CN104561326B - 一种基于菌毛多样性的尿路感染大肠杆菌的分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于菌毛多样性的尿路感染大肠杆菌的分型方法，特别是涉及对尿路感染大肠杆菌的分型方法，该方法通过三种菌毛抗原基因（yagV,fimF,fimH）的进化分析以及菌毛抗原类型的鉴定确定尿路感染大肠杆菌的型别，包括样品预处理—扩增—电泳检测结果—切胶回收电泳样品—测序—序列比对，构建进化树。同时也公开了菌毛抗原多样性在尿路感染大肠杆菌分型中的应用。本发明的分型方法具有简便，检测周期短、速度快，可操作性强的特点，分辨率相比MLST显著提高，接近于基于全基因组测序分型方法的分辨率，而检测成本相比基因组测序方法较低，具有很好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种对尿路感染大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）的分型方法，其中包括用于分型的三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）的选取及菌毛抗原类型的确定，以及菌毛抗原多样性在尿路感染大肠杆菌分型中的应用。此外，还包括所涉及的菌毛基因特异性扩增的引物序列。
背景技术
泌尿系统是人类遭受病原细菌感染的最常见部位之一。病原细菌引起的尿路感染（UTI，urinary tract infections）会导致急性单纯性膀胱炎，急性单纯性肾盂肾炎，复杂性尿路感染，反复发作性尿路感染等临床常见感染性疾病。据报道，大约40%的女性和12%的男性在一生中至少会经历一次有症状的尿路感染，其中10%的女性会在感染后的6-12个月中再次遭受感染。此外，儿童也存在遭受病原细菌引起的尿路感染的风险。统计数据表明，2006年美国有一千三百万尿路感染患者。尿路感染也是重要的医院感染之一，占美国医院感染及菌血症的首位。病原细菌引起的尿路感染也带来了巨大的社会经济负担，仅以美国的统计数据为例，每年花费在其治疗方面的费用达到35个亿。因此，预防和控制尿路病原细菌的感染是全球亟待解决的问题。
病原细菌的溯源分析与传染源的确定是感染性疾病预防、诊断和控制中切断感染源的重要科学依据。随着新发、突发传染病对人类威胁的日趋严重，人们迫切需要对病原细菌，尤其是新发病源细菌进行更全面、更高精度的检测，例如：提供关于病原细菌致病性、威胁性、流行能力等相关的更多信息。病原细菌的分子分型及其进化位置为溯源病原细菌提供了关键信息。准确而高分辨率的分型信息为感染性疾病的流行病学变化以及扩散范围的检测与预警奠定了基础，同时也为临床诊断提供了依据。
病原细菌的分型鉴定中以脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gelelectrophoresis, PFGE）和多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）应用最为广泛，随着基因组测序技术的进步，基于全基因组序列的分型分析技术更为全面的提供了病原细菌的海量信息，对于病原细菌的鉴定非常有效。准确而高分辨率的分型信息为感染性疾病的流行病学变化以及扩散范围的检测与预警奠定了基础，同时也为临床诊断提供了依据。然而，分辨率不高严重影响了PFGE和MLST这两种方法对临床菌株的诊断。而全基因组测序就目前来说费用还较高，计算和分析方法还需要进一步的完善，用于日常检测的可行性还较低。
造成尿路感染的病原细菌主要为革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌，变形杆菌，普罗维登斯氏菌，铜绿假单胞菌等。其中，大肠杆菌所造成的尿路感染占单纯性感染的80%以上，变形杆菌是造成医院内留置导尿管患者尿路感染的主要元凶。尿路感染细菌在人体中的生存环境较为特殊，病原细菌实现对宿主细胞的粘附和侵袭需要首先抵抗尿道中尿液的冲洗等，此外造成肾盂肾炎的尿路病原细菌需要顺尿道上行至肾，因此尿路病原细菌通常具有丰富的表面抗原，而菌毛抗原是细菌满足细菌有效粘附和系统性感染的关键作用因子。
菌毛抗原广泛存在于尿路感染细菌，与宿主尿路上皮细胞的受体特异性结合，并介导进一步的侵袭。菌毛的结构在种属水平具有保守型，但菌毛顶端的粘附素具有多态性，决定了与宿主受体结合的特异性。此外，菌毛抗原还具有免疫原性和抗原性，成为尿路感染细菌疫苗研发的靶标。我们前期的分析发现，根据尿路感染大肠杆菌I型菌毛抗原基因的多态性所构建的系统进化树与根据这些细菌基因组直系同源基因构建的系统进化树非常相似。基于以上特性，我们推测，尿路感染细菌的菌毛多态性与功能密切相关，并且具备高分辨率的分型特征，具有作为其分子分型的靶位点的潜力。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种用于尿路感染大肠杆菌分型的特异性引物，它具有如SEQ NO:1-50所示。
本发明进一步公开了采用特异性引物进行尿路感染大肠杆菌分型的方法，其特征在于，该方法通过三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）的进化分析以及菌毛抗原类型的鉴定确定尿路感染大肠杆菌的型别，包括样品预处理—扩增—电泳检测结果—切胶回收电泳样品—测序—序列比对，构建进化树，其按如下的步骤进行：
（1）基因组的提取
（2）引物的设计：针对尿路感染大肠杆菌编码22种菌毛ursher蛋白的基因（SEQNO:7-50），尿路感染大肠杆菌菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）（SEQ NO:1-6），设计特异性检测引物，引物序列如SEQ NO:1-50所示：
（3）PCR产物的获得及测序：
