza para describir la capacidad de las microburbujas en el primer componente y las microgotas en el segundo componente para formar agrupaciones de microburbujas/microgotas al mezclarse.
En el presente documento, la expresión “agrupación de microburbujas/microgotas” o el término “agrupación” se refieren a grupos de microburbujas y microgotas unidas de manera permanente por fuerzas de atracción electrostática, en una sola entidad aglomerada de partículas.
En el presente documento, el término “agrupamiento” se refiere al proceso en el que las microburbujas del primer componente y las microgotas del segundo componente forman agrupaciones.
En el presente documento, el término “activación” se refiere a la inducción de un cambio de fase de las agrupaciones de microburbujas/microgotas mediante irradiación con US.
Abreviaturas
Hd: distancia de Hansen.
ADV: vaporización acústica de microgotas (acoustic microdroplet vaporisation).
ANOVA: análisis de varianza
u. a.: unidades arbitrarias
p. eb.: punto de ebullición.
p. c.: peso corporal
C: circularidad.
C1: primer componente
C2: segundo componente
dCldFEt: diclorodifluoroetano.
CltFPr: clorotrifluoropropano.
COO: gasto cardíaco continuo (continuous cardiac output)
CV: validación cruzada (cross validation).
dB: decibelio.
dClMe: diclorometano.
DiR: colorante fluorescente del infrarrojo cercano (near infrared fluorescent dye)
DP: composición de agrupaciones o composición farmacéutica
DSPC: 1,2-diestearoil-sn-glicerol-3-fosfocolina.
p. ej.: por ejemplo
FPIA: Análisis de imágenes de partículas de flujo (flow Particle Image Analysis).
HEPS: Fosfatidilserina sódica hidrogenada de huevo (hydrogenated egg sodium-phosphatidyl serine).
HIFU: ultrasonidos focalizados de alta intensidad (high intensity focused ultrasound).
i.v: intravenoso.
LogP: logaritmo (en base 10) del coeficiente de partición (octanol/agua), una medida de la lipofilia.
LogS: logaritmo (en base 10) de la solubilidad acuosa en g/100 ml
M: molar
MI: MI.
NA: no aplicable.
NR: colorante fluorescente rojo Nilo (nile Red).
PBS: solución salina tamponada con fosfato (phosphate buffered satine).
PCA: análisis de componentes principales (principal component analysis)
PFS: perfluorobutano.
pFMCP: perfluorometil-ciclopentano
PLSR: regresión de mínimos cuadrados parciales (partial least squares regression).
QC: control de calidad (quality control).
R: reactividad de la composición de agrupaciones.
SA: estearilamina
tClMe: triclorometano.
TIC: curva de intensidad frente al tiempo (time intensity curve)
TRIS: 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol.
US: Ultrasonidos.
p. v.: Presión de vapor.
v/v: volumen por volumen.
~: aproximado.
Características de la invención
Los inventores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, se puede conseguir la administración de fármacos mediante la utilización de un sistema de formulación de microburbujas/microgotas bifásico de dos componentes, en el que las microburbujas en un primer componente, a través de la atracción electrostática, se unen físicamente a microgotas de emulsión de tamaño micrométrico en un segundo componente antes de la administración. Contrariamente a las enseñanzas de la Patente WO 99/53963, los inventores de la presente invención han descubierto que mezclar el primer componente con el segundo componente antes de la administración es un requisito previo para la formación eficiente de dichas agrupaciones de microburbujas/microgotas y que la composición de agrupaciones puede ser estable en condiciones ambientales. Las agrupaciones se activan fácilmente in vivo con ultrasonidos de baja potencia (es decir, con un MI de menos de 1,9, preferentemente, menos de 0,7 y, de la manera más preferente, menos de 0,4), que inducen una transición de líquido a gas (cambio de fase) del componente difusible. Se puede añadir un agente terapéutico a la fase oleosa de microgotas y/o se puede coadministrar como una formulación de fármaco normal. Las burbujas activadas grandes se retienen temporalmente en la microvasculatura y se pueden utilizar para facilitar la absorción del fármaco en el tejido diana mediante la aplicación adicional de ultrasonidos.
La tecnología de administración de fármacos, según la presente invención, difiere notablemente de las tecnologías de administración de fármacos mediadas por ultrasonidos existentes y de la técnica anterior descritas anteriormente. Las principales mejoras/elementos novedosos frente a los enfoques estándar de microburbujas son:
• Un aumento destacado en la capacidad de carga del fármaco, en el que se puede utilizar todo el volumen de una microgota de emulsión grande (de tamaño micrométrico) para la carga útil del fármaco, en comparación con solo la delgada membrana estabilizante del componente de microburbujas para los enfoques de la técnica anterior.
• El tamaño de las burbujas de cambio de fase activadas es, aproximadamente, 10 veces más grandes que las microburbujas habituales; atrapamiento de las burbujas activadas en la microvasculatura; interrupción transitoria del flujo sanguíneo, lo que evita una depuración rápida del fármaco; contacto cercano entre las burbujas activadas y el endotelio; efectos biológicos de órdenes de magnitud mayores durante el tratamiento con US después dela activación, lo que evita los mecanismos de cavitación
Las principales mejoras/elementos novedosos frente a los enfoques de vaporización acústica de microgotas (ADV) son:
• Se requiere una potencia acústica significativamente menor para producir el evento de cambio de fase; normalmente, se requiere un MI de 0,2 a 0,4 para la presente invención frente a > 4, normalmente, para ADV.
• Vida útil significativamente más larga de las burbujas activadas, sin recondensación rápida;
• Activación en el compartimento vascular frente a activación en tejido.
• El tamaño de las burbujas de cambio de fase activadas es, aproximadamente, 10 veces más grandes que las microburbujas habituales de ADV; captura de las burbujas activadas, lo que evita una depuración rápida del fármaco; contacto cercano entre las burbujas activadas y el endotelio; efectos biológicos de órdenes de magnitud mayores durante el tratamiento con USA después de la activación, lo que evita los mecanismos de cavitación.
Las principales mejoras/elementos novedosos frente a los enfoques de cambio de fase descritos en las Patentes WO 98/1732 y WO 99/53963 son:
• La formación de agrupaciones estables de microburbujas/microgotas en una única composición de agrupaciones combinadas antes de la administración, con un aumento resultante de ~ 10 veces en la capacidad de depósito. • Un aumento destacado en la capacidad de carga del fármaco en el que se puede utilizar todo el volumen de una microgota de emulsión grande (de tamaño micrométrico) para la carga útil del fármaco, en comparación con solo la delgada membrana estabilizante del componente de microburbujas.
• La aplicación continua de energía acústica, posterior a la activación, para facilitar la administración de fármacos. Ahora, se ha identificado una composición de agrupaciones, una composición farmacéutica para la administración de fármacos y un procedimiento de administración que utiliza la tecnología de cambio de fase de la presente invención para generar burbujas de cambio de fase grandes in vivo a partir de una composición administrada que contiene agrupaciones de microburbujas/microgotas, y que facilita la administración de uno o más agentes terapéuticos asociados y/o preadministrados y/o coadministrados y/o administrados posteriormente.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención da a conocer una composición de agrupaciones que comprende una suspensión de agrupaciones en un medio acuoso biocompatible, en la que dichas agrupaciones tienen un diámetro en el intervalo de 1 a 10 pmi y una circularidad ≤ 0,9 y comprenden:
(i) un primer componente que comprende una microburbuja de gas y un primer estabilizante para estabilizar dicha microburbuja, y
(ii) un segundo componente que comprende una microgota, que comprende una fase oleosa y un segundo estabilizante para estabilizar dicha microgota, en el que el aceite comprende un componente difusible capaz de difundirse en dicha microburbuja de gas para aumentar, como mínimo, de manera transitoria, el tamaño de la misma, en el que dicho segundo componente comprende opcionalmente, además, un primer agente terapéutico; en la que las microburbujas y las microgotas de dichos primer y segundo componentes tienen cargas superficiales opuestas y forman dichas agrupaciones a través de interacciones electrostáticas atractivas.
La composición de agrupaciones, es decir, la combinación del primer y segundo componentes comprende agrupaciones de microburbujas de gas y microgotas de aceite, es decir, es una suspensión o dispersión de microburbujas y microgotas individuales junto con agrupaciones estables de microburbujas/microgotas. La composición de agrupaciones está destinada a la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) a un individuo mamífero. Las metodologías analíticas para la detección y caracterización cuantitativa de dichas agrupaciones se describen en el ejemplo 1.
En el presente documento, el término “agrupaciones” se refiere a agrupaciones de microburbujas y microgotas unidas de manera permanente mediante fuerzas de atracción electrostática, en una sola entidad aglomerada de partículas. El contenido y el tamaño de las agrupaciones en la composición de agrupaciones es esencialmente estable durante algún tiempo (por ejemplo, > 1 hora) después de combinar el primer y el segundo componentes in vitro, es decir, no se desintegran espontáneamente, no forman agregados más grandes ni se activan (cambios de fase) de manera espontánea, y son esencialmente estables durante algún tiempo después de la dilución, incluso durante la agitación continua. De esta manera, es posible detectar y caracterizar las agrupaciones en la composición de agrupaciones con diversas técnicas analíticas que requieren dilución y/o agitación.
Las agrupaciones normalmente contienen, como mínimo, una microburbuja y una microgota, normalmente de 2 a 50 microburbujas/microgotas individuales, normalmente, tienen un diámetro de 1 a 10 pmi y, de esta manera, pueden fluir libremente en la vasculatura. Además, se caracterizan y distinguen de microburbujas y microgotas individuales mediante un parámetro de circularidad. La circularidad de una forma bidimensional (por ejemplo, una proyección de una microburbuja, microgota o agrupación de microburbuja/microgota) es la proporción del perímetro de un círculo con la misma área que la forma, dividido por el perímetro real de la forma. Se utilizan diversos algoritmos matemáticos para calcular y reportar la circularidad. Normalmente, para proporcionar una respuesta que sea sensible a pequeñas desviaciones de una forma circular perfecta, se calcula y reporta la circularidad cuadrática (también denominada “circularidad de alta sensibilidad”). Este término (C) tiene su significado convencional en el sector del análisis de imágenes [Wojnar, L. et al., Practical Guide to Image Analysis, ASM International, 2000, págs.
157-160] y es una definición matemática de redondez en dos dimensiones, expresada como:
C = 4nA / P
En la que A es el área de la proyección bidimensional de la forma y P es el perímetro de la proyección bidimensional de la forma. En consecuencia, un círculo perfecto (es decir, una proyección bidimensional de una microburbuja o microgota esférica) tiene un valor de circularidad teórico de 1, y cualquier otra forma geométrica (por ejemplo, la proyección de una agrupación) tiene una circularidad inferior a 1. En el presente documento, se utiliza la circularidad (C) tal como se ha definido anteriormente.
Tal como se ha señalado, contrariamente a las enseñanzas de la Patente WO 99/53963, los inventores de la presente invención han descubierto que mezclar el primer componente con el segundo componente antes de la administración es un requisito previo para la formación eficiente de dichas agrupaciones de microburbujas/microgotas y que la composición de agrupaciones puede ser estable en condiciones ambientales. Además, los inventores de la presente invención han descubierto que es la forma agrupada de las microburbujas y las microgotas en la composición de agrupaciones la que permite una activación eficaz (cambio de fase) y depósito de las burbujas activadas in vivo en la vasculatura. Tal como se detalla en los ejemplos 1 y 2, se ha descubierto también que la ingeniería de diversos aspectos de las agrupaciones de la presente invención, su concentración y tamaño en particular, se puede conseguir un aumento de ~10 veces en la capacidad de depósito y administración del fármaco, en comparación con la coadministración simultánea de los dos componentes separados de microburbujas y microgotas.
Según la presente invención, las agrupaciones en el intervalo de tamaño de 1-10 pmi definidas por una circularidad de ≤ 0,9 se consideran particularmente útiles, tal como se demuestra en los ejemplos 2 y 5-1. Las agrupaciones en este intervalo de tamaño fluyen libremente en la vasculatura antes de la activación, se activan fácilmente mediante la irradiación con US y producen burbujas activadas que son lo suficientemente grandes para depositarse y alojarse temporalmente en la microvasculatura.
Se ha descubierto que la presencia de microburbujas en las agrupaciones permite una transferencia de energía eficaz de la energía de ultrasonidos en el intervalo de frecuencias de diagnóstico (1-10 MHz), es decir, la activación, y permite la vaporización (cambio de fase) de las microgotas de la emulsión a un MI bajo (por debajo de 1,9 y, preferentemente, por debajo de 0,7 y, más preferentemente, por debajo de 0,4) y una difusión del líquido vaporizado en las microburbujas y/o fusión entre la burbuja de vapor y la microburbuja. A continuación, la burbuja activada se expande adicionalmente desde la difusión hacia el interior de los gases de la matriz (por ejemplo, gases de la sangre) para alcanzar un diámetro de más de 10 μml, preferentemente, más de 20 pmi. Los mecanismos exactos involucrados durante la activación de las agrupaciones y la generación de burbujas de cambio de fase necesitan investigación y elucidación adicional.
Además, se ha descubierto que la formación de estas agrupaciones es un requisito previo para un evento de cambio de fase eficiente y que sus características de número y tamaño están fuertemente relacionadas con la eficacia de la composición, es decir, su capacidad para formar burbujas activadas grandes (es decir, con cambio de fase) in vivo. Las características de número y tamaño se pueden controlar a través de varios parámetros de formulación, tales como, pero sin limitarse a estos: la intensidad de las fuerzas de atracción entre las microburbujas en el primer componente y las microgotas en el segundo componente (por ejemplo, la diferencia en la carga superficial entre las microburbujas y las microgotas); la distribución de tamaños de las microburbujas y las microgotas; la proporción entre las microburbujas y las microgotas; y la composición de la matriz acuosa (por ejemplo, concentración de tampón, fuerza iónica) (véanse los ejemplos 1 y 2).
El tamaño de las burbujas activadas se puede diseñar variando la distribución de tamaño de las microgotas en la emulsión y las características de tamaño de las agrupaciones (véase el ejemplo 1). Las agrupaciones se activan para producir burbujas grandes mediante la aplicación de energía ultrasónica externa, tal como la de un sistema clínico de formación de imágenes por ultrasonidos, bajo el control de la formación de imágenes. Las burbujas de cambio de fase grandes producidas tienen normalmente un diámetro de 10 p.m o más (véanse los ejemplos 1, 2, 3 y 4). Bajos niveles de energía de MI, que están dentro de los límites de exposición de imágenes de diagnóstico (MI ≤ 1,9), son suficientes para activar las agrupaciones, lo que hace que la tecnología sea significativamente diferente de las otras tecnologías de transición de fase disponibles (por ejemplo, ADV).
Debido al gran tamaño de las burbujas activadas, se alojan temporalmente en la microvasculatura y pueden localizarse espacialmente en un tejido u órgano de interés mediante el depósito espacialmente localizado de la energía ultrasónica para activar las agrupaciones (véanse los ejemplos 4 y 7). Las burbujas activadas grandes producidas (10 pmi o más de diámetro) tienen resonancias acústicas a una frecuencia ultrasónica baja (1 MHz o menos). Se ha descubierto que la aplicación de ultrasonidos de baja frecuencia, cerca de las frecuencias de resonancia de las burbujas activadas grandes (es decir, componentes de frecuencia en el intervalo de 0,05 a 2 MHz, preferentemente, en el intervalo de 0,1 a 1,5 MHz, de la manera más preferente, en el intervalo de 0,2 a 1 MHz), se puede utilizar para producir mecanismos de efectos biológicos mecánicos y/o térmicos para aumentar la permeabilidad local de la vasculatura y/o la sonoporación y/o la endocitosis y, de esta manera, aumentar la administración y la retención de fármacos (véase el ejemplo 8).
Se entenderá que los mecanismos de administración durante esta irradiación con US serán sustancialmente diferentes de los inducidos cuando se aplica US a microburbujas normales que fluyen libremente, tales como agentes de contraste para imágenes de US. Mientras que las microburbujas de cambio de fase grandes están atrapadas en un segmento de los vasos sanguíneos y la superficie de las microburbujas está en estrecho contacto con el endotelio, las microburbujas de tamaño micrométrico fluyen libremente y (en promedio) están relativamente lejos de la pared del vaso (véase el ejemplo 4). Además, el volumen de una burbuja activada de la presente invención es normalmente 1.000 veces mayor que el de una microburbuja normal. A un MI igual, insonado a una frecuencia cercana a la resonancia para ambos tipos de burbujas (0,5 MHz para microburbujas de cambio de fase y 5 MHz para microburbujas de agente de contraste normales), se ha demostrado que el desplazamiento de volumen absoluto durante las oscilaciones es casi tres órdenes de magnitud mayor con las burbujas de cambio de fase que con una microburbuja de contraste normal. De esta manera, la insonación de burbujas de cambio de fase producirá niveles completamente diferentes de efectos biomecánicos, con un tamaño del efecto y una profundidad de penetración significativamente mayores que durante la insonación de microburbujas de contraste normales. Los efectos biológicos observados con microburbujas de contraste normales y de flujo libre probablemente dependan de los mecanismos de cavitación, con los consiguientes problemas de seguridad, tales como microhemorragia y daño vascular irreversible. Las burbujas de cambio de fase más grandes pueden oscilar de una manera más suave (MI más bajo, por ejemplo, ≤ 0,4), evitando los mecanismos de cavitación, pero induciendo aun suficiente trabajo mecánico para mejorar la captación del fármaco desde la vasculatura y hacia el tejido diana (véase el ejemplo 8).
La captura de las burbujas de cambio de fase grandes también actuará como un rastreador de depósito. Esto permite además la cuantificación del número de agrupaciones activadas y la perfusión del tejido, y permite la formación de imágenes con agente de contraste para la vasculatura tisular para identificar la extensión espacial de la patología a tratar (véase el ejemplo 7).
La composición de agrupaciones, es decir, que comprende la combinación del primer y segundo componentes, se compone de un sistema de micropartículas bifásico diseñado para agruparse y cambiar de fase de manera controlada. El fármaco se puede incorporar dentro de las microgotas de aceite del segundo componente de tamaño micrométrico y de bajo punto de ebullición, que se estabilizan, por ejemplo, con una membrana de fosfolípidos cargada positivamente. Antes de la administración, las microgotas de aceite cargadas con fármaco del segundo componente se mezclan con microburbujas de gas de tamaño micrométrico en el primer componente. Dichas microburbujas de gas pueden consistir, por ejemplo, sin limitarse a estos, en un núcleo de gas de compuesto perfluorocarbonado de baja solubilidad estabilizado con una membrana de fosfolípidos cargada negativamente.
Cuando se expone a los ultrasonidos (frecuencia e intensidad estándar de imágenes médicas) en la patología específica, la microburbuja transfiere energía acústica a las microgotas de aceite adheridas y actúa como una “semilla” para que el aceite experimente un cambio de fase de líquido a gas (vaporización). Durante este proceso, la carga de fármaco se libera de la fase oleosa o se expresa en la superficie de la burbuja activada. La burbuja resultante experimenta una rápida expansión inicial debido a la vaporización del aceite, seguida de una expansión más lenta debido a la difusión hacia el interior de los gases de la sangre, hasta, como mínimo, 10 pmi de diámetro o más, preferentemente, como mínimo, 20 p.m de diámetro o más, y bloquea temporalmente la microcirculación (metarteriola y red capilar), deteniendo transitoriamente el flujo sanguíneo durante, aproximadamente, 1 minuto o más, preferentemente, 2-3 minutos o más, de la manera más preferente, 3-6 minutos o más, manteniendo el fármaco liberado o expresado a concentración elevada y muy cerca de la patología diana (véanse los ejemplos 4 y 7).
De manera alternativa, si el agente terapéutico no se incorpora a la fase oleosa de la microgota de la emulsión, el agente terapéutico se puede administrar por separado, tal como coadministrar, preadministrar o administrar posteriormente con la composición de agrupaciones. En este caso, el agente terapéutico se puede administrar en cualquier forma conveniente para incluir, pero sin limitación a estas, formas inyectables u orales, por ejemplo, tal como una formulación normal de un fármaco, por ejemplo, Taxol, Gemzar u otros agentes quimioterapéuticos en el mercado. De manera alternativa, se puede incluir un agente terapéutico tanto en la fase oleosa como administrarse como una composición separada. La activación de la tecnología de cambio de fase produce burbujas de cambio de fase grandes que quedan atrapadas en el sitio de interés deteniendo temporalmente el flujo sanguíneo que contiene el agente terapéutico administrado por separado. La aplicación adicional de ultrasonidos después de la captura facilita la extravasación del fármaco al tejido diana.
El primer componente de la presente invención contiene microburbujas que son similares a los agentes de contraste para ultrasonidos convencionales que están en el mercado y están aprobados para su utilización en diversas aplicaciones clínicas, tales como Sonazoid, Optison, Definity o Sonovue, o agentes similares utilizados para una aplicación preclínica, tales como Micromarker y Polyson L. El primer componente es un medio acuoso inyectable que comprende gas disperso y material para estabilizar dicho gas. Cualquier gas biocompatible puede estar presente en la dispersión de gas, incluyendo el término “gas”, tal como se utiliza en el presente documento, cualquier sustancia (incluidas las mezclas) en forma gaseosa (incluido el vapor), como mínimo, parcialmente, por ejemplo, sustancial o completamente, a la temperatura normal del cuerpo humano de 37 °C. De este modo, el gas puede comprender, por ejemplo, aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; un gas inerte, tal como helio, argón, xenón o criptón; un fluoruro de azufre, tal como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de disulfuro o pentafluoruro de trifluorometilazufre; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado, tal como metilsilano o dimetilsilano; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, que contiene hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo, un alcano, tal como metano, etano, propano, butano o pentano, un cicloalcano, tal como ciclopropano, ciclobutano o ciclopentano, un alqueno, tal como etileno, propeno, propadieno o buteno, o un alquino, tal como acetileno o propino; un éter, tal como éter dimetílico; una cetona; un éster; un hidrocarburo halogenado de bajo peso molecular (por ejemplo, que contiene hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. De manera ventajosa, como mínimo, algunos de los átomos de halógeno en los gases halogenados son átomos de flúor; de este modo, los gases de hidrocarburos halogenados biocompatibles se pueden seleccionar, por ejemplo, entre bromoclorodifluorometano, clorodifluorometano, diclorodifluorometano, bromotrifluorometano, clorotrifluorometano, cloropentafluoroetano, diclorotetrafluoroetano, clorotrifluoroetileno, fluoroetileno, fluoruro de etilo, 1,1-difluoroetano y compuestos perfluorocarbonados. Entre los compuestos perfluorocarbonados representativos se incluyen perfluoroalcanos, tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (por ejemplo, perfluoro-n-butano, opcionalmente mezclado con otros isómeros, tales como perfluoro-iso-butano), perfluoropentanos, perfluorohexanos o perfluoroheptanos; perfluoroalquenos, tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (por ejemplo, perfluorobut-2-eno), perfluorobutadieno, perfluoropentenos (por ejemplo, perfluoropent-1-eno) o perfluoro-4-metilpent-2-eno; perfluoroalquinos, tales como perfluorobut-2-ino y perfluorocicloalcanos, tales como perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano o perfluorocicloheptano. Entre otros gases halogenados se incluyen cloruro de metilo, cetonas fluoradas (por ejemplo, perfluoradas), tales como perfluoroacetona y éteres fluorados (por ejemplo, perfluorados), tales como éter perfluorodietílico.
La utilización de gases perfluorados, por ejemplo, hexafluoruro de azufre y compuestos perfluorocarbonados, tales como perfluoropropano, perfluorobutanos, perfluoropentanos y perfluorohexanos, es particularmente ventajosa en vistas de la reconocida elevada estabilidad en el torrente sanguíneo de microburbujas que contienen estos gases. También pueden ser útiles otros gases con características fisicoquímicas que les hagan formar microburbujas muy estables en el torrente sanguíneo. De la manera más preferente, el gas disperso comprende hexafluoruro de azufre, perfluoropropano, perfluorobutano, perfluoropentano, perfluorohexano, nitrógeno, aire o una mezcla de los mismos.
