ES2276843T3 - Metodo para tipificar rapidamente microorganismos mediante electroforesis en gel de campo pulsado en el que las muestras se preparan en un molde flexible que se puede esterilizar en autoclave. - Google Patents

Abstract

Se provee un proceso para tipificar rápidamente levaduras, parásitos y bacterias. Comprende los siguientes pasos: a) Preparar, en5 a 60 minutos, ADN intacto e inmovilizado mediante un método que emplea un juego de reactivos que solo contiene solución tampón,un detergente, un agente quelante y un agente que rompe los puentes de hidrógeno. b) Separar moléculas de ADN intactas o sus fragmentos de restricción usando miniequipos de electroforesis de campos pulsantes de los sistemas CHEF (Contour Clamped Homogeneous Electric Field) y TAFE (Transversal Alternating Field Electrophoresis) en tiempos comprendidos entre 2.5 y 7 horas. c) Seleccionar las condiciones óptimas que se aplicarán en el miniCHEF empleando un método que simula a priori los patrones electroforéticos que se obtendrían en dichos geles. d) Brindar los tiempos de reorientación, velocidades de migración y tallas de las moléculas sin emplear marcadores de tallas pero valiéndose de un método que analiza distancias migradas.

Description

Método para tipificar rápidamente microorganismos mediante electroforesis en gel de campo pulsado en el que las muestras se preparan en un molde flexible que se puede esterilizar en autoclave.

Referencia a la solicitud relacionada

La presente invención está relacionada con la biología molecular. En particular, se proporciona un proceso. Dicho proceso incluye el uso de métodos y procedimientos, así como de un equipo de reactivos para la tipificación rápida de microorganismos. Los microorganismos a tipificar pueden ser bacterias gram positivas y gram negativas. La tipificación de microorganismos se realiza mediante electroforesis en minigel de campo pulsado realizada en miniequipos de los sistemas CHEF o TAFE.

Antecedentes de la invención

Durante los últimos años se han incrementado las enfermedades infecciosas y han surgido microorganismos multirresistentes a fármacos (Acar J y Courvalein P, págs. 50-53; Aubry-Damon H y Andremot A, págs. 54-55; Trieu-Cout P y Poyart C, págs. 62-66, en "La Recherche", vol. 314, 1998).

Los brotes epidémicos de enfermedades infecciosas han generado la necesidad de tipificar los microorganismos causantes. La tipificación es el proceso mediante el cual se clasifican las diferentes especies de microorganismos de un género dado en diferentes subgrupos o subtipos (Busch U y Nitschko H, J Chromatogr B, 1999, 722:263-278). La tipificación es importante, desde el punto de vista epidemiológico, para reconocer los brotes de infección, determinar la forma de transmisión de los patógenos nosocomiales en los centros de salud y detectar las fuentes de las infecciones. También es útil para identificar cepas virulentas nuevas y monitorizar los programas de vacunación. Un proceso de tipi-
ficación se considera adecuado si cumple los siguientes criterios (Maslow JN et al., Clin Infect Dis, 1993, 17:153-164):

1.

Proporcionar resultados inequívocos para cada aislamiento analizado.

2.

Proporcionar resultados reproducibles.

3.

Diferenciar cepas no relacionadas dentro de una especie.

Existen varios métodos de tipificación de microorganismos. Algunos de ellos se basan en el análisis de las características fenotípicas (métodos fenotípicos) y otros en el análisis de las características genotípicas (métodos genotípicos). Los métodos fenotípicos detectan las características expresadas por los microorganismos, mientras los genotípicos evidencian las diferencias entre el ADN de los microorganismos. Así, los métodos fenotípicos tienen la desventaja de proporcionar una medida indirecta de los cambios en la dotación genética. Dicha desventaja no ocurre con el uso de los métodos genotípicos.

Uno de los métodos de tipificación genotípica más ampliamente usado es la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Este método se considera el método de referencia para la tipificación molecular de microorganismos. La tipificación mediante PFGE se realiza separando en geles moléculas de ADN que se someten a la acción de pulsos eléctricos en dos direcciones diferentes. Después de la electroforesis, los patrones de bandas proporcionados por las moléculas de ADN de un aislamiento del microorganismo son sumamente reproducibles y discriminatorios, y caracterizan inequívocamente su ADN (Oliver DM y Bean P, J Clin Microbiol, 1999, 37(6):1661-1669). Además, se pueden comparar los genomas completos de numerosos aislamientos en un único gel. Así, PFGE ha sido propuesto como el método de tipificación óptimo (Maslow JN, Mulligan ME y Arbeit RD, Clin Infect Dis, 1993(17):153-164; Busch U y Nitschko H, J Chromatogr B, 1999(722):263-278). Los resultados obtenidos mediante PFGE dependen de las condiciones experimentales aplicadas en la separación del ADN, y del género y especie del microorganismo sometido al estudio. Así,

a)

si el microorganismo tiene varios cromosomas lineales de tamaños menores de 10 Mb (1 megabase = 1.000.000 pares de bases) se obtiene el patrón de bandas proporcionado por sus cromosomas. Dicho patrón de bandas se denomina "cariotipo electroforético". Por ejemplo, el microorganismo puede ser una levadura, parásitos unicelulares, etc.

b)

si el microorganismo tiene un único cromosoma circular grande, se obtiene el patrón de bandas proporcionado por los fragmentos de macrorrestricción de dicho ADN circular. Estos patrones se denominan pulsotipos, ya que se obtienen en condiciones experimentales específicas. Por ejemplo, el microorganismo puede ser una bacteria tal como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, etc.

La comparación de los cariotipos electroforéticos de las diferentes cepas permite su caracterización y diferenciación. Lo mismo ocurre con los fragmentos de restricción del ADN bacteriano. Así, tanto los cariotipos moleculares como los pulsotipos se usan en el estudio comparativo de hongos, bacterias y parásitos. El uso rutinario de PFGE en la microbiología médica ha generado la necesidad de mejorar los métodos de preparación de muestras. También ha generado la necesidad de diseñar a priori las condiciones de funcionamiento para separar de forma adecuada las moléculas y para analizar los patrones de electroforesis resultantes.

En general, el proceso de tipificación de microorganismos mediante PFGE comprende las siguientes etapas y procedimientos:

1)

Preparar las muestras: cultivar los microorganismos en caldo nutriente, inmovilizar las células en gel y obtener moléculas de ADN intactas inmovilizadas y desproteinizadas.

2)

Diseñar el funcionamiento de la electroforesis: seleccionar las condiciones experimentales que se deberían aplicar en los equipos de PFGE para obtener la separación óptima entre las moléculas.

3)

Cargar las muestras en los geles y realizar la electroforesis en gel de campo pulsado para separar las moléculas de ADN.

4)

Analizar los patrones de bandas obtenidos tras la electroforesis y comparar los resultados proporcionados por diferentes aislamientos de microorganismos.

Se analizan los equipos y procedimientos usados actualmente en la tipificación de microorganismos mediante PFGE.

Electroforesis en gel de campo pulsado

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) data de 1984, cuando Schwartz y Cantor (Cell, 37, 67-75, 1984; patente de Estados Unidos nº 4.473.452) observaron que al aplicar pulsos eléctricos que alternaban periódicamente su orientación en un cierto ángulo con respecto al gel de agarosa, se resolvían grandes moléculas de ADN intactas en forma de patrones de bandas.

Los autores también determinaron que las separaciones de las moléculas dependían esencialmente de la duración de los pulsos eléctricos. Más tarde se determinó que el ángulo formado por las líneas de fuerza del campo, la intensidad del campo eléctrico, la temperatura experimental, la fuerza iónica de la disolución tampón, la concentración del gel de agarosa y el grosor de los bloques de agarosa en los que se inmovilizan las muestras, son los factores más importantes que influyen en la resolución de las moléculas de ADN. (Birren B. y Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide. Academic Press. Nueva York, 1993, págs. 107, 111, 129, 131, 135; López-Cánovas L. et al., J. of Chromatogr. A, 1998, 806, 123-139; López-Cánovas L. et al., J. of Chromatogr. A, 1998, 806, 187-197).

Se han desarrollado diferentes sistemas para realizar PFGE. Estos tienen cubetas características con electrodos colocados en diferentes disposiciones. Entre estas cubetas están las disposiciones de electrodos OFAGE ("Orthogonal Field Alternating Gel Electrophoresis", Carle C.F. y Olson M.V. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 5647-5664), CHEF ("Contour Clamped Homogeneous Electric Field", Chu G. Science 234, 1986, 1582-1585), TAFE ("Transversal Alternating Field Electrophoresis", patente de EE.UU. nº 4.740.283), FIGE ("Field Inversion Gel Electrophoresis", patente de EE.UU. nº 4.737.251 de Carle G.F. y Olson M.V.), y las minicubetas de MiniTAFE y MiniCHEF (Riverón, A.M. et al., Anal. Lett, 1995, 28, 1973-1991; solicitud de patente europea EP 0 745 844, bol. 1996/49; solicitud de patente de EE.UU. nº 08/688.607, 1995; patente cubana RPI nº 02/95, 1995).

Sistemas usados habitualmente para la tipificación de microorganismos mediante PFGE

Los sistemas más usados para la tipificación de microorganismos basada en el análisis de ADN mediante PFGE son CHEF y TAFE. Estos proporcionan patrones de bandas rectas en todos los carriles del gel, y así, permiten la comparación de los resultados obtenidos en una única electroforesis o en diferentes electroforesis.

Los electrodos del sistema CHEF se colocan en una disposición hexagonal alrededor del gel, y las tensiones se fijan en ellos para garantizar un campo eléctrico homogéneo en todo el gel. La generación de un campo eléctrico homogéneo en toda la cubeta permite obtener bandas rectas y migraciones reproducibles en los carriles del gel. Los electrodos de polaridades opuestas están separados 33,5 cm en las cubetas de CHEF. Se usan geles sumergidos que pueden ser de hasta 21x14 cm de anchura y longitud. Los geles se colocan horizontalmente (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Números de catálogo 170-3670 a 170-3673, BioRad, pág. 11, 1995). Como se ha mencionado, los sistemas CHEF se han usado ampliamente para la tipificación de microorganismos. Por ejemplo, bacterias (Beverly, S, Anal Biochem, 1989, 177:110-114; Dingwall A y Shapiro L, Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:119-123; Ferdows MS y Barbour AG, Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:5960-5973; Kohara Y, Akiyma K y Isono K, Cell, 1987, 50:495-508; Ohki M y Smith Cl, Nucleic Acids Res, 1989, 17:3479-3490; Schoenline PV, Gallman LM y Ely B, Gene, 1989, 70:321-329; Ventra L y Weiss AS, Gene, 1989, 78:29-36), Pseudomonas (Bautsch W, Grothues D y Tummler B, FEMS Microbiol Lett, 1988, 52:255-258; Romling U y Tummler B, J Clin Microbiol, 2000, 38(1):464-465), S. cerevisiae (Albig W y Entian KD, Gene, 1988, 73:141-152; Zerva L et al., J Clin Microbiol, 1996, 34(12):3031-3034), E. histolytica (Petter R et al., Infect Immun, 1993, 61(8):3574-3577), S. pneumoniae (McEllistrem MC et al., J Clin Microbiol, 2000, 38(1):351-353), S. aureus (Wichelhaus TA et al., J Clin Microbiol, 1999, 37(3):690-693), M. tuberculosis (Singh SP et al., J Clin Microbiol, 1999, 37(6):1927-1931), P. haemolytica (Kodjo A et al., J Clin Microbiol, 1999, 37(2):380-385), etc.