采用步骤（20中所列引物，以尿路感染细菌的基因组为模板，进行PCR扩增反应，PCR体系为10uM 引物1μl、10×buffer 5μl、10mM dNTP 0.5μl、5 U/μl Taq 聚合酶0.5μl及1μl的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至50μl，PCR仪上扩增；反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液以9：1的体积比混合；将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；目的条带进行切胶，使用康为世纪大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对切胶产物进行回收，回收后的产物进行Sanger法进行DNA双向测序；其中的扩增为：前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为94℃，5分钟；变性温度和时间为94℃，50秒；复性温度和时间为50℃，45秒；延伸温度和时间为72℃，1秒；变性、复性、延伸的循环次数为30个循环；为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5分钟。
（4）对测序结果进行序列比对分析：
对于GenBank中已公布基因组序列的尿路感染大肠杆菌，将其三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列和菌毛ursher基因序列下载，将DNA双向测序结果用Staden软件进行序列拼接，校正，每株尿路感染大肠杆菌的三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列连接，将所测序的三种基因序列和所下载的三种基因序列用ClustalX进行序列比对，MEG5A，通过最大似然法进行进化树的构建，经过1000次验证，根据进化树的结果，初步确定尿路感染大肠杆菌的分型；
根据所下载的ursher基因序列类型及22种菌毛ursher基因在不同菌株中的扩增结果，确定尿路感染大肠杆菌所含有的菌毛类型；
结合三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）所确定的分型结果和菌株所含有的菌毛类型确定尿路感染大肠杆菌的分型。
本发明所述的特异性PCR引物，其中的特异性引物为：
SEQ NO:1 ATGCTGGCGGCACCTTTGAC特异扩增尿路感染大肠杆菌yagV基因的上游引物；
SEQ NO:2 TTAGTCCGCCGAAGGGGGC特异扩增尿路感染大肠杆菌yagV基因的下游引物；
SEQ NO:3 GTGATGAGAAACAAACCTTTTTATC特异扩增尿路感染大肠杆菌fimF基因的上游引物；
SEQ NO:4 TTACTGATATTCAAGAGTGAAGGTAG特异扩增尿路感染大肠杆菌fimF基因的下游引物；
SEQ NO:5 ATGATTGTAATGAAACGAGTTATTAC特异扩增尿路感染大肠杆菌fimH基因的上游引物；
SEQ NO:6 TTATTGATAAACAAAAGTCACGCC特异扩增尿路感染大肠杆菌fimH基因的下游引物；
SEQ NO:7 AATGTCTACGCTACTGTCTC特异扩增尿路感染大肠杆菌CS1-like型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:8 CTGTGCCTGAACCTGAATA特异扩增尿路感染大肠杆菌CS1-like型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:9 GCTATCTGTCGCTGAATAAC特异扩增尿路感染大肠杆菌Mat型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:10 CACCGCCTGATTATCGTAT特异扩增尿路感染大肠杆菌Mat型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:11 GCTGGAAGACAACAACCT特异扩增尿路感染大肠杆菌Type 1型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:12 ATAACTGCTGCTGACTCTC特异扩增尿路感染大肠杆菌Type 1型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:13 CTGAAGGAACGCTGAAGTA特异扩增尿路感染大肠杆菌 F1C型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:14 CTGAACGGAATGCTGACA特异扩增尿路感染大肠杆菌F1C型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:15 GATAGTTATACCGATGGCGATA特异扩增尿路感染大肠杆菌 F9型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:16 CCTTGCGTAGAATAGCGATA特异扩增尿路感染大肠杆菌F9型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:17 ATGACGGTGATGATGAAGAT特异扩增尿路感染大肠杆菌 Ycb型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:18 GGTAATGCCTTGTGAATGG特异扩增尿路感染大肠杆菌Ycb型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:19 TTCAGACAGGAACAGCATT特异扩增尿路感染大肠杆菌 Auf型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:20 CACCAACAGAACCACTACT特异扩增尿路感染大肠杆菌Auf型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:21 GTAACAGAGGTAATGGTAACG特异扩增尿路感染大肠杆菌 Sfm型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:22 