PT1350852E - Método para tipagem rápida de microrganismos e conjunto de reagentes utilizados - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA TIPAGEM RÁPIDA DE MICRORGANISMOS E CONJUNTO DE REAGENTES UTILIZADOS"

REFERENCIA A PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO A presente invenção está relacionada com biologia molecular. Em particular, é proporcionado um processo. O referido processo inclui a utilização de métodos e procedimentos, assim como de um estojo ("kit") de reagentes para tipagem rápida de microrganismos. Os microrganismos a serem tipados podem ser bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas. A tipagem dos microrganismos é efectuada por Electroforese em minigéis de campo pulsado realizada em mini-equipamentos de sistema CHEF ou TAFE.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Durante os últimos anos, as doenças infecciosas aumentaram e surgiram microrganismos multi-resistentes a fármacos (Acar J e Courvalein P pp 50-53; Aubry-Damon H e Andremot A, pp 54-55; Trieu-Cout P e Poyart C, pp 62-66, em 'La Recherche', vol 314, 1998).

Os surtos de doenças infecciosas criaram a necessidade de tipar os microrganismos causadores. A tipagem é o 4 ΡΕ1350852 processo pelo qual diferentes espécies de microrganismos de um determinado género são classificados em diferentes subgrupos ou subtipos (Busch U e Nitschko H, J Chromatogr B, 1999, 722: 263-278). A tipagem é importante, do ponto de vista epidemiológico, para o reconhecimento de surtos de infecção, determinação do modo de transmissão de patogénios nosocomiais em centrifugação de saúde e detecção das fontes das infecções. É também útil para a identificação de novas estirpes virulentas e monitorização de programas de vacinação. Um processo de tipagem é considerado adequado se preencher os critérios seguintes (Maslow J N et al., Clin Infect Dis, 1993, 17: 153-164): 1. Proporcionar resultados não ambíguos para cada isolado analisado. 2. Proporcionar resultados reprodutíveis. 3. Diferenciar estirpes não aparentadas dentro da espécie.

Existem vários métodos de tipagem de microrganismo. Alguns deles baseiam-se na análise de caracterís-ticas fenotípicas (métodos fenotípicos) e outros na análise de características genotípicas (métodos genotípicos). Os métodos fenotípicos detectam características expressas por microrganismos, enquanto que os genotípicos evidenciam as diferenças entre o DNA dos microrganismos. Deste modo, os métodos fenotípicos têm a desvantagem de proporcionar uma 5 ΡΕ1350852 medida indirecta das alterações no material genético. A referida desvantagem não ocorre com a utilização de métodos genotipicos.

Um dos métodos genotipicos de tipagem mais vastamente utilizado é Electroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) . Este método é considerado o padrão de ouro para a tipagem molecular de microrganismos. A tipagem por PEGE é realizada pela separação em géis de moléculas DNA que são submetidas à acção de pulsos eléctricos em duas direcções diferentes. Após a electroforese, os padrões de bandas produzidos por moléculas DNA de um isolado de microrganismo são altamente reprodutíveis e discriminatórios e caracterizam inequivocamente o seu DNA (Oliver DM e Bean P, J Clin Microbiol, 1999, 37(6): 1661-1669). Adicionalmente, os genomas completos de numerosos isolados podem ser comparados num único gel. Deste modo, a PFGE foi proposta como o método de tipagem óptimo (Maslow JN, Mulligan ME e Arbeit RD, Clin Infect Dis, 1993(17): 153-164; Busch U e Nitschko H, J Chromatogr B, 1999(722): 263-278). Os resultados obtidos por PFGE dependem das condições experimentais utilizadas na separação de DNA e do género e espécie do microrganismo em estudo. Deste modo, a) Se o microrganismo possui vários cromossomas lineares de tamanhos inferiores a 10 Mb (1 megabase = 1 000 000 pares de bases) é obtido o padrão de bandas produzido pelos seus cromossomas. O referido padrão de bandas é desi- 6 ΡΕ1350852 gnado "o cariótipo electroforético". Por exemplo, o microrganismo pode ser levedura, parasitas unicelulares, etc. b) Se o microrganismo possui um único cromossoma grande circular, é obtido o padrão de bandas produzido pelos macrofragmentos de restrição do referido DNA circular. Estes padrões são designados pulsotipos, uma vez que são obtidos em condições experimentais especificas. Por exemplo, o microrganismo pode ser uma bactéria, tal como, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, etc. A comparação dos cariótipos electroforéticos de diferentes estirpes permite a sua caracterização e diferenciação. O mesmo acontece com os fragmentos de restrição do DNA bacteriano. Deste modo, são utilizados ambos os cariótipos moleculares e os pulsotipos no estudo comparativo de fungos, bactérias e parasitas. A utilização por rotina de PFGE em microbiologia médica criou a necessidade de melhoramento dos métodos de preparação de amostras.

Criou também a necessidade de planear a priori as condições de corrida para separar de modo adequado as moléculas e para analisar os padrões de electroforese resultantes .

De um modo geral, o processo de tipagem de microrganismos por PFGE compreende os seguintes passos e procedimentos: 7 ΡΕ1350852 1) Preparação das amostras: crescer os microrganismos num meio nutritivo, encaixar as células em gel e obter moléculas intactas de DNA imobilizadas e despro-teinizadas. 2) Planeamento da corrida de electroforese: selecção das condições experimentais que devem ser definidas nos equipamentos de PFGE para obtenção de separação óptima entre as moléculas. 3) Carregar as amostras nos géis e efectuar Electroforese em Gel de Campo Pulsado para separar as moléculas DNA. 4) Analisar os padrões de bandas obtidos após a electroforese e comparar os resultados produzidos por diferentes isolados de microrganismos. São analisados os equipamentos e procedimentos utilizados actualmente na tipagem de microrganismos por PFGE.

Electroforese em Gel de Campo Pulsado A Electroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) data de 1984, quando Schwartz e Cantor (Cell, 37, 67-75, 1984; Pat. dos E.U.A. N° 4 473 452) observaram que aplicando pulsos eléctricos que alterassem periodicamente a sua orientação num determinado ângulo em relação ao gel de ΡΕ1350852 agarose, moléculas grandes intactas de DNA eram resolvidas como padrões de bandas.

Os autores determinaram também que as separações das moléculas dependem essencialmente na duração dos pulsos eléctricos. Posteriormente, o ângulo formado pelas linhas do campo de força, a intensidade do campo eléctrico, a temperatura experimental, a força iónica da solução tampão, a concentração do gel de agarose e a espessura dos rolhões de agarose, em que amostras são encaixadas, foram reconhecidos como os factores mais importantes que influenciam a resolução de moléculas de DNA. (Birren B. e Lai E. Pulse Field Gel ELectrophoresls: a practical guide. Academic Press. Nova Iorque, 1993, p 107, 111, 129, 131, 135; López-Cánovas L. et al., J. of Chromatogr. A, 1998, 806, 123-139; López-Cánovas L. et al., J. of Chromatogr. A, 1998, 806, 187-197).

Foram desenvolvidos diferentes sistemas para a realização de PFGE. Eles possuem compartimentos caracte-rísticos com eléctrodos colocados em disposições diferentes. Entre estes compartimentos estão as disposições de eléctrodos OFAGE (Electroforese de Campo Alternado Ortogonal, Carie C.F. e Olson M.V. Nucleic Acid Res. 1984, 12, 5647-5664) CHEF ("Electroforese de Campo Eléctrico Homogéneo de Contornos Limitados", Chu G. Science 234, 1986, 1582-1585), TAFE ("Electroforese de Campo Alternado Transversal", Pat. dos E.U.A. N° 4 740 283), FIGE ("Electroforese em Gel de Inverso de Campo", Pat. dos E.U.A. N° 4 9 ΡΕ1350852 737 251 de Carie G. F. e Olson Μ. V) , e os mini-compartimentos MiniTAFE e MiniCHEF (Riverón, A. M. et ai., Anal. Lettr 1995, 28, 1973-1991; Pedido de Patente Europeu EP 0 745 844, Bula. 1996/49; Pedido de Patente dos E.U.A. N° de Ser. 08/688,607, 1995; Patente Cubana RPI N° 02/95, 1995) .

Sistemas comummente utilizados para a tipagem de microrganismos por PFGE.

Os sistemas mais utilizados para a tipagem de microrganismos baseados na análise de DNA por PFGE são o CHEF e TAFE. Eles proporcionam padrões de bandas direitas em todas as pistas do gel, e deste modo, permitam a comparação dos resultados obtidos numa corrida única ou em diferentes corridas de electroforese.

Os eléctrodos do sistema CHEF são colocados numa disposição hexagonal à volta do gel e são-lhe ligadas as voltagens para garantir um campo eléctrico homogéneo em todo o gel. A criação de um campo eléctrico homogéneo em todo o compartimento permite obter bandas direitas e migrações reprodutíveis nas pistas do gel. Os eléctrodos de polaridades opostas estão separados 33,5 cm nos compartimentos CHEF. Utiliza géis submarinos que podem ter até 21 X 14 cm de largura e comprimento. Os géis são colocados horizontalmente (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electropho-resis System. Manual de Instruções e Guia de Aplicações. Números de Catálogo 170-3670 a 170-3673, BioRad, pp 11, 10 ΡΕ1350852 1995). Como mencionado, os sistemas CHEF têm sido extensivamente utilizados para a tipagem de microrganismos. Por exemplo, bactérias (Beverly, S, Anal Biochem, 1989, 177: 110-114; Dingwall A e Shapiro L, Proc Natl Acad Sei USA, 1989, 86: 119-123; Ferdows M S e Barbour A G, Proc Natl

Acad Sei USA, 1989, 86: 5960-5973; Kohara Y, Akiyma K e Isono K, Cell, 1987, 50: 495-508; Ohki M e Smith Cl, Nucleic Acid Res, 1989, 17: 3479-3490; Schoenline PV,

Gallman LM e Ely B, Gene, 1989, 70: 321-329; Ventra L e Weiss AS, Gene, 1989, 78: 29-36), Pseudomonas (Bautsch W, Grothues D e Tummler B, FEMS Microbiol Lett, 1988, 52: 255-258; Romling U e Tummler B, J Clin Microbiol, 2000, 38(1): 464-465), S. cerevisiae (Albig W e Entian KD, Gene, 1988, 73: 141-152; Zerva L et ai., J Clin Microbiol, 1996, 34(12): 3031-3034), E. histolytica (Petter R et al., Infect Immun, 1993, 61(8): 3574-3577), S. pneumoniae (McEllistrem MC et al., J Clin Microbiol, 2000, 38(1): 351-353), S. aureus (Wichelhaus TA et al., J Clin Microbiol, 1999, 37(3): 690-693), M. tuberculosis (Singh SP t al., J Clin

Microbiol, 1999, 37(6): 1927-1931), P. haemolytica (Kodjo A et al., J Clin Microbiol, 1999, 37(2): 380-385), etc.