Debido a las grandes dimensiones de la cubeta de CHEF, se requiere una gran cantidad de disolución tampón para cubrir la plataforma de los electrodos. Así, la intensidad de corriente en la cubeta puede alcanzar valores elevados, incluso cuando se aplican intensidades bajas de campo eléctrico. Por lo tanto, los experimentos de CHEF exigen fuentes de alimentación con salidas elevadas de potencia nominal. Además, se genera una gran cantidad de calor en las cubetas, lo que impide la reducción de la duración de la electroforesis incrementando el campo eléctrico. Las cubetas de CHEF necesitan al menos 20 horas de electroforesis para separar cromosomas de Saccharomyces cerevisiae (moléculas menores de 1,6 Mb. 1 Mb = 10^{6} pares de bases) en el patrón característico de 11 bandas, y para tipificar diferentes cepas de esta levadura (Zerva L, et al., J Clin Microbiol, 1996, 34(12): 3031-3034). La cubeta de CHEF requiere mucho tiempo para separar los fragmentos de macrorrestricción de moléculas de ADN bacteriano, ya que se necesitan 20 horas o más (van Belkum A et al., J Clin Microbiol 1998, 36(6):1653-1659; Marchadin H et al., Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(1):213-216; Romling U y Tummler B, J Clin Microbiol, 2000, 38(1):464-465). De forma similar, son necesarios tiempos de funcionamiento largos para estudiar parásitos tales como Entamoeba histolytica. Para separar sus cromosomas son necesarias 24 horas, como mínimo (Petter R et al., Infect Immun, 1993, 61 (8):3574-3577).

La ventaja de los equipos de CHEF usados actualmente es la posibilidad de analizar 40 muestras en una única electroforesis. Este formato de elevado rendimiento de muestras facilita el análisis comparativo de los patrones de electroforesis proporcionados por las muestras de numerosos aislamientos.

El sistema TAFE fue propuesto por KJ Gardiner, W Laas y D Patterson en el artículo publicado en Somatic Cell Mol Genet, 1986(12): 185. Inicialmente denominaron el sistema "electroforesis en campo pulsado vertical" (VPFE) y desarrollaron el equipo que se protegió mediante la patente de EE.UU. nº 4.740.283 del 26 de abril de 1988.

En el sistema TAFE, se colocan dos pares de electrodos paralelos a ambas caras del gel sumergido (10 x 7,6 x 0,64 cm, longitud x anchura x grosor), que se coloca verticalmente en la cubeta. Dicha disposición de los electrodos genera líneas de fuerza del campo eléctrico que cruzan de forma transversal el gel, y fuerza a las moléculas a migrar a través del grosor del gel durante cada pulso. En TAFE, las moléculas de tamaños homogéneos se desplazan distancias similares y migran hasta la misma altura en el gel dejando trayectorias rectas, independientemente de las posiciones de los pocillos (en los que se cargaron las muestras) en el gel. Así, este sistema es útil para la tipificación de microorganismos, ya que facilita el análisis comparativo de los patrones de electroforesis proporcionados por las muestras de numerosos aislamientos.

Basándose en estos principios, Beckman Instruments fabricó el equipo llamado "Geneline I, o sistema de electroforesis de campo alternante transversal" (Beckman, The Geneline System Instruction Manual, ed. Spinco Division of Beckman Instruments Inc., 1988), que también se conoce como TAFE. Este sistema usa un gel (11 x 7,2 x 0,6 cm, longitud x anchura x grosor) en el que se pueden cargar 20 muestras. Sin embargo, TAFE también necesita una gran cantidad de disolución tampón (3,5 litros) y de muestra biológica. El equipo requiere, al menos, 20 horas para resolver los cromosomas de E. histolytica (Báez-Camargo M et al., Mol Gen Genet 1996, 253:289-296). Así, TAFE comparte las desventajas de CHEF en la tipificación de microorganismos.

Como conclusión, los equipos disponibles comercialmente usados más frecuentemente para caracterizar el genoma de microorganismos y parásitos requieren un tiempo de funcionamiento largo, y una gran cantidad de reactivos y muestras biológicas para resolver moléculas de ADN grandes en su patrón de bandas.

El sistema FIGE se ha usado para la tipificación rápida de bacterias (Goering RV y Winters MA, J Clin Microbiol, 30(3):577-580, 1992; Grothues D et al., J Clin Microbiol, 26(10):1973-1977-1988). Sin embargo, se ha documentado la inversión de la movilidad electroforética del ADN en experimentos de FIGE. La inversión de la movilidad del ADN impide las estimaciones correctas de los tamaños, y hace difícil la interpretación y la comparación de los patrones proporcionados por numerosas muestras. La imposibilidad de predecir el momento de la existencia de inversión de la movilidad del ADN es uno de los problemas asociados con dicho fenómeno (Birren B y Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, pág. 10, Academic Press, Inc. San Diego, California 1993). La principal desventaja de la inversión de la movilidad es la imposibilidad de identificar inequívocamente las moléculas presentes en una banda dada. Para hacerlo, las bandas se deberían transferir e hibridar con sondas específicas. La hibridación incrementa notablemente
el precio del ensayo y requiere tiempo, por lo que el proceso de tipificación será más caro y requerirá más tiempo.

Los intentos de reducir el tiempo de electroforesis en los equipos actuales de CHEF, tales como GeneNavigator (Amersham-Pharmacia-LKB, Pharmacia Molecular and Cell Biology Catalogue, Pulsed Field Gel Electrophoresis, Nucleic Acids Electrophoresis. 1998, págs. 77-79), CHEF DRII y CHEF Mapper (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Números de catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad, pág. 11, 1995) incrementando la tensión aplicada a los electrodos es prácticamente imposible. Esto es debido al límite de salida de la fuente de alimentación y al sistema de refrigeración. Por lo tanto, los fabricantes recomiendan 9 V/cm como campo eléctrico máximo a aplicar en dichos equipos (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Números de catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad, pág. 2, 1995). Por lo tanto, la reducción de la duración de la electroforesis incrementando la intensidad del campo eléctrico está impedida en el sistema CHEF. Los equipos actuales de TAFE tienen problemas similares.

Miniequipos de PFGE

En 1995 se informó de los equipos de miniPFGE, versiones miniCHEF y miniTAFE (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, vol. 28, págs. 1973-1991; solicitud de patente europea EP 0 745 844, bol. 1996/49; solicitud de patente de EE.UU. nº 08/688.607, 1995; patente cubana RPI 02/95, 1995). Los miniequipos superan la mayoría de las desventajas mencionadas de los equipos de PFGE. Los experimentos de electroforesis en campo pulsado se realizan en un minigel (4 x 4 x 0,5 cm; longitud x anchura x grosor) cargado con 7 muestras en 4 a 6 horas. Se puede aplicar una intensidad de campo eléctrico que alcanza los 16 V/cm en la cubeta de MiniCHEF de 11,6 cm entre los electrodos de polaridades opuestas, lo que proporciona una buena resolución de los patrones de bandas de la electroforesis en 2,7 horas. La corta distancia entre los electrodos de polaridades opuestas permite construir cubetas pequeñas y usar pequeños volúmenes de tampón para cubrir los electrodos. Aplicando una tensión dada a las cubetas de miniCHEF y CHEF (cierto valor de intensidad del campo eléctrico "E"), el calor generado en la minicubeta es siempre inferior que el calor generado en el CHEF disponible comercialmente (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995 vol. 28, págs. 1973-1991).

Los equipos de miniTAFE admiten 22 V/cm, con lo que se consigue la resolución de las bandas (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995 vol. 28, págs. 1973-1991). MiniTAFE permite obtener el cariotipo electroforético de S. cerevisiae en 5 horas. Las cubetas de miniTAFE con separación corta (7,8 cm) entre electrodos opuestos son pequeñas y usan una cantidad pequeña de disolución tampón. Sin embargo, si se cargan muestras de más de 0,1 cm de grosor en los minigeles, son necesarios tiempos de funcionamiento más largos para conseguir una buena resolución de los patrones de electroforesis. Según los informes previos, el grosor de la muestra influye en el tiempo de funcionamiento de la electroforesis (López-Cánovas et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806, págs. 187-197). A medida que las muestras son más gruesas, son necesarios geles más largos para obtener los mismos patrones de bandas. Sin embargo, los minigeles de miniCHEF informados admiten solamente 7 muestras, mientras miniTAFE admite 13 muestras. Son formatos de bajo rendimiento de muestras para tipificar aislamientos de microorganismos en laboratorios clínicos.

A pesar de que los equipos de miniPFGE tienen ventajas sobre los sistemas usados actualmente, no se ha usado ni miniCHEF ni miniTAFE para la tipificación de microorganismos. Tal vez esto obedece al intento de usar muestras del grosor de las usadas en los geles convencionales. Además, no hay disponibles procedimientos simples para seleccionar los parámetros de funcionamiento de los miniequipos.

Preparación de ADN inmovilizado

Un método para preparar moléculas de ADN intactas es esencial para la tipificación de microorganismos mediante PFGE en los equipos o miniequipos actuales. Los métodos informados previamente de aislamiento y purificación de ADN en disolución provocan la ruptura de dichas moléculas (Schwartz DC y Cantor CR, Cell, 1984, 37, págs. 66-75). Schwartz y Cantor propusieron una metodología para preparar muestras para PFGE y excluyeron solamente las moléculas con tamaños menores de 1 Mb (10^{6} pares de bases). La metodología consiste en recoger las células cultivadas, lavar las células e inmovilizarlas en bloques de agarosa. En las etapas posteriores se forman esferoplastos (si existe pared celular) "in situ" y se lisan posteriormente en dichos bloques. Finalmente, las moléculas de ADN inmovilizadas se desproteinizan mediante el uso de proteinasa K. El método ha sido eficaz para preparar muestras a partir de microorganismos de diferentes géneros, especies y orígenes. Sin embargo, se necesita formar los esferoplastos si dichos microorganismos poseen pared celular, y las enzimas necesarias para formar esferoplastos, así como las proteasas, son caras. El procedimiento informado requiere que las muestras se incuben durante la noche dos veces, lo que implica 32 horas para la preparación de la muestra (patente de EE.UU. nº 4.473.452, 25 de sep. de 1984).