AGAGGAAGCGAATGGAATC特异扩增尿路感染大肠杆菌Sfm型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:23 GCCGAGGTCAGTGTATTC特异扩增尿路感染大肠杆菌 LPF型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:24 CGTTGTATCCAGGTGCTTA特异扩增尿路感染大肠杆菌LPF型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:25 CCTTCATTCTGTCTTCGGATA特异扩增尿路感染大肠杆菌 ECSF-0165型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:26 ATCGCTGTTGGCAATACC特异扩增尿路感染大肠杆菌ECSF-0165型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:27 TTCAGTCTTCAGCAGCAAT特异扩增尿路感染大肠杆菌 ECSF-4008型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:28 TCGTAATGGTATTCGTGGTT特异扩增尿路感染大肠杆菌ECSF-4008型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:29 CATACCGATATTCCACTGAGA特异扩增尿路感染大肠杆菌CS12型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:30 TCCACTACAATAGCACCATC特异扩增尿路感染大肠杆菌CS12型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:31 GATAGAGGTGCGTCAGAAC特异扩增尿路感染大肠杆菌Afa型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:32 CTCAGACTCAGCGTGGTA特异扩增尿路感染大肠杆菌Afa型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:33 GGCGTAGCGAATACCAAT特异扩增尿路感染大肠杆菌Yad型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:34 ACTGACCGTGACCTGATT特异扩增尿路感染大肠杆菌Yad型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:35 CCAGCGGTAAGCAATGTT特异扩增尿路感染大肠杆菌Yeh型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:36 GCATAAGGCACCAGATAGG特异扩增尿路感染大肠杆菌Yeh型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:37 AATGATACCAGACACGAAGG特异扩增尿路感染大肠杆菌Yeh-like型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:38 CCAGACAACTAATCCACTACT特异扩增尿路感染大肠杆菌Yeh-like型菌毛的ursher基因的下游引物；
SEQ NO:39 GCGGCTTATCGTTATTCATC特异扩增尿路感染大肠杆菌F17-like型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:40 GTATCACTCAGGTCATTACTCA特异扩增尿路感染大肠杆菌F17-like型菌毛的ursher基因的下游引物
SEQ NO:41 CCTACAACGGTTCCTACG特异扩增尿路感染大肠杆菌Yfc型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:42 TGCCTTCATCATCCACAAT特异扩增尿路感染大肠杆菌Yfc型菌毛的ursher基因的下游引物
SEQ NO:43 CGGACTGATGCTGGATTA特异扩增尿路感染大肠杆菌P型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:44 GCTACTGACTGCGTGATA特异扩增尿路感染大肠杆菌P型菌毛的ursher基因的下游引物
SEQ NO:45 CGTCACACTCAACAAGAAC特异扩增尿路感染大肠杆菌Pix型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:46 CGGTAATAACTGCTCACATC特异扩增尿路感染大肠杆菌Pix型菌毛的ursher基因的下游引物
SEQ NO:47 GGATGACGACGAAGAGAAT特异扩增尿路感染大肠杆菌Yqi型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:48 CCTGAATACCGCTGAGATAA特异扩增尿路感染大肠杆菌Yqi型菌毛的ursher基因的下游引物
SEQ NO:49 AAGTGACGGAAGAAGATGG特异扩增尿路感染大肠杆菌Ybg型菌毛的ursher基因的上游引物；
SEQ NO:50 TGGTGCTGTGATTACTGTT特异扩增尿路感染大肠杆菌Ybg型菌毛的ursher基因的下游引物。
本发明公开的基于菌毛多样性的尿路感染大肠杆菌的分型方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）方法简便，周期短、速度快、可操作性强：本发明所涉及的方法均为基础分子生物学方法，方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，而检测成本相比基因组测序方法较低（如基因组测序方法成本在2000-3000元/样品,检测时间为4-6周，而本方法仅需300元/样品，检测时间为1周），市场应用前景广。
