WO2002038802A1 - Proceso para la tipificación rápida de microorganismos y juego de reactivos empleado - Google Patents

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WO2002038802A1
WO2002038802A1 PCT/CU2001/000008 CU0100008W WO0238802A1 WO 2002038802 A1 WO2002038802 A1 WO 2002038802A1 CU 0100008 W CU0100008 W CU 0100008W WO 0238802 A1 WO0238802 A1 WO 0238802A1
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microorganisms
pulse
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Lilia LÓPEZ CÁNOVAS
Ana María RIVERÓN ROJAS
David Higgison Clarke
Axel SÁNCHEZ ALONSO
Esther Orozco Orozco
Oscar ARENCIBIA DÍAZ
María Concepción ARIOSA ACUÑA
Hilda Teresa CLARK DONDÉRIZ
Regnar GIGATO PÉREZ
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Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to the Molecular Biology Branch and in particular provides a process, which includes the use of methods and procedures, and a set of reagents for the rapid typing of microorganisms.
  • the microorganisms can be yeasts, parasites and gram positive or negative bacteria and for their typing, electrophoresis mini-devices of pulsating fields of type CHEF and TAFE are used.
  • ECP Pulsed Field Electrophoresis
  • This method is considered the gold standard 'methods of molecular typing of microorganisms genome.
  • ECP typing is done by separating in gels the DNA molecules that are subjected to the action of electrical pulses in two different directions.
  • the band patterns that are obtained after electrophoresis of DNA samples from isolates of any microorganism unambiguously characterize their genetic endowment and are highly reproducible and discriminatory (Oliver DM, Bean P., J. Clin. Microbiol., 1999, 37: 6, 1661-1669).
  • Oliver DM Bean P., J. Clin. Microbiol., 1999, 37: 6, 1661-1669
  • ECP electrophoretic karyotype
  • the microorganisms can be yeast fungi, single-celled parasites, etc.
  • the band patterns of the restriction macrophages of said circular DNA are obtained. These patterns are called pulsotypes since they are obtained under conditions Experimental set.
  • microorganisms can be bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, etc. The comparison of the karyotypes of the different strains allows their characterization and differentiation. Similarly, it occurs with bacterial DNA restriction fragments. Thus, both molecular karyotypes and pulsotypes are used in the comparative study of fungi, bacteria and parasites.
  • the process of typing microorganisms through ECP includes the following steps and procedures:
  • ECP Pulsed Field Electrophoresis
  • FIGE ' Field Investment Gel Electrophoresis ', US Patent No. 4, 737,251, April 12, 1988
  • MiniTAFE and MiniCHEF mini-cameras (Riverón AM et al., Anal. Lett, 1995, vol. 28, pp1973-1991; European Patent Application EP 0 745 844, Bula 1996/49; US Patent Application 08 / 688,607, 1995; Cuban Patent RPI No. 02/95, 1995).
  • the systems commonly used to typify microorganisms by ECP The systems commonly used to typify microorganisms by ECP.
  • the most used systems to typify and study the genome of microorganisms are CHEF and TAFE, since they obtain straight patterns in any lane of the gel, which allows comparing the results of a run and between different electrophoretic runs.
  • CHEF cuvettes employ underwater gels up to 21 x 14 cm (width x length) placed horizontally and have a distance between opposite pairs of electrodes of 33.5 cm (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Catalog Numbers 170 -3670 to 170-3673, BioRad, pp 11, 1995). As mentioned, the CHEF system has been widely used to typify microorganisms.
  • bacteria Bacillly, S., Anal. Biochem., 1989, 177, pp 110-114; Dingwall A. and Shapiro L., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 1989, 86, pp 119- 123; Ferdows MS and Barbour AG, Proc. Nati. Acad. Sci.
  • the advantage of the CHEF equipment that has been used so far is that it allows the analysis of up to 40 samples at a time, which facilitates the comparative analysis of the electrophoretic patterns provided by the samples of numerous isolates.
  • the TAFE system was proposed by Gardiner KJ, Laas W and Pa terson D. in their publication in Somatic Cell Mol. Genet., 1986, 12, pp 185. They initially called that system "Vertical Pulsed Field Electrophoresis” (VPFE) and developed an apparatus that was protected by US Patent No. 4,740,283 April 26, 1988.
  • This system places two pairs of electrodes parallel to both sides of an underwater gel (10 cm long x 7.6 cm wide x 0.64 cm thick) that is placed vertically. That arrangement of electrodes generates lines of force in the electric field that cross the gel transversely, and force the molecules to migrate during each pulse through the thickness of the gel. In this configuration, molecules of equal size travel similar distances during electrophoresis and migrate following straight paths to the same height in the gel, regardless of the well in which the samples were deposited. This is one of the advantages of this system for typing, since it allows comparing the migrations of DNA that are contained in different samples.
  • TAFE Transverse Alternating Field Electrophoresis System
  • FIGE has also been used to quickly type bacteria (Goering RV and inters MA., J. Clin. Microbiol., 1992, 30: 3,577-580; Grothues D. et al., J. Clin. Microbiol., 1988 , 26:10, 1973-1977).
  • the phenomenon of inversion of electrophoretic mobility has been described in FIGE which prevents a correct estimation of sizes and the comparison of the patterns of numerous samples.
  • One of the characteristics of this investment is the inability to predict when it will occur (Birren B.
  • ECP mini-teams In 1995, the miniECP, miniTAFE and miniCHEF versions were reported (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp1973-1991; European Patent Application EP 0 745 844, Bull 1996/49; US Patent Application 08 / 688,607, 1995; Cuban Patent RPI No. 02/95, 1995) in which most of the limitations of the listed ECP equipment were resolved. In them, electrophoresis of pulsating fields is performed in 4 to 6 hours, with 7 samples deposited in a minigel of 4 x 4 x 0.5 cm (length x width x thickness).
  • miniCHEF equipment In miniCHEF equipment, electric fields of up to 16 V / cm can be applied, which gives the minigeles an adequate resolution between the electrophoretic pattern bands in 2.7 hours. The little separation of its electrodes Opposite polarity allows the construction of small cuvettes and the use of low buffer volume to cover the electrodes.
  • a given voltage is applied in the mini- CHEF, that is, a certain value of electric field intensity ⁇ ', less heat is generated than would be generated if the same value of the CHEF equipment currently marketed is applied (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973-1991).
  • minigels when minigels are deposited more than 0.1 cm thick, it takes a long time to achieve an adequate resolution of the electrophoretic pattern.
  • the reported minigels only admit 7 samples (miniCHEF) and 13 samples (miniTAFE), which is a low capacity for analysis to typify microorganism isolates in clinical laboratories.
  • cerevisiae samples could be prepared without using any enzyme, but incubating the 4 h blocks in LETK (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 600 mM KCI, pH 7.5), 2 hours in NDS ( 10 mM Tris, 500 mM EDTA, 1% sarcosyl, pH 9.5) and 4 hours in NDS containing 4 M urea (NDSU), which gave a 10 h sample preparation time (López-Cánovas L, et al. , Anal. Lett., 1996, 29:12, 2079-2084).
  • LETK 10 mM Tris, 500 mM EDTA, 600 mM KCI, pH 7.5
  • NDS 10 mM Tris, 500 mM EDTA, 1% sarcosyl, pH 9.5
  • NDSU NDS containing 4 M urea
  • molds for their formation.
  • These molds can be reusable or disposable. Reusable molds should allow sterilization by any means. This is important when working with samples of pathogenic microorganisms.
  • the disposable mold is simpler, but it generates a dependency on the part of the user and could be a limiting step in laboratories with few resources.
  • the existing molds are the following: a) those that form similar and independent blocks (U. S Patent, No. 4,473,452, Sep. 25, 1984); b) those that form flat and long strips that are cut to form independent blocks; c) those that form long agarose rods or rods that are cut to form independent blocks (Birren B and Lai E.
  • Pulsed Field Gel Electrophoresis a practical guide, Academic Press, Inc. San Diego, California, 1993, pp 29-30 ). They generate samples that, in general, are larger than the gel wells. Therefore, for the blocks to have the dimensions of the gel wells, it is necessary to cut them with a scalpel or any other implement (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide pp 40, Section 7. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673 Bio-Rad. 1995). However, not all manually cut blocks remain with similar dimensions. This inequality influences the quality of the electrophoretic pattern, since the resolution of the molecules in the gels depends on the thickness of the sample that is deposited in the gel.
  • the selection of the experimental conditions of the ECP The selection of the experimental conditions is complex. There are methods that allow you to select the run conditions in ECP equipment.
  • the CHEF Mapper of the Bio-Rad has an auto-algorithm option and an interactive algorithm option (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Pp 31-40 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995).
  • the two options allow you to calculate the pulse times, the duration of the pulse ramps, the reorientation angle, the electric field and the optimal run time to separate the DNA molecules from a given sample.
  • the interactive algorithm allows to vary the type, temperature and concentration of the buffer and the type and concentration of agarose.
  • Both algorithms work on the basis of empirical and theoretical data collected during 5 years of experiences (Bio-Rad Catalog. Life Science Research Products. Bio-Rad Laboratories, pp185. 1998/99), but the manufacturers themselves recommend that the autoalgorithm be enter sizes larger and smaller than those that you want to separate. Also, that it is considered that if the size range that is introduced, such as data in the autoalgorithm and in the interactive program, is large, the algorithms can give erroneous results, such as the inversion of the mobility of the molecules in the center of the gel.
  • Equations have been proposed that describe the migration of DNA molecules when a single ramp of electric pulses and any electric field and temperature value is applied (electrophoresis is performed in 1.5% Lachema agarose and in 0.5X TBE buffer (TBE 1X: 89 mM Tris, 89 mM Boric Acid, 2 mM EDTA) (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806: 123-139)
  • TBE 1X 89 mM Tris, 89 mM Boric Acid, 2 mM EDTA
  • Electrophoresis requires about 20 hours, sample preparation methods recommended by manufacturers and reported in the literature require the use of large amounts of enzymes (For example, 80 mg / ml proteinase K) (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System Instruction Manual and Application Guide pp. 40-43 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995) and / or long incubation times. It is accepted that one of the factors that has limited the use of ECP for the typing of microorganisms is that it takes between 2 and 3 days to complete the analysis of the isolates. This has reduced the ability of laboratories to analyze a large number of samples (Olive DM and Bean P, J. Clin. Microbiol., 1999, 37: 6, 1661-1669). Essence of the invention
  • the present invention provides a process and a set of reagents that allow to isolate microorganism isolates in a working day (between 7 and 13 hours) by obtaining the patterns of bands typical of the separation of DNA molecules when subjected to pulsating field electrophoresis in miniequipments.
  • a method is provided that in 60 minutes, at most, provides intact and immobilized DNA samples in miniblocks of some gel starting from cells that are treated with solutions that do not contain hydrolytic enzymes, being the previous treatment or after immobilization of said cells.
  • the cells can be yeasts, parasites and gram positive and negative bacteria and are immobilized in some gel, by using a sterilizable mold of a flexible material that provides miniblocks whose thicknesses are homogeneous and can be between 0.03 and 0.1 cm depending on the dimensions of the mold to be used.
  • a sterilizable mold of a flexible material that provides miniblocks whose thicknesses are homogeneous and can be between 0.03 and 0.1 cm depending on the dimensions of the mold to be used.
  • Predictive methods of linear DNA migrations are provided. The methods were conceived on the basis of theoretical equations that allow calculating the migrations of all DNA molecules in any condition of electric field, temperature, pulse duration, pulse ramps and electrophoresis in the CHEF system.
  • the process allows to study up to 27 samples of immobilized DNA of microorganisms that are a) prepared by the non-enzymatic procedure, b) separated in the minigels of the mini-equipment after selecting, by the predictive methods mentioned, the optimal conditions that will be applied during the electrophoresis c) analyzed their sizes using the methods of analysis of the migrations of the linear molecules of DNA that were deposited in the wells of the minigel, subjected to the action of two electric fields in said mini-equipment and revealed in the gel by any staining procedure.
  • the sample preparation method provided in this invention consumes 60 minutes at most, it is simple and cheap, as it does not require lytic enzymes or proteases in the incubation solutions of the microorganisms and provides intact and immobilized DNA.
  • the intact molecules are digestible with restriction enzymes and when said samples are subjected to pulsed field electrophoresis, the intact DNA or its restriction fragments migrate in the minigeles providing the band patterns corresponding to their molecular karyotypes or pulsotypes.
  • the method is based on the chemical modification of the bacterial wall that allows the lysis of the microorganisms, or the passage of small effector molecules to the target molecules within the cell, as well as the elimination of undesirable intracellular components by dialysis. In the miniblocks where the cells were immobilized, intact immobilized DNA is obtained.
  • the method contemplates the following general steps:
  • microorganism cells are initially isolated from fluids of hospitalized persons, from a biotechnological strain or from experiments in a common laboratory of molecular, genetic or other biology.
  • the cells are grown in liquid or solid media provided they are of the appropriate composition for each microorganism.
  • the cells are a) immobilized and incubated in the non-enzymatic solutions, or b) incubated in the solution (s) and subsequently immobilized.
  • the miniblocks containing the cells are incubated for 30-60 minutes at 45-50 ° C in the non-enzymatic solution.
  • the cells are first incubated in the non-enzymatic solution for 5-30 minutes at 50 ° C and then immobilized in agarose miniblock.
  • the cells are dialyzed against the electrophoresis buffer if it is to be performed, or against the preservation buffer if they wish to store, or against the restriction buffer if they are to be digested.
  • the organisms that can be incubated in the non-enzymatic solution prior to immobilization are Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorph, P ⁇ chia pastoris and Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Entamoeba Histolytics should be immobilized first and then incubated in non-enzymatic solutions. Table I presents the most effective solutions for washing the collected cells:
  • Non-enzymatic solutions for the incubation of cells or miniblocks are characterized by containing anionic detergents, a chelating agent, an agent capable of competing in the formation of hydrogen bonds and Tris buffer.
  • anionic detergents a chelating agent
  • Tris buffer The most efficient contains: 1% sarcosyl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris-base, 4 M urea and its pH is 9.5 (NDSU).
  • nonidet P-40 is added to the previous solution (NDSUPIus).
  • microorganisms such as Escherichia coli
  • a non-enzymatic lysis solution containing 1% sarcosyl, nonidet
  • the preservation buffer of miniblocks containing immobilized DNA is TE-
  • the procedure to immobilize the cells in agarose miniblock is to use a sterilizable mold of flexible material. This is a sheet of silicone, rubber or other flexible material up to 0.5 cm thick (see the example in embodiments
  • the sheet has any shape and size in the other dimensions. In the sheet there are multiple square depressions stamped that can be up to 0.3 cm wide and 0.03 to 0.1 cm deep. To pour the agarose cell suspension the mold is pre-set at 42 ° C by placing it on a surface at that temperature, then the suspension is poured into the mold and with a spatula it is distributed in the depressions. The mold is then covered with a lid that can be made of glass, plastic, acrylic or any other material and placed between 4 -15 ° C to gel the miniblock. The miniblocks of homogeneous sizes that are generated are extracted from the flexible mold by holding it by the edges and twisting it inside a container containing the non-enzymatic solution for the treatment of said miniblocks.
  • the suspension is prepared in such a way that between 0.12 and 3 x 10 8 bacteria, 8 x 10 7 yeasts or 6 x 10 4 trophozoites of Entamoeba histolytica are immobilized for each 0.3 x 0.07 cm gel miniblock. All the mentioned microorganisms can be prepared by using this type of mold. Also with this type of mold, mini-blocks containing any other type of cells can be prepared.
  • the method for selecting the optimal electrophoresis conditions that will be applied in the mini-equipment is based on calculating the migrations of the linear DNA molecules by employing a group of theoretical equations that describe the migration, the reorientation times and the migration rates of said DNA molecules in the miniCHEF minigel.
  • the equations are fed with electric field and temperature values between 1 - 20 V / cm and 4 - 30 ° C and it is assumed that 1.5% agarose is used in the electrophoresis process and as a 44.5 mM Tris electrophoresis buffer, acid Boric 44.5 mM, 1 mM EDTA, pH 8.3 (TBE 0.5x).
  • the theoretical equations that describe the migration of DNA are as follows:
  • tr reorientation time (sec.), vr. migration speed during reorientation (cm / sec.), vm: migration speed after reorientation (cm / sec.),
  • N number of pulse ramps.
  • a series of pulse times (tp r ) are calculated, which begin for 1.5 times less time than the reorientation time of the smaller molecule and end with 1.5 times more than the reorientation time of the larger molecule. Linear time increments are used in the tp r series calculated.
  • the maximum electrophoresis time is estimated from the calculation of the migration of the smaller linear DNA molecule. This is done as follows:
  • Equations 2 and 3 are defined as the electric field and temperature values of the buffer to be used.
  • the program would also provide a quick means of performing the calculations required to implement this part of the invention.
  • the graphic representation of the distances that the linear DNA molecules would migrate, under the specified conditions of the electrophoresis process, is carried out: i) drawing a minigel of the dimensions of the real minigel and drawing in said minigel the wells where the samples were supposedly deposited , ii) placing lines below each well that represent the bands of the molecules of each size that would separate. Each line is the width of the well and they are separated from the well the distances that the molecules of each size would migrate in the real minigel. iii) assigning to each hypothetical line or band a color that depends on the size of the molecules it contains. That is, using a color code that is characterized because each color identifies molecules of a given size.
  • This program is a method to choose the appropriate experimental conditions to separate intact chromosomal DNA molecules or large DNA fragments by Pulsed Field Electrophoresis in the miniCHEF.
  • different electrophoretic patterns are obtained that allow identifying the conditions that would separate the molecules of interest in the CHEF and miniCHEF.
  • This procedure does not waste reagents or biological samples. It is based on the theoretical equations that describe the migration of linear DNA in miniCHEF. These equations were obtained from real linear DNA migration data in the miniCHEF. Therefore, they correctly describe the migration of these molecules when subjected to this type of electrophoresis and do not give anomalous results of mobility inversion in the center of the gel.
  • miniCHEF and miniTAFE type mini-buckets are used in which the distance between the pairs of opposite electrodes does not exceed 11.6 cm and 7.8 cm respectively and in which it is possible to apply up to 20 V / cm in the miniCHEF and 22 V / cm in the miniTAFE.
  • the electrophoresis equipment that was selected to implement this part of the invention includes the miniCHEF and miniTAFE mini-buckets previously described by Riverón et al. 1995 (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp1973-1991; European Patent Application EP 0 745 844, Bull. 1996/49; US Patent Application 08 / 688,607, 1995; Cuban Patent RPI No. 02/95, 1995) and whose content is fully incorporated herein by reference.
  • the floor of the miniCHEF tray changed slightly.
  • An agarose minigel was used that can have from 4 to 7 cm wide and in which you can place from 12 to 27 samples.