Más recientemente, Gardner (Gardner DCJ et al., Yeast, 1993, 9, 1053-1055) obtuvo patrones de bandas de cromosomas de S. cerevisiae a partir de células que no formaron esferoplastos. En paralelo, Higginson et al. (Higginson D. et al., Anal. Lett., 1994, 27:7, 1255-1264) demostraron que el ADN de S. cerevisiae se puede desproteinizar mediante el uso de urea 8 M en vez de proteinasa K. Sin embargo, el método descrito por Gardner todavía es caro, porque usó proteasas para desproteinizar el ADN, mientras el método descrito por Higginson es barato, pero consume 72 horas de incubación, que es un tiempo largo. Después, se prepararon las muestras de S. cerevisiae, y no se usaron enzimas: los bloques se incubaron secuencialmente con LETK (Tris 10 mM, EDTA 500 mM, KCl 600 mM, pH 7,5) durante 4 horas, NDS (Tris 10 mM, EDTA 500 mM, 1% de Sarcosil, pH 9,5) durante 2 horas, y NDS más urea 4 M (NDSU) durante 2 horas. Este método necesitó 10 horas para la preparación de la muestra (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29:12, 2079-2084). También se describieron métodos rápidos para la preparación de ADN inmovilizado, pero usan enzimas (por ejemplo, en Guidet F y Langridge P, Biotech, 1992, 12:2, 222-223).

Como regla general, el ADN inmovilizado para experimentos de PFGE requiere la formación de esferoplastos y la desproteinización del ADN mediante el uso de proteasas. Estos requerimientos son independientes del tipo de célula estudiado (bacteria, levadura, etc.) (Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9: 107-126; Olive DM y Bean P, J. Clin. Microbiol, 1996, 37:6, 1661-1669). Por ejemplo, se informó que se preparó ADN inmovilizado de Staphilococcus aureus en 2 horas inmovilizando las células con lisostafina e incubando los bloques con detergentes, mientras las células de Streptococcus fecalis necesitaron ser incubadas con lisozima y mutanolisina antes de la inmovilización (Goering RV. y Winter MA., J. Clin. Microbiol, 1992, 30:3, 577-580). En el trabajo mencionado, los autores no incubaron las muestras con proteinasa K. Sin embargo, Matushek et al. (Matushek MG et al., J. Clin. Microbiol, 1996, 34:10, 2598-2600) informaron que fueron incapaces de obtener los patrones de bandas si las muestras no se incubaban con proteinasa K. Como alternativa, propusieron un método rápido para preparar muestras de ADN inmovilizado mediante el uso de proteinasa K. Recientemente, McEllistrem et al. (McEllistrem MC et al., J. Clin. Microbiol, 2000, 38:1, 351-353) informaron de un método no enzimático completo para preparar ADN inmovilizado de Streptococcus pneumoniae. Sin embargo, consume 6 horas y los autores atribuyeron el éxito del protocolo a la activación de una autolisina del Streptococcus. En la actualidad, las enzimas de formación de esferoplastos y las proteasas se han eliminado solamente de los protocolos de preparación de moléculas de ADN intactas de S. cerevisiae y Streptococcus pneumoniae, pero los tiempos necesarios para completar estas preparaciones son de 10 y 6 horas, respectivamente, que son tiempos largos. No existe consenso sobre la viabilidad de eliminar las enzimas de formación de protoplastos y la proteinasa K en la preparación de muestras de microorganismos. Por lo tanto, los métodos actuales son caros y consumen mucho tiempo.

La mayoría de los métodos anteriores se basan en la suposición de que los microorganismos con paredes celulares se deben inmovilizar previamente al tratamiento enzimático. Se presenta una excepción en el artículo publicado por Goering y Winter (Goering RV y Winter MA, J. Clin. Microbiol, 1992, 30:3, 577-580). Los autores suspendieron células en una disolución que contenía lisozima y mutanolisina (dos enzimas para formar esferoplastos) antes de su inmovilización. Sin embargo, todavía no se ha presentado un método general no enzimático para tratar microorganismos con paredes celulares antes de su inmovilización en geles de agarosa. Tal método sería más barato y más simple que los protocolos actuales en la preparación de las muestras.

Se ha informado de métodos para aislar ácidos nucleicos en disolución, que parten de células calentadas en presencia de agentes que provocan la permeabilidad de la pared celular del microorganismo (patente europea 0 657 530, 1994, boletín 95/24; patente de EE.UU. nº 158,940, 1993). El método libera grandes fragmentos de ácidos nucleicos sin degradar de microorganismos sin romper físicamente toda la pared celular. Este método no requiere enzimas líticas. Sin embargo, no se obtienen moléculas de ADN intactas, porque el ADN se aísla en disolución; y los autores no propusieron el método para obtener los cariotipos moleculares o los pulsotipos de los microorganismos mencionados. Los autores informaron que el ADN obtenido es adecuado para hibridación, pero no abordaron la posibilidad de tratamiento de restricción del ADN con endonucleasas. En conclusión, dicho método no garantiza la obtención de moléculas de ADN intactas, mientras la posibilidad de digerirlas con enzimas de restricción sigue siendo una incógnita.

Por lo tanto, todavía no se ha propuesto un procedimiento general para la preparación de ADN intacto inmovilizado a partir de levaduras, bacterias gram positivas y gram negativas y parásitos mediante métodos no enzimáticos en periodos de tiempo cortos.

La preparación de muestras de ADN inmovilizado necesita moldes para formar dichas muestras. Estos moldes pueden ser reutilizables o desechables. Los moldes reutilizables deberían permitir la esterilización.

Esto es importante para manejar muestras de microorganismos patógenos. El uso de moldes desechables requiere un suministro continuo, lo que puede ser un factor limitante en laboratorios con presupuesto bajo.

Los moldes conocidos son los siguientes:

a)

Moldes que forman bloques independientes y similares (patente de EE.UU. nº 4.473.452, 25 de sep. de 1984; patente de EE.UU. 4.861.448, 29 de ago. de 1989);

b)

Moldes que forman tiras largas, que se cortan para formar bloques independientes (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29:12, 2079-2084);

c)

Moldes que forman "fideos" cuadrados largos o barras largas de agarosa, que se cortan para formar bloques independientes (Birren B y Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, Academic Press, Inc. San Diego, California, 1993, págs. 29-30).

En general, en dichos moldes se generan muestras de dimensiones mayores que los pocillos del gel. Por esta razón, para obtener bloques con dimensiones similares a las de los pocillos, es necesario cortar las tiras, fideos, etc., con una cuchilla de afeitar u otro dispositivo. (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide pág. 40, sección 7. Números de catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad. 1995). Sin embargo, el cortar las tiras o los fideos provoca bloques de tamaños y dimensiones que no son homogéneos, lo que influye en la calidad de los patrones de electroforesis. Las resoluciones de las moléculas de ADN en el gel dependen del grosor de la muestra. Por lo tanto, es difícil la comparación de los patrones obtenidos en los diferentes carriles del gel. Las dificultades en las comparaciones de los patrones de bandas representan una desventaja en la tipificación de microorganismos.

Se describió un molde para inmovilizar células en geles de agarosa y tratar los bloques en la patente de EE.UU. nº 5.457.050, 10 de oct. de 1995. El molde podría ser desechable o reutilizable, dependiendo del material usado para fabricarlo. Se reivindica que la característica del molde es que las muestras se forman y se tratan dentro de dicho molde. Sin embargo, es una desventaja: si los bloques se mantienen dentro del molde durante las incubaciones, el tiempo necesario para obtener las muestras adecuadas para análisis de PFGE se alarga notablemente. Las moléculas efectoras de las disoluciones de lisis y desproteinización no pueden alcanzar suficientemente las moléculas de interés dentro de las células, porque el área de contacto entre los bloques y las disoluciones de incubación se reduce como mínimo a la mitad.

Los moldes que forman bloques independientes y similares, descritos en la patente de EE.UU. nº 4.473.452, 25 de sep. de 1984 y en la patente de EE.UU. nº 4.861.448, 29 de ago. de 1989, están formados de dos piezas de material sólido unidas con tornillos. La principal desventaja de dichos moldes es que se deben montar antes y desmontar después del uso: así, la extracción de los bloques de gel es una tarea laboriosa.

Los moldes que forman tiras largas, que se cortan para formar bloques independientes (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29:12, 2079-2084) se fabrican de material acrílico, y por ello no se pueden autoclavar. Esta es una desventaja seria cuando las muestras se preparan a partir de microorganismos patógenos.

En conclusión, no se han descrito o revelado moldes que se puedan montar-desmontar fácilmente para moldear minibloques independientes y de tamaños homogéneos, y que se puedan reutilizar después de un proceso de esterilización mediante autoclave.

Selección de las condiciones experimentales de PFGE

La selección de las condiciones experimentales es compleja. Se ha informado de métodos para seleccionar las condiciones de funcionamiento de PFGE.

Por ejemplo, el CHEF Mapper de Bio-Rad tiene una opción de auto-algoritmo y otra de algoritmo interactivo (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. págs. 31-40, números de catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad. 1995). Ambas opciones permiten calcular los tiempos de pulso, las duraciones de las rampas de pulsos, el ángulo de reorientación, el campo eléctrico y el tiempo de funcionamiento óptimo para separar moléculas de ADN de una muestra dada. En contraste con el auto-algoritmo, en el que se asumen condiciones experimentales fijas, el algoritmo interactivo permite variar la introducción del tipo de tampón, la temperatura y la concentración, y el tipo y concentración de agarosa. Ambos algoritmos funcionan basándose en los datos empíricos y teóricos recogidos durante 5 años de experiencia (Bio-Rad Catalogue. Life Science Research Products. Bio-Rad Laboratories, pág. 185. 1998/99). Sin embargo, los fabricantes recomiendan introducir en el auto-algoritmo tamaños de ADN menores y mayores que los tamaños esperados de las moléculas de muestra. Además, si se introducen intervalos de tamaño extremadamente amplios en el auto-algoritmo, así como en el programa interactivo, se pueden generar resultados erróneos, tales como inversión de bandas en la zona media del gel.

Se propuso otra expresión empírica para proporcionar la duración del pulso eléctrico que separa el grupo de moléculas de tamaños que se encuentran entre un valor dado y uno superior denominado RSL (tamaño límite de resolución) (Smith DR. Methods I, 1990, 195-203). Sin embargo, dicha expresión es válida solamente en condiciones experimentales específicas, y no predice la resolución entre dos moléculas cualesquiera. Se propuso otra función. Esta proporciona las condiciones aproximadas de campo eléctrico y tiempo de pulso necesarias para separar un grupo dado de moléculas (Gunderson K y Chu G, Mol. Cell. Biol., 1991, 11:3348-3354). Sin embargo, dicha función permite solamente obtener estimaciones aproximadas de las dos variables mencionadas, y no proporciona las migraciones de las moléculas en cualquier condición experimental.

A pesar de que se realizaron diversos estudios teóricos sobre la reorientación molecular del ADN durante PFGE (Noolandi J, Adv. Electrophoresis, 1992, 5: 1-57; Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9:107-126), dichos estudios todavía no han proporcionado un resultado práctico y útil en los laboratorios. No generaron métodos que permitiesen al usuario de PFGE seleccionar y ajustar las condiciones experimentales necesarias para separar las moléculas a analizar.

Las ecuaciones propuestas por López-Cánovas et al. (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806:123-139) para describir la migración del ADN en PFGE no se han usado para predecir los patrones de bandas que se deberían obtener al variar las rampas de tiempos de pulso, el campo eléctrico, la temperatura y el tiempo de funcionamiento. Estas variables se modifican habitualmente en la tipificación de microorganismos.