（2）准确性高：本发明所涉及的方法通过与MLST和基于全基因组序列的同源基因序列分型结果相比较，显示分型分辨率显著高于MLST，与基于全基因组序列的同源基因序列分型近似，说明本发明的方法具有较高准确性，具有较大的临床诊断和检测尿路感染大肠杆菌的应用潜力。
（3）有助于指导临床针对尿路感染正确治疗，有效用药：虽然临床诊断尿路感染并不困难，但尿路感染病原微生物种类繁多，如果想有效治疗，需要针对不同病原微生物对症用药，这时就需要对感染样本进行实验室检查，对感染病原微生物进行种属及分型鉴定。快速准确的分型方法该可提示所感染细菌的菌株型别，有助于对感染菌株的耐药性和毒性进行判断，从而指导用药。
附图说明：
图1，根据尿路感染大肠杆菌的三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列所构建的分子进化树。
图2，尿路感染大肠杆菌的菌毛抗原类型图，22种菌毛类型分别为CS1-like，Mat，Type 1，F1C，F9，Ycb，Auf，Sfm，LPF，ECSF_0165，ECSF_4008，CS12，AFA，Yad，Yeh，Yeh-like，F17-like，Yfc，P，Pix，Yqi，Ybg。
图3，根据尿路感染大肠杆菌的MLST基因序列所构建的分子进化树。
图4，根据尿路感染大肠杆菌的基因组同源基因序列所构建的分子进化树。
具体实施方式：
为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，结合具体实例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
基因组的提取
1)从菌种保存管中取少许菌液，划线接种于Luria-Bertani固体平板，37℃，过夜培养。
2)用接种环挑取Luria-Bertani固体平板的单克隆菌落，接种于5mlLuria-Bertani液体培养基，37℃，过夜培养。
3)取1ml菌液至1.5mL离心管中，10000rpm离心5分钟积菌，去掉上清。
4)加250μL 50mM Tris-HCl (pH8.0)重悬，加10μL 0.5M EDTA(pH8.0)，充分混匀。
5)加15μL 20mg/mL溶菌酶，充分混匀，37℃保温20分钟。
6)加3μL 20mg/mL蛋白酶K，温柔混匀。
7)加20μL 10%SDS，50℃水浴1小时至溶液澄清。
8)加2μL 25mg/mL RNAase，65℃水浴20分钟。
9)加等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），10000rpm离心10分钟，上清液置新管，重复抽提一次。
10)加等体积氯仿：异戊醇（24：1），10000rpm离心10分钟，上清液置新管。
11)加2.5倍预冷的无水乙醇，轻摇，沉淀DNA。
12)用毛细管绕起DNA，并用70%冰乙醇洗涤。
13)65℃烘干，30μL TE回溶，通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：
引物的设计
从NCBI上下载的序列，结合实验室自测序列，针对尿路感染大肠杆菌编码22种编码菌毛ursher蛋白的基因（SEQ NO:1-6），尿路感染大肠杆菌菌毛抗原基因（yagV, fimF,fimH）（SEQ NO:7-50），设计特异性检测引物，引物序列如下表1所示：
表1尿路感染大肠杆菌菌毛抗原基因的特异性扩增引物序列
实施例3：
PCR产物的获得及测序
使用实施例2中所列引物，以尿路感染细菌的基因组为模板，进行PCR扩增反应。PCR体系为10uM 引物1μl、10×buffer 5μl、10mM dNTP 0.5μl、5 U/μl Taq 聚合酶0.5μl及1μl的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至50μl。PCR仪上扩增；反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为94℃，5分钟；变性温度和时间为94℃，50秒；复性温度和时间为50℃，45秒；延伸温度和时间为72℃，1秒；变性、复性、延伸的循环次数为30个循环；为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5分钟。
扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液以9：1的体积比混合；将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；目的条带进行切胶，使用康为世纪大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对切胶产物进行回收。回收后的产物进行Sanger法进行DNA双向测序。
实施例4：
对测序结果进行序列比对分析
对于GenBank中已公布基因组序列的尿路感染大肠杆菌，将其三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列和菌毛ursher基因序列下载。
将DNA双向测序结果用Staden软件进行序列拼接，校正。每株尿路感染大肠杆菌的三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列连接。将所测序的三种基因序列和所下载的三种基因序列用ClustalX进行序列比对，MEG5A，通过最大似然法进行进化树的构建，经过1000次验证。根据进化树的结果，初步确定尿路感染大肠杆菌的分型。
根据所下载的ursher基因序列类型及22种菌毛ursher基因在不同菌株中的扩增结果，确定尿路感染大肠杆菌所含有的菌毛类型。
结合三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）所确定的分型结果和菌株所含有的菌毛类型确定尿路感染大肠杆菌的分型。
实施例5：
基于菌毛多样性的分型结果与基于MLST的分型结果和基于基因组同源基因的分型结果的比较
对19株尿路感染大肠杆菌（11株的基因组序列由GenBank公布（表1），8株的基因组序列通过高通量测序法测定（表1）），比较了菌毛多样性的分型结果（图1和2），MLST的分型结果（图3）和基于基因组同源基因的分型结果（图4）。