  • the concentration of agarose in the minigel can vary from 0.8 to 1.5%, with a preferred concentration of 1.5%.
  • the TBE 1X buffer comprises a solution of 0.089 M Tris base, 0.089 M Boric Acid and 0.002 M EDTA (sodium salt of ethylene diamino tetraacetic acid) and can be used at concentrations between 0.25 and 1X, but preferably at 0.5X.
  • the buffer temperature can range between 4 and 30 ° C.
  • TAX 1X buffer (0.04 M Tris-Acetate and 0.001 M EDTA) can also be used.
  • any equipment constructed for this purpose can be used, which also includes the equipment described by Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, 28: 5; 845-860; and Riverón AM ⁇ t al., Anal. Lett., 1995, 28:11, 1973-1991.
  • any power source with a maximum output of 300 watts of power can be used.
  • the agarose miniblocks are placed in the wells that form the teeth of the comb that is used to form the minigel. You can use different combs and place wider or less wide samples, depending on the size of the blocks that have been prepared. Ethidium bromide is used to stain the molecules present in each band of the minigel.
  • the minigel is illuminated with ultraviolet light (UV transilluminator) and the images are collected by a camera sensitive to ultraviolet light using a 550 nm filter. Any other staining procedure can also be used.
  • the strength of the electric field, the buffer temperature, the pulse ramps, the electrophoresis times and the number of electric pulses applied on each ramp come from the simulator results (or method of selecting the optimal conditions of molecule separation) , or the results of any other method that the experimenter uses, including his empirical experience.
  • the buffer concentration must be 0.5X TBE
  • the agarose gel (Lachema) must be 1.5%
  • the electric field must be up to 20 " V / cm
  • the temperature must be between 4 and 30 ° C and the camera must be the miniCHEF.
  • the same electric field conditions may apply and temperature provided by the simulator, but the amount of pulses of each ramp must be increased by 1.5 times and the duration of the pulses by 1.2 times. Under other conditions of electric field forces and temperature, typical band patterns of the molecules contained in the separating mixture can also be obtained in the mini-equipment.
  • the preferred method for analyzing the patterns of bands that are obtained after the electrophoresis process is based on measuring the migrations of the linear DNA molecules in the minigel, and using equations 1-5 to calculate the size of the molecules
  • the method starts from the base that the band patterns have been obtained in the minigeles after the electrophoresis process in the miniCHEF equipment at an electric field between 1 and 20 V / cm, temperature between 4 and 30 ° C, agarose (Lachema) 1.5%, 0.5X TBE buffer and any number of ramps
  • the method consists of: i) Measuring the distances migrated by the linear DNA molecules in the minigeles after the electrophoresis and staining of the bands in said minigeles.
  • Equations 2, 3 and 4 are used to estimate vr, vm and tr respectively, of the hypothetical DNA molecule.
  • D and Dt are compared. If Dt is greater than D, the size of the hypothetical DNA molecule is increased by 1000 bp. 5) The sections 2) to 4) are repeated until the estimated migration for the hypothetical DNA molecule is less than or equal to the distance (D) migrated by the real molecule in the minigel.
  • Process 1) - 6) is repeated for the distances measured in all bands, that is, for all molecules separated in the minigel.
  • the final description of the electrophoresis process can be given not only by the electrophoretic pattern, but by a matrix that contains in the rows the order number of each separated fragment or molecule, from the bottom to the top, and in the columns the sizes, reorientation times and migration rates of all the separated molecules in the bands of the revealed electrophoretic pattern.
  • the preferred method of practicing this part of the present invention could be a computer program that would provide a quick means of performing the required calculations. That is, a means of calculating the size and kinetic parameters of the groups of fragments or intact DNA molecules separated at the end of the electrophoresis.
  • a program was created that allows the user to change the following variables: 1- The distances migrated in the minigel for each group of molecules, or position in the gel of each of the bands of the pattern.
  • Example 1 Sterilizable mold to prepare the samples.
  • FIG. 1 An exemplary embodiment of a sterilizable mold of flexible material (silicone, rubber or other material) for preparing the immobilized DNA samples is shown in the scheme of Figure 1.
  • the sheet (1) has 49 depressions (2).
  • the cell suspension is poured into agarose and this is distributed throughout the mold with the special spatula (4).
  • the sheet (1) is then covered with the lid (3) and the miniblocks (5) containing immobilized cells are obtained.
  • the sheet was made of molten silicone, which was poured into a mold until the sheet (1) was formed.
  • the dimensions of each miniblock are 3 x 3 x 0.7 mm (length x width x thickness).
  • To extract the mini-blocks (5) from the sheet (1) it is placed in a container that contains a solution and is twisted by holding it at the ends, so that all the mini-blocks (5) detach from it and fall into the solution .
  • the width of the same can vary from 1.5 mm to the width of the minigel, while its thickness can vary from 0.5 to 1.5 mm. You can also vary the amount of depressions that are stamped on the bottom of the sheet.
  • Example 2 Non-enzymatic preparation of intact and immobilized yeast DNA molecules from cultures in liquid medium. Different yeasts (S. cerevisiae, H. polymorph and P. pastoris) were grown in YPG liquid medium (YPG: 10 g of yeast extract, 20 g of glucose and 10 g of peptone in a liter of distilled water) at 30 ° C and with agitation until the late exponential phase. Cells were collected by centrifugation and washed with 0.05 M EDTA, pH 7.5 (Washing solution of Table I). Intact and immobilized DNA is obtained by performing any of the following two variants:
  • Variant 1 The cells are incubated in suspension and then immobilized in miniblock.
  • Variant 2 The cells are immobilized and the mini-blocks containing the cells are incubated.
  • the immobilization is performed by preparing a suspension of cells in agarose at a rate of 1.3 x 10 10 cells per milliliter of low melting point agarose prepared at 1.5% in 0.125 M EDTA solution.
  • the cell suspension is poured into the sheet (1) of the mold shown in Figure 1, it is covered with the lid (3) and is expected until the agarose solidifies and the miniblock (5) is formed.
  • the cell button (from 100 ml of culture) is resuspended in 5 ml of NDSU and incubated for 5 minutes at 50 ° C.
  • the suspension is diluted five times with TE-100 and the cells are collected by centrifugation and immobilized in agarose miniblock as described above.
  • variant 2 After the cells are harvested and washed (see Table I) they are immobilized in agarose miniblock. The mini-blocks containing the cells are incubated for half an hour in NDSU at 45 ° C. After treatments for either of the two variants, the miniblocks are washed twice 5 minutes with TE-100 (0.01 M Tris-base, 0.1 M EDTA, pH 8.0) at 50 ° C and stored in fresh TE-100 buffer at 4 ° C. Before electrophoresis, the miniblocks are incubated 10 minutes in 0.5X TBE at room temperature.
  • Figure 2 shows the photograph of the minigel (10) where the separation into stripe patterns of chromosomes (12) and mitochondrial DNA (13) of S. cerevisiae was performed.
  • FIG. 1 Samples were prepared by immobilizing the cells and subsequently incubating them in NDSU (variant 2).
  • the 7 cm wide minigel of the miniCHEF was used, which admits up to 27 samples in its wells (11).
  • the electrophoresis conditions were 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose, 0.5X TBE, 50 second pulse time and 4 hours of electrophoresis.
  • Figure 2 also shows the photograph of a lane (16) of the miniCHEF minigel where the chromosomes were separated from H. polymorph. In it, chromosomes (17) and mitochondrial DNA (18) separated into a band pattern.
  • the chromosomes of H. polymorph were prepared according to variant 2. They were separated in the miniCHEF at 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose, 0.5X TBE, 120 second pulse time and 4 hours of electrophoresis.
  • the S. cerevisiae chromosomes were also separated in the minigel (20) of the miniTAFE shown in Figure 2.
  • the band patterns of the chromosomes (21) and mitochondrial DNA (22) are shown.
  • Samples were prepared by variant 1, that is, by incubating them in NSDU and then immobilizing them. They were deposited in the 13 wells (23) that form the comb that was used.
  • the minigel is 7 cm wide and in the miniTAFE 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose, 0.5X TBE, 60 second pulse time and 6 hours of electrophoresis were applied.
  • Example 3 Non-enzymatic preparation of intact and immobilized DNA of Pseudomonas aeru ⁇ inosa from cultures in solid medium and liquid medium.
  • a cell suspension was prepared at a rate of 2 x 10 9 cells per ml of low melting point agarose at 1.5% in 0.15 M NaCl.
  • the cell-agarose mixture was poured into the sheet (1) of the mold of Figure 1, covered with the lid (3) and allowed to solidify until the miniblocks (5) were formed.
  • the miniblocks were incubated in NDSUPIus for half an hour at 50 ° C. Subsequently, the miniblocks were washed twice for 10 minutes with TE-100 at 50 ° C and stored in fresh TE-100 buffer at 4 ° C until they were digested with restriction enzymes.
  • the miniblocks were washed and incubated for 10 minutes in digestion buffer of restriction enzyme Xba I and each was digested with 20 U of said enzyme at 37 ° C for 2 hours.
  • the restriction fragments obtained from samples containing cells grown in liquid or solid medium were separated in the miniCHEF at 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose and 0.5X TBE applying pulse ramps of 20, 15, 10, 5 and 3 seconds and 5, 15, 320, 1020 and 100 pulses, respectively.
  • Figure 3 shows the patterns of bands (26) separated in the minigel (25) of the miniCHEF.
  • the P. aeruginosa mini-blocks (27) come from cultivation in liquid LB medium, while the mini-blocks (28) come from cultures in solid LB medium. Also shown in the figure are the sizes of the separated DNA fragments.
  • Example 4 Non-enzymatic preparation of intact and immobilized DNA of Staphylococcus aureus from cultures in solid medium.
  • Variant 1- The suspended cells are treated and then immobilized.
  • Variant 2-Cells are immobilized and miniblocks containing cells are treated.
  • the immobilization is performed by preparing a suspension of cells in agarose at a rate of 4 x 10 10 cells per milliliter of 1.5% low melting point agarose in wash solution (Table I).
  • the cell suspension is poured into the sheet (1) of the mold of Figure 1, covered with the lid (3) and allowed to solidify until the miniblock (5) is formed.
  • the cell button is resuspended in 3 ml of NDSUPIus and incubated at 50 ° C for 30 minutes.
  • the suspension is diluted five times with TE-100 and the cells are collected by centrifugation and immobilized in agarose miniblock.
  • the cells are harvested and washed, they are immobilized in agarose miniblock.
  • the mini-blocks containing the cells are incubated for one hour with NDSUPIus at 50 ° C.
  • the miniblocks are washed twice for 10 minutes with TE-100 at 50 ° C and then for 10 minutes in digestion buffer of the restriction enzyme Sma I on ice and digested with 20 U of said enzyme at 37 ° C for 2 hours.
  • Figure 4 shows the minigel (30) where the restriction macrophages of S. aureus DNA were separated into a band pattern (31).
  • Samples (32) were prepared by variant 2, while (33) were prepared by variant 1.
  • Electrophoresis conditions were 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose, 0.5X TBE, pulse times 1, 5, 9, 13, 17 and 21. All ramps received 130 pulses.
  • the figure shows the size values of the separated fragments.
  • Example 5 Non-enzymatic preparation of intact and immobilized DNA from Entamoeba histolytica.
  • E. histolytica clone A trophozoites were grown in TY1-S-33 medium until the exponential phase of growth. The trophozoites were harvested by cooling the culture flasks and collected by centrifugation. Subsequently, they were washed with cold PBS and after collection the cells were incubated for 15 minutes in a hypertonic solution (0.5 M NaCI, 0.05 M EDTA, 0.01 M Tris, pH 7.0) at a rate of 2.5 x 10 6 trophozoites per milliliter of solution. Finally, 10 8 trophozoites were resuspended in a milliliter of 2% low melting agarose dissolved in hypertonic solution.
  • a hypertonic solution 0.5 M NaCI, 0.05 M EDTA, 0.01 M Tris, pH 7.0
  • the suspension was poured into the flexible silicone mold of Figure 1 and the miniblocks were allowed to solidify at 4 ° C.
  • the miniblocks were incubated with NDSU (0.01 M Tris-base, 0.1 M EDTA, 1% sarcosyl (w / v), 4 M urea, pH 9.5) at 45 ° C for one hour. Subsequently, 10 minutes were incubated in 0.5X TBE at room temperature and electrophoresis was performed. If the samples are to be stored, they are washed twice for 5 minutes with TE-100 (0.01 M Tris-base, 0.1 M EDTA, pH 8.0) at 45 ° C and stored at 4 ° C in fresh TE-100.
  • Figure 5 shows the photo of a mini-tablet (35) of the miniTAFE where E. histolytica (38) and S. cerevisiae (37) DNAs and phage DNA concatamers were separated into band patterns (36). (39).
  • the electrophoresis was carried out at 9.03 V / cm electric field, 120 seconds of pulse time, 20 ° C, 1% Seakem agarose, 0.5X TBE buffer and 6 hours of electrophoresis. 0.1 cm thick samples were deposited.
  • Example 6 Design of electrophoretic runs in the miniCHEF. The selection of experimental conditions through the use of the simulator (method of selecting the optimal separation conditions).
  • the pulse time ramps needed to separate the S. cerevisiae chromosomes were simulated in a miniCHEF cuvette that is 11.6 cm apart between the opposite electrodes. It was desired to obtain an 11-band pattern in which all S. cerevisiae chromosomes are present. It was assumed that the separation would be carried out in a 1.5% agarose minigel and that the run buffer to be used would be 0.5X TBE.
  • the values reported by Goffeau (Goffeau A et al., Science, 1996, 274: 546) were taken as sizes of the chromosomes of S. cerevisiae: 230 kb (chrom. I), 270 kb (chrom. VI), 315 kb (chrom.
  • the simulator determined that for an electric field strength of 10 V / cm and a buffer temperature of 20 ° C the optimal separation conditions of all S.
  • cerevisiae chromosomes in a single band pattern were achieved by applying four ramps of 5, 40, 75 and 110 s of pulse time and 42 pulses in each of them.
  • Migration results, reorientation times, migration speeds and the color code used to identify chromosome sizes are shown in Table II.
  • the flow chart of the simulator provided in this invention is shown in Figure 7. It initially shows the calculation of the pulse ramp from migration data or size data.
  • the simulator When the user provides the migration data, the simulator initially estimates the sizes, based on said data and subsequently estimates a set of linear pulse ramps. When the user provides size data, the simulator estimates the ramps directly.
  • the criterion of stopping the increase in the number of pulses in this example is that the smaller molecule migrates 2.5 cm.
  • the simulator gives the final result that would be seen in the minigel (see pattern of bands in minigel 43 simulated in the hypothetical minigel 42 of Figure 6) if these pulse ramps and pulse numbers were applied to the set of specified molecules by the user It also provides quantitative data. This part of the diagram is not shown because the solution is trivial.
  • Example 7 Analysis of band patterns of karyotypes or pulsotypes.
  • Figure 8 shows the electrophoretic karyotype (61) of S. cerevisiae obtained in the miniCHEF by separating said chromosomes in 1.5% agarose, 0.5X TBE, at 10 V / cm, 20 ° C, 2.95s and 453 pulses and 21.56 s and 453 pulses.
  • Table III Sizes, reorientation times and migration rates of the molecules contained in each band.
  • FIG. 10 shows the patterns of bands (87) separated in the minigel (86) of the miniCHEF.
  • the separation achieved in the miniCHEF of the restriction fragments with Xba I from the total DNA of the E. coli isolates INN3 (88) and INN7 (89) allowed to identify six common fragments among them (90) and therefore, according to Tenover (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33: 9, 2233-2239) classify them as two different subtypes of E. coli.
  • Restriction fragments were separated in the miniCHEF at 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose and 0.5X TBE. applying pulse ramps of 25, 20, 15, and 5 seconds and 35, 40, 50, 140 and 800 pulses, respectively.
  • Figure 1 Scheme of a mold to melt the samples.
  • the lower part shows the sheet where the depressions are stamped where the cell suspension is poured into agarose, in the upper part the mold cover and a miniblock are shown. On the right is shown the spatula that allows to distribute the cell-agarose suspension.
  • Figure 2. Photograph of the stripe patterns of the S. cerevisiae and H. polymorph chromosomes when separated into miniCHEF and miniTAFE minigeles.
  • the upper part shows the 7 cm wide miniCHEF minigel, its 27 wells and the stripe patterns of the S. cerevisiae chromosomes. In the center of the figure, the 4 cm wide minigel and the band pattern of the H. polymorph chromosomes are shown.
  • the samples were prepared by the non-enzymatic method by immobilizing the cells and then incubating them in NDSU.
  • the electrophoresis conditions were 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose, 0.5X TBE, 50 second pulse time and 4 hours of electrophoresis.
  • the mini-mini of the miniTAFE with the patterns of S. cerevisiae bands.
  • TBE 0.5X pulse time of 60 seconds and 6 hours of electrophoresis were used.
  • Samples were prepared by incubating the cells in NDSU prior to immobilization.
  • FIG. 3 Patterns of bands in the miniCHEF of the restriction macrophages of P. aeruginosa digested with Xba I.
  • the P. aeruginosa miniblocks that come from culture in liquid LB medium, while those on the right they come from cultures in solid LB medium.
  • the miniCHEF was used at 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose and 0.5X TBE, and pulse ramps of 20, 15, 10, 5 and 3 seconds and 5, 15, 320, 1020 and 100 pulses were applied respectively.
  • FIG. 4 Patterns of bands in the miniCHEF of the restriction macrophages of S. aureus DNA digested with Sma I. On the left are shown the band patterns of the first immobilized samples, and incubated in NDSUPIus later. On the right are the samples that are first incubated in NDSUPIus and then immobilized. In both cases the cells were cultured in solid medium.
  • the electrophoresis conditions were 10 V / cm, 20 ° C, 1.5% agarose, 0.5X TBE, pulse times 1, 5, 9, 13, 17 and 21. All ramps received 130 pulses.
  • FIG. 5 Photograph of the DNA band patterns of E. histolytica, S. cerevisiae and concatamers of phage DNA ⁇ .
  • the electrophoresis was performed in the mini-field of the miniTAFE at electric field 9.03 V / cm, 120 seconds of pulse time, 20 ° C, 1% Seakem agarose, 0.5X TBE buffer and 6 hours of electrophoresis. 0.1 cm thick samples were deposited. From left to right in the lanes are, Lane 1: Miniplugs with S.
  • the separation conditions predicted by the simulator were four pulse ramps of 5, 40, 75 and 110 seconds and 42 pulses in each of them.
  • the migration results and the color code used to identify the sizes are shown in Table II.
  • DNA that migrate in MiniCHEF minigels are the following parameters and variables: size (kb), reorientation times (tr), migration speed during reorientation (vr) and migration speed after reorientation (vm) of the molecules in the miniCHEF.