Análisis de los patrones de bandas de PFGE

Hay disponibles sistemas computerizados para la adquisición de datos de imágenes de geles de PFGE para el análisis de los patrones de bandas (Gerner-Smidt P et al., J. Clin. Microbiol, 1998, 37(3):876-877; Tenover F et al., J. Clin. Microbiol, 1995, 33(9):2233-2239; van Belkum A et al., J. Clin. Microbiol, 1998, 36(6):1653-1659). Sin embargo, la comparación de los patrones de restricción sigue siendo un proceso subjetivo, y no se puede reducir totalmente a algoritmos rígidos (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol, 1995, 33(9):2233-2239). Aunque se realizaron análisis por ordenador, la interpretación final de los patrones se debe subordinar a la inspección visual previa.

El análisis de los patrones de bandas automático y no automático da como resultado el número de bandas y los tamaños de las moléculas de las bandas. Esto se hace habitualmente comparando las migraciones del ADN desconocido con las migraciones de marcadores de peso molecular. Sin embargo, PFGE es relativamente nuevo, y no siempre hay disponibles marcadores de tamaño para intervalos de tamaños de ADN amplios. Por lo tanto, los criterios usados para la tipificación bacteriana, basados en la interpretación de los patrones de bandas de PFGE, consisten en la determinación del número de fragmentos de restricción diferentes hallados cuando se digiere el ADN de los microorganismos en comparación.

Se propusieron ecuaciones para describir las migraciones de las moléculas de ADN con una única rampa de pulsos, diferente intensidad de campo eléctrico y distinta temperatura a partir de los datos de electroforesis recogidos en experimentos realizados en agarosa Lachema al 1,5% y TBE 0,5X, TBE 1X: Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806:123-139). Sin embargo, no existe un método para extender y aplicar dichas ecuaciones al análisis de patrones de bandas después de la aplicación de rampas de tiempos de pulso. La aplicación de rampas de tiempos de pulso se realiza normalmente en el estudio comparativo de microorganismos.

Proceso actual para la tipificación de microorganismos mediante PFGE.

El proceso total para la tipificación de microorganismos requiere un tiempo prolongado y muchos recursos. La electroforesis requiere alrededor de 20 horas, métodos de preparación de las muestras, recomendados por los fabricantes o informados en la bibliografía, requiere el uso de grandes cantidades de enzimas (por ejemplo, 80 mg/ml de proteinasa K) y tiempos de incubación prolongados (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. págs. 40-43, números de catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad. 1995). Un factor que limita el uso de PFGE para la tipificación de microorganismos es el tiempo necesario para completar el análisis de los aislamientos, que es de 2 a 3 días, lo que reduce la capacidad de los laboratorios para analizar muchas muestras (Olive DM y Bean P, J. Clin. Microbiol, 1999, 37:6,1661-1669).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un proceso y un equipo de reactivos para tipificar aislamientos de microorganismos en un único día de trabajo (entre 7 y 13 horas). La tipificación se realiza mediante la obtención de los patrones de bandas típicos proporcionados mediante la separación de moléculas de ADN sometidas a electroforesis en gel de campo pulsado en miniequipos. Específicamente:

i)

Se proporciona un método y el equipo de reactivos asociado para preparar, en 60 minutos como máximo, muestras de ADN intacto inmovilizado en los minibloques de un gel. El método se basa en el tratamiento de las células con disoluciones que no contienen enzimas líticas. Dicho tratamiento se puede realizar antes o después de la inmovilización de tales células en el gel. Las células pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas. Las células se inmovilizan por medio de un molde hecho de un material flexible que se puede esterilizar. Este proporciona minibloques de tamaños homogéneos. El grosor de los minibloques varía de 0,03 a 0,1 cm, dependiendo de las dimensiones del molde utilizado.

ii)

Se proporcionan métodos para predecir las migraciones del ADN lineal. Los métodos se basan en ecuaciones teóricas que permiten el cálculo de las migraciones de las moléculas de ADN lineales en cualquier condición de campo eléctrico, temperatura, rampas de duraciones de pulso y duraciones de la electroforesis en el sistema CHEF. Estos métodos permiten seleccionar las condiciones óptimas de electroforesis a aplicar a los geles y proporcionan una representación gráfica de las distancias migradas por el ADN lineal.

iii)

Se proporcionan procesos para la separación y el análisis de moléculas de ADN de microorganismos. Las separaciones se realizan en miniequipos para electroforesis en gel de campo pulsado. Los miniequipos de miniCHEF proporcionan los patrones de bandas en 2,5 a 5 horas, y los de miniTAFE en 5 a 7 horas. El proceso permite estudiar hasta 27 muestras de ADN inmovilizado de microorganismos. Dichas muestras: a) se preparan como en el punto i); b) se separan en los minigeles de los miniequipos en las condiciones óptimas de electroforesis, condiciones seleccionadas con la ayuda de los métodos predictivos.

El método de preparación de muestras proporcionado en esta invención implica como máximo 60 minutos, y es simple y barato, no requiere ni enzimas líticas ni proteasas en las disoluciones para incubar las células de los microorganismos y proporciona ADN intacto inmovilizado. Las moléculas de ADN intacto se pueden digerir con enzimas de restricción, y cuando se someten a electroforesis en gel de campo pulsado las moléculas de ADN intactas o sus fragmentos de restricción migran en los minigeles formando patrones de bandas que corresponden a los cariotipos moleculares o pulsotipos de los microorganismos.

El método se basa en la modificación química de la pared bacteriana para permitir la lisis de los microorganismos, o la difusión de pequeñas moléculas efectoras hacia las moléculas de interés en las células. Los componentes intracelulares indeseados se eliminan también durante la preparación mediante diálisis. Como resultado, se obtienen moléculas de ADN intactas en los minibloques en los que las células se inmovilizaron.

El método comprende las siguientes etapas generales:

1)

Las células de los microorganismos se aíslan inicialmente a partir de los fluidos de personas hospitalizadas, o a partir de una colección biotecnológica o a partir de los experimentos realizados en un laboratorio común de biología molecular, genética u otro.

2)

Las células se cultivan en medios líquidos o sólidos con la composición apropiada para cada microorganismo.

3)

Las células se recogen mediante centrifugación y posteriormente se lavan.

4)

Las células a) se inmovilizan en el gel y se incuban con las disoluciones no enzimáticas, o b) se incuban con dicha(s) disolución(es) y se inmovilizan después en el gel. En el caso de "a", los minibloques que contienen las células inmovilizadas se incuban primero en la disolución no enzimática durante 5 a 30 minutos a 50°C. En el caso de "b", las células se incuban con la disolución no enzimática durante 5 a 30 minutos a 50°C y después se inmovilizan en los minibloques de agarosa.

5)

Los minibloques que contienen las células se dializan con el tampón de electroforesis, si se va a realizar la electroforesis; o con tampón de conservación, si los minibloques se van a almacenar; o con el tampón de endonucleasa de restricción, si las moléculas de ADN se van a digerir.

Se puede incubar Staphylococcus aureus en las disoluciones no enzimáticas previamente a la inmovilización, mientras Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli se deberían inmovilizar primero e incubar posteriormente en las disoluciones no enzimáticas. Las disoluciones de lavado de células más eficaces se presentan en la Tabla I.

TABLA I Disoluciones de lavado de células más eficaces para preparar ADN inmovilizado

1

Las disoluciones no enzimáticas para incubar las células, o los minibloques que contienen células, tienen detergentes aniónicos, un agente quelante de metales, un agente capaz de competir por la formación de enlaces de hidrógeno y tampón Tris. La más eficaz contiene: 1% de Sarcosil, EDTA 0,1 M, Tris-base 0,01 M, urea 4M y su pH es 9,5 (NDSU). Para incubar células de bacterias gram positivas y gram negativas se añade Nonidet P-40 (NDSUPlus).

Ciertos microorganismos, p.ej. Escherichia coli, se deberían incubar primero durante 10 minutos a 37°C en una disolución de lisis no enzimática. Esta contiene un 1% de Sarcosil, 1% de Nonidet P-40, EDTA 0,1 M, Tris-base 0,01 M, y su pH es 8,0. Además, se incuban durante media hora en la disolución NDSUPlus.

El tampón de almacenamiento de los minibloques que contienen ADN inmovilizado es TE-100 (Tris-base 0,01M, EDTA 0,1 M, pH 8,0).

El procedimiento para inmovilizar células en minibloques de agarosa consiste en utilizar un molde hecho de material flexible que se puede esterilizar. El molde es una lámina de silicona, goma u otro material flexible de hasta 0,5 cm de ancho (véase en los Ejemplos, Ejemplo 1). En la lámina hay estampadas varias depresiones cuadradas. Las depresiones pueden ser de hasta 0,3 cm de ancho y 0,03 a 0,1 cm de profundidad. Para verter la suspensión agarosa-células, el molde se precalienta a 42°C poniéndolo en una superficie calentada a esta temperatura, tras lo cual la suspensión se vierte en el molde, y se distribuye uniformemente en las depresiones con la ayuda de una espátula. Después, el molde se cubre con una tapa (que puede estar hecha de vidrio, acrílico, plástico o cualquier otro material) y se incuba a 4-15°C hasta que los minibloques se endurecen. Los minibloques de tamaños homogéneos se extraen del molde flexible sosteniendo sus bordes y doblando el molde dentro de un recipiente que contiene la disolución no enzimática para el tratamiento del minibloque. La suspensión se prepara de forma que se inmovilizan 0,12 a 3 x 10^{8} células bacterianas por cada minibloque de dimensiones 0,3 x 0,07 cm. Todos los microorganismos mencionados se pueden preparar usando este tipo de molde. Realmente, este tipo de molde se puede usar para preparar minibloques que contienen cualquier otro tipo de células.

En la presente invención, el método para seleccionar las condiciones óptimas de electroforesis a aplicar en los miniequipos se basa en calcular las migraciones de las moléculas de ADN lineales. El cálculo se realiza usando un grupo de ecuaciones teóricas conocidas que describen la migración, los tiempos de reorientación y las velocidades de migración de las moléculas de ADN lineales en el minigel de miniCHEF. Las ecuaciones se utilizan con los valores de campo eléctrico y temperatura, y deberían estar comprendidos entre 1 - 20 V/cm y 4 - 30°C, respectivamente. Para aplicar las ecuaciones, se asume que la electroforesis se realiza en agarosa al 1,5%, y el tampón de electroforesis debería ser Tris 44,5 mM, ácido bórico 44,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3 (TBE 0,5X). Las ecuaciones teóricas que describen la migración del ADN son las siguientes:

D = \sum\limits_{r=1}^{n} { vr tp_{r} \Gamma_{r}(tp_{r}-tr) Np_{r} + vm (tp_{r}-tr)[1-\Gamma_{r}(tp_{r}-tr)] Np_{r}

Ec. 1

\vskip1.000000\baselineskip

vr = 0,0207[QE^{1,45}/(8\pi\etaL^{1,35})]

Ec. 2

\vskip1.000000\baselineskip

vm = 0,665[QE^{1,76}/(8\pi\etaL^{1,08})]

Ec. 3

\vskip1.000000\baselineskip

tr = 0,134 (L^{1,14} / vr)^{0,926}

Ec. 4

\vskip1.000000\baselineskip

\Gamma_{r}(tp_{r}-tr) = 1 si (tp_{r}-tr) \leq 0 \hskip0,3cm y \hskip0,3cm \Gamma_{r}(tp_{r}-tr) = 0 si (tp_{r}-tr) > 0

Ec. 5

\vskip1.000000\baselineskip

en las que:

tr: tiempo de reorientación (s),

vr: velocidad de migración durante la reorientación (cm/s),

vm: velocidad de migración después de la reorientación (cm/s),

Q: 1e^{-} x pb (carga neta del ADN, e^{-}: carga del electrón en statculombios),

L: 0,34 nm x pb (longitud del contorno del ADN, en cm),

E: intensidad del campo eléctrico en statvoltios/cm,

\eta: viscosidad de la disolución tampón en poises, y \eta se calculó interpolando la temperatura experimental (°C) en una función polinómica que relaciona la viscosidad del agua con la temperatura.

