BR0115172B1 - Processo para a tipificação bacteriana rápida por meio de eletroforese de campo pulsado em gel - Google Patents

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“PROCESSO PARA A TIPIFICAÇÃO BACTERIANA RÁPIDA POR MEIO DE ELETROFORESE DE CAMPO PULSADO EM GEL” ÍNDICE DA CLASSIFICAÇÃO INTERNACIONAL DE PATENTES: C12N 1/00 CAMPO OU RAMO DA TÉCNICA A QUE SE REFERE A INVENÇÃO: A presente invenção refere-se com o ramo da biologia molecular e, em particular, proporciona um processo, que inclui a utilização de métodos e procedimentos, e de um conjunto de reativos para a tipificação rápida de microorganismos. Os microorganismos podem ser leveduras, parasitas e bactérias gram positivas ou negativas e, para sua tipificação, utiliza-se mini-equipamentos de eletroforese de campos pulsantes de tipo CHEF e TAFE.

NÍVEL CONHECIDO DA TÉCNICA. CARACTERÍSTICAS DAS

SOLUÇÕES TÉCNICAS ANÁLOGAS

Durante os últimos anos aumentou o número de doenças infecciosas e apareceram numerosos microorganismos multirresistentes a drogas (Acar J. e Courvalein P. pp. 50-53; Aubry-Damon H. e Andremot A., pp. 54-55; Trieu-Cout P. e Poyart C., pp. 62-66, em 'La Recherche', vol 314, 1998). A ocorrência de brotos infecciosos gerou a necessidade de tipificar os microorganismos causadores das infecções. A tipificação é o processo mediante o qual as diferentes espécies de microorganismos de um dado gênero se classificam em subgrupos ou subtipos diferentes (Busch U., Nitschko H., J. Chromatogr. B, 1999, 722: 263-278). A tipificação é epidemiologicamente importante para se conhecer o broto infeccioso, determinar a operação ou transposição dos patógenos nosocomiais dentro dos centros de saúde e a fonte da infecção. Também é útil para reconhecer novas cepas virulentas e monitorar programas de vacinação. Para que um processo de tipificação seja considerado adequado, ele deve atender os seguintes critérios (Maslow J.N., etal., Clin. Infect. Dis., 1993, 17:153-164): 1 - Proporcionar resultados que não sejam ambíguos para cada isolado analisado. 2 - Proporcionar resultados reproduzíveis. 3 - Diferenciar as cepas não relacionadas dentro de uma mesma espécie.

Existem diversas formas de tipificar microorganismos.

Algumas delas baseiam-se em métodos que analisam características fenotípicas (métodos fenotípicos) e outras na análise de características genotípicas (métodos genotípicos). Os métodos fenotípicos detectam as características que são expressas pelos microorganismos, enquanto que os genotípicos baseiam-se em evidenciar as diferenças entre os dons genéticos dos microorganismos. Por isto, os métodos fenotípicos apresentam a desvantagem de que proporcionam uma medida indireta das alterações na dotação genética, o que não ocorre com os métodos genotípicos.

Um dos métodos genotípicos de tipificação que mais se tem empregado é a Eletroforese de Campos Pulsantes (PFGE). Este método é considerado como o padrão de ouro dos métodos de tipificação molecular do genoma de microorganismos. A tipificação mediante PFGE é realizada separando-se em géis as moléculas de DNA que são submetidas à ação de pulsos elétricos em duas direções diferentes. Os padrões de bandas que se obtém após a eletroforese de amostras de DNA procedentes de isolados de um microorganismo qualquer caracterizam inequivocamente sua dotação genética e são altamente reproduzíveis e discriminatórios (Oliver DM, Bean P., J. Clin.

Microbiol., 1999, 37:6, 1661-1669). Além disso, em um único gel é possível comparar os genomas completos de numerosos isolados. Reportou-se que a PFGE é o método ótimo de tipificação (Maslow J. N., Mulligan M.E., Arbeit R.D., Clin. Infect. Dis., 1993, 17: 153-164; Busch U, Nitschko H., J.

Chromatogr. B., 1999, 722: 263-278). Os resultados que a EDP proporcionam dependem das condições que se aplica no equipamento, e do gênero e espécie do microorganismo que se está estudando.

Assim, a) quando o microorganismo apresenta vários cromossomas lineares inferiores a 10 Mb (1 megabase = 1.000.000 de pares de bases) obtém-se o padrão de bandas de seus cromossomas, que se denomina cariótipo eletroforético. Por exemplo, os microorganismos podem ser fungos leveduriformes, parasitas unicelulares, etc. b) quando o microorganismo apresenta um cromossomo circular grande obtém-se os padrões de bandas dos macrofragmentos de restrição do referido DNA circular. Estes padrões são denominados pulsotipos já que são obtidos em condições experimentais determinadas. Por exemplo, os microorganismos podem ser bactérias, tais como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, etc. A comparação dos cariótipos das diferentes cepas permite sua caracterização e diferenciação. O mesmo ocorre com os fragmentos de restrição de DNA bacteriano. Assim, tanto os cariótipos moleculares como os pulsotipos são utilizados no estudo comparativo de fungos, bactérias e parasitas. O incremento das aplicações práticas da eletroforese de campos pulsantes na microbiologia médica, entre outras coisas, gerou não apenas a necessidade de melhorar os métodos de preparação de amostras, mas também de projetar a priori as condições de operação que separam adequadamente as moléculas, e de proporcionar melhores métodos para analisar os padrões eletroforéticos resultantes.

Em geral, o processo de tipificação de microorganismos mediante PFGE inclui as seguintes etapas e procedimentos: 1) Preparar as amostras: Desenvolver os microorganismos em meio nutriente, imobilizar as células em algum gel e obter DNA intactos, desproteinados e imobilizados. 2) Projetar as operações eletroforéticas: Selecionar as condições experimentais que devem ser aplicadas nos equipamentos de PFGE para se obter uma separação ótima entre as moléculas. 3) Depositar as amostras nos géis e efetuar a eletroforese de campos pulsantes para separar as moléculas de DNA. 4) Analisar os padrões de bandas que se obtém e comparar os resultados que proporcionam diferentes isolados de microorganismos.

Em seguida, analisa-se os equipamentos e procedimentos empregados atualmente na tipificação de microorganismos mediante PFGE. A eletroforese de campos pulsantes. A eletroforese de campos pulsantes (PFGE) data de 1984, quando Schwartz e Cantor (Schwartz D.C. e Cantor C.R., Cell, 1984, 37, pp. 67-75; Patente U.S. 4,473,452 de 25 de setembro de 1984) observaram que as grandes moléculas intactas de DNA se separavam nos géis de agarose em padrões de bandas mediante a aplicação de pulsos elétricos que alternavam periodicamente sua direção de aplicação.

Os autores também determinaram que a separação das moléculas dependia essencialmente da duração dos pulsos elétricos.

Posteriormente determínou-se que a geometria das linhas de força dos campos elétricos alternantes, a intensidade dos mesmos, a temperatura experimental, a intensidade iônica do tampão, a concentração do gel de agarose e a espessura dos blocos de agarose de onde se imobilizam as amostras eram fatores importantes que influíam na separação que podia ser alcançada entre as referidas moléculas (Birren B. e Lai E., Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide. P. 10. Academic Press, Inc., San Diego. Califórnia, 1993, pp. 107, 111, 129, 131, 135; López-Cãnovas et a!., J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp. 123-139; López-Cãnovas et aL, J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp. 187- 197). Desenvolveu-se vários sistemas para realizar PEGE que apresentam câmaras com diferentes disposições de eletrodos. Entre elas encontram-se as câmaras com disposição de eletrodos OFAGE (do inglês, Orthogonal Field Alternating Gel Electrophoresis', Carie C.F. e Olson M.V,, Nucleic Àcíds Res., 1984, vol. 12, pp. 5647-5664), CHEF ('Contour Clamped Homogeneous Electric Field', Chu G. Science, 1986, 234, p. 1532), TAFE (Transversal Alternating Field Electrophoresis', Patente U.S. 4,740,283 de 26 de abril de 1988) c F1GE ("Field Inversion Gel Electroplioresis', Patente U.S. 4,737,251, 12 de abril de 1988) e as minicâmaras MiniTAFE e MiniCHEF (Riverón AM et «/., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp. 1973-1991; Pedido de Patente Européia EP 0 745 844, Bula. 1996/49; Pedido de patente U.S. 08/688,607, 1995;

Patente cubana RPI n° 02/95, 1995).

Os sistemas comumente empregados para tipificar microorganismos mediante PFGH, Os sistemas mais utilizados para tipificar e estudar o genoma de microorganismos são o CHEF e o TAFE, jã que com eles se obtêm padrões retos em qualquer fileira do gel, o que permite comparar os resultados de uma operação e entre operações eletroforéticas diferentes.

No sistema CHEF os eletrodos são dispostos de forma hexagonal em redor do gel e em cada um deles aplica-se voltagens que garantem que o campo elétrico seja homogêneo sobre todo o comprimento e a largura do gel. Este último é o que permite a obtenção de migrações retas e reproduzíveis em qualquer fileira do gel. As cubetas CHEF empregam géis submarinos de até 21 x 14 cm, (largura x comprimento) colocados horizontalmente e apresentam uma distância entre os pares de eletrodos opostos de 33,5 cm (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.

Instruction Manual and Application Guide. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673, BíoRad, pp. 11, 1995).

Como se indicou, o sistema CHEF foi amplamente empregado para tipificar microorganismos. Por exemplo: bactérias (Beverly, S., Anal.

Biochem., 1989, 177, pp. 110-114; Dingwall A. e Shapiro L., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA., 1989, 86, pp. 119-123; Ferdows M.S. e Barbour A.G., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA., 1989, 86, pp. 5960-5973; Kohara Y., Akiyma K., Isono K., Cell 50. 1987, pp. 495-508; Ohki M., Smith C.I., Nucleic Acids Res., 1989, 17, pp. 3479-3490; Schoenline P.V., Galiman L.M., Ely B., Gene, 1989, 70 pp. 321-329; Ventra L., Weiss A.S., Gene, 1989, 78 pp. 29-36), Pseudomonas (Bautsch W., Grothues D. e Tummler B., FEMS Microbiol.

Lett., 1988, 52, 255-258; Romling U. e Tummler B., J. Clin. Microbiol., 2000, 38,1, pp. 464-465), S. cerevisiae (Albig W. e Entian K-D. Gene, 1988, 73, pp. 141-152; Zerva L, et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34:12, 3031-3034), E. histolytica (Petter R. et al., Infect. Immun., 1993, 61:8: 3574-3577), S. pneumoniae (McEllistrem MC. et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38:1, 351- 353), S. aureus (Wichelhaus T.A. et al., J. Clin. Microbiol., 1999, 37:3, 690- 693), M. tuberculosis (Singh S.P. et al., J. Clin. Microbiol., 1999, 37:6, 1927- 1931), P. haemolytica (Kodjo A. et al., J. Clin. Microbiol., 1999, 37:2, 380- 385), etc.

Devido a suas grandes dimensões, as cubetas CHEF requerem grande volume de volume de solução tampão para cobrir sua plataforma de eletrodos, sendo que a intensidade da corrente elétrica pode chegar a alcançar valores elevados empregando também campos elétricos que sejam pouco intensos, de modo que é necessário empregar fontes de energia com elevada potência de saída. Além disso, por razões anteriormente indicadas gera-se grande quantidade de calor nessas cubetas, o que impede que se reduza a duração da eletroforese às expensas de incrementar o campo elétrico. Sabe-se que o CHEF necessita pelo menos 20 horas de eletroforese para separar os cromossomos de Saccharomyces cerevisiae (moléculas menores que 1,6 Mb. 1 Mb = 106 pares de bases) em um padrão de 11 bandas e para tipificar diferentes cepas desta levedura (Zerva L, et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34:12, 3031-3034). Também é um processo lento separar os macrofragmentos de restrição das moléculas de DNA bacteriano, porque se necessita de mais de 20 horas de eletroforese (van Belkum A et al., J. Clin. Microbiol. 1998, 36:6: 1653-1659; Marchadin H. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2000, 44:1:213-216; Romling U e Tummler B., J. Clin. Microbiol., 2000, 38:1: 464- 465). O mesmo ocorre quando se estuda parasitas tais como Entamoeba histolytica, que necessitam mais de 24 horas (Petter R. et al., Infect. Immun., 1993,61:8: 3574-3577). A vantagem dos equipamentos CHEF que se tem empregado até o momento é que é possível analisar até 40 amostras de uma vez, o que facilita a análise comparativa dos padrões eletroforéticos que proporcionam as amostras de numerosos isolados. O sistema TAFE foi proposto por Gardiner K.J., Laas W e Patterson D. em sua publicação em Somatic Cell Mol. Genet., 1986, 12, pp. 185. Este sistema foi denominado inicialmente como "Vertical Pulsed Field Electrophoresis" (VPFE) e desenvolveram um aparelho que foi protegido pela Patente U.S. 4,740,283 de 26 de abril de 1988. Neste sistema instala-se dois pares de eletrodos paralelos a ambos os lados de um gel submarino (10 cm de comprimento x 7,6 cm de largura x 0,64 cm de espessura) que é colocado verticalmente. Esta disposição de eletrodos gera linhas de força do campo elétrico que atravessam transversalmente o gel, e forçam as moléculas a migrar durante cada pulso através da espessura do gel. Nesta configuração, as moléculas de mesmo tamanho percorrem distâncias semelhantes durante a eletroforese e migram, seguindo trajetórias retas até a mesma altura no gel, independentemente de que poço as amostras foram depositadas. Esta é uma das vantagens deste sistema para a tipificação, já que permite comparar as migrações dos DNA que estão contidos em diferentes amostras.