  • Tpr pulse time on each ramp
  • Np number of pulses on each ramp
  • gO g1, g2, g3, g4 coefficients obtained to describe the viscosity ( ⁇ ) as a function of the experimental temperature (T)
  • Dt theoretical distance calculated by the program
  • nr number of ramps
  • E electric field
  • L length of the DNA molecule contour
  • bp base pairs
  • Q net DNA charge.
  • Figure 9 Flowchart of the method that uses the migrated distances to estimate the size (kb), reorientation times (tr), migration speed during reorientation (vr) and migration speed after reorientation (vm) of the separate molecules in the miniCHEF.
  • tpr pulse time on each ramp
  • Np r number of pulses on each ramp
  • gO g1, g2, g3, g4 coefficients obtained to describe the viscosity ( ⁇ ) as a function of the experimental temperature (T)
  • D distance migrated in the gel
  • Dt theoretical distance calculated by the simulator
  • n number of ramps
  • E electric field
  • L contour length of the DNA molecule
  • bp base pairs
  • Q net DNA load.
  • DNA immobilized by the described procedures are free of restriction enzyme inhibitors and are digestible in 2 hours by restriction endonucleases, providing the typical band patterns in pulsed field electrophoresis in mini-teams.
  • the gel mini-blocks containing the immobilized DNA of the microorganisms have all homogeneous dimensions and do not have to be cut before the electrophoresis process, which guarantees reproducibility in the results.
  • 5- Molecular karyotypes or pulsotypes of up to 27 samples are obtained between 2.5 and 7 hours with little cost of buffer solution and separation matrix. The time depends on the microorganism studied and the mini-equipment used, as well as the electric field, temperature and selected pulse ramps.
  • Electrophoretic patterns can be simulated on a computer before the experiment as many times as desired, allowing to select the conditions of electric field, temperature and pulse ramps that provide the best separation between the molecules without spending reagents or biological sample.
  • the pulse ramps that must be applied are selected using an equation-based method that describes the migration of DNA molecules in the miniCHEF minigels, so it provides the optimal electrophoretic pattern of separation between the molecules.
  • no size markers are needed, since a method is provided that estimates these parameters from the distances migrated in the gel, under any field condition electric between 1 - 20 V / cm, temperature 4 - 30 ° C and pulse ramps.

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Abstract

Se provee un proceso para tipificar rápidamente levaduras, parásitos y bacterias. Comprende los siguientes pasos: a) Preparar, en 5 a 60 minutos, ADN intacto e inmovilizado mediante un método que emplea un juego de reactivos que solo contiene solución tampón, un detergente, un agente quelante y un agente que rompe los puentes de hidrógeno. b) Separar moléculas de ADN intactas o sus fragmentos de restricción usando miniequipos de electroforesis de campos pulsantes de los sistemas CHEF (Contour Clamped Homogeneous Electric Field) y TAFE (Transversal Alternating Field Electrophoresis) en tiempos comprendidos entre 2.5 y 7 horas. c) Seleccionar las condiciones óptimas que se aplicarán en el miniCHEF empleando un método que simula a priori los patrones electroforéticos que se obtendrían en dichos geles. d) Brindar los tiempos de reorientación, velocidades de migración y tallas de las moléculas sin emplear marcadores de tallas pero valiéndose de un método que analiza distancias migradas.

Description

DESCRIPCIÓN
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCESO PARA LA TIPIFICACIÓN RÁPIDA DE MICROORGANISMOS Y JUEGO DE REACTIVOS EMPLEADO.
ÍNDICE DE LA CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL DE PATENTES: C12N 1/00
CAMPO O RAMA DE LA TÉCNICA CON LA QUE SE RELACIONA LA INVENCIÓN: La presente invención se relaciona con la Rama de la Biología Molecular y en particular provee un proceso, que incluye la utilización de métodos y procedimientos, y de un juego de reactivos para la tipificación rápida de microorganismos. Los microorganismos pueden ser levaduras, parásitos y bacterias gram positivas o negativas y para su tipificación se utilizan miniequipos de electroforesis de campos pulsantes de tipo CHEF y TAFE.
NIVEL CONOCIDO DE LA TÉCNICA. CARACTERÍSTICAS DE LAS SOLUCIONES TÉCNICAS ANÁLOGAS.
Durante los últimos años se han incrementado las enfermedades infecciosas y han aparecido numerosos microorganismos multiresistentes a drogas (Acar J. y Courvalein P. pp 50-53; Aubry-Damon H. y Andremot A., pp 54-55; Trieu-Cout P. y Poyart C, pp 62-66, en 'La Rec erche', vol 314, 1998).
La aparición de brotes infecciosos ha generado la necesidad de tipificar los microorganismos causantes de las infecciones. La tipificación es el proceso mediante el cual las diferentes especies de microorganismos de un género dado se clasifican en subgrupos o subtipos diferentes (Busch U., Nitschko H., J. Chromatogr. B, 1999, 722: 263-278). La tipificación es epidemiológicamente importante para conocer el brote infeccioso, determinar el flujo o traspaso de los patógenos nosocomiales dentro de los centros de salud y la fuente de la infección. También es útil para reconocer nuevas cepas virulentas y monitorear programas de vacunación. Para que un proceso de tipificación sea considerado adecuado debe cumplir con los siguientes criterios (Maslow J.N., et al., Clin. Infect. Dis., 1993, 17:153-164):
1- Que brinde resultados no ambiguos para cada aislado que se analice.
2- Que brinde resultados reproducibles. 3- Que dentro de una misma especie diferencie las cepas no relacionadas. Existen varias formas de tipificar microorganismos. Algunas de ellas se basan en métodos que analizan caracteres fenotípicos (métodos fenotípicos) y otras en el análisis de caracteres genotípicos (métodos genotípicos). Los métodos fenotípicos detectan las características que son expresadas por los microorganismos, mientras que los genotípicos se basan en evidenciar las diferencias entre las dotaciones genéticas de los microorganismos. Por eso, los métodos fenotípicos tienen la desventaja de que proveen una medida indirecta de los cambios en la dotación genética, lo que no ocurre con los métodos genotípicos.
Uno de los métodos genotípicos de tipificación que más se ha empleado es la Electroforesis de Campos Pulsantes (ECP). Este método se considera el standard de oro de' los métodos de tipificación molecular del genoma de microorganismos. La tipificación mediante ECP se realiza separando en geles las moléculas de ADN que son sometidas a la acción de pulsos eléctricos en dos direcciones diferentes. Los patrones de bandas que se obtienen después de la electroforesis de muestras de ADN procedentes de aislados de un microorganismo cualquiera caracterizan inequívocamente su dotación genética y son altamente reproducibles y discriminatorios (Oliver DM, Bean P., J. Clin. Microbiol., 1999, 37:6, 1661-1669). Además, en un sólo gel pueden compararse los genomas completos de numerosos aislados. Se ha reportado que la ECP es el método óptimo de tipificación (Maslow J. N., Mulligan M.E., Arbeit R.D., Clin. Infect. Dis., 1993, 17: 153-164; Busch U, Nitschko H., J. Chromatogr. B., 1999, 722: 263-278). Los resultados que brinda la ECP dependen de las condiciones que se aplican en el equipo y del género y especie del microorganismo que se está estudiando. Así, a) Cuando el microorganismo posee varios cromosomas lineales inferiores a 10 Mb (1 megabase = 1000000 de pares de bases) se obtiene el patrón de bandas de sus cromosomas, el que se denomina cariotipo electroforético. Por ejemplo, los microorganismos pueden ser hongos levaduriformes, parásitos unicelulares, etc. b) Cuando el microorganismo posee un cromosoma circular grande se obtienen los patrones de bandas de los macrofragmentos de restricción de dicho ADN circular. Estos patrones se denominan pulsotipos ya que son obtenidos en condiciones experimentales determinadas. Por ejemplo, los microorganismos pueden ser bacterias tales como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, etc. La comparación de los cariotipos de las diferentes cepas permite su caracterización y diferenciación. De igual forma, ocurre con los fragmentos de restricción de ADN bacteriano. Así, tanto los cariotipos moleculares como los pulsotipos son utilizados en el estudio comparativo de hongos, bacterias y parásitos. El incremento de las aplicaciones prácticas de la electroforesis de campos pulsantes en la microbiología médica, entre otras, ha generado no solo la necesidad de mejorar los métodos de preparación de muestras, sino de diseñar a priori las condiciones de corrida que separan adecuadamente las moléculas y de disponer de mejores métodos para analizar los patrones electroforéticos resultantes.
En general, el proceso de tipificación de microorganismos mediante ECP incluye los siguientes pasos y procedimientos:
1) Preparar las muestras: Crecer los microorganismos en medio nutriente, inmovilizar las células en algún gel y obtener ADN intactos, desproteinizados e inmovilizados.
2) Diseñar las corridas electroforéticas: Seleccionar las condiciones experimentales que deben aplicarse en los equipos de ECP para obtener una separación óptima entre las moléculas.
3) Depositar las muestras en los geles y efectuar la electroforesis de campos pulsantes para separar las moléculas de ADN.
4) Analizar los patrones de bandas que se obtienen y comparar los resultados que brindan diferentes aislados de microorganismos.
A continuación se analizan los equipos y procedimientos empleados actualmente en la tipificación de microorganismos mediante ECP.
La electroforesis de campos pulsantes.
La electroforesis de campos pulsantes (ECP) data de 1984, cuando Schwartz y Cantor (Schwartz D.C. y Cantor C.R., Ce», 1984, 37, pp 67-75; U.S Patente, No. 4,473,452 de Septiembre 25 de 1984) observaron que las grandes moléculas intactas de ADN se resolvían en los geles de agarosa en patrones de bandas mediante la aplicación de pulsos eléctricos que alternaban periódicamente su dirección de aplicación. Los autores también determinaron que la separación de las moléculas dependía esencialmente de la duración de los pulsos eléctricos. Con posterioridad, se determinó que la geometría de las líneas de fuerza de los campos eléctricos alternantes, la intensidad de los mismos, la temperatura experimental, la fuerza iónica del tampón, la concentración del gel de agarosa y el grosor de los bloques de agarosa donde se inmovilizan las muestras eran factores importantes que influían en la resolución que podía ser alcanzada entre dichas moléculas (Birren B. y Lai E., Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide. P. 10. Academic Press, Inc., San Diego, California, 1993, pp 107, 111, 129, 131, 135; López-Cánovas et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp 123-139; López-Cánovas et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp 187- 197). Se han desarrollado varios sistemas para realizar ECP que poseen cámaras con diferentes ordenamientos de electrodos. Entre ellas se encuentran las cámaras con ordenamiento de electrodos OFAGE (del inglés, 'Orthogonal Field Alternating Gel Electrophoresis', Carie C.F. y Olson M.V., Nucleic Acids Res., 1984, vol. 12, pp 5647- 5664), CHEF ('Contour Clamped Homogeneous Electric Field', Chu G. Science, 1986, 234, p 1532), TAFE (Transversal Alternating Field Electrophoresis', U.S Patent. No 4, 740, 283 de abril 26 de 1988) y FIGE ('Field Inversión Gel Electrophoresis', U.S Patent No 4, 737,251 , Abril 12 de 1988) y las minicámaras MiniTAFE y MiniCHEF (Riverón AM et al., Anal. Lett, 1995, vol. 28, pp1973-1991 ; European Patent Aplicación EP 0 745 844, Bula. 1996/49; US Patent Application 08/688,607, 1995; Patente cubana RPI Nro. 02/95, 1995).
Los sistemas comúnmente empleados para tipificar microorganismos mediante ECP. Los sistemas mas utilizados para tipificar y estudiar el genoma de microorganismos son el CHEF y el TAFE, ya que en ellos se obtienen patrones rectos en cualquier carrilera del gel, lo que permite comparar los resultados de una corrida y entre corridas electroforéticas diferentes.
En el sistema CHEF los electrodos se disponen de forma hexagonal alrededor del gel y en cada uno de ellos se imponen voltajes que garantizan que el campo eléctrico sea homogéneo a todo lo largo y ancho del gel. Esto último es lo que permite la obtención de migraciones rectas y reproducibles en cualquier carrilera del gel. Las cubetas CHEF emplean geles submarinos de hasta 21 x 14 cm (ancho x largo) colocados horizontalmente y poseen una distancia entre los pares de electrodos opuestos de 33.5 cm (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673, BioRad, pp 11, 1995). Como se mencionó, el sistema CHEF ha sido ampliamente empleado para tipificar microorganismos. Por ejemplo: bacterias (Beverly, S., Anal. Biochem., 1989, 177, pp 110-114; Dingwall A. y Shapiro L., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 1989, 86, pp 119-123; Ferdows M.S. y Barbour A.G., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 1989, 86, pp 5960-5973; Kohara Y., Akiyma K., Isono K., Cell 50.1987, pp 495-508; Ohki M., Smith C.I., Nucleic Acids Res., 1989, 17, pp 3479-3490; Schoenline P.V., Gallman L.M., Ely B., Gene, 1989, 70 pp 321-329; Ventra L., Weiss A.S., Gene, 1989, 78 pp 29-36), Pseudomonas (Bautsch W., Grothues D. y Tummler B., FEMS Microbiol. Lett., 1988, 52, 255-258; Romling U. y Tummler B., J. Clin. Microbiol., 2000, 38,1, pp 464-465), S. cerevisiae (Albig W. y Entian K-D. Gene, 1988, 73, pp 141-152; Zerva L, et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34:12, 3031-3034), E. histolytica (Petter R. et al., Infecí. Immun., 1993, 61 :8: 3574-3577), S. pneumoniae (McEllistrem MC. et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38:1, 351- 353), S. aureus ( ichelhaus T.A. et al., J. Clin. Microbiol., 1999, 37:3, 690-693), M. tuberculosis (Singh S.P. et al., J. Clin. Microbio!., 1999, 37:6, 1927-1931), P. haemolytica (Kodjo A. et al., J. Clin. Microbiol., 1999, 37:2, 380-385), etc.
Debido a sus grandes dimensiones, las cubetas CHEF requieren gran volumen de solución tampón para cubrir su plataforma de electrodos, por lo que la intensidad de la corriente eléctrica puede llegar a alcanzar valores elevados aún empleando campos eléctricos que sean poco intensos, por lo que es necesario emplear fuentes de poder de elevada potencia de salida. Además, por las razones anteriores se genera gran cantidad de calor en esas cubetas, lo que impide que se reduzca la duración de la electroforesis a expensas de incrementar el campo eléctrico. Se conoce que el CHEF necesita al menos 20 horas de electroforesis para separar los cromosomas de Saccharomyces cerevisiae (moléculas menores de 1.6 Mb. 1 Mb = 106 pares de bases) en un patrón de 11 bandas y para tipificar diferentes cepas de esta levadura (Zerva L, et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34:12, 3031-3034). También es lento para separar los macrofragmentos de restricción de las moléculas de ADN bacteriano, pues necesita mas de 20 horas de electroforesis (van Belkum A et al., J. Clin. Microbiol. 1998, 36:6: 1653-1659; Marchadin H. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2000, 44:1 :213-216; Romling U y Tummler B., J. Clin. Microbiol., 2000, 38:1 : 464-465). Lo mismo ocurre cuando se estudian parásitos tales como Entamoeba histolytica, que se necesitan mas de 24 horas (Petter R. et al., Infect. Immun., 1993, 61 :8: 3574-3577). La ventaja de los equipos CHEF que se han empleado hasta el momento es que permiten analizar hasta 40 muestras a la vez, lo que facilita el análisis comparativo de los patrones electroforéticos que brindan las muestras de numerosos aislados. El sistema TAFE fue propuesto por Gardiner K.J., Laas W y Pa terson D. en su publicación en Somatic Cell Mol. Genet., 1986, 12, pp 185. Denominaron inicialmente ese sistema como "Vertical Pulsed Field Electrophoresis" (VPFE) y desarrollaron un aparato que fue protegido por la patente U.S. Patent, No 4, 740, 283 de abril 26 de 1988. En este sistema se ubican dos pares de electrodos paralelos a ambas caras de un gel submarino (10 cm de longitud x 7.6 cm de ancho x 0.64 cm de espesor) que es colocado verticalmente. Esa disposición de electrodos genera líneas de fuerza del campo eléctrico que atraviesan transversalmente el gel, y fuerzan a las moléculas a migrar durante cada pulso a través del grosor del gel. En esta configuración las moléculas de igual tamaño recorren distancias similares durante la electroforesis y migran siguiendo trayectorias rectas hasta la misma altura en el gel, con independencia del pocilio en el cual fueron depositadas las muestras. Esta es una de las ventajas de este sistema para la tipificación, ya que permite comparar las migraciones de los ADN que están contenidos en diferentes muestras.
Basado en esos principios, la Bec man Instru ent, Inc. (Beckman, The Geneline System Instruction Manual, ed. Spinco División of Beckman Instruments, 1988) construyó el equipo denominado "Geneline I, o Transverse Alternating Field Electrophoresis System" conocido como TAFE. Este sistema emplea un gel de 11 cm de longitud, 7.2 cm de ancho y 0.6 cm de espesor, y el gel admite hasta 20 muestras. Sin embargo, el TAFE también requiere de mucha solución tampón (3.5 Litros), muestra biológica y más de 20 horas para resolver los cromosomas y ADN amibiano (Baez- Camargo M., et al., Mol. Gen., 1996, Genet . 253: 289-296). Por tanto, posee las mismas desventajas de los equipos CHEF actuales.
Así, en los equipos comerciales de ECP que más se han empleado para caracterizar el genoma de los microorganismos y parásitos se requiere mucho tiempo, reactivos y muestras biológicas para resolver las grandes moléculas de ADN en un patrón de bandas. También se ha empleado el FIGE para tipificar bacterias de manera rápida (Goering RV y inters MA., J. Clin. Microbiol., 1992, 30:3,577-580; Grothues D. et al., J. Clin. Microbiol., 1988, 26:10, 1973-1977). Sin embargo, en el FIGE se ha descrito el fenómeno de inversión de la movilidad electroforética lo cual impide una estimación correcta de tallas y la comparación de los patrones de numerosas muestras. Una de las características de dicha inversión es la imposibilidad de predecir cuando ocurrirá (Birren B. y Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, P. 10, Academic Press, Inc. San Diego, California. 1993, pp10). Por eso, la principal desventaja de la inversión de la movilidad es la imposibilidad de identificar sin ambigüedades las moléculas de una banda dada. Siempre se introducen dudas en la identificación de las moléculas, salvo que se hibridara el gel con sondas específicas de cada molécula, lo que encarecería notablemente el proceso de tipificación y consumiría mucho tiempo.