D: migración total de una molécula de ADN en el minigel de CHEF (cm),

d: migración por pulso (cm),

n: número de rampas de tiempos de pulso.

Np_{r}: número de pulsos en la rampa "r",

tp_{r}: duración del pulso en la rampa "r" (s).

El método para seleccionar las condiciones de electroforesis óptimas incluye las siguientes etapas:

I.

Calcular la duración de los pulsos (tp_{r}) que se usarán en las rampas. Para realizarlo:

1)

Se introducen en esta etapa los tiempos de reorientación ("tr") de las moléculas de ADN lineales más pequeñas y más grandes a analizar, valores de "tr" que se obtuvieron sustituyendo los tamaños del ADN de tales moléculas, el campo eléctrico y la temperatura del tampón de electroforesis en la ecuación 4.

2)

Se calcula la media de ambos tiempos de reorientación (un único tp_{r}, o tp_{1}) si se desea que las moléculas de ADN de tamaños comprendidos entre las moléculas mayores y menores estén incluidas en un único patrón.

3)

Se calcula una secuencia numérica de duraciones de pulso (tp_{r}). Esta comienza con una duración de pulso que es 1,5 veces menor que el tiempo de reorientación de la molécula más pequeña, y termina con una 1,5 veces mayor que el tiempo de reorientación de la molécula mayor. Se usan incrementos lineales en la duración del pulso en la secuencia numérica de tp_{r} calculado.

4)

Para llevar a cabo la electroforesis se podría tomar el tp calculado en la etapa (2), o de otra manera, se usa la secuencia numérica de tp_{r}, calculada en la etapa (3).

II.

Calcular el tiempo total de funcionamiento. El tiempo total de funcionamiento de la electroforesis se estima en base al cálculo de la migración de la molécula de ADN lineal más pequeña. Esto se realiza como sigue:

1)

Especificar en esta etapa el tiempo de reorientación y las velocidades de migración durante y después de la reorientación de la molécula de ADN lineal más pequeña, valores que se obtuvieron sustituyendo el tamaño del ADN de tales moléculas, el campo eléctrico y la temperatura del tampón de electroforesis en las ecuaciones 2-3. La ecuación 1 se utiliza con las duraciones de los pulsos eléctricos (tp_{r}) estimados en la etapa I. Se fijan los valores iniciales del número de pulsos.

2)

El número de pulsos de cada rampa "r" se incrementa uno a uno, y cada vez se estima la migración de la molécula más pequeña por medio del uso de las ecuaciones 1 y 5. Las iteraciones se repiten hasta que la molécula alcanza la posición que está a una distancia de 0,1 a 1 cm del borde inferior del minigel.

III.

Por medio del uso de las ecuaciones 1 - 5, se calculan las migraciones de las moléculas que se desean separar para las "n" rampas, y después se predicen los patrones de bandas proporcionados por estas moléculas en los minigeles de miniCHEF para las condiciones seleccionadas para el campo eléctrico, temperatura, número de rampas "r", duración de los pulsos eléctricos y número de pulsos (Np_{r}). Este cálculo incluye las siguientes etapas:

1)

Se asume que la electroforesis se realiza en gel de agarosa del 1,5% y tampón TBE 0,5X.

2)

El grupo de datos de "tr", "vr" y "vm" de las moléculas a analizar se introduce en esta etapa, grupo de valores que se obtuvo definiendo, en las ecuaciones 2 - 3, los tamaños de las moléculas de ADN y el campo eléctrico y la temperatura del tampón (que se usarán en el experimento real).

3)

Según los valores estimados en las etapas previas, se define en la ecuación 1 el número total de rampas (n), el número de pulsos que se aplicarán en cada rampa (Np_{r}) y la duración de los pulsos en cada rampa (tp_{r}).

4)

Por medio del uso de las ecuaciones 1 - 5, se calculan las distancias que deberían migrar las moléculas de ADN (que se desean analizar) para las condiciones de electroforesis especificadas.

5)

Las migraciones, calculadas para las moléculas de ADN lineales, se representan en un formato numérico o gráfico.

6)

Las etapas 2 - 5 se repiten hasta que el patrón predicho muestra la separación óptima entre las moléculas de ADN lineales.

IV.

Basándose en los anteriores resultados, se seleccionan las condiciones experimentales que producirán la separación óptima entre las moléculas de ADN lineales.

El medio preferido para implementar este método podría ser un programa de ordenador que facilitaría la simulación de la separación de las moléculas de ADN de diferentes tamaños en miniCHEF. Este programa calcularía las condiciones experimentales óptimas para las separaciones de ADN.

El programa también proporcionaría un medio rápido para realizar los cálculos necesarios para implementar esta parte de la presente invención.

Se creó un programa para simular el patrón de bandas. El programa permite al usuario variar las siguientes variables:

1-

El tamaño de los fragmentos de ADN o las moléculas de ADN intactas que se desean separar en el gel.

2-

La temperatura del tampón.

3-

La tensión.

4-

El tiempo de pulso y el número de pulsos eléctricos aplicados en cada rampa.

5-

El número de rampas de tiempos de pulso. Comprende entre 1 y 1000 rampas.

Al introducir los valores mencionados, el programa proporciona los siguientes resultados:

1-

Las velocidades de las moléculas de ADN (en cm/s) durante y después de la reorientación del ADN.

2-

El tiempo de reorientación de cada molécula de ADN (en segundos).

3-

La migración de cada molécula en el gel para la duración de funcionamiento seleccionada.

4-

La migración de cada molécula y el esquema del patrón de electroforesis.

La representación gráfica de las distancias que deberían migrar las moléculas de ADN lineales en las condiciones de electroforesis especificadas se realiza como sigue:

i)

Mediante el dibujo de un minigel con las mismas dimensiones que el minigel real, y mediante el dibujo de los pocillos en los que se cargan hipotéticamente las muestras.

ii)

Mediante la colocación de líneas debajo de cada pocillo. Estas representarían las bandas formadas por las moléculas de ADN de diferentes tamaños después de la separación. Cada línea tiene la anchura del pocillo. Estas líneas se dibujan separadas de los pocillos a las distancias que las moléculas de ADN migrarían en el minigel real.

iii)

Mediante la asignación a cada línea, o banda hipotética, de un color. El color varía con el tamaño de las moléculas que la banda contiene. Es decir, se usa un código de colores que identifica a las moléculas de un tamaño dado.

Este programa constituye un método para elegir las condiciones experimentales apropiadas para separar moléculas intactas de ADN del tamaño de un cromosoma o fragmentos grandes de ADN mediante electroforesis en gel de campo pulsado en miniCHEF. Si al programa se le introducen distintos valores de las variables experimentales, se obtienen diferentes patrones de electroforesis, lo que permite la identificación de las condiciones experimentales que deberían separar las moléculas de interés en CHEF y miniCHEF. Esta aproximación no gasta reactivos o muestras biológicas. Se basa en las ecuaciones teóricas que describen la migración de ADN lineal en miniCHEF. Dichas ecuaciones se ajustaron mediante el uso de datos de migración de ADN lineal, obtenidos en experimentos reales de miniCHEF. Por lo tanto, describen correctamente la migración de dichas moléculas cuando se someten a electroforesis. Además, no producen resultados anómalos de inversión de la movilidad en el centro del gel.

En la presente invención, se propone la tipificación rápida de microorganismos por medio de la separación electroforética de ADN en los miniequipos de miniCHEF y miniTAFE. Los miniequipos de miniCHEF proporcionan los patrones de bandas en 2,5 a 5 horas, y los de miniTAFE en 5 a 7 horas. Las muestras de células de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Staphylococcus aureus, preparadas usando el método y el equipo de reactivos asociado, se cargan en los minigeles de los miniequipos y se separan a una intensidad de campo eléctrico de hasta 20 V/cm en miniCHEF o 22 V/cm en miniTAFE.

La intensidad del campo eléctrico, temperatura del tampón, rampas de tiempos de pulso, tiempo de electroforesis y número de pulsos eléctricos establecidos en cada rampa proceden de los resultados del simulador (o del método para seleccionar las condiciones óptimas para separar las moléculas). En tal caso, la concentración del tampón debería ser TBE 0,5X (el tampón TBE 1X es Tris-base 0,089 M, ácido bórico 0,089 M, y EDTA 0,002 M (sal sódica del ácido etilendiamintetraacético)), la concentración del gel de agarosa (Lachema) debe ser del 1,5%, el campo eléctrico debe ser de hasta 20 V/cm, la temperatura debe estar entre 4 y 30°C y la cubeta debe ser de miniCHEF. Cuando se emplea el simulador, pero se desea usar miniTAFE, se pueden usar las mismas condiciones de campo eléctrico y temperatura, proporcionadas por el simulador, pero el número de pulsos de cada rampa se debería incrementar en 1,5 veces, y la duración de los pulsos en 1,2 veces.

Ejemplos Ejemplo 1 Molde capaz de ser esterilizado para la preparación de minibloques de muestra

Se muestra un ejemplo del molde capaz de ser esterilizado y hecho de un material flexible (silicona, goma o cualquier otro material) en el esquema de la Figura 1. El molde se usa para preparar muestras de ADN inmovilizadas en agarosa. La lámina (1) tiene 49 depresiones (2). La suspensión agarosa-células se vierte en el molde o lámina y se distribuye en el molde con la espátula especial (4). Después, la lámina (1) se cubre con la tapa (3), lo que genera los minibloques (5) que contienen células inmovilizadas. La lámina del molde real se hizo con silicona fundida. Se vertió en otro molde hasta que se formó la lámina (1). En el ejemplo, las dimensiones de los minibloques son 3 x 3 x 0,7 mm (longitud, anchura x grosor). Para recuperar los minibloques (5) de la lámina (1), dicha lámina se sostiene por sus extremos y se dobla dentro de un recipiente con una disolución. Por lo tanto, los minibloques se liberan de la lámina y caen en la disolución.

En otras variantes del molde, la anchura de la depresión puede variar de 1,5 mm a la anchura del minigel, mientras el grosor puede variar de 0,5 mm a 1,5 mm. El número de depresiones estampadas en la lámina también puede variar.