El gas disperso puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, utilizando cualquier formulación adecuada de agente de contraste para ultrasonidos que contenga gas, como componente que contiene gas, tal como Sonazoid, Optison, Sonovue o Definity, o agentes preclínicos, tales como Micromarker o PolySon L. El primer componente también contendrá material para estabilizar la dispersión de microburbujas, denominado en el presente documento “primer estabilizante”. Entre los ejemplos representativos de estas formulaciones se incluyen microburbujas de gas estabilizadas (por ejemplo, como mínimo, parcialmente encapsuladas) mediante un primer estabilizante, tal como una membrana superficial resistente a la coalescencia (por ejemplo, gelatina), una proteína filmógena (por ejemplo, una albúmina, tal como la albúmina de suero humano), un material polimérico (por ejemplo, un polímero biodegradable sintético, una membrana polimérica sintética interfacial elástica, un polialdehído biodegradable en micropartículas, un ácido N-dicarboxílico en micropartículas derivado de un poliaminoácido - imida policíclica), un material no polimérico y no polimerizable que forma la pared o un surfactante (por ejemplo, un surfactante de copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, tal como Pluronic, un surfactante polimérico o un surfactante formador de película, tal como un fosfolípido). Preferentemente, el gas disperso está en forma de microburbujas de gas estabilizadas con fosfolípidos, proteínas o polímeros. Entre los surfactantes particularmente útiles se incluyen fosfolípidos que comprenden moléculas con carga negativa total neta, tales como fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y/o cardiolipinas naturales (por ejemplo, derivados de la yema de huevo o soja), semisintéticos (por ejemplo, hidrogenados parcial o totalmente) y sintéticos. De manera alternativa, los fosfolípidos aplicados para la estabilización pueden portar una carga global neutra y añadirse un surfactante negativo, tal como un ácido graso, por ejemplo, ácido palmítico añadido a fosfatidilcolina, o ser una mezcla de fosfolípidos con diferente carga, por ejemplo, fosfatidiletanolaminas y/o fosfatidilcolina y/o ácido fosfatídico.
El tamaño de las microburbujas del componente de gas disperso destinado a la inyección intravenosa debe ser, preferentemente, inferior a 7 μm, más preferentemente, inferior a 5 μm y, de la manera más preferente, inferior a 3 μm para facilitar el paso sin obstáculos a través del sistema pulmonar, incluso cuando se encuentra en una agrupación de microburbujas/microgotas.
Para el segundo componente, el “componente difusible” es adecuadamente un gas/vapor, un líquido volátil, un sólido volátil o un precursor del mismo capaz de generar gas, por ejemplo, tras la administración, siendo el requisito principal que el componente deba tener o ser capaz de generar una presión de gas o vapor suficiente in vivo (por ejemplo, como mínimo, 50 torr y, preferentemente, más de 100 torr) para poder promover la difusión hacia el interior de las moléculas de gas o vapor en el gas disperso. El “componente difusible” se formula, preferentemente, como una emulsión (es decir, una suspensión estabilizada) de microgotas en un medio acuoso apropiado, ya que en estos sistemas la presión de vapor en la fase acuosa del componente difusible será sustancialmente igual a la del componente puro, incluso en emulsiones muy diluidas.
El componente difusible en dichas microgotas es, de manera ventajosa, un líquido a la temperatura de procesamiento y almacenamiento, que puede ser, por ejemplo, tan baja como -10 °C, si la fase acuosa contiene un material anticongelante adecuado, siendo un gas o mostrando una presión de vapor sustancial a la temperatura corporal. Los compuestos apropiados se pueden seleccionar, por ejemplo, entre las diversas listas de líquidos emulsionables de bajo punto de ebullición indicadas en la Patente w O-A-9416379, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. Entre los ejemplos específicos de componentes emulsionables y difusibles se incluyen éteres alifáticos, tales como dietil éter; aceites o alcoholes policíclicos, tales como mentol, alcanfor o eucaliptol; compuestos heterocíclicos, tales como furano o dioxano; hidrocarburos alifáticos, que pueden ser saturados o insaturados y de cadena lineal o ramificada, por ejemplo, como en n-butano, n-pentano, 2-metilpropano, 2-metilbutano, 2,2-dimetilpropano, 2,2-dimetilbutano, 2,3-dimetilbutano, 1-buteno, 2-buteno, 2-metilpropeno, 1,2-butadieno, 1,3-butadieno, 2-metil-1-buteno, 2-metil-2-buteno, isopreno, 1-penteno, 1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, butenino, 1-butino, 2-butino o 1,3-butadiino; hidrocarburos cicloalifáticos, tales como ciclobutano, ciclobuteno, metilciclopropano o ciclopentano; e hidrocarburos halogenados de bajo peso molecular (por ejemplo, que contienen hasta 7 átomos de carbono). Entre los hidrocarburos halogenados representativos se incluyen diclorometano, bromuro de metilo, 1,2-dicloroetileno, 1,1-dicloroetano, 1-bromoetileno, 1-cloroetileno, bromuro de etilo, cloruro de etilo, 1-cloropropeno, 3-cloropropeno, 1-cloropropano, 2-cloropropano y cloruro de t-butilo. De manera ventajosa, como mínimo, algunos de los átomos de halógeno son átomos de flúor, por ejemplo, tal como en diclorofluorometano, triclorofluorometano, 1,2-dicloro-1,2-difluoroetano, 1,2-dicloro-1,1,2,2-tetrafluoroetano, 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano, 2-bromo-2-cloro-1,1,1-trifluoroetano, 2-cloro-1, 1,2-trifluoroetil difluorometil éter, 1-cloro-2,2,2-trifluoroetil difluorometil éter, alcanos parcialmente fluorados (por ejemplo, pentafluoropropanos, tales como 1H,1H,3H-pentafluoropropano, hexafluorobutanos, nonafluorobutanos, tales como 2H-nonafluoro-t-butano y decafluoropentanos, tales como 2H,3H-decafluoropentano), alquenos parcialmente fluorados (por ejemplo, heptafluoropentenos, tales como 1H,1H,2H-heptafluoropent-1-eno y nonafluorohexenos, tales como 1H,1H,2H-nonafluorohex-1-eno), éteres fluorados (por ejemplo, 2,2,3,3,3-pentafluoropropil metil éter o 2,2,3,3,3-pentafluoropropil difluorometil éter) y, más preferentemente, compuestos perfluorocarbonados. Entre los ejemplos de compuestos perfluorocarbonados se incluyen perfluoroalcanos, tales como perfluorobutanos, perfluoropentanos, perfluorohexanos (por ejemplo, perfluoro-2-metilpentano), perfluoroheptanos, perfluorooctanos, perfluorononanos y perfluorodecanos; perfluorocicloalcanos tales como perfluorociclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorociclopentano y perfluorometilciclopentano; perfluoroalquenos, tales como perfluorobutenos (por ejemplo, perfluorobut-2-eno o perfluorobuta-1,3-dieno), perfluoropentenos (por ejemplo, perfluoropent-1-eno) y perfluorohexenos (por ejemplo, perfluoro-2-metilpent-2-eno o perfluoro-4-metilpent-2-eno); perfluorocicloalquenos, tales como perfluorociclopenteno o perfluorociclopentadieno; y alcoholes perfluorados, tales como perfluoro-tbutanol.
En la presente invención, son particularmente útiles los componentes difusibles con una solubilidad acuosa por debajo de 1 ■ 10-4 M, más preferentemente, por debajo de 1 ■ 10-5 M (véase el ejemplo 5-3). Debe señalarse, sin embargo, que si se utiliza una mezcla de componentes difusibles y/o codisolventes, una fracción sustancial de la mezcla puede contener compuestos con mayor solubilidad en agua (véase el ejemplo 5-4).
Se entenderá que, si se desea, se pueden utilizar mezclas de dos o más componentes difusibles, según la presente invención; las referencias en el presente documento al “componente difusible” se deben interpretar como que incluyen dichas mezclas. También se entenderá que se pueden incorporar fármacos en el componente o componentes difusibles y que también se pueden utilizar codisolventes, descritos en el presente documento a continuación, para aumentar la capacidad de carga de fármacos del sistema.
El segundo componente también contendrá material para estabilizar la dispersión de microgotas, en el presente documento, denominado “segundo estabilizante”. El segundo estabilizante puede ser el mismo o diferente de cualquier material o materiales utilizados para estabilizar la dispersión de gas, por ejemplo, un surfactante, un polímero o una proteína. La naturaleza de cualquier material de este tipo puede afectar significativamente a factores, tales como la velocidad de crecimiento de la fase gaseosa dispersa. En general, puede ser útil una amplia gama de surfactantes, por ejemplo, se pueden seleccionar entre las amplias listas indicadas en la Patente e P-A-0727225, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. Entre los ejemplos representativos de surfactantes útiles se incluyen ácidos grasos (por ejemplo ácidos grasos saturados o insaturados de cadena lineal, por ejemplo, que contienen de 10 a 20 átomos de carbono) y ásteres de carbohidratos y triglicéridos de los mismos, fosfolípidos (por ejemplo, lecitina), fosfolípidos que contienen flúor, proteínas (por ejemplo, albúminas, tales como la albúmina sérica humana), polietilenglicoles y polímeros, tales como los surfactantes de copolímeros de bloques (por ejemplo, copolímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, tales como Pluronics, polímeros extendidos, tales como aciloxiacil polietilenglicoles, por ejemplo, 16-hexadecanoiloxi-hexadecanoato de polietilenglicol metil éter, por ejemplo, en el que el resto de polietilenglicol tiene un peso molecular de 2300, 5000 o 10000), y surfactantes que contienen flúor (por ejemplo, comercializados con los nombres comerciales Zonyl y Fluorad), o tal como se describe en la Patente WO-A-9639197, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. Entre los surfactantes particularmente útiles se incluyen fosfolípidos que comprenden moléculas con carga globalmente neutra, por ejemplo, diestearoil-sn-glicerol-fosfocolina.
Se entenderá que, para facilitar interacciones electrostáticas atractivas para conseguir la agrupación entre las microburbujas en el primer componente y las microgotas de emulsión en el segundo componente, estas deberían tener una carga superficial opuesta. De esta manera, si las microburbujas del primer componente tienen carga negativa, las microgotas del segundo componente deberían tener carga positiva, o viceversa. A efectos de facilitar una carga superficial adecuada para las microgotas de aceite, se puede añadir un surfactante catiónico a la estructura estabilizante. Se puede utilizar una amplia gama de sustancias catiónicas, por ejemplo, compuestos, como mínimo, algo hidrófobos y/o sustancialmente insolubles en agua que tienen un átomo de nitrógeno básico, por ejemplo, aminas y alcaloides primarios, secundarios o terciarios. Un surfactante catiónico particularmente útil es la estearilamina.
Se entenderá también que la mezcla del primer y segundo componentes se puede conseguir de diversas maneras dependiendo de la forma de los componentes; por ejemplo, mezcla de dos componentes líquidos, reconstitución de un componente en forma de polvo seco con un componente en forma líquida, mezcla de dos componentes en forma seca antes de la reconstitución con líquido (por ejemplo, agua para inyección o solución tampón). Además, se entenderá que otros componentes pueden influir en la capacidad de las microburbujas y las microgotas para formar agrupaciones tras mezclarlas, entre los que se incluyen, pero sin limitarse a estos; el nivel de carga superficial de las microburbujas/microgotas, la concentración de las microburbujas/microgotas en los dos componentes, el tamaño de las microburbujas/microgotas, la composición y concentración de iones, la composición y concentración de excipientes (por ejemplo, tampón o componentes de tonicidad) etc. (véase el ejemplo 1). Estas características de los componentes y la composición pueden influir también en el tamaño y la estabilidad (tanto in vitro como in vivo) de las agrupaciones generadas y pueden ser factores importantes que influyan en los atributos biológicos (por ejemplo, perfil de eficacia y seguridad). Se entiende también que no todas las microburbujas/microgotas en la composición de agrupaciones pueden estar presentes en forma agrupada, sino que una fracción sustancial de las microburbujas y/o microgotas pueden estar presentes conjuntamente en forma libre (no agrupada) junto con una población de agrupaciones de microburbujas/microgotas. Además, la forma en que se mezclan los dos componentes puede influir en estos aspectos, entre los que se incluyen, pero sin limitarse a estos; esfuerzo de cizalla aplicado durante la homogeneización (por ejemplo, homogeneización manual suave u homogeneización mecánica fuerte) e intervalo de tiempo para la homogeneización.
El tamaño de las microgotas del componente difusible disperso en las emulsiones destinadas a la inyección intravenosa debe ser, preferentemente, inferior a 7 μm, más preferentemente, inferior a 5 μm, de la manera más preferente, inferior a 3 μm y superior a 0,5 μm, más preferentemente, superior a 1 μm, a efectos de facilitar el paso sin obstáculos a través del sistema pulmonar, pero aun así retener un volumen que es suficiente para la carga de fármaco y la retención de burbujas activadas en la microvasculatura.
El crecimiento de la fase gaseosa dispersa in vivo puede ir acompañado, por ejemplo, de la expansión de cualquier material de encapsulación (cuando tenga suficiente flexibilidad) y/o de la extracción del exceso de surfactante del material administrado a las interfases gas-líquido en crecimiento. Sin embargo, es posible también que el estiramiento del material de encapsulación y/o la interacción del material con los ultrasonidos pueda aumentar sustancialmente su porosidad. Si bien hasta ahora se ha descubierto que esta alteración del material de encapsulación en muchos casos conduce a una rápida pérdida de ecogenicidad a través de la difusión hacia el exterior y la disolución del gas expuesto de este modo, se ha descubierto que, cuando se utilizan composiciones según la presente invención, el gas expuesto muestra una estabilidad sustancial. Si bien no se desea quedar limitado por cálculos teóricos, se cree que el gas expuesto, por ejemplo, en forma de microburbujas liberadas, se puede estabilizar, por ejemplo, contra el colapso de las microburbujas, mediante un entorno supersaturado generado por el componente difusible, que proporciona un gradiente de presión hacia el interior para contrarrestar la tendencia de difusión hacia el exterior del gas de las microburbujas. La superficie de gas expuesta, en virtud de la ausencia sustancial de material de encapsulación, puede hacer que las burbujas activadas muestren propiedades acústicas excepcionalmente favorables, tal como lo demuestra la elevada retrodispersión y la baja absorción de energía (por ejemplo, expresada por las elevadas proporciones de retrodispersión:atenuación) en frecuencias habituales de imágenes de diagnóstico; este efecto ecogénico puede continuar durante un período significativo, incluso durante la irradiación ultrasónica continua.
La resonancia acústica del componente de microburbujas de las agrupaciones está dentro del intervalo de frecuencias de diagnóstico (1-10 MHz) La activación de las agrupaciones se obtiene fácilmente con pulsos de imágenes de ultrasonidos de diagnóstico estándar utilizados, por ejemplo, en aplicaciones abdominales y cardíacas de ultrasonidos médicos convencionales, con índices mecánicos de intervalo medio a bajo (MI por debajo de 1,9 y, preferentemente, por debajo de 0,7 y, más preferentemente, por debajo de 0,4). La activación de las agrupaciones para el cambio de fase para producir burbujas de cambio de fase más grandes (10 μm o más de diámetro) se puede conseguir con un sistema de imágenes clínicas con una resolución espacial milimétrica utilizando pulsos de imágenes. Tras la activación, el aceite de la microgota se vaporiza, liberando el agente terapéutico (si se incluye) al fluido circundante en forma de fármaco libre, o como fármaco cristalizado o en forma de partículas o expresado en la superficie de la burbuja activada o asociado con la misma. Las burbujas activadas quedan atrapadas en la microvasculatura, lo que detiene temporalmente el flujo sanguíneo y mantiene el fármaco en la microvasculatura en una concentración elevada. La aplicación adicional de ultrasonidos después de la captura facilita los mecanismos de administración para aumentar la eficiencia de la administración del fármaco al tejido. Las agrupaciones no se activan con un MI bajo (por debajo del umbral de activación de la agrupación de, aproximadamente, 0,1) permitiendo que se obtengan imágenes de agente de contraste para ultrasonidos médico estándar, por ejemplo, para identificar la patología microvascular tumoral sin activación de las agrupaciones. La activación bajo el control de imágenes de ultrasonidos médicos, utilizando los pulsos de imágenes, permite la activación dirigida espacialmente de las agrupaciones en la región del tejido que está siendo interrogada por el campo de ultrasonidos. Después de la activación, las burbujas de cambio de fase grandes producidas quedan atrapadas temporalmente en la microvasculatura debido a su tamaño (10 μm o más de diámetro). Las burbujas de cambio de fase grandes resultantes son, aproximadamente, 1.000 veces el volumen de la microgota de la emulsión vaporizada (diámetro de burbuja de 30 μm de una microgota de aceite de 3 μm de diámetro). Las secciones transversales de dispersión de estas burbujas de cambio de fase grandes son de órdenes de magnitud mayores que las secciones transversales de dispersión de las microburbujas de tamaño micrométrico comprendidas en las agrupaciones antes de la activación. Como resultado, las burbujas de cambio de fase grandes producen una señal de retrodispersión copiosa y se visualizan fácilmente en el modo de formación de imágenes fundamental con sistemas de formación de imágenes de diagnóstico (véanse los ejemplos 2 y 7). Las frecuencias de resonancia mecánica de las burbujas de cambio de fase grandes también son de un orden de magnitud más bajas (1 MHz o menos) que las frecuencias de resonancia de las microburbujas comprendidas en las agrupaciones antes de la activación. La aplicación de campos acústicos acordes con las frecuencias de resonancia de las burbujas de cambio de fase grandes produce oscilaciones de radio relativamente grande a MI dentro del intervalo de diagnóstico médico. De este modo, se pueden aplicar ultrasonidos de baja frecuencia (de 0,05 a 2 MHz, preferentemente, de 0,1 a 1,5 MHz y, de la manera más preferente, de 0,2 a 1 MHz) para producir los mecanismos de los efectos biológicos que mejoran la captación del fármaco liberado o coadministrado. La explotación de los efectos de resonancia de las burbujas activadas permite un mejor control de la iniciación de estos efectos biológicos a intensidades acústicas más bajas y frecuencias más bajas de lo que es posible con otras tecnologías. Junto con el hecho de que las burbujas de cambio de fase grandes se activan y depositan en la microvasculatura tisular bajo el control de imágenes (lo que permite el direccionamiento espacial de las grandes burbujas activadas en el tejido) y su tiempo de residencia prolongado, se consigue una implementación más eficiente y controlada de los mecanismos de administración de fármacos. La frecuencia más baja y las potencias acústicas reducidas requeridas al utilizar las propiedades de resonancia de las burbujas de cambio de fase grandes depositadas tienen una gran ventaja potencial para abrir la barrera hematoencefálica. Los campos de frecuencia más baja reducen en gran medida los problemas de efectos térmicos que actualmente experimentan otros enfoques y la necesidad de eliminar el hueso del cráneo para evitar estos problemas.
El agente terapéutico, denominado también “el fármaco”, a administrar se puede seleccionar del grupo de moléculas farmacológicas, nanopartículas y sistemas de administración de nanopartículas, genes y radioisótopos. Este se disuelve o incorpora de otro modo (por ejemplo, se dispersa) en la fase oleosa del segundo componente, o se administra, de manera alternativa, como una composición separada. Entre los ejemplos de las clases de fármacos se incluyen, pero sin limitarse a estos, genes (para terapia génica), agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos (por ejemplo, para terapia contra el cáncer o terapia de trasplante de órganos), fármacos que producen angiogénesis, por ejemplo, para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, fármacos para atravesar la barrera hematoencefálica, por ejemplo, para tratar el cáncer o enfermedades neurológicas, tales como el Parkinson y el Alzheimer.
Para ejemplos de fármacos quimioterapéuticos se incluyen, pero sin limitarse a estos, las clases de fármacos: agentes alquilantes, tales como Ciclofosfamida, Mecloretamina, Clorambucilo, Melfalan; antraciclinas, tales como Daunorrubicina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, Mitoxantrona, Valrrubicina; disruptores del citoesqueleto (taxanos), tales como Paclitaxel y Docetaxel; epotilonas; inhibidores de histona desacetilasa, tales como Vorinostat, Romidepsina; inhibidores de la topoisomerasa I y II, tales como Irinotecan, Topotecan, Etopósido, Tenipósido, Taflupósido; inhibidores de cinasas, tales como Bortezomib, Erlotinib, Gefitinib, Imatinib, Vemurafenib, Vismodegib; anticuerpos monoclonales, tales como Bevacizumab, Cetuximab, Ipilimumab, Ofatumumab, Ocrelizumab, Panitumab, Rituximab; análogos de nucleótidos y análogos de precursores, tales como Azacitidina, Azatioprina, Capecitabina, Citarabina, Doxifluridina, Fluorouracilo, Gemcitabina, Hidroxiurea, Mercaptopurina, Metotrexato, Tioguanina; antibióticos peptídicos, tales como bleomicina, actinomicina; agentes a base de platino, tales como carboplatino, cisplatino, oxaliplatino; retinoides, tales como Tretinαna, Alitretinαna, Bexaroteno; alcaloides de la vinca y derivados, tales como Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina.
Tal como se indica en el ejemplo 5, en la presente invención son preferentes los fármacos hidrófobos con un LogS inferior a -2.
En una realización de la presente invención, el fármaco se disuelve en las microgotas de aceite que comprenden el componente difusible. Para disolver el fármaco en cantidad suficiente, por ejemplo, superior al 0,5 % en masa o, preferentemente, superior al 2 % en masa, se pueden añadir uno o más disolventes (codisolventes) al componente de aceite principal. La reactividad química de los disolventes debe ser, preferentemente, inerte, tales como, pero sin limitarse a estos, alcanos y éteres no sustituidos, compuestos fluorocarbonados hidrogenados (hFC) y alcanos perfluorados (pF) (pFC), pF-cicloalcanos, pF-éteres, fluoroéteres hidrogenados (hFE), pF-oxolanos, pF-furanos, pF-piranos, dietilsilano. Los codisolventes se deben restringir, preferentemente, a las clases IHC 2, 3 y 4, disolventes con bajo potencial tóxico y disolventes para los que no existen datos toxicológicos adecuados, tales como, pero sin limitarse a estos, acetona, etanol, acetato de etilo, 2-propanol, 1,1-dimetoximetano, éter isopropílico, ácido tricloroacético, etc. Entre otros ejemplos de disolventes potencialmente preferentes se incluyen, pero sin limitarse a estos, dimetilsulfóxido (DMSO), oxetano (óxido de trimetileno), 1-cloro-2-fluoroetano, dietilenglicol monoetil éter, dicloruro de metileno (diclorometano), tricloruro de metileno (triclorometano), 3-fluorooxetano, glucofurol, dicloroetileno, 1,3-difluoropropano, 2-cloro-1,1-difluoroetano, 1-cloro-2,2-difluoroetano, 1,2,2-tetrafluoroetil fluorometil éter, metil isopropil éter, 1-propanol, propilenglicol, 2-propanol, 1-pentanol, 1-butanol, 2-butanol, 1,3-butanodiol y alcohol isobutílico.
Para optimizar la capacidad de carga de fármaco, puede ser particularmente útil utilizar dos o más codisolventes de manera simultánea. Entre los codisolventes particularmente útiles se incluyen dicloruro de metileno, cloruro de metileno y 2-cloro-1,1-difluoroetano.
La señal acústica de las burbujas de cambio de fase grandes producidas tras la activación de la composición de agrupaciones en la ubicación espacial deseada se puede medir, normalmente con un sistema de imágenes de ultrasonidos médico, para cuantificar la cantidad de fármaco liberado por la composición y administrado a la región del tejido. La información acústica se registra e interpreta, por ejemplo, mediante algoritmos de software adecuados y procedimientos de soporte que utilizan procesamiento informático. De esta manera, en una realización de la presente invención se da a conocer un procedimiento de cuantificación de la cantidad de fármaco liberado mediante el análisis de la firma acústica producida por las burbujas de cambio de fase grandes liberadas por la activación de la tecnología de cambio de fase. De esta manera, la cantidad de fármaco administrado se cuantifica mediante el procesamiento de las firmas acústicas de las burbujas activadas grandes.