Com base nestes princípios, a Beckman Instrument, Inc. (Beckman, The Geneline System Instruction Manual, ed. Spinco Division of Beckman Instruments, 1988) construiu o equipamento denominado "Geneline I, o conjunto de reativos Transverse Altemating Field Electrophoresis System" conhecido como TAFE. Este sistema emprega um gel de 11 cm de comprimento, 7,2 cm de largura e 0,6 cm de espessura, e o gel permite até 20 amostras. No entanto, a TAFE também requer muita solução tampão (3,5 litros), amostra biológica e mais de 20 horas para resolver os cromossomos e DNA amebiano (Baez-Camargo M., et al., Mol. Gen., 1996, Genet. 253: 289- 296). Portanto, apresenta as mesmas vantagens dos equipamentos CHEF atuais.

Assim, nos equipamentos comerciais de PFGE que mais foram empregados para caracterizar o genoma dos microorganismos e parasitas necessita-se de muito tempo, reagentes e amostras biológicas para separar as grandes moléculas de DNA em um padrão de bandas. Também se empregou o FIGE para tipificar bactérias de maneira rápida (Goering RV e Winters MA., J. Clin. Microbiol, 1992, 30:3,577-580; Grothues D. et al., J. Clin. Microbiol., 1988, 26:10,1973-1977). No entanto, na FIGE descreveu-se o fenômeno de inversão da mobilidade eletroforética que impede uma estimativa correta das dimensões e a comparação dos padrões de numerosas amostras. Uma das características da referida inversão é a impossibilidade de predizer quando ocorrerá (Birren B. e Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, P. 10, Academic Press, Inc. San Diego, Califórnia. 1993, pp. 10). Por isso, a principal desvantagem da inversão da mobilidade é a impossibilidade de identificar sem ambigüidades as moléculas de uma dada banda. Sempre se introduzem dúvidas na identificação das moléculas, salvo caso se tenha hibridizado o gel com sondas específicas de cada molécula, o que encarecería notavelmente o processo de tipificação e consumiría muito tempo.

Se nos equipamentos CHEF atuais GeneNavigator (Amersham-Pharmacia-LKB, Pharmacia Molecular and Cell Biology Catalogue, Pulsed Field Gel Electrophoresis, Nucleic Acids Electrophoresis. 1998, pp. 77-79), CHEF DR1I, CHEF Mapper, (CHEF Mapper XA Pulsed Fíeld Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide.

Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad, pp. 11, 1995) se havia tentado reduzir o tempo de eletroforese mediante o incremento da diferença de potencial aplicada entre os eletrodos de polaridade oposta é possível atingir o limite máximo de potência máxima de saída da fonte de poder e do sistema de resfriamento. Por isto, os fabricantes recomendam que o campo elétrico máximo que é possível aplicar nos referidos equipamentos é de 9 V/cm (CHEF Mapper XA Pulsed Fíeld Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad, pp. 2, 1995), o que impede a redução da duração da eletroforese mediante incrementos da intensidade do campo elétrico. Um feito semelhante ocorre com os equipamentos TAFE atuais.

Os mini-equipamentos de PFGE

Em 1995 reportou-se acerca dos equipamentos de miniPFGE, das versões miniTAFE e miniCHEF (Ríverón AM et ai., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp, 1973-1991; Pedido de patente européia EP 0 745 844, Bull, 1996/49; Pedido de patente U.S. 08/688,607, 1995; Patente cubana RP1 n° 02/95, 1995) em que se resolveu a maior parte das limitações dos equipamentos de PFGE enumerados. Neles realiza-se eletroforese de campos pulsantes em de 4 a 6 horas, com 7 amostras depositadas em um minigel de 4 x 4 x 0,5 cm (comprimento x largura x espessura). Nos equipamentos miniCHEF é possível aplicar campos elétricos de até 16 V/cm, o que proporciona nos minigéis uma separação adequada entre as bandas do padrão eletroforctico em 2,7 horas. A pouca separação de seus eletrodos de polaridade oposta permite a construção de cube!as pequenas e o emprego de pouco volume de tampão para cobrir os eletrodos, Quando se aplica nos miniCHEF uma voltagem dada, ou seja, um certo valor de intensidade de campo elétrico Έ', gera-se menos calor do que o que seria gerado caso se aplicasse o mesmo valor de Έ nos equipamentos CHEF que atualmente são comercializados (Riverón AM et aí., Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973- 1991).

Nos equipamentos miniTAFE é possível aplicar campos elétricos de até 22 V/cm sem que se perda a resolução entre as bandas do padrão (Riverón AM et aí,, Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973-1991). Isto permite obter o cariótipo eletroforético de 5. cereviskie em 5 horas, No miniTAFE, como a separação entre os eletrodos opostos é pequena (7,8 cm) a câmara de eletroforese também é pequena e utiliza pouco volume de solução tampão.

No entanto, quando se deposita nos minigéis amostras com mais de 0,1 cm de espessura necessita-se muito tempo para obter uma resolução adequada do padrão eletroforético. Além disso, de acordo com relatos anteriores onde se analisou a influência da espessura da amostra sobre o tempo de eletroforese (López-Cãnovas et aí., J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp. 187-197), deve-se necessitar mais comprimento do gel para se conseguir obter referido padrão em um único gel. Por outro lado. os minigéis reportados só permitem 7 amostras (miniCHEF) e 13 amostras (miniTAFE), o que representa pouca capacidade de análise para tipificar isolados de microorganismos em laboratórios clínicos.

Apesar das vantagens dos mini-equipamentos de PFGE sobre os sistemas atualmente existentes, não existe qualquer procedimento ou método de tipificação de microorganismos mediante minieletroforese de campos pulsantes em miniCHEF ou miniTAFE. Isto talvez responda à intenção de empregar amostras grossas, como as que se aplicam nos géis convencionais, e na ausência de procedimentos, que de forma simples, proporcionem os parâmetros de operação que devem ser empregados nos referidos mini-equipamentos. A preparação de DNA imobilizado Para a tipificação de microorganismos mediante Eletroforese de Campos Pulsantes, nos equipamentos atuais ou nos mini-equipamentos, é imprescindível dispor de um método de preparação de moléculas intactas de DNA. Isto é necessário porque os métodos conhecidos de isolamento e purificação de DNA em meio líquido provocam, rupturas de referidas moléculas (Schwartz DC e Cantor CR, Cell, 1984, 37, pp. 66-75). Schwartz e Cantor somente excluíram as moléculas com tamanhos inferiores a 1 Mb (106 pares de bases) e propuseram uma metodologia para preparar amostras de DNA para PFGE que consistia em coletar as células cultivadas, lavá-las e imobilizá-las em blocos de agarose. Depois, nos blocos formavam-se os esferoplastos (quando existe parede celular), estes eram lisados e os DNA imobilizados eram posteriormente desproteinados na presença de proteinase K. O método tem sido efetivo para preparar amostras de diferentes gêneros, espécies e várias origens, porém propunha a formação de esferoplastos quando as células possuíam parede. No entanto, as enzimas formadoras de protoplastos, assim como as proteases, são caras. O procedimento descrito originalmente requeria que as amostras fossem incubadas 2 vezes durante toda a noite, o que equivale a 32 horas de preparação (US Patente n° 4,473,452 de 25 de setembro de 1984).

Em trabalhos mais recentes, Gardner (Gardner DCJ et al., Yeast, 1993, 9:1053-1055) demonstrou que os padrões de bandas de S. cerevisiae são obtidos sem necessidade de formar esferoplastos, enquanto que, Higginson et cols, (Higginson D. et al., Anal. Lett., 1994, 27:7, 1255- 1264) demonstraram que os DNA de S. cerevisiae podiam ser desproteinados substituindo, na solução de desproteinação, a proteinase K por uréia 8 M. No entanto, o método descrito por Gardner continua sendo caro devido à necessidade de empregar proteases, enquanto que o descrito por Higginson é barato, porém consome 72 horas de incubação, que é um tempo muito longo.

Posteriormente demonstrou-se que as amostras de S. cerevisiae podiam ser preparadas sem empregar qualquer enzima, porém incubando os blocos durante 4 b em LETK (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 600 mM KCl, pH 7,5), 2 horas em NDS (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 1% sarcosila, pH 9,5) e 4 horas em NDS que continha uréia 4 M (NDSU), o que rendia um tempo de 10 h de preparação de amostras (López-Cánovas L, et aí., Anal. Lett., 1996, 29:12, 2079-2084). Descreveu-se outros métodos rápidos de preparação de amostras de DNA imobilizado, porém todos empregam enzimas (por exemplo, em Guidct F e Langridgc P, Biotech., 1992, 112:2, 222-223).

Em geral, considerou-se que a preparação de DNA imobilizado para PFGE, quer seja proveniente de bactérias, leveduras, etc, requer a obtenção de esferoplastos e a posterior digestão com proteases (Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9: 107-126; Olive DM e Bean P, JCM, 1996, 37:6, 1661-1669). Por exemplo, propô-se que a preparação de amostras de DNA imobilizado de Staphylococcus aureus podia ser realizada em aproximadamente 2 horas, ímobilizando-se as células com lisostafina e incubando-se os blocos em soluções que continham detergentes, enquanto que as amostras de Streptococcus fevaUs foram incubadas com lisozima e mutanolisina previamente à sua imobilização (Goering RV. e Winter MA., J.

Clin. Microbiol., 1992, 30:3, 577-580). Neste último trabalho, os autores não incubaram as amostras com proteinase K. Por outro lado, Matushek et cols. (Matushek MG et a/., J. Clin. Microbiol., 1996, 34:10, 2598-2600) reportaram que não foram capazes de obter padrões de bandas quando não incubavam a amostras com proteinase K. De maneira alternativa, propuseram um método rápido de preparação de amostras que empregava proteinase K. Recentemenie McEl lis trem et aí. (McEllistrcm MC et aí., J. Clin. Microbiol., 2000, 38:1, 351-353) reportaram um método totalmente não enzimãtico para preparar DNA imobilizado de Streptococcus pneumoniae. No entanto, o mesmo consome 6 horas e os autores atribuiram o êxito do protocolo ao fato de que a solução empregada pôde ativar uma autolísina do Streptococcus. Atualmente, somente na preparação de DNA intactos de S. cerevisiae e do Streptococcus pneumoniae foi possível eliminar o uso das enzimas formadoras de esferoplastos e as proteases, porém estes procedimentos consomem 10 e 6 horas, respectivamente, que são tempos consideravelmente longos. Não existe consenso acerca da exequibilidade da eliminação das enzimas formadoras de esferoplastos e da desproteinação do DNA na preparação de amostras de outros microorganismos. Portanto, os métodos atuais são caros e consomem tempos prolongados. A maioria dos métodos anteriores partem da base de que as células que apresentam parede têm que ser imobilizadas previamente a seu tratamento enzimático. Constituem exceção os trabalhos de Goering e Winter (Goering RV e Winter MA, J. Clin. Microbiol., 1992, 30:3, 577-580). Estes autores trataram as células em meio líquido com lisozima e mutanolisina (duas enzimas para formar esferoplastos) antes de sua imobilização. No entanto, não existe um método não enzimático para tratar as células que possuem parede antes de sua imobilização em agarose. Se este método puder ser desenvolvido poder-se-ia dispor de um procedimento simples e barato.

Existem métodos para extrair ácidos nucléicos em solução partindo de células esquentadas na presença de agentes permeabilizadores da parede celular dos microorganismos (Patente européia 0,657,530, 1994, bulletin 95/24; Patente U.S. 158940, 1993). O método libera grandes fragmentos de ácidos nucléicos não degradados sem romper fisicamente aa parede celular de microorganismos gram-positivos e negativos, bem como de leveduras. Este método não requer enzimas líricas. No entanto, ao se extrair o DNA em solução não se obtém moléculas intactas de DNA, de modo que os autores não consideraram que o método fosse aplicável para a obtenção dos cariótipos moleculares a partir dos microorganismos mencionados, nem para a obtenção de pulsotipos. Por outro lado, os autores reportam que o DNA obtido é apropriado para hibridizar, porém não mencionam se o mesmo pode ser empregado para digeri-lo com enzimas de restrição. Finalmente, este método não garante a obtenção de DNA intacto que seja digerível com enzimas de restrição. É possível afirmar que não existe um procedimento geral que permita preparar DNA intacto e imobilizado de leveduras, bactérias gram positivas, bactérias gram negativas e parasitas unicelulares mediante o emprego de soluções que no contenham enzimas e que liberem rapidamente do interior das células as moléculas intactas de DNA.