Si en los equipos CHEF actuales GeneNavigator (Amersham-Pharmacia-LKB, Pharmacia Molecular and Cell Biology Catalogue, Pulsed Field Gel Electrophoresis, Nucleic Acids Electrophoresis. 1998, pp 77-79), CHEF DRII, CHEF Mapper, (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad, pp. 11, 1995) se intentara reducir el tiempo de electroforesis mediante el incremento de la diferencia de potencial aplicada entre los electrodos de polaridad opuesta se puede alcanzar el límite de potencia máxima de salida de la fuente de poder y del sistema de enfriamiento. Por eso, los fabricantes recomiendan que el campo eléctrico máximo que puede aplicarse en dichos equipos es 9 V/cm (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide . Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad, pp. 2, 1995), lo que impide que se reduzca la duración de las electroforesis mediante incrementos de la intensidad del campo eléctrico. Un hecho similar ocurre con los equipos TAFE actuales.
Los miniequipos de ECP En 1995 se reportaron los equipos de miniECP, de las versiones miniTAFE y miniCHEF (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp1973-1991 ; European Patent Application EP 0 745 844, Bull. 1996/49; US Patent Application 08/688,607, 1995; Patente cubana RPI Nro. 02/95, 1995) en los que se resolvieron la mayoría de las limitaciones de los equipos de ECP enumeradas. En ellos se realiza electroforesis de campos pulsantes en 4 a 6 horas, con 7 muestras depositadas en un minigel de 4 x 4 x 0.5 cm (largo x ancho x grosor). En los equipos miniCHEF se pueden aplicar campos eléctricos de hasta 16 V/cm lo que brinda en los minigeles una resolución adecuada entre las bandas del patrón electroforético en 2.7 horas. La poca separación de sus electrodos de polaridad opuesta permite la construcción de cubetas pequeñas y el empleo de poco volumen de tampón para cubrir los electrodos. Cuando en los miníCHEF se aplica un voltaje dado, es decir, un cierto valor de intensidad de campo eléctrico Ε', se genera menos calor que el que se generaría si se aplicara el mismo valor de en los equipos CHEF que actualmente se comercializan (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973-1991).
En los equipos miniTAFE se pueden aplicar campos eléctricos de hasta 22 V/cm sin que se pierda la resolución entre las bandas del patrón (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995 vol. 28, pp. 1973-1991). Esto permite obtener el cariotipo electroforético de S. cerevisiae en 5 horas. En el miniTAFE, como la separación entre los electrodos opuestos es pequeña (7.8 cm) la cámara de electroforesis es también pequeña y usa poco volumen de solución tampón.
Sin embargo, cuando en los minigeles se depositan muestras de más de 0.1 cm de grosor se necesita mucho tiempo para lograr una adecuada resolución del patrón electroforético. Además, de acuerdo con reportes anteriores, donde se analizó la influencia del grosor de la muestra sobre el tiempo de electroforesis (López-Cánovas et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806, pp. 187-197), debe necesitarse más longitud del gel para lograr obtener dicho patrón en un único gel. Por otro lado, los minigeles reportados solo admiten 7 muestras (miniCHEF) y 13 muestras (miniTAFE), lo que es poca capacidad de análisis para tipificar aislados de microorganismos en laboratorios clínicos.
A pesar de las ventajas de los miniequipos de ECP sobre los sistemas actualmente existentes, no existe ningún procedimiento o método de tipificación de microorganismos mediante minielectroforesis de campos pulsantes en miniCHEF o miniTAFE. Esto quizás responda al intento de emplear muestras gruesas, como las que se aplican en los geles convencionales, y a la ausencia de procedimientos, que de forma sencilla, brinden los parámetros de corrida que deben emplearse en dichos miniequipos.
La preparación de ADN inmovilizado
Para la tipificación de microorganismos mediante Electroforesis de Campos Pulsantes, en los equipos actuales o en los miniequipos, es imprescindible disponer de un método de preparación de moléculas intactas de ADN. Esto es necesario pues los métodos conocidos de aislamiento y purificación de ADN en medio líquido provocan rupturas de dichas moléculas (Schwartz DC y Cantor CR, Cell, 1984, 37, pp. 66-75). Schwartz y Cantor sólo excluyeron a las moléculas de tallas inferiores a 1 Mb (106 pares de bases) y propusieron una metodología para preparar muestras de ADN para ECP que consistía en colectar las células cultivadas, lavarlas e inmovilizarlas en bloques de agarosa. Después en los bloques se formaban los esferoplastos (cuando existe pared celular), estos se usaban y los ADN inmovilizados eran posteriormente desproteinizados en presencia de proteinasa K. El método ha sido efectivo para preparar muestras de diferentes géneros, especies y varios orígenes, pero proponía la formación de esferoplastos cuando las células poseían pared. Sin embargo, las enzimas formadoras de protoplastos, al igual que las proteasas, son caras. El procedimiento descrito originalmente requería que las muestras fueran incubadas 2 veces toda la noche, lo que equivale a 32 horas de preparación (US Patente No. 4,473,452 de Septiembre 25 de 1984). En trabajos mas recientes, Gardner (Gardner DCJ et al., Yeast, 1993, 9:1053-1055) demostró que los patrones de bandas de S. cerevisiae se obtienen sin necesidad de formar esferoplastos, mientras, Higginson y cois, (Higginson D. et al., Anal. Lett., 1994, 27:7, 1255-1264) demostraron que los ADN de S. cerevisiae podían ser desproteinizados reemplazando en la solución de desproteinización a la proteinasa K por urea 8 M. Sin embargo, el método descrito por Gardner sigue siendo caro por la necesidad de emplear proteasas, mientras que el descrito por Higginson es barato, pero consume 72 horas de incubación, el cual es un tiempo muy largo. Con posterioridad, se demostró que las muestras de S. cerevisiae podían ser preparadas sin emplear ninguna enzima, pero incubando los bloques 4 h en LETK (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 600 mM KCI, pH 7.5), 2 horas en NDS (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 1 % sarcosyl, pH 9.5) y 4 horas en NDS que contenía urea 4 M (NDSU), lo que rendía un tiempo de 10 h de preparación de muestras (López-Cánovas L, et al., Anal. Lett., 1996, 29:12, 2079-2084). Se han descrito otros métodos rápidos de preparación de muestras de ADN inmovilizado, pero todos emplean enzimas (por ejemplo, en Guidet F y Langridge P, Biotech., 1992, 12:2, 222-223). En general, se ha considerado que la preparación de ADN inmovilizado para ECP, ya sea proveniente de bacterias, levaduras, etc. requiere la obtención de esferoplastos y la posterior digestión con proteasas (Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9: 107-126; Olive DM y Bean P, JCM, 1996, 37:6, 1661-1669). Por ejemplo, se propuso que la preparación de muestras de ADN inmovilizado de Staphylococcus aureus podía ser realizada en aproximadamente 2 horas, inmovilizando las células con lisostafina e incubando los bloques en soluciones que contenían detergentes, mientras que las muestras de Streptococcus tecalis se incubaron con lisozima y mutanolisina previamente a su inmovilización (Goering RV. y inter MA., J. Clin. Microbiol., 1992, 30:3, 577-580). En este último trabajo, los autores no incubaron las muestras con proteinasa K. Por otro lado, Matushek y cois. (Matushek MG et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34:10, 2598-2600) reportaron que no fueron capaces de obtener patrones de bandas cuando no incubaban sus muestras con proteinasa K. De manera alternativa, propusieron un método rápido de preparación de muestras que empleaba proteinasa K. Recientemente McEllistrem et al. (McEllistrem MC et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38:1, 351-353) reportaron un método totalmente no enzimático para preparar ADN inmovilizado de Streptococcus pneumoniae. Sin embargo, el mismo consume 6 horas y los autores atribuyeron el éxito del protocolo a que la solución empleada pudo activar una autolisina del Streptococcus. En la actualidad, solo en la preparación de ADN intactos de S. cerevisiae y del Streptococcus pneumoniae se ha logrado eliminar el uso de las enzimas formadoras de esferoplastos y las proteasas, pero esos procedimientos consumen 10 y 6 horas, respectivamente, los cuales son tiempos considerablemente largos. No existe consenso de la factibilidad de eliminar las enzimas formadoras de esferoplastos y de desproteinización del ADN en la preparación de muestras de otros microorganismos. Por tanto, los métodos actuales son caros y consumen largos tiempos. La mayoría de los métodos anteriores parten de la base que las células que poseen pared tienen que ser inmovilizadas previamente a su tratamiento enzimático. La excepción son los trabajos de Goering y Winter (Goering RV y Winter MA, J. Clin. Microbiol., 1992, 30:3, 577-580). Esos autores trataron en medio líquido las células con lisozima y mutanolisina (dos enzimas para formar esferoplastos) antes de su inmovilización. Sin embargo, no existe un método no enzimático para tratar las células que poseen pared con anterioridad a su inmovilización en agarosa. Si este método se lograra desarrollar se dispondría de un procedimiento sencillo y barato.
Existen métodos para extraer ácidos nucleicos en solución partiendo de células calentadas en presencia de agentes permeabilizantes de la pared celular de los microorganismos (European Patent 0,657,530, 1994, bulletin 95/24; US Patent 158940, 1993). El método libera grandes fragmentos de ácidos nucleicos no degradados sin romper físicamente la pared celular de microorganismos gram-positivos y negativos, así como de levaduras. Este método no requiere de enzimas líticas. Sin embargo, al extraerse el ADN en solución no se obtienen moléculas intactas de ADN, por lo que, los autores no consideraron que el método fuera aplicable a la obtención de los cariotipos moleculares de los microorganismos mencionados, ni a la obtención de pulsotipos. Por otro lado, los autores reportan que el ADN obtenido es apropiado para hibridar, pero no mencionan si puede ser empleado para digerirlo con enzimas de restricción. En fin, este método no garantiza la obtención de ADN intacto que sea digerible con enzimas de restricción.
Puede afirmarse que no existe un procedimiento general que permita preparar ADN intacto e inmovilizado de levaduras, bacterias gram positivas, bacterias gram negativas y parásitos unicelulares mediante el empleo de soluciones que no contengan enzimas y liberen rápidamente del interior de las células a las moléculas intactas de ADN.
Por otro lado, cuando se desean preparar muestras de ADN inmovilizado es necesario disponer de moldes para la formación de las mismas. Esos moldes pueden ser reusables o desechables. Los moldes reusables deben permitir su esterilización por cualquier medio. Esto es importante cuando se trabaja con muestras de microorganismos patógenos. El molde desechable es más simple, pero genera por parte del usuario una dependencia del fabricante y pudiera ser un paso limitante en los laboratorios de pocos recursos. Los moldes existentes son los siguientes: a) los que forman bloques similares e independientes ( U. S Patent, No 4,473,452, Sep. 25 de 1984); b) los que forman tiras planas y largas que se cortan para formar bloques independientes; c) los que forman barras o varillas largas de agarosa que se cortan para formar bloques independientes (Birren B y Lai E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: a practical guide, Academic Press, Inc. San Diego, California, 1993, pp 29-30). En ellos se generan muestras que, en general, son de dimensiones mayores que los pocilios del gel. Por eso, para que los bloques posean las dimensiones de los pocilios del gel es necesario cortarlos con un bisturí o cualquier otro implemento (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide pp 40, Section 7. Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995). Sin embargo, no todos los bloques cortados manualmente quedan con dimensiones similares. Esta desigualdad influye en la calidad del patrón electroforético, pues la resolución de las moléculas en los geles depende del grosor de la muestra que se deposita en el gel. De esa forma, se dificulta la comparación de los patrones en las diferentes carrileras del gel, lo cual es una desventaja cuando se desea tipificar microorganismos. En la patente US Patent, No 5,457,050, Oct. 10 de 1995, se reportó un molde para inmovilizar las células y tratarlas en el interior del mismo. Se propuso que ese molde pudiera ser desechable o reusable según el material empleado en su construcción. No obstante, se reivindica como una facilidad del molde que las muestras son formadas y tratadas dentro de él, lo que en realidad es una desventaja. Cuando los bloques se mantienen dentro del molde durante las incubaciones, el tiempo necesario para que dichas muestras estén disponibles para la ECP se prolonga notablemente. Las moléculas efectoras de las soluciones de lisis y desproteinización tienen menos acceso a las moléculas diana dentro de las células, pues el área de contacto entre los bloques y las soluciones de incubación se reduce por lo menos a la mitad.
La selección de las condiciones experimentales de la ECP La selección de las condiciones experimentales es compleja. Existen métodos que permiten seleccionar las condiciones de corrida en equipos de ECP. Por ejemplo, el CHEF Mapper de la Bio-Rad posee una opción de autoalgoritmo y otra de algoritmo interactivo (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. pp 31-40 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995). Las dos opciones permiten calcular los tiempos de pulso, la duración de las rampas de pulso, el ángulo de reorientación, el campo eléctrico y el tiempo óptimo de corrida para separar las moléculas de ADN de una muestra dada. A diferencia del autoalgoritmo en el que se asumen condiciones fijas para las variables, el algoritmo interactivo permite variar el tipo, temperatura y concentración del tampón y el tipo y concentración de agarosa. Ambos algoritmos funcionan sobre la base de datos empíricos y teóricos colectados durante 5 años de experiencias (Bio-Rad Catalogue. Life Science Research Products . Bio-Rad Laboratories, pp185. 1998/99), pero los propios fabricantes recomiendan que al autoalgoritmo se le introduzcan tallas superiores e inferiores a las que se desean separar. También, que se considere que si el rango de tallas que se introduce, como datos en el autoalgoritmo y en el programa interactivo, es grande, los algoritmos pueden brindar resultados erróneos, tales como la inversión de la movilidad de las moléculas en el centro del gel. Existen otras expresiones empíricas que brindan la duración de los pulsos eléctricos que separarían un grupo de moléculas cuyas tallas están comprendidas entre un valor dado y otro mayor llamado RSL (Resolution Size Limit) (Smith DR. Methods I, 1990, 195-203). Sin embargo, esa relación sólo es válida en algunas condiciones experimentales y no predice la resolución entre dos moléculas cualesquiera. También existe una función que brinda las condiciones aproximadas de campo eléctrico y tiempo de pulso que separarían un grupo dado de moléculas (Gunderson K y Chu G, Mol. Cell. Biol., 1991, 11 : 3348- 3354). Debe notarse que sólo permite estimar aproximadamente esos dos valores, pero no brinda la migración de las moléculas en cualquier condición experimental. A pesar de que existen múltiples estudios teóricos acerca de la reorientación de las moléculas de ADN durante la ECP (Noolandi J, Adv. Electrophoresis, 1992, 5: 1-57; Maule J, Mol. Biotech. 1998, 9:107-126), ellos aún no han brindado un resultado práctico de utilidad en los laboratorios. Es decir, no han generado métodos que permitan que el usuario de la ECP seleccione fácilmente las condiciones que debe emplear en la separación de las moléculas que desea estudiar.
Las ecuaciones propuestas por López Cánovas y cois (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806:123-139) para describir la migración de las moléculas de ADN en ECP tampoco han sido extendidas para predecir los patrones de bandas que se obtendrían en los geles cuando se aplican rampas de pulso y se varían el campo eléctrico, la temperatura y el tiempo de electroforesis, lo cual constituye las condiciones experimentales mas frecuentemente empleadas en la tipificación de microorganismos.
El análisis de los patrones de bandas de ECP.
Existen sistemas computarizados para adquirir las imágenes de los geles de ECP y analizar los patrones de bandas (Gerner-Smidt P et al., J. Clin. Microbiol., 1998, 37:3, 876-877; Tenover F et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33:9,2233-2239; van Belkum A et al., J. Clin. Microbiol., 1998, 36:6.1653-1659). Sin embargo, se considera que la comparación de los patrones de bandas de los fragmentos de restricción continúa siendo un proceso subjetivo que no puede ser totalmente reducido a rígidos algoritmos (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33:9,2233-2239), porque aunque se realice un análisis automático, este tiene que subordinarse a la inspección visual previa de los patrones. El análisis de los patrones de bandas de forma manual o automática se limita a aportar como resultado el número de bandas y la determinación de la talla de las moléculas por comparación de su migración con la de marcadores de peso molecular. Sin embargo, la ECP es relativamente reciente y aún no se dispone de marcadores de talla para todos los tamaños de moléculas de ADN. Así, hasta el momento, los criterios de interpretación de los patrones de ECP utilizados para tipificar especies bacterianas se basan en determinar el número de fragmentos de restricción de tallas diferentes encontrados en los microorganismos que se comparan. Se han propuesto ecuaciones que describen la migración de moléculas de ADN cuando se aplica una sola rampa de pulsos eléctricos y cualquier valor de campo eléctrico y temperatura (la electroforesis se realiza en agarosa Lachema al 1 .5% y en tampón TBE 0.5X (TBE 1X: Tris 89 mM, Ácido Bórico 89 mM, EDTA 2 mM) (López-Cánovas L et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806:123-139). Sin embargo, no existe un método para extender y aplicar dichas ecuaciones al análisis de los patrones de bandas cuando se aplican rampas de pulso, lo que es común en los estudios comparativos de cualquier tipo de microorganismo.
El proceso actual de tipificación de los microorganismos mediante ECP.