En otra realización, la presente invención da a conocer un procedimiento para la administración de fármacos como parte de un régimen de tratamiento multifármaco.
En aún otra realización, la presente invención da a conocer el procedimiento que incluye una etapa de utilizar modos de formación de imágenes con agente de contraste de MI bajo (MI ≤ 0,15) para obtener imágenes del componente de microburbujas, es decir, el gas disperso, sin activación de las agrupaciones, para identificar la región de patología para el tratamiento. De esta manera, dado que las agrupaciones no se activan con un MI bajo (por debajo del umbral de activación), se pueden obtener imágenes con agentes de contraste para ultrasonidos médicos estándar, antes de la etapa de activación, por ejemplo, para identificar la patología microvascular tumoral sin activación de las agrupaciones.
En otra aún realización, la presente invención da a conocer la utilización de las propiedades del rastreador de depósito de las burbujas activadas y la formación de imágenes por ultrasonidos para identificar la región patológica para el tratamiento y para cuantificar la perfusión. Además de la utilización de modos de formación de imágenes con agente de contraste de MI bajo para obtener imágenes del componente de microburbujas, sin activar las agrupaciones, para identificar la región de patología para el tratamiento, el procedimiento puede incluir la utilización de las propiedades de rastreador de depósito de las burbujas activadas para identificar la región de patología para el tratamiento y para cuantificar la perfusión.
En aún otra realización de la presente invención, se preadministra y/o coadministra y/o administra posteriormente un agente terapéutico. Se administra la composición de agrupaciones y se realiza la etapa de activación. La activación de la composición de agrupaciones produce burbujas de cambio de fase grandes que quedan atrapadas en el sitio de interés deteniendo temporalmente el flujo sanguíneo. La aplicación adicional de ultrasonidos después de la captura facilita los mecanismos biológicos, tales como el aumento de la permeabilidad de la vasculatura, aumentando, de esta manera, la captación y/o distribución y, por lo tanto, la eficacia del fármaco preadministrado y/o coadministrado y/o administrado posteriormente.
En aún otra realización de la presente invención, se administra un agente terapéutico cargado en las microgotas de emulsión en el segundo componente y como una composición separada.
En aún otra realización de la presente invención, la perfusión de la región del tejido que se está tratando se cuantifica mediante el procesamiento de las firmas acústicas de las burbujas activadas grandes.
En aún otra realización de la presente invención, la firma acústica de las burbujas de cambio de fase grandes se separa total o parcialmente de la firma acústica de la región del tejido mediante el procesamiento de las señales retrodispersadas y utilizarse para mejorar la cuantificación del fármaco administrado y/o la perfusión del tejido que se está tratando.
En aún otra realización de la presente invención, se aplican ultrasonidos de alta potencia (High Intensity Focused Ultrasound, HIFU) [Lukka, H. et al., Clinical Oncology 23 (2011) 117-127] a la región del tejido que contiene las burbujas activadas grandes. La presencia de burbujas de cambio de fase grandes aumenta la tasa local de suministro térmico utilizando tratamiento de hipertermia y/o ablación de tejido mediante ultrasonidos.
En aún otra realización de la presente invención, se aplican ultrasonidos de alta potencia a la región del tejido que contiene burbujas de cambio de fase grandes para lisar células, por ejemplo, células cancerosas, para invocar una respuesta inmunitaria sistémica al tejido canceroso.
De este modo, la composición de agrupaciones de la presente invención se puede utilizar como composición farmacéutica.
En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende
(i) la composición de agrupaciones, tal como se define según el primer aspecto
(ii) un segundo agente terapéutico opcional, proporcionado en una mezcla con (i) o como una composición separada de (i);
en la que dicha composición farmacéutica comprende, como mínimo, un agente terapéutico.
En una primera realización del segundo aspecto, el agente terapéutico no está presente en la composición de agrupaciones de la composición farmacéutica, sino que se proporciona como una composición separada.
En una segunda realización del segundo aspecto, un primer agente terapéutico está presente en la composición de agrupaciones de la composición farmacéutica, y está presente también un segundo agente terapéutico y se proporciona como una composición separada.
En un tercer aspecto, la presente invención da a conocer un agente de contraste para ultrasonidos que comprende la composición de agrupaciones, tal como se describe en el primer aspecto, o la composición farmacéutica descrita en el segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para administrar, como mínimo, un agente terapéutico al individuo mamífero, que comprende las etapas de:
(i) administrar la composición farmacéutica, tal como se define en el segundo aspecto, a un individuo mamífero; (ii) opcionalmente, obtener imágenes de las microburbujas de dicha composición farmacéutica utilizando imágenes de ultrasonidos para identificar la región de interés para el tratamiento dentro de dicho individuo;
(iii) activar un cambio de fase del componente difusible del segundo componente de la composición de agrupaciones de la etapa (i) mediante irradiación de ultrasonidos de una región de interés dentro de dicho individuo, de manera que:
(a) las microburbujas de dichas agrupaciones se agrandan mediante dicho componente difusible de la etapa (iii) para dar burbujas agrandadas que se localizan en dicha región de interés debido al bloqueo temporal de la microcirculación en dicha región de interés por dichas burbujas agrandadas; y
(b) dicha activación de la etapa (iii) facilita la extravasación del agente o agentes terapéuticos administrados en la etapa (i).
(iv) opcionalmente, facilitar la extravasación adicional del agente o agentes terapéuticos administrados en la etapa (i) mediante irradiación de ultrasonidos adicional.
En este contexto, en las etapas ii, iii y iv se pueden utilizar ultrasonidos de cualquier índice mecánico.
Sin embargo, en la etapa ii, es preferente un MI de ≤ 0,15, y en las etapas iii y iv es preferente un MI de ≤ 0,7. En este contexto, en las etapas ii, iii y iv se pueden utilizar ultrasonidos de cualquier frecuencia entre 0,05 y 30 MHz. Sin embargo, en las etapas ii y iii es preferente una frecuencia en el intervalo de 1-10 MHz, y en la etapa iv es preferente una frecuencia en el intervalo de 0,05-2 MHz.
Preferentemente, la composición farmacéutica se administra a dicho individuo mamífero por vía parenteral, preferentemente, por vía intravenosa. La vía de administración se podría seleccionar también entre la administración intraarterial, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. En un quinto aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento de tratamiento del individuo mamífero que comprende el procedimiento de administración, tal como se define en el cuarto aspecto.
La presente invención se refiere también a la utilización de la composición farmacéutica, según la presente invención, o al procedimiento de administración, según la presente invención, en el tratamiento de un individuo mamífero.
En un sexto aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento de tratamiento del individuo mamífero, que comprende administrar la composición de agrupaciones, según la presente invención, o la composición farmacéutica, según la presente invención, y la aplicación de Ultrasonidos Focalizados de Alta Intensidad (HIFU) a una región de interés.
En un séptimo aspecto, la presente invención da a conocer la utilización de la composición de agrupaciones, según la presente invención, o la composición farmacéutica, según la presente invención, como agente de contraste para ultrasonidos o medicamento. En un octavo aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento de obtención de imágenes mediante ultrasonidos, que comprende obtener imágenes de un individuo mamífero al que se ha administrado previamente el agente de contraste para ultrasonidos de la presente invención.
En los aspectos segundo a octavo, se pueden utilizar los mismos componentes y realizaciones que se describen en el primer aspecto.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos, que no constituyen limitación, sirven para ilustrar la presente invención. Para simplificar, en todos los ejemplos siguientes, el primer componente se designa como C1, el segundo componente se designa como C2 y la composición de agrupaciones, es decir, la composición que resulta de una combinación del primer y segundo componentes se designa como DP (Drugproduct, producto farmacéutico).
El ejemplo 1 proporciona descripciones de metodologías analíticas para la caracterización y cuantificación de agrupaciones de microburbujas/microgotas en el DP y explica las respuestas y atributos relevantes, entre los que se incluyen la concentración, el tamaño y la circularidad. Proporciona también detalles sobre la metodología analítica para la caracterización y cuantificación del tamaño y la concentración de las burbujas activadas. Además, se presentan datos sobre la estabilidad de las agrupaciones después de la preparación, así como una comparación de las características del DP premezclado frente al coinyectado. También detalla las etapas de ingeniería para las manipulaciones controladas del contenido y el tamaño de las agrupaciones en el DP.
El ejemplo 2 proporciona los resultados de dos estudios in vivo que dilucidan los efectos de las características de las agrupaciones sobre la eficacia del producto, tales como la capacidad de depositar burbujas activadas grandes en la microcirculación. Analiza más a fondo estos datos y concluye que las agrupaciones con un tamaño de entre 3 y 10 |om, definidas por una circularidad de menos de 0,9, están contribuyendo a la eficacia de la composición de agrupaciones. Compara también los resultados sobre la eficacia del producto con los resultados reportados en la Patente WO 99/53963 y muestra que la presente invención ofrece un aumento de 10 veces en la cantidad de burbujas de cambio de fase depositadas.
El ejemplo 3 proporciona los resultados de un estudio que demuestra el tamaño y la dinámica de las burbujas activadas in vivo. Confirma los resultados del análisis in vitro, mostrando un tamaño promedio de burbuja activada de, aproximadamente, 20 μm.
El ejemplo 4 proporciona los resultados de un estudio in vivo que demuestra la naturaleza de depósito de las burbujas activadas mediante microscopía intravital del tejido del mesenterio. Proporciona también cálculos teóricos sobre las oscilaciones de volumen de las burbujas activadas grandes tras la irradiación de US y las compara con las oscilaciones de volumen de las microburbujas de contraste normales. Concluye que las oscilaciones de volumen absoluto proporcionadas por las burbujas activadas grandes de la presente invención son tres órdenes de magnitud mayores que las microburbujas de contraste normales.
El ejemplo 5 proporciona resultados de varios estudios de formulación sobre C1 y C2. Muestra que el concepto enseñado por la presente invención es funcional cuando se utilizan formulaciones de microburbujas disponibles en el mercado; Sonazoid, Optison, Sonovue, Micromarker y Polyson como C1, lo que demuestra que se puede explorar una gama de componentes de microburbujas para su utilización en la presente invención. Los resultados de las composiciones de agrupaciones producidas con algunos de estos agentes demuestran que las agrupaciones pequeñas de hasta, aproximadamente, 1 μm de diámetro se pueden activar y, de esta manera, contribuir a la eficacia global de la composición. El ejemplo 5 investiga también una gama de componentes difusibles para su utilización en C2 y muestra que la activación espontánea al mezclar C1 y C2 se puede evitar utilizando hidrocarburos perfluorados de baja solubilidad en agua y también que la utilización de dichos compuestos aumenta la capacidad de formar burbujas de cambio de fase grandes tras la activación por US. Además, el ejemplo 5 proporciona datos de investigaciones sobre la carga de fármacos de C2 y la utilización de hidrocarburos parcialmente halogenados como codisolventes para facilitar dicha carga.
El ejemplo 6 proporciona resultados de microscopía de fluorescencia en burbujas activadas preparadas con C2 cargado con colorante de fluorescencia rojo Nilo. Demuestra que, después de la activación, la sustancia cargada se expresa de manera homogénea en la superficie de las burbujas activadas y, de esta manera, estará en estrecho contacto con la pared endotelial y será accesible para la extravasación.
El ejemplo 7 proporciona los resultados de un estudio de contraste de imágenes de US que demuestra la naturaleza de depósito de las burbujas activadas en un modelo de cáncer murino y compara sus características con las microburbujas de HEPS/p Fs normales (C1). Muestra que, tras la administración de DP y la activación posterior, las burbujas de cambio de fase grandes se depositan en la microcirculación tumoral y permanecen estacionarias durante varios minutos. No se observa ningún cambio en el nivel de contraste 1,5 minutos después de la activación. Por el contrario, las microburbujas de HEPS/PFS muestran un contraste de flujo libre que se lava rápidamente y regresa por completo a la línea base después de menos de 1 minuto.
El ejemplo 8 proporciona resultados de investigaciones de administración de compuestos coadministrados y cargados. En una primera cohorte de estudio, se muestra que la administración del DP con activación posterior seguida de irradiación con US aumenta la captación en el tejido muscular en un factor de 2. Utilizando procedimientos de irradiación de US idénticos, no se observó un aumento en la captación después de solamente la administración de microburbujas de HEPS/PFS (C1). Con el DP, la captación en el tumor aumentó en un factor de 2 tras la activación solamente y en un factor de 3,4 después de irradiación con US adicional. En una segunda cohorte de estudio, se demostró que la administración del DP con la activación posterior aumenta la captación del tumor (como aumento de la intensidad de la luminiscencia) de un colorante CW800 IR en, aproximadamente, el 30 % y que la irradiación con US adicional aumenta la captación del tumor en, aproximadamente, el 60 %. En una tercera cohorte de estudio, se investigó la administración del DP cargado con un colorante de fluorescencia DiR, la activación posterior y la irradiación adicional con US. Los resultados mostraron un aumento fuerte y significativo en la intensidad de la fluorescencia en el tejido tumoral tratado, lo que demuestra la liberación y la absorción del colorante de fluorescencia cargado en el componente C2.
El ejemplo 9 proporciona una descripción de la fabricación de C1 y C2. Tres lotes consecutivos de C1 y C2 pasaron las pruebas de esterilidad según la farmacopea (Ph. Eur./USP).
Descripción breve de las figuras
Figura 1 - Resultados de los análisis de recuentos de Coulter en el primer componente (microburbujas, línea de puntos), el segundo componente (microgotas, línea de puntos y rayas), la suma del primer y segundo componentes (línea de puntos y rayas) y la composición de agrupaciones (línea continua) para tres niveles de atracción electrostática entre la microburbuja en el primer componente y las microgotas en el segundo componente. El eje Y es la concentración numérica (u.a.), el eje X es el diámetro en μm. Atracción baja con el 1,5 % de SA (gráfico superior), atracción media con el 3 % de SA (gráfico medio) y atracción elevada con el 5 % de SA (gráfico inferior). Tal como se puede observar, la pérdida en el número total de partículas en el sistema (indicado por flechas blancas) aumenta desde insignificante al 1,5 % de SA, hasta más del 50 % al 5 % de SA. Además, la prolongación grande de la distribución de tamaños de la composición de agrupaciones (indicada por flechas negras) aumenta con el aumento de la atracción electrostática, lo que demuestra un mayor contenido de agrupaciones de microburbujas/microgotas.
Figura 2 - Resultados del análisis de imágenes de partículas de flujo sobre la composición de agrupaciones. Selección representativa de micrografías de partículas entre 5 y 10 μm que muestran agrupaciones de microburbujas/microgotas.
Figura 3 - Resultados de microscopía y análisis de imágenes en el primer componente (microburbujas, gráfico superior) y el segundo componente (microgotas, gráfico inferior). El panel de gráficos con el número 1 muestra la distribución de tamaño de microburbujas/microgotas, en el que el eje y es el número de detecciones y el eje x es el diámetro en μm. El panel de gráficos con el número 2 muestra la distribución de circularidad de microburbujas/microgotas, en el que el eje y es la circularidad y el eje x es el número de detecciones. El panel de gráficos con el número 3 muestra el gráfico de dispersión de tamaño (eje x) frente a circularidad (eje y), en el que cada detección se representa como un único punto en la matriz de tamaño/circularidad. El área sombreada en el panel de gráficos 3 designa detecciones > 3 μm con una circularidad ≤ 0,9. El panel derecho (grande) muestra una selección representativa de micrografías de detecciones individuales de microburbujas/microgotas. Tal como se puede observar en el gráfico superior, las microburbujas en el primer componente muestran una distribución de tamaños bastante estrecha con un diámetro promedio de, aproximadamente, 2,8 μm, así como una distribución de circularidad estrecha con una circularidad mediana de, aproximadamente, 0,98. Menos del 1 % de las detecciones están contenidas en el sector de diámetro > 3 μm y circularidad ≤ 0,9 y todas ellas son microburbujas individuales.
Tal como se puede observar en el gráfico inferior, las microgotas del segundo componente muestran una distribución de tamaño bastante estrecha con un diámetro mediano de, aproximadamente, 3,0 μm, así como una distribución de circularidad estrecha con una circularidad mediana de, aproximadamente, 0,96. Menos del 1 % de las detecciones están contenidas en el sector de diámetro > 3 μm y circularidad ≤ 0,9 y todas ellas son microgotas individuales.
Figura 4 - Resultados de microscopía y análisis de imágenes sobre la composición de agrupaciones, antes (gráfico superior) y después (gráfico inferior) de la activación del cambio de fase inducida por US. El panel de gráficos con el número 1 muestra la distribución de tamaño de las partículas detectadas, en el que el eje y es el número de detecciones y el eje x es el diámetro en μm. El panel de gráficos con el número 2 muestra la distribución de circularidad, en el que el eje y es la circularidad y el eje x es el número de detecciones. El panel de gráficos con el número 3 muestra el gráfico de dispersión de tamaños (eje x) frente a circularidad (eje y), en el que cada detección se representa como un único punto en la matriz de tamaño/circularidad. Gráfico superior, el área gris en el panel de gráfico 3 designa detecciones > 3 μm con una circularidad ≤ 0,9. Gráfico superior, panel derecho (grande) que muestra una selección representativa de micrografías de detecciones individuales en el sector de diámetro > 3 μm y circularidad ≤ 0,9. En comparación con la figura 3, las partículas en la composición de agrupaciones no activadas muestran una prolongación en el extremo largo de tamaños y una prolongación en el extremo inferior de circularidad, observadas como una cresta pronunciada en el diagrama de dispersión de tamaño frente a circularidad, lo que demuestra la presencia de agrupaciones de microburbujas/microgotas. Aproximadamente, el 6 % de las detecciones están contenidas en el sector de diámetro > 3 μm y circularidad ≤ 0,9. De estas, más del 95 % son agrupaciones de microburbujas/microgotas (es decir, menos del 5 % de microburbujas o microgotas individuales). Gráfico inferior, panel derecho (grande) que muestra una selección representativa de micrografías de detecciones individuales de las burbujas activadas grandes. Tal como se puede observar, tras la irradiación de US, las agrupaciones en la composición de agrupaciones cambian de fase para producir una población de burbujas de cambio de fase grandes contenidas entre, aproximadamente, 10 y 100 μm con un diámetro promedio de, aproximadamente, 20 μm.
Figura 5 - Las distribuciones de tamaño en número (superior) y circularidad (inferior) relativas de agrupaciones de microburbujas/microgotas aisladas de los resultados para la composición de agrupaciones que se muestra en la figura 4. Tal como se puede observar, las agrupaciones en la composición de agrupaciones tienen un diámetro de ~3 a -10 μm y se caracterizan por una circularidad de ≤ 0,9.
Figura 6 - Respuestas del análisis de sonometría. Gráfico izquierdo: fracción de volumen (eje y) en la celda de medición del sonómetro frente al tiempo (eje x) después de la activación. Gráfico de la derecha: diámetro promedio ponderado en volumen (A) y ponderado en número (B) (eje y) de las burbujas activadas frente al tiempo (eje x) después de la activación.
Figura 7 - Estabilidad de la composición de agrupaciones. Concentración de agrupaciones entre 5 y 10 μm del análisis FPIA (círculos abiertos, eje izquierdo) y volumen de burbujas activadas respecto a volumen de microgotas del análisis de sonometría (círculos rellenos, eje derecho) frente al tiempo después de la preparación.
Figura 8 - Diámetro promedio ponderado en volumen (eje y, μm) de las burbujas activadas del análisis de sonometría frente a la reactividad (eje x, %) de la composición de agrupaciones del análisis de Coulter.
Figura 9 - Eficacia de la composición de agrupaciones frente a la reactividad. El eje y muestra una mejora lineal en la señal de US del miocardio de perro (unidades de escala de grises) tras la administración i.v. de la composición de agrupaciones y activación en el ventrículo izquierdo. El eje X muestra la reactividad (%) de la composición de agrupaciones a partir del análisis de Coulter. Estos resultados demuestran una reactividad óptima entre el 30 y el 60 %.
Figura 10 - Tamaño de las agrupaciones en la composición de agrupaciones frente a la reactividad. El eje y muestra el contenido de agrupaciones en % del valor promedio observado para las clases de tamaño; ≤ 5 μm (línea de puntos), 5 a 10 μm (línea continua), 10 a 20 μm (línea de puntos y guiones) y 20 a 40 μm (línea de puntos y guiones). El eje x muestra la reactividad (%) de la composición de agrupaciones a partir del análisis de Coulter. Estos resultados demuestran el cambio hacia agrupaciones más grandes con mayor reactividad y el agotamiento de agrupaciones pequeñas y medianas con reactividad elevada.
Figura 11 - Eficacia de la composición de agrupaciones frente a la concentración de agrupaciones y el volumen de burbujas activadas. Figura de la izquierda; el eje y muestra una mejora lineal en la señal de US del miocardio de perro (unidades de escala de grises) tras la administración i.v. de la composición de agrupaciones y activación en el ventrículo izquierdo. El eje x muestra la concentración (millones/ml) de agrupaciones entre 5 y 10 μm en la composición de agrupaciones administrados a partir del análisis FPIA. Figura de la derecha; el eje y muestra una mejora lineal en la señal de US del miocardio de perro (unidades de escala de grises) tras la administración i.v. de la composición de agrupaciones y activación en el ventrículo izquierdo. El eje x muestra el volumen de la burbuja activada (μl/ml) en la composición de agrupaciones administrada a partir del análisis de sonometría. El área sombreada en ambas figuras indica el intervalo de aumento miocárdico informado en la Patente WO 99/53963.
Estos resultados demuestran que los parámetros in vitro investigados son buenos predictores de la eficacia de la composición, y que la eficacia de una composición de agrupaciones, tal como se enseña en la presente invención, ofrece un aumento de 10 veces en la eficacia frente a lo que se enseña en la Patente WO 99/53963.
Figura 12 - Resultados del análisis multivariable de componentes principales (PCA, principal component analysis) de la contribución de las agrupaciones en diversas clases de tamaño respecto la mejora lineal en la señal de US del miocardio de perro (unidades de escala de grises) tras la administración i.v. de la composición de agrupaciones y activación en el ventrículo izquierdo. El PCA se realizó sobre los datos de las 30 muestras detalladas en las tablas 7 y 8. Gráfico de la izquierda; el eje Y muestra el coeficiente de correlación calculado, es decir, la contribución al aumento miocárdico para clases de tamaño de agrupación (variables X) ≤ 5 μm, 5 a 10 μm, 10 a 20 μm y 20 a 40 μm. Gráfico de la derecha; el eje Y muestra la mejora miocárdica calculada (unidades GS) utilizando el modelo del gráfico de la izquierda y el eje X muestra la mejora miocárdica medida (unidades GS) para cada muestra (R=0,85). Estos resultados demuestran que las agrupaciones de tamaño pequeño y mediano (≤ 10 μm) contribuyen significativamente a la eficacia de la composición de las agrupaciones, mientras que las agrupaciones más grandes (> 10 μm) no lo hacen.
Figura 13 - Las distribuciones de tamaño numérico (superior) y circularidad (inferior) relativas de agrupaciones de microburbujas/microgotas aisladas a partir de los resultados para la composición de agrupaciones con una reactividad del 46 % (muestra número 3 de la tabla número 4). Tal como se puede observar, las agrupaciones en la composición de agrupaciones tienen un diámetro de ~3 a ~10 μm y se caracterizan por una circularidad de ≤0,9.
Figura 14 - Fracción de volumen (eje y, ppm) de burbujas activadas en sangre arterial frente al tiempo (eje x, segundos) después de la administración i.v. de una composición de agrupaciones y activación en la cámara del corazón.