实验的结果显示：
菌毛多样性的分型拓扑结构与其他两种分型方法类似，分型分辨率高于MLST分型结果，近似于基因组同源基因的分型结果。
表2：本实施例所使用的GenBank已公布的尿路感染大肠杆菌的基因组
表3：本实施例所使用的其他尿路感染大肠杆菌（临床分离菌株）
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津医科大学
<120> 一种基于菌毛多样性的尿路感染大肠杆菌的分型方法
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctggcgg cacctttgac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttagtccgcc gaagggggc 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgattgtaa tgaaacgagt tattac 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttattgataa acaaaagtca cgcc 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatgtctacg ctactgtctc 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgtgcctga acctgaata 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctatctgtc gctgaataac 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caccgcctga ttatcgtat 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctggaagac aacaacct 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ataactgctg ctgactctc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgaaggaac gctgaagta 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctgaacggaa tgctgaca 18
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gatagttata ccgatggcga ta 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccttgcgtag aatagcgata 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atgacggtga tgatgaagat 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggtaatgcct tgtgaatgg 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttcagacagg aacagcatt 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caccaacaga accactact 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gtaacagagg taatggtaac g 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agaggaagcg aatggaatc 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gccgaggtca gtgtattc 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cgttgtatcc aggtgctta 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccttcattct gtcttcggat a 21
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
atcgctgttg gcaatacc 18
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ttcagtcttc agcagcaat 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tcgtaatggt attcgtggtt 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cataccgata ttccactgag a 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tccactacaa tagcaccatc 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gatagaggtg cgtcagaac 19
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctcagactca gcgtggta 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ggcgtagcga ataccaat 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