Por outro lado, quando se deseja preparar amostras de DNA imobilizado é necessário dispor de moldes para a formação das mesmas. Estes moldes podem ser reutilizáveis ou descartáveis. Os moldes reutilizáveis devem permitir sua esterilização por qualquer meio. Isto é importante quando se trabalha com amostras de microorganismos patógenos. O molde descartável é mais simples, porém gera por parte do usuário uma dependência do fabricante e podería ser uma etapa limitante nos laboratórios de poucos recursos.

Os moldes existentes são os seguintes: a) os que formam blocos similares e independentes (Patente U.S. 4,473,452, 25 de setembro de 1984); b) os que formam tiras planas e longas que são cortadas para formar blocos independentes; c) os que formam barras ou varinhas longas de agarose que são cortadas para formar blocos independentes (Birren B e Lai E.

Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, Academic Press, Inc. San Diego, Califórnia, 1993, pp. 29-30).

Neles geram-se amostras que, em geral, apresentam dimensões maiores do que os poços do gel. Por isso, para que os blocos apresentem as dimensões dos poços do gel é necessário cortá-los com um bisturí ou qualquer outro implemento (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.

Instruction Manual and Application Guíde pp. 40, Section 7. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995). No entanto, nem todos os blocos cortados manualmente permanecem com dimensões semelhantes. Esta desigualdade influi na qualidade do padrão eletrolbrético, pois a resolução das moléculas nos géis depende da espessura da amostra que se deposita no gel.

Desta forma dificulta-se a comparação dos padrões nas diferentes fileiras do gel, o que é uma desvantagem quando se deseja tipificar microorganismos.

Na Patente U.S. 5,457,050, de 10 de outubro de 1995, relatou- se acerca de um molde para imobilizar as células e tratã-las no interior do mesmo. Propôs-se que este molde poderia ser descartável ou reutilizável de acordo com o material empregado em sua construção. No entanto, reivindica- se como uma finalidade do molde que as amostras são formadas e tratadas dentro do mesmo, o que na realidade é uma desvantagem. Quando os blocos são mantidos dentro do molde durante as incubações, o tempo necessário para que as referidas amostras estejam disponíveis para a PFGE prolonga-se significativamente. As moléculas efe tu adoras das soluções de lise e desproteinação têm menos acesso às moléculas despertadoras dentro das células, pois a área de contato entre os blocos e as soluções de incubação reduz-se pelo menos à metade.

A seleção das condições experimentais da PFGE A seleção das condições experimentais é complexa. Existem métodos que permitem selecionar as condições de operação em equipamentos de PFGE.

Por exemplo, o CHEF Mapper da Bio-Rad apresenta uma opção de autoalgorítmo e outra de algoritmo interativo (CHEF Mapper XA

Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. pp. 31-40 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995).

As duas opções permitem calcular os tempos de pulso, a duração das rampas de pulso, o ângulo de reorientação, o campo elétrico e o tempo ótimo de operação para separar as moléculas de DNA de uma amostra dada. A diferença do autoalgoritmo, em que se assume condições fixas para as variáveis, o algoritmo interativo permite variar o tipo, a temperatura e a concentração do tampão e o tipo e a concentração de agarose. Ambos algoritmos funcionam com base em dados empíricos e teóricos coletados durante 5 anos de experiências (Bio-Rad Catalogue. Life Science Research Products. Bio-Rad Laboratories, pp. 185. 1998/99), porém os próprios fabricantes recomendam que se introduza no autoalgoritmo dimensões superiores e inferiores àquelas que se deseja separar. Também, considerando- se que é grande a gama de dimensões que se introduz, como dados no autoalgoritmo e no programa interativo, os algoritmos podem proporcionar resultados errôneos, como a inversão da mobilidade das moléculas no centro do gel.

Existem outras expressões empíricas que proporcionam a duração dos pulsos elétricos que separariam um grupo de moléculas cujas dimensões estão compreendidas entre um valor dado e outro maior denominado RSL (Resolution Size Limit) (Smith DR. Methods I, 1990, 195- 203). No entanto, esta relação só é válida em algumas condições experimentais e não prediz a resolução entre duas moléculas quaisquer.

Também existe uma função que proporciona as condições aproximadas de campo elétrico e tempo de pulso que separariam um grupo dado de moléculas (Gunderson K e Chu G, Mol. Cell. Biol., 1991, 11: 3348-3354). Deve-se observar que [isto] somente permite estimar aproximadamente estes dois valores, porém não proporciona a migração das moléculas em qualquer condição experimental.

Apesar de existirem múltiplos estudos teóricos acerca da reorientação das moléculas de DNA durante a PFGE (Noolandi J, Adv.

Electrophoresis, 1992, 5: 1-57; Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9:107-126), eles ainda não proporcionaram um resultado prático de utilidade nos laboratórios.

Ou seja, não se gerou métodos que permitam que o usuário da PFGE selecione facilmente as condições que se deve empregar na separação das moléculas que se deseja estudar.

As equações propostas por López Cánovas et cols (López- Cánovas L et a!., J. Chromatogr. A, 1998, 806:123-139) para descrever a migração das moléculas de DNA em PFGE também não foram estendidas para predizer os padrões de bandas que se poderia obter nos géis quando se aplicam rampas de pulso e se varia o campo elétrico, a temperatura e o tempo de eletroforese, o que constitui as condições experimentais mais frequentemente empregadas na tipificação de microorganismos. A análise dos padrões de bandas de PFGE.

Existem sistemas computadorizados para adquirir as imagens dos géis de PFGE e analisar os padrões de bandas (Gerner-Smidt P et aL, J.

Clin. MicrobioL, 1998, 37:3, 876-877; Tenover F et «/., JL Clin. MicrobioL 1995, 33:9,2233-2239; van Belkum A et aL, J. Clin. MicrobioL, 1998, 36:6.1653-1659). No entanto, considera-se que a comparação dos padrões de bandas dos fragmentos de restrição continua sendo um processo subjetivo que não pode ser totalmente reduzido a rígidos algoritmos (Tenover F et aL, J.

Clin. MicrobioL, 1995, 33:9, 2233-2239), porque ainda que se realize uma análise automática, esta precisa subordinar-se à inspeção visual prévia dos padrões. A análise dos padrões de bandas de forma manual ou automática limita-se a fornecer como resultado o número de bandas e a determinação do tamanho das moléculas por meio de comparação de sua migração com a de marcadores de peso molecular. No entanto, a PFGE é relativamente recente e embora não se disponha de marcadores de tamanho para todos os tamanhos de moléculas de DNA. Assim, até o momento, os critérios de interpretação dos padrões de PFGE utilizados para tipificar espécies bacterianas baseiam-se em determinar o número de fragmentos de restrição de tamanhos diferentes encontrados nos microorganismos que se está comparando.

Propôs-se equações que descrevem migração de moléculas de DNA quando se aplica uma única rampa de pulsos elétricos e qualquer valor de campo elétrico e temperatura (a eletroforese realiza-se em agarose Lachema a 1,5% e em tampão TBE 0,5X (TBE IX: Tris 89 mM, Ácido Bórico 89 mM, EDTA 2 mM) (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806:123-139). No entanto, não existe um método para estender e aplicar referidas equações à análise dos padrões de bandas quando se aplica rampas de pulso, o que é comum nos estudos comparativos de qualquer tipo de microorganismo. Q processo atual de tipificação dos microorganismos mediante PFGE. O processo total de tipificação de microorganismos consome muito tempo e recursos. A eletroforese requer em torno de 20 horas, os métodos de preparação de amostras recomendados pelos fabricantes e reportados na literatura requerem o uso de grandes quantidades de enzimas (Por exemplo, 80 mg/ml de proteinase K) (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. pp. 40-43 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995) e/ou longos tempos de incubação. Aceita-se que um dos fatores que limitou o uso da PFGE para a tipificação de microorganismos é que se necessita entre 2 e 3 dias para completar a análise dos isolados. Isto reduziu a capacidade dos laboratórios para analisar um grande número de amostras (Olive DM e Bean P, J. Clin.

Microbiol, 1999, 37:6, 1661-1669).

Essência da invenção A presente invenção proporciona um processo e um conjunto de reativos que permitem tipificar isolados de microorganismos em um dia de trabalho (entre 7 e 13 horas) mediante a obtenção dos padrões de bandas típicos da separação das moléculas de DNA ao serem submetidas a eletroforese de campos pulsantes em mini-equipamentos. Especificamente: i) Proporciona-se um método que em 60 minutos, no máximo, proporciona as amostras de DNA intacto e imobilizado em miniblocos de algum gel partindo de células que são tratadas com soluções que não contêm enzimas hidrolíticas, podendo o tratamento ser prévio ou posterior à imobilização de referidas células. As células podem ser leveduras, parasitas e bactérias gram positivas e negativas e são imobilizadas em algum gel, mediante o emprego de um molde esterilizável de um material flexível que proporciona miniblocos cujas espessuras são homogêneas e podem estar entre 0,03 e 0,1 cm de acordo com as dimensões do molde que se empregue.

ii) Proporciona-se métodos preditivos das migrações dos DNA lineares. Os métodos foram concebidos com base em equações teóricas que permitem calcular as migrações de todas as moléculas de DNA em qualquer condição de campo elétrico, temperatura, durações dos pulsos, das rampas de pulsos e da eletroforese no sistema CHEF. Estes métodos permitem selecionar as condições ótimas de eletroforese que devem ser aplicadas nos géis e analisar os resultados dos padrões de bandas que se obtêm após realizar o processo de eletroforese, iii) Proporciona-se processos de separação e análise das moléculas de DNA de microorganismos mediante sua separação em mini- equipamentos de eletroforese de campos pulsantes, os quais proporcionam os padrões de bandas em tempos de entre 2,5 a 5 horas no miniCHEF e entre 5-7 horas no miniTAFE. O processo permite estudar até 27 amostras de DNA imobilizado de microorganismos que são a) preparadas por meio do procedimento não enzimático, b) separadas nos minigéis dos mini-equipamentos depois de selecionar, mediante os métodos preditivos mencionados, as condições ótimas que serão aplicadas durante a eletroforese c) analisadas no que se refere a seu tamanho mediante os métodos de análise das migrações das moléculas lineares de DNA que foram depositadas nos poços do minigel, submetidas à ação de dois campos elétricos nos referidos mini-equipamentos e reveladas no gel por meio de qualquer procedimento de tingimento. O método de preparação de amostras previsto nesta invenção consome 60 minutos no máximo, é simples e barato, pois não requer enzimas líticas nem proteases nas soluções de incubação dos microorganismos e proporciona DNA intacto e imobilizado. As moléculas intactas são digeríveis com enzimas de restrição e quando referidas amostras são submetidas a eletroforese de campos pulsantes, os DNA intactos ou seus fragmentos de restrição migram nos minigéis proporcionando os padrões de bandas correspondentes a seus cariótipos moleculares ou pulsotipos. O método fundamenta-se na modificação química da parede bacteriana que permite a lise dos microorganismos, ou a passagem de moléculas efetuadoras pequenas até às moléculas despertadoras dentro da célula, bem como a eliminação de componentes intracelulares indesejáveis mediante diálise. Nos miniblocos onde se imobilizou as células obtém-se DNA intacto imobilizado. O método contempla as seguintes etapas gerais: 1) As células de microorganismos são inicialmente isoladas de fluidos de pessoas hospitalizadas, de uma coleção de cepas biotecnológica ou de experimentos em um laboratório comum de biologia molecular, genética ou outro. 2) As células eram cultivadas em meios líquidos ou sólidos sempre que fossem da composição apropriada para cada microorganismo. 3) As células são coletadas posteriormente mediante centrifugação e lavadas. 4) As células são a) imobilizadas e incubadas nas soluções não enzimáticas, ou b) incubadas na(s) so!ução( soluções) e posteriormente imobilizadas. No caso 'a’, os miniblocos que continham células são incubados durante 30-60 minutos a 45 - 50 C na solução nâo enzimãtica.. No caso 'b\ as células são incubadas primeiramente na solução não enzimãtica entre 5-30 minutos a 50°C e, depois, são imobilizadas em miniblocos de agarose. 5) As células são dialisadas contra o tampão de eletroforese caso esta venha a ser realizada, ou contra o tampão de conservação caso se deseje guardá-las, ou contra o tampão de restrição caso se pretenda digeri-las.