Figura 15 - Micrografía superior izquierda muestra una imagen del mesenterio de rata 17 segundos después de la inyección y la activación de la composición de agrupaciones en el mesenterio con una burbuja de cambio de fase alojada temporalmente en la microvasculatura que bloquea el flujo sanguíneo. El área indicada por el cuadro rectangular discontinuo se muestra esquemáticamente en la ilustración (abajo a la izquierda). El contorno de la burbuja de cambio de fase se ha ampliado en un factor de 5. El contorno de la burbuja de cambio de fase está etiquetado como A con una barra de escala de 20 micras etiquetada como C. Una microburbuja de HEPS/PFS de 3 μm, etiquetada como B y mostrada a escala, es claramente lo suficientemente pequeña como para no bloquear el vaso sanguíneo de la misma manera que la burbuja de cambio de fase activada. (Arriba a la derecha) y (abajo a la derecha) muestran la misma región del mesenterio a los 5 minutos y 19 segundos y 5 minutos y 45 segundos después de la inyección, respectivamente. La burbuja de cambio de fase se encoge y se mueve intermitentemente por el árbol vascular antes de desprenderse por completo, siendo arrastrada por el flujo sanguíneo restablecido.
Figura 16 - Una burbuja de cambio de fase de 30 micras de diámetro etiquetada A y una microburbuja de HEPS/PFS de 3 micras de diámetro etiquetada B, a escala con una barra de escala de 10 micras. Se representan los diámetros mínimo y máximo de las respuestas simuladas a la insonación de US mediante líneas discontinuas de diámetro más pequeño y más grande, también dibujadas a escala. Existe un aumento de, aproximadamente, 3 órdenes de magnitud en el cambio absoluto de volumen debido a la insonación de la burbuja de cambio de fase en comparación con la microburbuja HEPS/PFS, lo que demuestra una diferencia fundamental en los efectos mecánicos sobre el tejido circundante entre estos dos tipos de burbujas.
Figura 17 - Efecto de la solubilidad en agua de la fase oleosa sobre el crecimiento de burbujas espontáneo y activado por US. Gráfico de la izquierda; el eje y muestra la puntuación del examen microscópico para la cantidad de burbujas de cambio de fase grandes formadas espontáneamente al mezclar el primer componente y el segundo componente (es decir, en la composición de agrupaciones) (0 = ninguna o muy poca cantidad de burbujas > 15 μm observadas, 1 = cantidad media de burbujas > 15 μm observadas y 2 = cantidad elevada de burbujas > 15 μm observadas). El eje x muestra la solubilidad molar en agua de la fase oleosa en el segundo componente. Gráfico de la derecha; el eje y muestra la puntuación del examen de microscopía para la cantidad de burbujas grandes formadas tras la activación por US de la composición de agrupaciones (0 = ninguna o muy poca cantidad de burbujas > 15 μm observadas, 1 = cantidad media de burbujas > 15 μm observadas y 2 = cantidad elevada de burbujas > 15 μm). El eje x muestra la solubilidad molar en agua de la fase oleosa en el segundo componente. Estos resultados demuestran que el nivel de activación espontánea aumenta y que el nivel de activación inducida por US disminuye con el aumento de la solubilidad en agua de la fase oleosa en el segundo componente.
Figura 18 - Micrografías de los segundos componentes cargados con colorante DiR, colorante rojo Nilo y Paclitaxel que muestran emulsiones estables sin signos de precipitación de las moléculas de carga y un diámetro de microgotas en el intervalo de tamaños de 1 a 5 μm.
Figura 19 - Micrografía de microscopía de fluorescencia en una intersección de burbujas de cambio de fase activadas de una composición de agrupaciones, en la que las microgotas en el segundo componente se cargaron con 5 mg/ml de colorante rojo Nilo. Tal como se puede observar, después de la activación, el colorante molecular cargado en las microgotas se expresa en la superficie de la burbuja activada y, por lo tanto, estará en estrecho contacto con la pared endotelial y será accesible para la extravasación.
Figura 20 - La imagen de la izquierda muestra una imagen de ultrasonidos típica de un tumor subcutáneo PC-3 en la extremidad trasera de un ratón. La línea blanca discontinua indica la ubicación del tejido tumoral. El interior del tumor es típicamente hipoecogénico en comparación con el tejido circundante, tal como la piel y el músculo. La imagen de la derecha muestra una imagen de ultrasonidos típica del mismo tumor PC-3 que se muestra en la imagen de la izquierda, después de la inyección i.v. y activación de la composición de agrupaciones. Los ecos de contraste adicionales que se representan claramente en el interior del tumor se depositan en el tejido y permanecen estacionarios en el tejido del tumor durante varios minutos.
Figura 21 - Curvas normales de intensidad frente al tiempo (TIC, time intensity curves) de aumentos de contraste en un tumor PC-3 después de la administración y activación de la composición de agrupaciones (A) y después de una dosis equivalente de solamente microburbujas de HEPS/PFS (B), medidas en el mismo tumor. La intensidad de retrodispersión linealizada se promedia en una región de interés que cubre el centro del tumor. El eje y es el valor de la retrodispersión linealizada promediada, y el eje x es el número de fotograma en la secuencia de video. El video fue adquirido a una velocidad de 10 fotogramas por segundo. Tal como se puede observar, con la composición de agrupaciones, la intensidad de dispersión alcanza un nivel elevado después de, aproximadamente, 20 s y permanece estable durante el periodo de tiempo investigado. Por el contrario, administrada solamente con microburbujas de HEPS/PFS, la intensidad de dispersión alcanza su punto máximo a un nivel más bajo que con las burbujas de cambio de fase y vuelve a la línea base después de, aproximadamente, 1 minuto.
Figura 22 - Imágenes típicas de epifluorescencia para la administración conjunta del agente EPR CW800 de LiCor con la composición de agrupaciones. Un animal del grupo 1 (imagen de la izquierda) no recibió irradiación de US, mientras que un animal del grupo 3 (imagen de la derecha) recibió activación de US y, posteriormente, irradiación de US de baja frecuencia. Las flechas indican la ubicación de los tumores que son, aproximadamente, del mismo tamaño y ubicación en cada animal. Las imágenes se tomaron con la misma configuración del escáner y se presentan con la misma escala de grises lineal de intensidad de fluorescencia para una comparación directa. Existe un claro aumento en la intensidad de la fluorescencia del tumor que recibe la activación por ultrasonidos y la posterior irradiación con US en comparación con el tumor que no recibió irradiación con ultrasonidos, lo que demuestra una captación significativamente mayor del colorante CW800 cuando se trata con la composición de agrupaciones.
Figura 23 - Proporción entre la intensidad de la fluorescencia del tumor y la intensidad de la pierna de control sin tratamiento desde 1 minuto hasta 9 horas después del tratamiento. El eje y es la proporción entre la intensidad del tumor y la intensidad de la pierna de control no tratada. El eje x es el tiempo en minutos. Existe un aumento de captación inicial estadísticamente significativo en el grupo 2 (cuadrados; solo activación) en comparación con el grupo 1 (rombos; sin activación, sin irradiación con US posterior), y un aumento de captación inicial y tasa de captación estadísticamente significativos en el grupo 3 (círculos; activación y posterior irradiación con US), en comparación con las agrupaciones 1 y 2.
Figura 24 - la proporción entre la intensidad promedio en la región del tumor y la intensidad promedio en la pierna sin tratar se integró desde 1 minuto hasta 1 hora después del tratamiento. Los grupos A, B y C son “sin activación, sin irradiación con US posterior”, “solo activación” y “activación e irradiación con US posterior”, respectivamente. El aumento observado en la captación es estadísticamente significativo entre los grupos A y B y entre los grupos B y C.
Figura 25 - Imágenes típicas de epifluorescencia posteriores al tratamiento con una composición de agrupaciones en las que las microgotas del segundo componente se cargaron con 10 mg/ml de colorante DiR. La imagen superior (A) es de un animal del grupo 1 que no recibió activación ni irradiación con US posterior en la pata izquierda que presentaba el tumor. La imagen inferior (B) es de un animal del grupo 2 en el que se activó la composición de agrupaciones seguida de la posterior irradiación con US en la pata izquierda que presentaba el tumor. La ubicación del tumor está indicada por la flecha. Las diferencias observadas en la intensidad de la fluorescencia demuestran claramente la liberación y la absorción tisular del colorante molecular cargado tras la activación y la posterior irradiación con US, tal como se muestra en el análisis estadístico que se proporciona en la tabla 22.
Ejemplo 1 (E1) - Herramientas analíticas y características básicas de la presente invención
E1-1 Introducción
Las agrupaciones de microburbujas/microgotas formadas al combinar C1 y C2, es decir, presentes en el DP, son cruciales para los atributos de calidad críticos de la composición, es decir, su funcionalidad para la administración de fármacos. De esta manera, la metodología analítica para caracterizar y controlar las agrupaciones formadas con respecto a la concentración y el tamaño es una herramienta imprescindible para evaluar la presente invención, así como para el control de calidad (QC) de los medicamentos. Los inventores de la presente invención han identificado tres herramientas analíticas diferentes que se pueden aplicar para este propósito: recuento de Coulter, análisis de imágenes de partículas de flujo (FPIA) y análisis de microscopía/imágenes. En el siguiente texto se explican brevemente estas tres metodologías analíticas y respuestas adecuadas, se ejemplifican algunas características básicas de C1, C2 y DP, así como algunos aspectos para la ingeniería controlada de estas características.
Además de estas técnicas, aplicadas para la caracterización de las agrupaciones en la composición de agrupaciones, se ha desarrollado una metodología analítica para estudiar la activación de las agrupaciones in vitro, es decir, la generación de burbujas activadas grandes tras la irradiación con US. Esta metrología, la “sonometría”, se detalla en E1-6. Las principales respuestas reportadas a partir del análisis de sonometría son el número y el volumen de las burbujas activadas y su distribución de tamaño, ambos frente al tiempo después de la activación. Las respuestas de activación se pueden explorar también mediante análisis de Microscopía/Imagen, tal como se detalla en E1-5.
E1-2 Componentes y composiciones investigados
El primer componente (C1) en todas las composiciones investigadas en todos los ejemplos, con la excepción de E5-2, consistía en microburbujas de perfluorobutano (PFS) estabilizadas mediante una membrana de fosfatidilserina sódica de huevo hidrogenada (HEPS-Na) e incluidas en sacarosa liofilizada. La HEPS-Na porta un grupo de cabeza cargado negativamente con una carga superficial negativa resultante de las microburbujas. Cada vial de C1 contiene, aproximadamente, 16 μl o 2-109 microburbujas, con un diámetro promedio de, aproximadamente, 2,0 μm. El segundo componente (C2) en todas las composiciones investigadas en este ejemplo consistía en microgotas de perfluorometil-ciclopentano (pFMCP) estabilizadas mediante una membrana de 1,2-distearoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DSPC) con el 3 % mol/mol de estearilamina (SA) añadida para proporcionar una carga superficial positiva. Las microgotas en el C2 se dispersaron en tampón TRIS 5 mM. La formulación estándar de C2 investigada en estos estudios contiene, aproximadamente, 4 μl o 0,8-109 microgotas por ml, con un diámetro promedio de, aproximadamente, 1,8 μm.
En algunos casos, para dilucidar los efectos sobre las características de las agrupaciones, se varió de forma controlada una diversidad de variables de formulación, tales como el contenido de SA, el tamaño de las microgotas, la concentración de las microgotas, la concentración de TRIS y el pH. En caso de que se hayan utilizado dichas muestras, estos aspectos se detallan en el presente documento.
La composición de agrupaciones (DP) se preparó de manera aséptica mediante la reconstitución de un vial de C1 con 2 ml de C2, seguida de una homogeneización manual durante 30 segundos. Se extrajeron 2 ml de un vial de C2 utilizando una jeringa y una aguja estériles de una sola utilización. Se añadió el contenido de la jeringa a través del tapón de un vial de C1 y se homogeneizó el DP resultante.
Se fabricaron C1 y C2, tal como se detalla en el ejemplo 9.
En algunos casos, con el fin de comparar los efectos de la composición de agrupaciones de la presente invención con microburbujas de contraste normales, se preparó C1 con agua pura en lugar de C2 para producir una dispersión acuosa de microburbujas de HEPS/PFS.
E1-3 Recuento de Coulter
El recuento de Coulter es una de las técnicas analíticas más utilizadas para la cuantificación y caracterización del tamaño de sustancias en partículas de más de 1 μm y ha demostrado ser adecuada para el control de calidad de productos farmacéuticos [Sontum, PC. y Christiansen, C., J. Pharm. Biomed. Anal. Vol.12, No.10, 1233-1241 (1994)]. De forma resumida, una pequeña alícuota del analito (por ejemplo, C1, C2 o DP) se diluyó/dispersó en un electrolito acuoso libre de partículas (típicamente solución salina tamponada con fosfato, PBS) y se homogeneizó mediante agitación continua. A continuación, se extrajo una parte de la muestra diluida a través de una abertura en el instrumento, sobre la cual se mide continuamente la resistividad. Cada partícula que pasa a través de la apertura hará que la resistividad cambie proporcionalmente respecto al volumen de la partícula. Durante el transcurso del análisis, el instrumento extrae un volumen conocido de electrolito a través de la apertura, mide y cuenta cada pulso de resistividad y presenta los resultados como concentración en número de partículas medidas frente al tamaño. Para los análisis informados, se utilizó un Coulter Multisizer III o IV (Beckman Coulter Ltd.) configurado con una apertura de 50 μm (intervalo de medición de 1 a 30 μm). Se diluyó un volumen de muestra adecuado en Isoton II (electrolito PBS, Beckman Coulter Ltd.) y se homogeneizó mediante agitación continua durante todo el análisis. El recuento de Coulter es adecuado para la cuantificación de la concentración y distribución de tamaños de microburbujas y microgotas en C1 y C2, y para la caracterización de partículas en el DP. Como dos o más microburbujas/microgotas en una agrupación se cuentan como una sola partícula, la formación de agrupaciones al combinar los dos componentes conducirá a 1) una reducción en el número total de partículas en el sistema y 2) un cambio hacia tamaños más grandes. Estos efectos se ejemplifican en la figura 1 que muestra la distribución de concentración y tamaño de C1 y C2 como componentes individuales, la suma de C1 y C2 (es decir, la composición combinada si no hubiera habido formación de agrupaciones tras mezclarlas) y del DP. Los gráficos muestran resultados utilizando una formulación C2 con el 1,5 %, 3,5 % y 5,5 % de SA, un surfactante cargado positivamente, en la membrana estabilizante. La cantidad de SA afecta a la carga superficial (potencial zeta) de las microgotas y la fuerza de atracción electrostática forzada entre las microgotas en C2 y las microburbujas en C1 y, de esta manera, a la capacidad de formar agrupaciones tras mezclarlas. El potencial zeta de las microgotas en estas tres muestras se midió a 22 mV, 35 mV y 43 mV para las formulaciones de SA al 1,5 %, 3,5 % y 5,5 %, respectivamente. Todas las muestras se prepararon con la misma formulación C1. El potencial zeta de las microburbujas en C1 se midió a -57 mV. Tal como se muestra en la figura 1, una diferencia mayor en la carga superficial entre los dos componentes (es decir, fuerzas electrostáticas atractivas más grandes) conduce a la formación de más agrupaciones y más grandes. Con la formulación de SA al 1,5 %, hubo un cambio insignificante en la concentración y el tamaño en el DP a partir de la suma teórica de C1 y C2, por lo que no se observó evidencia de formación de agrupaciones. Por otro lado, la formulación de SA al 3,5 % muestra una disminución leve, pero significativa, en la concentración y un aumento en la prolongación del extremo grande, y la formulación de SA al 5,5 % muestra evidencia de un agrupamiento significativo, con una marcada disminución en la concentración en número y un claro cambio hacia una prolongación del extremo grande. De esta manera, la fuerza de atracción entre las microburbujas y las microgotas debe estar por encima de un cierto umbral para que se formen agrupaciones estables tras la combinación de C1 y C2.
Una respuesta particularmente útil de estas mediciones es la reactividad (R) de la composición de agrupaciones definida como:
R = (Cc1 Cc2 - Cdp) • 100 / (Cc1 Cc2)
En la que Cc1, Cc2 y Cdp son la concentración en número observada en C1, C2 y DP, respectivamente (en C1, después de la reconstitución en 2 ml de agua pura). De esta manera, esta reactividad es una medida de cuántas de las microburbujas y microgotas individuales en C1 y C2 están contenidas en forma de agrupación en el DP. La reactividad se correlaciona también con el tamaño de estas agrupaciones (es decir, cuántas microburbujas y microgotas individuales componen una sola agrupación), véase E2-5 para obtener más detalles. Por ejemplo, si no hay agrupamiento, entonces CDP = CC1 CC2 y R = 0 % y si todas las microburbujas y microgotas en una composición de agrupaciones forman una sola agrupación grande entonces Cdp ~ 0 y R ~ 100 %. A partir del análisis de Coulter de C1 (después de la reconstitución en 2 ml de agua), C2 y DP, R se pueden calcular fácilmente.
Aunque el análisis de Coulter es adecuado para la caracterización de la concentración total de partículas y la distribución de tamaños en el DP, no discrimina per se entre microburbujas, microgotas o agrupaciones; todas las entidades se cuentan y se clasifican como “una partícula”. A efectos de poder diferenciar y caracterizar las agrupaciones de forma específica, son necesarias técnicas de microscopía.
E1-4 Análisis de imágenes de partículas de flujo
El análisis de imágenes de partículas de flujo (FPIA) es una técnica de análisis de imágenes y microscopía completamente automatizada [Sontum, PC. y Martinsen, E., Abstracts of Eur. Conf. Drug Deliv. Pharm. Tech., Sevilla (España), pág. 47, # 25 (2004)]. De forma resumida, una pequeña alícuota del analito (por ejemplo, C1, C2 o DP) se diluyó/dispersó en un diluyente acuoso libre de partículas (agua o PBS) y se homogeneizó mediante agitación continua. A continuación, una porción conocida de la muestra diluida se extrajo a través de una celda de medición en el instrumento en el que una cámara CCD con una fuente de luz estroboscópica toma un conjunto fijo de micrografías. El software de análisis de imágenes aísla y analiza automáticamente las partículas de cada fotograma, y se calcula una variedad de parámetros morfológicos para cada partícula. Además, se informó de la concentración de partículas. De particular interés para la presente invención son los parámetros que discriminan entre microburbujas o microgotas libres y agrupaciones de las mismas. Para ello se ha utilizado como respuestas estándar el tamaño de partícula, descrito como diámetro equivalente circular, y su circularidad. El diámetro equivalente circular se define como el diámetro de un círculo con un área equivalente a la de la partícula detectada. El término “circularidad” (C) tiene su significado convencional en el campo del análisis de imágenes y se define en la página 9.
Además de las respuestas numéricas, el instrumento proporciona una selección representativa de micrografías para diferentes clases de tamaño; ≤ 5 μm, de 5 a 10 μm, de 10 a 20 μm y de 20 a 40 μm. Para los análisis descritos, se utilizó un instrumento Sysmex 2100 (Malvern Instruments Ltd.) configurado con un campo de alta potencia (20X) y un intervalo de medición de 0,7 a 40 μm. Se diluyó en agua un volumen de muestra adecuado y se homogeneizó mediante agitación continua durante todo el análisis.
En la figura 2 se muestra una selección representativa de micrografías de agrupaciones individuales en la clase de tamaño entre 5 y 10 μm, a partir del análisis de una muestra del DP fabricada con C2 que contenía estearilamina al 3,5 %. Tal como se puede observar, en esta clase de tamaño, todas las detecciones menos una de 117 (es decir, ≤1 %) son agrupaciones de microburbujas/microgotas. La tabla 1 indica la concentración en número de agrupaciones observadas en diferentes clases de tamaño para las muestras con cantidad variable de estearilamina (1,5 a 5,5 %) visualizadas en la figura 1. Tal como se puede observar, corroborando los resultados en la figura 1, la concentración de agrupaciones al 1,5 % de estearilamina fue insignificante, al 3,5 % se observa un número significativo de agrupaciones de tamaño pequeño (es decir, ≤ 5 μm) y mediano (es decir, 5 - 10 μm) y al 5,5 % se observa una disminución en las agrupaciones pequeñas y un aumento en la concentración de agrupaciones medianas y grandes (es decir, > 10 μm).
Tabla 1 Reactividad (R) y concentración (millones/ml) de agrupaciones de microburbujas/microgotas en diversas clases de tamaño en la composición de agrupaciones en tres niveles de atracción electrostática de cantidades variables de estearilamina (SA %) en la membrana estabilizante de las microgotas.
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E1- 5 Microscopía/Análisis de imagen
Como alternativa al análisis FPIA, se puede utilizar una técnica de microscopía más manual junto con un software de análisis de imágenes. Para ello se utilizó un sistema Malvern Morphology G3 (Malvern Instruments Ltd.) con un objetivo de 20X y un intervalo de medición de 1,8 a 100 μm. En algunos casos se utilizó una diana de 50X con un intervalo de medición de 0,5 a 40 μm. De forma resumida, una pequeña alícuota del analito (por ejemplo, C1, C2 o DP) se diluyó/dispersó en un diluyente acuoso libre de partículas (por ejemplo, agua o PBS) y se homogeneizó. A continuación, la muestra diluida se introdujo en un portaobjetos de canal de microscopía (IBIDI p-slide, IBIDI GmBh), con una altura de canal conocida de 400 μm y se colocó bajo el microscopio. El instrumento escanea automáticamente un área preestablecida del portaobjetos y una cámara CCD toma un conjunto fijo de micrografías. El software de análisis de imágenes aísla y analiza automáticamente las partículas de cada fotograma, y se calcula una variedad de parámetros morfológicos para cada partícula. Se informa el número total de partículas y, a partir del área de exploración conocida y la altura conocida del canal, se puede calcular la concentración de partículas en el analito. En cuanto al análisis FPIA, se reportó el diámetro circular equivalente y la circularidad de las partículas. Las micrografías de todas las partículas detectadas se pueden mostrar y evaluar mediante una inspección visual manual. De esta manera, todas las agrupaciones se pueden aislar de, por ejemplo, las microburbujas libres y se puede construir el tamaño completo de las agrupaciones y una distribución de circularidad para las agrupaciones en cada muestra.
Esta metodología se puede utilizar también para caracterizar la población de burbujas activadas, es decir, la composición de agrupaciones después de la activación por ultrasonidos. Para este propósito, se sumergió el portaobjetos de microscopía en agua a 37 °C y se insonó durante 10 s con un transductor ATL 3-2 (frecuencia central de 2,25 MHz) a un MI nominal de 0,8. Inmediatamente después de la activación, el portaobjetos se colocó bajo el microscopio y se repitió el análisis.
En la figura 3 se muestran ejemplos normales de resultados de este análisis para C1 y C2 y en la figura 4 para la preactivación y posactivación del DP. Tal como se puede observar en los diagramas de dispersión de circularidad frente a diámetro, C1 y C2 muestran una distribución de tamaño estrecha con partículas esencialmente esféricas, mientras que el DP no activado contiene una cresta de material con menor circularidad provocada por la presencia de agrupaciones de microburbujas/microgotas. Una inspección visual de todas las micrografías muestra que no se observan agrupaciones de microburbujas/microburbujas o microgotas/microgotas en las muestras puras C1 y C2; todas las partículas detectadas consisten en entidades esféricas individuales. Los resultados de la muestra de DP después de la irradiación con US muestran claramente que las agrupaciones se han activado y han cambiado de fase a burbujas de gas grandes (> 10 μm). No se observan burbujas de gas grandes después de la insonación equivalente de muestras puras C1 o C2 solas. La figura 5 muestra los resultados para toda la población de agrupaciones, aislada a partir de la muestra de DP en la figura 4. tal como se puede observar, las agrupaciones están contenidos entre ~3 a -10 μm y se caracterizan por una circularidad ≤ 0,9.
E1-6 Sonometría
Con el fin de estudiar y demostrar las características de las burbujas de cambio de fase grandes producidas después de la activación de las agrupaciones de microburbujas/microgotas presentes en la composición, se ha desarrollado una metodología analítica que permite determinar la concentración, el tamaño y la dinámica de las burbujas activadas después de la activación en un sistema in vitro pertinente. El texto a continuación describe en detalle un procedimiento para medir el tamaño de las burbujas activadas in vitro, que produce una medición de la concentración de burbujas activadas y la distribución del tamaño de 4 a 80 micras de diámetro a lo largo del tiempo. Las mediciones se realizan cada 15 segundos durante un período que cubre el tiempo de crecimiento y disolución de la burbuja activada.