El proceso total de tipificación de microorganismos consume mucho tiempo y recursos. La electroforesis requiere alrededor de 20 horas, los métodos de preparación de muestras recomendados por los fabricantes y reportados en la literatura requieren el uso de grandes cantidades de enzimas (Por ejemplo, 80 mg/ml de proteinasa K) (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Instruction Manual and Application Guide. pp 40-43 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673. Bio-Rad. 1995) y/o largos tiempos de incubación. Es aceptado que uno de los factores que ha limitado el uso de la ECP para la tipificación de microorganismos es que se necesitan entre 2 y 3 días para completar el análisis de los aislados. Esto ha reducido la capacidad de los laboratorios para analizar un gran número de muestras (Olive DM y Bean P, J. Clin. Microbiol., 1999, 37:6, 1661-1669). Esencia de la invención
La presente invención provee un proceso y un juego de reactivos que permiten tipificar aislados de microorganismos en un día de trabajo (entre 7 y 13 horas) mediante la obtención de los patrones de bandas típicos de la separación de las moléculas de ADN al ser sometidas a electroforesis de campos pulsantes en miniequipos. En específico: i) Se provee un método que en 60 minutos, a lo sumo, brinda las muestras de ADN intacto e inmovilizado en minibloques de algún gel partiendo de células que son tratadas con soluciones que no contienen enzimas hidrolíticas, pudiendo ser el tratamiento previo o posterior a la inmovilización de dichas células. Las células pueden ser levaduras, parásitos y bacterias gram positivas y negativas y se inmovilizan en algún gel, mediante el empleo de un molde esterilizable de un material flexible que brinda minibloques cuyos grosores son homogéneos y pueden estar entre 0.03 y 0.1 cm según las dimensiones del molde que se emplee. ii) Se proveen métodos predictivos de las migraciones de los ADN lineales. Los métodos fueron concebidos sobre la base de ecuaciones teóricas que permiten calcular las migraciones de todas las moléculas de ADN en cualquier condición de campo eléctrico, temperatura, duraciones de los pulsos, de las rampas de pulsos y de la electroforesis en el sistema CHEF. Esos métodos permiten seleccionar las condiciones óptimas de electroforesis que deben aplicarse en los geles y analizar los resultados de los patrones de bandas que se obtienen después de realizar el proceso de electroforesis, iii) Se proveen procesos de separación y análisis de las moléculas de ADN de microorganismos mediante su separación en miniequipos de electroforesis de campos pulsantes, los que brindan los patrones de bandas en tiempos de entre 2.5 a 5 horas en el miniCHEF y entre 5 - 7 horas en el miniTAFE. El proceso permite estudiar hasta 27 muestras de ADN inmovilizado de microorganismos que son a) preparadas por el procedimiento no enzimático, b) separadas en los minigeles de los miniequipos después de seleccionar, mediante los métodos predictivos mencionados, las condiciones óptimas que se aplicarán durante la electroforesis c) analizadas sus tallas mediante los métodos de análisis de las migraciones de las moléculas lineales de ADN que fueron depositadas en los pocilios del minigel, sometidas a la acción de dos campos eléctricos en dichos miniequipos y reveladas en el gel por cualquier procedimiento de tinción. El método de preparación de muestras provisto en esta invención consume 60 minutos a lo sumo, es sencillo y barato, pues no requiere de enzimas líticas ni proteasas en las soluciones de incubación de los microorganismos y brinda ADN intacto e inmovilizado. Las moléculas intactas son digeribles con enzimas de restricción y cuando dichas muestras son sometidas a electroforesis de campos pulsantes, los ADN intactos o sus fragmentos de restricción migran en los minigeles brindando los patrones de bandas correspondientes a sus cariotipos moleculares o pulsotipos. El método se fundamenta en la modificación química de la pared bacteriana que permite la lisis de los microorganismos, o el paso de moléculas efectoras pequeñas hasta las moléculas dianas dentro de la célula, así como la eliminación de componentes intracelulares indeseables mediante diálisis. En los minibloques donde se inmovilizaron las células se obtiene ADN intacto inmovilizado. El método contempla los siguientes pasos generales:
1) Las células de microorganismos son ínicialmente aisladas de fluidos de personas hospitalizadas, de un cepario biotecnológico o de experimentos en un laboratorio común de biología molecular, genética u otro.
2) Las células se cultivan en medios líquidos o sólidos siempre que sean de la composición apropiada para cada microorganismo.
3) Las células son posteriormente colectadas mediante centrifugación y lavadas.
4) Las células son a) inmovilizadas e incubadas en las soluciones no enzimáticas, o b) incubadas en la(s) solución(es) y posteriormente inmovilizadas. En el caso 'a', los minibloques que contienen las células se incuban durante 30-60 minutos a 45 - 50°C en la solución no enzimática. En el caso 'b', las células se incuban primero en la solución no enzimática entre 5 - 30 minutos a 50°C y después se inmovilizan en minibloques de agarosa.
5) Las células se dializan contra el tampón de electroforesis si se va a realizar ésta, o contra el tampón de conservación si se desean guardar, o contra el tampón de restricción si se van a digerir.
Los organismos que pueden ser incubados en la solución no enzimática previo a su inmovilización son Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polimorfa, Píchia pastoris y Staphylococcus aureus. La Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Entamoeba histolytica deben ser inmovilizados primero y después incubados en las soluciones no enzimáticas. En la Tabla I se presentan las soluciones más efectivas para el lavado de las células colectadas:
Tabla I. Soluciones de lavado de células que resultaron más efectivas en la preparación de ADN inmovilizado:
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Las soluciones no enzimáticas para la incubación de las células o los minibloques se caracterizan por contener detergentes aniónicos, un agente quelante, un agente capaz de competir en la formación de puentes de hidrógeno y tampón Tris. La más eficiente contiene: sarcosyl 1 %, EDTA 0.1 M, Tris-base 0.01 M, urea 4 M y su pH es 9.5 (NDSU).
Para incubar células provenientes de bacterias gram-positivas y gram-negativas se le añade nonidet P-40 a la solución anterior (NDSUPIus).
Algunos microorganismos, como la Escherichia coli, deben ser incubados durante 10 minutos a 37°C en una solución de lisis no enzimática, que contiene sarcosyl 1 %, nonidet
P-40 1 %, EDTA 0.1 M, Tris-base 0.01 M, y su pH es 8.0, antes del tratamiento de media hora con la solución NDSUPIus.
El tamp.ón de conservación de los minibloques que contienen ADN inmovilizado es TE-
100 (Tris-base 0.01 M, EDTA 0.1 M, pH 8.0). El procedimiento para inmovilizar las células en minibloques de agarosa consiste en emplear un molde esterilizable de material flexible. Este es una lámina de silicona, goma u otro material flexible de hasta 0.5 cm de grosor (ver en ejemplos de realización el ejemplo
1). La lámina posee cualquier forma y tamaño en las otras dimensiones. En la lámina hay estampadas múltiples depresiones cuadradas que pueden tener hasta 0.3 cm de ancho y de 0.03 a 0.1 cm de profundidad. Para verter la suspensión de células-agarosa el molde se pre-ambienta a 42°C colocándolo sobre una superficie a dicha temperatura, después se vierte la suspensión en el molde y con una espátula se distribuye en las depresiones. El molde se cubre entonces con una tapa que puede ser de vidrio, plástico, acrílico o cualquier otro material y se coloca entre 4 -15°C para que gelifiquen los minibloques. Los minibloques de tamaños homogéneos que se generan son extraídos del molde flexible sosteniéndolo por los bordes y torciéndolo en el interior de un recipiente que contiene la solución no enzimática para el tratamiento de dichos minibloques. La suspensión se prepara de tal forma que se inmovilizan entre 0.12 y 3 x 108 bacterias, 8 x 107 levaduras ó 6 x 104 trofozoitos de Entamoeba histolytica por cada minibloque de gel de 0.3 x 0.07 cm. Todos los microorganismos mencionados pueden ser preparados mediante el empleo de este tipo de molde. También con este tipo de molde pueden prepararse minibloques que contengan cualquier otro tipo de células.
En la presente invención, el método para seleccionar las condiciones óptimas de electroforesis que se aplicarán en los miniequipos se basa en calcular las migraciones de las moléculas lineales de ADN mediante el empleo de un grupo de ecuaciones teóricas que describen la migración, los tiempos de reorientación y las velocidades de migración de dichas moléculas de ADN en el minigel del miniCHEF. Las ecuaciones se alimentan con valores de campo eléctrico y temperatura comprendidos entre 1 - 20 V/cm y 4 - 30°C y se asume que en el proceso de electroforesis se emplea agarosa al 1.5% y como tampón de electroforesis Tris 44.5 mM, Acido Bórico 44.5 mM, EDTA 1 mM, pH 8.3 (TBE 0.5x). Las ecuaciones teóricas que describen la migración del ADN son las siguientes:
D = ∑ { vr tpr r(tprtr) Npr + vm (tpr-tr)[1-r(tpr-tr)] Npr } Ec. 1 r=1 vr = 0.0207[QE 1 5/(8πηL 1 35)] Ec 2 vm = 0.665[QE 1 6/(8πηL 1 08)] Ec 3 tr = 0.134 (L 1'14 / vr) 0-926 Ec 4 r(tpr-tr) = 1 si (tpr-tr) < 0 y r(tpr-tr) = 0 si (tpr-tr) > 0 Ec 5
donde: tr: tiempo de reorientación (seg.), vr. velocidad de migración durante la reorientación (cm/seg.), vm: velocidad de migración después de la reorientación (cm/seg.),
Q: 1e" x bp (carga neta del ADN, o carga del electrón en statcoulomb), L: 0.34 nm x bp (largo del contorno del ADN en cm), E: Intensidad del campo eléctrico en statvolts/cm, η: viscosidad del tampón en Poises y η se calculó interpolando en un polinomio que relaciona la viscosidad del agua con la temperatura (°C) experimental, D: migración total de una molécula de ADN en el minigel del CHEF (cm), d: migración por pulso (cm),
N: número de rampas de pulsos. Npr: número de pulsos en la rampa Y, tpr: duración del pulso en la rampa Y (seg.), El método para seleccionar las condiciones óptimas del proceso de electroforesis incluye los siguientes pasos:
I. Calcular la duración de los pulsos (tpr) que se emplearán en las rampas. Para realizarlo:
1) Se suministran a las ecuaciones los valores escogidos de campo eléctrico y temperatura. También los de tallas de las moléculas de ADN lineal de menor y de mayor tamaño que serán separadas.
2) Mediante el empleo de la ecuación 4, se estiman los tiempos de reorientación de las moléculas lineales de ADN de mayor y menor tallas.
3) Se calcula el promedio de ambos tiempos de reorientación (único tpr o tp cuando se desea que las moléculas de ADN de tamaños comprendidos entre la mayor y la menor estén incluidas en un solo patrón.
4) Se calcula una serie de tiempos de pulsos (tpr), que comienzan por 1.5 veces menos tiempo que el tiempo de reorientación de la molécula más pequeña y terminan con 1.5 veces más que el tiempo de reorientación de la molécula mayor. Se emplean incrementos de tiempos lineales en la serie de tpr calculada.
5) Para llevar a cabo la electroforesis se toma el tp calculado en acápite 3), o la serie de tpr calculados en el acápite 4).
II. Calcular la duración máxima de la electroforesis. El tiempo máximo de electroforesis se estima a partir del cálculo de la migración de la molécula de ADN lineal de menor talla. Este se realiza de la siguiente forma:
1) Se suministran a las ecuaciones 2 y 3 los valores de campo eléctrico y temperatura del tampón de electroforesis. 2) Se estiman el tiempo de reorientación y velocidades de migración de la molécula de menor talla.
3) Se suministran a la ecuación 1 la duración de los pulsos eléctricos (tpr), estimados en el paso I y se fijan cantidades iniciales de número de pulsos eléctricos.
4) Se incrementan de uno en uno, el número de pulsos de cada rampa Y y cada vez se estima la migración de la molécula de menor talla mediante el uso de las ecuaciones 1 y 5, hasta que dicha molécula se encuentra entre 0.1 - 1 cm del borde inferior del minigel. III. Mediante las ecuaciones 1 - 5, calcular, para todas las rampas 'n', las migraciones que tendrían las moléculas que se desean separar y predecir sus patrones de bandas en los minigeles de los miniequipos miniCHEF en las condiciones de campo eléctrico, temperatura, cantidad de rampas Y, duración de los pulsos eléctricos (tpr) y número de pulsos (Npr). Este incluye los siguientes pasos: 1) Se asume que la electroforesis se realiza en agarosa 1.5% y en TBE 0.5X.
2) Se le definen a las ecuaciones 2 y 3, los valores de campo eléctrico y temperatura del tampón que se emplearán.
3) De acuerdo con los valores estimados en los pasos anteriores, se definen a la ecuación 1 , el número total de rampas (n) o veces que se cambiará la duración del tiempo del pulso, la cantidad de pulsos que se aplicará en cada rampa (Npr) y la duración de los pulsos en cada una de dichas rampas (tpr).
4) Se especifican las tallas de las moléculas que se desean analizar.
5) Se calculan medíante el empleo de las ecuaciones 1 - 5 y para las condiciones especificadas de electroforesis, las distancias que migrarían todas las moléculas que se desean analizar.
6) Se presentan las migraciones de las moléculas lineales de ADN de forma numérica o gráfica.
7) Se repiten los pasos 2 - 6 hasta que se obtenga un patrón predicho que muestre una separación óptima entre las moléculas lineales de ADN. IV. Seleccionar a partir de los resultados anteriores las condiciones experimentales que brinden en los patrones simulados una óptima separación entre las moléculas de ADN lineal. Alimentar con esos datos la fuente de poder, la unidad de control de la electroforesis y el control del sistema de enfriamiento. El medio preferido para poner en práctica este método de la presente invención podría ser un programa de computación que facilitara el proceso de simulación de la separación de las moléculas de ADN de diferentes tallas en el miniCHEF. Este programa permitiría el cálculo de las condiciones experimentales óptimas de separación.
El programa también proveería un medio rápido de realizar los cálculos requeridos para poner en práctica esta parte de la invención.
Con esa finalidad, se creó un programa que simula los patrones de bandas y permite al usuario cambiar las siguientes variables: 1- La talla de los fragmentos o moléculas intactas de ADN que se desean separar en el gel.
2- La temperatura del tampón.
3- El voltaje aplicado.
4- Los tiempos de pulso y la cantidad de pulsos eléctricos aplicados en cada una de las rampas.
5- La cantidad de rampas de pulso, comprendidas entre 1 y 1000 rampas. Con los valores anteriores el programa provee los siguientes resultados:
1- La velocidad de cada molécula durante y después de la reorientación en cm/seg.
2- Los tiempos de reorientación de cada molécula en seg. 3- La migración de cada molécula en el gel (cm) después de un experimento de una determinada duración. 4- La migración de cada una de las moléculas y un esquema del patrón electroforético.
La representación gráfica de las distancias que migrarían las moléculas lineales de ADN, en las condiciones especificadas del proceso de electroforesis, se realiza: i) dibujando un minigel de las dimensiones del minigel real y dibujando en dicho minigel los pocilios donde supuestamente se depositarían las muestras, ii) ubicando líneas debajo de cada pocilio que representan las bandas de las moléculas de cada tamaño que se separarían. Cada línea es del ancho del pocilio y ellas están separadas del pocilio las distancias que las moléculas de cada talla migrarían en el minigel real. iii) asignando a cada línea o banda hipotética un color que depende de la talla de las moléculas que contiene. Es decir empleando un código de colores que se caracteriza porque cada color identifica moléculas de una talla dada.
Este programa constituye un método para elegir las condiciones experimentales apropiadas para separar moléculas intactas de ADN cromosomal o grandes fragmentos de ADN mediante Electroforesis de Campos Pulsantes en el miniCHEF. Cuando se usa el programa para diferentes valores de las variables experimentales, se obtienen diferentes patrones electroforéticos que permiten identificar las condiciones que separarían las moléculas de interés en el CHEF y miniCHEF. Este procedimiento no gasta reactivos ni muestras biológicas. Se basa en las ecuaciones teóricas que describen la migración de los ADN lineales en miniCHEF. Esas ecuaciones fueron obtenidas a partir de datos reales de migración de ADN lineal en el miniCHEF. Por tanto, describen correctamente la migración de dichas moléculas al ser sometidas a este tipo de electroforesis y no brindan resultados anómalos de inversión de la movilidad en el centro del gel.
En la presente invención se propone la tipificación rápida de microorganismos mediante la electroforesis en los miniequipos miniCHEF y miniTAFE. En los geles se depositan muestras provenientes de células de Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polimorfa, Pichia pastoris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Entamoeba histolytica que son preparadas empleando el procedimiento no enzimático. También pueden depositarse muestras de estas o cualquier otro microorganismo preparado por los procedimientos enzimáticos convencionales.
Para la obtención de los cariotipos, o de los pulsotipos, se emplean minicubetas del tipo miniCHEF y miniTAFE en las cuales la distancia entre los pares de electrodos opuestos no sobrepasa los 11.6 cm y 7.8 cm respectivamente y en las que es posible aplicar hasta 20 V/cm en el miniCHEF y 22 V/cm en el miniTAFE.
Los equipos de electroforesis que se seleccionaron para poner en práctica esta parte de la invención incluyen las minicubetas miniCHEF y miniTAFE descritas previamente por Riverón et al. 1995 (Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, vol. 28, pp1973-1991 ; European Patent Application EP 0 745 844, Bull. 1996/49; US Patent Application 08/688,607, 1995; Patente cubana RPI Nro. 02/95, 1995) y cuyo contenido es incorporado totalmente aquí como referencia. El piso de la cubeta del miniCHEF se modificó ligeramente. Se usó un minigel de agarosa que puede poseer desde 4 hasta 7 cm de ancho y en el que se pueden colocar desde 12 hasta 27 muestras. La cubeta del miniTAFE se ensanchó ligeramente para que pueda usar un minigel que posee 7 cm de ancho y en el que se pueden colocar hasta 27 muestras.
La concentración de agarosa en el minigel puede variar desde 0.8 a 1.5%, con una concentración preferida de 1.5%. El tampón TBE 1X comprende una solución de 0.089 M Tris base, 0.089 M Ácido Bórico y 0.002 M EDTA (sal sódica del ácido etilén-diamino- tetra-acético) y puede emplearse a concentraciones entre 0.25 y 1X, pero preferentemente a 0.5X. La temperatura del tampón puede oscilar entre 4 y 30°C. También se puede emplear tampón TAE 1X (Tris-Acetato 0.04 M y EDTA 0.001 M). Para imponer los voltajes en los electrodos del miniCHEF y alternar los campos eléctricos en las cubetas miniCHEF y miniTAFE se puede emplear cualquier equipo construido para ese propósito que incluye también los equipos descritos por Riverón AM et al., Anal. Lett., 1995, 28: 5; 845-860; y Riverón AM βt al., Anal. Lett., 1995, 28:11 , 1973-1991. Para energizar los electrodos se puede emplear cualquier fuente de poder que posea como salida máxima 300 watts de potencia.
Los minibloques de agarosa son colocados en los pozos que forman los dientes del peine que se utiliza para formar el minigel. Pueden emplearse peines diferentes y colocar muestras más anchas o menos anchas, según el tamaño de los bloques que se hayan preparado. Se utiliza bromuro de etidio para teñir las moléculas presentes en cada banda del minigel. El minigel se ilumina con luz ultravioleta (transiluminador de UV) y las imágenes son recogidas por una cámara sensible a luz ultravioleta usando un filtro de 550 nm. También puede emplearse cualquier otro procedimiento de tinción. La fuerza del campo eléctrico, la temperatura del tampón, las rampas de pulso, los tiempos de electroforesis y el número de pulsos eléctricos aplicados en cada rampa provienen de los resultados del simulador (o método de selección de las condiciones óptimas de separación de moléculas), o de los resultados de cualquier otro método que emplee el experimentador, incluyendo su experiencia empírica. Cuando se emplea el simulador la concentración del tampón debe ser 0.5X TBE, el gel de agarosa (Lachema) debe ser al 1.5%, el campo eléctrico debe ser hasta 20" V/cm, la temperatura debe ser entre 4 y 30°C y la cámara debe ser el miniCHEF. Cuando se emplea el simulador, pero se desea usar el miniTAFE pueden aplicarse las mismas condiciones de campo eléctrico y temperatura que brinde el simulador, pero deben aumentarse la cantidad de pulsos de cada rampa en 1.5 veces y la duración de los pulsos en 1.2 veces. Bajo otras condiciones de fuerzas del campo eléctrico y temperatura también se pueden obtener en los miniequipos los patrones de bandas típicos de las moléculas contenidas en la mezcla que se separa.