Os organismos que podem ser incubados na solução não enzimãtica previa mente a sua i mobilização são Saccharomyces cerevisiae, Hansemda polimorfa, Pichia pastoris e Staphylococcus aureus. A

Pseudomonas aeruginosct, Escherichia coli e Entamoeba histolytka devem ser imobilizadas primeiramente e, depois, incubadas nas soluções não enzimáticas. Na Tabela I apresenta-se as soluções mais efetivas para a lavagem das células coletadas: Tabela I. Soluções de lavagem de células que resultaram mais efetivas na preparação de DNA imobilizado: As soluções não enzimáticas para a incubação das células ou os miniblocos caracterizam-se por conterem detergentes aniônicos, um agente quelante, um agente capaz de competir na formação de pontes de hidrogênio e tampão Tris. A mais eficiente contém: sarcosila 1%, EDTA 0,1 M, Tris-base 0,01 M, uréia 4 Μ e seu pH é de 9,5 (NDSU). Para incubar células provenientes de bactérias gram-positivas e gram-negativas adiciona-se nonideto P-40 à solução anterior (NDSUPlus).

Alguns microorganismos, como a Escherichia coli, devem ser incubados durante 10 minutos a 37 C em uma solução de lise não enzimática, que contém sarcosila 1%, nonideto P-40 1%, EDTA 0,1 M, Tris-base 0,01 M, e seu pH é de 8,0, antes do tratamento de meia hora com a solução NDSUPlus.

O tampão de conservação dos miniblocos que contêm DNA imobilizado é TE-100 (Tris-base 0,01 M, EDTA 0,1 M, pH 8,0). O procedimento para imobilizar as células em miniblocos de agarose consiste em empregar um molde esterilizável de material flexível.

Este é uma lâmina de silicone, borracha ou outro material flexível de até 0,5 cm de espessura (ver nos exemplos de realização o exemplo 1). A lâmina apresenta qualquer forma e tamanho nas outras dimensões. Na lâmina encontram-se estampadas múltiplas depressões quadradas que podem ter até 0,3 cm de largura e de 0,03 a 0,1 cm de profundidade. Para verter a suspensão de células-agarose o molde é pré-ambientado a 42 C colocando-se o mesmo sobre uma superfície à referida temperatura, em seguida despeja-se a suspensão no molde e distribui-se nas depressões com uma espátula.

Em seguida, o molde é coberto com uma tampa que pode ser vidro, plástico, acrílico ou qualquer outro material e coloca-se a entre 4-15 C para que os miniblocos se gelifiquem. Os miniblocos de tamanhos homogêneos gerados são extraídos do molde flexível sustentando-se o mesmo pelas bordas e torcendo-se o mesmo no interior de um recipiente que contém a solução não enzimática para o tratamento dos referidos miniblocos. A suspensão é preparada de tal forma a imobilizar entre 0,12 e 3 x 108 bactérias, 8 x 107 leveduras ou 6 x 104 trofozoítos de Entamoeba histolytica para cada minibloco de gel de 0,3 x 0,07 cm. Todos os microorganismos mencionados podem ser preparados mediante o emprego deste tipo de molde. Com este tipo de molde também é possível preparar miniblocos que contenham qualquer outro tipo de células.

Na presente invenção, o método para selecionar as condições ótimas de eletroforese que serão aplicadas nos mini-equipamentos baseia-se em calcular as migrações das moléculas lineares de DNA mediante o emprego de um grupo de equações teóricas que descrevem a migração, os tempos de reorientação e as velocidades de migração de referidas moléculas de DNA no minigel do miniCHEF. As equações são alimentadas com valores de campo elétrico e temperatura compreendidos entre 1-20 V/cm e 4-30°C e presume-se que no processo de eletroforese emprega-se agarose a 1,5% e, como tampão de eletroforese, Tris 44,5 mM, ácido bórico 44,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3 (TBE 0,5x). As equações teóricas que descrevem migração do DNA são as seguintes: em que: tr: tempo de reorientação (seg.), vr: velocidade de migração durante a reorientação (cm/seg.), vm: velocidade de migração depois da reorientação (cm/seg.), Q: le‘ x bp (carga 'líquida' do DNA, ou carga do elétron em statcoulomb), L: 0,34 nm x bp (comprimento do contorno do DNA em cm), E: Intensidade do campo elétrico em statvolts/cm, η: viscosidade do tampão em Poises e η foi calculado interpolando-se em um polinômio que relaciona a viscosidade da água com a temperatura (C) experimental, D: migração total de uma molécula de DNA no minigel do CHEF (cm), d: migração por pulso (cm), N: número de rampas de pulsos.

Npr: número de pulsos na rampa Y, tpr: duração do pulso na rampa Y (s), O método para selecionar as condições ótimas do processo de eletroforese inclui as seguintes etapas: I. Calcular a duração dos pulsos (tpr) que se empregará nas rampas.

Para realizar isto: 1) Os valores escolhidos de campo elétrico e temperatura são submetidos às equações. Também os [valores] dos tamanhos das moléculas de DNA linear de menor e de maior tamanho que serão separadas. 2) Mediante o emprego da equação 4, estima-se os tempos de reorientação das moléculas lineares de DNA de maior e menor tamanho. 3) Calcula-se a média de ambos os tempos de reorientação (único tpr ou tpi) quando se deseja que as moléculas de DNA de tamanhos compreendidos entre a maior e a menor estejam incluídas em um único padrão. 4) Calcula-se uma série de tempos de pulsos (tpr), que começam com 1,5 vezes menos tempo do que o tempo de reorientação da molécula mais pequena e terminam com 1,5 vezes mais do que o tempo de reorientação da molécula maior. Emprega-se incrementos de tempos lineares na série de tpr calculada. 5) Para levar a cabo a eletroforese toma-se o tp calculado no parágrafo 3), ou a série de tp calculados no parágrafo 4). II. Calcular a duração máxima da eletroforese. O tempo máximo de eletroforese é estimado a partir do cálculo da migração da molécula de DNA linear de menor tamanho. Isto é realizado da seguinte forma: 1) Os valores de campo elétrico e temperatura do tampão de eletroforese são submetidos às equações 2 e 3. 2) Estima-se o tempo de reorientação e velocidades de migração da molécula de menor tamanho. 3) A duração dos pulsos elétricos (tpr) estimados na etapa I é submetida à equação 1 e fixa-se as quantidades iniciais de número de pulsos elétricos. 4) Incrementa-se de um em um o número de pulsos de cada rampa V e, cada vez, estima-se a migração da molécula de menor tamanho mediante o uso das equações 1 e 5, até que a referida molécula se encontre entre 0,1-1 cm da borda inferior do minigel. III. Mediante as equações 1-5, calcular, para todas as rampas 'n', as migrações apresentadas pelas moléculas que se deseja separar e predizer seus padrões de bandas nos minigéis dos mini- equipamentos miniCHEF nas condições de campo elétrico, temperatura, quantidade de rampas V, duração dos pulsos elétricos (tpr) e número de pulsos (NPr). Este inclui as seguintes etapas: 1) Presume-se que a eletroforese é realizada em agarose a 1,5% e em TBE 0,5X. 2) Define-se com as equações 2 e 3, os valores de campo elétrico e temperatura do tampão que se empregará. 3) De acordo com os valores estimados nas etapas anteriores, define-se com a equação 1, o número total de rampas (n) ou vezes que se alternará a duração do tempo do pulso, a quantidade de pulsos que se aplicará em cada rampa (Npr) e a duração dos pulsos em cada uma das referidas rampas (tpr). 4) Especifica-se os tamanhos das moléculas que se deseja analisar. 5) Calcula-se mediante o emprego das equações 1-5 e para as condições especificadas de eletroforese, as distâncias que migrariam todas as moléculas que se deseja analisar. 6) Apresenta-se as migrações das moléculas lineares de DNA de forma numérica ou gráfica. 7) Repete-se as etapas 2-6 até que se obtenha um padrão predito que mostre uma separação ótima entre as moléculas lineares de DNA. IV. Selecionar, a partir dos resultados anteriores, as condições experimentais que proporcionem nos padrões simulados uma ótima separação entre as moléculas de DNA linear. Alimentar com estes dados a fonte de energia, a unidade de controle da eletroforese e o controle do sistema de resfriamento. O meio preferido para por em prática este método da presente invenção podería ser um programa de computação que facilitará o processo de simulação da separação das moléculas de DNA de diferentes tamanhos no miniCHEF. Este programa permitiría o cálculo das condições experimentais ótimas de separação. O programa também proporcionaria um meio rápido de realizar os cálculos requeridos para por em prática esta parte da invenção.

Com esta finalidade criou-se um programa que simula os padrões de bandas e permite ao usuário alternar as seguintes variáveis: 1- O tamanho dos fragmentos ou moléculas intactas de DNA que se deseja separar no gel. 2- A temperatura do tampão. 3- A voltagem aplicada. 4- Os tempos de pulso e a quantidade de pulsos elétricos aplicados em cada uma das rampas. 5- A quantidade de rampas de pulso, compreendidas entre 1 e 1000 rampas.

Com os valores anteriores o programa proporciona os seguintes resultados: 1- A velocidade de cada molécula durante e após a reorientação em cm/seg. 2- Os tempos de reorientação de cada molécula em seg. 3- A migração de cada molécula no gel (cm) depois de um experimento com uma determinada duração. 4- A migração de cada uma das moléculas e um esquema do padrão eletroforético. A representação gráfica das distâncias que as moléculas lineares de DNA migrariam, nas condições especificadas do processo de eletroforese, realiza-se: i) projetando um minigel com as dimensões do minigel real e projetando no referido minigel os poços de onde supostamente se depositariam as amostras, ii) localizando linhas sob cada poço que representam as bandas das moléculas de cada tamanho que se separariam. Cada linha tem a largura do poço e elas estão separadas do poço [lacuna] as distâncias que as moléculas de cada tamanho migrariam no minigel real. iii) designando a cada linha ou banda hipotética uma cor que depende do tamanho das moléculas que contém. Ou seja, empregando-se um código de cores que se caracteriza porque cada cor identifica moléculas de um tamanho dado.

Este programa constitui um método para selecionar as condições experimentais apropriadas para separar moléculas intactas de DNA cromossômico ou grandes fragmentos de DNA mediante Eletroforese de Campos Pulsantes no miniCHEF. Quando se usa o programa para diferentes valores das variáveis experimentais, obtêm-se diferentes padrões eletroforéticos que permitem identificar as condições que separariam as moléculas de interesse no CHEF e miniCHEF. Este procedimento não consome reagentes nem amostras biológicas. Baseia-se nas equações teóricas que descrevem migração dos DNA lineares em miniCHEF. Estas equações foram obtidas a partir de dados reais de migração de DNA linear no miniCHEF. Portanto, descrevem corretamente a migração de referidas moléculas ao serem submetidas a este tipo de eletroforese e não proporcionam resultados anômalos de inversão da mobilidade no centro do gel.

Na presente invenção propõe-se a tipificação rápida de microorganismos mediante a eletroforese nos mini-equipamentos miniCHEF e miniTAFE. Deposita-se nos géis amostras provenientes de células de Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polimorfa, Pichia pastoris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Entamoeba histolytica que são preparadas empregando-se o procedimento não enzimático. Também é possível depositar amostras destes tipos ou qualquer outro microorganismo preparado com os procedimentos enzimáticos convencionais.

Para a obtenção dos cariótipos, ou dos pulsotipos, emprega-se minicubetas do tipo miniCHEF e miniTAFE nas quais a distância entre os pares de eletrodos opostos não ultrapassa os 11,6 cm e 7,8 cm respectivamente, e nas quais é possível aplicar até 20 V/cm no miniCHEF e 22 V/cm no miniTAFE.

Os equipamentos de eletroforese que foram selecionados para por em prática esta parte da invenção incluem minicubetas miniCHEF e miniTAFE descritas previamente por Riverón et al. 1995 (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp. 1973-1991; Pedido de patente européia EP 0 745 844, Bull. 1996/49; Pedido de patente U.S. 08/688,607, 1995; Patente cubana RPI n° 02/95, 1995) e cujo conteúdo é incorporado totalmente aqui como referência. O piso da cubeta do miniCHEF modificou-se ligeiramente.

Utilizou-se um minigel de agarose que pode possuir de 4 até 7 cm de largura e em que se pode colocar de 12 até 27 amostras. A cubeta do miniTAFE foi ligeiramente alargada para que se possa usar um minigel que apresenta 7 cm de largura e em que se pode colocar até 27 amostras. A concentração de agarose no minigel pode variar desde 0,8 a 1,5%, com uma concentração preferida de 1,5%. O tampão TBE IX compreende uma solução de 0,089 M Tris base, 0,089 M de Ácido Bórico e 0,002 M EDTA (sal sódico do ácido etileno-diamino-tetra-acético) e pode ser empregado em concentrações entre 0,25 e IX, porém preferivelmente a 0,5X. A temperatura do tampão pode oscilar entre 4 e 30°C. Também é possível empregar tampão TAE IX (Tris-Acetato 0,04 M e EDTA 0,001 M). Para impor as voltagens nos eletrodos do miniCHEF e alternar os campos elétricos nas cubetas miniCHEF e miniTAFE é possível empregar qualquer equipamento construído para este propósito que também inclui os equipamentos descritos por Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, 28: 5; 845- 860; e Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, 28:11, 1973-1991.