Devido às grandes dimensões do compartimento CHEF, são necessárias grandes quantidades de solução tampão para cobrir a plataforma com os eléctrodos. Deste modo, a intensidade da corrente no compartimento pode atingir valores elevados, mesmo quando são aplicadas baixas intensidades de campo eléctricos. Assim sendo, experiências com CHEF requerem fontes de alimentação eléctrica com 11 ΡΕ1350852 débito de corrente elevado. Mais ainda, são produzidas grandes quantidades de calor nos compartimentos, impedindo a redução da duração da corrida devido ao aumento do campo eléctrico. Os compartimentos CHEF necessitam pelo menos de 20 horas de electroforese para separar cromossomas de Saccharomyces cerevisiae (moléculas mais pequenas do que 1,6 Mb. 1 Mb=106 pares de bases) no padrão caracteristico de 11 bandas, e para tipar diferentes estirpes desta levedura (Zerva L, et al., J Clin Microbiol, 1996, 34(12): 3031-3034). O compartimento CHEF leva muito tempo para a separação dos macrofragmentos de restrição de moléculas de DNA bacteriano, uma vez que são necessárias 20 ou mais horas (van Belkum A et al., J Clin Microbiol 1998, 36(6): 1653-1659; Marchadin H et al., Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(1): 213-216; Romling U e Tummler B, J Clin Microbiol, 2000, 38(1): 464-465). De modo semelhante, são necessários longos tempos de corrida para estudar parasitas, tal como, Entamoeba histolytica. Para separar os seus cromossomas são necessárias pelo menos 24 horas (Petter R et al., Infect Immun, 1993, 61(8): 3574-3577). A vantagem dos equipamentos CHEF actualmente utilizados é a possibilidade de analisar 40 amostras numa única corrida. Este formato de elevado rendimento de amostras facilita a análise comparativa dos padrões de electroforese produzidos por amostras de vários isolados. O sistema TAFE foi proposto por KJ Gardiner, W Laas e D Patterson no artigo publicado na Somatic Cell Mol 12 ΡΕ1350852

Genet, 1986(12): 185. Eles baptizaram inicialmente o sistema como "Electroforese Vertical em Campo Pulsado" (VPFE) e desenvolveram o equipamento que foi protegido pela Pat. dos E.U.A. N° 4 740 283 de 26 de Abril, 1988.

No sistema TAFE, são colocados paralelamente a ambas as faces do gel submarino dois pares de eléctrodos (10 X 7,6 X 0,64 cm, comprimento X largura X espessura), que são colocados verticalmente no compartimento. A referida disposição dos eléctrodos cria linhas do campo de força eléctrico que atravessam transversalmente o gel e obriga as moléculas a migrar através da espessura do gel durante cada pulso. No TAFE, as moléculas com tamanho homogéneo correm distâncias semelhantes e migram até à mesma altura no gel deixando rastos lineares, independentemente das posições dos poços (nos quais foram carregadas as amostras) no gel. Deste modo, este sistema é útil para a tipagem de microrganismos, uma vez que facilita a análise comparativa dos padrões de electroforese produzidos por amostras de vários isolados.

Baseado nestes princípios, a Beckman Instruments produziu o equipamento designado "Geneline I, ou Sistema de Electroforese de Campo Alternado Transverso" (Beckman, The Geneline System Instruction Manual, ed. Spinco Division of Beckman Instruments Inc., 1988), que também é conhecido como TAFE. Este sistema utiliza um gel (11 X 7,2 X 0,6 cm, comprimento X largura X espessura) em que podem ser 13 ΡΕ1350852 carregadas 20 amostras. No entanto, o TAFE também requer grandes quantidades de solução tampão (3,5 litros) e amostra biológica. O equipamento requer, pelo menos, 20 horas para separar os cromossomas de E. histolytica (Baez-Camargo M et al., Mol Gen Genet 1996, 253: 289-296). Deste modo, o TAFE partilha as desvantagens do CHEF na tipagem de microrganismos.

Em conclusão, os equipamentos comercialmente disponíveis mais frequentemente utilizados para caraterizar o genoma dos microrganismos e parasitas requerem um tempo de corrida longo, e grandes quantidades de reagentes e amostras biológicas para separar moléculas de DNA grandes no seu padrão de bandas.

O sistema FIGE tem sido utilizado para tipagem rápida de bactérias (Goering RV e Winters MA, J Clin Microbiol, 30(3): 577-580, 1992; Grothues D et al., J Clin Microbiol, 26(10): 1973-1977 1988). No entanto, foi documentada a inversão de mobilidade electroforética de DNA em experiências FIGE. A inversão de mobilidade do DNA impede a estimação correcta do tamanho e torna difícil a interpretação e comparação dos padrões produzidos por várias amostras. A impossibilidade de prever o momento de ocorrência de inversão de mobilidade do DNA é um dos problemas associados com o referido fenómeno (Birren B e Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, pp 10, Academic Press, Inc. São Diego, Calif. 1993). A 14 ΡΕ1350852 principal desvantagem da inversão de mobilidade é a impossibilidade de identificar de modo inequívoco as moléculas presentes numa determinada banda. Para tal, as bandas devem ser transferidas e hibridadas com sondas específicas. A hibridação aumenta de modo notável os preços do teste e o tempo necessário, assim sendo, o processo de tipagem será mais dispendioso e moroso.

As tentativas para reduzir o tempo de electroforese nos equipamentos actuais CHEF, tais como, GeneNavigator (Amersham-Pharmacia-LKB, Pharmacia Molecular e Cell Biology Catalogue, Pulsed Field Gel Electrophoresis, Nucleic Acids Electrophoresis. 1998, pp 77-79), CHEF DRII e CHEF Mapper (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Números de Catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad, pp 11, 1995) aumentando a voltagem aplicada aos eléctrodos, são praticamente impossíveis. É devido ao limite da saída da fonte de alimentação e do sistema de arrefecimento. Consequentemente, os fabricantes recomendam 9 V/cm como o campo eléctrico máximo a aplicar nos referidos equipamentos (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Números de Catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad, p 2, 1995). Assim sendo, a redução da duração da electroforese aumentando a intensidade do campo eléctrico não ocorre no sistema CHEF. OS equipamentos TAFE actuais têm problemas similares. 15 ΡΕ1350852

Miniequipamentos PFGE

Os equipamentos MiniPFGE, versões miniCHEF e miniTAFE, foram divulgados em 1995 (Riverón AM et al.r Anal. Lett., 1995, vol. 28, p 1973-1991; Pedido de Patente Europeia EP 0 745 844, Buli. 1996/49; Pedido de Patente dos E.U.A. N° de Ser. 08/688,607, 1995; Patente Cubana RPI 02/95, 1995). Os Miniequipamentos contornam a maioria das desvantagens mencionadas para os equipamentos PFGE. As experiências de electroforese de campo pulsado são realizadas em 4 a 6 horas num minigéis (4 X 4 X 0,5 cm; comprimento X largura X espessura) carregado com 7 amostras. Podem ser aplicadas intensidades de campo eléctrico até 16 V/cm no compartimento MiniCHEF de 11,6 cm entre os eléctrodos de polaridade oposta, proporcionando boa resolução dos padrões de bandas electroforéticos em 2,7 horas. A curta distância entre os eléctrodos de polaridades opostas permite a construção de pequenos compartimentos e a utilização de pequenas quantidades de volume de tampão para cobrir os eléctrodos. Aplicando uma determinada voltagem a compartimentos miniCHEF e CHEF (determinado valor de intensidade de campo eléctrico "E") o calor gerado no minicompartimento é sempre menos do que o calor gerado no CHEF comercialmente disponível (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973-1991).

Os equipamentos MiniTAFE permitem 22 V/cm, obtendo-se resolução entre as bandas (Riverón A M et al., 16 ΡΕ1350852

Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973-1991). O MiniTAFE permite a obtenção do cariótipo electroforético de S. cere-visiae em 5 horas. Os compartimentos MiniTAFE com separação pequena (7,8 cm) entre eléctrodos opostos são pequenos e utilizam pequenas quantidades de solução tampão. No entanto, se são carregadas amostras com espessura superior a 0,1 cm nos minigéis, são necessários tempos de corrida mais longos para se obter boa resolução dos padrões de electro-forese. De acordo com descrições anteriores, a espessura da amostra influencia o tempo de corrida da electroforese (López-Canovas et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp. 187-197) . À medida que a espessura das amostras aumenta, são necessários géis mais compridos para se obter os mesmos padrões de bandas. No entanto, os minigéis miniCHEF descritos permitem apenas 7 amostras, enquanto que o miniTAFE permite 13 amostras. Eles são formatos de baixa capacidade de análise de amostras para a tipagem de isolados de microrganismos em laboratórios clínicos.

Apesar dos equipamentos miniPFGE possuírem vantagens relativamente aos sistemas actualmente utilizados, nem o miniCHEF nem o MiniTAFE foram utilizados para a tipagem de microrganismos. Talvez isso obedeça à tentativa de se utilizar amostras de igual espessura às utilizadas em géis convencionais. Adicionalmente, não estão disponíveis procedimentos simples para a selecção de parâmetros de corrida para miniequipamento. 17 ΡΕ1350852

Preparação de DNA imobilizado É essencial um método para a preparação de moléculas intactas de DNA para a tipagem de microrganismos por PFGE em equipamentos ou miniequipamentos actuais. Os métodos previamente divulgados de isolamento e purificação de DNA em solução causam quebra das referidas moléculas (Schwartz DC e Cantor CR, Cell, 1984, 37, pp. 66-75).

Schwartz e Cantor propuseram uma metodologia para a preparação de amostras para PFGE e apenas excluíram as moléculas com tamanhos inferiores a 1 Mb (106 pares de bases). A metodologia consiste na colheita de células em cultura, lavagem das células e encaixando-as em rolhões de agarose. Nos passos posteriores, formam-se esferoblastos (no caso de existir parede celular) "ín situ" e são lisados nos referidos rolhões. Finalmente, as moléculas de DNA imobilizado são desproteinizadas utilizando proteinase K. O método tem sido eficaz para a preparação de amostras a partir de microrganismos de diferentes géneros, espécies e origens. No entanto, é necessária a formação de esferoblastos se os referidos microrganismos possuem parede celular, e as enzimas necessárias para a formação de esferoblastos, assim como as proteases, são caras. O procedimento descrito requer que as amostras fossem incubadas durante a noite duas vezes, o que significa 32 horas para a preparação de amostras (Pat. dos E.U.A. N° 4 473 452, 25 de Set., 1984). 18 ΡΕ1350852

Mais recentemente, Gardner (Gardner DCJ et al., Yeast, 1993, 9, 1053-1055) obteve padrões de bandas de cromossomas de S. cerevisiae a partir de células que não formaram esferoblastos. Paralelamente, Higginson et al (Higginson D. et al., Anal. Lett., 1994, 27: 7, 1255-1264) demonstraram que o DNA de S. cerevisiae pode ser despro-teinizado utilizando ureia a 8 M em vez de proteinase K. No entanto, o método descrito por Gardner continua a ser dispendioso, porque ele utilizou proteases para desprotei-nizar o DNA, enquanto que, o método descrito por Higginson é barato, mas consome 72 horas em incubação, o que é muito tempo. Posteriormente foram preparadas amostras de S. cerevisiae e não foram utilizadas enzimas: os rolhões foram incubados sequencialmente com LETK (Tris a 10 mM, EDTA a 500 mM, KC1 a 600 mM, pH 7,5) durante 4 horas, NDS (Tris a 10 mM, EDTA a 500 mM, sarcosil a 1%, pH 9,5) durante 2 horas, e NDS mais ureia a 4 M (NDSU) durante 2 horas. Este método necessita de 10 horas para a preparação de amostras (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29: 12, 2079-2084) . Foram também descritos métodos rápidos para a preparação de DNA imobilizado, mas eles utilizam enzimas (por exemplo, em Guidet F e Langridge P, Bíotech, 1992, 12: 2, 222-223).