Se utilizó una técnica de transmisión acústica para medir la dinámica de la distribución de tamaños de la población de burbujas activadas grandes in vitro. La técnica acústica requiere la medición de la atenuación en un intervalo de frecuencias, que son un orden de magnitud más bajas (alrededor de 0,2 MHz) que las utilizadas para la obtención de imágenes convencionales (1-10 MHz). La conversión posterior a la información del tamaño de la burbuja activada se basa en la teoría de la resonancia de la burbuja y la solución de la ecuación integral de Fredholm resultante del primer tipo, utilizando técnicas estándar. Los datos de dispersión de velocidad asociados se utilizan para proporcionar una medición de calidad cuantitativa con la que evaluar el rendimiento del procedimiento de inversión. La técnica se basa en procedimientos descritos en la literatura de sónar para dimensionar las poblaciones de burbujas en la parte superior del océano, con modificaciones no esenciales para adaptarse al problema en cuestión.
Con el fin de obtener información sobre el tamaño de la burbuja activada, se miden las principales propiedades acústicas en función de la frecuencia. A continuación, estos datos se invierten para proporcionar información sobre el tamaño. La inversión requiere un modelo preciso de la interacción de las burbujas activadas con el campo sonoro incidente. En la literatura se encuentran disponibles diversos modelos para la propagación de ondas de presión no lineales en líquidos burbujeantes. En el presente documento, se restringen las mediciones a la propagación de ondas acústicas de baja amplitud, lo que efectivamente coloca las mediciones en la región lineal, por lo que se emplea un modelo lineal. También se restringe la consideración y las mediciones a las densidades de burbujas para las cuales la aproximación de Foldy es aplicable [Phys. Rev. B, vol. 67, págs. 107-119, 1945]. La teoría relevante se presenta en [J. Acoust. Soc. Am 85, págs. 732-746, 1989].
Un pulso de banda ancha de baja frecuencia (Panametrics Videoscan SN:267202 parte n.° V1012, frecuencia central de 0,25 MHz) se dirige a través de una celda de muestra, se refleja desde una placa de acero (aproximadamente a 25 cm del transductor de baja frecuencia), se propaga de regreso a través de la muestra y se recibe por el mismo transductor. De este modo, el pulso pasa a través de la celda de muestra dos veces. Las dimensiones internas de la celda de muestra son: anchura 7,4 cm, espesor 3,1 cm, altura 10,3 cm, dando una capacidad de volumen total de 236,28 cm3. La celda está cerrada y no contiene espacio de cabeza para que se pueda mantener a una saturación de gas controlada. Se elige que la temperatura para realizar las mediciones sea de 37 °C para imitar la temperatura corporal. La saturación de gas en la sangre in vivo es de, aproximadamente, 98 kPa en sangre arterial y 90 kPa en sangre venosa. Junto con la sobrepresión sistémica (~ 100 mmHg), esto proporciona un entorno de saturación de gas de, aproximadamente, el 85 % in vivo. Se controló la saturación de gas de la celda de muestra al 85 % para imitar el entorno in vivo. Se incorpora una agitación suave para asegurar una mezcla adecuada. Se utilizan membranas de Mylar para proporcionar ventanas acústicamente transparentes. La fuente de baja frecuencia no activa las agrupaciones. La activación está proporcionada por el transductor de alta frecuencia. El ancho de banda del pulso de baja frecuencia es capaz de cubrir un intervalo de tamaños de burbuja activada de 4 a 80 |o.m de diámetro.
El procedimiento de inversión está mal planteado en el sentido de Hadamard y, por lo tanto, requiere la optimización de la proporción señal/ruido de los datos. De esta manera, es apropiado promediar tanto como sea posible en la práctica. Se registran 200 señales de línea A de rf consecutivas a una frecuencia de muestreo de 10 MHz a 8 bits nominales y comprenden un conjunto de datos de medición. La frecuencia de repetición de pulsos del transductor de transmisión se establece en 200 Hz y, de este modo, se requiere un segundo para la captura de datos. Los conjuntos de datos se registran una vez cada 15 segundos y se descargan a un PC para su posterior inversión numérica. 45 conjuntos de datos de medición de este tipo comprenden una ejecución, que abarca 11 minutos en total.
La inversión de las propiedades acústicas primarias medidas para producir información sobre la distribución del tamaño y la concentración de burbujas activadas se basa en una solución de elementos finitos simple propuesta por Commander y McDonald [J Acoust. Soc. Am. 89 págs. 592-597, 1991]. Los detalles del algoritmo de inversión utilizado se pueden encontrar en [“Solving least squares problems”, Prentice Hall, Capítulo 23, pág. 161, 1974].
A partir de las mediciones acústicas, se pueden calcular tanto la atenuación acústica como la velocidad en función de la frecuencia. Los datos de velocidad se pueden considerar independientes de los datos de atenuación. Solo se utilizan los datos de atenuación para calcular la distribución de tamaños de las burbujas activadas, los datos de velocidad se pueden utilizar como base de una verificación independiente de la distribución estimada de tamaños de las burbujas activadas. La velocidad de un líquido burbujeante es altamente dispersiva alrededor de la frecuencia de resonancia. Este fenómeno se puede utilizar para obtener una medición de la “calidad” con el fin de inferir cuantitativamente la precisión o confianza de la distribución estimada de tamaños de burbujas activadas, según [IEEE J. of Oceanic Engineering, vol. 23, núm. 3, 1998].
Los informes principales de metrología detallados anteriormente son el número de burbujas activadas y la concentración volumétrica, y el diámetro de burbuja ponderado por número y volumen, ambos frente al tiempo después de la activación.
Aplicando el análisis de sonometría, se analizó una muestra de la composición de agrupaciones detallada en E1-2. La figura 6 (lado izquierdo) muestra la concentración volumétrica de burbujas activadas (% v/v) en la celda de medición (eje y) y la figura 6 (lado derecho) muestra el diámetro promedio ponderado por número y volumen (eje y), ambos en función del tiempo después de la activación (eje x). La métrica de calidad confirmó que las distribuciones de tamaños presentadas son robustas. Tal como se puede observar en la figura 6, los resultados generados confirman que las agrupaciones en la composición se activan dentro del intervalo de MI deseado y producen un crecimiento de burbujas dentro del intervalo de tamaño y la dinámica deseados en un sistema de medición in vitro relevante.
En los siguientes ejemplos, las respuestas primarias evaluadas a partir de este análisis son el volumen máximo de burbujas activadas por volumen de microgotas o por volumen de DP, y el diámetro promedio ponderado por volumen en el volumen activado máximo.
E1-7 Estabilidad de las agrupaciones en la composición de agrupaciones
Las agrupaciones en el DP se forman y mantienen por la atracción electrostática entre las microburbujas y las microgotas. Estas fuerzas son finitas y las agrupaciones se pueden romper después de la formación a través de varias rutas/influencias, tales como la tensión mecánica o el movimiento térmico (browniano).
Para una caracterización precisa y detallada, es importante que las agrupaciones permanezcan estables durante el tiempo de análisis. Esta estabilidad ha sido investigada con todas las metodologías descritas anteriormente. Para evaluar la estabilidad, se repitieron de 3 a 5 análisis en una sola muestra de DP durante un período de tiempo de > 5 minutos. No se han observado cambios significativos ni en la concentración ni en el tamaño de estas réplicas, lo que demuestra que las microburbujas, las microgotas y las agrupaciones son estables durante > 5 minutos en las condiciones analíticas indicadas, es decir, después de la dilución en PBS o agua y bajo homogeneización continua (agitación).
Para su utilización como medicamento, es imperativo que las características vitales del producto se mantengan durante un tiempo que permita su utilización. La estabilidad del DP después de la preparación se ha estudiado con diversas técnicas, incluidas FPIA y sonometría. La figura 7 muestra la concentración de agrupaciones entre 5 y 10 μm a partir del análisis FPIA y el volumen activado máximo por volumen de microgota a partir del análisis de sonometría en dos muestras de DP, almacenadas a temperatura y presión ambiental, frente al tiempo después de la preparación. No se observó evidencia de activación espontánea durante el análisis FPIA. Tal como se puede observar en la figura 7, se observa un cambio insignificante en el contenido de agrupaciones y el volumen de burbujas activadas durante un período de 1 hora después de la preparación del DP.
E1-9 Aspectos de formulación
Se pueden explorar diversos aspectos de formulación diferentes para controlar el contenido y el tamaño de agrupaciones en el DP y para buscar propiedades óptimas. Entre los parámetros que se pueden utilizar para diseñar el contenido de agrupaciones y la distribución de tamaño se incluyen, pero sin limitarse a estos: la diferencia de carga superficial entre las microburbujas y las microgotas (por ejemplo, % de SA, tal como se muestra en E1-3); el tamaño de las microgotas de C2: el pH; la concentración de TRIS en C2; y la concentración de microburbujas y microgotas. Además, la degradación química de los componentes, por ejemplo, durante el almacenamiento prolongado a elevadas temperaturas, puede influir en la capacidad de C1 y C2 para formar agrupaciones durante la preparación del DP. A continuación, se hace una breve descripción de estos aspectos.
Tamaño de microgotas - Se prepararon muestras de C2 con tamaño de microgotas variable a partir de un solo lote de emulsión en bruto mediante centrifugación y control de la eliminación del sobrenadante y/o sedimento después de diferentes tiempos de centrifugación. Después del ajuste de tamaño, la concentración de todas las muestras se ajustó al mismo volumen de concentración de microgotas (aproximadamente 4 μl de microgotas/ml). Se prepararon muestras de C2 con tamaño de microgotas como diámetros volumétricos medios de 1,8 μm, 2,4 μm y 3,1 μm y se utilizaron para la preparación de DP con viales de un solo lote de C1 y se midió la reactividad mediante recuento de Coulter. Se descubrió que la reactividad aumentaba con la disminución del tamaño de las microgotas, del 27 % a 3,1 μm, al 49 % a 2,4 μm y al 78 % a 1,8 μm. La disminución del tamaño de las microgotas, por lo tanto, aumenta la formación de agrupaciones al mezclar C1 y C2.
pH - Se prepararon dos viales de DP a un pH de 6,6 y dos viales a un pH de 6,1. La reactividad resultante, medida por recuento de Coulter, fue del 30 al 32 % y del 51 al 52 % para las muestras de pH de 6,6 y de pH 6,1, respectivamente. Una disminución en el pH, por lo tanto, aumenta la formación de agrupaciones.
Concentración de TRIS - Para tres muestras de C2 del mismo lote, la concentración de TRIS se varió de 1 mM a 10 mM. Utilizando un solo lote de C1, cada muestra se utilizó para preparar el DP y se midió la concentración de agrupaciones entre 5 y 10 μm mediante análisis FPIA en todas las muestras. Se descubrió que la formación de agrupaciones disminuía al aumentar la concentración de TRIS, con una reducción de la concentración de agrupaciones de 6,7 a 3,7 millones/ml, pasando de 1 a 10 mM de TRIS en C2.
Concentración de microgotas - La formación de agrupaciones al combinar C1 y C2 también está en función de la concentración de microburbujas y microgotas en los dos componentes, es decir, la proporción de microburbujas a microgotas. Desde una perspectiva intuitiva, parece probable que en un sistema en el que la carga total de la superficie presentada por los dos componentes se equilibre por completo, el resultado sería que todas las microburbujas y todas las microgotas formarían unas pocas agrupaciones muy grandes (es decir, daría como resultado un colapso total del sistema). Los inventores de la presente invención han descubierto que para generar un agrupamiento controlado y dirigido en el que la mayoría de las microgotas están contenidas en forma de agrupaciones, y en el que las agrupaciones formadas son de un tamaño aceptable, la carga total presentada por las microburbujas debe exceder la carga total presentada por las microgotas. Sin embargo, la proporción de microgotas/microburbujas también debe estar por encima de un cierto umbral para formar una cantidad significativa de agrupaciones. Los resultados de la tabla 2 muestran el efecto de la concentración de microgotas en C2, cuando se utiliza para preparar DP con una concentración fija de microburbujas en C1 (8 μl de microgotas/ml). Tal como se puede observar, se ha descubierto un fuerte aumento en el agrupamiento en términos de reactividad y un fuerte aumento en el diámetro promedio de las agrupaciones, con una concentración creciente de microgotas añadidas a una cantidad fija de microburbujas.
Tabla 2 Reactividad (R) a partir del análisis de Coulter y del diámetro promedio de las agrupaciones y del análisis de microscopía/imagen en composiciones de agrupaciones producidas con C2 con concentración de microgotas variable (C).
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Degradación térmica - El componente SA en la membrana de fosfolípidos que estabiliza las microgotas en C2 es propenso a la degradación térmica tras un almacenamiento prolongado a temperaturas elevadas, perdiendo su carga positiva en el proceso de degradación. Por lo tanto, se reduce la capacidad de formar agrupaciones de microburbujas/microgotas cuando se combina con C1. Se colocaron dos muestras de C1 en condiciones de almacenamiento controladas a 4 y 30 °C durante tres meses y se utilizaron para la preparación de DP en las que se midió el contenido de agrupaciones entre 5 y 10 μm mediante análisis FPIA. El contenido de agrupaciones observado fue de 29,6 y 0,2 millones/ml para las muestras almacenadas a 4 y 30 °C, respectivamente.
E1-10 Tamaño de las burbujas activadas
El tamaño de las burbujas activadas puede ser importante para los atributos biológicos de la composición administrada, por ejemplo, aspectos de seguridad y eficacia. Si bien se depende naturalmente del tamaño de las microgotas en C2, el tamaño de la burbuja activada también está fuertemente relacionado con el tamaño de la agrupación. La figura 8 muestra la covarianza entre la reactividad por análisis de Coulter y el diámetro de la burbuja activada por sonometría, medidos en las muestras detalladas en la tabla 4, E2-3. Tal como se puede observar, el diámetro de la burbuja activada aumenta de, aproximadamente, 20 μm a baja reactividad (es decir, desde pequeñas agrupaciones) a, aproximadamente, 50 μm a alta reactividad (es decir, desde grandes agrupaciones).
Ejemplo 2 (E2): estudios in vivo sobre los atributos de las agrupaciones frente a la eficacia del producto E2-1 Introducción
Habiendo mostrado en E1 cómo medir características importantes de la presente invención; es decir, para las agrupaciones en la composición de agrupaciones, y también cómo manipularlas y controlarlas, el presente ejemplo explora qué características de agrupación deben ser el objetivo para una eficacia in vivo óptima. A efectos de alcanzar este objetivo, se realizaron dos estudios amplios in vivo (Estudio A y Estudio B) en los que se midió la mejora de contraste para US obtenida después de la administración de un número de muestras de DP con diferentes características, en un modelo de miocardio de perro con tórax abierto. La mejora miocárdica de la señal de US se observó después de la inyección i.v. y activación de la composición en el ventrículo izquierdo. Después de la activación, las burbujas de cambio de fase grandes quedan atrapadas en la red de capilares del miocardio y la mejora del contraste ecográfico es una medida directa de la cantidad de burbujas activadas depositadas y, de esta manera, una medida de la eficacia de la muestra administrada.
E2-2 Componentes y composiciones investigados
El primer componente (C1) en las composiciones investigadas en este ejemplo se describe en E1-2.
El segundo componente (C2) en todas las composiciones investigadas en este ejemplo consistió en microgotas de perfluorometil-ciclopentano (pFMCP) estabilizadas mediante una membrana de 1,2-diestearoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DSPC) con adición de estearilamina (SA) para proporcionar una carga superficial positiva. Las microgotas en el C2 se dispersaron en tampón TRIS.
Con el fin de obtener una variación significativa en las características de agrupación de la composición de agrupaciones (DP), las variables de formulación, tales como el contenido de SA, el tamaño de las microgotas, la concentración de microgotas, la concentración de TRIS y el pH, se variaron de manera controlada, tal como se describe en E1.
En el Estudio A, se varió el tamaño de las microgotas, el contenido de SA (% mol/mol) y el pH en una serie de 15 muestras, tal como se detalla en la tabla 3. Para estas muestras, las concentraciones de microgotas y TRIS se mantuvieron constantes a aproximadamente 4 μl/ml y 5 mM.
Tabla 3 Variación en las características del com onente C2 investi adas en el Estudio A
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En el Estudio B, se variaron la concentración de microgotas y TRIS y el diámetro de las microgotas en una serie de 15 muestras. Además, una muestra se degradó térmicamente durante 3 meses de almacenamiento a 40 °C. Las muestras de C2 investigadas se detallan en la tabla 4. Para estas muestras, el pH se mantuvo constante a 6,2 y el contenido de SA se mantuvo constante en el 3 %.
Tabla 4 Variación en las características del com onente C2 investi adas en el Estudio B
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E2-3 Caracterización in vitro
Todas las muestras detalladas en las tablas 3 y 4 se utilizaron para preparar y caracterizar DP, tal como se detalla en E1. Para todas las muestras, se determinó el contenido y el tamaño de las agrupaciones mediante análisis FPIA y se determinó el contenido y el tamaño de las burbujas activadas mediante sonometría. Además, para las muestras detalladas en la tabla 3, se midió la reactividad mediante recuento de Coulter.
E2-4 Procedimientos in vivo
Para ambos estudios, se aplicaron los siguientes procedimientos in vivo.
Manipulación de animales:
El animal (perro mestizo o de cría mixta) llegó la mañana del día del experimento. No hubo aclimatación. Se indujo la anestesia con pentobarbital (12 - 25 mg kg-1 i.v.) y fentanilo (1,5 - 2,5 μg kg-1) y se le insertó un tubo endotraqueal. El animal se transfirió a la mesa de operaciones y se puso ventilación mecánica del aire de sala controlada por volumen (Ventilador para animales grandes New England mod. 101). Cuando sea necesario, se puede administrar aire enriquecido con O2 durante algunos períodos de tiempo, pero no en ninguno de los intervalos de tiempo de 10 minutos antes a 11 minutos después de las inyecciones de la sustancia de prueba.
Anestesia:
El animal se mantuvo bajo anestesia general mediante infusión i.v. continua de fentanilo (20 μg kg-1 h-1) controlada por una bomba de infusión de jeringa (IVAC modelo P2000) y pentobarbital (10 mg kg-1 h-1) mediante una línea de goteo. La velocidad de los anestésicos administrados se puede ajustar algo a partir del valor nominal para asegurar una profundidad constante de la anestesia. La profundidad de la anestesia fue controlada mediante registros fisiológicos (frecuencia cardíaca, presión arterial) y mediante observación general del animal (signos de actividad muscular, esfuerzos respiratorios, reflejos).
Temperatura corporal:
La temperatura corporal se mantuvo constante a 38 °C mediante una unidad de control de retroalimentación homeotérmica Harvard.
Cirugía e instrumentación:
Se insertó un catéter de Swann-Ganz para medir la presión en la arteria pulmonar a través de la vena femoral y una incisión en la ingle. Se insertó un catéter transductor de presión arterial sistémica en la arteria femoral mediante la misma incisión. Se realizó una esternotomía de línea media y se extrajo el pericardio anterior. El corazón se suspendió en una cuna pericárdica para evitar la compresión de las aurículas y las venas. Se insertó una cánula Venflon® de 0,8 mm en la vena cefálica derecha proximal a la articulación del codo para inyecciones de sustancias de prueba.
Control fisiológico:
Se midió la presión arterial y pulmonar con transductores SensoNor 840 (Sensonor AS, Horten, Noruega) conectados a amplificadores de puente con compensación de deriva personalizados (MAX 420, Maxim Integrated Products, Sunnyvale, California). Las salidas del amplificador se muestrean a 500 Hz y se alimentan a una tarjeta ADC de 8 canales y 12 bits (CIO-DAS 08, Computer Boards) para su posterior procesamiento mediante software de PC (Turbo Pascal 5.0, Borland International). El contenido inhalado y exhalado de O2 y CO2 se controlará continuamente (analizador de gases respiratorios Capnomac Ultima), pero no se registrará.
Las siguientes variables se calculan, visualizan y registran para cada latido: a) presión arterial sistémica (PAS) promedio sistólica, diastólica y verdadera, b) presión arterial pulmonar (PAP) promedio verdadera y c) frecuencia cardíaca instantánea derivada de la detección de onda r de ECG automatizado (mediante software).
Obtención de imágenes:
Con un escáner ATL HDI-5000 se obtuvieron imágenes de una vista del eje corto papilar medio de la línea media del corazón. Se utilizó un transductor P3-2, el escáner se operó en modo B fundamental convencional con dos zonas focales, a la velocidad de fotograma más elevada y la potencia de salida máxima (MI = 1,0). Se utilizó una almohadilla de caucho de silicona suave de 30 mm entre la superficie del transductor y el epicardio. Todas las interfases de materiales están cubiertas por un gel de contacto acústico de base acuosa.
La profundidad de la imagen se ajustó al valor más pequeño que incluirá todo el corazón. Se utilizó un intervalo dinámico de 50 dB. Se almacenaron un par de imágenes digitales de fin de diástole y fin de sístole en cada punto especificado en el tiempo. El escáner se dejó funcionando continuamente, excepto breves períodos de recuperación de bucles de cine para almacenar las imágenes. Las imágenes digitales se transfieren al disco magneto-óptico después de la finalización de la sesión experimental. Se realizó una grabación de video PAL VHS de la pantalla para documentar los procedimientos. La identidad del animal y todas las inyecciones (número de inyección, sustancia y dosis) deben anotarse en la pantalla.
Técnicas de inyección y dosificación:
Antes de cada inyección, se reconstituyó un vial nuevo de C1 con 2 ml de C2. Se extrajo la dosis deseada de DP (200 μl) y se diluyó a 2,5 ml con 50 mg/ml de manitol tamponado con TRIS (10 mM, pH 7,4). La dosis administrada fue equivalente a 10 μl de DP/kg de peso corporal, equivalente a 0,04 μl nominales de microgotas de pFMCP y 0,08 μl de microburbujas de HEPS/PFS por kg de peso corporal. Las inyecciones se realizan a través de una cánula Venflon® equipada con un puerto de membrana de goma. La cánula y el espacio muerto del puerto (aproximadamente 0,1 ml) se enjuagaron con 5 ml de solución salina isotónica inmediatamente después de cada inyección.
Procedimientos experimentales:
Las inyecciones de DP se realizan a través de la vena cefálica derecha y el efecto de contraste miocárdico resultante se cuantifica a los 90 segundos, 3, 5, 7 y 11 minutos. Se realizó una lectura de referencia antes de cada inyección. Se dejaron, como mínimo, 20 minutos entre inyecciones para reducir los posibles efectos de arrastre. Análisis de datos e informes:
Para cada uno de los puntos de tiempo especificados, se leyó el efecto de contraste miocárdico de una gran región de interés en el miocardio anterior (software MathLab), se tabuló frente al tiempo y se ilustró gráficamente. El efecto de contraste a los 90 segundos se utilizó como medida principal de la eficacia de cada inyección. Los valores de intensidad de contraste se reportaron en dB y, a partir de estos valores, se calculó la mejora lineal (unidades de escala de grises, GS).
E2-5 Resultados del Estudio A
Los resultados de la caracterización in vitro y de la mejora miocárdica observada para las 15 composiciones investigadas se detallan en la tabla 5. A partir de estos datos se pueden extraer varias correlaciones importantes que aclaran la naturaleza y las características del sistema.
Lo que es más importante, se descubre un óptimo en la correlación entre reactividad y mejora, tal como se muestra en la figura 9. Esta covarianza demuestra claramente que existe un equilibrio óptimo en la formación de agrupaciones en el DP.
En segundo lugar, se descubre que el tamaño de las agrupaciones formadas también está fuertemente relacionado con la reactividad del sistema, tal como se muestra en la figura 10. Tal como se puede observar en esta figura, solo se forman agrupaciones pequeñas (es decir, ≤ 5 |o.m) y de tamaño mediano (es decir, 5-10 |o.m) a niveles relativamente bajos de reactividad (por ejemplo, ≤ 20 %). Con el aumento de la reactividad, comienzan a formarse agrupaciones más grandes; con R > 20 %, aproximadamente, comienzan a formarse agrupaciones de 10-20 |o.m y en R > 50 %, aproximadamente, se empiezan a formar agrupaciones de 20-40 |j.m. Cuando se forman agrupaciones más grandes, es a expensas de agrupaciones más pequeñas y medianas; se descubre un claro óptimo en contenido frente a reactividad para concentración de agrupaciones de ≤ 5 |o.m y 5 - 10 |o.m.