Para energizar os eletrodos é possível empregar qualquer fonte de energia que possua como saída máxima 300 watts de potência.

Os miniblocos de agarose são colocados no poços que formam os dentes do pente que se utiliza para formar o minigel. É possível empregar pentes diferentes e colocar amostras mais largas ou menos largas, de acordo com o tamanho dos blocos que se preparou.

Utiliza-se brometo de etídio para tingir as moléculas presentes em cada banda do minigel. O minigel é iluminado com luz ultravioleta (transiluminador de UV) e as imagens são recolhidas por uma câmara sensível a luz ultravioleta utilizando-se um filtro de 550 nm. Também é possível empregar qualquer outro procedimento de tingimento. A força do campo elétrico, a temperatura do tampão, as rampas de pulso, os tempos de eletroforese e o número de pulsos elétricos aplicados em cada rampa provêm dos resultados do simulador (o método de seleção das condições ótimas de separação de moléculas), ou dos resultados de qualquer outro método empregado pelo experimentador, incluindo sua experiência empírica. Quando se emprega o simulador, a concentração do tampão deve ser de 0,5X TBE, o gel de agarose (Lachema) deve ser a 1,5%, o campo elétrico deve ser de até 20 V/cm, a temperatura deve ser entre 4 e 30°C e a câmara deve ser o miniCHEF. Quando se emprega o simulador, porém desejando utilizar o miniTAFE, é possível aplicar as mesmas condições de campo elétrico e de temperatura proporcionadas pelo simulador, porém deve- se aumentar a quantidade de pulsos de cada rampa em 1,5 vezes e a duração dos pulsos em 1,2 vezes.

Sob outras condições de forças do campo elétrico e temperatura também é possível obter nos mini-equipamentos os padrões de bandas típicos das moléculas contidas na mistura que se separa.

Na presente invenção, o método preferido para analisar os padrões de bandas obtidos após o processo de eletroforese baseia-se em medir as migrações das moléculas lineares de DNA no minigel, e empregar as equações 1-5 para calcular o tamanho das moléculas. O método parte do fundamento de que os padrões de bandas foram obtidos nos minigéis depois do processo de eletroforese no equipamento miniCHEF de campo elétrico compreendido entre 1 e 20 V/cm, temperatura entre 4 e 30°C, agarose (Lachema) a 1,5%, tampão TBE 0,5X e qualquer quantidade 'n' de rampas (compreendidas entre 1-1000) de duração do tempo de pulso e da eletroforese. O método consiste em: i) Medir as distâncias migradas pelas moléculas lineares de DNA nos minigéis depois do processo de eletroforese e de tingimento das bandas nos referidos minigéis. ii) Alimentar as equações 1-5 com os valores de campo elétrico, temperatura do tampão, número de rampas (n) de pulso empregadas, número de pulsos aplicados em cada rampa (Npr) e duração do pulso em cada rampa (tpr) iii) Alimentar o programa com a distância real (D em cm) a que se encontra uma banda qualquer depois da eletroforese, iv) A partir destas distâncias migradas, calcular a tamanho das moléculas de cada banda presente no minigel para o qual: 1) Se define uma molécula hipotética de DNA que possui inicialmente um tamanho de 1000 pares de bases. 2) Se emprega as equações 2, 3 e 4 para estimar vr, vm e tr respectivamente, da molécula hipotética de DNA. 3) Mediante o emprego das equações 1 e 5 e nas condições em que se realizou o processo de eletroforese, estima-se a migração teórica (Dt em cm) que tingiría a molécula hipotética de DNA. 4) Compara-se D e Dt. Se Dt for maior do que D incrementa-se em 1000 bp o tamanho da molécula hipotética de DNA. 5) Repete-se os parágrafos de 2) a 4) até que a migração estimada para a molécula hipotética de DNA seja menor ou igual que a distância (D) migrada pela molécula real no minigel. 6) Assume-se que as moléculas de DNA contidas na referida banda apresentam um tamanho equivalente ao tamanho da molécula hipotética de DNA que atende a condição proposta em 4). Também se assume que os valores estimados de tr, vr e vm da molécula hipotética são os da molécula real. 7) O processo 1) - 6) é repetido para as distâncias medidas em todas as bandas, ou seja, para todas as moléculas separadas no minigel. A descrição final do processo de eletroforese pode ser dada não só pelo padrão eletroforético, mas por uma matriz que contém, nas fileiras, o número de ordem de cada fragmento ou molécula separada, desde a parte inferior até a superior, e, nas colunas, os tamanhos, tempos de reorientação e velocidades de migração de todas as moléculas separadas nas bandas do padrão eletroforético revelado. O método preferido para por em prática esta parte da presente invenção podería ser um programa de computação que proporcionaria um meio rápido de realizar os cálculos requeridos. Ou seja, um meio de calcular o tamanho e os parâmetros cinéticos dos grupos de fragmentos ou moléculas intactas de DNA separados ao final da eletroforese. Criou-se um programa que permite ao usuário alterar as seguintes variáveis: 1- As distâncias migradas no minigel para cada grupo de moléculas, ou posição no gel de cada uma das bandas do padrão. 2- A temperatura do tampão. 3- A voltagem aplicada na câmara de eletroforese. 4- O tempo de pulso e o número de pulsos elétricos aplicados en cada uma das rampas. 5- A quantidade de rampas de pulso (limitadas entre 1-1000).

Com os valores indicados previamente o programa proporciona os seguintes resultados: 1- A velocidade (cm/seg.) de cada molécula durante e depois da reorientação. 2- Os tempos de reorientação (seg.) de cada molécula. 3- O tamanho das moléculas em kb (quilobases).

Dadas as condições experimentais e os resultados de uma eletroforese no miniCHEF pode-se usar o programa para calcular o tamanho e os parâmetros cinéticos das moléculas presentes em cada banda do minigel.

Na maioria dos casos não é necessário o uso de marcadores de peso molecular para identificar as moléculas das bandas. Esta análise permitiría classificar os fragmentos ou moléculas de DNA de acordo com suas propriedades cinéticas.

Também é possível descrever os resultados finais de eletroforese mediante qualquer outro método empregado usual mente.

Exemplos de realização: Exemplo 1. Molde esterilizável para preparar as amostras.

Um exemplo de realização de molde esterilizável de material flexível (silicone, borracha ou outro material) para preparar as amostras de DNA imobilizado é mostrado no esquema da figura 1. A lâmina (1) apresenta 49 depressões (2). No molde ou lâmina despeja-se a suspensão de células em agarose e esta é distribuída por todo o molde com a espátula especial (4), Depois da lâmina (1) cobre-se com a tampa (3) e obtém-se os mmiblocos (5) contendo células imobilizadas. No exemplo real, a lâmina foi confeccionada com silicone fundido, que se despejou num molde até formar-se a lâmina (1).

As dimensões de cada minibluco são de 3 x 3 x 0,7 mm (comprimento x largura x espessura). Para extrair os mmiblocos (5) da lâmina (1), esta é colocada em um recipiente que contém uma solução e é torcida sustentando- se a mesma pelas extremidades, com o que todos os mmiblocos (5) se desprendem da mesma e caem na solução.

Em outras variantes de moldes, a largura dos mesmos pode variar desde 1.5 mm até a largura do minigel, enquanto que sua espessura pode variar desde 0,5 até 1,5 mm. Também se pode variar a quantidade de depressões que se encontram estampadas no fundo da lâmina.

Exemplo 2, Preparação não enzimática de moléculas intactas e imobilizadas de DNA de leveduras procedentes de cultivos em meio líquido.

Diferentes leveduras (S. cerevisiae, H. polimorfa e P. pastoris) cresceram em meio líquido YPG (YPG: 10 g de extrato de levedura, 20 g de glucose e 10 g de peptona em um litro de água destilada) a 30°C e com agitação até a fase exponencial tardia. As células foram coletadas por centrifugação e foram lavadas com EDTA 0,05 M, pH 7,5 (solução de lavagem da Tabela I). Obtém-se DNA intacto e imobilizado efetuando qualquer das duas variantes a seguir: Variante 1: As células são incubadas em suspensão e depois são imobilizadas em miniblocos.

Variante 2: As células são imobilizadas e incuba-se os miniblocos que contêm células.

Em ambas as variantes a imobilização é realizada preparando uma suspensão de células em agarose à razão de 1,3 x 1010 células por mililitro de agarose de baixo ponto de fusão preparada a 1,5% em solução de EDTA 0,125 Μ. A suspensão celular é despejada na lâmina (1) do molde mostrado na figura 1, cobre-se com a tampa (3) e espera-se até que a agarose solidifique e se formem os miniblocos (5).

Na variante 1, ressuspende-se o botão celular (proveniente de 100 ml de cultivo) em 5 ml de NDSU e incuba-se durante 5 minutos a 50 C. A suspensão é diluída cinco vezes com TE-100 e as células são coletadas por centrifugação e são imobilizadas em miniblocos de agarose como se descreveu anteriormente.

Na variante 2, depois de se colher as células estas são lavadas (ver Tabela I) e imobilizadas em miniblocos de agarose. Os miniblocos que contêm células são incubados durante meia hora em NDSU a 45 °C.

Depois dos tratamentos por qualquer das duas variantes, os miniblocos são lavados duas vezes por 5 minutos com TE-100 (Tris-base 0,01 M, EDTA 0,1 M, pH 8,0) a 50°C e são conservados em tampão TE-100 fresco a 4 C. Antes de realizar a eletroforese os miniblocos são incubados durante 10 minutos em 0,5X TBE à temperatura ambiente. A figura 2 mostra a fotografia do minigel (10) de onde se efetuou a separação em padrões de bandas dos cromossomos (12) e do DNA mitocondrial (13) de S. Cerevisiae. As amostras foram preparadas imobilizando-se as células e, posteriormente, incubando-se as mesmas em WDSU (variante 2). Empregou-se o minigel com 7 cm de largura do miniCHEF que admite até 27 amostras em seus poços (11). As condições de eletroforese foram de 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X* tempo de pulso de 50 segundos e 4 horas de eletroforese. A figura 2 também mostra a fotografia de uma fileira (16) do minigel do miniCHEF de onde se efetuou a separação dos cromossomos de H. polimorfa. Nele se separaram os cromossomos (17) num padrão de bandas e o DNA mitocondrial (18). Os cromossomos de H. polimorfa foram preparados de acordo com a variante 2. Eles foram separados no miniCHEF a 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X, tempo de pulso de 120 segundos e 4 horas de eletroforese.

Os cromossomos de S. cerevisiae também foram separados no minigel (20) do miniTAFE como o mostra a figura 2. Mostra-se os padrões de bandas dos cromossomos (21) e do DNA mitocondrial (22). As amostras foram preparadas por meio da variante 1, ou seja, incubando-se as mesmas em NSDU e depois imobilizando-se as mesmas. Elas depositaram-se nos 13 poços (23) que forma o pente empregado. O minigel tem 7 cm de largura e no miniTAFE aplicou-se 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X, tempo de pulso de 60 segundos e 6 horas de eletroforese.

Exemplo 3. Preparação não enzlmática de DNA. intacto e imobilizado de Pseudomonas aerusinosa procedente de cultivos cm meio sólido e em meio líquido.

Para se obter os cultivos de P. aerusinosa em meio líquido e sólido foram isolados de meio agar-sangue duas conjunto de reativos colônias deste microorganismo. Uma delas foi inoculada em 5 mililitros de meio LB (10 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio, 10 g de triptona bacteriológica por litro de água destilada) e a outra foi estriada numa placa deste mesmo meio a que se adicionou agar bacteriológico a 1,2%.

Ambos cultivos foram incubados durante toda a noite a 37°C. O cultivo líquido foi incubado com agitação e o sólido manteve-se estático.

As células foram colhidas centrifugando-se o meio líquido e lavando-se a superfície da placa com a correspondente solução de lavagem mostrada na Tabela I.

Depois de lavar as células provenientes de ambos cultivos com a solução de lavagem mostrada na Tabela I e coletar as mesmas por meio de centrifugação, em ambos os casos preparou-se uma suspensão celular à razão de 2 x 109 células por ml de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% em NaCl 0,15 Μ. A mistura de células-agarose foi despejada na lâmina (1) do molde da figura 1, cobrindo-se com a tampa (3) e deixando-se solidificar até que se formassem os miniblocos (5). Os miniblocos foram incubados em NDSUPlus durante meia hora a 50°C. Posteriormente, os miniblocos foram lavados duas vezes durante 10 minutos com TE-100 a 50°C e foram conservados em tampão TE-100 fresco a 4°C até que fossem dirigidos com enzimas de restrição. Os miniblocos foram lavados e incubados durante 10 minutos em tampão de digestão da enzima de restrição Xba I e cada um deles foi digerido com 20 U de referida enzima a 37 C durante 2 horas. Os fragmentos de restrição obtidos a partir de amostras que contêm células cultivadas em meio líquido ou sólido foram separados no miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, agarose a 1,5% e TBE 0,5X aplicando-se rampas de pulsos de 20, 15, 10, 5 e 3 segundos e 5, 15, 320, 1020 e 100 pulsos, respectivamente.