Regra geral, o DNA imobilizado para experiências com PFGE requer a formação de esferoblastos e desprotei-nização do DNA utilizando proteases. Estes requisitos são independentes do tipo celular estudado (bactérias, levedura, etc.) (Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9: 107-126; 19 ΡΕ1350852

Olive DM e Bean P, J. Clin. Microbiol, 1996, 37: 6, 1661-1669) . Por exemplo, foi relatada a preparação de DNA imobilizado de Staphilococcus aureus em 2 horas imobilizando células com lisostafina e incubação dos rolhões com detergentes, enquanto que as células de Streptococcus fecalis precisaram de ser incubadas com lisozima e mutanolisina antes da imobilização (Goering RV. e Winter MA., J. Clin. Microbiol, 1992, 30: 3, 577-580). No referido trabalho, os autores não incubaram as amostras com proteinase K. No entanto, Matushek et al. (Matushek MG et ai., J. Clin. Microbiol, 1996, 34: 10, 2598-2600) relataram que foram incapazes de obter os padrões de bandas se as amostras não fossem incubadas com proteinase k. Como alternativa, eles propuseram um método rápido para a preparação de amostras de DNA imobilizado utilizando proteinase K. Recentemente, McEllistrem et al. (McEllistrem MC et al., J. Clin. Microbiol, 2000, 38: 1, 351-353) divulgaram um método completamente não-enzimático para a preparação de DNA imobilizado de Streptococcus pneumoniae. No entanto, leva 6 horas e os autores atribuem o sucesso do protocolo à acti-vação de uma autolisina do Streptococcus. No presente, as enzimas de formação de esferoplastos e as proteases foram apenas eliminadas dos protocolos de preparação de moléculas intactas de DNA de S. cerevisiae e Streptococcus pneumoniae, mas os tempos necessários para completar estas preparações são, respectivamente, 10 e 6 horas, o que são tempos longos. Não existe consenso sobre a prática de eliminar as enzimas de formação de protoplastos e proteinase K na preparação de amostras de microrganismos. Assim 20 ΡΕ1350852 sendo, os métodos correntes são dispendiosos e levam muito tempo. A maioria dos métodos acima referidos assentam no princípio de que os microrganismos com parede celular têm de ser imobilizados antes do tratamento enzimático. É apresentada uma excepção no artigo publicado por Goering e Winter (Goering RV e Winter MA, J. Clin. Microbiol, 1992, 30: 3, 577-580). Os autores prepraram uma suspensão de células numa solução contendo lisozima e mutanolisina (duas enzimas para a formação de esferoplastos) antes da sua imobilização. No entanto, ainda não foi apresentado um método geral não-enzimático para tratar microrganismos com parede celular antes do seu encaixe em géis de agarose. Tal método seria mais barato e mais simples do que os protocolos correntes para a preparação de amostras.

Foram divulgados métodos para o isolamento de ácidos nucleicos em solução, partindo de células aquecidas na presença de agentes que provocam a permeabilidade da parede celular do microrganismo (Patente Europeia 0 657 530, 1994, boletim 95/24; Pat. dos E.U.A. N° 158 940, 1993). O método liberta fragmentos grandes de ácidos nucleicos não degradados de microrganismos sem perturbar fisicamente a parede celular. Este método não requer enzimas líticas. No entanto, não são obtidas moléculas intactas de DNA, porque o DNA é isolado em solução; e os autores não propuseram o método para se obterem os cariótipos moleculares ou os pulsotipos dos referidos 21 ΡΕ1350852 microrganismos. Os autores relataram que o DNA obtido é adequado para hibridação, mas eles não se debruçaram sobre a possibilidade de restrição de DNA com endonucleases. Em conclusão, o referido método não garante a obtenção de moléculas intactas de DNA, enquanto que as possibilidade de as digerir com enzimas de restrição permanece desconhecida.

Assim sendo, não foi ainda proposto um procedimento para a preparação de DNA intacto imobilizado de levedura, bactérias gram-positivas e gram-negativas e parasitas por métodos não-enzimáticos em tempos curtos. A preparação de amostras de DNA imobilização necessita de moldes para a formação das referidas amostras. Estes moldes podem ser reutilizáveis ou descartáveis. Os moldes reutilizáveis devem permitir esterilização.

Isto é importante para o manuseamento de amostras de microrganismos patogénicos. A utilização de moldes descartáveis requer um abastecimento contínuo, o que pode ser um factor limitante em laboratórios com um orçamento baixo.

Os moldes conhecidos são os seguintes: a) Moldes que formam rolhões independentes e similares (Pat. dos E.U.A. 4 473 452, 25 de Set., 1984;

Pat. dos E.U.A. 4 861 448, 29 de Ago. de 1989); 22 ΡΕ1350852 b) Moldes que formam longas fitas, que são cortadas para formar rolhões independentes (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29: 12, 2079 — 2084); c) Moldes que formam "talharins" quadrados longos ou cilindros de agarose longos, que são cortados para formar rolhões independentes (Birren B e Lai E. Pulsed Fíeld Electrophoresis: a practical gulde, Academic Press, Inc. São Diego, Calif., 1993, pp 29-30).

De um modo geral, as amostras de dimensões maiores do que o poço do gel são produzidas nos referidos moldes. Por esta razão, para se obterem rolhões com dimensões similares às dos poços, as fitas, talharim, etc., necessitam de ser cortadas com uma lâmina ou outro instrumento. (CHEF Mapper XA Pulsed Fíeld Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide pp 40, Secção 7. Números de Catálogos 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad. 1995) . No entanto, cortar as fitas ou talharins produz rolhões de tamanhos e dimensões não-homogéneos, o que influencia a qualidade dos padrões de electroforese. A separação de moléculas de DNA no gel depende da espessura da amostra. Consequentemente, a comparação dos padrões obtidos em diferentes pistas do gel é difícil. As dificuldades nas comparações dos padrões de bandas representam uma desvantagem na tipagem de microrganismos.

Foi divulgado um molde para encaixar células em 23 ΡΕ1350852 géis de agarose e tratar rolhões na Pat. dos E.U.A. N° 5 457 050, 10 de Out. de 1995. O molde pode ser descartável ou reutilizável, dependendo do material utilizado para o fabricar. É reclamado que a facilidade do molde é que as amostras são formadas e tratadas dentro do referido molde. No entanto, é uma desvantagem: se os rolhões são mantidos dentro do molde durante a incubação, o tempo necessário para se obterem as amostras adequadas para análise por PFGE é notoriamente aumentado. As moléculas efectoras das soluções de lise e desproteinização dificilmente chegam às moléculas alvo dentro das células, porque a área de contacto entre os rolhões e as soluções de incubação é reduzida pelo menos a metade.

Os moldes que formam rolhões independentes e similares divulgados na Patente dos E.U.A. 4 473 452, 25 de Set. de 1984 e na Patente dos E.U.A. 4 861 448, 29 de Ago. de 1989 consistem em duas partes de material sólido mantidas juntas por parafusos. A principal desvantagem dos referidos moldes é que eles têm de ser montados antes e desmontados depois de serem utilizados: consequentemente, a remoção dos rolhões de agarose é uma tarefa laboriosa.

Os moldes que formam fitas longas, que são cortadas para formar rolhões independentes (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29: 12, 2079-2084) são feitos de material acrílico e não podem consequentemente ser autoclavados. Isto constitui uma séria desvantagem quando 24 ΡΕ1350852 as amostras são preparadas a partir de microrganismos patogénicos.

Em conclusão, ainda não foram descritos ou divulgados moldes que possam ser facilmente montados e desmontados para moldar mini-rolhões independentes e de tamanho homogéneo, e que também sejam reutilizáveis após o processo de esterilização em autoclave.

Selecção das condições experimentais para PFGE A selecção das condições experimentais é complexa. Foram relatados métodos para seleccionar as condições de corrida para.

Por exemplo, o CHEF Mapper da Bio-Rad possui uma opção de auto-algoritmo e outra de algoritmo interactivo (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. pp 31-40 Números de Catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad. 1995). Ambas as opções permitem calcular os tempos de pulso, as durações das rampas de pulso, ângulo de reorientação, campo eléctrico e tempo de corrida óptimo para separar moléculas de DNA de uma determinada amostra. Ao contrário do auto-algoritmo, em que são assumidas condições experimentais fixas, o tipo, temperatura e concentração do tampão, e o tipo e concentração de agarose podem variar como entradas no algoritmo interactivo. Ambos os algoritmos funcionam com base em dados empíricos e teóricos recolhidos durante 5 25 ΡΕ1350852 anos de experiências (Bio-Rad Catalogue. Life Science Research Products. Bio-Rad Laboratories, pp 185. 1998/99). No entanto, os fabricantes recomendaram introduzir no auto-algoritmo tamanhos de DNA mais pequenos e maiores do que os tamanhos esperados das moléculas da amostra. Adicionalmente, se forem introduzidos no auto-algoritmo gamas de tamanhos extremamente grandes, assim como no programa interactivo, podem ser produzidos resultados erróneos, tal como, inversão de bandas na zona centrifugação do gel.

Foi proposta outra expressão empírica para dar a duração do pulso eléctrico que separa o grupo de moléculas com tamanhos entre um determinado valor e um valor superior designado RSL (Limite de Tamanho da Resolução) (Smith DR. Methods I, 1990, 195-203) . No entanto, a referida expressão é válida apenas em condições experimentais específicas, e não prediz a resolução entre quaisquer duas moléculas. Foi proposta outra função. Fornece as condições aproximadas de campo eléctrico e pulso tempo necessárias para separar um determinado grupo de moléculas (Gunderson K e Chu G, Mol. Cell. Biol., 1991, 11: 3348-3354). No entanto, a referida função apenas permite obter estimativas grosseiras das duas variáveis mencionadas, e não fornece as migrações das moléculas em nenhuma condição experimental.

Apesar da realização de vários estudos teóricos sobre a reorientação de moléculas de DNA durante a PFGE (Noolandi J, Adv. Electrophoresis, 1992, 5: 1-57; Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9: 107-126), os referidos estudos ainda 26 ΡΕ1350852 não produziram um resultado prático e útil nos laboratórios. Eles não produziram métodos que permitam ao utilizador de PFGE seleccionar e fixar as condições experimentais necessárias para separar as moléculas em análise.

As equações propostas por López-Cánovas et al. (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806: 123-139) para descrever a migração de DNA em PFGE, não foram utilizadas para prever os padrões de bandas que se devem obter quando os tempos de rampa do pulso, o campo eléctrico, a temperatura e o tempo de corrida variam. Estas variáveis são geralmente modificadas na tipagem de microrganismos.

Análise do Padrão de bandas de PFGE

Estão disponíveis sistemas computorizados para a aquisição de dados de imagens a partir de géis de PFGE para análise do padrão de bandas (Gerner-Smidt P et al., J. Clin. Microbiol, 1998, 37(3): 876-877; Tenover F et al., J. Clin. Microbiol, 1995, 33(9): 2233-2239; van Belkum A et al., J. Clin. Microbiol, 1998, 36(6): 1653-1659). No entanto, a comparação dos padrões de restrição contém a ser um processo subjectivo, e não pode ser completamente reduzido a rígidos algoritmos (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol, 1995, 33(9): 2233-2239). Apesar da realização de análises computacionais, a interpretação final dos padrões deve ser submetida a inspecção visual prévia. 27 ΡΕ1350852 A análise automática e não-automática de padrões de bandas tem como resultado o número de bandas e os tamanhos das moléculas nas bandas. É normalmente realizada comparando migrações de DNA desconhecido com migrações de marcadores de peso molecular. No entanto, a PFGE é relativamente recente, e nem sempre estão disponíveis marcadores de tamanho para gamas grandes de tamanhos de DNA. Consequentemente, os critérios utilizados para tipagem de bactérias, baseados na interpretação de padrões de bandas de PFGE, consiste na determinação do número de diferentes fragmentos de restrição encontrados aquando da digestão do DNA dos microrganismos a serem comparados.