En la presente invención el método preferido para analizar los patrones de bandas que se obtienen después del proceso de electroforesis se basa en medir las migraciones de las moléculas lineales de ADN en el minigel, y emplear las ecuaciones 1 - 5 para calcular el tamaño de las moléculas. El método parte de la base que los patrones de bandas hayan sido obtenidos en los minigeles después del proceso de electroforesis en el equipo miniCHEF a campo eléctrico comprendido entre 1 y 20 V/cm, temperatura entre 4 y 30°C, agarosa (Lachema) al 1.5%, tampón TBE 0.5X y cualquier cantidad 'rí de rampas
(comprendidas entre 1-1000) de duración del tiempo de pulso y de la electroforesis. El método consiste en: i) Medir las distancias migradas por las moléculas lineales de ADN en los minigeles después del proceso de electroforesis y de tinción de las bandas en dichos minigeles. ii) Alimentar las ecuaciones 1 - 5 con los valores de campo eléctrico, temperatura del tampón, número de rampas (n) de pulso empleados, número de pulsos aplicados en cada rampa (Npr) y duración del pulso en cada rampa (tpr) iii) Alimentar al programa con la distancia real (D en cm) a que se encuentra una banda cualquiera después de la electroforesis, ív) A partir de esas distancias migradas, calcular la talla de las moléculas de cada banda presente en el minigel para lo cual: 1) Se define una molécula hipotética de ADN que posee inicialmente una talla de
1000 pares de bases.
2) Se emplean las ecuaciones 2, 3 y 4 para estimar vr, vm y tr respectivamente, de la molécula hipotética de ADN.
3) Mediante el empleo de las ecuaciones 1 y 5 y en las condiciones en que se realizó el proceso de electroforesis, se estima la migración teórica (Dt en cm) que tendría la molécula hipotética de ADN.
4) Se comparan D y Dt. Si Dt es mayor que D se incrementa en 1000 bp la talla de la molécula hipotética de ADN. 5) Se repiten los acápites de 2) a 4) hasta que la migración estimada para la molécula hipotética de ADN sea menor o igual que la distancia (D) migrada por la molécula real en el minigel.
6) Se asume que las moléculas de ADN contenidas en dicha banda poseen un tamaño equivalente a la talla de la molécula hipotética de ADN que cumple la condición propuesta en 4). También se asume que los valores estimados de tr, vr y vm de la molécula hipotética son los de la molécula real.
7) El proceso 1) - 6) se repite para las distancias medidas en todas las bandas, o sea para todas las moléculas separadas en el minigel. La descripción final del proceso de electroforesis puede estar dada no sólo por el patrón electroforético, sino por una matriz que contiene en las filas el número de orden de cada fragmento o molécula separada, desde la parte inferior hasta la superior, y en las columnas las tallas, tiempos de reorientación y velocidades de migración de todas las moléculas separadas en las bandas del patrón electroforético revelado. El método preferido para poner en práctica esta parte de la presente invención podría ser un programa de computación que proveería de un medio rápido de realizar los cálculos requeridos. Es decir, de un medio de calcular la talla y los parámetros cinéticos de los grupos de fragmentos o moléculas intactas de ADN separados al final de la electroforesis. Se creó un programa que permite al usuario cambiar las siguientes variables: 1- Las distancias migradas en el minigel por cada grupo de moléculas, o posición en el gel de cada una de las bandas del patrón.
2- La temperatura del tampón.
3- El voltaje aplicado en la cámara de electroforesis.
4- El tiempo de pulso y el número de pulsos eléctricos aplicados en cada una de las rampas. - La cantidad de rampas de pulso (limitadas entre 1-1000).
Con los valores anteriores el programa provee los siguientes resultados:
1- La velocidad (cm/seg.) de cada molécula durante y después de la reorientación. 2- Los tiempos de reorientación (seg.) de cada molécula.
3- La talla de las moléculas en kb (kilobases). Dada las condiciones experimentales y los resultados de una electroforesis en el miniCHEF se puede usar el programa para calcular la talla y los parámetros cinéticos de las moléculas presentes en cada banda del minigel. En la mayoría de los casos no es necesario el uso de marcadores de peso molecular para identificar las moléculas de las bandas. Este análisis permitiría clasificar los fragmentos o moléculas de ADN de acuerdo con sus propiedades cinéticas. También pueden describirse los resultados finales de electroforesis mediante cualquier otro método empleado usualmente.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:
Ejemplo 1. Molde esterilizable para preparar las muestras.
Un ejemplo de realización de molde esterilizable de material flexible (silicona, goma u otro material) para preparar las muestras de ADN inmovilizado se muestra en el esquema de la figura 1. La lámina (1) posee 49 depresiones (2). En el molde o lámina se vierte la suspensión de células en agarosa y esta se distribuye en todo el molde con la espátula especial (4). Después la lámina (1) se cubre con la tapa (3) y se obtienen los minibloques (5) conteniendo células inmovilizadas. En el ejemplo real, la lámina fue confeccionada con silicona fundida, la que se vertió en un molde hasta que se formó la lámina (1). Las dimensiones de cada minibloque son de 3 x 3 x 0.7 mm (largo x ancho x grosor). Para extraer los minibloques (5) de la lámina (1), ésta se coloca en un recipiente que contiene una solución y es torcida sosteniéndola por los extremos, con lo que todos los minibloques (5) se desprenden de ella y caen en la solución.
En otras variantes de moldes, el ancho de los mismos puede variar desde 1.5 mm hasta el ancho del minigel, mientras que su grosor puede variar desde 0.5 hasta 1.5 mm. También puede variar la cantidad de depresiones que se estampan en el fondo de la lámina.
Ejemplo 2. Preparación no enzimática de moléculas intactas e inmovilizadas de ADN de levaduras procedentes de cultivos en medio líquido. Diferentes levaduras (S. cerevisiae, H. polimorfa y P. pastoris) se crecieron en medio líquido YPG (YPG: 10 g de extracto de levadura, 20 g de glucosa y 10 g de peptona en un litro de agua destilada) a 30°C y con agitación hasta la fase exponencial tardía. Las células se colectaron por centrifugación y se lavaron con EDTA 0.05 M, pH 7.5 (Solución de lavado de la Tabla I). Se obtiene ADN intacto e inmovilizado efectuando cualquiera de las dos variantes siguientes:
Variante 1 : Se incuban las células en suspensión y después se inmovilizan en minibloques. Variante 2: Se inmovilizan las células y se incuban los minibloques que contienen las células.
En ambas variantes la inmovilización se realiza preparando una suspensión de células en agarosa a razón de 1.3 x 1010 células por mililitro de agarosa de bajo punto de fusión preparada al 1.5% en solución de EDTA 0.125 M. La suspensión celular se vierte en la lámina (1) del molde mostrado en la figura 1 , se cubre con la tapa (3) y se espera hasta que solidifique la agarosa y se forman los minibloques (5).
En la variante 1 , se resuspende el botón celular (proveniente de 100 mi de cultivo) en 5 mi de NDSU y se incuba durante 5 minutos a 50°C. La suspensión se diluye cinco veces con TE-100 y las células se colectan por centrifugación y se inmovilizan en minibloques de agarosa como se describió anteriormente.
En la variante 2, después que las células se cosechan y lavan (ver Tabla I) se inmovilizan en minibloques de agarosa. Los minibloques que contienen las células se incuban durante media hora en NDSU a 45°C. Después de los tratamientos por cualquiera de las dos variantes, los minibloques se lavan dos veces 5 minutos con TE-100 (Tris-base 0.01 M, EDTA 0.1 M, pH 8.0) a 50°C y se conservan en tampón TE-100 fresco a 4°C. Antes de realizar la electrophoresis los minibloques se incuban 10 minutos en 0.5X TBE a temperatura ambiente. La figura 2 muestra la fotografía del minigel (10) donde se efectuó la separación en patrones de bandas de los cromosomas (12) y del ADN mitocondrial (13) de S. cerevisiae. Las muestras fueron preparadas inmovilizando las células y posteriormente incubándolas en NDSU (variante 2). Se empleó el minigel de 7 cm de ancho del miniCHEF, el que admite hasta 27 muestras en sus pocilios (11). Las condiciones de electroforesis fueron 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X, tiempo de pulso de 50 segundos y 4 horas de electroforesis. La figura 2 también muestra la fotografía de una carrilera (16) del minigel del miniCHEF donde se efectuó la separación de los cromosomas de H. polimorfa. En él se separaron en un patrón de bandas los cromosomas (17) y el ADN mitocondrial (18). Los cromosomas de H. polimorfa fueron preparados según la variante 2. Ellos fueron separados en el miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X, tiempo de pulso de 120 segundos y 4 horas de electroforesis.
Los cromosomas de S. cerevisiae también fueron separados en el minigel (20) del miniTAFE que muestra la figura 2. Se muestran los patrones de bandas de los cromosomas (21 ) y del ADN mitocondrial (22). Las muestras se prepararon por la variante 1 , es decir, incubándolas en NSDU y después inmovilizándolas. Ellas se depositaron en los 13 pocilios (23) que forma el peine que se empleó. El minigel es de 7 cm de ancho y en el miniTAFE se aplicó 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X, tiempo de pulso de 60 segundos y 6 horas de electroforesis.
Ejemplo 3. Preparación no enzimátíca de ADN intacto e inmovilizado de Pseudomonas aeruαinosa procedente de cultivos en medio sólido y en medio liquido.
Para obtener los cultivos de P. aeruginosa en medio líquido y sólido se aislaron de medio agar-sangre dos colonias de este microorganismo. Una de ellas se inoculó en 5 mililitros de medio LB (10 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio, 10 g de triptona bacteriológica por litro de agua destilada) y la otra se estrió en una placa de este mismo medio al que se le añadió agar bacteriológico al 1.2%. Ambos cultivos se incubaron durante toda la noche a 37°C. El cultivo líquido se incubó con agitación y el sólido se mantuvo estático. Las células se cosecharon centrifugando el medio líquido y lavando la superficie de la placa con la correspondiente solución de lavado mostrada en la Tabla I.
Después de lavar las células provenientes de ambos cultivos con la solución de lavado mostrada en la Tabla I y colectarlas por centrifugación, en ambos casos se preparó una suspensión celular a razón de 2 x 109 células por mi de agarosa de bajo punto de fusión al 1.5% en NaCl 0.15 M. La mezcla células-agarosa se vertió en la lámina (1) del molde de la figura 1 , se cubrió con la tapa (3) y se dejó solidificar hasta que se formaron los minibloques (5). Los minibloques se incubaron en NDSUPIus durante media hora a 50°C. Posteriormente, los minibloques se lavaron dos veces durante 10 minutos con TE-100 a 50°C y se conservaron en tampón TE-100 fresco a 4°C hasta que se digirieron con enzimas de restricción. Los minibloques se lavaron e incubaron por 10 minutos en tampón de digestión de la enzima de restricción Xba I y cada uno de ellos se digirió con 20 U de dicha enzima a 37°C durante 2 horas. Los fragmentos de restricción obtenidos a partir de muestras que contienen células cultivadas en medio líquido o sólido se separaron en el miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5% y TBE 0.5X aplicando rampas de pulsos de 20, 15, 10, 5 y 3 segundos y 5, 15, 320, 1020 y 100 pulsos, respectivamente. En la Figura 3 se muestran los patrones de bandas (26) separados en el minigel (25) del miniCHEF. Los minibloques de P. aeruginosa (27) provienen de cultivo en medio LB liquido, mientras que los minibloques (28) provienen de cultivos en medio LB sólido. En la figura también se muestran las tallas de los fragmentos de ADN separados.
Ejemplo 4. Preparación no enzimática de ADN intacto e inmovilizado de Staphylococcus aureus procedente de cultivos en medio sólido.
Se tomó una colonia de S. aureus crecida en agar-sangre y se estrió en una placa de medio sólido Mueller-Hinton (Oxoid), incubándose a 37°C durante toda la noche. La placa se lavó con la solución de lavado (NaCI 0.15 M, EDTA 0.01 M, pH 8.0) de la Tabla I y las células se colectaron por centrifugación. Se puede obtener ADN intacto e inmovilizado efectuando cualquiera de las dos variantes siguientes:
Variante 1-Se tratan las células en suspensión y después se inmovilizan. Variante 2-Se inmovilizan las células y se tratan los minibloques que contienen las células. En ambas variantes la inmovilización se realiza preparando una suspensión de células en agarosa a razón de 4 x 1010 células por mililitro de agarosa de bajo punto de fusión al 1.5% en solución de lavado (Tabla I). La suspensión celular se vierte en la lámina (1) del molde de la figura 1 , se cubre con la tapa (3) y se deja solidificar hasta que se formen los minibloques (5). Para tratar las células en suspensión (variante 1) se resuspende el botón celular en 3 mi de NDSUPIus y se incuban a 50°C durante 30 minutos. La suspensión se diluye cinco veces con TE-100 y las células se colectan por centrifugación y se inmovilizan en minibloques de agarosa. En la variante 2 después que las células se cosechan y lavan se inmovilizan en minibloques de agarosa. Los minibloques que contienen las células se incuban durante una hora con NDSUPIus a 50°C.
Después de los tratamientos por cualquiera de las dos variantes anteriores los minibloques se lavan dos veces durante 10 minutos con TE-100 a 50°C y después durante 10 minutos en tampón de digestión de la enzima de restricción Sma I en hielo y se digiere con 20 U de dicha enzima a 37°C durante 2 horas.
La figura 4 muestra el minigel (30) donde se separaron en un patrón de bandas (31) los macrofragmentos de restricción del ADN de S. aureus. Las muestras (32) fueron preparadas por la variante 2, mientras que las (33) fueron preparadas por la variante 1. Las condiciones de electroforesis fueron 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X, tiempos de pulso 1 , 5, 9, 13, 17 y 21. Todas las rampas recibieron 130 pulsos. En la figura se muestran los valores de las tallas de los fragmentos separados.
Ejemplo 5. Preparación no enzimática de ADN intacto e inmovilizado de Entamoeba histolytica.
Se cultivaron trofozoitos de E. histolytica clona A en medio TY1-S-33 hasta la fase exponencial de crecimiento. Los trofozoitos se cosecharon enfriando los frascos de cultivo y se colectaron por centrifugación. Posteriormente, se lavaron con PBS frío y después de colectadas las células se incubaron durante 15 minutos en una solución hipertónica (NaCI 0.5 M, EDTA 0.05 M, Tris 0.01 M, pH 7.0) fría a razón de 2.5 x 106 trofozoitos por mililitro de solución. Finalmente, se resuspendieron 108 trofozoitos en un mililitro de agarosa de bajo punto de fusión al 2% disuelta en solución hipertónica. La suspensión se vertió en el molde flexible de silicona de la figura 1 y los minibloques se dejaron solidificar a 4°C. Los minibloques se incubaron con NDSU (Tris-base 0.01 M, EDTA 0.1 M, sarcosyl 1 % (p/v), urea 4 M, pH 9.5) a 45°C durante una hora. Posteriormente, se incubaron 10 minutos en TBE 0.5X a temperatura ambiente y se realizó la electroforesis. Si las muestras se van a conservar se lavan dos veces durante 5 minutos con TE-100 (Tris-base 0.01 M, EDTA 0.1 M, pH 8.0) a 45°C y se guardan a 4°C en TE-100 fresco. En la figura 5 se muestra la foto de un minigel (35) del miniTAFE donde se separaron en patrones de bandas (36) los ADN de E. histolytica (38) y de S. cerevisiae (37) y concatámeros de ADN de fago λ (39). La electroforesis se realizó a campo eléctrico 9.03 V/cm, 120 segundos de tiempo de pulso, 20°C, agarosa 1 % Seakem, tampón TBE 0.5X y 6 horas de electroforesis. Se depositaron muestras de 0.1 cm de grosor. Ejemplo 6. Diseño de corridas electroforéticas en el miniCHEF. La selección de las condiciones experimentales mediante el uso del simulador (método de selección de las condiciones óptimas de separación).
Se simularon las rampas de tiempo de pulso necesarias para separar los cromosomas de S. cerevisiae en una cubeta miniCHEF que posee 11.6 cm de distancia entre los electrodos opuestos. Se deseaba obtener un patrón de 11 bandas en el que estén presentes todos los cromosomas de S. cerevisiae. Se asumió que la separación se realizaría en un minigel de agarosa al 1.5% y que el tampón de corrida a utilizar sería TBE 0.5X. Se tomaron como tallas de los cromosomas de S. cerevisiae los valores reportados por Goffeau (Goffeau A et al., Science, 1996, 274: 546): 230 kb (crom. I), 270 kb (crom. VI), 315 kb (crom. III), 440 kb (crom. IX), 589 kb (crom. VIII), 577 kb (crom. V), 667 kb (crom. XI), 745 kb (crom. X), 784 kb (crom. XIV), 813 kb (crom. II), 924 kb (crom. XIII), 948 kb (crom. XVI), 1091 kb (crom. Vil y crom. XV), 1554 kb (crom. IV) y 2352 kb (crom. XII). El simulador determinó que para una intensidad de campo eléctrico de 10 V/cm y una temperatura del tampón de 20°C las condiciones óptimas de separación de todos los cromosomas de S. cerevisiae en un único patrón de bandas, se lograban, aplicando cuatro rampas de 5, 40, 75 y 110 s de tiempo de pulso y 42 pulsos en cada una de ellas. Los resultados de migración, tiempos de reorientación, velocidades de migración y el código de colores empleado para identificar las tallas de los cromosomas se muestran en la Tabla II.
Tabla II. Resultados cuantitativos del simulador. Tallas (kb) y colores asignados a los cromosomas de S. cerevisiae en el código de colores del simulador.
Figure imgf000034_0001
D experimental: Distancia migrada por la molécula en el minigel (40) de la figura 6. D predicha: Distancia que debió migrar la molécula según el simulador en las condiciones del experimento de la figura 6. vr: velocidad de migración de la molécula durante la reorientación, vm: velocidad de migración de la molécula después de la reorientación, tr: tiempo de reorientación de la molécula. En la figura 6 se muestra la fotografía del minigel real (40) donde aparece el patrón de bandas de los cromosomas (41) de S. cerevisiae 196-2 separados en el miniCHEF en las condiciones que predice el simulador. También se muestra el patrón de bandas (43) simulado en el minigel hipotético (42) que dibuja el simulador. Ambos patrones son similares. Las moléculas intactas de ADN inmovilizado de S. Cerevisiae 196-2 empleadas en esta electroforesis se prepararon según el procedimiento no enzimático descrito en esta invención.
En la figura 7 se muestra el diagrama de flujo del simulador provisto en esta invención. En él se muestra inicialmente el cálculo de la rampa de pulsos a partir de datos de migración o datos de talla.