En combinación, los resultados mostrados en las figuras 9 y 10 demuestran que la formación de agrupaciones más grandes es perjudicial para la eficacia de la composición y que, en consecuencia, se debe equilibrar el potencial de agrupamiento.
Si bien no se desea quedar limitado por especulaciones teóricas, las posibles razones de estos efectos podrían ser 1) que las masas más grandes contenidas en agrupaciones más grandes previenen o reducen la eficacia de la activación o 2) que las agrupaciones más grandes se retienen en la circulación pulmonar después de una inyección i.v. y, de esta manera, no llegan al ventrículo izquierdo en el que se realiza la activación.
Tabla 5 Resultados de la caracterización in vitro y el rendimiento in vivo de las composiciones investigadas - Estudio A (véase el texto)
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E2-6 Resultados del Estudio B
Los resultados de la caracterización in vitro y la mejora miocárdica observados para las 15 composiciones investigadas se detallan en la tabla 6. A partir de estos datos se pueden extraer varias correlaciones importantes que aclaran la naturaleza y las características del sistema.
En la figura 11 se muestran las correlaciones entre la concentración de agrupaciones entre 5 y 10 |j.m y el volumen máximo de burbujas activadas observado in vitro frente al aumento miocárdico observado in vivo.
Los ejemplos 20 a 27 proporcionados en la Patente WO99/53963 también incluyen datos de sitios para la mejora del miocardio en un modelo idéntico al descrito en E2-4 y los procedimientos aplicados son idénticos. Además, las dosis en términos de gas y volumen de microgotas administradas por kg de peso corporal son comparables entre estos estudios; la Patente WO99/53963 establece 0,35 μl de gas y 0,04 μl de microgotas/kg de peso corporal mientras que en el presente ejemplo las dosis efectivas fueron de 0,08 μl de gas y de 0,026 a 0,059 μl de microgotas/kg de peso corporal. Por tanto, para comparación, se ha incluido en la figura 11 el intervalo de aumento observado y citado en los ejemplos 20 a 27 en la Patente WO99/53963. El aumento en estos ejemplos se proporcionó como dB, de esta manera, para esta comparación, los valores de aumento lineal se han vuelto a calcular a partir de los datos ubicados en la tabla 4, ejemplos 20 a 27, página 63 en la Patente WO99/53963 según; Aumento lineal = 10 (dB/10)
Tal como se puede observar en la figura 11, la mejora in vivo está bien correlacionada con los dos parámetros in vitro, demostrando su relevancia como predictores del rendimiento in vivo; es decir, las agrupaciones comprenden el componente activo en DP. Además, el valor máximo de la mejora miocárdica lineal reportado en la Patente WO/9953963 fue de 51 frente a 693 en el presente estudio. Aplicando entonces el concepto de la presente invención; al preparar una composición de C1 y C2 antes de la administración, de esta manera, formando agrupaciones de microburbujas/microgotas, a diferencia de la coinyección de los dos componentes, tal como se enseña en la Patente WO/9953963, permite un aumento de > 10 veces en la eficacia.
Tabla 6 Resultados de la caracterización in vitro y el rendimiento in vivo de las composiciones investigadas - Estudio B (véase el texto).
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E2-7 Análisis multivariante, tamaño de agrupación diana y diferenciación de circularidad
Los resultados del contenido de agrupaciones en las diversas clases de tamaño y la mejora in vivo, para todos los datos informados en E2-5 y E2-6, permiten una evaluación estadística de la contribución de las diversas clases de tamaño de agrupación a la eficacia in vivo. Para ello se realizó un análisis multivariante de componentes principales. La correlación entre el contenido en las diversas clases de tamaño de agrupación (X) y la mejora (Y) se determinó mediante regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR, partial least squares regression). El algoritmo PLSR discrimina el ruido para extraer y definir correlaciones verdaderas. La validación de los modelos PLSR se realizó aplicando validación cruzada completa (CV, cross validation). El procedimiento de CV deja fuera una muestra y, a continuación, prueba la precisión del modelo estimando o prediciendo el valor de y para la muestra excluida y comparándolo con el valor de y medido. El procedimiento se repitió para cada muestra y, por lo tanto, el número de modelos fue igual al número de muestras. Al comparar todos los modelos derivados de la validación cruzada, se determinó la importancia de las variables x evaluando la variación en los coeficientes de regresión que se originaron en cada modelo (p=0,05). El modelo final se desarrolla a partir de las 30 muestras.
La precisión y fiabilidad del modelo se realizaron comparando la mejora predicha y la mejora medida y los modelos fiables se verificaron mediante estimaciones de calidad estadística clásica (r, RMSEC, RMSEP). La evaluación de parámetros estadísticos adicionales, como el apalancamiento del modelo y la distancia de la muestra al modelo, concluyó que ningún valor atípico crítico influyó en las soluciones del modelo. Para el análisis estadístico se utilizó el software Unscrambler v.9.8, de Camo ASA.
Los resultados de este análisis se muestran en la figura 12. Tal como se puede observar, se descubre una contribución estadísticamente significativa a la mejora miocárdica para agrupaciones ≤ 5 μm y, más fuertemente, para agrupaciones entre 5 y 10 μm, corroborando el análisis bidimensional presentado en la figura 11. Las agrupaciones entre 10 y 20 μm no contribuyen significativamente a la mejora, ni tampoco las agrupaciones entre 20 y 40 μm, se indica que estos últimos incluso tienen una contribución negativa, corroborando los resultados mostrados en las figuras 9 y 10. Los resultados demuestran que la formación de agrupaciones más grandes reduce la funcionalidad del concepto, ya que esta formación agota la concentración de agrupaciones funcionales por debajo de 10 μm.
La muestra de reactividad media (R = 46 %) reportada en la tabla 2 representa el DP con los atributos de la agrupación a los que se debe apuntar. La figura 13 muestra el tamaño de las agrupaciones y la distribución de la circularidad de esta muestra. Tal como se puede observar, las agrupaciones en esta muestra están entre ~3 y -10 μm y muestran una circularidad inferior a 0,9.
E2-8 Conclusiones
Según los datos y las discusiones detalladas en E1 y E2, se demuestra que
• La formación de agrupaciones de microburbujas/microgotas tras la combinación del primer componente y el segundo componente, es decir, en la composición de agrupaciones o composición farmacéutica, es un requisito previo para su funcionalidad prevista in vivo.
• Los atributos objetivo de las agrupaciones en términos de tamaño son inferiores a 10 μm, y la diferenciación de las microburbujas/microgotas libres se puede designar mediante una circularidad ≤ 0,9.
Ejemplo 3 (E3): tamaño de burbuja activada in vivo
E3-1 Introducción
Para estudiar y demostrar las características de las burbujas de cambio de fase grandes producidas después de la activación de las agrupaciones de microburbujas/microgotas presentes en la composición, se ha desarrollado una metodología que permite la determinación in vivo del tamaño y la dinámica de las burbujas activadas en un modelo animal relevante.
E3-2 Componentes y composiciones investigados
Las composiciones investigadas en este estudio fueron las detalladas en E1-2.
E3-3 Metodología
La medición de la distribución del tamaño de las burbujas activadas y el rendimiento de la activación se realizó en un modelo de perro. El estudio fue aprobado por el comité local de bienestar animal. Se colocó una cánula en la aorta para permitir el flujo sanguíneo a través de una cámara de medición extracorpórea que realiza el dimensionamiento acústico de la burbuja. El compuesto se administró mediante inyección intravenosa a razón de 10 μl DP/kg de peso corporal y la activación fue proporcionada por un escáner de ultrasonidos clínico que genera imágenes de las cámaras cardíacas.
Para proporcionar consistencia de datos, el compuesto también se administró a través de una cánula en la aurícula izquierda con activación acústica en la cánula, proporcionando de este modo datos que pueden compararse directamente con la misma administración (activación en la cánula) en el sistema de dimensionamiento de burbujas in vitro.
Se desarrolló un modelo matemático para calcular el volumen de burbujas activadas liberadas a partir de las mediciones realizadas en la cámara de medición extracorpórea. Los resultados del modelo se validaron inyectando burbujas activadas en la aurícula izquierda a través de una cánula y comparando el resultado con la misma administración en el sistema de medición in vitro.
Se dejaron, como mínimo, 15 minutos entre cada dosificación. Las inyecciones se realizaron con una aguja de 18 G a través de un puerto de membrana de goma sobre una cánula i.v. de extremidad anterior Venflon®. Debido a los bajos niveles de dosis, todas las inyecciones i.v. se administraron después de una dilución 1:10 del DP con una solución acuosa de manitol/TRIS. Las inyecciones se administraron en, aproximadamente, 5 segundos, seguidas de un lavado con solución salina. En algunas ocasiones, las inyecciones se realizaron en la aurícula izquierda del corazón a través de un catéter corto de polietileno, con o sin activación previa del medicamento por ultrasonidos ex vivo. Las inyecciones en la aurícula izquierda fueron lentas (20 segundos) para simular la dispersión temporal del bolo durante el paso pulmonar normal. Debido a la necesidad de diluir la muestra inyectada para que la exposición ultrasónica ex vivo penetre en el líquido, las inyecciones auriculares se diluyeron adicionalmente con solución salina isotónica hasta un volumen total de 20 ml.
La temperatura corporal se mantuvo constante a 38 grados C mediante una unidad de control de retroalimentación homeotérmica de Harvard (sensor de temperatura rectal que controla una manta térmica eléctrica). Se insertó un catéter Swann-Ganz para medir la presión y controlar el gasto cardíaco (monitor de gasto cardíaco continuo (CCO) Vigilance de Baxter) en la arteria pulmonar a través de la vena femoral y una incisión en la ingle. Se insertó un catéter transductor de presión arterial sistémica en la arteria femoral a través de la misma incisión. Se insertó una cánula Venflon® de 1,4 mm en la vena cefálica derecha proximal a la articulación del codo, para la inyección de sustancias de prueba. Se realizó una esternotomía media y se aplicó PEEP a la salida del respirador al ingresar en los espacios pleurales. Se extrajo el pericardio anterior y se suspendió el corazón suturando el borde del pericardio restante a los bordes de la herida. Se canuló el apéndice auricular de la aurícula izquierda para inyecciones de DP activado, sin pasar por la circulación pulmonar.
El animal se anticoaguló por completo mediante una única inyección intravenosa de heparina (1000 i.u./kg de peso corporal) después de conseguir la hemostasia quirúrgica completa y antes de que se iniciara la circulación extracorpórea. La derivación extracorpórea y su tubo asociado se llenaron con solución salina isotónica y se evacuó todo el aire del sistema antes de establecer las conexiones a los catéteres carotídeo y yugular.
La presión dentro de la cámara de medición acústica se comprobó a intervalos regulares conectando brevemente el transductor de presión de la arteria pulmonar a un puerto lateral de la cámara, manteniendo el transductor al mismo nivel de elevación que la cámara.
No se observaron desviaciones significativas en el flujo o la presión en la circulación de derivación durante los experimentos, y no se observaron depósitos de coágulos de fibrina dentro de los dispositivos de derivación después de los experimentos. De este modo, la anticoagulación fue adecuada.
Se desarrolló un modelo matemático del sistema de flujo para estimar la concentración máxima en la celda de medición, en función del caudal en la celda, y la semivida de la burbuja activada y la semivida del bolo. A continuación, se puede ajustar el caudal, modificando la resistencia al flujo, a efectos de garantizar una dosis adecuada en la celda de medición. Además, se desarrolló un modelo matemático para estimar la concentración de burbujas activadas en la sangre arterial a partir de la concentración observada en la celda de medición.
E3- 4 Resultados
La figura 14 muestra una curva habitual de concentración-tiempo de burbujas activadas en el compartimiento de sangre arterial después de la corrección del gasto cardíaco, el flujo a través de la celda, el tiempo de tránsito a la celda y la vida útil de la burbuja activada. Solo se trazan los dos primeros minutos para mayor claridad de visualización. El eje x es el tiempo en segundos y el eje y es la fracción de gas de la población de burbujas activadas en la sangre arterial en partes por millón.
La tabla 7 siguiente muestra los diámetros promedio ponderados por volumen de burbujas activadas después de la inyección i.v. medida en condiciones arteriales (saturación normal de gases en sangre arterial, presión hidrostática de, aproximadamente, 60 mmHg). El valor promedio de todas las observaciones de la tabla es de 21,4 |o.m.
Tabla 7 Diám r r m i n r r v l m n l r iv n n i i nes arteriales
Figure imgf000034_0001
La tabla 8 siguiente muestra las tasas de contracción de la burbuja activada a la presión arterial y venosa, dadas como semivida de disminución de la fracción de volumen de gas en la cámara de medición acústica. Las presiones se han calculado a partir de las mediciones del catéter/transductor de la presión arterial y suponiendo una presión venosa (vena yugular) de cero. Téngase en cuenta la disminución más rápida de la presión arterial que está provocada por la presión parcial elevada de todos los gases dentro de las burbujas activadas, dando mayores gradientes para la difusión de gas hacia el exterior.
Tabla 8 Presiones de las cámaras arterial y venosa y semividas de las burbujas activadas
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Las burbujas activadas en la sangre arterial tienen diámetros de 20 a 22 mieras, bien dentro del intervalo previsto. Después de la inyección de la sustancia en la aurícula izquierda y la activación en el ventrículo izquierdo, las burbujas activadas se vuelven ligeramente más grandes, de 22 a 25 micras de diámetro. La verificación de las mediciones y los cálculos correctos en todos los animales se ha obtenido mediante análisis in vitro paralelos con activación de las muestras inyectadas mediante irradiación con US.
E3-5 Conclusiones
El ejemplo 3 confirma que la composición se activa dentro del intervalo de MI deseado y produce un crecimiento y dinámica de burbujas dentro del intervalo de tamaño deseado in vivo después de la administración intravenosa. Ejemplo 4 (E4): microscopía intravital sobre la naturaleza del depósito de burbujas activadas y modelo de respuesta a la irradiación con US, en comparación con microburbujas normales
E4-1 Introducción
Con el fin de seguir estudiando y demostrar las características de las burbujas grandes producidas después de la activación in vivo, se realizó un estudio de observación directa de las burbujas de cambio de fase activadas individuales dentro de la microcirculación mediante microscopía del mesenterio de rata. Además, para describir las diferencias significativas entre las burbujas activadas grandes de la presente invención y las microburbujas de contraste normales de US, tales como, por ejemplo, Sonazoid, se realizó un modelo teórico de la respuesta de volumen a la insonación por US.
E4-2 Componentes y composiciones investigados
Las composiciones investigadas en este estudio fueron las detalladas en E1-2.
E4-3 Metodología
En el estudio se utilizaron ratas Wistar macho. La composición se administró por vía intravenosa a una dosis de 1 ml de DP/kg de peso corporal (es decir, microgotas de 4 μl-kg de peso corporal y microburbujas de 8 μl/kg de peso corporal). Se administró anestesia general y se mantuvo con inyección i.v. y pentobarbital sódico. i.m. Se intubaron las ratas y se canuló la vena de la cola o la vena carótida para la administración de la formulación de prueba. Se aplicó ultrasonidos para activar las agrupaciones en el mesenterio. Se abrió el abdomen por medio de una incisión vertical en la línea media, a continuación, se colocaron las ratas en posición lateral sobre una placa de plástico que incorporaba una ventana redonda de vidrio de cobertura, y se colocaron los mesenterios exteriorizados sobre la ventana de vidrio de cobertura. Los mesenterios extendidos se perfundieron con tampón de Krebs-Ringer a 37 °C. Se aplicó ultrasonidos directamente sobre el mesenterio exteriorizado bajo la lente diana del microscopio. Se utilizó un escáner de ultrasonidos (Elegra; Siemens, Seattle, Washington) equipado con una sonda lineal (7.5L40) para la exposición a los ultrasonidos. La potencia de salida se fijó al máximo correspondiente a un valor MI de 1,2. Se aplicó gel de sónar entre el transductor de ultrasonidos y la pared torácica o el mesenterio. Las imágenes se grabaron en cinta S-VHS o DV para su posterior revisión.
Las simulaciones del cambio de volumen de las burbujas activadas de la presente invención y las microburbujas normales de HEPS/PFS (C1 reconstituido con agua) tras la insonación se modelaron utilizando el modelo de burbuja no lineal desarrollado por Lars Hoff y descrito en Acoustic Characterization of Contrast Agents for Medical Ultrasound Imaging, Kluwer Academic Publishers, 2001, Capítulo 8. Parámetros de simulación para la burbuja de cambio de fase activada: pulso impulsor de 8 ciclos con un Ml de 0,2 y una frecuencia de 0,5 MHz, en sangre y un diámetro en reposo de 30 micras. Parámetros de simulación para las microburbujas de HEPS/PFS: pulso impulsor de 8 ciclos con un Ml de 0,2 y una frecuencia de 5 MHz, en sangre y un diámetro en reposo de 3 micras.
E4-5 Resultados
Sin activación por ultrasonidos:
Se utilizaron dos animales. No se observaron burbujas de cambio de fase grandes en la microcirculación del mesenterio después de las 6 inyecciones.
Activación por ultrasonidos:
Se utilizaron tres animales. Se observaron burbujas activadas grandes después de todas las inyecciones. Las burbujas activadas solo se observaron después de la aplicación de ultrasonidos. La fase de crecimiento de las burbujas de cambio de fase activadas se pudo observar en tiempo real. El núcleo de la burbuja activada creció en unos pocos segundos junto con la obstrucción del flujo sanguíneo de la microvasculatura. No se observó expansión de la microvasculatura. Las burbujas activadas se encogieron gradualmente y avanzaron de manera intermitente en la microvasculatura. Todas las burbujas de cambio de fase activadas eran más grandes que los glóbulos rojos y se alojaban en la microvasculatura y bloqueaban de manera transitoria el flujo sanguíneo. Todas las burbujas activadas eran no esféricas y tenían forma elipsoidal, formándose contra una sección de la microvasculatura.
La figura 15 muestra fotogramas de una burbuja de cambio de fase activada en el mesenterio; (arriba a la izquierda) 17 segundos después de la inyección en la microvasculatura, bloqueando el flujo sanguíneo; (arriba a la derecha) a los 5 minutos y 19 segundos; (abajo a la derecha) a los 5 minutos y 45 segundos, respectivamente. La burbuja de cambio de fase activada (indicada por la flecha) se encoge gradualmente y avanza en la microvasculatura alojándose y desalojándose de manera intermitente, antes de que se diluya por completo. La figura 15 (abajo a la izquierda) muestra una ampliación esquemática de 5 veces de la caja rectangular discontinua indicada en la imagen (arriba a la izquierda). El contorno de la burbuja de cambio de fase se muestra (A) con una barra de escala de 20 micras que se muestra en C. Suponiendo una burbuja cilíndrica, se mide una longitud de 30 micras y una anchura de 13 micras, lo que da un volumen de 3982 micras cúbicas, equivalente a una burbuja esférica de 20 micras de diámetro, en excelente concordancia con los resultados detallados en E3. Se muestra a escala una microburbuja de HEPS/PFS (B). Estas microburbujas normales de contraste con US fluyen claramente de forma libre en la microvasculatura y no están en contacto con la pared endotelial.
Simulación de la dinámica de la burbuja cuando se expone al campo de ultrasonidos:
Los resultados se muestran en la figura 16. La burbuja de cambio de fase tiene un diámetro mínimo de 22,8 y un diámetro máximo de 36,4 micras cuando oscila en respuesta al campo ultrasónico impulsor. La microburbuja de HEPS/PFS tiene un diámetro mínimo de 2,3 y un diámetro máximo de 4,1 micras cuando oscila en respuesta al campo ultrasónico impulsor. Los cambios de volumen absolutos inducidos por las burbujas de cambio de fase son, aproximadamente, tres órdenes de magnitud mayores que los de las microburbujas de HEPS/PFS.
E4-5 Conclusiones
Se observaron burbujas de cambio de fase activadas con un tamaño de, aproximadamente, 20 p.m cuando se aplicó la activación por ultrasonidos. No se observaron burbujas de cambio de fase activadas cuando no se aplicó la activación por ultrasonidos. Las burbujas de cambio de fase activadas se depositaron de manera transitoria (5-19 minutos) en la microcirculación, pero se desalojaron a medida que disminuía su tamaño.
La simulación de los cambios de volumen de una burbuja de cambio de fase durante la insonación con US muestra una respuesta mayor, en tres órdenes de magnitud, que una microburbuja de HEPS/PFS, lo que demuestra el trabajo mecánico ejercido de órdenes de magnitud mayor sobre el tejido por la burbuja de cambio de fase.
Ejemplo 5 (E5) - Estudios de formulación
E5-1 Introducción
Como resulta evidente a partir de E1, los inventores de la presente invención han optado deliberadamente por centrar los estudios de formulación en la variación de C2. Esto es con el fin de estudiar los efectos generales sobre la capacidad de formar agrupaciones tras la preparación del DP y, de esta manera, obtener un control con las características de las agrupaciones y dilucidar su importancia. Es razonable suponer que los aspectos/efectos generales de la formulación que se muestran en E1 se aplican a una amplia variedad de sistemas de formulación de microburbujas/microgotas. Para demostrar esto, se han probado seis formulaciones de microburbujas disponibles en el mercado para la preparación de la composición de agrupaciones y la activación posterior.
Además, dos aspectos importantes de la presente invención: la estabilidad de la preparación farmacéutica en términos de evitar la activación espontánea (tal como se indica en la Patente WO99/53963) y la capacidad de cargar las microgotas con un agente terapéutico, se elucidan en el presente ejemplo.
E5-2 Composiciones de agrupaciones de formulaciones de microburbujas disponibles en el mercado Con el fin de demostrar que el concepto de la presente invención es aplicable a una amplia variedad de formulaciones de microburbujas, se analizó el contenido de agrupaciones mediante microscopía/análisis de imágenes del DP elaborado a partir de C2, tal como se detalla en E1-2, y seis productos de microburbujas disponibles en el mercado, como C1, y el volumen y diámetro de las burbujas activadas mediante sonometría. Los componentes de microburbujas investigados como C1 se detallan en la tabla 9 junto con los proveedores, la composición del núcleo de gas, la membrana estabilizante y la forma farmacéutica.
Tabla 9 Formulaciones de microburbuas dis onibles en el mercado analizadas como C1
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Para las formas liofilizadas, la preparación de las composiciones de agrupaciones se realizó, tal como se detalla en E1-2, reconstituyendo el C1 con un volumen de C2, tal como se detalla en el prospecto de cada formulación (2 ml para Sonazoid, 5 ml para Sonovue y 0,7 ml para Micromarker). Para Optison y Definity, se aislaron las microburbujas en un vial de producto eliminando el infranadante después de la segregación de las microburbujas y la composición de agrupaciones se preparó añadiendo el mismo volumen de C2 al vial antes de la homogeneización. Para Polyson L, se mezclaron 0,5 ml de C1 homogeneizado con 0,5 ml de C2.