Foram propostas equações para descrever as migrações de moléculas de DNA sob uma única rampa de pulsos, diferentes intensidades de campo eléctrico e distintas temperaturas a partir de dados de electroforese recolhidos em experiências efectuadas em agarose a 1,5%, Lachema e TBE a 0,5 X, TBE a 1 X: Tris a 89 mM, Ácido Bórico a 89 mM, EDTA a 2 mM (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806: 123-139). No entanto, não existe um método para estender e aplicar as referidas equações à análise de padrões de bandas após a aplicação de rampas de tempo de pulso. A aplicação de rampas de tempo de pulso é geralmente efectuada no estudo comparativo de microrganismos. 28 ΡΕ1350852

Processo actuais para a tipagem de microrganismos por PFGE. O processo completo para a tipagem de microrganismos requer muito tempo e muitos recursos. A electro-forese requer cerca de 20 horas, os métodos de preparação das amostras, recomendados pelos fabricantes ou relatados na literatura, requerem a utilização de grandes quantidades de enzimas (Por exemplo, 80 mg/mL de proteinase k) e longos periodos de incubação (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Aplicação Guide. pp 40-43 Números de Catálogo 170-3670 a 170-3673. Bio-Rad. 1995) . Um factor limitante à utilização da PFGE para a tipagem de microrganismos é o tempo necessário para completar a análise dos isolados, entre 2 a 3 dias, deste modo reduzindo a capacidade dos laboratórios para analisar muitas amostras (Olive DM e Bean P, J. Clin. Microbiol, 1999, 37: 6, 1661-1669) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um processo e um estojo ("kit") de reagentes para tipagem de isolados de microrganismos num único dia (entre 7 e 13 horas). A tipagem é efectuada pela obtenção dos padrões de bandas típicos produzido pela separação de moléculas de DNA sujeitas a Electroforese em Gel de Campo Pulsado em miniequipamentos. Especificamente: 29 ΡΕ1350852 i) É aqui proporcionado um método e o estojo ("kit") de reagentes associado para a preparação, no máximo em 60 minutos, de amostras de DNA intacto encaixado em mini-rolhões de um gel. O método é baseado no tratamento das células com soluções que não possuem enzimas líticas. O referido tratamento pode ser realizado antes ou depois de encaixar tais células no gel. As células podem ser bactérias gram-positivas e gram-negativas. As células são encaixadas por intermédio de um molde feito de um material flexivel que não pode ser esterilizado. Gera mini-rolhões de tamanhos homogéneos. A espessura do mini-rolhão varia entre 0,03 a 0,1 cm dependendo das dimensões do molde utilizado. ii) São proporcionados métodos preditivos para as migrações de DNA linear. Os métodos são baseados em equações teóricas que permitem o cálculo das migrações de moléculas de DNA linear em quaisquer condições de campo eléctrico, temperatura, duração das rampas de pulso e duração de electroforese no sistema CHEF. Estes métodos permitem seleccionar as condições óptimas de electroforese a serem aplicadas aos géis e proporcionam uma representação gráfica das distâncias migradas por DNA linear. iii) São aqui proporcionados Processos para a separação e análise de moléculas de DNA de microrganismos. As separações são efectuadas em miniequipamentos para Electroforese em Gel de Campo Pulsado. Os miniequipamentos miniCHEF produzem os padrões de bandas em 2,5 a 5 horas e o 30 ΡΕ1350852

MiniTAFE em 5 a 7 horas. O processo permite estudar até 27 amostras de DNA imobilizado de microrganismos. As referidas amostras são: a) preparadas como no item i) ; b) separadas nos minigéis de miniequipamentos com as condições óptimas de electroforese, condições seleccionadas com a ajuda dos métodos preditivos. O método de preparação de amostras proporcionado nesta invenção demora no máximo 60 minutos, e é simples e barato. Não requer enzimas liticas nem proteases nas soluções para incubação de células de microrganismo e produz DNA imobilizado intacto. As moléculas intactas de DNA podem ser digeridas com enzimas de restrição e quando são sujeitas a Electroforese em Gel de Campo Pulsado, as moléculas intactas de DNA ou os seus fragmentos de restrição migram nos minigéis formando padrões de bandas que correspondem aos cariótipos moleculares ou pulsotipos dos microrganismos. O método é baseado na modificação química da parede bacteriana para permitir a lise dos microrganismos, ou a difusão de pequenas moléculas efectoras em direcção às moléculas alvo nas células. São também eliminados componentes intracelulares indesejáveis durante a preparação por diálise. Como resultado, são obtidas moléculas intactas de DNA nos mini-rolhões em que as células foram encaixadas. O método compreende os seguintes passos gerais: 31 ΡΕ1350852 1) As células dos microrganismos são inicialmente isoladas dos fluidos de pessoas hospitalizadas, ou de uma colecção biotecnológica ou a partir das experiências realizadas num laboratório comum de molecular biologia, genética ou outro. 2) As células são crescidas em meio liquido ou num meio sólido com a composição adequada para cada microrganismo . 3) As células são recolhidas por centrifugação e depois lavadas. 4) As células são a) encaixadas no gel e incubadas com as soluções não-enzimáticas, ou b) incubadas com as referidas solução (ões) e depois encaixadas em gel. No caso de "a", os mini-rolhões contém células imobilizadas são primeiro incubados em solução não-enzimática durante 5 a 30 minutos a 50°C. No caso de "b", as células são incubadas com a solução não-enzimática durante 5 a 30 minutos a 50°C e posteriormente são encaixadas nos mini-rolhões de agarose. 5) Os mini-rolhões que contém as células são submetidos a diálise contra o tampão de electroforese, se se for efectuar uma electroforese; ou contra o tampão de conservação, se os mini-rolhões são para ser armazenados; ou contra o tampão da endonuclease de restrição, se as moléculas de DNA são para ser digeridas. 32 ΡΕ1350852

Staphylococcus âureus pode ser incubado em soluções não-enzimáticas antes da imobilização, enquanto que Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli devem ser primeiro imobilizados e depois incubados nas soluções não-enzimáticas. As soluções de lavagem de células mais eficazes são apresentadas na Tabela I. TABELA I. As soluções de lavagem de células mais eficazes para a preparação de DNA imobilizado.

Microrganismos recolhidos Composição da solução de lavagem Pseudomonas aeruginosa NaCl a 0,15 M Staphylococcus aureus, Escherichia coli NaCl a 0,15 M, EDTA a 0,01 M, pH 8,0

As soluções não-enzimáticas para incubar as células, ou os mini-rolhões que contêm células, possuem detergentes aniónicos, um agente quelante de metais, um agente com a capacidade de competir na formação de ligações de hidrogénio e tampão Tris. A mais eficaz contém: sarcosil a 1%, EDTA a 0,1 M, base Tris a 0,01 M, Ureia a 4 M e o seu pH é 9,5 (NDSU) . Para a incubação de células de bactérias gram-positivas e gram-negativas é adicionado Nonidet P-40 (NDSUPlus) .

Alguns microrganismos, e. g. Escherichia coli, devem primeiro ser incubados durante 10 minutos a 37 °C numa solução de lise não-enzimática. Contém sarcosil a 1%, Nonidet P-40 a 1%, EDTA a 0,1 M, base Tris a 0,01 M, e o 33 ΡΕ1350852 seu pH é 8,0. Adicionalmente, são incubados durante meia hora na solução NDSUPlus. O tampão de armazenamento dos mini-rolhões contém DNA imobilizado é TE-100 (base Tris a 0,01M, EDTA a 0,1 M, pH 8,0). O procedimento para encaixar células em mini-rolhões de agarose consiste na utilização de um molde feito de material flexível que pode ser esterilizado. O molde é uma lâmina de silicone, borracha ou outro material flexível no máximo com 0,5 cm de largura (ver nos Exemplos, exemplo 1) . São gravadas na lâmina várias depressões quadradas. A depressão pode ter até 0,3 cm de largura e 0,03 a 0,1 cm de profundidade. Para se verter a suspensão células-agarose, o molde é pré-aquecido a 42 °C colocando-o numa superfície aquecida e essa temperatura, seguidamente a suspensão é despejada no molde, e é distribuída uniformemente nas depressões com a ajuda de uma espátula. Seguidamente, o molde é coberto com uma tampa (pode ser feita de vidro, acrílico, plástico ou qualquer outro material) e incubado entre 4-15 °C até os mini-rolhões ficarem duros. Os mini-rolhões de tamanhos homogéneos são extraídos do molde flexível segurando de lado e dobrando o molde dentro de um recipiente que contém a solução não enzimática para o tratamento do mini-rolhão. A suspensão é preparada de tal modo que são encaixadas 0,12 a 3 X 108 células bacterianas por cada mini-rolhão de dimensão 0,3 X 0,07 cm. Todos os microrganismos mencionados podem ser preparados utilizando 34 ΡΕ1350852 este tipo de molde. No geral, este tipo de molde pode ser utilizado para a preparação de mini-rolhões que contêm qual outro tipo de células.

Na presente invenção, o método para seleccionar as condições óptimas de electroforese a serem aplicadas nos miniequipamentos é baseado no cálculo das migrações de moléculas de DNA linear. O cálculo é realizado utilizando um conjunto de equações teóricas conhecidas que descrevem a migração, os tempos de reorientação e as velocidades de migração de moléculas de DNA linear nos minigéis de miniCHEF. Nas equações introduzem-se os valores de campo eléctrico e temperatura e que devem estar compreendidos, respectivamente, entre 1-20 V/cm e 4-30 °C. Para se aplicarem as equações, assume-se que a electroforese é realizada em agarose a 1,5% e o tampão de electroforese deve ser Tris a 44,5 mM, Ácido bórico a 44,5 mM, EDTA a 1 mM, pH 8,3 (TBE a 0,5 X). As equações teóricas que descrevem a migração DNA são as seguintes: n O-« X {Vf tpf rr(tprtf) Npr * vm {tprtrlt-r^rtr}] Np# J E<j. 1 vr « O,O0O7[QS 1,45/{8πηΙ5 35}] 2 vm: * 0.865CQE 1'w/<&snL Eq. 3 ír» 0,134 (L^/vr)^ lq,4 r,(íprtf) - 1 íf (tprír) á Õ and Γ^ίρΗΟ = Õ If (iprlt) > 0 Eq. 5 35 ΡΕ1350852 em que: tr: tempo de reorientação (s), vr: velocidade de migração durante a reorientação (cm/s), vm: velocidade de migração após reorientação (cm/s), Q: le“ X pb (carga liquida do DNA, e“: carga do electrão em statcoulomb), L: 0,34 nm X pb (comprimento do contorno do DNA em cm), E: intensidade do campo eléctrico em statvolts/cm, η: viscosidade da solução tampão em Poises, e η foi calculado por interpolação das temperaturas experimentais (°C.) numa função polinomial que relaciona a viscosidade da água com a temperatura. D: migração total de uma molécula de DNA no minigel de CHEF (cm), d: migração por pulso (cm), n: número de rampas de tempo de pulso.