Na Figura 3 mostra-se os padrões de bandas (26) separados no minigel (25) do miniCHEF. Os miniblocos de P. aeruginosa (27) provêm de cultivo em meio LB líquido, enquanto que os miniblocos (28) provêm de cultivos em meio LB sólido. Na figura mostra-se também os tamanhos dos fragmentos de DNA separados.

Exemplo 4. Preparação nào enzimática de DNA intacto e imobilizado de Staphvhcoccus miretis procedente de cultivos em meio sólido.

Tomou-se uma colônia de S, cntreus acrescida de agar-sangue e estriou-se a mesma numa placa de meio sólido Mueller-Hinton (Oxoid), incubando-se a 37°C durante toda a noite. A placa foi lavada com uma solução de lavagem (NaCl, 0,15 M, EDTA 0,01 M, pH 8,0) da Tabela 1 e as células foram coletadas por meio de centrifugação. É possível obter DNA intacto e imobilizado efetuando-se qualquer das duas variantes a seguir: Variante 1 - Trata-se as células em suspensão e depois imobiliza-se as mesmas.

Variante 2 - Imobiliza-se as células e trata-se os miniblocos que contêm as células.

Em ambas as variantes, realiza-se a ímobilização preparando- se uma suspensão de células em agarose à razão de 4 x lü,() células por mililitro de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% em solução de lavagem (Tabela I). A suspensão celular é despejada na lâmina (1) do molde da figura 1, é coberta com a tampa (3) e é deixada solidificar até que se formassem miniblocos (5).

Para tratar as células em suspensão (variante I) ressuspende-se o botão celular em 3 inl de NDSUPlus e incuba-se a 50 C durante 30 minutos. A suspensão é diluída cinco vezes com TE-100 e as células são coletadas por meio de cenirifugação e são imobilizadas em miniblocos de agarose* Na variante 2, depois que as células são colhidas e lavadas, elas são imobilizadas em miniblocos de agarose. Os miniblocos que contêm as células são incubados durante uma hora com NDSUPlus a 50°C* Depois dos tratamentos por meio de qualquer das duas variantes anteriores os miniblocos são lavados duas vezes durante 10 minutos com TE-100 a 50°C e, depois, durante 10 minutos em tampão de digestão da enzima de restrição Sma I em gelo e digeridos com 20 U da referida enzima a 37 C durante 2 horas. A figura 4 mostra o mínigel (30) de onde se separaram num padrão de bandas (31) os maerofragmentes de restrição do DNA de S. mireus.

As amostras (32) foram preparadas por meio da variante 2, enquanto que as (33) foram preparadas por meio da variante 1, As condições de eletroforese foram de 10 V/cm, 2()°C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X, tempos de pulso 1, 5, 9, 13, 17 e 21. Todas as rampas receberam 130 pulsos. Na figura mostra-se os valores dos tamanhos dos fragmentos separados.

Exemplo 5. Preparação não enzimática de DNA intacto e imobilizado de Entamoeba hisiolvtica.

Cultivou-se trofozoitos de E. histoíytica clotta A em meio TYl-S-33 até a fase exponencial de crescimento. Os trofozoitos foram colhidos rcsfriando-se os frascos de cultivo c coletados por meio de centrifugação. Posteriormente, foram lavados com PBS frio e, depois de coletadas as células, foram incubados durante 15 minutos em uma solução hipertônica (NaCI 0,5 M, EDTA. 0,05 M, Tris 0,01 M, pH 7,0) fria à razão de 2,5 x 106 trofozoitos por mililitro de solução. Finalmente, ressuspendeu-se l(f trofozoitos em um mililitro de agarose de baixo ponto de fusão a 2% dissolvida em solução hipertônica. A suspensão foi despejada no molde flexível de silicone da figura 1 e os miniblocos foram deixados solidificar a 4°C. Os miniblocos foram incubados com NDSU (Tris-base 0,01 M, EDTA 0,1 M, sarcosila 1% (p/v), uréia 4 M, pH 9,5) a 45°C durante uma hora.

Posteriormente, foram incubados durante 10 minutos cm TBE 0,5X à temperatura ambiente e realizou-se a eletroforese. Caso as amostras devam ser conservadas, lava-se as mesmas duas vezes durante 5 minutos com TE- 100 (Tris-base 0,01 M, EDTA 0,1 M, pH 8,0) a 45 C e guarda-se a 4 C em TE-100 fresco.

Na figura 5 mostra-se a foto de um mínigel (35) do mi π ÍT A FE de onde se separou, em padrões de bandas (36), os DNA de E. histolytica (38) e de 5. cerevisiae (37) e eoncatâmeros de DNA de fago 2, (39). A eletroforese foi realizada em campo elétrico de 9,03 V/cin, 120 segundos de tempo de pulso, 20°C, agarose a 1% Seakem, tampão TBE Ü,5X e 6 horas de eletroforese. Depositaram-se amostras com 0,1 cm de espessura.

Exemplo 6. Proieto de operações eleiroforélleas no miniCHEE A seleção das condições experimentais mediante o uso do simulador (método de seleção das condições ótimas de separação).

Simularam-se as rampas de tempo de pulso necessárias para separar os cromossomos de S, cerevisiae em uma cubeta miníCHBP que apresenta 11,6 cm de distância entre os eletrodos opostos. Desejava-se obter um padrão de 11 bandas em que estivessem presentes todos os cromossomos de 5, cerevisiae. Assumiu-se que a separação se realizaria em um minigel de agarose a 1,5% e que o tampão de fluxo a utilizar seria TBE 0,5X. Tomou-se como medidas dos cromossomos de S. cerevisiae os valores reportados por Goffeau (Goffeau A et ai, Science, 1996, 274: 546): 230 kb (crom. I), 270 kb (crom. VI), 315 kb (crom. III), 440 kb (crom. IX), 589 kb (crom. VIII), 577 kb (crom. V), 667 kb (crom. XI), 745 kb (crom. X), 784 kb (crom. XIV), 813 kb (crom. II), 924 kb (crom. XIII), 948 kb (crom. XVI), 1091 kb (crom. VII e crom. XV), 1554 kb (crom. IV) e 2352 kb (crom. XII). O simulador determinou que, para uma intensidade de campo elétrico de 10 V/cm e uma temperatura do tampão de 20°C as condições ótimas de separação de todos os cromossomos de S. cerevisiae em um único padrão de bandas, isto era obtido, aplicando-se quatro rampas de 5, 40, 75 e i 10 s de tempo de pulso e 42 pulsos em cada uma delas. Os resultados de migração, tempos de reorientação, velocidades de migração e o código de cores empregado para identificar os tamanhos dos cromossomos são mostrados na Tabela II.

Tabela II. Resultados quantitativos do simulador. Tamanhos (kb) c cores atribuídas aos cromossomos de S. cerevisiae no código de cores do simulador. D experimental: Distância migrada pela molécula no minigcl (40) da figura 6, D predita: Distância que a molécula devia migrar de acordo com o simulador nas condições do experimento da figura 6, vr: velocidade de migração da molécula durante a reoríentação. vm: velocidade de migração da molécula depois da reoríentação. tr: tempo de reorientaçao da molécula, Na figura 6 mostra-se a fotografia do minigel real (40) onde aparece o padrão de bandas dos cromossomos (41) de 5. cerevisiae 196-2 separados no miniCHEF nas condições que o simulador prediz. Também se mostra o padrão de bandas (43) simulado no minigel hipotético (42) desenhado no simulador. Ambos padrões são similares. As moléculas intactas de DNA imobilizado de S, Cerevisiae 196-2 empregadas nesta eletroforese foram preparadas de acordo com o procedimento não enzimãtico descrito nesta invenção.

Na figura 7 mostra-se o diagrama de fluxo do simulador previsto nesta invenção. Nele mostra-se inicialmente o cálculo da rampa de pulsos a partir de dados de migração ou dados de tamanho.

Quando o usuário introduz os dados de migração, o simulador inicialmente estima os tamanhos, a partir dos referidos dados e, posteriormente, estima um conjunto de rampas lineares de pulsos. Quando o usuário proporciona dados de tamanho, o simulador estima as rampas diretamente. O critério de deter o incremento do numero de pulsos neste exemplo é que a molécula menor migre 2,5 cm.

Posterior mente, o simulador proporciona o resultado final que se vería no minígel (ver padrão de bandas em minigel 43 simulado no minigel hipotético 42 da figura 6) caso se aplicassem essas rampas de pulsos e números de pulsos ao conjunto de moléculas especificadas pelo usuário.

Também proporciona os dados quantitativos. Esta parte do diagrama não é mostrada porque a solução é trivial.

Exemplo 7: Análise dos padrões de bandas dos earíótipos ou pulsotipos.

Na figura 8 mostra-se o cariótipo eletroforético (61) de S, cerevisiae obtido no miníCHEF ao separar referidos cromossomos em agarose a 1,5%, TBE 0,5X, a 10 V/cm, 20 C, 2,958 e 453 pulsos e 21,568 e 453 pulsos.

Neste cariótipo mediou-se a migração de cada uma das bandas (62-66) que apareceram no cariótipo eletroforético de 5. cerevisiae mostrado na figura 8. O método de análise das migrações foi analisado com estes dados de migração, o campo elétrico, a duração e quantidade de pulsos empregados, bem como a temperatura do tampão de eletroforese. O método descrito nesta invenção permitiu o cálculo do tamanho, tempos de reorientaçâo e velocidades de migração das moléculas contidas em cada uma das bandas. Estes resultados são mostrados na Tabela 111 Este é o tipo de resultados proporcionados pelo método de análise de migrações que foi implementado nesta parte da invenção.

Tabela 111. Tamanhos, tempos de rcorientação e velocidades de migração das moléculas contidas em cada banda.

As estimativas são realizadas a partir da posição de cada uma das bandas no minigei, depois da aplicação de rampas de pulso. D exp: Distância migrada pela molécula 110 minigei da figura 8. D teor; Distância que a molécula de tamanho real deveria migrar nas condições do experimento da figura 8. vr: velocidade de migração da molécula durante a rcorientação. vm: velocidade dc migração da molécula depois da rcorientação, tr: tempo de reorientaçao. A figura 9 mostra o diagrama de fluxo do método dc analise das migrações das moléculas de DNA. O diagrama foi desenhado para o processamento de uma única molécula» porém estas etapas são repetidas para todas as moléculas que foram analisadas.

Quando o método descrito no exemplo 7 é alimentado com dados de migração, o mesmo estima os tamanhos de maneira semelhante ao que ocorre no método descrito neste exemplo.

Exemplo 8. Tipificação de isolados de Escherichia coíi mediante o emprego do miniCHEF. A partir de culturas em meio agar-sangue de dois isolados (INN3 c INN7) caracterizados fenotipicamente, como Escherichia coli, tomou-se uma colônia de cada um e subeultivou-se em 5 ml de meio LB (10 g de extrato de levedura» 5 g de cloreto de sódio» 10 g de triptona bacteriológica por litro de água destilada). Cada cultura foi incubado durante toda a noite a 37°C com agitação.

Depois de lavar as células provenientes de ambas culturas com a solução de lavagem mostrada na Tabela I e coletá-las por meio de centrifugação, em ambos os casos foram preparadas suspensões celulares à razão de 2 x 1(/ células por ml de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% em NaCl 0,15 M. Cada mistura de células-agarose foi despejada na lâmina (1) do molde da figura 1, cobrindo-se com a tampa (3) e deixou-se solidificar até que se formassem os miniblocos (5). Os miniblocos foram incubados com NDSUPlus durante meia hora a 50°C. Posteriormente, os miniblocos foram lavados duas vezes durante 10 minutos com TE-100 a 50 C. Depois, os miniblocos foram lavados e incubados durante 10 minutos em tampão de digestão da enzima de restrição Xba I e cada um deles foi digerido com 20 U de referida enzima a 37 C durante 2 horas.

Na figura 10 mostra-se os padrões de bandas (87) separados no minigel (86) do miniCHEF. A separação obtida no miniCHEF dos fragmentos de restrição com Xba I do DNA total dos isolados de E. coli INN3 (88) e INN7 (89) permitiu identificar seis fragmentos comuns entre si (90) e, portanto, de acordo com Tenover (Tenover F et a!., J. Clin. Microbiol., 1995, 33:9, 2233-2239) classificá-los como dois subtipos diferentes de E, coli. Os fragmentos de restrição foram separados no miniCHEF a 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5% e TBE 0,5X. aplicando-se rampas de pulsos de 25, 20, 15, e 5 segundos e 35, 40, 50, 140 e 800 pulsos, respectivamente.