Los resultados del contenido de agrupaciones y el volumen y diámetro de las burbujas activadas en las diversas composiciones de agrupaciones se indican en la tabla 10. El componente C1 detallado en E1-2 tiene la misma formulación y forma que el agente de contraste comercial Sonazoid, por lo tanto, se esperaría que estos dos agentes, cuando se utilizan como C1, generen composiciones de agrupaciones con características similares; como lo confirman los resultados indicados en la tabla 11. De los otros 5 productos de microburbujas comerciales investigados, todos menos Definity produjeron una composición de agrupaciones con cantidades significativas de agrupaciones que, tras la irradiación con US, se activaron y mostraron un volumen de burbujas activado significativo. Micromarker, Optison, Sonovue y Polyson, aunque muestran una fuerte variación en la composición química del núcleo de gas y la membrana estabilizante, muestran características para sus respectivas composiciones de agrupaciones que son comparables a las preparadas con Sonazoid y C1, tal como se detalla en E1-2. Si bien no se desea quedar limitado por consideraciones teóricas, es posible que la razón por la que las microburbujas Definity no formen agrupaciones con la microgota en C2 sea la utilización del componente PEG-DDPE en la membrana estabilizante. Es probable que este componente cree una capa gruesa y densa de agua que rodea la microburbuja, protegiendo así la atracción electrostática de las microgotas de C2. Un descubrimiento adicional de este estudio, al utilizar un objetivo 50X con un intervalo de medición de 0,5 a 40 μm, fue la observación de una cantidad significativa de agrupaciones de menos de 3 μm en las composiciones de agrupaciones preparadas con Sonovue y PolySon L. Estos agentes de microburbujas contienen una cantidad significativa de microburbujas pequeñas en comparación con C1, tal como se detalla en E1-2, Sonazoid u Optison. En las composiciones de agrupaciones preparadas con Sonovue y PolySon se observó una fracción significativa de agrupaciones formadas a partir de microburbujas de ~1 μm y microgotas de ~1 μm, y estas aparentemente contribuyeron al volumen de burbujas activadas después de la irradiación con US. Las agrupaciones en el intervalo de tamaño de 1 a 10 μm deberían considerarse, por lo tanto, como funcionales según la presente invención.
Tabla 10 Contenido de agrupaciones y volumen de burbujas activadas para composiciones de agrupaciones preparadas utilizando varias formulaciones de microburbujas disponibles en el mercado como C1
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Estos resultados reportados anteriormente demuestran que el concepto de la presente invención es aplicable a una amplia variedad de formulaciones C1, tanto en lo que respecta a la composición del núcleo de gas como en lo que respecta a la composición de la membrana estabilizante.
E5-3 Activación espontánea y activación por US
La naturaleza básica de la formulación está dirigida hacia una desestabilización del sistema, es decir, la generación inducida por US de burbujas de cambio de fase grandes a partir de la combinación de microburbujas y microgotas. Esta desestabilización debe ocurrir de manera controlada, in vivo y en el sitio diana (patología), y el crecimiento espontáneo (activación) tras la preparación del DP, o inmediatamente después de la administración (es decir, en ausencia de insonación) es perjudicial para la funcionalidad de la presente invención. La Patente WO99/53963 solo explora la coadministración de los dos componentes, pero señala que, si los componentes se mezclan antes de la administración, es probable que para evitar esta activación espontánea del sistema se requiera almacenamiento a presión elevada o temperatura baja después de la combinación de C1 y C2. Los inventores de la presente invención han tratado de eliminar estas necesidades, obviamente engorrosas y limitantes, para proporcionar una formulación que sea estable en condiciones ambientales. Tal como se indica en la Patente WO99/53963, basándose en una evaluación teórica, es probable que la activación espontánea esté en función del punto de ebullición (p. eb.) de la fase oleosa y su presión de vapor (p.v.). Sin embargo, los autores de esta patente no han identificado la posibilidad de que la solubilidad en agua de la fase oleosa pueda ser un contribuyente aún más importante para la desestabilización espontánea y el crecimiento de burbujas al combinar C1 y C2. Para dilucidar estas relaciones y proporcionar una solución a este problema, se examinaron diversos componentes de la fase de microgotas (aceites de fluorocarbono), con una amplia gama de p. eb., p. v., y solubilidades en agua, y se utilizaron para la fabricación de C2. A continuación, estas muestras se combinaron con C1 y se evaluó el contenido de burbujas activadas espontáneamente y activadas por US. La fabricación y el análisis de estas muestras se describen a continuación.
Se pesaron 641 mg de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y 73 mg de cloruro de 1,2-diestearoil-3-(trimetilamonio)propano (DSTAP) en un matraz de fondo redondo de 250 ml y se añadieron 50 ml de cloroformo. La muestra se calentó con agua corriente caliente hasta que se obtuvo una solución transparente. El cloroformo se eliminó por evaporación a sequedad en un evaporador rotatorio a 350 mm Hg y 40 °C, seguido de secado adicional a 50 mm Hg en un desecador durante toda la noche. A continuación, se añadieron 143 ml de agua y el matraz se colocó de nuevo en un evaporador rotatorio y los lípidos se rehidrataron a velocidad de rotación máxima y una temperatura del baño de agua de 80 °C durante 25 minutos. Las muestras se colocaron en el refrigerador durante toda la noche. La dispersión de lípidos se transfirió a un vial adecuado y se almacenó en el refrigerador hasta su utilización.
Se prepararon emulsiones transfiriendo alícuotas de 1 ml de la dispersión lipídica fría a viales de cromatografía de 2 ml. A cada uno de los siete viales se añadieron 100 μl de los aceites de fluorocarbono, tal como se detalla en la tabla 11. Los viales de cromatografía se agitaron en un CaμMix (Espe, GmbH) durante 75 segundos. Los viales se enfriaron inmediatamente en hielo, se combinaron y se mantuvieron fríos hasta su utilización. Se realizó un análisis de recuentos de Coulter para determinar la concentración en volumen de las microgotas y, a continuación, se diluyeron las emulsiones con agua hasta 10 μl/ml de fase dispersa.
Se reconstituyó C1 (tal como se detalla en E1-2) en 2 ml de agua y se mezcló junto con las muestras de C2 preparadas en un tubo de 10 ml en una proporción de 10:1 y se agitó cuidadosamente a mano. A continuación, la mezcla se diluyó con 7 ml de agua. Las muestras se evaluaron en busca de burbujas activadas espontáneamente y activadas por Us , mediante microscopía en la versión manual de la metodología descrita en E1-4. Se transfirió un ml de esta solución a una celda de microscopio en la que se estabilizó la temperatura a 37 °C después de 2 minutos. La celda se configuró de modo que se pudiera aplicar a la muestra sonicación por ultrasonidos, utilizando un transductor ATL 3-2 con una frecuencia central de 2,25 MHz. Con un aumento de 200X, se escaneó toda el área de la celda y se evaluó semicuantitativamente mediante inspección visual el contenido de burbujas grandes (> ~ 15 μm) activadas espontáneamente. Para cada muestra, se otorgó una puntuación en el intervalo de 0 a 2, en el que 0 designa “ninguna o muy pocas burbujas de cambio de fase grandes observadas”, 1 designa “número medio de burbujas de cambio de fase grandes observadas” y 2 designa “gran número de burbujas de cambio de fase grandes observadas”. A continuación, la muestra se insonó durante 5 s a un MI nominal de 0,8 y se contó y puntuó de la misma manera el contenido de burbujas grandes activadas por US. Los resultados de este estudio se detallan en la tabla 11 junto con las características fisicoquímicas de los compuestos investigados.
Tabla 11 Compuestos investigados y sus características fisicoquímicas: punto de ebullición (p. eb., °C), presión de vapor (p.v., torr) a 20 °C y solubilidad en agua (logaritmo de la solubilidad molar). Comparado con los resultados a partir de la evaluación de la cantidad de burbujas activadas espontáneamente y por US.
Calificación 0 = nula o^ mu limitada Calificación^ 1 = media Calificación 2 = alta.
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Los datos ubicados en la tabla 11 muestran que, sorprendentemente, el nivel de activación espontánea no está significativamente correlacionado con el p. eb. o la p. v. sino que está fuertemente relacionado con la solubilidad en agua del componente de aceite, al igual que el nivel de activación por US. La figura 17 muestra la solubilidad en agua frente a la calificación de activación espontánea y por US. Tal como se puede apreciar, se observa una marcada disminución en la formación de burbujas activadas espontáneamente con una solubilidad en agua decreciente, mientras que se observa un marcado aumento en el nivel de burbujas activadas por US con una solubilidad en agua decreciente. Estos resultados demuestran que el DP se puede estabilizar frente a la activación espontánea utilizando componentes de aceite para C2 con una solubilidad en agua por debajo de, aproximadamente, 1 ■ 10-5 M y también que el nivel de activación por US se beneficia de una solubilidad en agua por debajo de este nivel. Téngase en cuenta, sin embargo, que como se muestra en E5-4, una fracción significativa del componente de microgotas de la emulsión puede estar compuesta por componentes (por ejemplo, codisolventes añadidos para aumentar la carga del fármaco) con una mayor solubilidad en agua, sin que aumente la activación espontánea o disminuya la activación inducida por US.
E5-4 Carga de fármacos y codisolventes
En un aspecto de la presente invención, se añade un compuesto terapéutico a la fase de aceite de microgotas para su liberación en el sitio diana in vivo tras la activación. Con el fin de dilucidar los conceptos para conseguir dicha carga, se realizaron una serie de estudios de formulación. Estos se resumen brevemente a continuación.
Basándose en los estudios de selección de los diversos componentes informados en E5-3, con respuestas adicionales, tales como la facilidad de emulsificación, la estabilidad de las emulsiones, la disponibilidad, la calidad, etc., se seleccionó el perfluorometilciclopentano (pFMCP) como el principal componente del aceite para la fabricación de C2, con una membrana estabilizante de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) con estearilamina (SA) añadida para una carga superficial positiva. Como punto de partida para el estudio de la carga de fármacos, se realizó una evaluación teórica de la solubilidad de diferentes solutos (fármacos y cromóforos para imágenes ópticas) en pFMCP y una variedad de otros componentes del aceite. Esta evaluación se realizó utilizando un software de última generación para la evaluación de la compatibilidad disolvente-soluto; Parámetros de solubilidad de Hansen, HSPiP v.4 (Steven Abbott TCNF Ltd.). El análisis HSPiP calcula tres propiedades básicas relacionadas con la compatibilidad entre sustancias; polaridad, dispersión y enlace de hidrógeno y una distancia en este espacio tridimensional entre, por ejemplo, un disolvente y un soluto; la distancia de Hansen (Hd). Cuanto más cerca estén el disolvente y el soluto en este espacio, (relativamente) mejor será la solubilidad del soluto en el disolvente. La teoría de Hansen predice que un Hd ≤ 8 representa un par soluble de “soluto en disolvente”, 8 ≤ Hd ≤ 12 representa una solubilidad parcial y Hd > 12 representa la no solubilidad. Este análisis se realizó para 1) una serie de disolventes, seleccionados basándose en un p. eb. ≤ 65 °C, solubilidad en agua ≤ 0,1 M y biocompatibilidad probable (toxicidad), con un gran intervalo en los parámetros de Hansen y 2) una serie de solutos específicos; fármacos quimioterapéuticos y moléculas adecuadas para la formación de imágenes ópticas. Basándose en los criterios de selección de disolventes establecidos, los disolventes preferentes fueron todos los hidrocarburos parcialmente halogenados. Se determinó experimentalmente la miscibilidad entre el disolvente y la solubilidad de los solutos en uno de los disolventes. Los resultados de este estudio se indican en la tabla 12. Además de los datos indicados en la misma, se descubrió que el clorotrifluoropropano (CltFPr) y el diclorodifluoroetano (dCldFEt) eran completamente miscibles en pFMCP, diclorometano (dClMe) y triclorometano (tClMe).
Tabla 12 Propiedades fisicoquímicas de los disolventes: punto de ebullición (p. eb.), presión de vapor y solubilidad en agua (logaritmo de solubilidad molar y moléculas diana, distancia de Hansen (H d ) de pFMCP y tClMe miscibilidad/solubilidad en tClMe véase el texto .
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Tal como se puede observar a partir de estos resultados, mientras que la Hd calculada se ajusta razonablemente a la miscibilidad predicha entre disolventes, no es un buen predictor de la solubilidad absoluta de las diversas moléculas diana en tClMe. Esto muestra que el análisis de Hansen es principalmente una herramienta para la solubilidad relativa de una molécula dada en varios sistemas de disolventes y no se puede utilizar para estimar la solubilidad absoluta de varios compuestos en varios sistemas de disolventes.
Para siete de las sustancias ubicadas en la tabla 12, se correlacionó también la solubilidad medida en tClMe con los valores de la literatura para LogP y LogS. Mientras que este análisis indicó, tal como se esperaba, que la solubilidad en tClMe está en función de la lipofilia, estas características no pudieron predecir la solubilidad absoluta. Las sustancias con un LogP ≤ 0,9 y un logS > -2,7 no mostraron solubilidad o la solubilidad fue muy baja, pero para las sustancias con un intervalo de LogP de 3,2 a 3,9, la solubilidad varió de 50 a 350 mg/ml sin covarianza con LogP, y para las sustancias con un intervalo de LogS de -3,7 a -5,2, la solubilidad varió de 20 a 350 mg/ml sin covarianza con LogS.
Estas evaluaciones muestran que, mientras que son preferentes las sustancias lipófilas, la compatibilidad entre cualquier agente terapéutico específico y la presente invención necesita probarse experimentalmente.
Ninguna de las moléculas diana en la tabla 12 mostró una solubilidad medible en pFMCP, de esta manera, fue necesaria la utilización de un codisolvente para conseguir una capacidad de carga funcional. Dado que la miscibilidad de d-ClMe y t-ClMe en pFMCP es solo de un 10 %, se indica una construcción de “escalera de disolventes”, es decir, la utilización de un tercer disolvente entre tClMe y pFMCP en el espacio de Hansen. Basándose en estas consideraciones, se seleccionó una mezcla 1:1:1 (por volumen) de pFMCP, ClrFPr y pFMCP para estudios adicionales sobre C2 cargado con compuestos terapéuticos o de imagen óptica.
Se evaluó la solubilidad de rojo Nilo (NR), DiR y Paclitaxel (Ptx) en la mezcla 1:1:1 de pFMCP, ClrFPr y pFMCP y se descubrió que fue > 5 mg/ml, > 10 mg/ml y > 25 mg/ ml, respectivamente. Además, se exploró una mezcla 1:1:2 de dichos tres disolventes cargados con Ptx. La solubilidad de Ptx en esta mezcla de disolventes fue > 50 mg/ml, lo que demuestra que la capacidad de carga se puede incrementar sustancialmente cambiando la composición de la fase oleosa. Se fabricó C2 con una mezcla 1:1:1 de estos componentes, tal como se detalla a continuación.
Se preparó una dispersión lipídica pesando 250 mg de DSPC con SA al 3 % mol/mol en 50 ml de agua en un matraz de fondo redondo de 100 ml, se hidrató durante 30 minutos a y se dejó enfriar a 80 °C. Se pesaron X mg de sustancia (siendo X 5, 10 y 25 mg para NR, DiR y Ptx, respectivamente) y se disolvieron en 333 μl de tClMe (solución A). Se diluyeron 333 μl de la solución A con 333 μl de CltFPr 333 μl de pFMCP (solución B). Se añadieron 900 μl de dispersión de lípidos a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Se añadieron 100 μl de solución B a la dispersión de lípidos en el tubo de centrífuga. Se consiguió la emulsificación utilizando un amalgamador ZoneRay® Dental HL-AH G7 a 3.200 rpm durante 20 s. La emulsión resultante se centrifugó durante 5 min a 25 G. Después de la centrifugación, las microgotas formaron una capa de sedimento definida. El sobrenadante, que contenía un exceso de vesículas lipídicas, se eliminó con cuidado, se añadió un volumen equivalente de TRIS 5 mM en agua y las microgotas se redispersaron mediante agitación manual. Se realizó un análisis de Coulter y, basándose en la concentración de volumen detectada de microgotas, la emulsión se diluyó a 5 mM a 3 μl de microgotas/ml.
Las muestras resultantes de C2 se evaluaron mediante microscopía y análisis de Coulter. La figura 18 muestra micrografías de la evaluación microscópica. Para todas las muestras, se observaron emulsiones estables con tamaños de microgotas en el intervalo diana de 1 a 5 μm. Además, las sustancias cargadas están claramente contenidas en un estado disuelto dentro de las microgotas; no se observa material extravesicular y las microgotas son transparentes y de color homogéneo sin signos de precipitación. Para todas las muestras, el análisis de Coulter mostró, aproximadamente, 3 μl de microgotas/ml con un tamaño promedio de, aproximadamente, 3 μm.
Junto con C1, tal como se detalla en E1-2, estas muestras de C2 se utilizaron a continuación para la preparación del DP, cuya reactividad se evaluó mediante conteo de Coulter, agrupamiento por microscopía y tamaño y volumen de burbujas activadas por sonometría. La reactividad observada para todas las muestras estuvo en el intervalo del 40-70 %, la microscopía confirmó la presencia de agrupaciones, pero no mostró evidencia de activación espontánea, el volumen de burbujas activadas estuvo en el intervalo de 100-200 μl/μl de microgotas y las microgotas activadas el tamaño de la burbuja estuvo en el intervalo de 42-48 μm. Estos resultados demuestran;
• Que la fase oleosa de microgotas puede comprender una gama de disolventes con el fin de obtener una capacidad de carga de fármaco aceptable. Para esto, son particularmente útiles los hidrocarburos parcialmente halogenados.
• Que una fracción significativa (por ejemplo, > 60 % v/v) de los disolventes puede tener una solubilidad en agua significativamente mayor (por ejemplo, ≤ 1 ■ 10-1 M) que lo indicado por E5-2 (≤ 1-10-5 M).
• Que estas formulaciones conservan los atributos críticos del concepto en la formación de agrupaciones en la composición de agrupaciones, su capacidad de activación por insonación y la falta de activación espontánea.
Las muestras de C2 cargadas con DiR, tal como se han descrito anteriormente, se utilizaron para evaluar la administración in vivo (véase E8). Las muestras C2 cargadas con NR, tal como se han descrito anteriormente, se utilizaron para evaluar la expresión de la sustancia cargada tras la activación (véase E6).
Ejemplo 6 (E6) - Expresión de sustancia cargada tras la activación
E6-1 Introducción
Para investigar cómo se expresará una sustancia molecular cargada en las microgotas de C2, después de la activación de la composición de agrupaciones, se realizó un estudio de microscopía de fluorescencia. Se activó y estudió mediante microscopía de fluorescencia una composición de agrupaciones en la que las microgotas en C2 se habían cargado con colorante rojo Nilo (NR).
E6-2 Compuestos y procedimientos
Se utilizó C2 cargado con 5 mg/ml de colorante rojo Nilo, tal como se detalla en E5-4, para preparar una composición de agrupaciones, tal como se detalla en E1-2. La composición de agrupaciones se diluyó en agua, se colocó en un pocillo de microscopía y se activó utilizando un escáner de US Vscan (GE Healthcare).
Las imágenes de la composición de agrupaciones activada se adquirieron utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP8. El objetivo utilizado fue un objetivo de inmersión en agua HCX IRAPO L 25X con una apertura numérica de 0,95. El colorante fluorescente se excitó a 539 nm mediante un láser de luz blanca sintonizable. Se detectó la emisión en el intervalo de 570 - 670 nm mediante un detector híbrido (HyD). La velocidad del láser utilizada fue de 400 Hz y el diámetro del orificio se fijó en 1 AU. Las imágenes de transmisión se adquirieron simultáneamente en otro detector, que podría superponerse con las imágenes de fluorescencia. Las intersecciones y las imágenes 3D de la muestra se adquirieron moviendo el revólver del objetivo en la dirección z.
E6-3 Resultados
La figura 19 muestra una micrografía de fluorescencia de una intersección de burbujas de cambio de fase después de la activación del DP, en la que el componente de microgotas C2 se cargó con 5 mg de NR/ml.
Tal como se puede observar en esta figura, después de la activación, el NR cargado está presente en la interfase líquido/gas. Después de la activación in vivo, si se carga con la sustancia terapéutica, dicha sustancia estaría en estrecho contacto con la pared endotelial y, por lo tanto, sería accesible para la extravasación.
Ejemplo 7 (E7) - Deposición de burbujas activadas en tumores
E7-1 Introducción
Con el fin de estudiar y demostrar adicionalmente las características de las burbujas grandes producidas después de la activación en un modelo tumoral, se realizó un estudio con imágenes de burbujas de cambio de fase activadas en xenoinjertos tumorales PC-3 de cáncer de próstata subcutáneo en un modelo murino, demostrando la naturaleza del depósito y la diferencia destacada en la cinética de mejora de contraste de microburbujas de HEPS/PFS de flujo libre.
E7-2 Componentes y composiciones investigados
Las composiciones investigadas en este estudio fueron las detalladas en E1-2.
E7-3 Metodología
Se utilizaron 16 ratones desnudos Balb/c hembra. Antes de la implantación del tumor, los ratones se pesaron, se anestesiaron con isoflurano y se marcaron las orejas. Se inyectaron lentamente por vía subcutánea 100 μl de suspensión celular que contenía 3 x 106 células PC-3 en el lado lateral de la pata trasera izquierda entre la cadera y la rodilla.
A los ratones se les administró anestesia quirúrgica mediante inyección subcutánea de una mezcla de fentanilo (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) y medetomidina (0,5 mg/kg). Se colocó una cánula intravenosa (BD NeoflonTM 24 GA) en la vena de la cola. La permeabilidad se verificó mediante la inyección de una pequeña cantidad (~20 μl) de cloruro de sodio al 0,9 % para inyección, después de lo cual se inyectó una pequeña cantidad (~10 μl) de heparina (10 U/ml) para evitar la coagulación. El centro de la cánula se llenó con cloruro de sodio al 0,9 % para inyección para eliminar cualquier espacio muerto y se cerró con una tapa. La cánula se aseguró a la cola con cinta quirúrgica. Se utilizaron tres sistemas comerciales de imágenes por ultrasonidos. Se tomaron imágenes del tumor para todos los experimentos con un sistema de imágenes de animales pequeños de alta frecuencia Vevo 2100 (VisualSonic Inc.) con un transductor MS250 (16-18 MHz). La composición de agrupaciones se activó in vivo con un sistema de imágenes clínicas Vivid E-9 (GE Healthcare) utilizando una sonda de imágenes de 2 MHz con una configuración de MI de 0,28, o un sistema de imágenes clínicas Vscan 1.2 (GE Healthcare) con una sonda de imágenes de 2 MHz con un ajuste nominal de MI de 0,8.
Los 16 animales se dividieron en 4 grupos de 4 animales en cada grupo. El sistema de activación y la dosis para los grupos se indican en la tabla 13.
T l 1 r inv i n r imi n iv i n i
Figure imgf000042_0001
Los ratones preparados se colocaron sobre una mesa de manipulación (con control de temperatura ajustado a 37 °C), sobre su lado derecho. Se levantó horizontalmente la pierna izquierda, se sostuvo por un trozo de tela y se fijó con cinta quirúrgica. Se aplicó abundante gel de ultrasonidos al tumor y se colocó una bolsa de baño de agua encima del tumor. Las imágenes se realizaron con el sistema de imágenes Visualsonics Vevo 2100 con el transductor colocado en el baño de agua, con el transductor de imágenes sostenido en un plano de exploración fijo. La activación de la composición de agrupaciones se realizó con un transductor adicional (Vivid E9 o Vscan) durante 75 segundos a partir del momento de la inyección de la composición de agrupaciones.
La activación de la composición de agrupaciones produce ecos de contraste que permanecen estacionarios en la imagen de ultrasonidos durante varios minutos. El número de señales de contraste estacionarias se contó por unidad de área del tumor que aparece en la imagen del plano de exploración. Suponiendo un grosor del plano de exploración de 0,2 mm, se derivó el número de ecos de cambio de fase por unidad de volumen de tumor.
E7-4 Resultados
El tumor es hipoecogénico en la imagen de ultrasonidos. Las imágenes tumorales típicas se muestran en la figura 20 tanto antes de la inyección de la composición de agrupaciones (imagen de la izquierda) como después de la inyección y activación (imagen de la derecha), mostrando la presencia de los ecos de cambio de fase estacionarios después de la activación (imagen de la derecha). El número estimado de ecos de contraste de cambio de fase estacionarios por ml de tejido tumoral se muestra en la tabla 14. Todos los tumores mostraron depósito de ecos de contraste estacionarios. Estos ecos se denominan estacionarios dado que permanecen estáticos en las imágenes de ultrasonidos durante varios minutos. La aplicación de una secuencia de ráfaga del sistema de imágenes Vevo 2100, que está diseñado para destruir microburbujas de contraste normales, tales como HEPS/PFS, no destruye los ecos estacionarios. Esto es consistente con la teoría que predice que las burbujas de cambio de fase no son destruidas por secuencias de ráfaga debido a su mayor tamaño, y confirma que los ecos de contraste estacionarios no son producidos por las microburbujas HEPS/PFS en la composición. La figura 21 muestra la cinética de mejora de contraste integrada típica en la región tumoral de las burbujas de cambio de fase (etiquetadas como A en la figura) en comparación con una dosis equivalente de solamente microburbujas de HEPS/PFS (etiquetadas como B en la figura). Esto demuestra la diferencia en la cinética de las burbujas de cambio de fase en comparación con las microburbujas de HEPS/PFS, es decir, depósito frente a naturaleza de flujo libre. La mejora de las microburbujas HEPS/PFS de flujo libre es mucho más transitoria. El contraste de las burbujas de cambio de fase muestra ecos estacionarios que se depositan en el tumor y permanecen durante varios minutos.