Npr: número de pulsos na rampa "r", 36 ΡΕ1350852 tpr: duração do pulso na rampa "r" (s), O método para seleccionar as condições óptimas de electroforese inclui os seguintes passos: I. Cálculo da duração dos pulsos (tpr) que serão utilizados nas rampas. Para a sua realização: 1) São introduzidos neste passo os tempos de reo-rientação ("tr") das moléculas mais pequenas e maiores de DNA linear a serem analisadas, valores de "tr" que foram obtidos substituindo os tamanhos de DNA de tais moléculas, campo eléctrico e temperatura do tampão d electroforese nas equações 4. 2) A média de ambos os tempos de reorientaçâo (um único tPr, ou tpi) é calculado se se desejarem incluir num único padrão moléculas de DNA de tamanhos compreendidos entre a molécula maior e a mais pequena. 3) É calculada uma sequência numérica de durações de pulso (tpr) . Começa com uma duração de pulso que é 1,5 vezes inferior ao tempo de reorientaçâo da molécula mais pequena, e termina com 1,5 vezes maior do que o tempo de reorientaçâo da maior molécula. São utilizados incrementos lineares na duração de pulso na sequência numérica do tpr calculado. 37 ΡΕ1350852 4) Para se realizar a electroforese pode ser utilizado o tp calculado no passo (2) , de outro modo, é utilizada a sequência numérica de tpr, calculada no passo (3) . II. Cálculo do tempo total de corrida. O tempo total de corrida de electroforese é estimado com base no cálculo da migração da molécula de DNA linear mais pequena. Isto é realizado de acordo com o seguinte: 1) Especificar neste passo o tempo de reorientação e as velocidades de migração durante e após reorientação das molécula de DNA linear mais pequenas, valores que foram obtidos substituindo o tamanho do DNA de tais moléculas, campo eléctrico e temperatura do tampão de electroforese nas equações 2-3. As durações dos pulsos eléctricos (tpr) estimadas no passo I são introduzidas na Equação 1. Os valores iniciais do número de pulsos são fixos. 2) O número de pulsos de cada rampa "r" é aumentado um a um, e cada vez que a migração da molécula mais pequena é estimada por meio da utilização das equações 1 e 5. As iterações são repetidas até que a molécula atinge a posição que dista entre 0,1 a 1 cm do fim do minigel. III. Por intermédio da utilização das equações 1-5, as 38 ΡΕ1350852 migrações das moléculas, que se desejam separar, são calculadas durante as "n" rampas, e seguidamente, os padrões de bandas produzidos por estas moléculas nos minigéis de miniCHEF são previstos para as condições seleccionadas para o campo eléctrico, temperatura, número de rampas "r", duração dos pulsos eléctricos e número de pulsos (Npr). Este cálculo inclui os seguintes passos: 1) É assumido que a electroforese é realizada em gel de agarose a 1,5% e tampão TBE a 0,5 X. 2) Os dados de "tr", "vr", e "vm" das moléculas a serem analisadas são introduzidos neste passo, conjunto de valores que foram obtidos definindo, nas equações 2-3, os tamanhos das moléculas de DNA e o campo eléctrico e temperatura do tampão (que serão utilizados em experiências reais). 3) De acordo com os valores estimados nos anteriores passos, o número total de rampas (η), o número de pulsos que serão aplicados em cada rampa (Npr) e a duração dos pulsos em cada rampa (tpr) são definidos para a equação 1. 4) Utilizando as equações 1-5, são calculadas as distâncias que devem migrar as moléculas de DNA (que se desejam analisar) para as condições especificas de electroforese. 39 ΡΕ1350852 5) As migrações, calculadas para as moléculas de DNA linear, são apresentadas num formato numérico ou gráfico. 6) Os passos 2-5 são repetidos até que o padrão previsto apresenta a separação óptima entre as moléculas de DNA linear. IV. Com base nos resultados acima mencionados, é seleccionada a condição experimental que originou a separação óptima entre as moléculas de DNA linear. O meio preferido de implantação deste método poderia ser um programa de computador que facilitaria a simulação da separação das moléculas de DNA de diferentes tamanhos no miniCHEF. Este programa calcularia as condições experimentais óptimas para separações de DNA. O programa proporcionaria também um meio rápido para realizar os cálculos necessários para a implementação desta parte da presente invenção.

Foi desenvolvido um programa para simular o padrão de bandas. O programa permite ao utilizador mudar as seguintes variáveis: 1- 0 tamanho dos fragmentos de DNA ou das moléculas intactas de DNA que se desejam separar no gel. 40 ΡΕ1350852 2- A temperatura do tampão. 3- A voltagem. 4- O tempo de pulso e o número de pulsos eléctricos aplicados em cada rampa. 5- O número de rampas de tempo de pulso. É compreendido entre 1 e 1 000 rampas.

Alimentado com os valores mencionados, o programa produz os seguintes resultados: 1- Velocidades de moléculas de DNA (em cm/s) durante e após a reorientação do DNA. 2- O tempo de reorientação de cada molécula de DNA (em segundos). 3- A migração de cada molécula no gel durante a duração de corrida seleccionada. 4- A migração de cada molécula e o esquema do padrão de electroforese. A representação gráfica das distâncias que as moléculas de DNA linear devem migrar com as condições de electroforese especificadas é efectuada como se segue: 41 ΡΕ1350852 i) Desenhar um minigel com as mesmas dimensões do minigel verdadeiro, e desenhar os poços em que as amostras são hipoteticamente carregadas. ii) Colocar linhas debaixo de cada poço. Elas representarão as bandas formadas pelas moléculas de DNA de diferentes tamanhos após a separação. Cada linha tem a largura do poço. Estas linhas são desenhadas a uma distância dos poços correspondente às distâncias que as moléculas de DNA migrariam no minigel verdadeiro. iii) Atribuir uma cor a cada linha, ou banda hipotética. A cor varia com o tamanho das moléculas que a banda contém. Isto é, utilizando um código de cores que identifique as moléculas de um determinado tamanho.

Este programa constitui um método para selec-cionar as condições experimentais adequadas para separar moléculas de DNA de tamanho cromossómico intactas ou fragmentos grandes de DNA por Electroforese em Gel de Campo Pulsado no miniCHEF. Se no programa são introduzidos valores distintos das variáveis experimentais, são obtidos diferentes padrões de electroforese, permitindo deste modo a identificação das condições experimentais que deverão separar as moléculas de interesse no CHEF e miniCHEF. Esta abordagem não gasta reagentes ou amostras biológicas. É baseada nas equações teóricas que descrevem a migração de DNA linear no miniCHEF. As referidas equações foram 42 ΡΕ1350852 ajustadas utilizando dados de migração de DNA linear, obtidos em experiências miniCHEF reais. Assim sendo, elas descrevem correctamente a migração das referidas moléculas quando são submetidas a electroforese. Adicionalmente, elas não produzem resultados anómalos de inversão de mobilidade no centro do gel.

Na presente invenção, é proposta a tipagem rápida de microrganismos por intermédio de separação por electroforese de DNA nos miniequipamentos miniCHEF e miniTAFE. Os miniequipamentos miniCHEF produzem os padrões de bandas em 2,5 a 5 horas e o miniTAFE em 5 a 7 horas. São carregadas nos minigéis dos miniequipamentos amostras de células de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, e Staphylococcus aureus, preparadas utilizando o método e o estojo ("kit") de reagentes associado, e separadas a uma intensidade de campo eléctrico até 20 V/cm no miniCHEF ou 22 V/cm no miniTAFE. A intensidade do campo eléctrico, a temperatura do tampão, rampas de tempo de pulsos, o tempo de electroforese e o número de pulsos eléctricos definidos em cada rampa é ditado pelos resultados do simulador (ou do método para seleccionar as condições óptimas para separação das moléculas) . Nesse caso, a concentração do tampão deverá ser TBE 0,5 X [tampão TBE a 1 X é base Tris a 0,0089 M, ácido bórico a 0,089 M e EDTA a 0,002 M (sal sódico de ácido tetra acético de etilenodiamina)], a concentração do gel de agarose (Lachema) deverá ser de 1,5%, o campo eléctrico 43 ΡΕ1350852 deverá ser até 20 V/cm, a temperatura deverá ser entre 4 e 30 °C e o compartimento deverá ser o miniCHEF. Quando é utilizado o simulador, mas é desejada a utilização do miniTAFE, podem ser utilizadas as mesmas condições de campo eléctrico e temperatura produzidas pelo simulador, mas o número de pulsos de cada rampa deverá ser aumentado 1,5 vezes e a duração dos pulsos 1,2 vezes.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Molde Esterilizável para a preparação de Amostras Mini-rolhões É apresentado no esquema da figura 1 um exemplo de um molde que pode ser esterilizado e é fabricado de um material flexivel (silicone, borracha ou qualquer outro material). O molde é utilizado para a preparação de amostras de DNA encaixadas em agarose. A lâmina (1) tem 49 depressões (2) . A suspensão de células-agarose é despejada no molde ou lâmina e distribuída no molde com a espátula especial (4). Posteriormente, a lâmina (1) é coberta com a tampa (3), produzindo os mini-rolhões (5) contendo as células encaixadas. A lâmina do molde verdadeiro foi feita com silicone fundida. Foi vertida noutro molde até que se formou a lâmina (1) . No exemplo, as dimensões do mini-rolhão são 3 X 3 X 0,7 mm (comprimento, largura X espessura). Para extrair os mini-rolhões (5) da lâmina (1), a referida lâmina é segurada pelas suas extremidades e torcida para dentro de um recipiente com uma solução. Conse- 44 ΡΕ1350852 quentemente, os mini-rolhões são desprendidos da lâmina e caem na solução.

Noutras variantes do molde, a largura das depressões pode variar entre 1,5 mm até à largura do minigel, enquanto que a espessura pode variar entre 0,5 mm e 1,5 mm. 0 número de depressões impressas numa lâmina pode também variar.

Exemplo 2. Preparação não-enzimática de DNA intacto Encaixado em Agarose de Pseudomonas aeruginosa crescidas em meio líquido e sólido.

Foram isoladas duas colónias de P. aeruginosa a partir de uma placa de sangue-agar. Uma delas foi inoculada em 5 mL de meio LB (10 g de extracto de levedura, 5 g de cloreto de sódio e 10 g bacto-triptona por litro de água destilada) e a outra foi inoculada numa placa de LB (LB com agar bacteriológico a 1,2%).

Ambas as culturas foram incubadas durante a noite a 37 °C. A cultura em meio liquido foi incubada com agitação e as placas foram mantidas estáticas. As células, crescidas em meio líquido, foram colhidas por centrifugação, enquanto que as placas foram lavadas com a solução de lavagem adequada (apresentada na Tabela I) e depois recolhidas por centrifugação. 45 ΡΕ1350852

As células crescidas em meio líquido ou meio sólido foram lavadas com a solução apresentada na Tabela I, recolhidas por centrifugação e re-suspendidas a uma concentração de 2 X 109 células por mililitro de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% dissolvida em NaCl a 0,15 Μ. A mistura de células-agarose foi vertida na lâmina (1) do molde apresentada na figura 1, depois, a lâmina foi coberta com a tampa (3) e deixou-se a agarose repousar até os rolhões se encontrarem formados (5). Os mini-rolhões foram incubados com NDSUPlus durante meia hora a 50 °C. Poste-riormente, os mini-rolhões foram lavados duas vezes durante 10 minutos em TE-100 a 50 °C e mantidos em TE-100 novo a 4 °C. Antes da digestão com enzimas de restrição, os mini-rolhões foram lavadas e incubados durante 10 minutos em tampão da enzima de restrição Xba I. Cada mini-rolhão foi digerido com 20 U de Xba I durante 2 horas a 37 °C. Os fragmentos de restrição foram separados no miniCHEF a 10 V/cm, 20 °C, agarose a 1,5% e TBE a 0,5 X, aplicando uma rampa de pulso a 20, 15, 10, 5 e 3 segundos e respec-tivamente 5, 15, 320, 1 020 e 100 pulsos.