Cuando el usuario brinda los datos de migración, el simulador inicialmente estima las tallas, a partir de dichos datos y con posterioridad estima un conjunto de rampas lineales de pulsos. Cuando el usuario brinda datos de talla, el simulador estima las rampas directamente. El criterio de detener el incremento del número de pulsos en este ejemplo es que la molécula más pequeña migre 2.5 cm.
Con posterioridad, el simulador brinda el resultado final que se vería en el minigel (ver patrón de bandas en minigel 43 simulado en el minigel hipotético 42 de la figura 6) si se aplicaran esas rampas de pulsos y números de pulsos al conjunto de moléculas especificadas por el usuario. También brinda los datos cuantitativos. Esta parte del diagrama no se muestra porque la solución es trivial.
Ejemplo 7: Análisis de los patrones de bandas de los cariotipos o pulsotipos.
En la figura 8 se muestra el cariotipo electroforético (61 ) de S. cerevisiae obtenido en el miniCHEF al separar dichos cromosomas en agarosa al 1.5%, TBE 0.5X, a 10 V/cm, 20°C, 2.95s y 453 pulsos y 21.56s y 453 pulsos.
En este cariotipo, se midió la migración de cada una de las bandas (62-66) que aparecieron en el cariotipo electroforético de S. cerevisiae mostrado en la figura 8. El método de análisis de las migraciones se alimentó con esos datos de migración, el campo eléctrico, la duración y cantidad de pulsos empleados, así como la temperatura del tampón de electroforesis.
El método descrito en esta invención permitió el cálculo de la talla, tiempos de reorientación y velocidades de migración de las moléculas contenidas en cada una de las bandas. Estos resultados se muestran en la Tabla III. Este es el tipo de resultados que brinda el método de análisis de migraciones que fue implementado en esta parte de la invención.
Tabla III. Tallas, tiempos de reorientación y velocidades de migración de las moléculas contenidas en cada banda.
Las estimaciones se realizan a partir de la posición de cada una de las bandas en el minigel, después de la aplicación de rampas de pulso.
10 V/cm, 20°C Estimaciones 2.95s/453 pulsos; Talla real Bandas 21.56s/453 pulsos (kb)
D exp D teor Talla vr x 10a vm x 10a tr (s) (kb) cm cm
62 2.36 2.23 230 210 0.09443 0.2785 3.9
63 2.29 2.14 270 226 0.09204 0.2768 4.3
64 1.97 1.96 315 302 0.08310 0.2705 6.4
65 1.55 1.42 440 401 0.07530 0.2644 9.5
66 0.84 0.82 577 564 0.06683 0.2573 15.2
D exp: Distancia migrada por la molécula en el minigel de la figura 8. D teor: Distancia que debió migrar la molécula de talla real en las condiciones del experimento de la figura 8. vr: velocidad de migración de la molécula durante la reorientación, vm: velocidad de migración de la molécula después de la reorientación, tr: tiempo de reorientación. La figura 9 muestra el diagrama de flujo del método de análisis de las migraciones de las moléculas de ADN. El diagrama fue dibujado para el procesamiento de una sola molécula, pero esos pasos se repiten para todas las moléculas que se analizaron. Cuando el método descrito en el ejemplo 7 se alimenta con datos de migración, el mismo estima las tallas de manera similar a como lo hace el método descrito en este ejemplo. Ejemplo 8. Tipificación de aislados de Escherichia coli mediante el empleo del miniCHEF.
A partir de cultivos en medio agar-sangre de dos aislados (INN3 y INN7) caracterizados fenotípicamente como Escherichia coli se tomó una colonia de cada uno y se subcultivaron en 5 mi de medio LB (10 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio, 10 g de triptona bacteriológica por litro de agua destilada). Cada cultivo se incubó durante toda la noche a 37°C con agitación.
Después de lavar las células provenientes de ambos cultivos con la solución de lavado mostrada en la Tabla I y colectarlas por centrifugación, en ambos casos fueron preparadas sendas suspensiones celulares a razón de 2 x 109 células por mi de agarosa de bajo punto de fusión al 1.5% en NaCI 0.15 M. Cada mezcla de células-agarosa se vertió n la lámina (1) del molde de la figura 1 , se cubrió con la tapa (3) y se dejó solidificar hasta que se formaron los minibloques (5). Los minibloques se incubaron con NDSUPIus durante media hora a 50°C. Con posterioridad, los minibloques se lavaron dos veces durante 10 minutos con TE-100 a 50°C. Después, los minibloques se lavaron e incubaron por 10 minutos en tampón de digestión de la enzima de restricción Xba I y cada uno de ellos se digirió con 20 U de dicha enzima a 37°C durante 2 horas. En la figura 10 se muestran los patrones de bandas (87) separados en el minigel (86) del miniCHEF. La separación lograda en el miniCHEF de los fragmentos de restricción con Xba I del ADN total de los aislados de E. coli INN3 (88) y INN7 (89) permitió identificar seis fragmentos comunes entre ellos (90) y por tanto, de acuerdo a Tenover (Tenover F et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33:9, 2233-2239) clasificarlas como dos subtipos diferentes de E. coli. Los fragmentos de restricción se separaron en el miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5% y TBE 0.5X. aplicando rampas de pulsos de 25, 20, 15, y 5 segundos y 35, 40, 50, 140 y 800 pulsos, respectivamente.
Breve descripción de las figuras:
Figura 1. Esquema de un molde para fundir las muestras. En la parte inferior se muestra la lámina donde se encuentran estampadas las depresiones donde se vierte la suspensión de células en agarosa, en la parte superior se muestra la tapa del molde y un minibloque. A la derecha se muestra la espátula que permite distribuir la suspensión células-agarosa. Figura 2. Fotografía de los patrones de bandas de los cromosomas de S. cerevisiae y H. polimorfa al ser separados en minigeles del miniCHEF y del miniTAFE. La parte superior muestra el minigel del miniCHEF de 7 cm de ancho, sus 27 pocilios y los patrones de bandas de los cromosomas de S. cerevisiae. En el centro de la figura se muestra el minigel de 4 cm de ancho y el patrón de bandas de los cromosomas de H. polimorfa. Las muestras fueron preparadas por el método no enzimático inmovilizando las células y después incubándolas en NDSU. Las condiciones de electroforesis fueron 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X, tiempo de pulso de 50 segundos y 4 horas de electroforesis. En la parte inferior se muestra un minigel del miniTAFE con los patrones de bandas de S. cerevisiae. En el miniTAFE se empleó 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X tiempo de pulso de 60 segundos y 6 horas de electroforesis. Las muestras fueron preparadas incubando las células en NDSU con anterioridad a su inmovilización.
Figura 3. Patrones de bandas en el miniCHEF de los macrofragmentos de restricción del ADN de P. aeruginosa digerido con Xba I. A la izquierda, los minibloques de P. aeruginosa que provienen de cultivo en medio LB líquido, mientras que los de la derecha provienen de cultivos en medio LB sólido. Se empleó el miniCHEF a 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5% y TBE 0.5X, y se aplicaron rampas de pulsos de 20, 15, 10, 5 y 3 segundos y 5, 15, 320, 1020 y 100 pulsos, respectivamente.
Figura 4. Patrones de bandas en el miniCHEF de los macrofragmentos de restricción del ADN de S. aureus digerido con Sma I. A la izquierda se muestran los patrones de bandas de las muestras inmovilizadas primero, e incubadas en NDSUPIus posteriormente. A la derecha están las muestras que se incuban primero en NDSUPIus y después se inmovilizan. En ambos casos las células fueron cultivadas en medio sólido. Las condiciones de electroforesis fueron 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5%, TBE 0.5X, tiempos de pulso 1 , 5, 9, 13, 17 y 21. Todas las rampas recibieron 130 pulsos.
Figura 5. Fotografía de los patrones de bandas de ADN de E. histolytica, S. cerevisiae y concatámeros de ADN de fago λ. La electroforesis se realizó en el minigel del miniTAFE a campo eléctrico 9.03 V/cm, 120 segundos de tiempo de pulso, 20°C, agarosa 1 % Seakem, tampón TBE 0.5X y 6 horas de electroforesis. Se depositaron muestras de 0.1 cm de grosor. De izquierda a derecha en las carrileras son, Carrilera 1 : Miniplugs con S. cerevisiae 196-2; Carrileras 2, 3, 4 y 5: Miniplugs con E histolytica incubadas 0.5, 1 , 2 y 16 horas, respectivamente en NDSUPIus a 45 °C, Carrilera 6: concatámeros de ADN de fago λ. Figura 6. Fotografía del minigel (40) del miniCHEF donde se obtuvo el patrón de bandas de los cromosomas de 5. cerevisiae 196-2 (izquierda) y gráfico del minigel hipotético (42) que predice el simulador (derecha). La electroforesis real se realizó en las condiciones que predice el simulador. Las moléculas intactas de ADN inmovilizado de S. cerevisiae 196-2 empleadas en esta electroforesis se prepararon según el procedimiento no enzimático descrito en esta invención. Para un campo eléctrico de 10 V/cm y una temperatura del tampón de 20°C las condiciones de separación predichas por el simulador fueron cuatro rampas de pulso de 5, 40, 75 y 110 segundos y 42 pulsos en cada una de ellas. Los resultados de migración y el código de colores empleado para identificar las tallas se muestran en la Tabla II.
Figura 7. Diagrama de flujo del método que simula los patrones de bandas de los
ADN que migran en los minigeles del MiniCHEF. En el diagrama están los siguiente parámetros y variables: la talla (kb), tiempos de reorientación (tr), velocidad de migración durante la reorientación (vr) y velocidad de migración después de la reorientación (vm) de las moléculas en el miniCHEF.
Tpr: tiempo de pulso en cada rampa, Np: número de pulsos en cada rampa, gO, g1 , g2, g3, g4 coeficientes obtenidos para describir la viscosidad (η) en función de la temperatura (T) experimental, Dt: distancia teórica calculada por el programa, nr: número de rampas, E: campo eléctrico, L: largo del contorno de la molécula de ADN, bp: pares de bases, Q: carga neta del ADN.
Figura 8. Cariotipo electroforético (61) de S. cerevisiae obtenido en el miniCHEF al separar dichos cromosomas en agarosa al 1.5%, TBE 0.5X, a 10 V/cm, 20°C, 2.95s y 453 pulsos y 21.56s y 453 pulsos.
Figura 9. Diagrama de flujo del método que emplea las distancias migradas para estimar la talla (kb), tiempos de reorientación (tr), velocidad de migración durante la reorientación (vr) y velocidad de migración después de la reorientación (vm) de las moléculas separada en el miniCHEF. tpr: tiempo de pulso en cada rampa, Npr: número de pulsos en cada rampa, gO, g1 , g2, g3, g4 coeficientes obtenidos para describir la viscosidad (η) en función de la temperatura (T) experimental, D: distancia migrada en el gel, Dt: distancia teórica calculada por el simulador, n: número de rampas, E: campo eléctrico, L: largo del contorno de la molécula de ADN, bp: pares de bases, Q; carga neta del ADN. Figura 10. Tipificación en el miniCHEF de los aislados INN3 y INN7 de Escherichia coli mediante la obtención de los patrones de bandas de los fragmentos de restricción con Xba I de sus ADN. Se empleó el método no enzimático de preparación de muestras. Las condiciones de electroforesis fueron: 10 V/cm, 20°C, agarosa 1.5% y TBE 0.5X aplicando rampas de pulsos de 25, 20, 15, 10 y 5 segundos y 35, 40, 50, 140 y 800 pulsos, respectivamente. Los puntos (90) representan los fragmentos de restricción comunes en ambos aislados.
VENTAJAS DE LA SOLUCIÓN PROPUESTA.
1- La preparación de moléculas intactas de ADN de microorganismos, inmovilizadas en minibloques delgados de algún gel, se realiza entre 5 minutos y una hora y no requiere del uso de enzimas por lo que se hace rápidamente y a bajo costo.
2- La preparación no enzimática de muestras de ADN para ECP funciona igualmente eficiente para células provenientes de cultivos en medio sólido o líquido. Algunas células pueden ser incubadas en las soluciones no enzimáticas previamente a su inmovilización, lo que reduce el tiempo necesario para preparar muestras.
3- Los ADN inmovilizados por los procedimientos descritos están libres de inhibidores de enzimas de restricción y son digeribles en 2 horas por endonucleasas de restricción, brindando los patrones de bandas típicos en electroforesis de campos pulsantes en miníequipos.
4- Los minibloques de gel que contienen los ADN inmovilizados de los microorganismos tienen todos dimensiones homogéneas y no tienen que ser cortados antes del proceso de electroforesis, lo que garantiza reproducibilidad en los resultados. 5- Los cariotipos moleculares o pulsotipos de hasta 27 muestras se obtienen entre 2.5 y 7 horas con poco gasto de solución tampón y de matriz de separación. El tiempo depende del microorganismo que se estudie y del miniequipo que se emplee, así como el campo eléctrico, temperatura y rampas de pulsos seleccionados.
6- Los equipos requeridos para analizar los genomas de los microorganismos mediante el procedimiento de electroforesis de campos pulsantes en los minigeles de los miniequipos requieren de poco espacio útil del laboratorio.
7- Los patrones electroforéticos pueden ser simulados en una computadora antes del experimento tantas veces como se desee, lo que permite seleccionar las condiciones de campo eléctrico, temperatura y rampas de pulso que brinden la mejor separación entre las moléculas sin gastar reactivos ni muestra biológica. - Las rampas de pulso que deben ser aplicadas se seleccionan mediante un método basado en ecuaciones que describen la migración de las moléculas de ADN en los minigeles del miniCHEF, por lo que brinda cual sería el patrón electroforético óptimo de separación entre las moléculas. - Para estimar los tamaños de las moléculas de ADN y los tiempos de reorientación y velocidades de migración no se necesitan marcadores de talla, pues se provee un método que estima esos parámetros a partir de las distancias migradas en el gel, bajo cualquier condición de campo eléctrico entre 1 - 20 V/cm, temperatura 4 - 30°C y rampas de pulso. Su limitante es que requiere agarosa al 1.5% y tampón TBE 0.5X. 0-Las bandas separadas en el patrón electroforético pueden ser caracterizadas además de por la talla de sus moléculas, por los tiempos de reorientación y velocidades de migración de las moléculas. 1-EI proceso descrito ahorra considerablemente reactivos químicos, muestras biológicas y tiempo. 2-Todo el proceso de preparación de muestra y análisis del genoma de 27 microorganismos no excede de un día usual de trabajo. 3-Se provee un juego de reactivos que simplifica la preparación de los ADN intactos de los microorganismos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos mediante electroforesis de campos pulsantes caracterizado por los siguientes pasos: i) la preparación de moléculas intactas de ADN de microorganismos inmovilizados en minibloques de algún gel, preparación que se realiza mediante un método no enzimático con un juego de reactivos asociado, ii) el uso de una minicámara de electroforesis de campos pulsantes para la separación de las moléculas de ADN contenidas en los minibloques, siendo la minicámara mencionada CHEF o TAFE, iii) el uso de un método para seleccionar los valores apropiados de rampas de pulso y de duración de la electroforesis según sean el campo eléctrico y la temperatura aplicados en la minicámara, valores apropiados de rampas de pulso y duración de la electroforesis que deben rendir la mejor resolución de los fragmentos de ADN o de las moléculas intactas de ADN, iv) la aplicación en la minicámara de la temperatura, la intensidad del campo eléctrico y la duración de la rampa de pulso que fueron calculadas en el paso (iii) para resolver la mezcla de moléculas de ADN, v) el uso de un método para analizar las distancias que migraron las moléculas lineales de ADN en el minigel, una vez que la electroforesis en dicho minigel fue realizada.
2. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos mediante electroforesis de campos pulsantes de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque la preparación de las moléculas intactas de ADN incluidas en minibloques de algún gel se realiza según el siguiente esquema lógico: i) se colectan células de microorganismos crecidos en medio líquido o sólido, ii) dichas células se incuban en soluciones que contienen tampón, detergente, un agente quelante y un agente que rompe los puentes de hidrógeno, iii) las incubaciones se realizan antes o después de la inmovilización de las células según sea el microorganismo de que se trate.
3. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos mediante electroforesis de campos pulsantes de acuerdo con las reivindicaciones No. 1 y No. 2 caracterizado porque las células son inmovilizadas en minibloques de gel mediante el empleo de un molde que es una lámina flexible con múltiples depresiones estampadas en su superficie, las cuales determinan las dimensiones de los minibloques que serán preparados, siendo la mencionada lámina de silicona, goma o cualquier otro material flexible y pudiendo o no ser esterilizada.
4. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos mediante electroforesis de campos pulsantes de acuerdo con la reivindicación No. 3 caracterizado porque las depresiones de los mencionados moldes poseen cualquier ancho, 0.3 cm de longitud y desde 0.03 hasta 0.1 cm de profundidad, por lo que entre 106 y 108 células pueden quedar inmovilizadas en los minibloques, según sea el microorganismo.
5. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos mediante electroforesis de campos pulsantes de acuerdo con las reivindicaciones No. 1 y 2 caracterizado porque el tiempo requerido para incubar las células en la solución tampón que contiene detergente, un agente quelante y un agente que rompe los enlaces de hidrógeno, está comprendido entre 5 y 60 minutos, mientras que el volumen de incubación, en mililitros, es 'c • v • 20'; siendo V el volumen de un minibloque, en mililitros, y 'c' la cantidad de minibloques que se incubarán.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque cuando el microorganismo a tipificar es una levadura, el método no enzimático de preparación de las muestras consiste en emplear una solución compuesta por sarcosyl al 1 %, EDTA 100 mM, urea 4 M, Tris 10 mM, pH 9.5 para incubar los minibloques conteniendo dichas células a 45°C, entre 30 minutos y una hora, dando como resultado el ADN intacto e inmovilizado de dicha levadura, el cual puede opcionalmente ser tratado con endonucleasas de restricción después de incubar los minibloques por 10 minutos en el tampón requerido para dicha endonucleasa.
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque cuando el microorganismo a tipificar es una bacteria, el método no enzimático de preparación de las muestras consiste en emplear una solución compuesta por sarcosyl 1 %, nonidet P-40 1 %, EDTA 100 mM, urea 4 M, Tris 10 mM, pH 9.5, para incubar los minibloques conteniendo dichas células a 50°C durante 30 minutos a una hora, dando como resultado el ADN intacto e inmovilizado de dicha bacteria, el cual puede opcionalmente ser tratado con endonucleasas de restricción después de incubar los minibloques por 10 minutos en el tampón requerido para dicha endonucleasa.