Breve descrição das figuras: Figura l. Esquema de um molde para fundir as amostras. Na parte inferior mostra-se a lâmina onde se encontram estampadas as depressões onde se despeja a suspensão de células em agarose, na parte superior mostra- se a tampa do molde c um miniblocu. À direita mostra-se a espátula que permite distribuir a suspensão células-agarose.

Figura 2. Fotografia dos padrões de bandas dos cromossomos de S, cerevisiae e H. polimorfa ao serem preparados em minigéis do miniCHEF e do miniTAFE. A parte superior mostra o minigel do miniCHEF com 7 cm de largura, seus 27 poços e os padrões de bandas dos cromossomos de S. cerevisiae. No centro da figura mostra-se o minigel com 4 cm de largura e o padrão de bandas dos cromossomos de H. polimorfa. As amostras foram preparadas pelo método não enzimático imobilizando as células e, depois, incubando-se as mesmas em NDSU. As condições de eletroforese foram de 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X, tempo de pulso de 50 segundos e 4 horas de eletroforese, Na parte inferior mostra-se um minigel do miniTAFE com os padrões de bandas de S. cerevisiae, No miniTAFE empregou-se 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X tempo de pulso de 60 segundos e 6 horas de eletroforese. As amostras foram preparadas incubando-se as células em. NDSU previamente a sua mobilização.

Figura 3. Padrões de bandas no míniCHEF dos macrofragmentos de restrição do DNA de P. aeruginosa digerido com Xba I. A esquerda, os miniblocos de l\ aemgimmi que provêm de cultivo em meio LB líquido, enquanto que os da direita provêm de cultivos em meio LB

sólido. Empregou-se o miniCHEF a 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5% e TBE 0,5X, e aplicaram-se rampas de pulsos de 20,. 15, 10, 5 e 3 segundos e 5, 15, 320, 1020 e 100 pulsos, respectivamente.

Figura 4. Padrões de bandas no míniCHEF dos macrofragmentos de restrição do DNA de S. aurem digerido com Sma l. À esquerda mostra-se os padrões de bandas das amostras imobilizadas primeiramente, e incubadas em NDSUPlus posteriormente. À direita encontra-se as amostras que foram incubadas primeiramente em NDSUPlus e, depois, foram imobilizadas. Em ambos os casos as células foram cultivadas em meio sólido. As condições de eletroforese foram dc 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5%, TBE 0,5X, tempos de pulso 1, 5, 9, 13, 17 e 21. Todas as rampas receberam 130 pulsos.

Figura 5. Fotografia dos padrões de bandas de DNA de E, histolytica, S. cerevisiae e concatâ meros de DNA de fago λ. A eletroforese foi realizada no minigel do miniTAFE em campo elétrico de 9,03 V/cm, 120 segundos de tempo de pulso, 20°C, agarose a 1 % Seakem, tampão TBE 0,5X e 6 horas de eletroforese. Depositaram-se amostras com 0,1 cm de espessura, Da esquerda para a direita nas fileiras encontram-se, Fileira I: Miniblocos com S. cerevisiae 196-2; Fileiras 2, 3, 4 e 5: Miniblocos com E. histolyrica incubadas durante 0, 5, 1, 2 e 16 horas, respectivamente em NDSUPlus a 45 C, Fileira 6; concatâmeross de DNA de fago λ.

Figura 6. Fotografia do minigel (40) do miniCHEF de onde se obteve o padrão de bandas dos cromossomos de S. cerevisiae 196-2 (esquerdo) e gráfico do minigel hipotético (42) predito no simulador (direita), A eletroforese real foi realizada nas condições preditas pelo simulador. As moléculas intactas de DNA imobilizado de S. cerevisiae 196-2 empregadas nesta eletroforese foram preparadas de acordo com o procedimento não enzimátieo descrito nesta invenção. Para um campo elétrico de 10 V/cm e uma temperatura do tampão de 20 C as condições de separação preferidas pelo simulador consistiam de quatro rampas de pulso de 5, 40, 75 e 110 segundos e 42 pulsos em cada uma delas. Os resultados de migração e o código de cores empregado para identificar os tamanhos são mostrados na Tabela II.

Figura 7. Diagrama de fluxo do método que simula os padrões de bandas dos DNA que migram nos minigéis do MiniCHEF. No diagrama estão os seguintes parâmetros e variáveis: o tamanho (kb), tempos de reorientação (tr), velocidade de migração durante a reorientação (vr) e velocidade de migração depois da reorientação (vm) das moléculas no miniCHEF.

Tpr: tempo de pulso em cada rampa, Np: número de pulsos em cada rampa, gO, gl, g2, g3, g4 coeficientes obtidos para descrever a viscosidade (η) em função da temperatura (T) experimental, Dt: distância teórica calculada pelo programa, nr: número de rampas, E: campo elétrico, L: comprimento do contorno da molécula de DMA, bp: pares de bases, Q: carga líquida’ do DNA.

Figura 8. Cariótipo eletroforético (61) de S. cerevisiae obtido no miniCHEF ao separar referidos cromossomos em agarose a 1,5%, TBE 0,5X, a 10 V/cm, 20 C, 2,958 e 453 pulsos e 21,568 e 453 pulsos.

Figura 9. Diagrama de fluxo do método que emprega as distâncias migradas para estimar o tamanho (kb), tempos de reorientação (tr), velocidade de migração durante a reorientação (vr) e velocidade de migração depois da reorientação (vm) das moléculas separada no miniCHEF. tpr: tempo de pulso em cada rampa, Npr: número de pulsos em cada rampa, gO, gl, g2, g3, g4 coeficientes obtidos para descrever a viscosidade (η) em função da temperatura (T) experimental, D: distância migrada no gel, Dt: distância teórica calculada pelo simulador, n: número de rampas, E: campo elétrico, L: comprimento do contorno da molécula de DNA, bp: pares de bases, Q; carga liquida' do DNA.

Figura 10. Tipificação no miniCHEF dos isolados INN3 e 1NN7 de Escherichia voli mediante a obtenção dos padrões de bandas dos fragmentos de restrição com Xba 1 de seus DNA. Empregou-se o método não enzimãtico de preparação de amostras. As condições de eletroforese foram: 10 V/cm, 20 C, agarose a 1,5% e TBE 0,5X aplicando rampas de pulsos de 25, 20, 15, 10 e 5 segundos e 35, 40, 50, 140 e 800 pulsos, respectivamente.

Os pontos (90) representam os fragmentos de restrição comuns em ambos os isolados.

Vantagens da solução proposta, 1- A preparação de moléculas intactas de DNA de microorganismos, imobilizadas em miniblocos delgados de algum gel, é realizada entre 5 minutos e uma hora e não requer o uso de enzimas, o que se faz rapidamente e a baixo custo.

2- A preparação não enzimátiea de amostras de DNA para PFGE funciona de forma igualmente eficiente para células provenientes de cultivos em meio sólido ou líquido. Algumas células podem ser incubadas nas soluções não enzimáticas previamente a sua imobilização, o que reduz o tempo necessário para preparar amostras. 3- Os DNA imobilizados pelos procedimentos descritos estão livres de inibidores de enzimas de restrição e são digeríveis em 2 horas por meio de endonucleases de restrição, proporcionando os padrões de bandas típicos em eletroforese de campos pulsantes em mini- equipamentos. 4- Os miniblocos de gel que contêm os DNA imobilizados dos microorganismos apresentam, todos, dimensões homogêneas e não têm que ser cortados antes do processo de eletroforese, o que garante reprodutibilidade nos resultados. 5- Os cariótipos moleculares ou pulsotipos de até 27 amostras são obtidos entre 2,5 e 7 horas com pouco gasto de solução tampão e de matriz de separação. O tempo depende do microorganismo que se estuda e do mini-equipamento que se emprega, bem como do campo elétrico, temperatura e rampas de pulsos selecionados. 6- Os equipamentos requeridos para analisar os genomas dos microorganismos mediante o procedimento de eletroforese de campos pulsantes nos minigéis dos mini-equipamentos requerem pouco espaço útil do laboratório. 7- Os padrões eletroforéticos podem ser simulados em um computador antes do experimento tantas vezes quantas se deseje, o que permite selecionar as condições de campo elétrico, temperatura e rampas de pulso que proporcionam melhor separação entre as moléculas sem consumir reagentes nem amostra biológica. 8- As rampas de pulso que devem ser aplicadas são selecionadas mediante um método baseado em equações que descrevem a migração das moléculas de DNA nos minigéis do miniCHEF, com o que se obtém o padrão eletroforético ótimo de separação entre as moléculas. 9- Para estimar os tamanhos das moléculas de DNA e os tempos de reorientação e velocidades de migração não se necessita de marcadores de tamanho, pois se proporciona um método que estima estes parâmetros a partir das distâncias migradas no gel, sob qualquer condição de campo elétrico entre 1-20 V/cm, temperatura 4-30°C e rampas de pulso. Sua limitação é que requer agarose a 1,5% e tampão TBE 0,5X. 10- As bandas separadas no padrão eletroforético podem ser caracterizadas, além de pelo tamanho de suas moléculas, também pelos tempos de reorientação e velocidades de migração das moléculas. 11- O processo descrito economiza consideravelmente reagentes químicos, amostras biológicas e tempo. 12- Todo o processo de preparação de amostra e de análise do genoma de 27 microorganismos não excede um dia usual de trabalho. 13- Proporciona-se um conjunto de reativos que simplifica a preparação dos DNA intactos dos microorganismos.

Claims (17)