Os padrões de bandas (26) separados no minigel miniCHEF (25) são apresentados na figura 2. Os mini-rolhões de P. aeruginosa (27) foram preparados a partir de culturas em meio LB liquido, enquanto que os mini-rolhões (28) foram preparados a partir culturas feitas em placas de LB. O tamanhos dos fragmentos de DNA separados são também apresentados na figura. 46 ΡΕ1350852

Exemplo 3. Preparação não-enzimática de DNA intacto Encaixado em Agarose a partir de Staphylococcus aureus crescido em meios sólido.

Foi isolada uma colónia de S. aureus a partir de meio de sangue-agar e plaqueada numa placa Mueller-Hinton (Oxoid). A placa foi incubada durante a noite a 37 °C. A superfície da placa foi lavada com solução de lavagem (NaCl a 0,15 M, EDTA a 0,01 M, pH 8,0, Tabela I) e as células foram recolhidas por centrifugação. 0 DNA intacto encaixado em agarose foi preparado executando qualquer das duas variantes seguintes:

Variante 1: As células são incubadas antes de serem encaixadas em mini-rolhões de agarose.

Variante 2: As células são encaixadas em mini-rolhões de agarose e posteriormente, os mini-rolhões são incubados.

Em ambas as variantes as células foram encaixadas em agarose preparando uma suspensão celular a uma concentração de 4 X 1010 células/mL em agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% dissolvida em solução de lavagem (Tabela I) . A suspensão celular foi vertida na lâmina (1) do molde apresentada na figura 1, posteriormente a lâmina foi coberta com a tampa (3) e a agarose foi deixada a endurecer até os mini-rolhões (5) estarem formados. 47 ΡΕ1350852

Na variante 1, o sedimento celular foi ressus-pendido em 3 mL de NDSUPlus e incubado durante 30 minutos a 50 °C. Seguidamente, a suspensão foi diluida de 1 para 5 em TE-100. As células foram recolhidas por centrifugação e encaixadas em mini-rolhões de agarose.

Na variante 2, as células foram recolhidas, lavadas e posteriormente encaixadas em mini-rolhões de agarose. Os mini-rolhões de agarose foram incubados com NDSUPlus durante uma hora a 50 °C.

Após os tratamentos por qualquer das duas variantes, os mini-rolhões foram lavados duas vezes cada durante 10 minutos em TE-100 a 50 °C. Antes da digestão com enzimas de restrição, os mini-rolhões foram lavados e incubados com tampão da enzima de restrição Sma I durante 10 minutos em gelo. Cada mini-rolhão foi digerido com 20 U de Sma I durante 2 horas a 37 °C. Os macrofragmentos de DNA de restrição de S. aureus, separados em padrões de bandas (31) no minigel (30), são apresentados na figura 3. Os mini-rolhões (32) foram preparados de acordo com a variante 2, enquanto que os (33) pela variante 1. As condições de corrida foram 10 V/cm, 20 °C., agarose a 1,5%, TBE a 0,5 X e rampas de pulso de 1, 5, 9, 13, 17 e 21 segundos. Foram aplicados 130 pulsos em todas as rampas. Os tamanhos dos fragmentos de DNA separados são também apresentados na figura. 48 ΡΕ1350852

Exemplo 4. Planeamento das condições de corrida da electroforese no MiniCHEF. Definição das condições experimentais utilizando o simulador (Método para selec-cionar as condições óptimas para a separação de dna).

Foram simuladas as rampas de tempo de pulso necessárias para separar os cromossomas de S. cerevisiae no compartimento miniCHEF com 11,6 cm entre os eléctrodos de polaridades opostas. 0 objectivo era obter o padrão que apresenta as 11 bandas formadas por todos os cromossomas de S. cerevisiae. Assumiu-se que a electroforese foi realizada num gel de agarose a 1,5% e tampão de corrida TBE a 0,5 X. Foram registados os valores de tamanho dos cromossomas de S. cerevisiae relatados por Goffeau (Goffeau A et al.,

Science, 1996, 274: 546) : 230 kb (crom, , I), 270 kb (crom. VI) , 315 kb (crom. III) , 440 kb (crom. IX), 589 kb (crom. VIII), 577 kb (crom . V), 667 kb (crom. XI), 745 kb (crom. X), 784 kb (crom. XIV), 813 kb (crom. II), 924 kb (crom. XIII), 948 kb (crom. XVI) , 1 091 kb (crom. VII e crom . XV), 1 554 kb (crom. IV) e 2 352 kb (crom. XII). 0 simulador previu quatro rampas de tempo de pulso de 5, 40, 75 e 110 s de tempos de pulso e 42 pulsos em cada rampa para se alcançar a separação óptima dos cromossomas de S. cerevisiae num único padrão para um campo eléctrico com intensidade 10 V/cm e 20 °C. Os resultados da migração, tempos de reorientação, velocidades de migração e o código de cores utilizados para identificar cada cromossoma são apresentados na Tabela II. 49 ΡΕ1350852

Tabela II. Resultados quantitativos obtidos utilizando o simulador. Tamanhos (kb) e cores atribuídas aos cromossomas de S. cerevisiae de acordo com o código de cores do simulador.

Tamanho dos cromossomas de S. cerevisiae (kb) Código de cores tr (s) vr x 105 (cm/s) vm x 104 (cm/s) D previsto pelo simulador (cm) D experimental (cm) 250 azul 4,9 8,8843 2,7462 2,45 2,67 270 verde 5,5 8,6482 2,7293 2,40 2,67 315 vermelho 6,8 8,1940 2,6959 2,28 2,46 440 ciano 10,8 7,2984 2,6247 1,95 2,22 577 magenta 15, 6 6,6297 2,5684 1,59 1,85 589 cinzento escuro 16,1 6,5821 2,5642 1,57 1,85 667 castanho 19,1 6,3017 2,5388 1,42 1,66 745 azul claro 22,2 6,0625 2,5165 1,27 1,49 784 verde claro 23,9 5,9551 2,5062 1,19 1,35 813 vermelho claro 25,1 5,8799 2,4989 1,13 1,18 924 ciano claro 29, 9 5,6223 2,4735 0,92 0,92 948 magenta claro 31,0 5,5721 2,4684 0,89 0,92 1091 branco 37,6 5,3047 2,4408 0,73 0,6 1554 preto 61,3 4,6870 2,3727 0,52 0,4 2352 azul 108,6 4,0542 2,2953 0,46 0,17 D experimental: Distância migrada pelas moléculas no minigel (40) da figura 4. D previsto: Distância migrada pelas moléculas de acordo com as previsões do simulador para as condições de corrida utilizadas na experiência da figura 4. vr: velocidade de migração das moléculas durante a reorientação. vm: velocidade de migração das moléculas após a reorientação. tr: tempo de reorientação das moléculas. 50 ΡΕ1350852 A fotografia do minigel verdadeiro (40) com os padrões de bandas dos cromossomas de S. cerevisiae 196-2 (41) obtidos no miniCHEF com as condições previstas pelo simulador é apresentada na figura 4. Os padrões de bandas simulados nos minigel hipotético (42) e desenhado pelo simulador são também apresentados. Os dois padrões são similares. Foram preparadas moléculas intactas de DNA encaixadas em agarose de S. cerevisiae 196-2 separadas em experiências reais imobilizando células em rolhões de agarose. Os rolhões foram sequencialmente incubados com LETK (Tris a 10 mM, EDTA a 500 mM, KOI a 600 mM, pH 7,5) durante 4 horas, NDS (Tris a 10 mM, EDTA a 500 mM, sarcosil a 1%, pH 9,5) durante 2 horas, e NDS com ureia a 4 M (NDSU) durante 2 horas (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett, 1996, 29: 12, 2079-2084). O fluxograma de uma parte do simulador divulgado nesta invenção é apresentado na figura 5. O método dos cálculos para estimar as rampas de pulso, é apresentado no fluxograma. O critério para terminar os incrementos no número de pulsos é o número de pulsos que levam a mais pequena molécula a migrar 2,5 cm.

Finalmente, o simulador proporciona o resultado que o utilizador deverá observar no gel (ver os padrões de bandas reais no minigel 43 e os simulados no minigel hipo- 51 ΡΕ1350852 tético 42 da figura 4) para as rampas de pulso calculadas pelo programa e aplicadas ao grupo de moléculas especificadas pelo utilizador. 0 programa também fornece dados quantitativos. Esta parte do diagrama não é apresentada porque a solução é trivial.

Exemplo 5. Tipaqem de isolados de Escherichia coli em MiniCHEF

Foi retirada uma única colónia de cada isolado (INN3 e INN7), caracterizado a nivel fenotipico como Escherichia coli, de placas de sangue-agar. Posteriormente, foram sub-cultivadas em 5 mL de meio LB (10 g de extracto de levedura, 5 g de cloreto de sódio, 10 g de bacto-triptona por litro de água destilada). Cada cultura foi incubada durante a noite a 37 °C com agitação.

As células de cada cultura foram lavadas (ver solução de lavagem na Tabela I), centrifugadas e o sedimento re-suspendido à razão de 2 X 109 células por mililitro em agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% dissolvida em NaCl a 0,15 M. Cada mistura de agarose-células foi vertida na lâmina (1) do molde apresentada na figura 1. A lâmina foi coberta com a tampa (3) e a agarose foi deixada a endurecer até que se formassem os mini-rolhões (5). Ambos os grupos de mini-rolhões foram incubados com NDSUPlus durante meia hora a 50 °C. Posteriormente, os mini-rolhões foram lavados e incubados durante 10 minutos com tampão de digestão da enzima de restrição xba I e cada um foi digerido com 20 U de Xba I durante 2 horas a 37 °C. 52 ΡΕ1350852

Os padrões de bandas (87) separados no minigel (86) do miniCHEF são apresentados na figura 6. As separações conseguidas no miniCHEF do DNA total dos isolados INN3 (88) e INN7 (89) de E. coli digeridos com Xba 1 permitiram identificar seis fragmentos comuns entre eles (90) . Seguidamente, de acordo com Tenover (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33: 9, 2233-2239) os isolados INN3 e INN7 foram classificados como dois subtipos diferentes de E. coli. Os fragmentos de restrição de DNA foram separados no miniCHEF a 10 V/cm, 20 °C, agarose a 1,5% e TBE a 0,5 X, aplicando rampas de pulso de 25, 20, 15, e 5 segundos e, respectivamente, 35, 40, 50, 140 e 800 pulsos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Esguema do molde para moldar os mini-rolhões. A lâmina, com as depressões impressas, para verter a suspensão agarose-células é apresentada na parte inferior da figura. Na parte superior, são apresentados a tampa do molde e um mini-rolhão. A espátula para distribuir a suspensão agarose-células é também apresentada à direita.