Ejemplo 2 Preparación no enzimática de ADN intacto inmovilizado en agarosa de Pseudomonas aeruginosa cultivada en caldo y en medio sólido

Se aislaron dos colonias de P. aeruginosa a partir de una placa de agar-sangre. Una de ellas se inoculó en 5 ml de medio LB (10 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro sódico y 10 g de bacto-triptona por litro de agua destilada) y la otra se extendió en una placa LB (LB más 1,2% de agar bacteriológico).

Ambos cultivos se incubaron durante la noche a 37°C. Los cultivos en caldo se incubaron con agitación, y las placas se mantuvieron estáticas. Las células cultivadas en caldo se recogieron mediante centrifugación, mientras las placas se lavaron con la disolución de lavado apropiada (mostrada en la Tabla I) y se recogieron después mediante centrifugación.

Las células cultivadas en caldo o en medio sólido se lavaron con la disolución mostrada en la Tabla I, se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron a una concentración de 2 x 10^{9} células por mililitro de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% disuelta en NaCl 0,15 M. La mezcla agarosa-células se vertió en la lámina (1) del molde mostrado en la Figura 1, después la lámina se cubrió con la tapa (3) y la agarosa se dejó endurecer hasta que se formaron los bloques (5). Los minibloques se incubaron con NDSUPlus durante media hora a 50°C. Después, los minibloques se lavaron dos veces durante 10 minutos en TE-100 a 50°C y se almacenaron en TE-100 a 4°C. Antes de la digestión con enzima de restricción, los minibloques se lavaron y se incubaron durante 10 minutos en tampón de enzima de restricción Xba I. Cada minibloque se digirió con 20 U de Xba I durante 2 horas a 37°C. Los fragmentos de restricción se separaron en miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, 1,5% de agarosa y TBE 0,5X, aplicando una rampa de pulsos de 20, 15, 10, 5 y 3 segundos y 5, 15, 320, 1020 y 100 pulsos, respectivamente.

Los patrones de bandas (26) separadas en el minigel de miniCHEF (25) se muestran en la Figura 2. Los minibloques de P. aeruginosa (27) se prepararon a partir de cultivos en medios LB líquidos, mientras los minibloques (28) se prepararon a partir de cultivos realizados en placas LB. Los tamaños de los fragmentos de ADN separados también se muestran en la figura.

Ejemplo 3 Preparación no enzimática de ADN intacto inmovilizado en agarosa de Staphylococcus aureus cultivado en medios sólidos

Se aisló una colonia de S. aureus de medio agar-sangre y se extendió en una placa Mueller-Hinton (Oxoid). La placa se incubó durante la noche a 37°C. La superficie de la placa se lavó con disolución de lavado (NaCl 0,15 M, EDTA 0,01 M, pH 8,0, Tabla I) y las células se recogieron mediante centrifugación.

Se preparó ADN intacto inmovilizado en agarosa realizando una de las dos variantes siguientes:

Variante 1: Las células se incuban antes de su inmovilización en minibloques de agarosa.

Variante 2: Las células se inmovilizan en minibloques de agarosa, y después se incuban los minibloques.

En ambas variantes las células se inmovilizaron en agarosa preparando una suspensión celular a una concentración de 4 x 10^{10} células/ml en agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% disuelta en disolución de lavado (Tabla I). La suspensión de células se vertió en la lámina (1) del molde mostrado en la Figura 1, después la lámina se cubrió con la tapa (3) y se dejó enfriar la agarosa hasta que se formaron los minibloques (5).

En la variante 1, el sedimento celular se resuspendió en 3 ml de NDSUPlus y se incubó durante 30 minutos a 50°C. Tras ello, la suspensión se diluyó cinco veces en TE-100. Las células se recogieron mediante centrifugación y se inmovilizaron en minibloques de agarosa.

En la variante 2, las células se recogieron, se lavaron y después se inmovilizaron en minibloques de agarosa. Los minibloques de agarosa se incubaron con NDSUPlus durante una hora a 50°C.

Después de los tratamientos mediante cualquiera de las dos variantes, se lavaron los minibloques dos veces durante 10 minutos cada vez en TE-100 a 50°C. Antes de la digestión con enzima de restricción, los minibloques se lavaron y se incubaron con tampón de enzima de restricción Sma I durante 10 minutos en hielo. Cada minibloque se digirió con 20 U de Sma I durante 2 horas a 37°C. Los fragmentos de macrorrestricción de ADN de S. aureus, separados en el patrón de bandas (31) en el minigel (30), se muestran en la Figura 3. Los minibloques (32) se prepararon según la variante 2, mientras los de (33) mediante la variante 1. Las condiciones de funcionamiento fueron 10 V/cm, 20°C, 1,5% de agarosa, TBE 0,5X y rampas de pulsos de 1, 5, 9, 13, 17 y 21 segundos. En todas las rampas se aplicaron 130 pulsos. También se muestran en la figura los tamaños de los fragmentos de ADN separados.

Ejemplo 4 Diseño de las condiciones de funcionamiento de la electroforesis en miniCHEF. Ajuste de las condiciones experimentales usando el simulador (método para seleccionar las condiciones óptimas para la separación del ADN)

Se simularon las rampas de tiempos de pulso necesarias para separar los cromosomas de S. cerevisiae en la cubeta de miniCHEF de 11,6 cm entre los electrodos de polaridades opuestas. El propósito fue obtener el patrón que exhibe las 11 bandas formadas por todos los cromosomas de S. cerevisiae. Se asumió que la electroforesis se realiza en un gel de agarosa del 1,5% y TBE 0,5X como tampón de electroforesis. Se tomaron los valores de tamaño de los cromosomas de S. cerevisiae informados por Goffeau (Goffeau A et al., Science, 1996, 274: 546): 230 kb (crom. I), 270 kb (crom. VI), 315 kb (crom. III), 440 kb (crom. IX), 589 kb (crom. VIII), 577 kb (crom. V), 667 kb (crom. XI), 745 kb (crom. X), 784 kb (crom. XIV), 813 kb (crom. II), 924 kb (crom. XIII), 948 kb (crom. XVI), 1091 kb (crom. VII y crom. XV), 1554 kb (crom. IV) y 2352 kb (crom. XII).

El simulador predijo cuatro rampas de tiempos de pulso de 5, 40, 75 y 110 s y 42 pulsos en cada rampa para conseguir una separación óptima de los cromosomas de S. cerevisiae en un patrón único para una intensidad de campo eléctrico de 10 V/cm y 20°C. Los resultados de la migración, los tiempos de reorientación, las velocidades de migración y el código de color usado para identificar cada cromosoma se muestran en la Tabla II.

TABLA II Resultados cuantitativos obtenidos mediante el uso del simulador. Tamaños (kb) y colores asignados a los cromosomas de S. cerevisiae según el código de colores del simulador

2

La fotografía del minigel real (40) con los patrones de bandas de los cromosomas de S. cerevisiae 196-2 (41) obtenidos en miniCHEF en las condiciones predichas por el simulador se muestra en la Figura 4. También se muestra el patrón de bandas simulado en el minigel hipotético (42) y dibujado mediante el simulador. Ambos patrones son similares. Las moléculas de ADN intactas inmovilizadas en agarosa de S. cerevisiae 196-2 separadas en el experimento real se prepararon mediante la inmovilización de las células en bloques de agarosa. Los bloques se incubaron secuencialmente con LETK (Tris 10 mM, EDTA 500 mM, KCl 600 mM, pH 7,5) durante 4 horas, NDS (Tris 10 mM, EDTA 500 mM, 1% de Sarcosil, pH 9,5) durante 2 horas, y NDS más urea 4 M (NDSU) durante 2 horas. (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29:12, 2079-2084).

El diagrama de flujo de una parte del simulador descrito en esta invención se muestra en la Figura 5. El método de cálculo para estimar las rampas de pulsos se muestra en el diagrama de flujo.

El criterio para finalizar los incrementos en el número de pulsos es el número de pulsos que provoca que la molécula más pequeña migre 2,5 cm.

Finalmente, el simulador proporciona el resultado que el usuario debería observar en el gel (véanse los patrones de bandas reales en el minigel 43 y los simulados en el minigel hipotético 42 de la Figura 4) para las rampas de pulsos calculadas mediante el programa y aplicadas al grupo de moléculas especificado por el usuario. El programa también proporciona datos cuantitativos. Esta parte del diagrama no se muestra porque la solución es trivial.

Ejemplo 5 Tipificación mediante miniCHEF de aislamientos de Escherichia coli

Se tomó una única colonia de cada aislamiento (INN3 e INN7), caracterizada fenotípicamente como Escherichia coli, de placas de agar-sangre. Además, se subcultivaron en 5 ml de medio LB (10 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro sódico, 10 g de bacto-triptona por litro de agua destilada). Cada cultivo se incubó durante la noche a 37°C con agitación.

Las células de cada cultivo se lavaron (véase la disolución de lavado en la Tabla I), se centrifugaron y el sedimento se resuspendió hasta una proporción de 2 x 10^{9} células por mililitro en agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% disuelta en NaCl 0,15 M. Cada mezcla agarosa-células se vertió en la lámina (1) del molde mostrado en la Figura 1. La lámina se cubrió con la tapa (3) y la agarosa se dejó endurecer hasta que se formaron los minibloques (5). Ambos grupos de minibloques se incubaron con NDSUPlus durante media hora a 50°C. Después, los minibloques se lavaron y se incubaron durante 10 minutos con tampón de digestión de enzima de restricción Xba I, y cada uno se digirió con 20 U de Xba I durante 2 horas a 37°C.

Los patrones de bandas (87) separadas en el minigel (86) de miniCHEF se muestran en la Figura 6. Las separaciones conseguidas en miniCHEF del ADN total digerido con Xba I a partir de los aislamientos de E. coli INN3 (88) e INN7 (89) permitió identificar seis fragmentos comunes entre ellos (90). Después, según Tenover (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33:9, 2233-2239), los aislamientos INN3 e INN7 se clasificaron como dos subtipos diferentes de E. coli. Los fragmentos de restricción del ADN se separaron en miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, 1,5% de agarosa y TBE 0,5X, aplicando rampas de pulsos de 25, 20, 15, y 5 segundos y 35, 40, 50, 140 y 800 pulsos, respectivamente.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Esquema del molde para moldear los minibloques. Se muestra la lámina con las depresiones estampadas para verter la suspensión agarosa-células en la parte inferior de la figura. En la parte superior se muestra la tapa del molde y un minibloque. También se muestra a la derecha la espátula para distribuir la suspensión agarosa-células.

Figura 2. Patrones de bandas obtenidos en miniCHEF para los fragmentos de ADN de macrorrestricción de Xba I de P. aeruginosa. A la izquierda, los minibloques de P. aeruginosa se prepararon a partir de células cultivadas en medio LB líquido, mientras, a la derecha, los minibloques se prepararon a partir de células cultivadas en placas LB. Se usó miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, 1,5% de agarosa y TBE 0,5X, y se aplicaron rampas de pulsos de 20, 15, 10, 5 y 3 segundos y 5, 15, 320, 1020 y 100 pulsos, respectivamente.

