CN105372318B

CN105372318B - 将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法

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Publication number: CN105372318B
Application number: CN201410433182.1A
Authority: CN
Inventors: 国前; 于金明; 廖湘鲁
Original assignee: SHANDONG TUMOR HOSPITAL
Current assignee: SHANDONG TUMOR HOSPITAL
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2034-08-28
Also published as: CN105372318A

Abstract

本发明公开了一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定1‑6秒钟，终止固定；将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X‑100 200μl进行细胞打孔5‑15分钟；将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液制成细胞悬液；恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定22‑26h。本发明采用了二次固定的方法，第一次固定时使用4％的多聚甲醛预固定1‑6秒钟，使细胞膜的表面蛋白质变性，利于后续的打孔，保证细胞在打孔的过程中不破裂；若不进行第二次固定，细胞在进行后续的检测过程中会出现破裂，保证检测结果的准确性。

Description

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法

技术领域

本发明涉及固定细胞的方法，具体地涉及一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法。

背景技术

细胞是生命体结构和生命活动的基本单元，研究细胞内分子间相互结合的作用对揭示生命规律，尤其是疾病的发生机制，具有十分重要的意义。

细胞原位电泳(cell in situ electrophoresis)，是将待检细胞制备成单细胞悬液，使其单个游离的细胞分散于等渗即应力平衡的介质中，在电场作用下，将细胞中的物质从细胞中分离出来的一种电泳方式。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的细胞进行计数和分析。

将细胞原位电泳与流式细胞分析术结合使用可以实现对细胞内蛋白质与核酸等物质结合状态的定量分析与分选。但目前尚未有一种能够适用于细胞原位电泳与流式细胞分析术结合配套的细胞固定方法，既可保持细胞的应力平衡、耐受细胞原位电泳过程，又可保证流式细胞术的样品处理与检测过程得以完成。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：

(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定1-6(优选3)秒钟，终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔5-15(优选10)分钟；

(3)将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液制成细胞悬液；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定22-26(优选24h)。

PBS的pH为7.4。

本发明产生的有益效果：

本发明采用了二次固定的方法，第一次固定时使用4％的多聚甲醛预固定1-6秒钟，使细胞在保持其既有应力结构以及细胞内待检蛋白非变性的状态下，经受细胞原位电泳过程，而不发生破碎，利于后续的打孔，保证细胞在打孔的过程中不破裂；若不进行第二次固定，细胞在进行后续的检测过程中会出现破裂，无法进行流式细胞分析术检测，通过二次固定保证检测结果的准确性。

附图说明

图1为细胞原位电泳装置主视图，其中1.电泳缓冲液池，2.滤膜，3.侧连接通道，4.细胞电泳槽；

图2为正常人胚肺成纤维细胞核大小影响SSB结合状态的检测图，其中2a显示RPA32、RPA70和POT1检测结果；2b和2c分别为HFLF在贴壁与胰蛋白酶消化悬浮状态的细胞核荧光染色图。

具体实施方式

实施例1

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定1秒钟，用PBS终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100进行细胞打孔5分钟；

(3)将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液(三羟甲基氨基甲烷Tris:25mM；甘氨酸Glycine:192mM；葡萄糖Glucose:43.2mM；pH8.3)制成细胞悬液；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定22h。

实施例2

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定6秒钟，终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔15分钟；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定24h。

实施例3

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定3秒钟，终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔10分钟；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定26h。

验证试验：

检测细胞内SSBs结合状态的固定方法：

如图1所示，所用的装置：包括细胞电泳槽4：该槽为一内径0.8cm、外径0.95cm、长度18cm的聚苯乙烯圆管。管壁中部，沿其纵轴方向开有一9×0.6cm的矩形槽口；电极缓冲液槽1：阳极、阴极各有一个；尺寸相同，10×3.5×5cm；材质：聚苯乙烯；侧连接通道3：阳极与阴极侧各有一个；尺寸相同，内径0.8cm，外径0.95cm,长10cm的硅胶管；滤膜2：阳极与阴极侧各有一个；尺寸相同，0.45μm亲水聚苯醚砜(Hydrophilic polyethersulfone)滤膜；电极：阳极与阴极各有一根；6cm长，直径0.5mm电泳仪用铂丝。

胰蛋白酶消化对培养的正常人胚肺成纤维细胞(HFLF)SSBs(检测3种，分别为：复制蛋白A32抗体：RPA32、复制蛋白A70：RPA70和端粒保护蛋白1：POT1)结合状态影响的检测：

(1)用常规0.25％胰蛋白酶消化法获取指数生长期的2×10⁷HFLF。

(2)细胞经磷酸盐缓冲液(PBS)离心漂洗一次，将弃上清的细胞团加入200μl PBS后分成两等分，分别滴加于两个3.5cm培养皿底部，用移液器吸头分别将两个培养皿底部的细胞悬液均匀地摊布于整个培养皿底部。

(3)将培养皿置于冰上，用254nm UV灯以1.84W/cm²强度照射，总剂量165.6J/cm²。

(4)分别用20ml PBS将两个培养皿中被照射的细胞冲洗收集于一个50ml的离心管中。

(5)收集的细胞经260g离心5分钟，弃上清后，加入4％的多聚甲醛200μl预固定3秒钟，加入46ml PBS终止固定。

(6)经260g离心5分钟弃上清后，加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔，时间10分钟，之后加入46ml PBS，470g离心5分钟，弃上清。

(7)细胞团加入936μl CISE缓冲液(三羟甲基氨基甲烷Tris:25mM；甘氨酸Glycine:192mM；葡萄糖Glucose:43.2mM；pH8.3)，并通过吹吸轻柔地将细胞分散悬浮。