1. I. Processo para tipificação bactéria na rápida por meio de eletroforese de campo pulsado em gel (PFGE); sendo que o processo proporciona que separações de fragmentos de restrição de DNA bacteriano por PFGE sejam realizadas em minicâmaras de sistemas campo elétrico homogêneo fixado ao contorno (CHEF) ou eletroforese de campo altemante transversal (TAFE) em de 7 a 13 horas; e que o processo proporciona que migrações de DNA ('D') dos referidos fragmentos sejam calculadas em diversos tempos de pulso (’tp’) mediante substituição dos tamanhos de DNA (’L'), campo elétrico (Έ’), viscosidade do tamponador (η, um função da temperatura do tamponador) e tempo de pulso em um grupo de equações teóricas conhecidas que descrevem Ό' couro {'n', número de rampas de tempo de pulso; ’Np’, número de pulsos), 'd1 (migrações por pulsos) como Vr' (velocidade de reorientação do DNA) como ’vm' (velocidade do DNA após reorientação) como ’tr’ (tempo de reorientação do DNA) como em que Fr(tpr-tr)=l se tpr-tr < 0 e rr(tpr-tr)=0 se tpr-tr > 0, e admitindo que a eletroforese é realizada em géis de agarose a 1,5% e (),5X tamponador TBE; processo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma etapa de preparação de DNA imobilizado intacto de células de Escherichia coli, Psettdomonas aeruginosa ou Sraphylococcus aureus realizado por meio de: i) um, conjunto de soluções de reagentes químicos formando um kit de reagentes com o qual moléculas de DNA intacto imobilizado são preparadas a partir das referidas células bacterianas, sendo que soluções do kit apresentam as seguintes composições: - o sal NaCl 0,15 M ou o agente quelante de metal EDTA 0,01 Meo sal NaCl 0,15 M e um pH de 8,0, soluções do referido kit com que células bacterianas são lavadas e embutidas em miniblocos de agarose, - o agente quelante de metal EDTA 0,1 M, dois detergentes aniônicos Sarcosyl a 1% e Nonidet P-40 a 1% e Tris-base 0,01 M, soluções que poderíam conter adicionalmente uréia 4 M, soluções do referido kit com que células bacterianas são tratadas, - o agente quelante de metal EDTA 0,1 M e Tris-base 0,01 M, solução do referido kit com que miniblocos são lavados e armazenados; ii) moldes flexíveis para moldar miniblocos de agarose contendo células bacterianas; moldes que consistem de lâminas de materiais, como silicone, e que são cobertos com tampas de vidro; lâminas que apresentam até 0,5 cm de espessura e que apresentam, estampadas em uma de suas superfícies, várias depressões quadradas com 0,3 cm de lado e de 0,03 a cerca de 0,1 cm de profundidade, depressões em que a mistura de agarose- células bacterianas se solidifica e proporciona miniblocos com as referidas dimensões, moldes que são suficientemente flexíveis para serem flexionados para deles destacar referidos miniblocos e que são reutilizáveis após autoclavagem dos mesmos, sendo que referidos moldes e tampas são montados completamente e usados para imobilizar células bacterianas de acordo com um método, iii) métodos de uso do molde flexível e referido kit de reagentes com cada espécie bacteriana; b) uma etapa de cálculos precedentes às separações de fragmentos de restrição de DNA das referidas espécies bacterianas em minicâmaras; etapa com que se seleciona as condições ótimas de eletroforese da operação do miniCHEF, etapa realizada por meio de um método de cálculo que compreende: i) a entrada de conjuntos de dados de 'd', 'tr, 'vr', e 'virí de fragmentos de restrição de DNA bacteriano para campos elétricos de 1 a 20 V/cm e temperatura de 4 a 30 C, conjuntos de valores que foram obtidos substituindo-se tamanhos de DNA, campo elétrico e temperatura no grupo de equações teóricas conhecidas que descrevem V, 'vr', 'vm' e 'd', ii) o cálculo das durações dos pulsos da rampa, ou série de durações de pulsos que separam moléculas de DNA da maneira mais eficiente, iii) o cálculo do tempo de operação total, ou o tempo de operação de eletroforese mais eficiente para a série de durações de pulsos calculadas na etapa (ii), iv) o cálculo dos esquemas dos padrões de bandas para referidas condições ótimas de eletroforese ou tempo de operação e duração de rampa de pulsos mais eficientes, esquemas que são dados como saída do método e são distinguindos por bandas que são desenhadas como linhas de cores diferentes separadas de acordo com a migração do DNA; esquemas em que cada cor identificou fragmentos de restrição de um tamanho particular; de modo que um código de cor unívoco identifica o tamanho dos fragmentos, realizar cada cálculo de acordo com diversas etapas; e sendo que a série ou rampa formada por diversos termos, em que cada termo é uma duração de pulso ('tp'), e cada termo é acompanhado do correspondente número de pulsos ('Np') que fornece a duração de operação mais eficiente.
2. 2. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que as lâminas que formam referidos moldes flexíveis e autoclaváveis são confeccionadas em silicone, borracha ou qualquer outro material flexível, lâminas que apresentam qualquer forma, tamanho e número de depressões quadradas idênticas (de preferência até 50) estampadas em uma superfície.
3. 3. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado pelo fato de que o método de montagem e uso de um dos referidos moldes flexíveis para preparação de DNA imobilizado intacto em miniblocos de agarose apresenta as seguintes etapas: i) despejar a suspensão de células bacterianas e agarose sobre a superfície estampada do molde; ii) distribuir referida suspensão homogeneamente com uma espátula para preencher referidas depressões; iii) cobrir o molde com sua tampa e deixar endurecer até a formação dos miniblocos; iv) dobrar o molde sobre qualquer frasco para destacar os miniblocos.
4. 4. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição de uma solução de lavagem de células do referido kit de reagentes consiste de NaCl 0,15 M e EDTA 0,01 M, pH 8,0 (solução n° 1).
5. 5. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição de uma solução de lavagem de células do referido kit de reagentes consiste de NaCl 0,15 M (solução n° 2).
6. 6. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição de uma solução de embutimento de células do referido kit de reagentes consiste de 1,5 a 2% de agarose com baixa temperatura de fusão suspensa em NaCl 0,15M (solução n° 3).
7. 7. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição de uma solução de embutimento de células do referido kit de reagentes consiste de 1,5 a 2% de agarose com baixa temperatura de fusão suspensa em NaCl 0,15 M e EDTA 0,01 M, pH 8,0 (solução n° 4).
8. 8. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição de uma solução de tratamento de células do referido kit de reagentes consiste de EDTA 0,1 M, Sarcosyl a 1%, Nonidet P-40 a 1% e Tris-base 0,01 M, pH 8,0 (solução n° 5).
9. 9. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição de uma solução de tratamento de células do referido kit de reagentes consiste de EDTA 0,1 M, Sarcosyl a 1%, Nonidet P-40 a 1%, Tris-base 0,01 M e uréia 4 M, pH 9,5 (solução n° 6).
10. 10. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a composição da solução de lavagem de miniblocos e de armazenamento do referido kit de reagentes consiste de EDTA 0,1 M e de Tris-base 0,01 M, pH 8,0 (solução n° 7).
11. 11. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações de 1 a 10 caracterizado pelo fato de que o método de utilização do referido kit de reagentes e de um dos referidos moldes flexíveis de preparação de DNA imobilizado intacto a partir de células de P. aeruginosa compreende as etapas de: i) coletar células de brodo ou placas e lavá-las na solução n° 2 do referido kit de reagentes, ii) suspender células na solução n° 3 do referido kit de reagentes e despejar a suspensão sobre um molde flexível, iii) destacar miniblocos do molde, após a solidificação da agarose, mediante flexionamento do referido molde, e incubar os mesmos durante 30 minutos a 50 C na solução n° 6 do referido kit de reagentes, iv) lavar miniblocos duas vezes a 50 C durante 10 minutos na solução n° 7 do referido kit de reagentes, e armazená-los ulteriormente na referida solução.
12. 12. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações de 1 a 10 caracterizado pelo fato de que o método de utilização do referido kit de reagentes e de um dos referidos moldes flexíveis para preparação de DNA intacto imobilizado a partir de células de S. aureus compreende as etapas de: i) coletar células de brodo ou placas e lavá-las na solução n° 1 do referido kit de reagentes, ii) suspender células na solução n° 4 do referido kit de reagentes, e despejar a suspensão sobre um molde flexível, iii) destacar miniblocos do molde, após a solidificação da agarose, mediante flexionamento do referido molde, e incubar os mesmos durante 60 minutos a 50 C na solução n° 6 do referido kit de reagentes, iv) lavar miniblocos duas vezes a 50 C durante 10 minutos na solução n° 7 do referido kit de reagentes, e armazená-los ulteriormente na referida solução.
13. 13. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações de 1 a 10 caracterizado pelo fato de que o método de utilização do referido kit de reagentes e de um dos referidos moldes flexíveis para preparar DNA imobilizado intacto a partir de células de E. coli compreende as etapas de: i) coletar células de brodo ou placas e lavá-las na solução n° 1 do referido kit de reagentes, ii) suspender células na solução n° 3 do referido kit, e despejar a suspensão sobre um molde flexível, iii) destacar miniblocos do molde, após a solidificação da agarose, mediante flexionamento do referido molde, e incubar os mesmos durante 10 minutos a 37 C na solução n° 5 do referido kit de reagentes, iv) incubar miniblocos durante 30 minutos a 50°C na solução n° 6 do referido kit de reagentes, v) lavar miniblocos na solução n° 7 do referido kit de reagentes, e armazenar os mesmos ulteriormente na referida solução.
14. 14. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a etapa de cálculos precedente às separações dos fragmentos de restrição de DNA das referidas espécies bacterianas nas referidas minicâmaras é realizada por meio de um método de cálculo que permite selecionar as condições ótimas de eletroforese da operação de miniCHEF, sendo que o método compreende as etapas de: i) especificar para o método de cálculo os conjuntos de dados de migrações por pulso ('d'), tempos de reorientação ('tr'), velocidades de migração durante reorientação ('vr') e após reorientação ('vm') de fragmentos de restrição de DNA das referidas espécies bacterianas, conjuntos de dados calculados substituindo-se tamanhos do DNA, campo elétrico e temperatura de operação no grupo de equações teóricas conhecidas que descrevem 'tr', 'vr', 'vm' e 'd' de moléculas de DNA, ii) calcular a série mais eficiente (rampa) de durações de pulsos, iii) calcular o tempo de operação de eletroforese mais eficiente para a série de durações de pulsos calculada na etapa (ii), iv) calcular as distâncias ('D') migradas por todos os fragmentos de restrição de DNA para a série mais eficiente de durações de pulsos e o tempo de eletroforese mais eficiente, v) desenhar o esquema dos padrões de bandas preditos e o minigel, desenho que é realizado transferindo-se a escala das migrações do DNA para o esquema de minigel, vi) repetir etapas de (i) a (v) com diferentes conjuntos de dados 'd', 'tr', 'vr' e 'vm', obtidos em vários campos elétricos e temperaturas, e, finalmente, selecionar a série de durações de pulsos e o número de pulsos que proporcionam as melhores separações entre as bandas hipotéticas no esquema de padrão de bandas.
15. 15. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações 1 e 14 caracterizado pelo fato de que a etapa de calcular a série (rampa) de durações de pulsos 'tpr' que separa moléculas de DNA da maneira mais eficiente é realizada de acordo com as etapas a seguir: i) especificar para esta etapa os tempos de reorientação dos menores e dos maiores fragmentos de DNA ('trA' e ’trB', respectivamente) no campo elétrico e temperatura selecionados, ii) calcular os termos 'n' ('n' de 2 a 1000) da série (rampa) de durações de pulsos (tpr = tpi, tp2,..,tpn) que inicia num valor 1,5 vezes menor do que 'trA' e termina num valor 1,5 vezes maior do que 'trB'; série em que o incremento Ά é a diferença comum entre os termos sucessivos; assim, a série mais eficiente é: tpi = trA/l,5, tp2 = tpi + Δ, tp3 = tpi + 2Δ, ... , tpn = 1,5 · trB; em que Δ = | (tpi-tpn) | /(n-1), e n = te/(tpi+ tpn); sendo que 'te' é o tempo de operação de eletroforese.
16. 16. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações 1, 14 e 15 caracterizado pelo fato de que a etapa de calcular o tempo de operação de eletroforese mais eficiente para a série calculada de durações de pulsos é realizada de acordo com as seguintes etapas: i) especificar para esta etapa os termos (tpi, tp2, ..., tpn) da referida série de durações de pulsos ('tpr' para ’r'=l..n), e a quantidade 'n' de termos da referida série, ii) especificar para esta etapa o conjunto de migrações por pulsos ('drA') do menor fragmento de restrição de DNA; em que o conjunto de migrações por pulsos da referida molécula é definido para os pulsos da série (tpi, tp2,.., tpn) e o campo elétrico e temperatura selecionados; conjunto de migrações por pulsos que é calculado substituindo 'tr', 'vr' e 'vm' do menor fragmento de restrição de DNA na equação teórica conhecida que descreve ’d', iii) determinar um valor inicial para os números de pulsos ('Npr') que correspondem a todos os termos da série; sendo 1 o valor inicial recomendado para todos 'Npr' para V entre 1 e 'n', iv) incrementar em um o 'Npr' que acompanha cada termo ’tpr' (para todos tpr, Npr, e r = l..n), e calcular a migração 'D' da menor molécula para os termos 'n' da série; cálculo que é realizado como v) repetir etapa iv) até que o valor de 'D' indique que referida molécula atinge uma região do minigel que se encontra afastado de 0,1 a 1 cm do fundo do referido minigel hipotético; em seguida, terminar os incrementos de 'Npr', e selecionar os valores correntes de 'Npr' para avaliar a duração de operação mais eficiente, vi) tomar como o tempo de operação total aquele calculado como
17. 17. Processo para tipificação bacteriana rápida de acordo com as reivindicações Iedel4al6 caracterizado pelo fato de que a etapa de desenhar o esquema dos padrões de bandas transferindo a escala para um dado minigel baseia-se no cálculo das distâncias 'D' migradas por todos os fragmentos de DNA na série (rampa) mais eficiente de durações de pulsos e no tempo de operação de eletroforese mais eficiente; desenho que compreende etapas de: i) especificar para esta etapa o número de termos 'ri da série (rampa) de durações de pulsos, a duração de pulsos (tpr) de cada termo da série, e o número de pulsos (Npr) que acompanha cada ’tpr', para V entre 1 e 'ri, ii) especificar para esta etapa os conjuntos de migrações por pulsos (dri, dr2..) de todos os fragmentos de restrição de DNA (fi, f2..) das referidas espécies bacterianas; em que os referidos conjuntos de migrações por pulsos dos referidos fragmentos são definidos para os pulsos da série (tpi, tp2,.., tpn) e o campo elétrico e a temperatura selecionados; conjuntos de migrações por pulsos que são calculados substituindo 'tr', 'vr' e 'vm' de cada fragmento de restrição de DNA na referida equação teórica conhecida descrevendo 'd'; sendo ’dri', 'dr2' os conjuntos de migrações por pulsos de dois fragmentos diferentes, iii) calcular as distâncias que referidos fragmentos de DNA poderíam migrar no minigel hipotético, cálculo em que a distância 'D' migrada por cada fragmento no minigel é obtida como iv) desenhar um retângulo idêntico ao minigel real, e desenhar vários retângulos menores no interior do referido retângulo maior, esquema em que os retângulos menores representam as aberturas em que as amostras de DNA poderíam ser carregadas teoricamente, v) designar para cada fragmento uma cor única no esquema do padrão, cor que identificará referido fragmento e seu tamanho após a predição e desenho dos padrões de bandas; ou seja, utilizando um código de cores que identifica os tamanhos das moléculas que estão contidas hipoteticamente nas bandas desenhadas como linhas no esquema de separação, vi) desenhar as linhas coloridas abaixo de cada retângulo menor para representar as bandas hipotéticas formadas pelos fragmentos, em que cada linha encontra-se afastada do referido retângulo menor, ou abertura, pela distância 'D' que o fragmento correspondente migraria no minigel real.