Tabla 14 Número promedio estimado de ecos estacionarios de cambio de fase por ml de tejido tumoral y desviación estándar DE.
Figure imgf000043_0001
Se aplicó un análisis de varianza de dos vías para la dosis y el tipo de activación (Vivid E9 o Vscan). Existe una diferencia estadísticamente significativa para la dosis con p=0,024 y una diferencia no significativa para el transductor de activación, p=0,352.
E7-5 Conclusiones
La composición de agrupaciones se activó con dos sistemas de imágenes clínicas diferentes, un Vivid E9 con una sonda de 2 MHz y un MI de 0,28, y un Vscan con una sonda de 2 MHz y un MI de 0,8, y se tomaron imágenes de los tumores con un sistema de imagen por ultrasonidos de alta frecuencia (16-18 MHz) de animales pequeños. Todos los procedimientos produjeron ecos de contraste estacionarios en los tumores. Estos ecos de contraste permanecen estacionarios en la imagen de ultrasonidos durante varios minutos, a diferencia de los ecos de contraste transitorios de las microburbujas HEPS/PFS. No se destruyen con secuencias de imágenes en ráfaga diseñadas para destruir microburbujas HEPS/PFS. Estas observaciones son consistentes con el depósito de burbujas de cambio de fase en el tejido tumoral. Se observó una respuesta a la dosis estadísticamente significativa (p=0,24) y la cantidad de depósito no fue estadísticamente diferente cuando se activó con los diferentes sistemas de imágenes clínicas con MI de 0,28 y 0,8 (p=0,352).
Ejemplo 8 (E8) - Administración de sustancias coinyectadas o cargadas a tumores
E8-1 Introducción
Con el fin de demostrar la capacidad de la presente invención para mejorar el suministro de moléculas in vivo, se realizaron estudios en un modelo de tumor xenógrafo PC-3 de ratón. Se exploraron tres sistemas modelo; coinyección del DP y colorante Evans Blue: coinyección de DP y agente EPR Licor CW800 e inyección de DP en la que se había cargado un colorante DiR en el componente de microgotas (C2). El azul de Evans es un colorante fluorescente que se une a la proteína albúmina cuando se inyecta i.v. En condiciones fisiológicas, el endotelio es impermeable a la albúmina, y la albúmina unida al azul de Evans permanece confinada dentro de los vasos sanguíneos. De este modo, el azul de Evans se utiliza a menudo como compuesto modelo en estudios de administración de fármacos [Bohmer et al., J Controlled Release, 148, número 1, 2010, págs.18-24]. La permeabilidad y retención mejoradas (EPR, Enhancedpermeability and retention) es una característica común de la vasculatura tumoral. El endotelio vascular en el microambiente tumoral a menudo es discontinuo, lo que permite que las moléculas se difundan en el tejido tumoral circundante. El agente de contraste colorante de IR 800CW PEG (25-60 kDa) disponible en el mercado (Li-Cor Biosciences Inc.) es un agente de formación de imágenes no específico destinado a acumularse en los tumores debido al efecto EPR. El colorante DiR es un colorante de carbocianina lipófila DiOC1e(7) fluorescente cerca del IR disponible en el mercado (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.) que es débilmente fluorescente en condiciones acuosas pero altamente fluorescente y fotoestable cuando se incorpora, por ejemplo, a membranas celulares. De este modo, se utilizaron técnicas estándar de extracción y cuantificación de azul de Evans en tejido y formación de imágenes ópticas con los colorantes 800CW PEG y DiR como compuestos modelo para la demostración in vivo de la administración de fármacos con la presente invención.
E8-2 Componentes y composiciones investigados
Las composiciones investigadas en este estudio fueron las detalladas en E1-2 (modelos de coinyección) y E5-4 (cargada con DiR).
E8-3 Metodología
En el estudio se utilizaron ratones desnudos Balb/c hembra. Antes de la implantación del tumor, los ratones se pesaron, se anestesiaron con isoflurano y se marcaron las orejas. Se inyectaron lentamente por vía subcutánea 100 μl de suspensión celular que contenía 3 x 106 células PC-3 en el lado lateral de la pata trasera izquierda entre la cadera y la rodilla.
A los ratones se les administró anestesia quirúrgica mediante inyección subcutánea de una mezcla de fentanilo (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) y medetomidina (0,5 mg/kg). Se colocó una cánula intravenosa (BD NeoflonTM 24 GA) en la vena de la cola. La permeabilidad se verificó mediante la inyección de una pequeña cantidad (-20 μl) de cloruro sódico al 0,9 % para inyección, después de lo cual se inyectó una pequeña cantidad (-10 μl) de heparina (10 U/ml) para evitar la coagulación. El centro de la cánula se llenó con cloruro de sodio al 0,9 % para inyección para eliminar cualquier espacio muerto y se cerró con una tapa. La cánula se aseguró a la cola con cinta quirúrgica.
La extremidad trasera del ratón se colocó en un baño de agua con dos transductores de US preparados para la insonación del tumor. La activación por ultrasonidos de la composición de agrupaciones fue proporcionada por un Vscan con una sonda de 2 MHz y un MI nominal de 0,8. La exposición ultrasónica posterior se aplicó utilizando un transductor personalizado de 500 kHz (Imasonic SAS), pulsos de 8 ciclos con una frecuencia de repetición de pulso de 1 kHz en un MI que oscila entre 0,1 y 0,8.
Azul de Evans
Se inyectaron 50 μl de azul de Evans (50 mg/kg), seguido inmediatamente de 50 μl de la composición de agrupaciones que contenía microgotas nominales de 1,5 μl de pFMCP 4,0 μl de microburbujas de HEPS/PFS por ml, o 4,0 μl de microburbujas solamente de HEPS/PFS por ml. La activación fue proporcionada por un escáner de ultrasonidos clínico Vscan con una sonda de 2 MHz durante 45 segundos a partir del momento de la inyección. Esto fue seguido posteriormente por 5 minutos de irradiación de ultrasonidos de 500 kHz con un MI de 0,1 o 0,2. Se sacrificaron los animales 30 minutos después del tratamiento, se recogieron muestras de tejido; el tumor, el músculo del muslo de la pierna tratada y el músculo del muslo de la pierna contralateral no tratada y se extrajo y cuantificó el contenido de azul de Evans. Se probaron tres animales en cada grupo, todos con activación de 45 s utilizando la sonda VScan. Los grupos y las variables se dan en la tabla 15.
Tabla 15 Grupos investigados con coinyección de colorante azul de Evans; procedimiento de US y elemento r . L iv i n r r liz n l nim l r nim l r r
Figure imgf000044_0001
Agente EPR CW800 de LiCor
Se administró agente EPR CW800 de LiCor a una dosis de 5 nmol/kg de peso corporal seguido inmediatamente por 50 μl de la composición de agrupaciones que contenía nominalmente 1,5 μl de microgotas de pFMCP 4,0 μl de microburbujas de HEPS/PFS por ml. La activación fue proporcionada por un escáner de ultrasonidos clínico Vscan con una sonda de 2 MHz durante 45 segundos a partir del momento de la inyección. Esto fue seguido posteriormente por 5 minutos de irradiación ultrasónica de 500 kHz con un MI de 0,2. Se realizaron imágenes de epifluorescencia de todo el cuerpo con un sistema de imágenes Pearl Impulse hasta 12 horas después de la administración. Los grupos y números de animales se dan en la tabla 16.
Tabla 16 Grupos investigados con coinyección de CW800 de LiCor; procedimientos de US. Se administró la dosis de com osición de a ru aciones a todos los animales
Figure imgf000044_0002
Se dibujó una región de interés sobre el tumor en la imagen de epifluorescencia y se calculó la intensidad promedio. También se dibujó una región de interés proporcional sobre el muslo contralateral no tratado en, aproximadamente, la misma ubicación en la pata. Se calculó una proporción adimensional de la intensidad de imagen promedio en el área de la región del tumor dividida por la intensidad de imagen promedio en la pata no tratada. El área bajo la curva de esta proporción se calculó e integró desde los puntos de tiempo de 1 minuto a 1 hora.
Composición de agrupaciones cargadas con DiR
Se administraron 50 μl de la composición de agrupaciones que contenía microgotas nominales de 1,5 μl de pFMCP cargadas con 10 mg/ml de colorante DiR 4,0 μl de microburbujas de HEPS/PFS por ml. La activación fue proporcionada por un escáner de ultrasonidos clínico Vscan con una sonda de 2 MHz durante 45 segundos a partir del momento de la inyección. Esto fue seguido posteriormente por 5 minutos de irradiación de US a 500 kHz con un MI de 0,2. Los campos de ultrasonidos se aplicaron a las patas izquierdas de los animales que portaban el tumor. El grupo de control recibió la misma composición de agrupaciones cargadas con DiR y los mismos procedimientos de manipulación, pero sin exposición a ultrasonidos. Los detalles del grupo de animales se dan en la tabla 17.
Tabla 17 Grupos investigados con inyección de composición de agrupaciones cargada con DiR; número de animales rocedimientos de US. Se dosificó la com osición de a ru aciones a todos los animales
Figure imgf000045_0001
Las imágenes epifluorescentes se adquirieron con el sistema de formación de imágenes por fluorescencia Pearl Impulse tanto antes de la inyección como 1 minuto después del tratamiento (aproximadamente 7 minutos después de la inyección) con adquisiciones de imágenes estandarizadas para permitir comparaciones cuantitativas. Las regiones de interés se dibujaron sobre el tumor en el muslo izquierdo, y una región de interés correspondiente se dibujó en el muslo derecho sin tumor de, aproximadamente, el mismo tamaño y ubicación anatómica. Se registró la intensidad de fluorescencia promedio en las regiones. Como respuesta primaria, se evaluó la diferencia en la intensidad de fluorescencia entre la imagen anterior a la inyección y la imagen posterior al tratamiento. Se realizó un análisis de varianza de dos vías con factores de pierna con tumor frente a sin tumor, e irradiación con US frente a no irradiación con US
E8-4 Resultado
Azul de Evans
El azul de Evans se extrajo y cuantificó de las muestras de tejido (mg/ml de tejido). La concentración en el músculo del muslo tratado se dividió por la concentración en el músculo del muslo no tratado para cada animal (par emparejado) para proporcionar una proporción adimensional de la captación aumentada en el músculo tratado. Se aplicó un ANOVA de una vía a los datos y los resultados se dan en la tabla 18. Hubo una duplicación aproximada estadísticamente significativa en la captación de azul de Evans en la pierna tratada con la composición de agrupaciones activada con la aplicación posterior de baja frecuencia. Para los otros grupos, no se observó un aumento estadísticamente significativo en la captación.
Tabla 18 Proporciones de captación (promedio y desviación estándar) para tejido muscular tratado frente a no tratado en diferentes ru os
Figure imgf000045_0002
Se tomaron muestras de tumor de los grupos 1 y 2. La concentración de azul de Evans se dividió por la concentración de azul de Evans en la muestra de tejido muscular del muslo sin tratar para proporcionar una proporción adimensional que describía el aumento de la captación. Se aplicó una prueba t de 2 muestras con asunción de misma varianza de muestra. Los resultados se muestran en la tabla 19. Hubo una captación aumentada en el tejido tumoral en comparación con el músculo del muslo no tratado de, aproximadamente, 3,4 a 1 para el tumor con ultrasonidos de 500 kHz aplicado después de la activación y de, aproximadamente, 2 a 1 sin la aplicación de ultrasonidos de 500 kHz posterior a la activación.
Tabla 19 Proporciones de captación (promedio, desviación estándar y error estándar del promedio) para el i m r l r fr n l i l m l n r n if r n r
Figure imgf000045_0003
Imágenes ópticas con agente de contraste EPR CW800 de LiCor
Las imágenes típicas de epifluorescencia se muestran en la figura 22 para un animal del grupo 1 (imagen de la izquierda; activación y posterior irradiación con US) y del grupo 3 (imagen de la derecha; sin activación, sin posterior irradiación con US). Las flechas indican la ubicación de los tumores. Las imágenes se tomaron con la misma configuración de escáner del sistema de imágenes Pearl y se presentan con la misma escala de grises lineal de intensidad de fluorescencia para una comparación directa. Los tumores en los dos animales tienen aproximadamente la misma ubicación y tamaño.
La figura 23 muestra la proporción de la intensidad de la fluorescencia del tumor respecto a la intensidad de la pierna de control sin tratar desde 1 minuto hasta 9 horas después del tratamiento. Hay una captación inicial estadísticamente mayor en el grupo 2 (cuadrados; solo activación) en comparación con el grupo 1 (rombos; sin activación, sin irradiación con US posterior) y una captación inicial y una tasa de captación estadísticamente aumentada en el grupo 3 (círculos; activación e irradiación con US posterior), en comparación con los grupos 1 y 2. Se calculó la proporción de la intensidad promedio en la región del tumor respecto a la intensidad promedio en la pierna no tratada para crear una proporción Diana a Fondo (TBR, target to background) adimensional, y se integró el área bajo la curva TBR desde 1 minuto hasta 1 hora después del tratamiento. La captación de imágenes se realizó los momentos temporales de 1 minuto, 30 minutos y 60 minutos para todos los animales. Los resultados se tabulan en la tabla 20. La figura 24 muestra los errores estándar promedio y estimados de los grupos 1, 2 y 3, etiquetados A, B y C respectivamente en la figura.
Tabla 20 Årea bajo la curva (ABC) para las proporciones de captación de TBR (promedio y desviación estándar ara el teido tumoral tratado frente al teido del muslo no tratado en diferentes ru os
Figure imgf000046_0001
Se aplicó un análisis de varianza a los tres grupos de tratamiento con un valor de p resultante de ≤0,001. Se aplicaron contrastes entre los grupos 1 y 2 con valor de p de 0,037, y entre los grupos 2 y 3 con valor de p de 0,005. De este modo, hay un aumento estadísticamente significativo (al nivel de 0,05) en el área bajo la curva entre los grupos 1 y 2 y entre los grupos 2 y 3.
Componente de microgotas cargadas con DiR de la composición de agrupaciones
En la figura 25 se muestran imágenes habituales de epifluorescencia posteriores al tratamiento para un animal del grupo 1 que no recibió exposición a ultrasonidos (etiquetado como A) y un animal del grupo 2 (etiquetado como B) con activación y posterior irradiación con US en la pata izquierda con tumor. En la tabla 21 se muestra la diferencia promedio en la intensidad de la fluorescencia definida como la intensidad promedio posterior al tratamiento menos la intensidad promedio anterior a la inyección para las patas izquierda (con tumor) y derecha.
Tabla 21 Aumento promedio ± DE en la intensidad de fluorescencia a partir de los valores anteriores a la in ección en diferentes ru os
Figure imgf000046_0002
Un análisis de varianza de dos vías da un valor de p ≤0,001 para el aumento de la intensidad de la fluorescencia en la pata con el tumor cuando se aplicó la activación por ultrasonidos y la posterior irradiación. Estos resultados demuestran la administración y la captación localizadas de la molécula de colorante fluorescente cargada en la fase oleosa del componente de microgotas (C2).
E8-5 Conclusiones
Hubo un aumento estadísticamente significativo en la administración de colorante azul de Evans al tejido muscular y tumoral al nivel de 0,05 tras la coinyección con la composición de agrupaciones, seguido de la activación con US y la posterior irradiación con US. Se observó una duplicación aproximada del azul de Evans en el tejido muscular tratado en comparación con la ausencia de activación y la posterior irradiación con US. No se observó un aumento significativo en la administración de azul de Evans con la administración únicamente de microburbujas de HEPS/PFS, y la aplicación de la activación y la posterior exposición a los ultrasonidos. La captación en el tejido tumoral en comparación con el tejido muscular no tratado aumentó en un factor de 2 tras solamente la activación y en un factor de 3,4 tras la activación y posterior irradiación con US.
Hubo un aumento estadísticamente significativo en la administración del agente EPR CW800 Licor al tejido tumoral tras la coinyección con la composición de agrupaciones y la activación por ultrasonidos en comparación con ninguna activación con ultrasonidos. Hubo un aumento estadísticamente significativo adicional en la administración con la irradiación posterior con ultrasonidos en la mejora de la administración, en comparación con solo la activación. Se observó un aumento estadísticamente significativo en la intensidad de la fluorescencia en la pierna con el tumor cuando se aplicó la activación y la posterior irradiación con US después de la inyección de una composición de agrupaciones en la que se había cargado colorante DiR en la fase oleosa de las microgotas en C2. Esto demuestra la administración localizada de una carga útil molecular de las microgotas, lo que confirma la liberación espacial específica y la captación en áreas expuestas al procedimiento de ultrasonidos.
Ejemplo 9 (E9) - Fabricación de los componentes y preparación de la composición de agrupaciones Ambos componentes se fabricaron de manera aséptica.
C1: se preparó una dispersión en bruto de microburbujas a partir de una dispersión lipídica estéril y un componente de gas estéril. La dispersión de lípidos se esterilizó térmicamente en un recipiente en masa y el gas se filtró de forma estéril. La línea de producción completa fue esterilizada con vapor. Las microesferas se produjeron in situ en un molino coloidal, alimentado de manera simultáneamente con dispersión de lípidos y gas. A continuación, el producto intermedio (dispersión en bruto) se fraccionó por tamaño en un recipiente de flotación, se diluyó hasta la concentración de microburbujas deseada con una solución acuosa de agente protector contra la liofilización, se rellenó de manera aséptica y se liofilizó.
C2: se preparó la emulsión de microgotas a partir de una dispersión lipídica estéril y un componente de aceite estéril. La dispersión de lípidos se esterilizó térmicamente en un recipiente en masa y el componente de aceite se filtró de forma estéril. La línea de producción completa fue esterilizada con vapor. Las microgotas se produjeron in situ en un molino coloidal, alimentado de manera simultánea con la dispersión de lípidos y el componente de aceite. A continuación, la emulsión en bruto se fraccionó por tamaño en una centrífuga en línea, se diluyó a la concentración de microgotas objetivo con una solución acuosa de tampón TRIS y se rellenó de manera aséptica.
Se fabricaron tres lotes consecutivos de cada componente y se sometieron a pruebas de esterilidad según las normas de Ph. Eur y USP. Los seis lotes pasaron las pruebas de esterilidad.
DP: la composición de agrupaciones se preparó de manera aséptica reconstituyendo un vial de C1 con 2 ml de C2, seguido de una homogeneización manual de 30 segundos. Se extrajeron 2 ml de un vial de C2 utilizando una jeringa y una aguja estériles de una sola utilización. Se añadió el contenido de la jeringa a través del tapón de un vial de C1 y se homogeneizó el DP resultante.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Composición de agrupaciones que comprende una suspensión de agrupaciones en un medio acuoso biocompatible, en la que dichas agrupaciones tienen un diámetro en el intervalo de 1 a 10 μm y una circularidad ≤ 0,9, y comprenden:
(i) un primer componente que comprende una microburbuja de gas y un primer estabilizante para estabilizar dicha microburbuja, en el que el gas de la microburbuja de gas comprende hexafluoruro de azufre, un compuesto perfluorocarbonado C3-6, nitrógeno, aire o mezclas de los mismos; y
(ii) un segundo componente que comprende una microgota que comprende una fase oleosa y un segundo estabilizante para estabilizar dicha microgota, en el que el aceite comprende un componente difusible capaz de difundirse en dicha microburbuja de gas para aumentar, como mínimo, de manera transitoria, el tamaño de la misma, y en el que la fase oleosa comprende un hidrocarburo parcial o totalmente halogenado o una mezcla de los mismos, en el que dicho segundo componente comprende, además, un primer agente terapéutico;
en la que las microburbujas y las microgotas de dicho primer y segundo componentes tienen cargas superficiales opuestas y forman dichas agrupaciones a través de interacciones electrostáticas atractivas, en la que el primer estabilizante y el segundo estabilizante tienen cada uno una carga electrostática neta que es opuesta a la del otro, y en la que el primer estabilizante y el segundo estabilizante comprenden cada uno, de manera independiente, un fosfolípido, una proteína o un polímero.
2. Composición farmacéutica, según la reivindicación 1, en la que el primer agente terapéutico se carga dentro del componente difusible de la microgota.
3. Composición farmacéutica, según la reivindicación 1 o 2, para su utilización como una composición farmacéutica.
4. Composición farmacéutica que comprende:
(i) la composición de agrupaciones, según la reivindicación 1 o 2;
(ii) un segundo agente terapéutico opcional, proporcionado en una mezcla con (I) o como una composición separada de (I).
5. Composición farmacéutica, según la reivindicación 4, en la que el segundo agente terapéutico está presente y se proporciona como una composición separada de la composición de agrupaciones (I).
6. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en la que el primer y el segundo agentes terapéuticos se seleccionan, de manera independiente, entre el grupo de: moléculas farmacológicas, nanopartículas y sistemas de administración de nanopartículas, genes y radioisótopos.
7. Agente de contraste para ultrasonidos que comprende la composición de agrupaciones, según la reivindicación 1 o 2, o la composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Composición farmacéutica para su utilización en un procedimiento para administrar, como mínimo, un agente terapéutico al individuo mamífero, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(i) administrar la composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, a un individuo mamífero;
(ii) opcionalmente, obtener imágenes de las microburbujas de dicha composición farmacéutica utilizando imágenes de ultrasonidos para identificar la región de interés para el tratamiento dentro de dicho individuo; (iii) activar un cambio de fase del componente difusible del segundo componente de la composición de agrupaciones de la etapa (i) mediante irradiación de ultrasonidos de una región de interés dentro de dicho individuo, de manera que:
(a) las microburbujas de dichas agrupaciones se agrandan mediante dicho componente difusible de la etapa (iii) para dar burbujas agrandadas que se localizan en dicha región de interés debido al bloqueo temporal de la microcirculación en dicha región de interés por dichas burbujas agrandadas; y
(b) dicha activación de la etapa (iii) facilita la extravasación del agente o agentes terapéuticos administrados en la etapa (i);
(iv) facilitar la extravasación adicional del agente o agentes terapéuticos administrados en la etapa (i) mediante irradiación de ultrasonidos adicional.
9. Composición farmacéutica, según la reivindicación 8, para su utilización, según el procedimiento de la reivindicación 8, en el que los ultrasonidos aplicados en la etapa (iv) tienen una frecuencia en el intervalo de 0,05 a 2 MHz.
10. Composición farmacéutica, según la reivindicación 8, para su utilización, según el procedimiento, según la reivindicación 8, en el que los ultrasonidos aplicados en la etapa (iii) tienen un índice mecánico por debajo de 0,7.
11. Composición farmacéutica, según la reivindicación 8, para su utilización, según el procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende, además, la cuantificación de la cantidad de agente o agentes terapéuticos liberados, mediante el análisis de la firma acústica producida por las burbujas agrandadas de la etapa (iii)(a).
12. Composición farmacéutica, según la reivindicación 8, para su utilización, según el procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en un procedimiento de tratamiento de dicho individuo mamífero.
13. Composición de agrupaciones, según la reivindicación 1 o 2, o composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para su utilización en un procedimiento de tratamiento del individuo mamífero, que comprende administrar la composición de agrupaciones o la composición farmacéutica y aplicar Ultrasonidos Focalizados de Alta Intensidad (HIFU) a una región de interés.
14. Composición de agrupaciones, según la reivindicación 1 o 2, o composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para su utilización como agente de contraste para ultrasonidos o medicamento.
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