(8)取500μl细胞悬液加入另一支50ml离心管作为CISE的对照，待后续的固定处理。其余细胞悬液被用作CISE样本。

(9)装配CISE装置，如见图1，并连接电泳电源。

(10)按图1所示加入CISE缓冲液。

(11)开启电源，设置为恒压模式，调整电压设置到500V并开始电泳运行。

(12)戴橡胶或塑料手套，穿绝缘底鞋具，保证人体与地面绝缘。用塑料把手移液器吸取126μl CISE样品，轻柔小心地贴近液面，在距阴极侧电泳槽开口1.5cm处滴入CISE缓冲液。

(13)样品滴入后立即开始计时，电泳时间3分钟。计时结束，中止电源。

(14)用移液器尽量吸净电泳槽中的液体，并将吸出液汇集于一50ml离心管中。

(15)用CISE缓冲液彻底冲洗电泳槽，吸净残留液，按步骤10标准重新将电泳槽注入CISE电泳缓冲液。

(16)重复步骤10)-15)，直至全部CISE样品被CISE处理完毕。若最后一轮CISE样品不足126μl，仍按前步骤操作。

(17)分别用CISE缓冲液补加CISE样品汇集管和CISE对照管的液量至50ml。

(18)将CISE样品和CISE对照以1275g转速离心5分钟，弃上清。

(19)分别将CISE样品和CISE对照加入0.3ml PBS，并轻柔地将细胞分散悬浮。

(20)分别将CISE样品和CISE对照用70％的乙醇15ml固定。

(21)固定24小时后，将CISE样品和CISE对照按常规方式行流式细胞术分析检测。流式细胞术分析CISE结果：

(1)将固定的CISE样品和CISE对照以1275g离心5分钟，弃上清。

(2)CISE样品管加入300μl PBS，混悬细胞，分成三等分，分别移入三个1.5mlEppendorf管，分别在每个Eppendorf管中加入1ml PBS，560g离心5分钟，弃上清。CISE对照管中加入400μl PBS，混悬细胞，分成四等分，分别移入四个1.5ml Eppendorf管，分别在每个Eppendorf管中加入1ml PBS，560g离心5分钟，弃上清。

(3)将所有Eppendorf管分别加入20μl PBS配制的3％牛血清白蛋白。

(4)将三个装有CISE样品的Eppendorf管分别标记并加入兔抗RPA32，SANTA CRUZ，终浓度按说明书推荐量实验确定)、兔抗RPA70(BETHYL，终浓度按说明书推荐量实验确定)和兔抗POT(abcam，终浓度按说明书推荐量实验确定)抗体。同样，将三个装有CISE对照的Eppendorf管分别标记并加入兔抗RPA32(SANTA CRUZ，浓度剂量与CISE样品管相同)、兔抗RPA70(BETHYL，浓度剂量与CISE样品管相同)和兔抗POT(abcam，浓度剂量与CISE样品管相同)抗体。另外，将第4个装有CISE对照的Eppendorf管加入3μPBS替代一抗用作抗体同型对照(注：经实验证实，用CISE处理的细胞和CISE对照的细胞用作抗体同型对照，结果无统计学差异，故采用CISE对照的细胞作抗体同型对照)。

(5)上述Eppendorf管室温孵育2小时。

(6)上述Eppendorf管分别加入1ml PBS，500g离心漂洗2次，弃上清。

(7)将所有Eppendorf管分别加入20μl PBS配制的3％牛血清白蛋白。

(8)将所有Eppendorf管分别加入2μl FITC标记的羊抗兔IgG二抗。室温、避光孵育30分钟。

(9)上述Eppendorf管分别加入1ml PBS，500g离心漂洗2次，弃上清。

(10)将所有Eppendorf管分别加入PI(碘化丙啶)染液(浓度50μg/ml，按常规DNA染液方法配制)0.5ml，置4℃避光1小时。

(11)行常规双参数FCM检测(本实施例所用流式细胞仪为FACSCalibur)。DDM模式用于排除细胞碎片和细胞聚集。每个检测样品获取80000个细胞。

(12)结果采用Flowjo软件分析，如图2所示，虚线为抗体同型对照，深色实线为CISE对照，浅色实线为CISE样品。图2a从左向右分别为RPA32、RPA70和POT1检测结果。如图2所示，CISE样品峰后沿较CISE对照峰后沿前移，说明由于细胞核的缩小，SSBs的结合状态发生改变，即SSBs出现解离。图2b为正常生长的HFLF细胞核荧光染色图，图2c为经过胰蛋白酶消化后的HFLF细胞核荧光染色图，2b、2c可以看出HFLF经过胰蛋白酶消化后，HFLF细胞核发生收缩。

Claims

1.一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取待检测的细胞团加入4%的多聚甲醛预固定1-6秒钟，终止固定；

（2）将预固定后的细胞团中加入0.2% Triton X-100 200μL进行细胞打孔5-15分钟；

（3）将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液制成细胞悬液；

（4）恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70%的乙醇固定，固定22-26h。

2.如权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述步骤（1）固定3 秒。

3.如权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述步骤（2）打孔时间为10 分钟。

4.如权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述步骤（3）中电泳缓冲液为三羟甲基氨基甲烷Tris: 25 mM; 甘氨酸Glycine: 192 mM; 葡萄糖Glucose: 43.2 mM；pH8.3。

5.如权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述步骤（4）中固定为24h。

6.如权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述步骤（3）中PBS 的pH 为7.4。