Figura 3. Patrones de bandas proporcionados mediante miniCHEF para los fragmentos de ADN de macrorrestricción de Sma I de S. aureus. A la izquierda se muestran los patrones de bandas de las muestras preparadas incubando los minibloques que contienen células con NDSUPlus. A la derecha se muestran los patrones de bandas de las muestras preparadas incubando las células con NDSUPlus y posteriormente inmovilizándolas en minibloques de agarosa. En ambas preparaciones de muestras, las células se cultivaron en placas. Las condiciones de funcionamiento fueron 10 V/cm, 20°C, 1,5% de agarosa, TBE 0,5X, tiempos de pulso de 1, 5, 9, 13, 17 y 21. En cada rampa se aplicaron 130 pulsos.

Figura 4. Fotografía de un minigel de miniCHEF real (40) usado para obtener los patrones de bandas de los cromosomas 196-2 de S. cerevisiae (izquierda) y gráfico del minigel hipotético (42) predicho por el simulador (derecha). La electroforesis real se realizó en las condiciones predichas por el simulador. Las moléculas de ADN intactas inmovilizadas de 196-2 de S. cerevisiae, analizadas en esta electroforesis, se prepararon como se describió en el Ejemplo 4. Para una intensidad de campo eléctrico de 10 V/cm y una temperatura del tampón de 20°C, las condiciones de funcionamiento predichas por el simulador fueron cuatro rampas de pulsos de 5, 40, 75 y 110 segundos, y 42 pulsos en cada rampa. Los datos de migración y el código de colores usado para identificar los tamaños de las moléculas se muestran en la Tabla II.

Figura 5. Diagrama de flujo del método para simular los patrones de bandas de ADN en los minigeles de miniCHEF. Se usan los siguientes parámetros y variables en el diagrama: tamaño del ADN (kb), tiempos de reorientación del ADN (tr), velocidad de migración del ADN durante la reorientación (vr) y después de la reorientación (vm) en miniCHEF. Además, tp_{r}: tiempo de pulso en cada rampa, Np_{r}: número de pulsos en cada rampa, g0, g1, g2, g3, g4 coeficientes obtenidos para describir la viscosidad (\eta) como función de la temperatura experimental (T), Dt: distancia teórica predicha por el método, n: número de rampas, E: campo eléctrico, L: longitud del contorno del ADN, pb: pares de bases, Q: carga neta del ADN.

Figura 6. Tipificación mediante miniCHEF de los aislamientos de E. coli INN3 e INN7 después de digestión de restricción con Xba I de sus moléculas de ADN. Se usó el método y el equipo de reactivos asociado para preparar las muestras. Las condiciones de funcionamiento fueron: 10 V/cm, 20°C, gel de agarosa del 1,5% y TBE 0,5X, aplicando rampas de pulsos de 25, 20, 15, 10 y 5 segundos y 35, 40, 50, 140 y 800 pulsos, respectivamente. Los puntos (90) marcan los fragmentos de restricción que ambos aislamientos tienen en común.

Ventajas de las soluciones descritas

1- La preparación de moléculas de ADN intactas de microorganismos, inmovilizadas en minibloques finos de cualquier gel, se realiza en un tiempo de entre 5 minutos y 1 hora. La preparación no requiere el uso de enzimas, y por tanto se realiza rápidamente y con bajo coste.

2- La preparación no enzimática de muestras de ADN para PFGE es eficaz mediante el uso de cultivos de células en medios líquidos o sólidos. Algunos tipos de células se pueden incubar en las disoluciones no enzimáticas antes de su inmovilización. Esta modificación reduce el tiempo necesario para preparar las muestras.

3- Las moléculas de ADN inmovilizadas en el gel, preparadas mediante el procedimiento descrito, están exentas de inhibidores de endonucleasas de restricción. Estas moléculas se digieren mediante enzimas de restricción en 2 horas, y proporcionan sus patrones de bandas típicos en experimentos de electroforesis en gel de campo pulsado realizados en los miniequipos.

4- Se obtienen minibloques de tamaños homogéneos, que contienen ADN inmovilizado de microorganismos, y así no se necesita cortarlos antes de la electroforesis. Los minibloques idénticos garantizan la reproducibilidad de los resultados.

5- Los patrones de bandas se pueden simular en el ordenador cuantas veces sea necesario, previamente a realizar los experimentos. La simulación permite seleccionar el campo eléctrico, la temperatura y las rampas de tiempos de pulso que dan como resultado la mejor separación entre las moléculas sin gasto de reactivos ni de muestras biológicas.

6- La selección de las rampas de pulsos se realiza con la ayuda de un método basado en ecuaciones que describen la migración de las moléculas de ADN en los minigeles de miniCHEF. Así, el método para seleccionar las rampas proporciona el dibujo del patrón de separación óptimo entre las moléculas.

7- El proceso descrito aquí ahorra tiempo, reactivos químicos y muestras biológicas.

8- Se proporciona un equipo de reactivos para simplificar la preparación de ADN intacto de microorganismos.

Claims (17)

1. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), que comprende realizar separaciones mediante PFGE de fragmentos de restricción de ADN bacteriano en minicubetas de sistemas CHEF (campo eléctrico homogéneo de contorno cerrado) o TAFE (electroforesis de campo alternante transversal) en 7 a 13 horas, y calcular las migraciones del ADN ("D") de dichos fragmentos a diversos tiempos de pulso ("tp") sustituyendo los tamaños del ADN ("L"), el campo eléctrico ("E"), la viscosidad del tampón (\eta, una función de la temperatura del tampón) y el tiempo de pulso en un grupo de ecuaciones teóricas conocidas que describen

"D" como "\sum\limits_{r=1}^{n} d_{r} \cdot Np_{r}", ("n", número de rampas de tiempos de pulso; "Np", número de pulsos),

"d" (migraciones por pulsos) como "vr\cdottp_{r}\cdot\Gamma_{r}(tp_{r}-tr) + vm\cdot(tp_{r}-tr)\cdot[1-\Gamma_{r}(tp_{r}-tr)]",

"vr" (velocidad de reorientación del ADN) como "0,0207[QE^{1,45}/8\pi\etaL^{1,35}]"

"vm" (velocidad del ADN después de la reorientación) como "0,665[QE^{1,76}/8\pi\etaL^{1,08}]",

"tr" (tiempo de reorientación del ADN) como "0,134(L^{1,14}/vr)^{0,926}";

en la que \Gamma_{r}(tp_{r}-tr)=1 si tp_{r}-tr \leq 0 y \Gamma_{r}(tp_{r}-tr)=0 si tp_{r}-tr > 0,

y asumiendo que la electroforesis se realiza en geles de agarosa del 1,5% y tampón TBE 0,5X;

en el que el proceso comprende:

a)

una etapa de preparación de ADN intacto inmovilizado de células de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus realizada mediante:

i)

un grupo de disoluciones de reactivos químicos que forman un equipo de reactivos mediante el cual se preparan moléculas de ADN intactas inmovilizadas a partir de dichas células bacterianas, disoluciones del equipo que tienen las siguientes composiciones:

-

la sal NaCl a una concentración de 0,15 M, o el agente quelante de metales EDTA a una concentración de 0,01 M y la sal NaCl a una concentración de 0,15 M y un pH de 8,0, disoluciones de dicho equipo mediante las cuales las células bacterianas se lavan y se inmovilizan en minibloques de agarosa,

-

el agente quelante de metales EDTA a una concentración de 0,1 M, dos detergentes aniónicos, Sarcosil y Nonidet® P-40, ambos a una concentración del 1% y Tris-base 0,01 M, disoluciones que podrían contener adicionalmente urea 4 M, disoluciones de dicho equipo mediante las cuales se tratan las células bacterianas,

-

el agente quelante de metales EDTA a una concentración de 0,1 M y Tris-base 0,01 M, disolución de dicho equipo mediante la cual se lavan y se almacenan los minibloques;

ii)

moldes flexibles para moldear los minibloques de agarosa que contienen células bacterianas; moldes que son láminas de materiales tales como silicona, y que se cubren con tapas de vidrio; láminas que son de hasta 0,5 cm de grosor y que tienen estampadas en una de sus superficies diversas depresiones cuadradas de 0,3 cm de tamaño y de 0,03 a alrededor de 0,1 cm de profundidad, depresiones en las que la mezcla agarosa-células bacterianas se solidifica y proporciona minibloques de dichos tamaños, moldes que son lo suficientemente flexibles como para ser doblados para separar dichos minibloques de ellos y ser reutilizables después de someterlos a autoclave, y dichos moldes y tapas se montan completamente y se usan para inmovilizar células bacterianas según un método.

iii)

el uso del molde flexible y de dicho equipo de reactivos con cada especie bacteriana;

b)

una etapa de cálculo que precede a las separaciones de los fragmentos de restricción de ADN de dichas especies bacterianas en las minicubetas; etapa en la que se seleccionan las condiciones de electroforesis óptimas para el funcionamiento en miniCHEF, etapa que se realiza mediante un método de cálculo que comprende:

i)

la entrada de grupos de datos de "d", "tr", "vr" y "vm" de fragmentos de restricción de ADN bacteriano para campos eléctricos de 1 a 20 V/cm y temperatura de 4 a 30°C, grupos de valores que se obtuvieron sustituyendo los tamaños del ADN, el campo eléctrico y la temperatura en el grupo de ecuaciones teóricas conocidas que describen "tr", "vr", "vm" y "d",

ii)

el cálculo de las duraciones de los pulsos de la rampa, o series de duraciones de pulso que separan las moléculas de ADN más eficazmente,

iii)

el cálculo del tiempo total de funcionamiento, o el tiempo de funcionamiento de la electroforesis más eficaz para la serie de duraciones de pulso calculada en la etapa (ii),

iv)

el cálculo de los esquemas de los patrones de bandas para dichas condiciones óptimas de electroforesis o rampa de duraciones de pulso y tiempo de funcionamiento más eficaces, esquemas que se proporcionan como resultado del método y que se caracterizan por bandas que se dibujan como líneas de diferentes colores separadas según la migración del ADN; esquemas en los que cada color identifica los fragmentos de restricción de un tamaño particular; por lo que un código de color unívoco identifica el tamaño de los fragmentos,

y se realiza cada cálculo según varias etapas; y la serie o rampa está formada por varios términos, en los que cada término es una duración de pulso ("tp"), y cada término va acompañado del número correspondiente de pulsos ("Np") que proporciona la duración de funcionamiento más eficaz.

2. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que las láminas que forman dichos moldes flexibles y autoclavables están hechas de silicona, goma o cualquier otro material flexible, láminas que tienen cualquier forma, tamaño y número de depresiones cuadradas idénticas (preferiblemente hasta 50) estampadas en una superficie.

3. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1 y 2, en el que el método de montaje y uso de uno de dichos moldes flexibles para preparar ADN intacto inmovilizado en minibloques de agarosa tiene las siguientes etapas:

i)

verter la suspensión de células bacterianas y agarosa en la superficie estampada del molde;

ii)

distribuir dicha suspensión uniformemente con una espátula para llenar dichas depresiones;

iii)

cubrir el molde con su tapa y dejar endurecer hasta que se formen los minibloques;

iv)

doblar el molde en cualquier recipiente para despegar los minibloques.

4. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de una disolución de lavado de células de dicho equipo de reactivos es NaCl 0,15 M y EDTA 0,01 M, pH 8,0 (disolución Nº 1).

5. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de una disolución de lavado de células de dicho equipo de reactivos es NaCl 0,15 M (disolución Nº 2).

6. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de una disolución de inmovilización de células de dicho equipo de reactivos es agarosa de baja temperatura de fusión del 1,5 al 2% suspendida en NaCl 0,15 M (disolución Nº 3).

7. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de una disolución de inmovilización de células de dicho equipo de reactivos es agarosa de baja temperatura de fusión del 1,5 al 2% suspendida en NaCl 0,15 M y EDTA 0,01 M, pH 8,0 (disolución Nº 4).

8. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de una disolución de tratamiento de células de dicho equipo de reactivos es EDTA 0,1 M, 1% de Sarcosil, 1% de Nonidet P-40 y Tris-base 0,01 M, pH 8,0 (disolución Nº 5).

9. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de una disolución de tratamiento de células de dicho equipo de reactivos es EDTA 0,1 M, 1% de Sarcosil, 1% de Nonidet P-40, Tris-base 0,01 M y urea 4 M, pH 9,5 (disolución Nº 6).

10. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la composición de la disolución de lavado y almacenamiento de minibloques de dicho equipo de reactivos es EDTA 0,1 M y Tris-base 0,01 M, pH 8,0 (disolución Nº 7).

11. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1-10, en el que el método de uso de dicho equipo de reactivos y uno de dichos moldes flexibles para preparar ADN intacto inmovilizado de P. aeruginosa comprende las etapas de:

i)

recoger células de caldo o placas y lavarlas en la disolución Nº 2 de dicho equipo de reactivos,

\newpage

ii)

suspender las células en la disolución Nº 3 de dicho equipo de reactivos y verter la suspensión en un molde flexible,

iii)

despegar los minibloques del molde después de la solidificación de la agarosa doblando dicho molde, e incubarlos durante 30 minutos a 50°C en la disolución Nº 6 de dicho equipo de reactivos,

iv)

lavar los minibloques dos veces a 50°C durante 10 minutos en la disolución Nº 7 de dicho equipo de reactivos, y almacenarlos posteriormente en dicha disolución.

12. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1-10, en el que el método de uso de dicho equipo de reactivos y uno de dichos moldes flexibles para preparar ADN intacto inmovilizado de células de S. aureus comprende las etapas de:

i)

recoger células de caldo o placas y lavarlas en la disolución Nº 1 de dicho equipo de reactivos,

ii)

suspender las células en la disolución Nº 4 de dicho equipo de reactivos y verter la suspensión en un molde flexible,

iii)

despegar los minibloques del molde después de la solidificación de la agarosa doblando dicho molde, e incubarlos durante 60 minutos a 50°C en la disolución Nº 6 de dicho equipo de reactivos,

iv)

lavar los minibloques dos veces a 50°C durante 10 minutos en la disolución Nº 7 de dicho equipo de reactivos, y almacenarlos posteriormente en dicha disolución.

13. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1-10, en el que el método de uso de dicho equipo de reactivos y uno de dichos moldes flexibles para preparar ADN intacto inmovilizado de células de E. coli comprende las etapas de:

i)

recoger células de caldo o placas y lavarlas en la disolución Nº 1 de dicho equipo de reactivos,

ii)

suspender las células en la disolución Nº 3 de dicho equipo de reactivos y verter la suspensión en un molde flexible,

iii)

despegar los minibloques del molde después de la solidificación de la agarosa doblando dicho molde, e incubarlos durante 10 minutos a 37°C en la disolución Nº 5 de dicho equipo de reactivos,

iv)

incubar los minibloques durante 30 minutos a 50°C en la disolución Nº 6 de dicho equipo de reactivos,

v)

lavar los minibloques en la disolución Nº 7 de dicho equipo de reactivos, y almacenarlos posteriormente en dicha disolución.

14. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según la reivindicación 1, en el que la etapa de cálculos que precede a las separaciones de los fragmentos de restricción de ADN de dichas especies bacterianas en dichas minicubetas se realiza mediante un método de cálculo que permite seleccionar las condiciones de electroforesis óptimas de funcionamiento de miniCHEF, método que comprende las etapas de:

i)

especificar en el método de cálculo los grupos de datos de migraciones por pulso ("d"), tiempos de reorientación ("tr"), velocidades de migración durante la reorientación ("vr") y después de la reorientación ("vm") de los fragmentos de restricción de ADN de dichas especies bacterianas, grupos de datos calculados sustituyendo los tamaños del ADN, el campo eléctrico y la temperatura de funcionamiento en el grupo de ecuaciones teóricas conocidas que describen "tr", "vr", "vm" y "d" de las moléculas de ADN,

ii)

calcular la serie más eficaz (rampa) de duraciones de pulso,

iii)

calcular el tiempo de funcionamiento de la electroforesis más eficaz para la serie de duraciones de pulso calculada en la etapa (ii),

iv)

calcular las distancias ("D") migradas por todos los fragmentos de restricción de ADN para la serie más eficaz de duraciones de pulso y el tiempo de electroforesis más eficaz,

v)

dibujar el esquema de los patrones de bandas predichos y el minigel, dibujo que se realiza ajustando las migraciones del ADN al esquema del minigel,

vi)

repetir las etapas (i) a (v) con diferentes grupos de datos "d", "tr", "vr" y "vm", obtenidos a diversos campos eléctricos y temperaturas, y finalmente seleccionar la serie de duraciones de pulso y el número de pulsos que proporciona las mejores separaciones entre las bandas hipotéticas en el esquema de patrones de bandas.

15. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1 y 14, en el que la etapa de calcular la serie (rampa) de duraciones de pulso "tp_{r}" que separa las moléculas de ADN de forma más eficaz se realiza según las siguientes etapas:

i)

especificar en esta etapa los tiempos de reorientación de los fragmentos de ADN más pequeños y más grandes ("tr_{A}" y "tr_{B}", respectivamente) en el campo eléctrico y temperatura seleccionados,

ii)

calcular los "n" términos ("n" de 2 a 1000) de la serie (rampa) de duraciones de pulso (tp_{r} = tp_{1}, tp_{2}, ..., tp_{n}) que comienza en un valor 1,5 veces inferior que "tr_{A}" y finaliza en un valor 1,5 veces mayor que "tr_{B}"; serie en la que el incremento "\Delta" es la diferencia común entre los términos sucesivos; así, la serie más eficaz es: tp_{1} = tr_{A}/1,5, tp_{2} = tp_{1} + \Delta, tp_{3} = tp_{1} + 2\Delta, ..., tp_{n} = 1,5 \cdot tr_{B}; en la que \Delta = |(tp_{1}-tp_{n})| / (n-1), y n = te / (tp_{1}+tp_{n}); siendo "te" el tiempo de funcionamiento de la electroforesis.

16. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1, 14 y 15, en el que la etapa de cálculo del tiempo de funcionamiento de la electroforesis más eficaz para la serie calculada de duraciones de pulso se realiza según las siguientes etapas:

i)

especificar en esta etapa los términos (tp_{1}, tp_{2}, ..., tp_{n}) de dicha serie de duraciones de pulso ("tp_{r}" para "r"=1...n), y el número "n" de términos de dicha serie,

ii)

especificar en esta etapa el grupo de migraciones por pulso ("d_{rA}") del fragmento de restricción de ADN más pequeño; en el que el grupo de migraciones por pulsos de dicha molécula se define para los pulsos de la serie (tp_{1}, tp_{2}, ..., tp_{n}) y el campo eléctrico y la temperatura seleccionados; grupo de migraciones por pulsos que se calcula sustituyendo "tr", "vr" y "vm" del fragmento de restricción de ADN más pequeño en la ecuación teórica conocida que describe "d",

iii)

ajustar un valor inicial para el número de pulsos ("Np_{r}") que corresponde a todos los términos de la serie; siendo 1 el valor inicial recomendado para todos los "Np_{r}" para "r" entre 1 y "n",

iv)

incrementar en uno el "Np_{r}" que acompaña a cada término "tp_{r}" (para todos los tp_{r}, Np_{r} y r = 1...n), y calcular la migración "D" de la molécula más pequeña para los "n" términos de la serie; cálculo que se realiza como

D = \sum\limits_{r=1}^{n} d_{r} \cdot Np_{r};

v)

repetir la etapa iv) hasta que el valor de "D" indique que dicha molécula alcanza una región del minigel que está a una distancia de 0,1 a 1 cm de la parte inferior de dicho minigel hipotético; y después, finalizar los incrementos de "Np_{r}", y seleccionar los valores actuales de "Np_{r}" para estimar la duración de funcionamiento más eficaz,

vi)

tomar como tiempo de funcionamiento total el calculado como

2 \cdot \sum\limits_{r=1}^{n} tp_{r} \cdot Np_{r}.

17. Un proceso para la tipificación bacteriana rápida según las reivindicaciones 1 y 14 - 16, en el que la etapa de dibujo del esquema de los patrones de bandas ajustados a un minigel dado se basa en el cálculo de las distancias "D" migradas por todos los fragmentos de ADN en la serie más eficaz (rampa) de duraciones de pulso y en el tiempo de funcionamiento de la electroforesis más eficaz; y el dibujo comprende las etapas de:

i)

especificar en esta etapa el número de términos "n" de la serie (rampa) de duraciones de pulso, la duración de pulso (tp_{r}) de cada término de la serie, y el número de pulsos (Np_{r}) que acompaña a cada "tp_{r}", para "r" entre 1 y "n",

ii)

especificar en esta etapa los grupos de migraciones por pulsos (d_{r1}, d_{r2}...) de todos los fragmentos de restricción de ADN (f_{1}, f_{2}...) de dicha especie bacteriana; en el que dichos grupos de migraciones por pulsos de dichos fragmentos se definen para los pulsos de la serie (tp_{1}, tp_{2}, ..., tp_{n}) y el campo eléctrico y la temperatura seleccionados; grupos de migraciones por pulsos que se calculan sustituyendo "tr", "vr" y "vm" de cada fragmento de restricción de ADN en dicha ecuación teórica conocida que describe "d"; siendo "d_{r1}", "d_{r2}" los grupos de migraciones por pulsos de dos fragmentos diferentes,

iii)

calcular las distancias que dichos fragmentos de ADN migrarían en el mini-gel hipotético, cálculo en el que la distancia "D" migrada por cada fragmento en el minigel se obtiene como D = \sum\limits_{r=1}^{n} d_{r} \cdot Np_{r},

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iv)

dibujar un rectángulo idéntico al minigel real, y dibujar diversos rectángulos más pequeños dentro de dicho rectángulo mayor, esquema en el que los rectángulos más pequeños representan los pocillos en los que se cargarían hipotéticamente las muestras de ADN,

v)

asignar a cada fragmento un color único en el esquema del patrón, color que identificará dicho fragmento y su tamaño después de la predicción y el dibujo de los patrones de bandas; es decir, usar un código de colores que identifica los tamaños de las moléculas que están contenidas hipotéticamente en las bandas dibujadas como líneas en el esquema de separación,

vi)

dibujar líneas coloreadas debajo de cada rectángulo más pequeño para representar las bandas hipotéticas formadas por los fragmentos, en las que cada línea está alejada de dicho rectángulo menor, o pocillo, la distancia "D" que el fragmento correspondiente migraría en el minigel real.