actgaccgtg acctgatt 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ccagcggtaa gcaatgtt 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gcataaggca ccagatagg 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
aatgatacca gacacgaagg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ccagacaact aatccactac t 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gcggcttatc gttattcatc 20
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gtatcactca ggtcattact ca 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cctacaacgg ttcctacg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tgccttcatc atccacaat 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cggactgatg ctggatta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gctactgact gcgtgata 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cgtcacactc aacaagaac 19
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cggtaataac tgctcacatc 20
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ggatgacgac gaagagaat 19
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
cctgaatacc gctgagataa 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
aagtgacgga agaagatgg 19
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
tggtgctgtg attactgtt 19
Claims (3)
1.一套用于尿路感染大肠杆菌分型的特异性引物，其特征在于具有如SEQ NO:1-50所示序列。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物进行尿路感染大肠杆菌分型的方法，其特征在于，该方法通过三种菌毛抗原基因yagV, fimF, fimH的进化分析以及菌毛抗原类型的鉴定确定尿路感染大肠杆菌的型别，包括样品预处理—扩增—电泳检测结果—切胶回收电泳样品—测序—序列比对，构建进化树，按如下的步骤进行：
（1）基因组的提取
（2）引物的设计：针对尿路感染大肠杆菌编码22种菌毛ursher蛋白的基因，尿路感染大肠杆菌菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH），设计特异性检测引物，引物序列如SEQ NO:1-50所示：
（3）PCR产物的获得及测序：
采用步骤（2）中所列引物，以尿路感染细菌的基因组为模板，进行PCR扩增反应，PCR体系为10uM 引物1μl、10×buffer 5μl、10mM dNTP 0.5μl、5 U/μl Taq 聚合酶0.5μl及1μl的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至50μl，PCR仪上扩增；反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液以9：1的体积比混合；将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳10分钟，用DL2000 Marker进行对照；目的条带进行切胶，使用康为世纪大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对切胶产物进行回收，回收后的产物进行Sanger法进行DNA双向测序；
（4）对测序结果进行序列比对分析：
对于GenBank中已公布基因组序列的尿路感染大肠杆菌，将其三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列和菌毛ursher基因序列下载，将DNA双向测序结果用Staden软件进行序列拼接，校正，每株尿路感染大肠杆菌的三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）序列连接，将所测序的三种基因序列和所下载的三种基因序列用ClustalX进行序列比对，MEG5A，通过最大似然法进行进化树的构建，经过1000次验证，根据进化树的结果，初步确定尿路感染大肠杆菌的分型；
根据所下载的ursher基因序列类型及22种菌毛ursher基因在不同菌株中的扩增结果，确定尿路感染大肠杆菌所含有的菌毛类型；
结合三种菌毛抗原基因（yagV, fimF, fimH）所确定的分型结果和菌株所含有的菌毛类型确定尿路感染大肠杆菌的分型。
3.权利要求2所述的尿路感染大肠杆菌分型的方法，其中的扩增为：前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为94℃，5分钟；变性温度和时间为94℃，50秒；复性温度和时间为50℃，45秒；延伸温度和时间为72℃，1秒；变性、复性、延伸的循环次数为30个循环；为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5分钟。
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