Figura 2. Padrões de bandas obtidos no miniCHEF para os fragmentos de macro-restrição com Xba I de DNA de P. aeruginosa. No lado esquerdo, os mini-rolhões de P. aeruginosa foram preparados a partir de células crescidas em meio LB liguido, enquanto que, no lado direito, os mini- 53 ΡΕ1350852 rolhões foram preparados a partir de células crescidas em placas com LB. O MiniCHEF foi utilizado a 10 V/cm, 20 °C, agarose a 1,5% e TBE a 0,5 X, e foram aplicadas rampas de pulso de 20, 15, 10, 5 e 3 segundos e 5, 15, 320, 1 020 e 100 pulsos respectivamente.

Figura 3. Padrões de bandas produzidos pelo MiniCHEF para fragmentos de DNA de macro-restrição com Sma I para S. aureus. São apresentados do lado esquerdo os padrões de bandas de amostras preparadas incubando os mini-rolhões contendo as células com NDSUPlus. São apresentados do lado direito os padrões de bandas de amostras preparadas incubando as células com NDSUPlus e posteriormente encaixá-las em mini-rolhões de agarose. Em ambas as preparações de amostras, as células foram crescidas em placas. As condições de corrida foram 10 V/cm, 20 °C, agarose a 1,5%, TBE a 0,5 X, tempos de pulso de 1, 5, 9, 13, 17 e 21. Em cada rampa foram aplicados 130 pulsos.

Figura 4. Fotografia do minigel miniCHEF verdadeiro (40) utilizado para se obterem os padrões de bandas dos cromossomas 196-2 de S. cerevisiae (esquerda) e gráfico do minigel hipotético (42) previsto pelo simulador (direita) . Foi realizada uma electroforese verdadeira com as condições previstas pelo simulador. As moléculas intactas de DNA imobilizado de S. cerevisiae 196-2, analisadas nesta corrida de electroforese, foram preparadas como descrito no Exemplo 4. Para intensidade do campo eléctrico de 10 V/cm e temperatura do tampão 20 °C, as condições de corrida pre- 54 ΡΕ1350852 vistas pelo simulador foram quatro rampas de pulso de 5, 40, 75 e 110 segundos e 42 pulsos em cada rampa. Os dados de migração e o código de cores utilizado para a identificação dos tamanhos das moléculas são apresentados na Tabela II.

Figura 5. Fluxograma do método para simular os padrões de bandas de DNA nos minigéis do miniCHEF. São utilizados os seguintes parâmetros e variáveis no diagrama: tamanho do DNA (kb) , tempos de reorientação do DNA (tr) , velocidade de migração do DNA durante a reorientação (vr), e após a reorientação (vm) no miniCHEF. Adicionalmente, tpr: tempo de pulso em cada rampa, Npr: número de pulsos em cada rampa, gO, gl, g2, g3, g4 coeficientes obtidos para descrever a viscosidade (η) como função da temperatura experimental (T), Dt: distância teóricas previstas pelo método, n: número de rampas, E: campo eléctrico, L: comprimento do contorno do DNA, pb: pares de bases, Q: carga liquida do DNA.

Figura 6. Tipagem com MiniCHEF dos isolados INN3 e INN7 de E. coli após digestão de restrição com Xba I das suas moléculas de DNA. Foram utilizados o método e o estojo ("kit") de reagentes associados para a preparação das amostras. As condições de corrida foram: 10 V/cm, 20 °C, gel de agarose a 1,5% e TBE a 0,5 X, aplicando rampas de pulso de 25, 20, 15, 10 e 5 segundos e 35, 40, 50, 140 e 800 pulsos respectivamente. os pontos (90) marcam os fragmentos de restrição que ambos os isolados possuem em comum. 55 ΡΕ1350852

VANTAGENS DAS SOLUÇÕES DIVULGADAS 1- A preparação de moléculas intactas de DNA dos microrganismos, encaixadas em mini-rolhões finos de qualquer gel, é realizada entre 5 minutos e 1 hora. A preparação não requer a utilização de enzimas, consequentemente é de realizada rapidamente e a custo baixo. 2- A preparação não-enzimática de amostras de DNA para PFGE é eficaz utilizando células crescidas em meio liquido ou sólido. Alguns tipos de células podem ser incubados nas soluções não-enzimáticas antes do seu encaixe. Esta modificação reduz o tempo necessário para a preparação das amostras. 3- As moléculas de DNA encaixadas em gel, preparadas pelo procedimento divulgado, não possuem inibidores de endonucleases de restrição. Estas moléculas são digeridas por enzimas de restrição em 2 horas, originando os seus padrões de bandas tipicos nas experiências de Electroforese em Gel de Campo Pulsado realizadas em miniequipamentos. 4- São obtidos mini-rolhões de tamanho homogéneo, contendo DNA imobilizado a partir de microrganismos, consequentemente eles não necessitam de ser cortados antes da electroforese. Mini-rolhões idênticos garantem a reprodu-tibilidade dos resultados. 56 ΡΕ1350852 5- Os padrões de bandas podem ser simulados no computador quantas vezes foram necessárias, antes da realização das experiências. A simulação permite seleccionar o campo eléctrico, temperatura e rampas de tempo de pulso que resultam na melhor separação entre as moléculas sem consumo de reaqentes e amostras biológicas. 6- A selecção das rampas de pulso é realizada com a ajuda de um método baseado em equações que descrevem a migração de moléculas de DNA nos minigéis do miniCHEF. Assim sendo, o método para seleccionar as rampas proporciona a imagem do padrão óptimo de separação entre as moléculas. 7- 0 processo aqui divulgado poupa tempo, reagentes químicos e amostras biológicas. 8- É proporcionado um estojo ("kit") de reagentes, para simplificar a preparação de DNA intacto de microrganismos.

Lisboa, 16 de Março de 2007

Claims (17)

1 ΡΕ1350852 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a tipagem rápida de microrganismos por Electroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) que compreende a realização de separações por PFGE de fragmentos de restrição de DNA bacteriano em minicompar-timentos dos sistemas CHEF (Electroforese de Campo Eléc-trico Homogéneo de Contornos Limitados) ou TAFE (Electroforese de Campo Alternado Transversal) entre 7 a 13 horas, e o cálculo de migrações de DNA ("D") dos referidos fragmentos com vários tempos de pulso ("tp") substituindo os tamanhos de DNA ("L"), campo eléctrico ("E"), viscosidade do tampão (η, função da temperatura do tampão) e tempo de pulso num grupo de equações teóricas conhecidas que descrevem ff "D" como ("n", número de rampas de tempo de pulso; "Np", número de pulsos), "d" (migrações por pulsos) como "vr*tpr*rr (tpr-tr)+vm· (tpr-tr)·[1-ΓΓ(tpr-tr)"; "vr" (velocidade de reorientação do DNA) como "0,0207 [QE1'45/ (δπηΕ1'35) ] "; "vm" (velocidade do DNA após reorientação) como "0, 665 [QE1'76/ (δπηΕ1'08) ] "; 2 ΡΕ1350852 "tr" (tempo de reorientação do DNA) como "0,134 (L1-14/ vr)0·926"; em que rr(tpr-tr)=l se tpr-tr<0 e rr(tpr-tr)=0 se (tp-tr)>0, e assumindo que a electroforese é realizada em géis de agarose de 1,5% e com tampão TBE a 0,5 X; em que o processo compreende: a) um passo de preparação de DNA imobilizado intacto a partir de células de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus realizado por: i) conjunto de soluções de reagentes químicos constituindo um estojo ("kit") de reagentes em que as moléculas de DNA intacto imobilizado são preparadas a partir das referidas células bacterianas, em que as soluções dos estojo ("kit")s possuem as seguintes composições: - sal NaCl a uma concentração de 0.15 M ou o agente quelante de metais EDTA a uma concentração de 0,01 M e o sal NaCl a uma concentração de 0,15 M e um pH de 8,0, soluções do referido estojo ("kit") em que as células bacterianas são lavadas e encaixadas em mini-rolhões de agarose, 3 ΡΕ1350852 - agente quelante de metais EDTA a uma concentração de 0,01 M, dois detergentes aniónicos Sacosil e Noidet® P-4 0 ambos a uma concentração de 1% e base Tris a 0,01 M, soluções que podem adicionalmente conter Ureia a 4 M, soluções do referido estojo ("kit") com as quais as células bacterianas são tratadas, - agente quelante de metais EDTA a uma concentração de 0,01 M e base Tris a 0,01 M, soluções do referido estojo ("kit") com as quais os mini-rolhões são lavados e armazenados; ii) moldes flexíveis para a moldagem de mini-rolhões de agarose contendo células bacterianas; moldes que são lâminas de materiais, tais como, silicone, e são cobertas com tampas de vidro; lâminas que possuem até 0,5 cm de espessura e possuem impressas numa das suas superfícies várias depressões quadradas de 0,3 cm de tamanho e de 0,03 a cerca de 0,1 cm de profundidade, depressões em que a mistura células bacterianas-agarose solidifica e confere aos mini-rolhões os referidos tamanhos, moldes que são suficientemente flexíveis para serem torcidos para libertarem os referidos mini-rolhões e são reutilizáveis após autoclavagem, sendo os referidos moldes e tampas montados completamente e utilizados para imobilização de células bacterianas de acordo com um método. 4 ΡΕ1350852 (iii) utilização do molde flexível e do referido esto ("kit") de reagentes com cada espécie bacte-riana; b) passo de cálculos antecedendo as separações de fragmentos de restrição de DNA das referidas espécies bac-terianas em minicompartimentos; passo em que são selec-cionadas as condições óptimas de electroforese da corrida miniCHEF, passo realizado por um método de cálculo que compreende: i) entrada do conjunto de dados de "d", "tr", "vr", e "vm" de fragmentos de restrição de DNA bacteriano para campos eléctricos de 1 a 20 V/cm e temperatura de 4 a 30 °C, conjuntos de valores que foram obtidos substituindo tamanhos de DNA, campo eléc-trico e temperatura no grupo de equações teóricas conhecidas que descrevem "tr", "vr", "vm" e "d", ii) cálculo da duração dos pulsos da rampa, ou séries de durações de pulso que mais eficazmente separam moléculas de DNA, iii) cálculo do tempo total de corrida, ou o tempo de corrida de electroforese mais eficiente para a série de durações de pulso calculadas no passo (ii), 5 ΡΕ1350852 iv) cálculo dos esquemas dos padrões de bandas para as referidas condições óptimas de electroforese ou rampa de duração de pulso e tempo de corrida mais eficazes, esquemas que são produzidos como resultado do método e são caracterizados por bandas que são desenhadas como linhas de diferentes cores separadas de acordo com a migração de DNA; esquemas em que cada cor identificou fragmentos de restrição de um tamanho particular; consequentemente um código de cores univocal identifica o tamanho dos fragmentos, realizando-se cada cálculo de acordo com vários passos; e sendo as séries de rampas formadas por vários termos, em que cada termo é uma duração de pulso ("tp"), e cada termo é acompanhado pelo número correspondente de pulsos ("Np") que proporciona a duração de corrida mais eficiente.

2. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que as lâminas de formação designadas moldes flexíveis e autoclaváveis são feitas de silicone, borracha ou qualquer outro material flexível, lâminas que possuem qualquer forma, tamanho e número de depressões quadradas idênticas (de modo preferido até 50) impressas numa superfície.

3. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1 e 2, em que o método 6 ΡΕ1350852 de montagem e utilização de um dos referidos moldes flexíveis para a preparação de DNA intacto imobilizado em mini-rolhões de agarose possui os seguintes passos: i) verter a suspensão de células bacterianas e agarose na superfície impressa do molde; ii) distribuir a referida suspensão de células bacterianas uniformemente com uma espátula para preencher as referidas depressões; iii) cobrir o molde com a sua tampa e deixar repousar até que os mini-rolhões estejam formados; iv) torcer o molde para dentro de um frasco qualquer para se desprenderam os mini-rolhões.

4. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição de uma solução de lavagem de células do referido estojo ("kit") de reagentes é NaCl a 0,15 M e EDTA a 0,01 M, pH 8,0 (solução N°1) .

5. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição de uma solução de lavagem de células do referido estojo ("kit") de reagentes é NaCl a 0,15 M (solução N°2).

6. Processo para tipagem rápida de bactérias 7 ΡΕ1350852 como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição de uma solução de encaixe de células do referido estojo ("kit") de reagentes é agarose de baixo ponto de fusão entre 1,5 a 2% suspendida em NaCl a 0,15 M (solução N°3).

7. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição de uma solução de encaixe de células do referido estojo ("kit") de reagentes é agarose de baixo ponto de fusão entre 1,5 a 2% suspendida em NaCl a 0,15 Me EDTA a 0,01 M (solução N°4).

8. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição de uma solução para tratamento celular do referido estojo ("kit") de reagentes é EDTA a 0,1 M, Sarcosil a 1%, Nonidet P-4 0 a 1% e base Tris a 0,01 M, pH 8,0 (solução N°5).

9. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição de uma solução para tratamento celular do referido estojo ("kit") de reagentes é EDTA a 0,1 M, Sarcosil a 1%, Nonidet P-40 a 1%, base Tris a 0,01 M, e Ureia a 4 M, pH 9,5 (solução N°6).

10. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que a composição da solução de lavagem e armazenamento dos mini-rolhões do referido estojo ("kit") de reagentes é EDTA a 0,1 Me base Tris a 0,01 M, pH 8,0 (solução N°7). ΡΕ1350852

11. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1-10, em que o método de utilização do referido estojo ("kit") de reagentes e um dos referidos moldes flexiveis para a preparação de DNA intacto imobilizado a partir de células de P. aeruginosa compreende os passos: i) recolher células de meio liquido ou placas e lavá-las na solução N°2 do referido estojo ("kit") de reagentes, ii) suspender as células na solução N°3 do referido estojo ("kit") de reagentes e verter a suspensão num molde flexível, iii) separar os mini-rolhões do molde após a solidificação da agarose torcendo o referido molde, e incubá-los durante 30 minutos a 50 °C na solução N°6 do referido estojo ("kit") de reagentes, iv) lavar os mini-rolhões duas vezes a 50 °C durante 10 minutos na solução N°7 do referido estojo ("kit") de reagentes, e seguidamente armazená-los na referida solução.

12. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1-10, em que o método de utilização do referido estojo ("kit") de reagentes e um 9 ΡΕ1350852 dos referidos moldes flexíveis para a preparação de DNA intacto imobilizado a partir de células de S. aureus compreende os passos: i) recolher células de meio líquido ou placas e lavá-las na solução N°1 do referido estojo ("kit") de reagentes, ii) suspender as células na solução N°4 do referido estojo ("kit") de reagentes e verter a suspensão num molde flexível, iii) separar os mini-rolhões do molde após a solidificação da agarose torcendo o referido molde, e incubá-los durante 60 minutos a 50 °C na solução N°6 do referido estojo ("kit") de reagentes, iv) lavar os mini-rolhões duas vezes a 50 °C durante 10 minutos na solução N°7 do referido estojo ("kit") de reagentes, e seguidamente armazená-los na referida solução.

13. Processo para tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1-10 em que o método de utilização do referido estojo ("kit") de reagentes e um dos referidos moldes flexíveis para a preparação de DNA intacto imobilizado a partir de células de E. coli compreende os passos: 10 ΡΕ1350852 i) recolher células de meio líquido ou placas e lavá-las na solução N°1 do referido estojo ("kit") de reagentes, ii) suspender as células na solução N°3 do referido estojo ("kit") de reagentes e verter a suspensão num molde flexível, iii) separar os mini-rolhões do molde após a solidificação da agarose torcendo o referido molde, e incubá-los durante 10 minutos a 37 °C na solução N°5 do referido estojo ("kit") de reagentes, iv) lavar os mini-rolhões na solução N°7 do referido estojo ("kit") de reagentes, e seguidamente armazená-los na referida solução.

14. Processo para a tipagem rápida de bactérias como reivindicado na reivindicação 1, em que o passo de cálculos que antecede as separações de fragmentos de restrição de DNA das referidas espécies de bactérias nos referidos minicompartimentos é efectuado por um método de cálculo que permite seleccionar as condições óptimas de electroforese da corrida em mimiCHEF, método esse que compreende os passos: i) especificar para o método de cálculo os conjuntos de dados de migrações por pulso ("d"), tempo de reorientação ("tr"), velocidades de migração durante a 11 ΡΕ1350852 reorientação ("vr") e após a reorientação ("vm") dos fragmentos de restrição de DNA das referidas espécies bacterianas, conjuntos de dados esses calculados substituindo tamanhos de DNA, campo eléctrico e temperatura de corrida no grupo de equações teóricas conhecidas que descrevem "tr", "vr", "vm" e "d" das moléculas de DNA, ii) calcular as séries mais eficazes (rampa) de durações de pulso, iii) calcular o tempo de corrida de electroforese mais eficaz para as séries de durações de pulso calculadas no passo (ii), iv) calcular as distâncias ("D") migradas por todos os fragmentos de restrição de DNA para as séries mais eficazes de durações de pulso e o tempo de electroforese mais eficaz, v) desenhar o esquema do padrão de bandas previsto e o minigel, desenho esse que é efectuado colocando as migrações de DNA à escala do esquema de minigel, vi) repetir os passos (i) a (v) com diferentes conjuntos de dados "d", "tr", "vr" e "vm", obtidos com diferentes campos eléctricos e temperaturas, e finalmente seleccionar a série de durações de pulso e número de pulsos que proporcionam as melhores 12 ΡΕ1350852 separações entre as bandas hipotéticas no esquema de padrão de bandas.

15. Processo para a tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1 e 14, em que o passo de cálculo da série (rampa) de durações de pulso "tp", que mais eficazmente separa as moléculas de DNA é efectuado de acordo com os seguintes passos: i) especificar para este passo os tempos de reorientação do fragmento de DNA mais pequeno e do maior (respectivamente "trA" e "trB") para o campo eléctrico e temperatura seleccionados, ii) calcular os termos "n" ("n" de 2 a 1 000) da série (rampa) de durações de pulso (tpr=tpi, tp2, . .., tpn) que começa a um valor 1,5 vezes inferior a "trA" e termina a um valor 1,5 vezes superior a "trB": série na qual o incremento "Δ" é a diferença comum entre os termos sucessivos; consequentemente, a série mais eficaz é: trA/l,5, tp2 = tpi + Δ, tp3 = tpi + 2Δ, ..., tpn = 1,5 · trB; em que Δ = | (tpi-tpn) | / (η—1) , e n = te/ (tpi + tpn) ; sendo "te" o tempo de corrida da electroforese.

16. Processo para a tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1, 14 e 15, em que o passo de cálculo do tempo de corrida de electroforese mais 13 ΡΕ1350852 eficaz para a série de durações de piso calculada é efectuado de acordo com os seguintes passos: i) especificar para este passo os termos (tpi, tp2, tpn) da referida série de durações de pulso ("tpr" para "r"=l...n), e o número "n" de termos da referida série, ii) especificar para este passo o conjunto de migrações por pulsos ("drA") do fragmento de restrição de DNA mais pequeno; em que o conjunto de migrações por pulsos da referida molécula é definido para os pulsos da série tpi, tp2, tpn) e campo eléctrico e temperatura seleccionados; conjunto de migrações por pulsos esse que é calculado substituindo "tr", "vr" e "vm" do fragmento de restrição de DNA mais pequeno na equação teórica conhecida descrevendo "d", iii) definir um valor inicial dos números de pulsos ("Npr) que corresponde a todos os termos da série; sendo 1 o valor inicial recomendado para todos os "Npr" para "r" entre 1 e "n", iv) aumente' ;T\ ___- 1 _ IITiT__ 11 que acompanha cada termo "tpr" (para *> i :' '······ . ;·.·$ v ^ .mm ' ' e r = l...n), e calcular a migração "D ua muieuuid mais pequena para os termos "n" da série; cálculo esse que é efectuado como 14 ΡΕ1350852 v) repetir ο passo iv) até que o valor de "D" indique que a referida molécula atinge uma região do minigel que está entre 0,1 a 1 cm de distância do fim do referido minigel hipotético; posteriormente, terminar os incrementos de "Npr", e seleccionar os valores actuais de "Npr" para estimar a duração de corrida mais eficaz, vi) tomar como tempo total de corrida o calculado como

17. Processo para a tipagem rápida de bactérias como reivindicado nas reivindicações 1 e 14 -16, em que o passo para desenhar o esquema dos padrões de bandas à escala para um determinado minigel é baseado no cálculo das distâncias "D" migradas por todos os fragmentos de DNA para a série (rampa) mais eficaz de durações de pulso e tempo de corrida de electroforese mais eficaz; desenhar compreende os passos: i) especificar para este passo os termos "n" da série (rampa) de durações de pulso (tpr) de cada termo da série, e o número de pulsos (Npr) que acompanha cada "tpr", para "r" entre 1 e "n", ii) especificar para este passo os conjuntos de migrações por pulsos (dri, dr2, ...) para todos os 15 ΡΕ1350852 fragmentos de restrição de DNA (fi, Í2,...) das referidas espécies de bactérias; em que os conjuntos de migrações por pulso dos referidos fragmentos são definidos para os pulsos da série (tpi, tp2, . .., tpn) e o campo eléctrico e temperatura seleccionados; conjuntos de migrações por pulso esses que são calculados substituindo "tr", "vr" e "vm" de cada fragmento de restrição de DNA na referida equação teórica conhecida descrevendo "d"; sendo "dri", "dr2" os conjuntos de migrações por pulsos de dois fragmentos diferentes, iii) cálculo das distâncias que os referidos fragmentos de DNA migrariam no minigel hipotético, cálculo no qual a distância "D" migrada por cada fragmento no minigel é obtida como iv) desenhar um rectângulo &*#*** *'*»· minigel verda- y deiro, e desenhar vários rectângulos mais pequenos dentro do referido rectângulo maior, esquema esse que os rectângulos mais pequenos representam os poços onde as amostras de DNA seriam hipoteticamente carregadas, v) atribuir a cada fragmento uma única cor no esquema do padrão, cor essa que identificará o referido fragmento e o seu tamanho após a previsão e desenho dos padrões de bandas; isto é, utilizando um código de cores que identifique os tamanhos das moléculas que 16 ΡΕ1350852 estão hipoteticamente contidas nas bandas desenhadas como linhas no esquema de separação, vi) desenhar linhas coloridas de baixo de cada rectân-gulo mais pequeno para representar as bandas hipotéticas formadas pelos fragmentos, em que cada linha dista do referido rectângulo mais pequeno, ou poço, a distância "D" que o correspondente fragmento migraria no gel verdadeiro. Lisboa, 16 de Março de 2007