8. Proceso de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque cuando el microorganismo a tipificar es Escherichia coli, el método no enzimático de preparación de las muestras de ADN inmovilizado consiste en emplear dos soluciones en las cuales se incuban secuencialmente las células inmovilizadas; primero los minibloques se incuban en una solución que contiene sarcosyl al 1%, nonidet P-40 1 %, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0 durante 10 minutos a 37°C y después dichas células se incuban en sarcosyl 1 %, nonidet P-40 1 %, EDTA 100 mM, urea 4 M, Tris 10 mM, pH 9.5 durante 30 minutos a 50°C, dando como resultado el ADN intacto e inmovilizado de dicha bacteria, el cual puede opcionalmente ser tratado con endonucleasas de restricción después de incubar los minibloques por 10 minutos en el tampón requerido para dicha endonucleasa.
9. Proceso de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque cuando el microorganismo a tipificar es Entamoeba histolytica el método no enzimático de preparación de las muestras consiste en tratar los trofozoitos no inmovilizados con una solución hipertónica que contiene NaCI 0.5 M, EDTA 0.05 M, Tris 0.01 M, pH 7.0 durante 15 minutos y después de inmovilizarlos en los minibloques de agarosa, entonces incubarlos en una solución que contiene sarcosyl al 1%, EDTA 100 mM, urea 4 M, Tris 10 mM, pH 9.5 durante una hora a 45°C, dando como resultado el ADN intacto e inmovilizado de dicho parásito, el cual puede opcionalmente ser tratado con endonucleasas de restricción después de incubar los minibloques por 10 minutos en el tampón requerido para dicha endonucleasa.
10. Proceso de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque si el microorganismo a tipificar son las levaduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, o Hansenula polimorfa, un método no enzimático de preparación de ADN inmovilizado consiste en que células no inmovilizadas se incuban en una solución que contiene sarcosyl al 1%, EDTA 100 mM, urea 4 M, Tris 10 mM, pH 9.5 a 50°C entre 5 y 30 minutos, y con posterioridad dichas células son inmovilizadas en minibloques de gel, lo que da por resultado ADN intacto e inmovilizado de dichas levaduras, el que puede ser opcionalmente tratado con endonucleasas de restricción después de incubar los minibloques por 10 minutos en el tampón requerido para dicha endonucleasa.
11. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos medíante electroforesis de campos pulsantes de acuerdo con la reivindicación No. 1 caracterizado porque las diferenciaciones entre las cepas, o la tipificación de los microorganismos, son realizadas a partir de la información contenida en los patrones de bandas que brindan sus ADN intactos o sus fragmentos de restricción cuando se separan mediante electroforesis de campos pulsantes en los minigeles de los miniequipos, donde dichos miniequipos pueden ser: i) el miniCHEF, el cual posee 11.6 cm como la máxima distancia entre los pares de electrodos de polaridad opuesta y admiten minigeles que pueden llegar a ser de hasta 7 cm de ancho, ii) el miniTAFE (Transversal Alternating Field Electrophoresis), el cual posee 7.8 cm como distancia máxima entre los pares de electrodos de polaridad opuesta y admiten minigeles que pueden llegar a ser de hasta 7 cm de ancho.
12. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con la reivindicación No. 11 caracterizado porque las separaciones de las moléculas de ADN para diferenciar o tipificar los aislados o cepas de microorganismos se efectúan en los miniequipos de electroforesis de campos pulsantes del sistema CHEF o TAFE, en los que se emplean minigeles de agarosa entre 0.5 - 1.5 % y tampón de electroforesis Tris 89 mM, Acido Bórico 89 mM, EDTA 2 M, pH 8.4 (TBE 1X), o ese mismo con la mitad, o la cuarta parte de las concentraciones referidas y en dichos equipos se aplican una temperatura del tampón, intensidad del campo eléctrico y valores de las rampas de pulsos que son apropiadamente seleccionados por el experimentador mediante un método de cálculo, o métodos empíricos o cualquier otro, estando dichos valores experimentales comprendidos entre 4 - 30°C, 1-20 V/cm en el miniCHEF y 1-25 V/cm en el miniTAFE, así como cualquier duración de los pulsos eléctricos.
13. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con la reivindicación No. 1 y dado que existen las siguientes ecuaciones que describen la migración por pulso 'd' (cm) de las moléculas lineales de ADN en los minigeles de los miniequipos miniCHEF,
d = vr tp r (tp-tr) + vm (tp-tr)[1-r(tp-tr)] vr = 0.0207[QE 1 5/(8πηL 1'35)] vm = 0.665[QE 1 76/(8πηL 1 08)] tr = 0.134 (L 1-14 / vr) 926 T(tp-tr) = 1 si (tp-tr) < 0 y r(tp-tr) = 0 si (tp-tr) > 0
donde 'tf es el tiempo de reorientación (seg) de la molécula de ADN lineal, 'vr' y 'vm' son las velocidades de migración (cm/seg) durante y después de la reorientación de la molécula de ADN, respectivamente, 'Q' la carga neta de dicha molécula (statcoulomb) la cual está dada por 1e" x bp, donde 'e ' es la carga del electrón y 'bp' los pares de bases, V es el largo del contorno (cm) de la molécula lineal de ADN, dado por 0.34 nm x bp, Ε' la intensidad del campo eléctrico (statvolts/cm), 'η' la viscosidad del tampón (Poises), la que se calcula interpolando el valor de la temperatura experimental en un polinomio que relaciona la viscosidad del agua con la temperatura experimental (°C), está caracterizado por aportar y emplear métodos de cálculo que se basan en dichas ecuaciones para predecir los patrones de bandas que brindarían las moléculas lineales de ADN al ser separadas en un minigel del miniCHEF cuando se aplican 'n' rampas de pulso, así como aportar métodos para analizar los patrones de bandas resultantes al finalizar una corrida de electroforesis en la que se aplicaron 'n' rampas de pulso, métodos que son aplicables siempre y cuando el valor 'n' de la cantidad de rampas de pulso esté comprendido entre 1 y 1000 y las ecuaciones se alimenten con valores de campo eléctrico y temperatura comprendidos entre 1 - 20 V/cm y 4 - 30°C, respectivamente, asumiendo que en la corrida de electroforesis se emplea agarosa al 1.5% y tampón de electroforesis Tris 44.5 mM, Acido Bórico 44.5 mM, EDTA 1 mM, pH 8.4.
14. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos que de acuerdo con las reivindicaciones No. 1 y 13 aporta métodos de cálculo que permiten determinar la mejor rampa de pulso, así como analizar los patrones de bandas que se obtienen después de 'n' rampas de pulso, métodos que están caracterizados por realizar sus cálculos a partir de las predicciones de las migraciones 'D' de las moléculas de ADN lineal en los minigeles después de 'n' rampas de pulsos, cálculo de la migración 'D' de cada molécula que es sometida a una rampa de 'n' pulsos que se obtiene a partir de:
D = ∑dr . Npr r=1 donde, Npr es el número de pulsos aplicados en la rampa Y, tpr es la duración del pulso (segundos) en la rampa Y y 'dr' es la migración por pulso de cada molécula en cada rampa Y y está dada por:
dr = vr tpr rr (tpr-tr) + vm (tpr-tr)[1 -rr(tprtr)] rr(tpr-tr) = 1 si (tpr-tr) < 0 y rr(tpr-tr) = 0 si (tpr-tr) > 0
15. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con la reivindicación No. 14 caracterizado porque el método para determinar la mejor rampa de pulso incluye los siguientes pasos: i) alimentar a las ecuaciones con los datos de campo eléctrico y temperatura que se desean aplicar, así como con las tallas de las moléculas de ADN lineal que se estudiarán, ¡i) calcular la duración de los pulsos que se emplearán en las rampas, iii) calcular el tiempo máximo de electroforesis sobre la base del cálculo de la migración que tendría la molécula de menor talla en el minigel, iv) calcular las migraciones de todas las moléculas y predecir los patrones de bandas que brindarían dichas moléculas en los minigeles de los miniequipos miniCHEF, empleando en dicho cálculo las condiciones de campo eléctrico y temperatura suministrados al método, el tiempo de electroforesis calculado en el paso (iii) y los valores ya calculados de duración de los pulsos eléctricos y cantidades de pulsos en las rampas, v) seleccionar como las condiciones experimentales que se aplicarán en < miniCHEF, aquellas que brinden una óptima separación entre las moléculas d ADN lineal en los patrones simulados.
16. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con I reivindicación No. 15 caracterizado porque el cálculo del tiempo máximo de electroforesi se realiza a partir de calcular la migración que experimentaría en el minigel del miniCHE la molécula de ADN lineal de menor talla; calculo de dicha migración que se lleva a cab de la siguiente manera: las ecuaciones que describen la migración 'D' de las molécula lineales de ADN en el miniCHEF se alimentan con los valores de campo electrice temperatura y duración de los pulsos eléctricos (tpr) que se aplicarán en las 'n' rampas; s fija una cantidad inicial de pulsos eléctricos en cada rampa Npr, siendo 1 el valor inicií recomendado para todos los Npr y para todo Y todos los Npr se van incrementando d unidad en unidad y cada vez que se realizan esos incrementos, la migración O' de I n molécula más pequeña se estima mediante D = ∑ dr • Npr; se detienen dicho
incrementos de Npr cuando la D calculada es tal que dicha molécula debería habe alcanzado una posición que dista entre 0.1 y 1 cm del borde inferior del minige aceptando entonces como duración máxima de la electroforesis a! tiempo que se calcul; n según 2 • ∑ tpr • Npr.
17. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con I; reivindicación No. 15 caracterizado porque el cálculo de las duraciones de los pulso; eléctricos que se emplearán en las rampas de pulsos para separar a las molécula; lineales de ADN en los minigeles del miniCHEF se realiza: i) suministrándole a las ecuaciones que describen la migración por pulso 'd' de las moléculas lineales de ADN en el minigel del miniCHEF los valores escogidos de campo eléctrico, temperatura y talla de las moléculas de meno
(A) y de mayor (B) tamaño que serán analizadas, ii) calculando, mediante el empleo de dichas ecuaciones, los tiempos í reorientación (trA y trB, respectivamente) de ambas moléculas lineales de ADN, iii) calculando la rampa del único tiempo de pulso que se empleará como el promedio entre los tiempos de reorientación de la molécula menor y mayor (0.5 • [trA + trB]), cuando se desea que las moléculas de ADN de tamaños comprendidos entre la mayor y la menor estén incluidas en un solo patrón, iv) calculando la rampa de pulsos que se empleará como una serie de duraciones de los pulsos eléctricos, que comienzan 1.5 veces por debajo del tiempo de reorientación de la molécula más pequeña y terminan 1.5 veces por encima del tiempo de reorientación de la mayor, con incrementos lineales entre ellos, o sea: tpi = trA /1.5, tp2 = tpi + Δ, tp3 = tp-i + 2 • Δ, .. , tp„ = 1.5 • trB, donde Δ = |(tpι - tpn)|/(n-1) y n = te/(tpι + tpn); siendo 'te' el tiempo de electroforesis, v) seleccionando como duraciones de los pulsos eléctricos a emplear en los experimentos aquellos calculados en los pasos iii) o iv).
18- Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con la reivindicación No. 15 caracterizado porque el cálculo de las migraciones que tendrían las moléculas lineales de ADN en los minigeles de los miniequipos miniCHEF, así como la predicción de los patrones de bandas que brindarían dichas moléculas en dichos minigeles se realiza según los siguientes pasos: i) se asume que la electroforesis se realiza en agarosa 1.5% y en TBE 0.5X, ¡i) definir los valores de campo eléctrico y temperatura del tampón que se emplearán en la electroforesis, así como los valores de tallas de las moléculas que se separarán en la electroforesis hipotética, iii) se definen la cantidad de rampas (n) o veces que se cambiará la duración del tiempo del pulso, la cantidad de pulsos que se aplicará en cada rampa (Npr) y la duración de los pulsos en cada una de dichas rampas (tpr), se especifican las tallas de las moléculas que se desean analizar, iv) se calculan las distancias que migrarían todas las moléculas mencionadas en las condiciones ya especificadas de la corrida de electroforesis, el cálculo se
,» realiza según D = ∑ dr • Npr, r=1 v) se presentan los resultados de los cálculos de migración de forma numérica o gráfica, vi) se repiten los pasos i) - v) hasta que se obtenga un patrón predicho que muestre una separación óptima entre las moléculas de ADN.
19. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con las reivindicaciones No. 1 y 13 caracterizado por disponer de un método para analizar las distancias migradas por las moléculas lineales de ADN en los minigeles del miniCHEF, n método que consiste en reemplazar en la ecuación D = ∑ dr • Npr los valores de las r=1 distancias O' que separan cada banda del origen de migración y a partir de este reemplazo calcular, por interpolación inversa, la talla de las moléculas contenidas en las bandas, sus velocidades de migración y tiempos de reorientación, siempre que la electroforesis se haya realizado a una intensidad de campo eléctrico comprendida entre 1 y 20 V/cm, a una temperatura entre 4 y 30°C, en agarosa al 1.5%, en tampón TBE 0.5X y se hayan aplicado 'n' rampas de pulso, donde 'n' está entre 1 y 1000, método de cálculo que consta de los siguientes pasos: i) medir las distancias (D) que separan las bandas del origen de migración de los minigeles después de concluida la corrida de electroforesis, n ii) definirle a la ecuación D = ∑ dr • Npr los valores empleados de campo r=1 eléctrico (E), temperatura del tampón, número de rampas (n) de pulso, número de pulsos aplicados en cada rampa (npr), duración del pulso en cada rampa (tpr) y las distancias (D) que separan cada banda del origen de migración, iii) a partir de dichos datos, calcular las tallas de las moléculas presentes en las n bandas medidas mediante el empleo de la ecuación D = ∑ dr • Npr y de las r=1 ecuaciones que describen 'dr' para los minigeles del miniCHEF, cálculo de talla que se realiza como sigue: (a) se estima la migración hipotética (Dt) que debería experimentar una molécula de ADN de 1000 pares de bases en las condiciones especificadas de electroforesis; (b) si esa migración hipotética (Dt) es mayor que la distancia real (D) medida para la banda que se está analizando, es decir (Dt > D), entonces el valor de talla de la molécula de ADN se incrementa en 1000 bp, (c) se repiten los pasos (a) y (b) hasta que la migración hipotética de la molécula de ADN es menor o igual que la distancia medida para dicha banda (Dt < D), (d) se asume que las moléculas de ADN contenidas en dicha banda poseen un tamaño similar a la talla de la molécula de ADN que cumple la condición propuesta en (c), (e) el proceso se repite para todas las bandas medidas en el minigel, iv) una vez calculadas las tallas se acepta que los tiempos de reorientación y las velocidades de migración de las moléculas de cada banda analizada son n aquellos que en el paso (iii) brindaron valores de 'dr' tales que ∑ dr • Npr < D, r=1 v) se presentan los resultados de forma numérica.
20. Proceso para la tipificación rápida de microorganismos de acuerdo con la reivindicación No. 18 caracterizado por brindar la representación gráfica de las migraciones de las moléculas lineales de ADN en condiciones especificadas de electroforesis, representación gráfica que se realiza: i) dibujando un rectángulo cuyas dimensiones son proporcionales a las del minigel real y dibujando dentro de dicho rectángulo otros rectángulos menores que representan a los pocilios donde hipotéticamente se depositarían las muestras de ADN, ii) dibujando, debajo de cada rectángulo pequeño o pocilio, líneas que representan las bandas de las moléculas de cada tamaño que se separarían en un minigel, líneas estas que se separarían del pocilio distancias proporcionales a las distancias que las moléculas de las diferentes tallas migrarían en el minigel real, iii) asignando un color diferente a cada línea que se dibuja debajo de cada pocilio, color que es único para cada talla de moléculas de ADN, es decir empleando un código de colores que identificaría las tallas de las moléculas que hipotéticamente estarían contenidas en las bandas dibujadas como líneas.
21. Juego de reactivos para implementar el método no enzimático de preparación de muestras dentro del proceso para la tipificación rápida de microorganismos mediante electroforesis de campos pulsantes de acuerdo a la reivindicación No. 1 , caracterizado porque está compuesto por: (a) un molde para verter las suspensiones de células y obtener minibloques que contienen las células inmovilizadas en algún gel;
(b) soluciones para el lavado de células;
(c) soluciones para la inmovilización de las células; (d) soluciones para la desproteinización de los ADN;
(e) soluciones de conservación de las muestras; y
(f) soluciones para el lavado de los minibloques.
22. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 caracterizado porque la solución para el lavado de células está compuesta por EDTA 0.05 M, pH 7.5, si los microorganismos son levaduras.
23. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 caracterizado porque la solución para el lavado de células está compuesta por NaCI 0.15 M y EDTA 0.01 M, pH 8.0, si los microorganismos son las bacterias Staphylococcus aureus o Escherichia coli.
24. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 caracterizado porque la solución para el lavado de células es NaCI 0.15 M, si el microorganismo es la bacteria Pseudomonas aeruginosa.
25. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 caracterizado porque si el microorganismo es Entamoeba histolytica, las soluciones para el lavado de células son dos, una de ellas es PBS, pH 7.4 y la otra es una solución hipertónica que contiene NaCI 0.5 M, EDTA 0.05 M, Tris 0.01 M, pH 7.0.
26. Juego de reactivos de acuerdo con las reivindicaciones No. 21 a la No. 25 caracterizado porque las soluciones para la inmovilización de las células de los microorganismos mencionados están compuestas por agarosa de bajo punto de gelificación que se prepara a una concentración entre 1.5 y 2.0 % y es disuelta en las soluciones para el lavado de dichas células.
27. Juego de reactivos de acuerdo con las reivindicaciones No. 21 a la No. 25, caracterizado porque las soluciones para la desproteinización de las moléculas de ADN están compuestas por un tampón, un agente quelante, un detergente y un agente que rompe los puentes de hidrógeno.
28. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 27, caracterizado porque las soluciones para la desproteinización de las moléculas de ADN están compuestas por tris
0.01 M, EDTA 0.1 M, Sarcosyl 1 % y urea 4 M si dichas moléculas de ADN provienen de S. cerevisiae, H. polimorfa y E. histolytica.
29. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 27, caracterizado porque las soluciones para la desproteinización de las moléculas de ADN están compuestas por tris
0.01 M, EDTA 0.1 M, Sarcosyl 1 %, Nonidet 1 % y urea 4 M si dichas moléculas de ADN provienen de S. aureus, E. coli y P. aeruginosa.
30. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 , caracterizado porque la solución para lavar los minibloques que ya fueron tratados con la solución de desproteinización está compuesta por EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0.
31. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 , caracterizado porque la solución para el lavado de los minibloques, que ya contienen moléculas de ADN que van a ser digeridas con enzimas de restricción, está compuesta por EDTA 0.5 mM, Tris 10 mM, pH 8.0.
32. Juego de reactivos de acuerdo con la reivindicación No. 21 , caracterizado porque la solución para la conservación de las moléculas de ADN inmovilizadas en los minibloques, está compuesta por tampón EDTA 100 mM, Tris 10 M, pH 8.0.
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